CN117866959A - 靶向ckip-1的双链rna分子及其用途 - Google Patents
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Abstract
提供了一种靶向CKIP‑1的双链RNA分子及其在治疗包括类风湿关节炎在内的炎症疾病方面的用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及靶向CKIP-1的双链RNA分子及其用途，特别是涉及所述双链RNA分子用于治疗炎症疾病，例如关节炎特别是类风湿关节炎的用途。
发明背景
CKIP-1(酪蛋白激酶相互作用蛋白1)是一种骨形成抑制基因，其特异性地调节骨形成而不是骨吸收。CKIP-1在骨质疏松患者中的骨组织中表达较高。已证明靶向抑制CKIP-1表达可以用于治疗骨质疏松或其它病理性骨破坏。然而，现有技术中并没有将CKIP-1与炎症相联系。
TNF-α和IL-6是两种重要的促炎细胞因子，在机体的炎症反应中起重要作用。在生理状态下，人体中TNF-α和IL-6水平较低。但在病理状态下，TNF-α和IL-6分泌的增加以及由此引起的各种促炎因子的级联增加可导致炎症反应，引起组织损伤。本领域已经通过靶向抑制TNF-α和IL-6来治疗炎症疾病。例如，靶向TNF-α的抑制剂已经有多个品种上市，包括英夫利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、戈利木单抗和赛妥珠单抗。此外已有IL-6阻断剂获批上市应用于临床，如托珠单抗。在大型随机、双盲临床试验中，托珠单抗在对TNF-α单抗无应答的患者有较好的治疗效果。
类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种以多关节滑膜炎症性病变为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。滑膜炎持久反复发作，可导致关节内软骨和骨的破坏，关节功能障碍，甚至残疾。类风湿关节炎在成人中发病率较高，每10万成年人口中约有20-40％的发病率。研究显示，70-75％的类风湿关节炎患者在发病3年内即可出现骨破坏，10％在发病2年内出现严重的功能障碍，约50％的患者在患病10年后丧失劳动能力，给患者和社会都造成严重的经济负担。目前治疗RA的药物主要包括非甾体抗炎药、激素、抗风湿药等，它们主要都是用来缓解疼痛、减轻炎症，并不能很好阻止关节、骨的破坏。近年来新出现的一些生物制剂能够缓解并抑制骨破坏的发生，但是并不能修复已有的骨损伤。目前临床上缺乏既能减轻炎症也能促进骨修复的RA治疗药物。
发明简述
在第一方面，本发明提供一种双链RNA(dsRNA)分子，其包含选自以下的有义链和反义链：
1)SEQ ID NO:63所示的有义链和SEQ ID NO:64所示的反义链；
2)SEQ ID NO:71所示的有义链和SEQ ID NO:72所示的反义链；
3)SEQ ID NO:83所示的有义链和SEQ ID NO:84所示的反义链；和
4)SEQ ID NO:161所示的有义链和SEQ ID NO:162所示的反义链。
在一些实施方案中，所述有义链和/或反义链在3’端额外还具有至少一个核苷酸的悬端(overhang)。在一些实施方案中，所述有义链和/或反义链在3’端额外还具有2个核苷酸的悬端，优选所述悬端是TT。
在一些实施方案中，其中所述有义链和反义链包含1个或2个核苷酸取代，所述取代位于5’和/或3’末端的6、5、4、3或2个核苷酸之内。在一些实施方案中，其中所述有义链和反义链包含1个核苷酸取代，所述取代位于有义链的3’最后一个核苷酸位置和相应地反义链5’端第一个核苷酸位置。
在一些实施方案中，所述dsRNA包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述修饰的核苷酸选自：2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-F修饰的核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基团的核苷酸以及与胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团相连接的末端核苷酸、2’-脱氧-2’-氟代修饰核苷酸、2’-脱氧-修饰核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基-修饰核苷酸、2’-烷基-修饰核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和含有非天然碱基的核苷酸。在一些实施方案中，所述dsRNA的有义链和/或反义链中所有尿嘧啶碱基或胞嘧啶碱基的核苷酸的2’羟基均被甲氧基修饰。
在一些实施方案中，所述dsRNA分子是siRNA或shRNA。在一些实施方案中，所述dsRNA分子抑制CKIP-1的表达至少50％，优选至少70％。在一些实施方案中，所述dsRNA分子抑制促炎细胞因子例如IL-6、TNF-α和/或IL-17A的表达。
在第二方面，本发明还提供一种表达载体，其包含编码本发明的dsRNA分子的核苷酸序列，所述核苷酸序列与转录调控元件可操作地连接。
在第三方面，本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的dsRNA分子或本发明的表达载体，以及药学可接受的载体。
在第四方面，本发明提供一种在有需要的对象中治疗关节炎，特别是类风湿关节炎的方法，包括给所述对象施用治疗有效量的本发明的dsRNA分子或本发明的表达载体或本发明的药物组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括给所述对象施用额外的用于治疗关节炎，特别是类风湿关节炎的治疗剂。
在第五方面，本发明提供本发明的dsRNA分子或本发明的表达载体或本发明的药物组合物在制备用于在有需要的对象中治疗关节炎，特别是类风湿关节炎的药物中的用途。
在第六方面，本发明提供一种在有需要的对象中治疗炎症疾病的方法，包括给所述对象施用治疗有效量的本发明的dsRNA分子或本发明的表达载体或本发明的药物组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括给所述对象施用额外的用于治疗炎症疾病的治疗剂。
在第七方面，本发明提供本发明的dsRNA分子或本发明的表达载体或本发明的药物组合物在制备用于在有需要的对象中治疗炎症疾病的药物中的用途。
在第八方面，本发明提供一种在有需要的对象中治疗骨代谢相关疾病的方法，包括给所述对象施用治疗有效量的本发明的dsRNA分子或本发明的表达载体或本发明的药物组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括给所述对象施用额外的用于治疗骨代谢相关疾病的治疗剂。
在第九方面，本发明提供本发明的dsRNA分子或本发明的表达载体或本发明的药物组合物在制备用于在有需要的对象中治疗骨代谢相关疾病的药物中的用途。
在本发明各个方面中，其中所述对象是人。
附图简述
图1、示出候选siRNA序列池。各序列3’端的TT为不与靶序列互补的悬端。
图2、示出用于双荧光素酶检测的过表达载体的载体图谱。
图3、示出si-TD137在双荧光素酶测定中对CKIP-1表达的抑制效果。
图4、示出si-TD141在双荧光素酶测定中对CKIP-1表达的抑制效果。
图5、示出si-TD176在双荧光素酶测定中对CKIP-1表达的抑制效果。
图6、示出si-7在双荧光素酶测定中对CKIP-1表达的抑制效果。
图7、示出siRNA降低CIA小鼠临床评分。
图8、示出siRNA处理后CIA小鼠体重变化。
图9、示出siRNA影响CIA小鼠关节组织促炎细胞因子表达。
发明详述
一、定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
除非另外指明，本文所引用的核酸序列以5’至3’方向书写。术语“核酸”是指DNA或RNA或其修饰的形式，其包含在DNA中存在的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤“A”，胞嘧啶“C”，鸟嘌呤“G”，胸腺嘧啶“T”)或在RNA中存在的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤“A”，胞嘧啶“C”，鸟嘌呤“G”，尿嘧啶“U”)。本文提供的双链RNA核酸分子还可以在3’端包含“T”碱基，即使“T”碱基在RNA中不是天然存在的。在一些情形中，这些碱基可以表示为“dT”，以区分在核糖核苷酸链中存在的脱氧核糖核苷酸。
当核酸分子选择性减少或抑制基因的表达时，该基因被本发明所述的核酸分子“靶向”。或者，核酸分子在严格条件下与基因转录物(即，其mRNA)杂交时，所述核酸分子靶向该基因。能够“在严格条件下”杂交意指在趋向于不利于杂交的标准条件下，例如，高温和/或低盐含量，与靶mRNA区域退火。适当的流程(包括0.1×SSC，68℃，2小时)记述在Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1982中。
本文所使用的“CKIP-1”是指CKIP-1基因或蛋白质(也被称为PLEKHO1)。CKIP-1的序列的例子包括但不限于：人类：Genbank号NM_016274.4；小鼠：Genbank号NM_023320.2；大鼠：Genbank号NM_001025119.1和食蟹猴：Genbank号XM_001098879和XM_001098774。
本文所使用的“靶序列”是指CKIP-1基因转录过程中形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。
除非另有说明，否则在用于描述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的关系时，本文所用术语“互补”是指包含所述第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在特定条件下与包含所述第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力，本领域技术人员可理解这一点。例如，此类条件可以是严格条件，其中所述严格条件可包括：400mMNaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA，在50℃或70℃下持续12-16小时，随后进行洗涤。也可应用其它条件，例如可能在生物体内遇到的生理相关条件。本领域技术人员能够根据杂交核苷酸的最终应用决定最适合于两序列互补试验的系列条件。
这包括包含所述第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含所述第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的全长范围内的碱基配对。本文中这些序列可被称为彼此“完全互补”。然而，在本文中当提到所述第一序列与所述第二序列“基本互补”时，所述两个序列可完全互补或在杂交时形成一个或多个，但通常不超过4个、3个或2个错配碱基对，同时保留在与其最终应用最相关的条件下杂交的能力。但是，当两个寡核苷酸经设计以在杂交时形成一个或多个单链悬端时，这种悬端不应该在涉及互补的定义时被认为是错配。例如，在包含一条长度为19个核苷酸的寡核苷酸和另一条长度为21个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA中，较长寡核苷酸包含与较短寡核苷酸完全互补的19个核苷酸的序列，这种情况也可以被称为“完全互补”。
只要关于其杂交能力的上述需求能够满足，本文所用“互补”序列也可以包含或完全由非Watson-Crick碱基对形成和/或由非天然和修饰核苷酸形成的碱基对形成。这些非Watson-Crick碱基对包括但不限于G:U Wobble或Hoogstein碱基配对。
本文中对于dsRNA的有义链与反义链之间的碱基匹配，或dsRNA的反义链与靶序列之间的碱基匹配，可使用术语“互补”、“完全互补”和“基本互补”，所述术语可根据其所处上下文进行理解。
本文所用的与信使RNA(mRNA)的“至少一部分基本互补”的多核苷酸是指与包括5’UTR、开放阅读框(ORF)或3’UTR的目标mRNA(例如，编码CKIP-1的mRNA)的连续部分基本互补的多核苷酸。例如，如果多核苷酸的序列与编码CKIP-1的mRNA中的非中断部分基本互补，那么所述多核苷酸与CKIP-1的至少一部分互补。
最近已发现双链RNA分子(dsRNA)通过被称为RNA干扰(RNAi)的高度保守的调控机制来阻断基因表达。WO99/32619(Fire等人)公开了长度为至少25个核苷酸的dsRNA在抑制秀丽隐杆线虫(C.elegans)基因表达中的应用。现还发现dsRNA在其它生物体中降解靶RNA，其中所述生物体包括植物(参见，例如WO99/53050，Waterhouse等人和WO 99/61631，Heifetz等人)、果蝇(参见，例如Yang，D.等人，Curr.Biol.(2000)10：1191-1200)和哺乳动物(参见WO00/44895，Limmer和DE10100586.5，Kreutzer等人)。这种天然机制现已成为开发用于治疗因基因异常或有害调控而引发的疾病的新型药物的研发热点。
本文所用术语“双链RNA”或“dsRNA”是指包含两条反平行且如上所述的基本互补的核酸链的双链体结构。通常，各链的大部分核苷酸是核糖核苷酸，但是如本文中详述的，各链或两条链也可以包含至少一个非核糖核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸和/或经修饰的核苷酸。另外，在本说明书中使用的“dsRNA”可包括对核糖核苷酸的化学修饰，包括在多个核苷酸处的修饰，并包括本文公开或本领域已知的所有修饰类型。
形成双链体结构的两条链可以是同一条较大RNA分子的不同部分，或者它们可以是单独的RNA分子。如果所述两条链为单独的RNA分子，此类dsRNA在文献中常被称为siRNA(“短干扰RNA”)。如果所述两条链为一个较大分子的部分并且通过形成双链体结构的一条链的3’-末端与另一条链的5’-末端之间的非中断核苷酸链连接，那么所述相连接的RNA链被称为“发夹环”、“短发夹RNA”或“shRNA”。如果所述两条链通过形成双链体结构的一条链的3’-末端与另一条链的5’-末端之间的非中断链之外的方式共价连接，那么所述连接结构被称为“接头(linker)”。所述RNA链可具有相同或不同数量的核苷酸。除双链体结构之外，dsRNA可包含一个或多个核苷酸悬端。通常，各链的大部分核苷酸是核糖核苷酸，但是如本文详细描述的，各链或两条链也可以包含至少一个非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸和/或经修饰的核苷酸。
本文所用“悬端”是指当dsRNA的一条链的3’末端超过另一条链的5’末端或反之时从dsRNA的双链体结构突出的一个或多个未配对核苷酸。“平端”或“平末端”是指在dsRNA的末端没有未配对的核苷酸，即没有核苷酸悬端。“平末端化的”dsRNA是指在其全长范围均为双链的dsRNA，即在此分子任一个末端均没有核苷酸悬端。为清楚起见，在确定dsRNA是具有悬端还是为平端时，不考虑偶联到dsRNA的3’-末端或5’-末端的化学帽或非核苷酸化学部分。
术语“反义链”是指dsRNA中包含与靶序列基本互补的区域的一条链。本文所用术语“互补区”是指反义链上与本文所定义的序列(例如靶序列)基本互补的区域。如果互补区与靶序列不完全互补，则错配可以位于分子的内部或末端区域。通常，最能容许的错配位于末端区域(不包括本文所述悬端)，例如5’和/或3’末端的6、5、4、3或2个核苷酸之内，或者是最末端1个核苷酸。
本文所用术语“有义链”是指dsRNA中包含与所述反义链区域基本互补的区域的一条链。
如本文所用的术语“对象”或“个体”意指哺乳动物，尤其灵长类动物，尤其是人。
如本文所用，“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。治疗还包括所提供的任何dsRNA、表达载体以及本文所提供的组合物的任何药学用途。
如本文所用，“疗效”表示由个体的治疗所导致的效果，其改变、通常改良或改善疾病或疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。例如，如果认为使疾病或病症相关的可测量参数下降至少25％的给定临床治疗为有效治疗，那么用于治疗所述疾病或病症的药物的治疗有效量是将所述参数减少至少25％时所必需的量。
术语“药学可接受的载体”是指用于施用治疗剂(如dsRNA)的载体。此类载体包括但不限于盐水、缓冲盐溶液、葡萄糖、水、甘油、乙醇和其组合。
如本文所用，“表达载体”包括能够表达感兴趣的核苷酸序列的载体，所述感兴趣的核苷酸序列与诸如启动子区的能够影响这类DNA片段表达的调控序列可操作地连接。这类额外的片段可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。
如本文所用，关于核酸序列、区域、元件或结构域的“可操作地连接”表示核酸区域互相功能相关。例如，启动子可以可操作地连接至编码dsRNA的核苷酸序列，从而所述启动子调控或介导所述核苷酸序列的转录。
二、靶向CKIP-1的核酸分子
本发明人设计、合成并筛选出能够显著抑制CKIP-1表达的dsRNA分子。令人惊奇地，所筛选出的dsRNA分子既能减轻炎症也能促进骨修复，从而能够有效用于治疗关节炎，例如类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)。
在一方面，本发明提供一种靶向CKIP-1的核酸分子例如dsRNA分子，其包含选自表1的有义链和对应的互补反义链。
在一些优选实施方案中，所述靶向CKIP-1的核酸分子包含表1中对应于si-TD060、si-TD062、si-TD066、si-TD068、si-TD070、si-TD074、si-TD080、si-TD082、si-TD089、si-TD096、si-TD137、si-TD140、si-TD141、si-TD143、si-TD176、si-TD178、si-TD181、si-TD362、si-TD364、si-TD378、si-TD726、si-TD730、si-7、si-10的有义链和反义链。
在一些更优选实施方案中，所述靶向CKIP-1的核酸分子包含表1中对应于si-TD137、si-TD141、si-TD176、si-7的有义链和反义链。
在一些实施方案中，所述核酸分子的有义链和/或反义链在3’端额外还具有至少一个核苷酸的悬端。例如，所述有义链和/或反义链在3’端额外还具有1个、2个或3个核苷酸的悬端。例如，在一些具体实施方式中，所述悬端是TT(即dTdT)。在一些具体实施方案中，所述核酸分子的有义链和反义链在3’端包含额外的悬端TT。
在一些实施方案中，所述核酸分子中的有义链和/或反义链包含至少1个例如1个或2个核苷酸取代。例如所述取代位于5’和/或3’末端的6、5、4、3或2个核苷酸之内。在一些实施方案，所述核酸分子的有义链和反义链包含1个核苷酸取代，所述取代位于有义链的3’最后一个核苷酸位置和相应地反义链5’第一个核苷酸位置。所述取代会导致与靶序列之间的错配，然而如此定义的错配是容许的，不显著影响或不影响dsRNA的活性。
在一些实施方案中，本发明的dsRNA包含至少一个修饰的核苷酸。所述修饰的核苷酸可以包含磷酸基团、核糖基团和/或碱基的修饰。
例如，核苷酸中磷酸基团的修饰包括对磷酸基团中的氧进行修饰，例如硫代磷酸酯(Phosphorthioate)修饰和硼烷化磷酸酯(Boranophosphate)修饰。如下式所示分别用硫和硼烷取代磷酸基团中的氧。两种修饰都能稳定核酸的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
核苷酸中核糖基团的修饰包括对核糖基团中2’-羟基(2’-OH)的修饰。RNA水解时，在RNA酶催化下，2’-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用下形成水解产物。在核糖基团的2’-羟基位置引入某些取代基如甲氧基或氟后，使核酸如siRNA具有更强的抵抗核酸酶水解的性能，增加了核酸的稳定性。对核苷酸戊糖2’-羟基的修饰包括但不限于2’-氟修饰(2’-fluro modification)、2’-甲氧基修饰(2’-OME)、2’-甲氧乙基修饰(2’-MOE)、2’-2,4-二硝基苯酚修饰(2’-DNP modification)、锁核酸修饰(LNAmodification)、2’-氨基修饰(2’-Amino modification)、2’-脱氧修饰(2’-Deoxymodification)、3’-胆固醇修饰(3’-cholesterol modification)、4’-硫脱氧胸苷修饰(4’-thiothymidine)等。此类修饰的结构示例如下：
核苷酸中碱基的修饰是指对核苷酸基团中的碱基进行修饰，通过碱基的修饰提高碱基的相互作用，从而增强对靶mRNA的效应。如在尿嘧啶的5’位点引入溴或碘的5’-溴尿嘧啶(5’-bromo-uracil)和5’-碘尿嘧啶(5’-iodo-uracil)修饰是常使用的碱基修饰方法.其他还有N3-甲基脲嘧啶(N3-methyl-uracil)修饰、2,6-二氨基嘌呤(2,6-diaminopurine)修饰等。
在一些实施方案中，本发明的dsRNA包含至少一个选自下组的修饰的核苷酸：2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-F修饰的核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基团的核苷酸以及与胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团相连接的末端核苷酸，和/或，例如，所述修饰核苷酸选自下组：2’-脱氧-2’-氟代修饰核苷酸、2’-脱氧-修饰核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基-修饰核苷酸、2’-烷基-修饰核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和含有非天然碱基的核苷酸。所述至少一个修饰的核苷酸可以例如增强dsRNA的稳定性和/或减少dsRNA的免疫原性作用。所述修饰的核苷酸可以在有义链上和/或在反义链上。
在一些实施方案中，所述dsRNA包含至少一个2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸和/或至少一个含5’-硫代磷酸酯基团的核苷酸。
在一些具体实施方式中，本发明的dsRNA的有义链和/或反义链中所有尿嘧啶碱基或胞嘧啶碱基的核苷酸的2’羟基均被甲氧基修饰。
在一些具体实施方式中，本发明的dsRNA的有义链中所有尿嘧啶碱基或胞嘧啶碱基的核苷酸的2’羟基均被甲氧基修饰。
在一些具体实施方式中，本发明的dsRNA的有义链和/或反义链中所有核苷酸的2’羟基均被甲氧基修饰。
在一些具体实施方式中，本发明的dsRNA的有义链中所有核苷酸的2’羟基均被甲氧基修饰。
在一些具体实施方式中，本发明的dsRNA的有义链和/或反义链的5’端被磷酸化。
在一些具体实施方式中，本发明的dsRNA的有义链和/或反义链包含3’胆固醇修饰。
在一些具体实施方式中，本发明的dsRNA的有义链中所有尿嘧啶碱基或胞嘧啶碱基的核苷酸基团的2’羟基均被氟(F)修饰。
在一些具体实施方式中，本发明的dsRNA的有义链中包含锁核酸修饰。
在一些具体实施方式中，本发明的dsRNA的有义链和/或反义链中所有核苷酸包含硫代磷酸酯修饰。
在一些实施方案中，所述dsRNA分子是siRNA。
在另一些实施方案中，所述dsRNA分子是shRNA(短发夹RNA)。基于siRNA序列设计合适的shRNA属于本领域技术人员的能力范围。
本发明的dsRNA可以通过本领域常规技术如固相合成或液相合成获得。可以通过在合成中使用修饰的核苷酸单体来引入修饰的核苷酸。
在另一方面，本发明提供了包含编码本发明的核酸分子如dsRNA的核苷酸序列的表达载体，其中所述核苷酸序列与转录调控元件如启动子等可操作地连接。能够表达dsRNA分子的重组载体可以被递送至靶细胞中并且在靶细胞中永久存在。或者，可以使用提供核酸分子的瞬时表达的载体。需要时，所述载体可以重复施用。一旦被表达，所述dsRNA分子与靶标mRNA相互作用，并且产生RNA干扰反应。通常而言，shRNA特别适合以这种方法产生。
表达载体可以是线性构建体、环状质粒载体或病毒载体(包括但不限于腺病毒、腺伴随病毒、慢病毒载体等)。在siRNA的情况下，siRNA的单条链可以由两个单独表达载体上的启动子转录；或者，siRNA的各单条链可以由均位于同一表达质粒上的启动子转录。在shRNA的情况下，shRNA链转录自单一表达载体。
在本发明的表达载体中驱动dsRNA表达的启动子可以是真核RNA聚合酶I(例如，核糖体RNA启动子)、RNA聚合酶II(例如，CMV早期启动子或肌动蛋白启动子或U1snRNA启动子)或一般地为RNA聚合酶III启动子(例如，U6snRNA或7SKRNA启动子)或者原核启动子(例如，T7启动子，前提是该表达载体还编码T7启动子转录所需的T7 RNA聚合酶)。
本发明的dsRNA能够在细胞内显著地抑制CKIP-1的表达。在一些实施方案中，CKIP-1的表达被抑制至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，甚至100％。优选地，本发明的dsRNA能够抑制CKIP-1的表达至少50％。更优选地，优选地，本发明的dsRNA能够抑制CKIP-1的表达至少70％。
当术语“抑制表达”、“下调表达”、“阻抑表达”等在针对CKIP-1基因时，它们在本文中是指至少部分抑制CKIP-1基因的表达，这通过与第二细胞或细胞群相比第一细胞或细胞群中的CKIP-1表达水平的减少来表示，其中所述第一细胞或细胞群中的CKIP-1基因被转录且其已经被处理以致CKIP-1基因的表达被抑制，所述第二细胞或细胞群与所述第一细胞或细胞群基本相同但其没有作此处理(对照细胞)。抑制程度通常用以下方式表示：
(对照细胞CKIP-1表达水平-处理细胞CKIP-1表达水平)/对照细胞CKIP-1表达水平x100％
其中所述表达水平可以是mRNA水平或蛋白质水平。本领域技术人员清楚知晓如何测定特定基因的mRNA水平或对应蛋白质水平。
令人惊奇地，本发明的dsRNA还可以抑制促炎细胞因子IL-6、TNF-α和/或IL-17A的表达。特别是，本发明的dsRNA可以显著抑制促炎细胞因子IL-6的表达。
在一些实施方案中，促炎细胞因子IL-6、TNF-α和/或IL-17A的表达被抑制至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，甚至100％。在一些优选实施方式中，IL-6的表达被抑制至少50％，更优选被抑制至少80％。
表1抑制CKIP-1表达的dsRNA
三、药物组合物
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含至少一种本发明的dsRNA或包含编码所述dsRNA的核苷酸序列表达载体，以及药学可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物用于治疗炎症疾病，例如关节炎，特别是类风湿关节炎(RheumatoidArthritis，RA)。
本文使用的“药学可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱、关节内或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即dsRNA分子包裹于一种材料如脂质体中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。在一些实施方式中，本发明的dsRNA可以通过阳离子脂质体递送系统递送。
本发明的药物组合物也可含有药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
这些组合物还可含有例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。
可以通过灭菌程序或通过包含诸如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各种抗细菌剂和抗真菌剂确保防止存在微生物。在很多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。
药学可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。常规介质或试剂，除了任何与活性化合物不相容的范围外，都可能在本发明的药物组合物中。还可以向组合物中掺入额外的活性化合物。
治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。
可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量根据所治疗的对象和特定给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，例如大约0.1％至大约70％，例如选大约1％至大约30％的活性成分，与药学可接受的载体相组合。
可以调节剂量方案以提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一推注，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的对象的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。
对于本发明的dsRNA分子的给药而言，剂量范围可以为约0.0000001至100mg/kg受者体重。示例性的治疗方案可以是每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次、每10个月一次、每11个月一次、甚至每12个月一次，或起始给药间隔略短(如每周一次至每三周一次)后期给药间隔加长(如每月一次至甚至每12个月一次)。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。
四、疾病治疗
本发明人设计了超过200个针对CKIP-1基因的siRNA分子，从中筛选出能够显著抑制CKIP-1表达的siRNA分子(实施例1-3)。实验表明，本发明的CKIP-1分子能够显著抑制人成骨细胞内CKIP-1蛋白的表达(实施例5)，并且施用所述dsRNA能够促进人成骨细胞表型基因的表达，从而能够促进成骨细胞分化(实施例6和7)。在小鼠和食蟹猴模型中，施用本发明的dsRNA可以显著缓解关节炎进展(实施例8和9)。
更令人惊奇的是，本发明人发现本发明的dsRNA能够抑制促炎细胞因子IL-6、TNF-α和/或IL-17A的表达(实施例4和8)。特别是，本发明的dsRNA可以显著抑制促炎细胞因子IL-6的表达。TNF-α主要由发炎关节的巨噬细胞、滑膜衬里细胞和激活的T细胞表达。在RA发炎关节，TNF-α是最主要的促炎细胞因子之一，能够诱导其它促炎因子如IL-1β、IL-6和IL-8的产生。CIA诱发进程中IL-6受体中和抗体可完全消除炎症反应，表明IL-6在引发关节炎的过程中起着重要作用。
之前关于CKIP-1的药物研究主要集中于抑制骨破坏或修复骨损伤，而本发明首次发现本发明靶向CKIP-1的dsRNA能够抑制促炎细胞因子的表达，从而可以用于治疗炎症。本发明靶向CKIP-1的dsRNA抑制炎症的能力在关节炎特别是类风湿关节炎的治疗中特别有优势。因为在RA中，早期的症状主要是关节炎症，在若干年后才出现骨破坏(称作“后期骨破坏”)。本发明的靶向CKIP-1的dsRNA能够同时抑制炎症，也能修复骨损伤，因此可有利地用于RA治疗的各个阶段，而不局限于后期的骨破坏。
因此，在另一方面，本发明提供一种在有需要的对象中治疗关节炎，特别是类风湿关节炎的方法，包括给所述对象施用治疗有效量的本发明的dsRNA分子或本发明的表达载体或本发明的药物组合物。
在另一方面，本发明还提供本发明的dsRNA或本发明的表达载体或本发明的药物组合物在制备用于在有需要的对象中治疗关节炎，特别是类风湿关节炎的药物中的用途。
可通过本发明的dsRNA分子或本发明的表达载体或本发明的药物组合物治疗的关节炎包括但不限于类风湿关节炎、骨关节炎、特发性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、感染性关节炎、青少年关节炎(Juvenile arthritis)、反应性关节炎、痛风性关节炎等。
本发明的dsRNA或本发明的表达载体或本发明的药物组合物还可以与额外的用于治疗关节炎，特别是类风湿关节炎的治疗剂联合使用。所述额外的治疗剂包括但不限于非甾体抗炎药、激素、抗风湿药等。
在另一方面，本发明提供一种在有需要的对象中治疗促炎细胞因子(例如IL-6、TNF-α和/或IL-17A)相关炎症疾病的方法，包括给所述对象施用治疗有效量的本发明的dsRNA分子或本发明的表达载体或本发明的药物组合物。
在另一方面，本发明还提供本发明的dsRNA或本发明的表达载体或本发明的药物组合物在制备用于在有需要的对象中促炎细胞因子(例如IL-6、TNF-α和/或IL-17A)相关炎症疾病的药物中的用途。
所述促炎细胞因子(例如IL-6、TNF-α和/或IL-17A)相关炎症疾病包括但不限于炎症性肠病、感染引起的炎症、损伤引起的炎症、呼吸系统炎症、癌症相关性炎症等。所述促炎细胞因子(例如IL-6、TNF-α和/或IL-17A)相关炎症疾病也包括关节炎，例如上文所列举的关节炎，特别是类风湿关节炎。
可通过本发明的dsRNA分子或本发明的表达载体或本发明的药物组合物治疗的其他促炎细胞因子(例如IL-6、TNF-α和/或IL-17A)相关炎症疾病包括但不限于系统性红斑狼疮、克罗恩病、银屑病、结肠炎、回肠炎、肾小球肾炎、哮喘、皮炎(包括接触性皮炎和特应性皮炎)、血管炎、慢性支气管炎、慢性前列腺炎、阑尾炎、胰腺炎、盆腔炎、多发性肌炎、慢性阻塞性肺病等。
本发明的dsRNA或本发明的表达载体或本发明的药物组合物还可以与额外的用于治疗炎症疾病，特别是促炎细胞因子(例如IL-6、TNF-α和/或IL-17A)相关炎症疾病的治疗剂联合使用。所述额外的治疗剂例如是靶向TNF-α的抑制剂，包括但不限于英夫利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、戈利木单抗和赛妥珠单抗；IL-6阻断剂，包括但不限于托珠单抗(Tocilizumab)；IL-17A阻断剂，包括但不限于苏金单抗(secukinumab)。
在另一方面，本发明提供一种在有需要的对象中治疗骨代谢相关疾病的方法，包括给所述对象施用治疗有效量的本发明的dsRNA分子或本发明的表达载体或本发明的药物组合物。
在另一方面，本发明还提供本发明的dsRNA或本发明的表达载体或本发明的药物组合物在制备用于在有需要的对象中骨代谢相关疾病的药物中的用途。
所述骨代谢相关疾病包括但不限于骨软化症、骨质缺乏、溶骨性骨病、肾性骨病、成骨不全、癌症骨转移引起的骨破坏等。
本发明的dsRNA或本发明的表达载体或本发明的药物组合物还可以与额外的用于治疗骨代谢相关疾病的治疗剂联合使用。
在另一方面，本发明提供一种在有需要的对象中降低促炎细胞因子(例如IL-6、TNF-α和/或IL-17A)水平的方法，包括给所述对象施用治疗有效量的本发明的dsRNA分子或本发明的表达载体或本发明的药物组合物。
优选地，在本发明上述各个方面中，所述对象是人。
在一些实施方案中，本发明的dsRNA或本发明的表达载体或本发明的药物组合物通过关节内施用。在一些实施方案中，本发明的dsRNA或本发明的表达载体或本发明的药物组合物通过全身施用。
实施例
通过参考在此给出的一些具体实施例可获得对本发明的进一步的理解，这些实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，可以对本发明作出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。
实施例1、靶向CKIP-1的siRNA的序列设计和合成
根据人CKIP-1mRNA和猴CKIP-1mRNA序列的同源区域设计候选siRNA获得候选siRNA序列池，综合分析候选siRNA序列池的脱靶效应，最后结合种子区匹配评分剔除脱靶分数高的候选siRNA序列，共获得并合成208条针对CKIP-1的siRNA候选序列。另外设计并合成8条不相关的NC序列作为筛选试验中的阴性对照。合成的208条目的基因siRNA序列，以及8条NC序列参见图1。
实施例2、用实时定量PCR筛选抑制CIKP-1表达的siRNA
将hFOB细胞(人成骨细胞株，购自中国科学院细胞库)接种于96孔细胞培养板中，并在细胞密度达到70％左右时进行siRNA转染。将0.5μl Lipofectamine2000稀释于25μl不含血清和抗菌素的opti-MEM中，充分混匀。将15pmol RNA稀释于25μl不含血清和抗菌素的opti-MEM中，轻轻混匀。Lipofectamine2000稀释液加入RNA稀释液中，充分混匀。室温放置20min。将50μl Lipofectamine2000与RNA混匀液加入至接种了细胞的96孔细胞板中，轻轻摇动，使混合均匀，5h后换液。48小时后提取RNA(天根微量RNA提取试剂盒)，反转录(Takara反转录试剂盒)后进行qPCR检测(全式金qPCR试剂盒)。以GADPH基因作为内参测定CIKP-1的相对表达。获得的各siRNA的对应CIKP-1相对表达值归一化至空白处理组。各NC序列也作为阴性对照。引物序列如下：
CIKP1-F：GGAACCAACCTCTTGTGCTG
CIKP1-R：GTCAACTTCTTGGGTGCCTG
GADPH-F：CATGAGAAGTATGACAACAGCCT
GADPH-R：AGTCCTTCCACGATACCAAAGT
结果显示，从208条siRNA序列中筛选出82条干扰效率达到50％及以上(见表2)，其中干扰效率达到70％及以上的22条序列(表2粗体斜体显示)。这些序列作为候选用于进一步筛选。
表2干扰效率达到50％及以上的siRNA
实施例3、通过双荧光素酶检测鉴定候选siRNA
本实施例中，通过双荧光素酶检测对实施例2中筛选出的候选siRNA序列进行进一步鉴定。
1、构建靶基因CKIP-1过表达载体
用分别带有SacI和XhoI酶切位点及保护碱基的上下游引物通过PCR扩增得到CKIP-1CDS1-652序列片段。扩增产物经过SacI和XhoI消化后插入至同样经SacI和XhoI消化的pGP-miRGLO过表达载体(见图2)中，获得pmirGlo-CDS1载体：其过表达CKIP-1基因CDS区第一段1-652的序列。
用分别带有SacI和XhoI酶切位点及保护碱基的上下游引物通过PCR扩增得到CKIP-1CDS 653-1230序列片段。扩增产物经过SacI和XhoI消化后插入至同样经SacI和XhoI消化的pGP-miRGLO过表达载体(见图2)中，获得pmirGlo-CDS2载体：其过表达CKIP-1基因CDS区第二段653-1230的序列。
2、细胞培养
293T细胞，常规培养使用含10％ FBS(Gibco)的DMEM培养基(Gibco)(含1.5mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素)中，37℃5％CO2饱和湿度培养箱中培养。
3、细胞转染
293T细胞在10cm培养皿中培养至80-90％融合时，倾去培养液，用3ml PBS洗涤细胞两次。加1ml Trypsin-EDTAsolution,混匀后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置2-3分钟。加入2ml完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液。血球计数板计数，按照每孔约1×105的细胞量接种于24孔板。
在1.5ml EP管中加入150μl Opti-MEM I(50μl/孔*3)，再分别加入的相应质粒载体30ng(每孔10ng)，以及相应用量的siRNA(各siRNA终浓度设置梯度：6.25、12.5、25、50、100、300nM，其中阴性对照NC-7的终浓度为25nM)，混匀；在另一1.5ml EP管中加入150μlOpti-MEM I(50μl/孔*3)，以及6μl的转染试剂Lipo2000，混匀，静置5min后将两者混匀，共300ul体积，室温静置20min。期间将前一天铺好的24孔板中培养基移除，按400μl/孔加入培养基；20min静置时间到后，将转染混合物分别加入到以上的24孔板中，100μl/孔，各设3重复，并设置Blank孔和Mock孔，将孔板摇匀，在培养箱中温育6小时。移除转染液，用PBS漂洗后，加入培养基继续培养，转染NC-FAM的孔拍照观察转染效率。在转染24h后收取细胞用于双荧光素酶检测。
4、双荧光素酶检测
实验材料及试剂包括：Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega,E1960)；PBS；96孔白板(corning cat.#3912)；多标记微孔板检测仪(PerkinElmerEnSpire)。
实验步骤：除去待检细胞孔板中的培养基，PBS清洗培养细胞，吸弃PBS。按100μl/孔，加入1×PLB，室温轻缓晃动培养板，裂解15min。将细胞裂解物移至小离心管中3000rpm3min离心，去除细胞碎片，取上清液30μl加入到96孔白板中，按说明书推荐操作步骤加入底物进行检测。
结果：
4种siRNA在双荧光素酶测定中对CKIP-1表达具有良好的抑制效果：si-TD137、si-TD141、si-TD176和si-7。测定结果分别示于表3-6和图3-6。
表3 si-TD137的双荧光素酶测定结果
表4 si-TD141的双荧光素酶测定结果
表5 si-TD176的双荧光素酶测定结果
表6 si-7的双荧光素酶测定结果
实施例4、靶向CKIP-1的siRNA抑制促炎细胞因子表达
RAW264.7小鼠腹腔巨噬细胞系(购自中国科学院细胞库，上海)培养于完全DMEM培养基中，培养基包含10％胎牛血清，100U青霉素和链霉素，置于37℃恒温二氧化碳(5％)培养箱中，培养过夜，待细胞融合度达到70-80％用于实验。
在体外，用上述制备得到的针对CKIP-1的小干扰RNA或其有义链甲氧基修饰序列转染小鼠巨噬细胞作为药物处理组(RNAi组)，单独用转染试剂X-TremeGENE siRNA转染试剂(购自Roche，货号4476093001)处理上述细胞作为转染试剂组(MOCK组)，每组3个平行，至少重复3次实验。转染小鼠巨噬细胞时，小干扰RNA终浓度为30nM。转染24小时后加入LPS(购自Sigma，货号L2630-10MG)刺激6小时，收集各组细胞上清，检测促炎细胞因子分泌，并收集各组细胞检测促炎细胞因子mRNA表达水平。
1.siRNA对TNF-α和IL-6蛋白分泌抑制效率的测定
采用ELISA方法检测上述细胞上清液中TNF-α和IL-6的分泌水平的抑制效率，具体地：使用Mouse TNF alpha ELISA Ready-SET-(eBioscience，货号88-7324-88)与Mouse IL-6ELISA Ready-SET-(eBioscience，货号88-7064-88)试剂盒，按其说明书进行检测，通过绘制标准曲线计算TNF-α和IL-6的浓度。
细胞因子抑制效率按如下等式进行计算：
细胞因子抑制效率＝[(LPS组-处理组)/(LPS组-空白对照组)]×100％。
测定结果见下表7和表8：
表7
备注：*P＜0.05与MOCK组比较，有统计学显著性差异。
表8
备注：*P＜0.05与MOCK组比较，有统计学显著性差异。
从上述表中可以看出，各候选siRNA及其甲基化修饰形式均可抑制LPS诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞的IL-6和TNF-α分泌，且对IL-6分泌的抑制达到显著水平。
2.siRNA对TNF-α和IL-6mRNA表达抑制效率的测定
采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法检测上述收获RAW264.7细胞中TNF-α和IL-6mRNA水平，具体地：使用TRIzol试剂(Invitrogen，货号15596018)抽提细胞总RNA，用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-StepgDNARemoval)(全式金，货号AT341-02)试剂盒反转录合成cDNA，用荧光定量PCR法进行检测siRNA对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞IL-6和TNF-α表达的抑制效率。
Real-time PCR法中用GAPDH基因作为内参基因，所使用引物序列如表9所示
表9
| 正向(5’-3’) | 反向(5’-3’) | |
| 小鼠TNF-α | TCAGCGAGGACAGCAAGG | AGTGAGTGAAAGGGACAGAACC |
| 小鼠IL-6 | CCTTCTTGGGACTGATGCTG | TTGGGAGTGGTATCCTCTGTGA |
| 小鼠GAPDH | CCTTCATTGACCTCAACTACATGG | CTCGCTCCTGGAAGATGGTG |
荧光定量PCR法中，核酸抑制效率按如下等式进行计算：
siRNA抑制效率＝[(LPS组细胞因子基因拷贝数/LPS组GAPDH基因拷贝数-处理组细胞因子基因拷贝数/处理组GAPDH基因拷贝数)/(LPS组细胞因子基因拷贝数/LPS组GAPDH基因拷贝数-空白对照组细胞因子基因拷贝数/空白对照组GAPDH基因拷贝数)]×100％
结果如表10所示：
表10
备注：*P＜0.05与MOCK组比较，有统计学显著性差异。
从表10中可以看出，各候选siRNA显著抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞的IL-6mRNA表达；对TNF-αmRNA表达则无明显抑制作用。
可见，本发明的靶向CKIP-1的siRNA可以抑制促炎细胞因子IL-6和TNF-α特别是IL-6的水平，由此抑制炎症，特别是IL-6和/或TNF-α相关炎症，例如RA中的炎症。
实施例5、靶向CKIP-1的siRNA对CKIP-1蛋白表达的抑制效果
人成骨细胞株hFOB1.19，购自中国科学院细胞库，培养液为含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基(购自Gibco公司)。将人成骨细胞系hFOB1.19转移至24孔板中培养过夜，使其贴壁。使用靶向CKIP-1的siRNA转染人成骨样细胞株hFOB1.19作为处理组，用非特异性核酸转染上述细胞作为阴性对照组(NC组)。每组2个平行，至少重复3次实验。转染人成骨样细胞时，核酸终浓度为20μM。转染72小时后，收集细胞，进行CKIP-1蛋白表达量的检测。
按照文献(分子克隆实验指南，科学出版社，2005年出版)中的方法，对成骨样细胞中CKIP-1蛋白的含量进行免疫印迹检测。免疫印迹检测所用的CKIP-1抗体购自Santa CruzBiotechnology公司(货号sc-376355)，内参抗体采用GADPH(购自Santa CruzBiotechnology公司，货号sc-166574)。
免疫印迹法中，核酸抑制活性按如下等式计算：核酸抑制活性＝[1-(处理组CKIP-1蛋白免疫印迹条带的光强度值/处理组GAPDH蛋白免疫印迹条带的光强度值)/(对照组CKIP-1蛋白免疫印迹条带的光强度值/对照组GAPDH蛋白免疫印迹条带的光强度值)]×100％。
结果：si-7能显著抑制人成骨细胞株hFOB1.19内CKIP-1蛋白的表达。与对照NC相比，有统计学差异(P<0.05)。测定结果如表11所示。
表11
| 对CKIP-1蛋白表达抑制率(％) | |
| NC | 0.0 |
| si-7 | 74.5* |
实施例6、靶向CKIP-1的siRNA对成骨细胞分化的影响
类似于实施例5，检测CKIP-1siRNA对人成骨细胞株hFOB1.19表型基因碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原蛋白(COL1)、骨调素(OPN)、骨唾液蛋白(BSP)和骨钙蛋白(OC)mRNA随时间变化的表达水平，使用的引物如表12所示。测定结果如表13所示。
表12
表13：
*P<0.05与NC组相比，有统计学差异。
结果：ALP、COL1A1和OPN在成骨细胞分化早期开始表达，BSP和OC在成骨细胞达成熟功能期才开始表达。作用72h，si-7组的ALP、COL1、OPN、BSP和OC的表达量较NC组的显著升高。
实验结果表明本发明的靶向CKIP-1的siRNA能够促进人成骨细胞株hFOB1.19表型基因的表达，从而能够促进成骨细胞分化。
实施例7、靶向CKIP-1的siRNA对骨基质矿化沉积率的影响
钙沉积量是体外成骨细胞形成过程中成熟成骨细胞的关键功能性矿化标记。如上所述，用靶向CKIP-1的siRNA转染人成骨样细胞株hFOB1.19作为处理组，用非特异性核酸转染上述细胞作为阴性对照组(NC组)。转染时，核酸终浓度为20μM。间隙性转染的频率为一周一次，每组4个平行。首次转染7、14和21天后，通过钙染色测定人成骨样细胞株hFOB1.19中的钙沉积量。
测定结果如表14所示。人成骨样细胞首次转染21天后，处理组的钙沉积量明显高于NC组，这在功能水平上验证了本发明的siRNA能够促进人前成骨细胞分化为成熟成骨细胞。
表14：
*P<0.05：与NC组相比，有统计学差异。
实施例8、用小鼠CIA模型评估siRNA体内活性
选用8-10周龄雄性DBA小鼠，采用II型胶原尾根部皮下注射建立胶原诱导关节炎(CIA)模型。具体方法如下：取适量浓度为2mg/mL牛II型胶原，与等量不完全弗氏佐剂混合，充分乳化，取乳化后的混合物以100μg II型胶原/只小鼠于尾根部皮下注射。21天后按50μgII型胶原/只于尾根部皮下加强1次。
以5级半定量评分标准作为关节炎临床严重程度的评判标准：0：无红肿；1：红斑伴随轻度肿胀，且限定于足中段或者踝关节；2：轻度肿胀从踝关节向足中段延伸；3：中度肿胀从踝关节向跖骨关节扩展；4：踝关节，足和足趾严重肿胀。
以视觉评估双后肢严重程度满足每组动物评分均值为1分左右时，对动物进行随机分组：载体组，踝关节腔注射空白脂质体；NC(阴性对照)组，踝关节腔注射载有阴性对照序列的脂质体；处理组，踝关节腔注射分别载有Si-7、Si-137、Si-141或Si-176的脂质体；阳性对照组，施用阳性药益赛普(Etanercept，每支含12.5mg活性成分，购于上海中信国健药业有限公司)。
各组动物自入组第0天、7天、14天、21天、28天和35天连续6次进行后肢双侧踝关节腔注射给药，给药剂量为4μg siRNA/5μl脂质体/踝关节。其中阳性药益赛普为皮下注射给药，剂量为7.5mg/kg体重。
1.siRNA处理对CIA小鼠临床评分和体重影响
自入组之日起开始观察记录小鼠双后肢踝关节肿胀评分，每周记录2次，以双后肢评分加和作统计学分析。临床评分结果见图7和下表15。同时，每周记录1次小鼠体重，结果见图8和表16。
结果显示，各组小鼠体重均增长，未出现体重下降。Si-7-Ome、Si-137-Ome、Si-141-Ome、Si-176-Ome均显著降低小鼠CIA模型关节炎临床评分，抑制率分别为50％、60％、70％、60％，作用均优于阳性药益赛普(抑制40％)。
表15.对小鼠CIA临床评分的抑制作用
备注：*表示与载体组相比P＜0.05，**表示与载体组相比P＜0.01，***表示与载体组相比P＜0.001。
表16.对小鼠体重变化的影响
2.siRNA处理对CIA小鼠关节组织促炎因子表达的影响
CIA模型小鼠处死后用剪刀剪去腿部皮毛，暴露踝关节部位，使用骨钳剪取膝关节以下部位，液氮冷却研磨并移至无酶管中，使用TRIzol试剂(Invitrogen，货号15596018)抽提细胞总RNA。用TransScript All-in-One First-Strand cDNASynthesis SuperMix forqPCR(One-Step gDNA Removal)(全式金，货号AT341-02)试剂盒反转录合成cDNA。用荧光定量PCR法进行检测si-7、si-137、si-141、si-176对CIA小鼠模型关节组织CKIP-1、IL-6、TNF-α、IL-17A mRNA表达的抑制效率。
所使用IL-6、TNF-α、和内参基因GAPDH的引物同上。CKIP-1、IL-17A引物序列如表17所示：
表17
| 正向(5’-3’) | 反向(5’-3’) | |
| 小鼠IL-17A | CTCCACCGCAATGAAGACC | CCCTCTTCAGGACCAGGATC |
| 小鼠CKIP-1 | TTTCTCGGCCTTGGGAAAAAC | GAGGCACATCGGCTCTTCT |
荧光定量PCR法中，表达抑制效率如下式进行计算：
抑制效率＝[(载体组细胞因子基因拷贝数/载体组GAPDH基因拷贝数-处理组细胞因子基因拷贝数/处理组GAPDH基因拷贝数)/(载体组细胞因子基因拷贝数/载体组GAPDH基因拷贝数-正常对照组细胞因子基因拷贝数/正常对照组GAPDH基因拷贝数)]×100％
测定结果见表18及图9所示：
表18
备注：*P＜0.05，与载体组比较有统计学显著性差异；**P＜0.01，与载体组比较有统计学极显著性差异；***P＜0.001，与载体组比较有统计学极显著性差异；****P＜0.0001，与载体组比较有统计学极显著性差异；####P＜0.0001与正常对照组比较，有统计学极显著性差异。
可以看出，si-7-OMe、si-137-OMe、si-141-OMe、si-176-OMe均显著地抑制了CIA小鼠关节组织CKIP-1、IL-6、TNF-α、IL-17A mRNA表达，抑制率均大于50％，且对CKIP-1mRNA的抑制作用均强于阳性药益赛普(41.37％)。相比其它小干扰RNA，si-137对促炎因子IL-6、TNF-α、IL-17A mRNA显示了更强的抑制作用，且抑制作用强于阳性药益赛普。表明本发明的siRNA可有效抑制RA中的炎症。
3.MicroCT检测
MicroCT的检测选用ScancovivaCT 40进行。将小鼠后爪放入Micro CT样本球管中，进行三维CT扫描重建。扫描完成后，采用配套软件分析其骨小梁三维微观结构并采集骨小梁的空间结构参数。
4.病理学检测
小鼠后肢置于4％甲醛溶液中固定，EDTA脱钙后石蜡包埋。连续切片，采用HE染色，检查关节病理改变及骨侵蚀状况。
5.骨形态计量学分析
小鼠处死前12天，腹腔注射二甲酚橙(90mg/kg)，处死前2天，腹腔注射钙黄绿素(10mg/kg)。小鼠处死后，取后爪，使用不脱钙切片机做不连续10μm切片，1％亚甲基蓝染色后用光学显微镜观察，未染色片子用做荧光显微镜观察。爪子中的跖骨用来进行骨形态计量学分析。
各siRNA给药组对比模型对照组，在改善类风湿关节炎模型的炎症和骨损伤，延缓疾病进展情况均起到了积极作用，体现了良好的治疗效果。
实施例9、猴子类风湿关节炎模型验证siRNA效果
1.动物造模及给药
实验选用3-6岁雌性正常食蟹猴，胶原诱导关节炎造模方法参考相关文献，食蟹猴分别于第0天和第21天接受牛II型胶原免疫。发病后给予药物治疗，给药形式为关节局部给药。小核酸采用脂质体递送系统。
分组如下：载体组，关节腔注射空白脂质体；NC(阴性对照)组，踝关节腔注射载有阴性对照序列的脂质体；处理组，关节腔注射分别载有Si-7、Si-137、Si-141或Si-176的脂质体；阳性对照组，施用阳性药益赛普(Etanercept，购于上海中信国健药业有限公司)。每组3只动物，关节腔注射给药，每周一次，连续6周。
2.指标检测
MicroCT、病理、骨形态计量等检测类似于小鼠实验。
siRNA给药组对比对照组动物，在类风湿关节模型上对于改善病情，尤其是减少骨损伤，维持骨功能等方面体现良好的治疗作用。
Claims (23)
1.一种用于抑制CKIP-1的表达的双链RNA(dsRNA)分子，其包含以下的有义链和反义链：SEQ ID NO:71所示的有义链和SEQ ID NO:72所示的反义链。
2.权利要求1的dsRNA分子，所述有义链和/或反义链在3’端额外还具有至少一个核苷酸的悬端。
3.权利要求2的dsRNA分子，所述有义链和/或反义链在3’端额外还具有2个核苷酸的悬端。
4.权利要求3的dsRNA分子，其中所述悬端是TT。
5.权利要求1的dsRNA分子，其中有义链和反义链包含1个或2个核苷酸取代，所述取代位于5’和/或3’末端的6、5、4、3或2个核苷酸之内。
6.权利要求5的dsRNA分子，其中所述有义链和反义链包含1个核苷酸取代，所述取代位于有义链的3’最后一个核苷酸位置和相应地反义链5’端第一个核苷酸位置。
7.权利要求1-6任一项的dsRNA分子，其包含至少一个修饰的核苷酸。
8.权利要求7的dsRNA分子，所述修饰的核苷酸选自：2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-F修饰的核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基团的核苷酸以及与胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团相连接的末端核苷酸、2’-脱氧-2’-氟代修饰核苷酸、2’-脱氧-修饰核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基-修饰核苷酸、2’-烷基-修饰核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和含有非天然碱基的核苷酸。
9.权利要求7的dsRNA分子，其有义链和/或反义链中所有尿嘧啶碱基或胞嘧啶碱基的核苷酸的2’羟基均被甲氧基修饰。
10.权利要求1-9任一项的dsRNA分子，其是siRNA或shRNA。
11.权利要求1-10任一项的dsRNA分子，其抑制CKIP-1的表达至少50％。
12.权利要求11的dsRNA分子，其抑制CKIP-1的表达至少70％。
13.权利要求1-12任一项的dsRNA分子，其抑制促炎细胞因子TNF-α、IL-6和/或IL-17A的表达。
14.表达载体，其包含编码权利要求1-13任一项的dsRNA分子的核苷酸序列，所述核苷酸序列与转录调控元件可操作地连接。
15.药物组合物，其包含权利要求1-13任一项的dsRNA分子或权利要求14的表达载体，以及药学可接受的载体。
16.权利要求1-13任一项的dsRNA分子或权利要求14的表达载体或权利要求15的药物组合物在制备用于治疗关节炎的药物中的用途。
17.权利要求16的用途，其中所述关节炎选自类风湿关节炎、骨关节炎、特发性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、感染性关节炎、青少年关节炎、反应性关节炎、痛风性关节炎。
18.权利要求1-13任一项的dsRNA分子或权利要求14的表达载体或权利要求15的药物组合物在制备用于治疗炎症疾病的药物中的用途。
19.权利要求18的用途，其中所述炎症疾病是促炎细胞因子TNF-α、IL-6和/或IL-17A相关炎症疾病。
20.权利要求19的用途，其中所述炎症疾病选自炎症性肠病、感染引起的炎症、损伤引起的炎症、呼吸系统炎症和癌症相关性炎症。
21.权利要求20的用途，其中所述炎症疾病选自系统性红斑狼疮、克罗恩病、银屑病、结肠炎、回肠炎、肾小球肾炎、哮喘、皮炎、血管炎、慢性支气管炎、慢性前列腺炎、阑尾炎、胰腺炎、盆腔炎、多发性肌炎和慢性阻塞性肺病。
22.权利要求1-13任一项的dsRNA分子或权利要求14的表达载体或权利要求15的药物组合物在制备用于治疗骨代谢相关疾病的药物中的用途。
23.权利要求22的用途，其中所述骨代谢相关疾病选自骨软化症、骨质缺乏、溶骨性骨病、肾性骨病、成骨不全和癌症骨转移引起的骨破坏。
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