CN116887842A

CN116887842A - 用于抑制angptl3的新型rna组合物和方法

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Publication number: CN116887842A
Application number: CN202180069687.2A
Authority: CN
Inventors: B·布鲁纳; M·赫尔姆斯; A·霍夫迈斯特; K·扬-霍夫曼; C·梅茨-魏德曼; S·沙伊德勒; P·来福
Original assignee: Sanofi Aventis France
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 2020-10-16
Filing date: 2021-10-15
Publication date: 2023-10-13
Also published as: JP2023546103A; EP4229200A1; WO2022079222A1; US20230383294A1

Abstract

本公开涉及靶向ANGPTL3的dsRNA，抑制ANGPTL3基因表达的方法，以及治疗与ANGPTL3基因表达相关病症的一种或多种方法。

Description

用于抑制ANGPTL3的新型RNA组合物和方法

序列表

本公开说明书中公开了作为参考品的核酸序列。根据出于专利事项目的的标准要求进行格式化的序列表中也示出了相同序列。如任一序列与标准序列表不一致，则本公开说明书中描述的序列应作为参考。

技术领域

本公开涉及靶向ANGPTL3的dsRNA，抑制ANGPTL3基因表达的方法，以及治疗与ANGPTL3基因表达相关一种或多种病症的方法。

背景技术

血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)是被认为参与脂质和葡萄糖代谢与血管生成的ANGPTL族成员。ANGPTL3也被称为血管生成素5、ANGPT5、FHBL2和ANL3，是一种调节血脂水平的54kDa肝分泌蛋白，包括血浆甘油三酯(TG)水平、极低密度脂蛋白(VLDL)水平、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)水平。ANGPTL3抑制脂蛋白脂肪酶和内皮脂肪酶介导的TG和磷脂水解(Tikka等，《内分泌》(2016年)52(2)：187-93)。通过促成肥胖、高血压、高胆固醇水平、高血糖、糖尿病和代谢综合征等风险因素，血浆甘油三酯水平(例如，150mg/dL或更高)和LDL水平(例如，130mg/dL或更高)的升高，以及HDL水平(例如，60mg/dL或更低)的降低显著增加了心脏病、心肌梗死、中风和动脉粥样硬化等心血管病的风险。超高血浆甘油三酯水平(例如，500mg/dL或更高)显著增加了胰腺炎的风险。

WO2012/177784披露了血管生成素样(ANGPTL3)RNA组合物及其使用方法。

双链RNA分子(dsRNA)已被证明可在被称为RNA干扰(RNAi)的一种高度保守的调控机制中阻断基因表达。这似乎是一种不同于反义寡核苷酸、抗miRNA分子和同型替代抗体等单链寡核苷酸的作用机制。在RNA干扰技术中，小干扰RNA(siRNA)等双链RNA与RNA诱导沉默复合体(”RISC”)结合，其中一条链(“随从链”或“正义链”)被替代，剩下的一条链(“导向链”或“反义链”)与RISC合作，以结合互补RNA(靶向RNA)。一旦结合，靶向RNA被RISC中的RNA内切酶AGO蛋白质(AGO)裂解，随后被RNA外切酶进一步降解。RNAi现在已用于开发一类新的治疗剂，用于治疗由基因的异常表达或不必要表达引发的紊乱。

由于ANGPTL3在调节甘油三酯和脂质代谢方面的重要性，以及与甘油三酯和LDL水平升高相关的疾病的流行，有必要继续确定ANGPTL3表达的抑制剂，并且测试这些抑制剂的功效和细胞毒性等不良副作用。

发明内容

本文提供了用于抑制ANGPTL3基因表达的dsRNA。本文提供的dsRNA可将升高的甘油三酯水平、VLDL水平和/或LDL水平降到正常范围内，或维持正常的甘油三酯水平，从而全面提高健康。本公开的RNA制剂可用于治疗脂代谢紊乱等病症，其全部或部分特征是TG和/或LDL胆固醇(LDL-c)水平升高(例如，高甘油三酯血症，和家族性复合高脂血症、家族性高胆甾醇血症(诸如纯合子家族性高胆固醇血症或HoFH)等高脂血症，以及多基因性高胆固醇血症)。本公开的RNA制剂还可用于降低TG和LDL-c水平升高的患者的患心血管的风险(例如，动脉粥样硬化、动脉硬化、心脏病、心肌梗死和中风)。

因此，提供了一种双链核糖核酸(dsRNA)，所述dsRNA通过靶向人血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)基因RNA转录物上的靶序列来抑制ANGPTL3基因表达，其中所述dsRNA包括包含正义序列的正义链和包含反义序列的反义链，其中所述正义序列与所述靶序列至少是90％相同的，并且其中所述靶序列为SEQ ID NO：1181的核苷酸135-153、143-161、143-163、144-162、145-163、150-168、151-169、1528-1546、1530-1548、1532-1550、1533-1551、1535-1553、1602-1620、2612-2630或2773-2791。在一些实施例中，本发明的dsRNA的正义链与反义链在15至25个连续核苷酸的区域中相互互补。在一些实施例中，正义链与反义链的长度不超过30个核苷酸。

在一些实施例中，本dsRNA的靶序列是SEQ ID NO：1181的核苷酸135-153、143-161、143-163、144-162、145-163、150-168、151-169、1528-1546、1530-1548、1532-1550、1533-1551、1535-1553、1602-1620、2612-2630或2773-2791。在进一步实施例中，靶序列为SEQ ID NO：1181的核苷酸135-153、143-161、144-162、145-163、150-168或1535-1553。在进一步实施例中，靶序列为核苷酸143-161、1535-1553和135-153。如本文所用，定义为SEQ IDNO：Z的“x-y”范围的靶序列由从SEQ ID NO：Z的核酸序列的x位置的核苷酸开始并终止于y位置的核苷酸的靶序列组成。举例说明，为清楚起见，定义为“135-153”范围的靶序列包括从SEQ ID NO：1181的核酸序列的135位核苷酸开始到153位核苷酸结束的靶序列。

在一些实施例中，dsRNA包括反义序列，所述反义序列与选自SEQ ID NO：227-229、SEQ ID NO：261-265、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：343、SEQ ID NO：356、SEQ ID NO：379、SEQID NO：385、SEQ ID NO：386、和SEQ ID NO：426组成的组中的核苷酸序列至少是90％相同的。

在一些实施例中，本公开dsRNA的正义序列和反义序列是互补的，其中：a)所述正义序列包括选自SEQ ID NO：13-15、SEQ ID NO：47-51、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：129、SEQID NO：142、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、以及SEQ ID NO：212组成的组中的核苷酸序列；或b)所述反义序列包括选自SEQ ID NO：227-229、SEQ ID NO：261-265、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：343、SEQ ID NO：356、SEQ ID NO：379、SEQ ID NO：385、SEQ IDNO：386、以及SEQ ID NO：426组成的组中的核苷酸序列。

在一些实施例中，dsRNA的正义链和反义链分别包括以下核苷酸序列：a)SEQ IDNO：13(正义链)和SEQ ID NO：227(反义链)；b)SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：228；c)SEQ IDNO：15和SEQ ID NO：229；d)SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：261；e)SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：262；f)SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：263；g)SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：264；h)SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：265；i)SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：269；j)SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：343；k)SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：356；1)SEQ ID NO：165和SEQ ID NO：379；m)SEQ IDNO：171和SEQ ID NO：385；n)SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：386；或o)SEQ ID NO：212和SEQID NO：426。在一些实施例中，dsRNA的正义链和反义链分别包括以下核苷酸序列：a)SEQ IDNO：13和SEQ ID NO：227；b)SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：228；c)SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：229；d)SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：265；e)SEQ ID NO：165和SEQ ID NO：379；或f)SEQ IDNO：171和SEQ ID NO：385。

在一些实施例中，dsRNA包括一个或多个修饰核苷酸，其中一个或多个修饰核苷酸中的至少一个修饰核苷酸是2′-脱氧-2′-氟-核糖核苷酸、2′-脱氧核糖核苷酸或2′-O-甲基-核糖核苷酸。在进一步实施例中，dsRNA包括两个或多个2′-O-甲基-核糖核苷酸和两个或多个2′-脱氧-2′-氟-核糖核苷酸(例如，以交替模式)。在一些实施例中，正义序列和反义序列包括交替2′-O-甲基核糖核苷酸和2′-脱氧-2′-氟核糖核苷酸。

在一些实施例中，dsRNA在其正义链或反义链的3′端包括反式2′-脱氧核糖核苷酸。

在一些实施例中，本公开的dsRNA的正义链和反义链中的一条或两条进一步包括：a)包括一个或多个核苷酸的5′突出端；和/或b)包括一个或多个核苷酸的3′突出端。在进一步实施例中，dsRNA中的突出端包括两个或三个核苷酸。在某些实施例中，dsRNA中的突出端包括一个或多个胸腺嘧啶。

在一些实施例中，正义链包括从SEQ ID NO：441-443、SEQ ID NO：475-479、SEQ IDNO：483、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600和SEQ ID NO：640组成的组中选择的核苷酸序列；和/或反义链包括从由SEQ ID NO：655-657、SEQ ID NO：689-693、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：771、SEQ ID NO：784、SEQ ID NO：807、SEQ ID NO：813、SEQ ID NO：814和SEQ ID NO：854组成的组中选择的核苷酸序列。在进一步实施例中，dsRNA的正义链和反义链分别包括以下核苷酸序列：a)SEQ ID NO：441和SEQID NO：655；b)SEQ ID NO：442和SEQ ID NO：656；c)SEQ ID NO：443和SEQ ID NO：657；d)SEQID NO：475和SEQ ID NO：689；e)SEQ ID NO：476和SEQ ID NO：690；f)SEQ ID NO：477和SEQID NO：691；g)SEQ ID NO：478和SEQ ID NO：692；h)SEQ ID NO：479和SEQ ID NO：693；i)SEQID NO：483和SEQ ID NO：697；j)SEQ ID NO：557和SEQ ID NO：771；k)SEQ ID NO：570和SEQID NO：784；l)SEQ ID NO：593和SEQ ID NO：807；m)SEQ ID NO：599和SEQ ID NO：813；n)SEQID NO：600和SEQ ID NO：814；o)SEQ ID NO：640和SEQ ID NO：854。

在一些实施例中，dsRNA缀合至包含或者不包含连接子的一个或多个配体(例如，一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc))。在一些实施例中，配体是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，并且dsRNA缀合至一个或多个GalNAc。在一些实施例中，dsRNA是小干扰RNA(siRNA)。

在一些实施例中，dsRNA的一条或两条链包括具有以下结构的一种或多种化合物：

其中：

-B是杂环核碱基，

-L1和L2中的一个是连接式(I)化合物与链的核苷间连接基，L1和L2中的另一个是H、保护基、磷部分或连接式(I)化合物与链的核苷间连接基，

-Y是O、NH、NR1或N-C(＝O)-R1，其中R1是：

·(C1-C20)烷基，所述(C1-C20)烷基可选地由选自卤原子、(C1-C6)烷基，(C3-C8)环烷基、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基、(C5-C14)杂芳基、-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1，-CN、-C(＝J)-O-Z1、-O-C(＝J)-Z1、-C(＝J)-N(Z1)(Z2)、和-N(Z1)-C(＝J)-Z2中的一个或多个基团取代，其中

J是O或S，

Z1和Z2中的每一个独立地是H、(C1-C6)烷基，所述Z1和所述Z2中的每一个可选地由选自卤原子和(C1-C6)烷基的一个或多个基团取代，

·(C3-C8)环烷基，所述(C3-C8)环烷基可选地由选自卤原子和(C1-C6)烷基的一个或多个基团取代，

·-[C(＝O)]m-R2-(O-CH₂-CH₂)p-R3基，其中

m是为0或1的整数，

p是为0到10的整数，

R2是可选地由(C1-C6)烷基、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(＝K)-O-Z3、-O-C(＝K)-Z3、-C(＝K)-N(Z3)(Z4)、或-N(Z3)-C(＝K)-Z4取代的(C 1-C20)亚烃基，其中

K是O或S，

Z3和Z4中的每一个独立地是H、(C1-C6)烷基，所述Z3和所述Z4中的每一个可选地由选自卤原子和(C1-C6)烷基的一个或多个基团取代，和

R3选自由氢原子、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C3-C8)环烷基、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基或(C5-C14)杂芳基组成的组，

或者R3是细胞靶向部分，

-X1和X2分别独立地是氢原子、(C1-C6)烷基，并且

-Ra、Rb、Rc和Rd中的每一个独立地是H或(C1-C6)烷基，

或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，本公开的dsRNA包括一个或多个式(I)化合物，其中Y是：

a)NR1，R1是非取代(C1-C20)烷基；

b)NR1，R1是非取代(C1-C16)烷基，所述非取代(C1-C16)烷基包括选自由甲基、异丙基、丁基、辛基和十六烷基组成的组中的烷基；

c)NR1，R1是(C3-C8)环烷基，所述(C3-C8)环烷基可选地由选自卤原子和(C1-C6)烷基的一个或多个基团取代；

d)NR1，R1是环己基；

e)NR1，R1是由(C6-C14)芳基取代的(C1-C20)烷基；

f)NR1，R1是由苯基取代的甲基；

g)N-C(＝O)-R1，R1是可选地取代的(C1-C20)烷基；或

h)N-C(＝O)-R1，R1是甲基或十五烷基。

在一些实施例中，本公开的dsRNA包括一个或多个式(I)化合物，B选自由嘧啶、取代嘧啶、嘌呤和取代嘌呤组成的组，或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，本公开的dsRNA包括一个或多个式(I)化合物，R3属于式(II)：

其中A1、A2和A3是OH，

A4是OH或NHC(＝O)-R5，其中R5是(C1-C6)烷基，所述(C1-C6)烷基可选地由卤原子取代，或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，本公开的dsRNA包括一个或多个式(I)化合物，R3是N-乙酰半乳糖胺，或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，本公开的dsRNA包括表A和表B的一个或多个核苷酸。

在一些实施例中，本公开的dsRNA包括2至10个式(I)化合物，或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，本公开的dsRNA包括正义链上的2至10个式(I)化合物。

在一些实施例中，在本公开的dsRNA中，正义链在5′端包括2至5个式(I)化合物和/或在3′端包括1至3个式(I)化合物。

在一些实施例中，在本公开的dsRNA中：

a)位于所述正义链的5′端上的2至5个式(I)化合物包括1gT3和/或1gT7，可选地包括3个连续1gT3核苷酸；并且/或者

b)位于所述正义链的3′端上的1至3个式(I)化合物包括1T4和/或1T3，可选地包括2个连续lT4。

在一些实施例中，本公开的dsRNA包括一个或多个独立选自磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸烷基酯和磷酰胺基主链连接基组成的组的核苷间连接基，或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，本公开的dsRNA选自表1至表3中的dsRNA。

在一些实施例中，正义链包括选自SEQ ID NO：858、SEQ ID NO：902、SEQ ID NO：907、SEQ ID NO：911、SEQ ID NO：915、SEQ ID NO：934、SEQ ID NO：970、SEQ ID NO：979和SEQ ID NO：988组成的组中的核苷酸序列；而反义链包括选自SEQ ID NO：1020、SEQ ID NO：1064、SEQ ID NO：1069、SEQ ID NO：1073、SEQ ID NO：1077、SEQ ID NO：1096、SEQ ID NO：1132、SEQ ID NO：1141和SEQ ID NO：1150组成的组中的核苷酸序列。

在一些实施例中，dsRNA的正义链和反义链分别包括以下核苷酸序列：a)SEQ IDNO：858和SEQ ID NO：1020；b)SEQ ID NO：902和SEQ ID NO：1064；c)SEQ ID NO：907和SEQID NO：1069；d) SEQ ID NO：91 1和SEQ ID NO：1073；e)SEQ ID NO：915和SEQ ID NO：1077；f)SEQ ID NO：934和SEQ ID NO：1096；g)SEQ ID NO：970和SEQ ID NO：1 132；h)SEQ ID NO：979和SEQ ID NO：1 141；i)SEQ ID NO：988和SEQ ID NO：1150。

本公开进一步提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本文所述的dsRNA或DNA载体，以及药学上可接受的赋形剂。本公开进一步提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本文所述的dsRNA以及药学上可接受的赋形剂。

本公开内容还提供了本dsRNA、DNA载体或组合物，所述dsRNA、DNA载体或组合物用于抑制ANGPTL3在有此需要的人类中的表达，或用于治疗或预防有此需要的人类中的ANGPTL3相关病症。本公开还提供了dsRNA或包含其的组合物，所述dsRNA或包含其的组合物用于抑制有此需要的人类中的ANGPTL3表达。在一个特定实施例中，人类肝脏中的ANGPTL3基因表达被dsRNA抑制。本公开还提供了dsRNA或包含其的组合物，所述dsRNA或包含其的组合物用于治疗或预防有此需要的人类中的ANGPTL3相关病症。在一个特定实施例中，ANGPTL3相关病症为脂代谢紊乱。在一个特定实施例中，脂代谢紊乱是高甘油三酯血症。

本公开进一步提供了一种抑制ANGPTL3表达，或通过向该哺乳动物施用本公开的dsRNA或组合物，治疗或预防有此需要的哺乳动物(例如，人类)中的ANGPTL3相关病症的方法。

本公开进一步提供了本公开的dsRNA在制造抑制ANGPTL3表达，或治疗或预防有此需要的哺乳动物(例如，人类)中的ANGPTL3相关病症的药物以及制品(例如，试剂盒)的用途。

在一些实施例中，dsRNA抑制了治疗方法中哺乳动物(例如，人类)肝脏中的ANGPTL3基因表达。在某些实施例中，ANGPTL3相关病症是脂代谢紊乱，例如高甘油三酯血症和相关疾病和病症(诸如动脉粥样硬化、胰腺炎等)，高脂血症(家族性复合高脂血症)，家族性高胆甾醇血症(诸如HoFH等)和多基因性高胆固醇血症。

附图说明

图1A、图1B和图1C是示出了用0.1nM或1nM的164个试验siRNA分别进行处理后，人Hep3B细胞裂解液中ANGPTL3 mRNA表达的RT-qPCR分析图。mRNA表达相对于用非靶向siRNA对照处理的细胞来表示。误差条表示标准偏差。

图2是示出了18个所选试验siRNA在人Hep3B细胞中的细胞毒性作用的图。在分析细胞活力(CellTiter-Glo测定法)和细胞毒性(ToxiLight测定法)之前，用5nM或50nM的siRNA对细胞进行处理。所得读数的比值相对于非靶向siRNA对照的结果来表示。误差条表示标准偏差。

图3是示出了从三个供体分离，并且向用所选GalNAc缀合siRNA靶向ANGPTL3或对照转染的人外周血单核细胞(PBMC)的上清液中释放的干扰素α(IFNα)蛋白量的免疫刺激图。蛋白质浓度通过ELISA测定。误差条表示标准偏差。

图4是示出了11个所选GalNAc缀合测试siRNA在人原代肝细胞中的细胞毒性作用的图。在分析细胞活力(CellTiter-Glo测定法)和细胞毒性(ToxiLight测定法)之前，用1nM、5nM或25nM的siRNA对细胞进行处理。与毒性阳性对照和非靶向siRNA对照相比，相对于未处理对照的结果示出所得读数的比值。误差条表示标准偏差。

图5是示出了通过ELISA测定，ANGPTL3蛋白分泌到用11种所选靶向ANGPTL3的GalNAc-siRNA(自由摄取)处理的人原代肝细胞上清液中的ANGPTL3蛋白量图。误差条表示标准偏差。

图6是示出了分别用10nM、100nM或1000nM的11种所选GalNAc-siRNA(加上核苷酸对照)处理(自由摄取)后，在人原代肝细胞中观察到的相对mRNA表达(通过qPCR测定)及蛋白质表达(通过ELISA测定)之间的相关性。

图7是示出了在第0天用12mg/kg的所选GalNAc-siRNA进行皮下处理的小鼠血清ANGPTL3蛋白水平的图。经治疗的小鼠通过肝特异性腺相关病毒载体来表达人ANGPTL3。人ANGPTL3水平通过ELISA进行量化，误差条表示SEM。误差条表示标准偏差。

图8是示出了分别用0.1nM或1nM的另外52个试验siRNA处理后，人Hep3B细胞裂解液中ANGPTL3 mRNA表达的RT-qPCR分析图。mRNA表达相对于用非靶向siRNA对照处理的细胞来表示。误差条表示标准偏差。

图9是示出了分别用0.1nM和1nM的另外52个试验siRNA处理后，食蟹猴原代肝细胞裂解液中ANGPTL3 mRNA表达的RT-qPCR分析图。mRNA表达相对于用非靶向siRNA对照处理的细胞来表示。误差条表示标准偏差。

图10是示出了11个其它试验siRNA在人Hep3B细胞中的细胞毒性作用的图。在分析细胞活力(CellTiter-Glo测定法)和细胞毒性(ToxiLight测定法)之前，用5nM或50nM的siRNA对细胞进行处理。所得读数的比值相对于非靶向siRNA对照的结果来表示。误差条表示标准偏差。

图11是示出了从三个供体分离，并且向用所选GalNAc缀合siRNA靶向ANGPTL3或对照转染的人外周血单核细胞(PBMC)的上清液中释放的干扰素α(IFNα)蛋白量的免疫刺激图。蛋白质浓度通过ELISA测定。误差条表示标准偏差。

图12是示出了在自由摄取后，6个所选GalNAc缀合测试siRNA在人原代肝细胞中的细胞毒性作用的图。在分析细胞活力(CellTiter-Glo测定法)和细胞毒性(ToxiLight测定法)之前，用1nM、5nM或25nM的siRNA对细胞进行处理。与毒性阳性对照、非靶向siRNA对照和从第一轮筛选中选择的两个siRNA相比，相对于未处理对照的结果示出所得读数的比值。误差条表示标准偏差。

图13是示出了ANGPTL3蛋白分泌到用4种靶向ANGPTL3的所选GalNAc-siRNA(自由摄取)处理，通过ELISA测定的人原代肝细胞上清液中的量的图。从第一轮筛选中选择的两个siRNA作为参考。误差条表示标准偏差。

图14是示出了在第0天用10mg/kg从两轮筛选中选择的GalNAc-siRNA来皮下处理小鼠的血清ANGPTL3蛋白水平的图。经治疗的小鼠通过肝特异性腺相关病毒载体来表达人ANGPTL3。人ANGPTL3水平通过ELISA进行量化，误差条表示SEM。误差条表示标准偏差。

图图15A至图15F是示出了在自由摄取条件下，用1nM、10nM或100nM基于亲本siRNA#013-c(图15A和图15B)、siRNA#051-c(图15C和图15D)和siRNA#165-c(图15E和图15F)的3x54个测试siRNA处理细胞72小时后，原代人肝细胞中ANGPTL3 mRNA表达的RT-qPCR分析图。mRNA表达相对于用LV2非靶向siRNA对照处理的细胞来表示。误差条表示标准偏差。

图16是示出了从三个供体分离，并且在24小时内向用浓度为100nM的24种所选被修饰GalNAc ANGPTL3 siRNA以及各自的亲本序列(siRNA#013-c、siRNA#051-c和siRNA#165-c)或对照进行转染的人外周血单核细胞(PBMC)的上清液中释放的干扰素α2a(IFN-α2a)蛋白量的免疫刺激图。蛋白质浓度通过ELISA测定。误差条表示标准偏差。

图17是示出了24个修饰GalNAc ANGPTL3 siRNA以及各自的亲本序列(siRNA#013-c、siRNA#051-c和siRNA#165-c)对人Hep3B细胞的细胞毒性作用的图。在分析细胞活力(CellTiter-Glo测定法)和细胞毒性(ToxiLight测定法)之前，用浓度为5nM或50nM的siRNA对细胞转染72小时。所得读数的比值相对于非靶向siRNA对照的结果来表示。误差条表示标准偏差。

图18A、图18B和图18C是示出了在第0天用5mg/kg的所选GalNAc-siRNA进行皮下处理的小鼠血清ANGPTL3蛋白水平的图。它们示出了基于亲本序列siRNA#013-c(图18A)、siRNA#051-c(图18B)和siRNA#165-c(图18C)的3x8siRNA的结果。经治疗的小鼠通过肝特异性腺相关病毒载体来表达人ANGPTL3。人ANGPTL3水平通过ELISA进行量化，误差条表示SEM。误差条表示平均值的标准误差(SEM)。

具体实施方式

本公开提供了抑制血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)基因表达的新型双链RNA(dsRNA)。在一些实施例中，dsRNA是小干扰RNA(siRNA)。dsRNA可用于治疗脂代谢紊乱(例如，血脂异常、混合血脂异常、高甘油三酯血症和胰腺炎等相关疾病)等病症。除非另有说明，″ANGPTL3″是指本文的人ANGPTL3。人ANGPTL3蛋白的mRNA序列可在NCBI参考序列号NM_014495.3(SEQ ID NO：1181)中找到，并且其多肽序列可在NCBI参考序列号NP_055310.1(SEQ ID NO：1182)中找到。在某些实施例中，本公开是指食蟹猴ANGPTL3。食蟹猴ANGPTL3蛋白的mRNA序列可在NCBI参考序列号XM_005543185.1(SEQ ID NO：1183)中找到，并且其多肽序列可在NCBI参考序列号XP_005543242.1(SEQ ID NO：1184)中找到。

本公开的dsRNA(例如，包括或不包括GalNAc部分的dsRNA)可具有以下一个、两个、三个或全部四个特性：(i)在体外具有至少24、26、28、30、32、48、52、56、60、72、96或168小时的半衰期；(ii)不增加人原代PMBC分泌的干扰素α的产生；(iii)具有不大于0.001、0.01、0.1、0.3、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10nM的IC₅₀值，用于抑制人ANGPTL3在体外的表达(例如，在如下文工作实例所述的人Hep3B细胞、人原代肝细胞或食蟹猴原代肝细胞中)；以及(iv)在表达人ANGPTL3的C57BL/6小鼠体内，将ANGPTL3的蛋白水平降低至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％(例如，以5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg或更多的量)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA包括GalNAc部分，并且具有以下一个、两个、三个或全部四个特性：(i)在体外的半衰期至少为24、48、72、96或168小时；(ii)不增加人原代PMBC分泌的干扰素α的产生，(iii)具有不大于9.68nM的IC₅₀值，以用于抑制人或食蟹猴原代肝细胞的体外人ANGPTL3表达；和(iv)在进行单次皮下注射5mg/kg的剂量后，降低表达人ANGPTL3的C57BL/6小鼠体内的人ANGPTL3的蛋白水平至少60％。在某些实施例中，dsRNA具有所有所述特性。

本领域的技术人员将理解，本文所述的dsRNA在自然界中并不存在(“分离型”dsRNA)。

I.双链RNA

本公开的某些方面涉及靶向ANGPTL3的双链核糖核酸(dsRNA)分子。如本文所用，术语“双链RNA“或“dsRNA“是指由具有两条反平行和基本互补核酸链的双链结构组成的寡核糖核苷酸分子。形成双链结构的两条链可为一个较大RNA分子的不同部分，也可位于不同的RNA分子上。当两条链位于不同的RNA分子上时，dsRNA结构可作为短干扰RNA(siRNA)发挥作用。如果两条链是一个较大分子的一部分，并且在第一条链的3′端和第二条链的5′端之间由一条不间断核苷酸链连接，则连接RNA链被称为“发夹环”，并且RNA分子可被称为“短发夹RNA“或“shRNA”。RNA链可具有相同或不同数量的核苷酸。除双链结构外，dsRNA还可包括一个或多个(如1、2或3个)核苷酸的突出端。如下文进一步所述，本公开的dsRNA可进一步包括如下所述的靶向部分(包括或不包括连接子)。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指长度至少为10个碱基的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式，或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式。

“dsRNA”可包括自然生成的核糖核苷酸和/或其化学修饰类似物。如本文所用，“dsRNA”不限于包括含核糖的核苷酸。本文中的dsRNA包含双链多核苷酸分子，其中只要生成的双链分子能够通过RNA干扰抑制靶基因的表达，则双链多核苷酸分子的部分或全部核苷酸中的核糖部分已被另一部分取代。dsRNA还可包括一种或多种、但不超过60％(例如，不超过50％、40％、30％、20％或10％)的脱氧核糖核苷酸或其化学修饰类似物。

本公开的dsRNA包括包含正义序列的正义链和包含反义序列的反义链，其中正义链与反义链充分互补以杂交形成双链结构。术语“反义序列”是指与细胞中的靶RNA序列基本或完全互补并且在生理条件下结合的序列。“靶序列”是指信使RNA分子(例如，原代RNA转录物或信使RNA转录物)上转录自靶基因(例如，如ANGPTL3基因)的核苷酸序列。术语“正义序列”是指与反义序列基本或完全互补的序列。

本公开的ANGPTL3靶向dsRNA包括包含正义序列的正义链以及包含反义序列的反义链，其中正义序列与反义序列彼此基本互补或完全互补。除非另有说明，术语“互补”在本文中是指包含第一连续核苷酸序列的多核苷酸在某些条件下(例如，生理条件下)，与包含第二连续核苷酸序列的另一多核苷酸杂交并形成双链结构的能力。这可包括在第一或第二连续核苷酸序列的整个长度上的两个多核苷酸的碱基配对；在这种情况下，这两个核苷酸序列被认为是彼此“完全互补”的。例如，在dsRNA包含长度为21个核苷酸的第一寡核苷酸和长度为23个核苷酸的第二寡核苷酸，以及两个寡核苷酸形成21个连续碱基对的情况下，两个寡核苷酸可被视为彼此“完全互补”。如果第一多核苷酸序列被称为与第二多核苷酸序列“基本互补”时，两个序列可在其杂交长度的80％以上(例如，90％以上)彼此进行碱基配对，其中不匹配碱基对不超过20％(例如，不超过10％)，例如对于20个核苷酸的双链，不超过4种或不超过2种不匹配碱基对。如果两个寡核苷酸设计为形成包括一个或多个单链突出端的双链，则突出端不应视为用于确定互补性的不匹配。两个序列的互补性可基于沃森-克里克碱基对和/或非沃森-克里克碱基对。如本文所用，与mRNA的“至少一部分基本互补”的多核苷酸是指与相关mRNA的相邻部分(例如，编码ANGPTL3的mRNA)基本互补的多核苷酸。

在一些实施例中，ANGPTL3靶向dsRNA是其中正义链与反义链彼此没有共价连接的siRNA。在一些实施例中，ANGPTL3靶向dsRNA的正义链和反义链彼此共价连接，例如通过发夹环(诸如在shRNA的情况下)，或通过发夹环以外的方式(诸如通过称为“共价接头”的连接结构)。

I.1长度

在一些实施例中，(在正义链中的)正义序列和(在反义链中)反义序列中的每一个序列长度为9-30个核苷酸。例如，每个序列可为上限是21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，以及独立选择下限是9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的核苷酸长度范围中的任何一个序列。在一些实施例中，每个序列中的核苷酸数量可为15-25、15-30、16-29、17-28、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22或19-21。

在一些实施例中，每个序列的长度大于8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施例中，每个序列的长度小于21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个核苷酸。在一些实施例中，每个序列的长度为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。

在一些实施例中，正义序列和反义序列的长度分别为至少15个且不大于25个核苷酸。在一些实施例中，正义序列和反义序列的长度分别为至少19个且不大于25个核苷酸。例如，序列长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。

正义序列和反义序列的长度可以相同或不同。例如，反义序列可包括21个核苷酸，而正义序列可包括23个核苷酸。在另一个示例中，反义序列包括19个核苷酸，正义序列包括19个核苷酸。

在一些实施例中，ANGPTL3靶向dsRNA具有相同长度或不同的正义链和反义链。例如，正义链可比反义链长1、2、3、4、5、6或7个核苷酸。或者，正义链可比反义链短1、2、3、4、5、6或7个核苷酸。

在一些实施例中，正义链和反义链中的每一条长度为9-36个核苷酸。例如，每条链可为上限是21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36，以及独立选择下限是9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的核苷酸长度范围中的任何一个序列。在一些实施例中，每条链中的核苷酸数量可为15-25、15-30、16-29、17-28、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22或19-21。

在一些实施例中，每条链的长度大于8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施例中，每条链的长度小于20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37个核苷酸。在一些实施例中，每条链的长度为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸。

在一些实施例中，正义链和反义链的长度分别为至少15个且不大于25个核苷酸。在一些实施例中，正义链和反义链的长度分别为至少19个且不大于23个核苷酸。例如，链的长度为19、20、21、22或23个核苷酸。

在一些实施例中，正义链可包括21、22、23、24或25个核苷酸(包括任一修饰核苷酸)，而反义链可包括21、22或23个核苷酸(包括任一修饰核苷酸)。在某些实施例中，正义链可包括具有19、20或21个核苷酸的正义序列，而反义链可包括具有19、20或21个核苷酸的反义序列。

I.2突出端

在一些实施例中，本公开的dsRNA在一条或两条正义链和反义链的3′端、5′端或两端包括一个或多个突出端。在一些实施例中，一个或多个突出端提高了dsRNA的稳定性和/或抑制活性。

本文中的“突出端”是指当dsRNA的第一条链的3′端延伸超过第二条链的5′端时，从dsRNA的双链结构突出的未成对核苷酸，反之亦然。“钝端”是指dsRNA端没有未配对核苷酸，即没有核苷酸突出端。“钝端”dsRNA是一种其整个长度都是双链的dsRNA，即在双链分子的两端没有核苷酸突出端。本文在确定dsRNA是否具有突出端时，不考虑缀合至dsRNA的3′端和/或5′端的化学帽或非核苷酸化学部分。

在一些实施例中，突出端包括一种或多种、两种或多种、三种或多种、或四种或多种核苷酸。例如，突出端可包括1、2、3或4个核苷酸。

在一些实施例中，本公开的突出端包括一种或多种核苷酸(例如，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，其自然生成或化学修饰类似物)。在一些实施例中，突出端包括一种或多种胸腺嘧啶或其化学修饰类似物。在某些实施例中，突出端包括一种或多种胸腺嘧啶。

在一些实施例中，dsRNA包括位于反义链3′端的突出端。在一些实施例中，dsRNA包括位于反义链5′端的钝端。在一些实施例中，dsRNA包括位于反义链3′端的突出端和位于反义序列5′端的钝端。在一些实施例中，dsRNA包括位于正义链3′端的突出端。在一些实施例中，dsRNA在正义链5′端包括钝端。在一些实施例中，dsRNA包括位于正义链3′端的突出端和位于正义链5′端的钝端。在一些实施例中，dsRNA包括位于dsRNA的正义链和反义链的3′端的突出端。

在一些实施例中，dsRNA包括位于反义链5′端的突出端。在一些实施例中，dsRNA包括位于反义链3′端的钝端。在一些实施例中，dsRNA包括位于反义链5′端的突出端和位于反义序列3′端的钝端。在一些实施例中，dsRNA包括位于正义链5′端的突出端。在一些实施例中，dsRNA包括位于正义链3′端的钝端。在一些实施例中，dsRNA包括位于正义链5’端的突出端和位于正义链3′端的钝端。在一些实施例中，dsRNA包括位于dsRNA的正义链5′端和反义链5′端的突出端。

在一些实施例中，dsRNA包括位于反义链3′端的突出端和位于反义链5′端的突出端。在一些实施例中，dsRNA包括位于正义链3′端的突出端和位于正义链5′端的突出端。

在一些实施例中，dsRNA具有两个钝端。

在一些实施例中，突出端是由于正义链比反义链长导致的。在一些实施例中，突出端是由于反义链比正义链长导致的。在一些实施例中，突出端是相同长度的正义链和反义链交错导致的。在一些实施例中，突出端与靶mRNA形成不匹配。在一些实施例中，突出端与靶mRNA互补。

在某些实施例中，本公开的dsRNA包含具有5′-CCA-[正义序列]-invdT序列的正义链和具有5’-[反义序列]-dTdT-3′序列的反义链，其中三核苷酸CCA可被修饰(例如，2′-O-甲基-C和2′-O-甲基-A)。

I.3靶序列和dsRNA序列

本公开的dsRNA反义链包括反义序列，该反义序列可与ANGPTL3 RNA(例如，mRNA)中长度为12-30个核苷酸的靶序列基本或完全互补。例如，靶序列可为上限是19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，以及独立选择下限是12、13、14、15、16、17、18或19的核苷酸长度范围中的任何一个序列。在一些实施例中，靶序列中的核苷酸数量可为15-25、15-30、16-29、17-28、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22或19-21。

在一些实施例中，靶序列的长度大于12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施例中，靶序列的长度小于21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施例中，靶序列的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在某些实施例中，靶序列的长度为至少15个且不大于25个核苷酸；例如，长度为至少19个且不大于23个核苷酸，或长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。

靶序列可能位于ANGPTL3 mRNA转录物的5′非编码区、编码区或3′非编码区域中。靶序列也可位于编码区和非编码区的交界处。

在一些实施例中，dsRNA反义链包括与靶序列具有一种或多种不匹配(例如，一种、两种、三种或四种不匹配)的反义序列。在某些实施例中，反义序列与人ANGPTL3 mRNA序列中的相应部分完全互补，并且与食蟹猴ANGPTL3 mRNA序列中的相应部分完全或基本互补(例如，包括至少一种或两种不匹配)。这种dsRNA的一个优点是，允许对食蟹猴等非人灵长类动物中的dsRNA进行临床前体内研究。在某些实施例中，dsRNA正义链包括与靶序列(例如，在人或食蟹猴ANGPTL3 mRNA中)至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的正义序列。

在一些实施例中，人ANGPTL3 mRNA序列(SEQ ID NO：1181)中的靶序列在以下核苷酸135和153、143和161、143和163、144和162、145和163、1 50和168、151和169、1528和1546、1530和1548、1532和1550、1533和1551、1535和1553、1602和1620、2612和2630、以及2773和2791处或附近(例如，在其3个核苷酸内)具有起始和终止核苷酸位置。在一些实施例中，靶序列的起始核苷酸位置在135和151之间，终止核苷酸位置在153和169之间；或者起始核苷酸位置在1528和1535之间，终止核苷酸位置在1546和1553之间。在某些实施例中，靶序列对应于人ANGPTL3 mRNA序列的核苷酸位置135-153、143-161、144-162、145-163、150-168、或1535-1553，其中起始和终止位置可在编号位置的3个核苷酸内变化。在一些实施例中，靶序列是表1中列出的作为正义序列的序列，或者包含所列序列的至少80％核苷酸(例如，至少90％)的序列。

在一些实施例中，本公开的dsRNA包括包含表1中所示正义序列的正义链。例如，所述正义链包括选自SEQ ID NO：13-15、SEQ ID NO：47-51、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、和SEQ ID NO：212的序列或具有源自所述所选序列的至少15、16、17或18个连续核苷酸的序列。在某些实施例中，正义链包括从SEQ ID NO：13-15、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：165和SEQ ID NO：171中选择的序列。

在一些实施例中，本公开的dsRNA包括反义链，所述反义链包含表1中所示的反义序列。在一些实施例中，反义链包括从SEQ ID NO：227-229、SEQ ID NO：261-265、SEQ IDNO：269、SEQ ID NO：343、SEQ ID NO：356、SEQ ID NO：379、SEQ ID NO：385、SEQ ID NO：386和SEQ ID NO：426中选择的序列，或具有至少15、16、17或18个来自所述所选序列的连续核苷酸的序列。在某些实施例中，反义链包括从SEQ ID NO：227-229、SEQ ID NO：265、SEQ IDNO：379和SEQ ID NO：385中选择的序列。

在一些实施例中，本公开的dsRNA包括包含表1中所示的正义序列的正义链和包含表1中所示的反义序列的反义链。在一些实施例中，正义链和反义链分别包括以下序列：

SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：227；

SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：228；

SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：229；

SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：261；

SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：262；

SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：263；

SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：264；

SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：265；

SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：269；

SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：343；

SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：356；

SEQ ID NO：165和SEQ ID NO：379；

SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：385；

SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：386；或

SEQ ID NO：212和SEQ ID NO：426。

在某些实施例中，正义链和反义链分别包括以下序列：

SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：227；

SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：228；

SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：229；

SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：265；

SEQ ID NO：165和SEQ ID NO：379；或

SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：385。

在一些实施例中，反义序列与选自SEQ ID NO：13-15、SEQ ID NO：47-51、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：212的序列完全互补。在一些实施例中，反义序列与选自SEQ ID NO：13-15、SEQID NO：47-51、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：212的序列基本互补，其中反义序列包括与所选序列的至少一种不匹配(例如，一种、两种、三种或四种不匹配)。

在一些实施例中，反义序列与选自SEQ ID NO：13-15、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：165和SEQ ID NO：171的序列完全互补。在一些实施例中，反义序列与选自SEQ ID NO：13-15、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：165和SEQ ID NO：171的序列基本互补，其中反义序列包括与所选序列的至少一种不匹配(例如，一种、两种、三种或四种不匹配)。

在一些实施例中，ANGPTL3靶向dsRNA的反义序列包括与靶序列的一种或多种不匹配(例如，由于普通人群中个体之间的等位差异)。例如，反义序列包括与靶序列的一种或多种不匹配(例如，一种、两种、三种或四种不匹配)。在一些实施例中，一种或多种不匹配不位于互补区域的中心。在一些实施例中，一种或多种不匹配位于互补区的5′端和/或3′端的五个、四个、三个、两个或一个核苷酸内。例如，对于含有19个核苷酸反义序列的dsRNA，在一些实施例中，反义序列在其与ANGPTL3 mRNA中的靶序列之间的互补区域的中心9个核苷酸内可能不包含任何不匹配。

下面的表1列出了示例性siRNA构建体(CNST)的正义序列和反义序列。NM_014495.3(SEQ ID NO：1181)中的起始(ST)和终止(ED)核苷酸位置被标明。“SEQ”表示SEQID NO。

表1 siRNA构建体的序列

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I.4核苷酸修饰

本公开的dsRNA可包括一个或多个修饰，以提高细胞摄取、对靶序列的亲和力、抑制活性和/或稳定性等。修饰可包括本领域已知的任何修饰，包括末端修饰、碱基修饰、糖修饰/糖替代和主链修饰等。末端修饰可包括，5′端修饰(例如，磷酸化、缀合和反式键)和3′端修饰(例如，缀合、DNA核苷酸和反式键)。碱基修饰可包括用稳定碱基、不稳定碱基或与扩展的碱基配对的碱基替代、去除碱基(核苷酸的脱碱基修饰)、或缀合碱基等。糖修饰或糖替代可包括在糖配基的2′或4′位置的修饰或糖配基的替代。主链修饰可包括包含一种或多种硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯、磷酸酯和磷酰胺的磷酸二酯键的修饰或替代。

如本文所用，术语“核苷酸“包括自然生成核苷酸或修饰核苷酸，或替代物置换部分(surrogate replacement moiety)。修饰核苷酸是一种非自然生成的核苷酸，在本文中也被称为“核苷酸类似物”。本领域的普通技术人员将理解，核苷酸中的鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶可被其它部分取代，而不会大大改变修饰核苷酸的碱基配对特性。例如，由肌苷作为碱基的核苷酸可与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此，在本公开的核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可被含有肌苷等的核苷酸取代。包含此类取代部分的序列作为本公开的实施例。修饰核苷酸也可为其核糖部分被非核糖部分取代的核苷酸。

本公开的dsRNA可包括本领域已知的一种或多种修饰核苷酸，包括但不限于：2′-O-甲基修饰核苷酸、2′-氟修饰核苷酸、2′-脱氧修饰核苷酸、2′-O-甲氧基乙基修饰核苷酸、包含硫代磷酸酯和硫代磷酸酯等交替核苷酸间连键的修饰核苷酸、磷酸三酯修饰核苷酸、末端连接到胆固醇衍生物或亲脂部分的修饰核苷酸、肽核酸(PNA；参见例如Nielsen等人，《科学》(1991年)254：1497-500)，约束乙基(cEt)修饰核苷酸，反式脱氧修饰核苷酸，反式双脱氧修饰核苷酸，锁核酸修饰核苷酸，核苷酸的脱碱基修饰，2′-氨基修饰核苷酸，2′-烷基修饰核苷酸，吗啉修饰核苷酸，磷酸化修饰核苷酸，包含位于寡核苷酸糖或碱基其它位点的修饰的修饰核苷酸，以及含有非自然碱基的修饰核苷酸。在一些实施例中，一个或多个修饰核苷酸中的至少一个修饰核苷酸是2′-O-甲基核苷酸、5′-硫代磷酸酯核苷酸、或与胆固醇衍生物、亲脂性靶向部分或其它靶向部分连接的末端核苷酸。在寡核苷酸的核苷酸中加入2′-O-甲基、2′-O-乙基、2′-O-丙基、′-O-烷基、2′-O-氨基烷基或2′-脱氧-2′-氟(即2′-氟)基团可赋予寡核苷酸增强的杂交特性和/或增强的核酸酶稳定性。此外，含有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸(例如，位于dsRNA的一个或多个位置的两个相邻核苷酸之间的硫代磷酸酯键)可具有增强的核酸酶稳定性。在一些实施例中，dsRNA可包含具有修饰核糖的核苷酸，例如锁核酸(LNA)单元。

在一些实施例中，本公开的dsRNA包括一个或多个2′-O-甲基核苷酸和一个或多个2′-氟核苷酸。在一些实施例中，dsRNA包括两个或多个2′-O-甲基核苷酸和两个或多个2′-氟核苷酸。在一些实施例中，dsRNA包括呈交替模式(例如，OMe-F-OMe-F模式或F-OMe-F-OMe模式)的两个或多个2′-O-甲基核苷酸(OMe)和两个或多个2′-氟核苷酸(F)。在一些实施例中，dsRNA包括多达10个的连续核苷酸，每个核苷酸都是2′-O-甲基核苷酸。在一些实施例中，dsRNA包括多达1 0个连续核苷酸，每个核苷酸都是2′-氟核苷酸。在一些实施例中，dsRNA在反义链的5′端或3′端包括两个或多个2′-氟核苷酸。

在一些实施例中，本公开的dsRNA包括一个或多个硫代磷酸酯基。在一些实施例中，本公开的dsRNA包括两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个、七个或多个、八个或多个、九个或多个、或十个或多个硫代磷酸酯基。在一些实施例中，dsRNA不包括任何硫代磷酸酯基。

在一些实施例中，dsRNA包括一个或多个磷酸三酯基。在一些实施例中，dsRNA包括两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个、七个或多个、八个或多个、九个或多个、或十个或多个磷酸三酯基团。在一些实施例中，dsRNA不包括任何磷酸三酯基。

在一些实施例中，dsRNA包括脱氧核苷等修饰核糖核苷，修饰核糖核苷包括脱氧核糖核苷突出端，以及dsRNA的双链部分内的一个或多个脱氧核糖核苷等。然而，不言而喻的是，在任何情况下，双链DNA分子都不包括在“dsRNA“一词中。

在一些实施例中，dsRNA包括两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个、七个或多个、八个或多个、九个或多个、或十个或多个本文所述的不同修饰核苷酸。在一些实施例中，dsRNA包括最多两个连续修饰核苷酸，最多三个连续修饰核苷酸，最多四个连续修饰核苷酸，最多五个连续修饰核苷酸，最多六个连续修饰核苷酸，最多七个连续修饰核苷酸，最多八个连续修饰核苷酸，最多九个连续修饰核苷酸，或最多十个连续修饰核苷酸。在一些实施例中，连续修饰核苷酸为相同修饰核苷酸。在一些实施例中，连续修饰核苷酸为两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个、七个或多个、八个或多个、九个或多个、或十个或多个不同修饰核苷酸。

下面的表2列出了包括修饰核苷酸的示例性siRNA构建体(CNST)的序列。NM_014495.3(SEQ ID NO：1181)中的起始(ST)和终止(ED)核苷酸位置被标明。缩略语如下：SEQ＝SEQ ID NO；mX＝2′-O-Me核苷酸；fX＝2′-F核苷酸；dX＝DNA核苷酸；invdX＝反式dX；PO＝磷酸二酯键；和Hy＝羟基。在这些构建体中，其正义链和反义链的序列与表1中具有相同编号构建体的正义序列和反义序列对应，但加入了：(1)修饰核苷酸mX和fX；(2)位于两条链的5′和3′端的“Hy”；(3)位于正义链核苷酸序列的5′端的mC-mC-mA，(4)位于正义链核苷酸序列的3′端的InvdT；(5)位于反义链核苷酸序列的3′端的dT-dT。在这些构建体中，核苷酸的碱基对在一些实施例中可被不同地修饰，例如，碱基对中的一个核苷酸为2′-O-Me核糖核苷酸，另一个为2′-F核苷酸。在一些实施例中，反义链在其5′端包括两个2′-F核苷酸。

表2示例性修饰siRNA构建体的序列

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在一些实施例中，dsRNA包括PCT出版物WO 2019/170731中描述的一种或多种修饰核苷酸，该出版物的披露内容在本文中全部纳入。在这种修饰核苷酸中，核糖环已被六元杂环所取代。此类修饰核苷酸具有式(I)的结构。

其中：

-B是杂环核碱基，

-L1和L2中的一个是连接式(I)化合物与多核苷酸的核苷间连接基，L1和L2中的另一个为H、保护基、磷部分或连接式(I)化合物与多核苷酸的核苷间连接基，

-Y是O、NH、NR1或N-C(＝O)-R1，其中R1是：

(C1-C20)烷基，所述(C1-C20)烷基可选地由选自卤原子、(C1-C6)烷基，(C3-C8)环烷基、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基、(C5-C14)杂芳基、-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1，-CN、-C(＝J)-O-Z1、-O-C(＝J)-Z1、-C(＝J)-N(Z1)(Z2)、和-N(Z1)-C(＝J)-Z2中的一个或多个基团取代，其中

J是O或S，

(C3-C8)环烷基，所述(C3-C8)环烷基可选地由选自卤原子和(C1-C6)烷基的一个或多个基团取代，

-[C(＝O)]m-R2-(O-CH₂-CH₂)p-R3基，其中

m是为0或1的整数，

p是为0到10的整数，

R2是可选地由(C1-C6)烷基、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(＝K)-O-Z3、-O-C(＝K)-Z3、-C(＝K)-N(Z3)(Z4)、或-N(Z3)-C(＝K)-Z4取代的(C1-C20)亚烃基，其中

K是O或S，

Z3和Z4中的每一个独立地是H、(C1-C6)烷基，所述Z1和所述Z2中的每-个可选地由选自卤原子和(C1-C6)烷基的一个或多个基团取代，以及

R3选自由氢原子、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C3-C8)环烷基、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基或(C5-C14)杂芳基组成的组，或R3是细胞靶向部分，

-X1和X2分别独立地是氢原子、(C1-C6)烷基，并且

-Ra、Rb、Rc和Rd中的每一个独立地是H或(C1-C6)烷基，

或为其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，Y是NR1，R1是非取代(C1-C20)烷基，并且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有与通式(I)相同的含义，或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，Y是NR1，R1是非取代(C1-C16)烷基，其中非取代(C1-C16)烷基包括选自包括甲基、异丙基、丁基、辛基、十六烷基的烷基，并且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有与通式(I)相同的含义，或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，Y是NR1，R1是可选地被一个或多个选自卤原子和(C1-C6)烷基的基团取代的(C3-C8)环烷基，并且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有与通式(I)相同的含义，或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，Y是NR1，R1是环己基，并且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有与通式(I)相同的含义，或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，Y是NR1，R1是被(C6-C14)芳基取代的(C1-C20)烷基，并且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有与通式(I)相同的含义，或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，Y是NR1，R1是被苯基取代的甲基，并且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有与通式(I)相同的含义，或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，Y是N-C(＝O)-R1，R1是可选地取代的(C1-C20)烷基，并且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有与通式(I)相同的含义，或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，Y是N-C(＝O)-R1，R1选自包括甲基和十五烷基的组，并且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有与通式(I)相同的含义，或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，B选自包括嘧啶、取代嘧啶、嘌呤和取代嘌呤的组，或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，dsRNA中的核苷间连接基独立地选自由磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸烷基酯和磷酰胺主链连接基组成的组，或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，dsRNA包括2至10个式(I)化合物，或其药学上可接受的盐。

在进一步实施例中，dsRNA包括一个或多个靶向核苷酸，或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，R3属于式(II)：

其中A1、A2和A3是OH，

A4是OH或NHC(＝O)-R5，其中R5是(C1-C6)烷基，所述(C1-C6)烷基可选地由卤原子。

在一些实施例中，R3是N-乙酰半乳糖胺。

可用于制备具有式(I)核苷酸的修饰siRNA的前体在下文表A中进行举例说明。表A示出了用于寡核苷酸合成的磷酰胺核苷酸类似物的实例。在(2R,6R)非对映异构体系列中，作为核苷酸前体的亚磷酰胺缩写为“pre-1“，核苷酸类似物缩写为“1“，后面加碱基和数字，表示式(I)中的Y基团。为了区分两种立体化学，类似物(2R，6R)-非对映异构体用额外的“b“表示。靶向核苷酸前体、靶向核苷酸类似物和固相载体的缩写如上所述，但采用“lg“，而不是“1”。

表A

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式(I)修饰核苷酸可合并到dsRNA的正义链和/或反义链的5′端、3′端或两端上。举例来说，一个或多个(如1个、2个、3个、4个或5个或更多)修饰核苷酸可结合在dsRNA的正义链5′端上。在一些实施例中，一个或多个(例如，1个、2个、3个或更多)修饰核苷酸定位于正义链的5′端，其中修饰核苷酸不与反义序列互补，但可选地在反义链的相应3′端与相同数量或更少数量的‘互补核苷酸配对。

在一些实施例中，dsRNA可包括具有长度为17、18或19个核苷酸的正义链，其中3至5个式(I)核苷酸(例如，包含或不包含其它式(I)核苷酸的三个连续lgT3或lgT7)置于正义序列的5′端，使正义链长度为20、21或22个核苷酸。在此类实施例中，正义链还可在正义序列的3′端包括两个连续的式(I)核苷酸(例如，1T4或1T3)，使正义链的长度为22、23或24个核苷酸。dsRNA可包括长度为19个核苷酸的反义序列，其中反义序列可在其3′端与2个修饰核苷酸或脱氧核糖核苷酸(例如，dT)连接，使反义链的长度为21个核苷酸。在进一步实施例中，dsRNA的正义链只包含自然生成的核苷酸间键(磷酸二酯键)，而反义链可选地包含非自然发生的核苷酸间键。例如，反义链可在主链附近或其5′和/或3′端上中包含硫代磷酸酯键。

在一些实施例中，式(I)修饰核苷酸的使用避免了其它RNA修饰的需要，例如使用非自然生成的核苷酸间键，从而简化了dsRNA的化学合成。此外，式(I)修饰核苷酸可易于制成包含GalNAc衍生物(包括GalNAc本身)等细胞靶向部分，从而提高包含此类核苷酸的dsRNA输送效率。此外，已经表明，加入式(I)修饰核苷酸的dsRNA位于正义链上等，显著提高了dsRNA的稳定性和治疗效力。

下面的表3列出了从表2中列出的构建体siRNA#013、siRNA#051和siRNA#165衍生的示例性修饰GalNAc-siRNA构建体的序列。在表中，mX＝2′-O-Me核苷酸；fX＝2′-F核苷酸；dX＝DNA核苷酸；1x＝锁核酸(LNA)；PO＝磷酸二酯键；PS＝硫代磷酸酯键；以及Hy＝羟基。

表3 siRNA#013、siRNA#051和siRNA#165的示例性修饰GalNAc-siRNA构建体的序列

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虽然表2和表3所示的示例性siRNA包括核苷酸修饰，但也可以考虑具有相同或基本相同序列但数量、模式和/或修饰类型不同的siRNA。

在一些实施例中，dsRNA包括如表1所示的正义链，并且在其任一末端或两个末端添加核苷酸(或其修饰版本)。例如，dsRNA包括如表1所示的添加5′CCA和/或3′invdT的正义链。在一些实施例中，dsRNA包括如表1所示的在其任一末端或两个末端添加核苷酸(或其修饰版本)的反义链。例如，dsRNA包括如表1所示的添加3′dTdT的反义链。在某些实施例中，dsRNA包括一对正义链和反义链，如表1所示的在正义链上添加5′CCA和3′invdT，并且在反义链上添加3′dTdT的一对正义链和反义链。在某些实施例中，dsRNA包括如表2所示的在正义链上添加5′lgT7-lgT7-lgT7和3′lT4-lgT4的一对正义链和反义链。

在一些实施例中，本公开的dsRNA包括正义序列，该正义序列与表1所示的正义序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％是相同的。在一些实施例中，本公开的dsRNA包括反义序列，该反义序列与表1所示的反义序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％是相同的。在一些实施例中，本公开的dsRNA包括正义序列和反义序列，该正义序列和反义序列与表1中所示的正义序列和反义序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％是相同的。在某些实施例中，dsRNA包括具有表2所示序列的正义链和反义链。在某些实施例中，dsRNA包括具有表3所示序列的正义链和反义链。

两个核苷酸序列之间的“同一性百分比”是通过比较两个最佳排列序列来确定的，其中要比较的核酸序列与参考序列相比可以进行增减，以便在两个序列之间实现最佳排列。“同一性百分比”的计算方法是：确定两个序列之间，最优选地两个完整序列之间核苷酸残基相同的位置数，将相同的位置数除以排列窗口中的总位置数，然后将结果乘以100，以得到两个序列之间的同一性百分比。出于本文中的目的，在确定两个核苷酸序列之间的“同一性百分比”时，不考虑对核苷酸的修饰。例如，5′-mC-fU-mA-fG-3′序列被认为与5′-CUAG-3′序列具有100％的序列同一性。

1.5 dsRNA缀合物

本发明的dsRNA可与一个或多个配体或部分以共价或不共价方式连接。可在Jeong等人，《生物共轭化学》(2009年)20：5-14和Sebestyén等人，《分子生物学方法》(2015年)1218：163-86中找到此类配体和部分的实例。在一些实施例中，dsRNA通过连接子与一个或多个配体缀合/连接。可以使用本领域已知的任何连接子，包括多价(例如，二价、三价或四价)支链连接子。该连接子可为可裂解连接子或不可裂解连接子。将配体缀合到dsRNA上可以改变其分布，增强其细胞摄取和/或靶向特定组织和/或被一种或多种特定细胞类型(例如，肝细胞)摄取，和/或增强dsRNA的寿命或半衰期。在一些实施例中，疏水性配体缀合至dsRNA，以促进细胞膜的直接渗透和/或跨细胞(例如，肝细胞)摄取。对于ANGPTL3靶向dsRNA(例如，siRNA)，靶组织可为肝脏，包括肝实质细胞(例如，肝细胞)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA缀合至细胞靶向配体。细胞靶向配体是指有助于dsRNA输送到靶细胞的分子部分，包括：(i)增加dsRNA与表达所选靶受体(例如，靶蛋白)的细胞结合的特异性；(ii)增加靶细胞对dsRNA的摄取；和(iii)增加dsRNA进入靶细胞后被适当处理的能力(诸如增加siRNA的细胞内释放等)，例如通过促进siRNA从运输囊泡转化到细胞质。例如，配体可为蛋白质(例如，糖蛋白)、肽、脂质、碳水化合物或对共配体具有特定亲和力的分子。

配体的具体实例包括但不限于结合肝细胞上的特异性受体抗体或其抗原结合片段、促甲状腺素、促黑素、表面活性蛋白A、黏蛋白糖链、多价乳糖、多价半乳糖、多价甘露糖、多价岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、转铁蛋白、双膦酸盐、类固醇、胆汁酸、脂多糖、合成聚合物等重组或合成分子、聚氨基酸、α螺旋肽、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、凝集素和辅因子。在一些实施例中，配体是一种或多种染料、交联剂、多环芳烃、肽缀合物(例如，黑腹果蝇触足肽、Tat肽)、聚乙二醇(PEG)、酶、半抗原、运输/摄取促进剂、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、或咪唑簇)、人血清白蛋白(HSA)、或LDL。

在一些实施例中，dsRNA缀合至一种或多种胆固醇衍生物或亲脂性部分(例如，胆固醇或胆固醇衍生物)；胆酸；维生素(例如，叶酸、维生素A、维生素E(生育酚)、生物素或吡哆醛)；胆汁或脂肪酸缀合物，包括饱和和不饱和缀合物(例如，月桂酰(C12)、肉豆蔻酰(C14)、棕榈酰(C16)、硬脂酰(C18)和二十二醇(C22)、石胆酸和/或石胆酸油胺缀合物(石胆油基，C43))；聚合物主链或支架(例如PEG、三甘醇(TEG)、六乙二醇(HEG)、聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚羟基乙酸(PLG)、水动力聚合物)；类固醇(例如，二氢睾酮)；萜烯(例如，三萜烯)；阳离子脂质或肽；和/或脂质分子或脂质基分子。此类脂质或脂质基分子可结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。脂质基配体可用于调节(例如，对照)缀合物与靶向组织的结合。例如，与HSA结合更强的脂质或脂质基配体不太可能被靶向到肾脏，因而不太可能被清除出体外。

在一些实施例中，细胞靶向部分或配体是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物。在一些实施例中，dsRNA连接到一个或多个(例如两个、三个、四个或多个)GalNAc衍生物。连接可通过一个或多个连接子(例如，两个、三个、四个或多个连接子)进行。在一些实施例中，本文所述的连接子是多价(例如，二价、三价或四价)支链连接子。在一些实施例中，dsRNA通过二价支链连接子连接到两个或多个GalNAc衍生物上。在一些实施例中，dsRNA通过三价支链连接子连接到三个或多个GalNAc衍生物上。在一些实施例中，dsRNA连接到包括或不包括连接子的三个或多个GalNAc衍生物上。在一些实施例中，dsRNA通过四个独立的连接子连接到四个或多个GalNAc衍生物上。在一些实施例中，dsRNA通过四价支链连接子连接到四个或多个GalNAc衍生物上。在一些实施例中，一个或多个GalNAc衍生物连接到dsRNA的正义链的3′端、反义链的3′端、正义链的5′端和/或反义链的5′端上。示例性和非限制性缀合物和连接子在如下出版物中有所描述：例如，Biessen等人，《生物共轭化学》(2002年)13(2)：295-302；Cedillo等人，《分子》(2017年)22(8)：E1356；Grijalvo等人，《基因》(2018年)9(2)：E74；Huang等人，《分子治疗-核酸》(2017年)6：116-32；Nair等人，《美国化学会志》(2014年)136：16958-61；Ostergaard等人，《生物共轭化学》(2015年)26：1451-5；Springer等人，《核酸治疗学》，(2018年)28(3)：109-18；以及美国专利号8，106,022、9，127,276和8,927,705。GalNAc缀合可易于通过本领域众所周知的方法进行(例如，如上述文件所述)。

II.制备dsRNA的方法

本公开的dsRNA可通过本领域内已知的任何方法合成。例如，dsRNA可通过使用自动合成器，通过体外转录和纯化(例如，使用市售体外RNA合成试剂盒)，通过从细胞(例如，包含编码dsRNA的表达盒/载体的细胞)转录和纯化等方式合成。在一些实施例中，dsRNA的正义链和反义链被分别合成，然后退火形成dsRNA。在一些实施例中，包含式(I)修饰核苷酸可选地缀合至细胞靶向部分(例如GalNAc)的dsRNA，可根据PCT出版物WO 2019/170731的公开内容制备。

配体缀合dsRNA和带有本公开的序列特异性连接核苷酸的配体分子可通过本领域已知的任何方法进行组装，包括利用标准核苷酸或核苷前体在合适多核苷合成器上组装、或已经带有连接部分的核苷酸或核苷缀合前体，配体-核苷、或已经带有配体分子的核苷缀合前体，或非核苷带配体的构建块。

本公开的配体缀合dsRNA可通过本领域已知的任何方法合成，包括使用带有悬垂反应功能性的dsRNA(例如，从连接分子连接到dsRNA上获得的功能)等。在一些实施例中，这种反应性寡核苷酸可直接与市售配体、带有各种保护基的合成配体、或具有与其连接的连接部分的配体进行反应。在一些实施例中，这些方法通过使用已与配体适当连接的核苷单体以及可进一步连接到固相载体材料上的核苷单体，来促进配体缀合的dsRNA的合成。在一些实施例中，通过首先将单体构建块经长链氨基烷基共价连接到可控孔度玻璃支持体上，制备带有连接到dsRNA 3′末端的芳基配体的dsRNA；然后，通过标准的固相合成技术将核苷酸与结合到固相载体上的单体构建块结合。单体构建块可为核苷或其它与固相合成兼容的有机化合物。

在一些实施例中，使用多核苷合成器制备位于5′端拥有氨基的本公开的功能化核苷序列，然后与所选配体的活性酯衍生物进行反应。活性酯衍生物对于本领域的普通技术人员来说是众所周知的。氨基和活性酯的反应生成寡核苷酸，其中所选配体通过连接基连接到5′位。位于5′端的氨基可利用5′-氨基修饰剂C6试剂来制备。在一些实施例中，配体分子通过使用配体-核苷亚磷酰胺在5′位缀合至寡核苷酸，其中配体直接或间接地通过连接子与5′羟基连接。这种配体-核苷亚磷酰胺通常在自动合成过程的最后使用，以提供位于5′端带有配体的配体缀合寡核苷酸。

在一些实施例中，点击化学法用于合成s iRNA缀合物。参见Astakhova等人，《分子药理学》.(2018年)15(8)：2892-9；Mercier等人，《生物共轭化学》.(2011年)22(1)：108-14。

III.组合物与dsRNA输送

本公开的某些方面涉及包含本文所述dsRNA的组合物(例如，药物组合物)。在一些实施例中，组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，组合物可用于治疗患ANGPTL3基因表达或活性有关的疾病或紊乱或具有患ANGPTL3基因表达或活性有关的疾病或紊乱风险的患者。在一些实施例中，ANGPTL3基因表达相关的疾病或紊乱是脂代谢紊乱(例如，高甘油三酯血症和高脂血症(诸如家族性复合高脂血症、家族性高胆甾醇血症(例如，HoFH))和多基因性高胆固醇血症)、以及与TG和/或LDL-c升高相关的病症和疾病(例如，动脉粥样硬化、动脉硬化、心脏病、心肌梗死、中风和胰腺炎)，和/或本文和本领域内所述的任何其它相关病症和疾病。本公开的组合物可依据施用方式配制，包括配制成通过肠外给药输送到肝脏的组合物等。

本发明的dsRNA可利用药学上可接受的赋形剂进行配制。药学上可接受的赋形剂可以是液体或固体，并且可根据计划的施用方式进行选择，以提供所需体积、浓度和其它相关的运输和化学特性。可使用任何已知的药学上可接受的赋形剂，包括水、盐溶液、粘合剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(例如，乳糖和其它糖类、明胶或硫酸钙)、润滑剂(例如，淀粉、聚乙二醇、或乙酸钠)、崩解物(例如，淀粉或羧基乙酸淀粉钠)、钙盐(例如，硫酸钙、氯化钙、磷酸钙、和羟基磷灰石)和润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)。

本发明的dsRNA可配制成包含与其它分子、分子结构或核酸混合物混合、封装、缀合或以其它方式关联的dsRNA的组合物(例如，药物组合物)。例如，包括本文所述的一个或多个dsRNA的组合物可包含其它治疗剂，例如其它降脂剂(诸如他汀类等)。在一些实施例中，组合物(例如，药物组合物)进一步包括如本文所述的输送载体。

本公开的dsRNA可以直接或间接方式输送。在一些实施例中，通过向受试者施用包括dsRNA的药物组合物而直接输送dsRNA。在一些实施例中，dsRNA通过施用下面描述的一个或多个载体间接输送。

本公开的dsRNA可通过本领域已知的任何方法来输送，包括：例如通过调整输送核酸分子的方法以与dsRNA一起使用(参见，例如，Akhtar等人，《细胞生物学进展》(1992年)2(5)：139-44；PCT出版号WO 94/02595)，或通过本领域已知的其它方法(参见，例如Kanasty等人，《自然材料》(2013年)12：967-77；Wittrup和Lieberman，《自然遗传学评论》》(2015年)16：543-52；Whitehead等人，《自然评论药物发现》(2009年)8：129-38；Gary等人，《控制释放杂志》(2007年)121(1-2)：64-73；Wang等人，《美国药学科学家协会杂志》(2010年)12(4)：492-503；Draz等人，《诊断治疗学》(2014年)4(9)：872-92；Wan等人，《药物输送和转化研究》(2013年)4(1)：74-83；Erdmann和Barciszewski(eds.)(2010年)“RNA技术及其应用(RNATechnologies and Their Applications)”、“施普林格出版社柏林海德堡(Springer-Verlag Berlin Heidelberg)，DOI 10.1007/978-3-642-12168-5)；Xu和Wang，《亚洲药物制剂科学》(2015年)10(1)：1-12)。对于体内输送，dsRNA可注射到组织位点或进行全身施用(例如，通过吸入的纳米粒子形式)。体内输送也可由β-葡聚糖输送系统介导(参见，例如Tesz等人，《生物化学期刑》.(2011年)436(2)：351-62)。体外引入细胞的方法包括电穿孔和脂感染等本领域中已知的方法。

在一些实施例中，本公开的dsRNA由包含dsRNA的输送载体输送。在一些实施例中，输送载体是脂质体、脂质复合物、复合物或纳米粒子。

III.1脂质体制剂

脂质体是包括由亲脂性材料形成的膜和水性内部的单细胞或多细胞囊泡。在一些实施例中，脂质体是由以球形双层或双层形式排列的两亲性脂质组成的囊泡。水部分包括要输送的组合物。阳离子脂质体具有能够与细胞壁融合的优势。脂质体的优点包括：例如，从天然磷脂中获得的脂质体具有生物相容性和可生物降解性；脂质体可纳入广泛的水溶性药物和脂溶性药物；脂质体可保护其内部舱室中封装的药物不被代谢和降解(Rosoff，在《药物剂型》中，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988年，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第一卷，第245页)。制备脂质体制剂的重要考虑因素是脂质表面电荷、囊泡大小和脂质体的液体容量。例如，工程阳离子脂质体和立体稳定脂质体可用于输送dsRNA。参见，例如Podesta等人，《酶学方法》(Methods Enzymol).(2009年)464：343-54；美国专利号5,665,710。

III.2核酸-脂质颗粒

在一些实施例中，本公开的dsRNA被完全封装在脂质制剂中，以形成不限于SPLP、pSPLP或SNALP等核酸-脂质颗粒。如本文所用，术语“SNALP“是指包括SPLP的稳定核酸-脂质颗粒。如本文所用，术语“SPLP“是指包括封装在脂质囊泡中的质粒DNA的核酸-脂质颗粒。核酸-脂质颗粒(例如，SNALP)，通常包含阳离子脂质、非阳离子脂质、和防止颗粒聚集的脂质(例如，PEG-脂质缀合物)。SNALP和SPLP对全身施用很有用，因为它们在静脉(i.v.)注射表现出较长的循环生命周命，并且在远端位点(例如，与施用位点物理分离的位点)积累。SPLP包括“pSPLP”，其包括PCT出版物WO 00/03683中所示的封装缩合剂-核酸复合物。

在一些实施例中，dsRNA在核酸-脂质颗粒中存在时，在水溶液中不易被核酸酶降解。核酸-脂质颗粒及其制备方法已在美国专利号5,976,567、5,981,501、6,534,484、6,586,410、和6,815,432等，以及PCT出版物WO 96/40964中公开。

在一些实施例中，核酸-脂质颗粒包括阳离子脂质。可使用本领域已知的任何阳离子脂质或其混合物。在一些实施例中，核酸-脂质颗粒包括非阳离子脂质。可以使用本领域已知的任何非阳离子脂质或其混合物。在一些实施例中，核酸-脂质颗粒包括缀合脂质(例如，以防聚集)。可使用本领域已知的任何缀合脂质。

III.3其它制剂

为了在体内成功输送dsRNA分子，需要考虑的重要因素包括：(1)输送分子的生物稳定性；(2)防止非特异性效应；以及(3)输送分子在靶向组织中的积累。可通过局部施用(例如，通过直接注射或植入组织或局部给药制剂)来尽量降低dsRNA的非特异性效应。为治疗疾病而全身施用dsRNA，可对dsRNA进行修饰或使用药物输送系统进行输送。这两种方法都是为了防止dsRNA在体内被内切酶和外切酶迅速降解。RNA或药物赋形剂的修饰也可使dsRNA组合物靶向靶组织，并且避免不良脱靶效应。如上所述，dsRNA分子可通过与亲脂基团(例如，胆固醇)的化学缀合进行修饰，以增强细胞摄取并且防止降解。在一些实施例中，dsRNA使用纳米颗粒(例如，磷酸钙纳米颗粒)、树状分子、聚合物、脂质体或阳离子输送系统等药物输送系统来输送。带正电的阳离子输送系统有利于dsRNA分子(带负电)的结合，也能增强带负电的细胞膜上的相互作用，使细胞有效摄取dsRNA。阳离子脂质、树状分子或聚合物可与dsRNA结合，或诱导形成包裹dsRNA的囊泡或胶束(参见，例如Kim等人，《控释杂志》(2008年)129(2)：107-16)。囊泡或胶束的形成进一步防止了dsRNA在全身施用时发生降解。制备和施用阳离子-dsRNA复合物的方法是本领域中已知的。在一些实施例中，dsRNA可与环糊精形成复合物用于全身施用。

III.4载体编码dsRNA

本公开的dsRNA可通过将编码dsRNA的重组载体(DNA或RNA载体)引入靶细胞，从而间接输送给靶向细胞。dsRNA将从细胞内的载体表达(例如，以shRNA形式)，其中shRNA随后在细胞内被加工成siRNA。在一些实施例中，载体是质粒、粘粒或病毒载体。在一些实施例中，载体与原核细胞中的表达兼容。在一些实施例中，载体与大肠杆菌中的表达兼容。在一些实施例中，载体与真核细胞中的表达兼容。在一些实施例中，载体与酵母细胞中的表达兼容。在一些实施例中，载体与脊椎动物细胞中的表达兼容。可使用本领域已知的能够编码dsRNA的任何表达载体，包括衍生自腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)、逆转录酶病毒(例如，慢病毒(LV)、弹状病毒、鼠白血病病毒)的载体等)，疱疹病毒、SV40病毒、多瘤病毒、乳头瘤病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒(例如，正痘病毒或禽痘病毒)等。病毒载体或病毒衍生载体的嗜性可通过用一种或多种其它病毒的包膜蛋白或其它表面抗原对载体进行假定性，或酌情使用不同病毒衣壳蛋白取代进行改变。例如，慢病毒载体可用水疱性口炎病毒(VSV)、狂犬病、埃博拉、莫科拉等表面蛋白进行假定性。AAV载体可通过工程设计载体来表达不同衣壳蛋白血清型，从而使其靶向不同细胞。例如，在血清2型基因组上表达血清2型衣壳的AAV载体被称为AAV 2/2。AAV 2/2载体中的血清2型衣壳基因可通过血清5型衣壳基因取代，从而产生AAV 2/5载体。构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术已在前文中进行过描述(参见，例如Rabinowitz等人，《病毒学杂志》(2002年)76：791-801)。

重组载体的选择、将核酸序列插入载体以表达dsRNA的方法、以及将载体输送到一个或多个相关细胞的方法，均为本领域已知的。参见，例如，Domburg，《基因疗法》.(1995年)2：301-10；Eglitis，《生物技术》(1998年)6：608-14；Miller，《人类基因治疗》.(1990年)1∶5-14；Anderson，《自然》.(1998年)392：25-30；Xia等人，《自然生物技术》.(2002年)20：1006-10；Robinson等人，《自然-遗传学》.(2003年)33∶401-6；Samulski等人，《病毒学杂志》.(1987年)61：3096-101；Fisher等人，《病毒学杂志》.(1996年)70：520-32；Samulski等人，《病毒学杂志》.(1989年)63：3822-6；美国专利号5,252,479和5,139,941；以及PCT出版物WO 94/13788和WO 93/24641。

对本文所述的dsRNA输送有用的载体可包括足以使dsRNA在所需靶细胞或组织中表达的调节元素(例如异源启动子、增强子等)。在一些实施例中，载体包括与一个或多个异源启动子相连的一个或多个编码dsRNA的序列。可使用本领域已知的能够表达dsRNA的任何异源启动子，例如包括U6或H1 RNA pol III启动子、T7启动子和巨细胞病毒启动子。一个或多个异源启动子可为可诱导启动子、可抑制启动子、可调节启动子和/或组织特异性启动子。在本领域普通技术人员的能力范围内选择其它启动子。在一些实施例中，调节元素被选择来提供组成型表达。在一些实施例中，选择调节元素以提供调节/可诱导/可抑制表达。在一些实施例中，调节元素被选来以提供组织特异性表达。在一些实施例中，调节元素和编码dsRNA的序列形成转录单元。

本公开的dsRNA可从插入DNA或RNA载体的转录单元中表达(参见，例如Couture等人，TIG(1996年)12：5-10；PCT专利出版物WO 00/22113和WO 00/22114；以及美国专利号6,054,299)。根据所用特定构建体和靶向组织或细胞类型，表达可能是短暂的表达(数小时至数周)或持续的表达(数周至数月或更长)。这些转基因可作为线性构建体、环状质粒或病毒载体(可为整合或非整合载体)引入。转基因也可被构建成允许其作为染色体外质粒遗传(Gassmann等人，《美国国家科学院院刑》(1995年)92：1292)。

在一些实施例中，dsRNA的正义链和反义链被编码在不同的表达载体上。在一些实施例中，正义链和反义链在共同引入(例如，通过转染或感染)到同一个靶细胞中的两个单独表达载体上表达。在一些实施例中，正义链和反义链被编码在同一个表达载体上。在一些实施例中，正义链和反义链从位于同一表达载体上的不同启动子转录。在一些实施例中，正义链和反义链从同一表达载体上的同一启动子转录。在一些实施例中，正义链和反义链从同一启动子转录，作为由连接子多核苷酸序列连接的反式重复，从而使dsRNA具有茎环结构。

四、dsRNA疗法

本公开的某些方面涉及抑制ANGPTL3基因在受试者(例如，人类等灵长类受试者)中的表达的方法，包括施用治疗有效量的本公开的一种或多种dsRNA、本公开的一种或多种载体、或本公开的一种或多种药物组合物。本公开的某些方面涉及治疗和/或预防本文所述的一种或多种病症(例如，ANGPTL3相关病症)的方法，包括：给本公开的一种或多种dsRNA和/或本公开的一种或多种载体和/或包含本文所述的一种或多种dsRNA的一种或多种药物组合物。在一些实施例中，下调受试者的ANGPTL3表达可减轻脂代谢紊乱的一种或多种症状，例如高脂血症、家族性复合高脂血症、家族性高胆甾醇血症(诸如HoFH等)和多基因性高胆固醇血症；或与TG和LDL-c升高有关的疾病或病症，例如，动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病、心肌梗死、中风、恶病质、胰腺炎，以及阿尔茨海默病和多发性硬化症等中枢神经系统疾病。

本公开的药物组合物可通过足以抑制ANGPTL3基因表达的剂量施用。在一些实施例中，本发明所述的dsRNA的合适剂量为受体体重的0.001mg/kg至200mg/kg。在某些实施例中，合适剂量为受体体重的0.001mg/kg至50mg/kg，例如，体重的0.001mg/kg至20mg/kg。用治疗有效量的药物组合物治疗受试者可包括一次治疗或一系列治疗。

如本文所用，术语“治疗有效量”和“预防有效量“是指在治疗、预防或管理由ANGPTL3表达介导的病变，或由ANGPTL3表达介导的病变明显症状方面提供疗效的量。

如本文所用，术语“ANGPTL3相关病症”旨在包括对抑制ANGPTL3活性有益的任何病症。这种病症可能是由ANGPTL3蛋白的过量生成、增加ANGPTL3活性或表达的ANGPTL3基因突变、增加活性或减少降解的ANGPTL3蛋白的异常裂解、和/或ANGPTL3与其它蛋白或其它内源性或外源性物质之间的异常相互作用使ANGPTL3活性增加或降解减少而引起的。ANGPTL3相关病症可选自高甘油三酯血症和相关疾病和病症(诸如动脉粥样硬化、胰腺炎等)，高脂血症(家族性复合高脂血症)，家族性高胆甾醇血症(诸如HoFH等)和多基因性高胆固醇血症。ANGPTL3相关病症可为脂代谢紊乱(例如，高甘油三酯血症)等。

在一些实施例中，本文所述的dsRNA用于治疗患有脂代谢紊乱(例如，高甘油三酯血症或与高甘油三酯血症相关的任何症状或病症)的受试者。在某些实施例中，本文所述的dsRNA用于治疗患药物导致的高甘油三酯血症、利尿剂导致的高甘油三酯血症、酒精导致的高甘油三酯血症、β-肾上腺素阻断剂导致的高甘油三酯血症、雌激素导致的高甘油三酯血症、糖皮质激素导致的高甘油三酯血症、维甲酸酯导致的高甘油三酯血症、西米汀导致的高甘油三酯血症、家族性高甘油三酯血症、与高甘油三酯血症有关的急性胰腺炎和/或与高甘油三酯血症有关的肝脾肿大。

在一些实施例中，本文所述的dsRNA用于治疗具有选自以下病症的一种或多种病症的受试者：脂血症(例如，高脂血症)、血脂异常(例如，致动脉粥样硬化性血脂异常、糖尿病性血脂异常或混合性血脂异常)、高脂蛋白血症、高胆固醇血症(例如，由LDL受体(LDLR)功能缺失的基因突变引起的HoFH、导致缺乏LDLR或非活性型LDLR)、与高胆固醇血症相关的痛风、乳糜微粒血症、脂肪代谢障碍、脂肪萎缩、代谢综合征、糖尿病(I型或II型)、前驱糖尿病、库欣氏综合征、肢端肥大症、系统性红斑狼疮、球蛋白血症、多囊卵巢综合征、阿狄森氏病、糖原贮积症1型、甲状腺功能减退症、尿毒症、阿霉素心肌病、脂蛋白脂肪酶缺乏症、溶酶体脂肪酶缺乏症、黄瘤病、爆发性黄瘤和脂血性视网膜。

此外地或替代地，本文所述的dsRNA可用于治疗患与本文所述任何疾病相关的一种或多种病情的受试者，例如心脏和循环系统病症(诸如动脉粥样硬化、心绞痛、高血压、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、再狭窄、心肌梗塞、中风、动脉瘤、脑血管疾病和外周血管疾病等)、肝病、肾病、肾病综合征和慢性肾病(诸如尿毒症、肾病综合征、维持透析和肾移植等)。

在一些实施例中，本文所述的dsRNA可用于治疗患导致或造成血甘油三酯或血脂升高，与任何遗传特征(例如，家族性高甘油三酯血症、家族性混合脂血症、家族性低β脂蛋白血症或家族性异常β脂蛋白血症)、治疗(例如，使用噻嗪类利尿剂、口服避孕药和其他雌激素、某些β-肾上腺素能阻断药、丙泊酚、HIV药物、异维A酸或蛋白酶抑制剂)，或生活方式(例如，吸烟、过度饮酒、高碳水化合物饮食或高脂饮食)相关的一种或多种病症的受试者。甘油三酯水平(例如，血清甘油三酯水平)超过150mg/dL被认为心血管病风险增加。甘油三酯水平(例如，血清甘油三酯水平)超过500mg/dL或以上被认为胰腺炎风险增加。

在一些实施例中，本文所述的dsRNA可用于管理受试者的体重或减少脂肪量。

在一些实施例中，本文所述的dsRNA可抑制人ANGPTL3基因表达，或人ANGPTL3基因表达和食蟹猴ANGPTL3基因表达。受试者体内ANGPTL3基因表达可被抑制，或受试者体内的ANGPTL3蛋白水平在治疗后与治疗前水平相比，可被降低至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、或约100％。在一些实施例中，与治疗前水平相比，ANGPTL3基因表达被抑制，和/或受试者中的ANGPTL3蛋白水平可减少至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约75倍、或至少约100倍。在一些实施例中，受试者肝脏中的ANGPTL3基因被抑制，或ANGPTL3水平降低。

在一些实施例中，ANGPTL3基因表达被dsRNA减少约12小时或以上，24小时或以上，或36小时或以上。在一些实施例中，ANGPTL3基因表达减少持续时间较长，例如至少约2天、3天、4天、5天或6天或更长时间，例如约1周、2周、3周、4周、1个月、2个月或更长。

如本文所用，术语“抑制表达(inhibit the expression of或inhibitingexpression of)”，只要是指ANGPTL3基因，就是指至少部分抑制ANGPTL3基因表达，表现为与第一细胞或一组细胞或第一细胞或一组细胞组基本相同但已被或未被如此处理的第二细胞或一组细胞(对照细胞)相比，在处理的第一细胞或一组细胞中从ANGPTL3基因转录的mRNA的数量减少，从而抑制ANGPTL3基因的表达。这种抑制可通过Northern分析、原位杂交、B-DNA分析、表达谱分析、报告基因转录以及本领域已知的其它技术进行评估。如本文所用，术语“抑制(inhibiting)”可与“减少(reducing)”、“沉默(silencing)”、“下调(downregulating)”、“抑制(suppressing)”和其它类似术语互换使用，并包括任何程度的抑制。抑制程度通常表示为((对照细胞中的mRNA)-(处理细胞中的mRNA))/(对照细胞中的mRNA))x 100％。

或者，抑制程度可通过降低与ANGPTL3基因转录功能相关的参数(例如，细胞中ANGPTL3基因编码的蛋白质数量、或示出某种表型的细胞数量(例如，细胞凋亡))来表示(例如，通过Western分析、报告蛋白的表达、ELISA、免疫沉淀法或本领域已知的其它技术等进行评估)。原则上，以组成性方式或者通过基因组工程设计方式，以及通过任何适当测定法来确定任何表达靶的细胞中的ANGPTL3基因沉默。然而，当需要参考以确定给定dsRNA是否在一定程度上抑制ANGPTL3基因的表达并因此包含在本公开中时，以下实例中提供的测定法应作为参考。

在一些实施例中，通过本文所述的任何方法抑制ANGPTL3基因表达的效果导致受试者(例如，受试者的血液和/或血清中)的甘油三酯水平下降。在一些实施例中，甘油三酯水平下降到低于下列水平之一：500、450、400、350、300、250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60或50mg/dL。在一些实施例中，LDL水平下降到低于下列水平之一：190、180、170、160、150、140、130、120、110、100或70mg/dL.

受试者的甘油三酯水平可用本领域已知的多种方法来确定。在一些实施例中，使用受试者的血液、血清或血浆等样本来确定受试者的甘油三酯水平。

本文所述的dsRNA或药物组合物可通过本领域已知的任何方式施用，包括但不限于静脉施用、肌肉施用、皮下施用、肺内施用、经皮施用和气道(气雾剂)施用等口服或胃肠外途径。通常，当治疗患高甘油三酯血症的患者时，dsRNA分子通过肠外途径实现全身施用。在一些实施例中，dsRNA和/或组合物通过皮下施用方式来施用。在一些实施例中，dsRNA和/或组合物通过静脉施用方式来施用。在一些实施例中，dsRNA和/或组合物通过肺施用方式来施用。

如本文所用，在ANGPTL3表达的上下文中，术语“治疗(treat、treatment)”等是指缓解或减轻由靶基因表达介导的病情。在本公开的上下文中，就其涉及本文所述的任何病症而言，术语“治疗(treat、treatment)”等是指缓解或减轻与所述病症相关的一种或多种症状。例如，在高甘油三酯血症的背景下，治疗可能涉及降低血清甘油三酯水平。如本文所用，“缓解(alleviate)”疾病、紊乱或病症是指降低疾病、紊乱或者病症症状的严重程度和/或发生频率。此外，本文提及的“治疗(treatment)”包括治疗性、姑息性和预防性治疗。

如本文所用，术语“预防(prevent)”或“延缓病情(delay progression of)”(及其语法变体)涉及在疑似患有或确认患该病症风险的个体等中对病症进行的预防性治疗。预防可包括但不限于，预防或延缓病症的发作或进展和/或将疾病的一种或多种症状维持在期望水平或亚病理水平。例如，在高甘油三酯血症的背景下，预防可能涉及将疑似患高甘油三酯血症或具有患高甘油三酯血症风险的个体的血清甘油三酯水平维持在一个理想水平。

应理解，本公开的dsRNA可用于本文所述的治疗，可用于本文所述的治疗方法，和/或可用于制造本文所述治疗用药物。

在一些实施例中，本公开的dsRNA与一种或多种其它治疗剂(例如，其它siRNA治疗剂、单克隆抗体和小分子)联合施用，比单独施用dsRNA对患者病情更有效果。在某些实施例中，附加治疗剂具有抗炎作用。在某些实施例中，附加治疗剂是治疗高甘油三酯血症的降脂剂等药物。

在一些实施例中，外加剂可以是HMG-CoA还原酶抑制剂(例如他汀类)、贝特类、胆汁酸螯合剂、烟酸、抗血小板剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂(例如，氯沙坦钾)、酰基辅酶A胆固醇乙酰转移酶(ACAT)抑制剂、胆固醇吸收抑制剂、胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂、微粒体甘油三酯转运蛋白(MTTP)抑制剂、胆固醇调节剂、胆汁酸调节剂、过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR)激动剂、ω-3脂肪酸(例如，鱼油或亚麻籽油)、以及胰岛素或胰岛素类似物。具体实例包括但不限于阿托伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、氟伐他汀、西伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀、依折麦布、苯扎贝特、氯贝特、非诺贝特、吉非罗齐、环丙贝特、消胆胺、考来替泊、考来维纶和烟酸。

在某些实施例中，如本文所述的dsRNA可与另一种治疗干预措施(例如降脂、减肥、饮食调节和/或适度运动)联合施用。

遗传倾向在靶基因相关疾病(例如，高甘油三酯血症)的发育中起作用。因此，需要用本公开的一种或多种dsRNA治疗的受试者可通过了解家族史，或筛选一种或多种遗传标记或变体等来识别。参与高甘油三酯血症的基因的实例可包括但不限于LPL、APOB、APOC2、APOA5、APOE、LMF1、GCKR、GPIHBP1和GPD1。在某些实施例中，需要用本公开的一种或多种dsRNA治疗的受试者可通过筛选这些基因中的任何一种变体或功能失活突变来识别。

医生、护士或家庭成员等保健提供者可在开药或施用本公开的dsRNA之前，了解家族史。此外，可进行测试以确定基因型或表型。例如，在对受试者施用dsRNA之前，可对受试者的血样等样本进行DNA测试，以确定ANGPTL3的基因型和/或表型。

V.试剂盒和制品

本公开的某些方面涉及一种制品或试剂盒，所述制品或试剂盒包括一种或多种本文所述的dsRNA、载体或组合物(例如药物组合物)，用于治疗和/或预防ANGPTL3相关病症(例如，高甘油三酯血症等脂代谢紊乱)。制品或试剂盒可进一步包括容器和容器上或与容器相关的标签或包装说明书。合适的容器包括瓶子、小瓶、注射器、静脉输液袋等。容器可由玻璃或塑料等各种材料制成。容器装有单独或与另一种有效治疗或预防疾病的组合物，并且可有无菌接入口(例如，容器可为静脉输液袋或具有可被皮下注射针头穿透塞子的小瓶)。组合物中至少有一种活性剂是本文所述的dsRNA。标签或包装说明书表明该组合物用于治疗ANGPTL3相关病症。在一些实施例中，病症是高甘油三酯血症等脂代谢紊乱和/或本文所述的另一种病症。此外，制品或试剂盒可包括：(a)具有其中所含组合物的第一容器，其中该组合物包括本文所述的dsRNA；和(b)具有其中所含组合物的第二容器，其中该组合物包括第二治疗剂(例如，本文所述的外加剂)。本公开的这一方面的制品或试剂盒可进一步包括说明组合物可用于治疗特定疾病的包装说明书。或者或此外，制品或试剂盒可进一步包括容纳抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液等药学上可接受的缓冲液的第二(或第三)容器。它还可进一步包括从商业和/或用户角度来看可取的其它材料(包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器)。

除非本文另有定义，否则结合本公开使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下文描述了示例性方法和材料，尽管与本文所述方法和材料类似或等效的方法和材料也可用于本公开的实践或测试。如有冲突，以本规范(包括定义)为准。

通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、心脏病学、微生物学、遗传学、分析化学、合成有机化学、医疗和药物化学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关的术语和技术均为本领域公知和常用的术语。根据制造商的规范，如本领域中通常实现的那样或者如本申请中所描述的那样进行酶反应和纯化技术。

此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。在本说明书和实施例中，术语“包括(comprise)”和“具有(have)”或诸“具有(has、having)”或“包括(comprises、comprising)”等变体将理解为暗示包含所述整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数。

本文中提及的所有出版物和其它参考文献通过引用全部并入本文。尽管本文引用了多个文件，但引用并不构成承认这些文件中的任何一份文件构成本领域普通常识的一部分。

实例

为了更好地理解本公开，提出了以下实例。这些实例仅用于说明，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。

实例1：siRNA的合成和纯化

使用固相寡核苷酸合成生成siRNA，包括非靶向对照siRNA(NT对照)。

方法

siRNA生成

按照固相合成和脱保护标准协议，使用市售5′-O-DMT-3′-O-(2-氰乙基-N、N-二异丙基)亚磷酰胺单体(SAFC)尿苷、4-N-乙酰胞苷(CAc)、6-N-苯甲酰腺苷(ABz)和具有2′-OMe或2′-F修饰的2-N-异丁酰鸟苷(GiBu)，以及固相载体5′-O-DMT-胸苷-CPG和3′-O-DMT-胸苷-CPG(invdT，Link)，以1μmol(体外)或10μmol(体内)的比例，在ABI 394DNA/RNA或BioAutomation MerMade 12合成仪上合成RNA寡核苷酸(Beaucage，Curr Opi Drug DiscovDevel.(2008年)11：203-1 6；Mueller等人，《当代有机合成》.(2004年)1：293-307)。

磷酰胺构建块使用0.1M的乙腈溶液，并且用5-(双-3，5-三氟甲基苯基)-1H-四唑(活化剂42，0.25M乙腈溶液，Sigma-Aldrich)进行活化。磷酰胺偶联的反应时间为300s。作为封端剂，使用THF中的乙酸酐(ABI的CapA，Sigma-Aldrich)和THF中的N-甲基咪唑(ABI中的CapB，Sigma-Adrich)。作为氧化试剂，使用THF/吡啶/水(0.02M；用于ABI的氧化剂，SigmaAldrich)中的碘。DMT保护基的脱保护在DCM(DCA deblock，Sigma-Aldrich)中使用二氯乙酸进行。用NH₃(32％的水溶液/乙醇，v/v 3∶1)实现固相载体的最终裂解和脱保护(酰基和氰乙基保护基)。

通过IEX和LC-MS分析粗寡核苷酸，并且过阴离子交换高效液相色谱(IEX)，在30分钟内使用10％至65％缓冲液B进行纯化。净化器(Thermo Fisher ScientificDNAPac PA200半制备离子交换柱，8μm颗粒，22mm宽x 250mm长)。缓冲液A：1.50L的H₂O、2.107g的NaClO₄、438mg的EDTA、1.818g的TRIS、540.54g的尿素，pH＝7.4。

缓冲液B：1.50L的H₂O、105.34g的NaClO₄、438mg的EDTA、1.818g的TRIS、540.54g的尿素，pH＝7.4。

通过添加4体积的乙醇并且在-20℃下储存进行诱导，通过沉淀来分离寡核苷酸。

为了确保数据的高保真度，所有单链均经HPLC纯化至>85％的纯度。寡核苷酸的纯度和同一性分别通过离子交换色谱和LC-MS确认。

双重退火

对于体外实验(100μM溶液)和体内实验(10mg/ml)，通过在1x PBS缓冲液中混合等摩尔量的互补正义和反义链来制备siRNA在PBS中的母液。将溶液加热至90℃，持续10min，并且缓慢冷却至室温以完成退火过程。siRNA进一步通过HPLC表征，并且冷冻保存直至使用。

siRNA序列

每个siRNA的序列以及包括核苷酸修饰的序列如上述表1和表2所示。

小鼠血清中的siRNA稳定性

在50％小鼠血清中测试表2中所列的修饰siRNA的核酸酶稳定性。将160μL的2.5μMsiRNA在1x DPBS中(Life Technologies，产品编号：14190-094)和160μL的小鼠血清(Sigma，产品编号：M5905)在37℃下培养72小时。在每个时间点(0小时、8小时、24小时、32小时、48小时、56小时和72小时)，取出21μL反应物，用23μL终止液(组织和细胞裂解液(Epicentre，产品编号：MTC096H)，183μL的20mg/mL蛋白酶K(Sigma，产品编号：P2308)，1694μL水)在65℃下淬灭30分钟。在使用沃特世2695分离模块和2487双摄取检测器进行HPLC分析之前，向每个样本中加入33μL的无RNase水。使用DNAPac PA200分析柱(ThermoScientific，产品编号：063000)和以下级度，对50μL的溶液进行HPLC分析。

缓冲液A：20mM的磷酸钠(Sigma，产品编号：342483)，pH＝11。

缓冲液B：20mM的磷酸钠(Sigma，产品编号：342483)、1M的溴化钠(Sigma.产品编号：02119)，pH＝11。

对两条siRNA的血清半衰期进行估计。

实例2：抑制从ANGPTL3表达的siRNA的识别

方法

维胞和组织培养

人Hep3B细胞在37℃、5％的CO₂和95％的相对湿度(RH)下生长，并在添加有10％FBS的EMEM培养基(ATCC，产品编号：30-2003)中培养。

siRNA转染

对于Hep3B细胞的基因敲低实验，在96孔板(Greiner，产品编号：655180)中使用了20,000个细胞/孔。根据制造商的协议，在反向转染设置中，使用0.2μL/孔的LipofectamineRNAiMAX转染试剂(ThermoFisher)将浓度为0.1nM和1nM的ANGPTL3 siRNA转染给细胞，在不更换培养基的条件下培养48h。通常，每个测试样本进行N＝4次技术重复。

mRNA表达分析

在siRNA转染或游离siRNA摄取后48或72小时，根据制造商的方案，通过使用Promega的SV96总RNA隔离系统(产品编号：Z3500)收获细胞RNA(包括过程中的DNase步骤)。

对于cDNA合成，使用ThermoFisher逆转录酶试剂盒(产品编号：N8080234)。使用总体积为12μL的以下材料从30ng的RNA合成cDNA，这些材料包括：1.2μL的10xRT缓冲液、2.64μL的MgCl₂(25mM)、2.4μL的dNTP(10mM)、0.6μL的随机引物(50μM)、0.6μL的Oligo(dT)16(SEQID NO：1185)(50μM)、0.24μL的RNase抑制剂(20U/μL)和0.3μL的Multiscribe(50U/μL)。在25℃下，培养样本10分钟；在42℃下，培养样本60分钟。将反应加热到95℃，5分钟后停止。

使用ThermoFisher TaqMan Universal PCR Master Mix(产品编号：4305719)和以下TaqMan基因表达测定法，通过qPCR对人ANGPTL3 mRNA水平和食蟹猴ANGPTL3 mRNA水平进行定量。

人	Hs00205581_m1
		食蟹猴	Mf04384789_m1

在以下PCR条件下，用ABI Prism 7900系统在技术重复中进行PCR：50℃下持续2分钟，95℃下持续10分钟，在95℃下循环40次，持续15秒，在60℃下循环40次，持续1分钟。将PCR设置在一个反应中检测靶基因并且在平行反应中检测管家基因(人/食蟹猴RPL37A)的简单PCR，以实现平行反应中的归一化。在1xPCR反应混合物中，PCR反应的最终体积是12.5μL；在50nM的终浓度下使用RPL37A引物，在200nM的终浓度使用探针。ΔΔCt法用于计算靶转录物的相对表达水平。根据非靶向siRNA对照处理的细胞水平进行归一化来计算靶基因表达的百分比。

IC₅₀测量

为了进行IC₅₀测量，在96孔板中，用Lipofectamine RNAiMAX转染20,000个人Hep3B细胞48小时，并且从25nM开始，采用5-8倍稀释步骤，以7种浓度转染ANGPTL3 siRNA。应用Biostat-Speed统计计算工具来计算每个siRNA的最大半抑制浓度(IC₅₀)。根据Ratkovsky和Reedy(《生物统计学》(1986年)42(3)：575-582)的四参数逻辑模型得出结果。利用SASv9.1.3软件中的莱文贝格-马夸特方法进行非线性回归实现调整。

细胞毒性

对96孔板每孔10,000个Hep3B细胞进行5nM和50nM siRNA转染72小时后，通过测定每个样本的细胞活力/毒性的比例来测量细胞毒性。根据制造商的方案，通过使用CellTiter-Glo测定法(Promega，产品编号：G7570)测定细胞内ATP含量来测量细胞活力。根据制造商的方案，使用ToxiLight测定法(Lonza，产品编号：LT07-217)在上清液中测量细胞毒性。将10nM的AllStars Hs细胞死亡siRNA(Qiagen，产品编号：SI04381048)、25μM的酮康唑(Calbiochem，，产品编号：420600)和1％的Triton X-100(Sigma，产品编号：T9284)用作毒性阳性对照。

结果

为了识别对靶向人ANGPTL3有用的siRNA，采用以下标准进行以电子方式生成：首先，从NM_014495.3所示的人ANGPTL3 mRNA序列中以电子方式确定19mers，其中包括18个核苷酸重叠片段。从2933个序列的列表中，如果分子的G/C含量大于55％或与食蟹猴(食蟹猕猴)ANGPTL3 mRNA序列有一种或多种不匹配，则进一步删除。

对于剩余的序列，然后进行电子分析，以确定人转录组(RefSeq RNA版2015-11-24)中与任一siRNA链(正义链/反义链)相匹配的任何潜在脱靶转录物。不考虑肝组织中RNAseq表达(Illumina Body Atlas)FPKM＜0.5的人脱靶序列。所有相关siRNA序列要么与除ANGPTL3以外的任何人转录物具有超过三种不匹配，要么与四种或更少的人类基因具有两种不匹配；不符合这两个标准之一的序列被过滤。经过过滤后，剩下162个潜在siRNA(见表1，构建体001-162)。

如上所述，这162个siRNA用具有固定模式的核苷酸制成(见表2，构建体001-162)。为了测试这162个siRNA减少ANGPTL3表达的能力，用0.1nM或1.0nM的每个siRNA转染人Hep3B细胞并且培养48小时。培养后，测量每个样本中ANGPTL3的mRNA表达，并且与用非靶向siRNA处理的阴性对照进行比较(图1A至图1C)。选择15种浓度为1.0nM的mRNA表达至少80％，或浓度为0.1nM的siRNA减少至少70％，加上3个与远序列区结合的siRNA减少以进行进一步表征。

在人Hep3B细胞中，对所选18个siRNA进行IC₅₀测量(表4)和细胞毒性测定(图2)。在移除3个示出＜40％的NT对照活力/毒性比(50nM时)的siRNA(siRNA#029、#036和#145)后，根据其与GalNAc结合的IC₅₀值选择11个siRNA(表4)。

表4所选siRNA的活性

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综上所述，这些结果证明了确定能够有效抑制人ANGPTL3表达的siRNA在人体细胞中没有明显的细胞毒性。

实例3：用于抑制从ANGPTL3表达和食蟹猴ANGPTL3表达的活性GalNAc缀合siRNA的确定

方法

基于所示序列(参见上述序列表)生成包括非靶向对照siRNA(NT对照)的GalNAc-siRNA。

细胞培养与测定

人(BioreclamationIVT，产品编号：M00995-P)原代肝细胞和食蟹猴(Primocyt，产品编号：CHCP-I-T)原代肝细胞按如下方式培养：用平面培养及冻存试剂盒(Primoctt，产品编号：PTK-1)解冻和平面培养保存细胞，并且在37℃、5％的CO₂和95％RH的条件下培养。平面培养后6小时，将培养基改为添加有1％的FBS的维持培养基(KaLy Cell，产品编号：KLC-MM)。

在实例2中进行如上所述的mRNA表达分析。

IC₅₀测量

为了证明人原代肝细胞和食蟹猴原代肝细胞在自由摄取条件下的剂量-活性关系与IC₅₀测量值，在不更换培养基的条件下，采用10倍稀释的步骤在96孔板中用浓度为10μM至0.01nM的siRNA培养50,000至70,000个细胞72小时。应用Biostat-Speed统计计算工具来计算每个siRNA的最大半抑制浓度(IC₅₀)。根据Ratkovsky和Reedy(《生物统计学》(1986年)42(3)：575-82)的四参数逻辑模型得出结果。利用SAS v9.1.3软件中的莱文贝格-马夸特方法进行非线性回归实现调整。

结果

在选择如上所述的有效siRNA后，发明人继续演示了在GalNAc缀合物适用于体内传递肝特异性siRNA的情况下，所选分子是否保持活性。他们还评估了食蟹猕猴(食蟹猴)的细胞中是否保持这种活性。

IC₅₀测量结果示出，所有测试的siRNA缀合物在自由摄取到人原代肝细胞均保留活性，只有两种除外(表5)，IC₅₀值为1.95nM至9.2nM。然而，令人惊讶的是，自由摄取GalNAc-siRNA后的性能排名与转染辅助摄取未结合的siRNA后的性能排名具有显著差异(表4)，包括两种分子完全不能产生可测量的敲低活性。这表明siRNA似乎具有基于其序列的固有性质，使得它们在GalNAc缀合物的应用中具有不同的敲低效力。

表5所选GalNAc缀合siRNA在人原代肝细胞中的I_max和IC₅₀

化合物	I_max	IC₅₀[nM]
			siRNA#013-c	0.891	2.32
siRNA#014-c	0.912	1.95
			siRNA#015-c	0.850	3.07
siRNA#047-c	0.782	5.03
			siRNA#048-c	0.768	4.39
siRNA#049-c	0.711	4.36
			siRNA#050-c	0.670	9.20
siRNA#051-c	0.735	5.50
			siRNA#055-c	0.502	2.06
siRNA#129-c	N/A	N/A
			siRNA#142-c	N/A	N/A

N/A：无可测量活性。

更令人惊讶的是，一些测试siRNA证明在食蟹猴肝细胞中缺乏活性，尽管预测序列与食蟹猕猴序列XM_005543185.1同源(表6)。这一意想不到的观察结果强调了对活性测定功能测定的需求，并且不能仅依据生物信息学信息来预测siRNA的疗效。

表6所选GalNAc缀合siRNA在食蟹猴原代肝细胞中的I_max和IC₅₀

N/A：无可测量活性。

实例4：抑制人ANGPTL3表达的GalNAc缀合siRNA的体内及体外表征

方法

维胞和组织培养

人Hep3B细胞在37℃、5％的CO₂和95％的RH下生长，并在添加有10％FBS的EMEM培养基(ATCC，产品编号：30-2003)中培养。

根据制造商的说明，从收集在涂有肝素钠的Vacutainer管中(BD，HeidelbergGermany)的三名健康供体的约16mL的血液中分离人外周血单核细胞(PBMC)。

对于人PBMC的转染，在总体积为150μL的无血清RPMI培养基(ThermoFisher，产品编号：11875)中，利用96孔板中每孔0.3μL的Lipofectamine 2000(N＝2)100nM的siRNA反向转染到1x10⁵PBMC中，持续24小时。单链RNA(″R-0006″)和DNA(″CpG ODN″)寡核苷酸，以及双链未修饰siRNA和2′-O-甲基修饰siRNA(″132/161″)作为对照使用。

ANGPTL3 ELISA测定法

采用R&D Systems的人ANGPTL3 Quantikine ELISA试剂盒(产品编号：DANL30)，对所选siRNA浓度的IC₅₀实验的上清液中的ANGPTL3蛋白浓度进行定量。根据制造商的方案，使用人Hep3B细胞、人原代肝细胞或食蟹猴原代肝细胞的50μl的1∶2-1∶8预稀释上清液进行ELISA测定。根据用非靶向性siRNA对照序列处理细胞的平均ANGPTL3水平，通过归一化计算ANGPTL3蛋白表达的百分比。

IFNa测定

IFNα蛋白浓度在人PBMC的上清液中进行量化，方法如下：采用基于MesoScaleDiscovery技术的自创电化学发光法，并且使用泛IFNα单克隆捕获抗体(MT1/3/5，Mabtech)，用25μL的细胞培养上清液来测量IFN α浓度。另外，根据MesoScale的U-PLEX平台以及供应商的方案，采用人IFNα 2a异构体特异性测定(产品编号：K151VHK)。

细胞毒性

在自由摄取条件下，用1μM、5μM和25μM的siRNA培养96孔板中每孔45,000至50,000个细胞72小时后，通过测定每个样本的细胞活力/毒性比率，测量siRNA在人原代肝细胞中的细胞毒性。根据制造商的协议，细胞活力通过使用CellTiter-Glo测定法(Promega，产品编号：G7570)来测定细胞内ATP含量，并且使用LDH测定法(Sigma，产品编号：11644793001)来测定上清液中的细胞毒性。25μM的酮康唑和1％的Triton-X-100被用作阳性对照。

核酸酶稳定性

用实例1中所述的方法对GalNAc缀合siRNA进行核酸酶稳定性测试。

体内试验

为了评估GalNAc-siRNA靶向人ANGPTL3在体内的效果，在小鼠中采用基于腺相关病毒载体的转基因表达系统。为此，在给小鼠注射siRNA之前，对C57BL/6雌鼠(CharlesRiver，Germany)静脉注射具有mRNA的肝特异性表达mRNA的AAV8载体，该载体由ApoA2启动子(Vectalys，Toulouse，France)编码人ANGPTL3。在AAV载体表达的人ANGPTL3血清水平达到足够高的血清水平后，以12mg/kg的剂量皮下注射GalNAc缀合siRNA(包括非靶向对照)(n＝8)。用ELISA法测量人ANGPTL3蛋白血清，对siRNA的活性进行量化。

ANGPTL3 ELISA测定法

采用R&D System的人ANGPTL3 Quantikine ELISA试剂盒(产品编号：DANL30)对用siRNA处理的小鼠血清ANGPTL3蛋白水平进行定量。ANGPTL3血清水平相对于用非靶向对照siRNA处理的组而言。

结果

通过检查从三个不同的健康供体分离的人原代细胞在转染siRNA后分泌的干扰素α(图3)，测量体外人原代PMBC对11种GalNAc-siRNA靶向ANGPTL3(如上所述选择)的免疫反应。对于任何一个被测试siRNA，在人PBMC中没有观察到免疫刺激的迹象。

而且，还通过测定ANGPTL3 GalNAc-siRNA的相对稳定性和半衰期，在50％小鼠血清中测试它们的体外核酸酶稳定性(表7)。半衰期在小于32小时与72小时之间。

表7体外血清稳定性

化合物	t_1/2
		siRNA#013-c	72h
siRNA#014-c	＜32h
		siRNA#015-c	32h
siRNA#047-c	＜32h
		siRNA#048-c	32h
siRNA#049-c	32h
		siRNA#050-c	48h
siRNA#051-c	72h
		siRNA#055-c	32h
siRNA#129-c	48h
		siRNA#142-c	48h

在人原代肝细胞中进行细胞毒性测定，以排除具有任何毒性潜力的GalNAc-siRNA，以进行进一步选择(图4)。没有观察到任何分子具有明显毒性作用。

剂量依赖性ANGPTL3蛋白敲低通过量化用三种不同浓度(10nM、100nM和1000nM)的GalNAc-siRNA处理的人原代肝细胞上清液中的ANGPTL3水平来确认(图5)。靶蛋白的减少与qPCR量化的mRNA敲低具有较好的相关性(图6)。这包括未表现出通过qPCR观察到的mRNA敲低活性的两个GalNAc-siRNA，从而转化为蛋白质水平。这些数据证实，用我们的siRNA成功敲低mRNA可靠地转化为相应的靶蛋白的减少。

最后，使用上述表达人ANGPTL3 mRNA的人源化小鼠模型(图7)对三种所选GalNAc-siRNA分子进行体内测试。经皮下施用12mg/kg的所选化合物后，与用非靶向对照处理的动物相比，靶蛋白水平降低75％至90％(KD_max)。根据不同的化合物，在治疗后第20天与第35天之间，水平恢复到最大敲低水平的50％(KD₅₀)。到第55天，各组均恢复到基线水平。

综上所述，发明人已证明成功确定了siRNA在GalNAc缀合物的背景下，强烈降低人ANGPTL3 mRNA及其转化的蛋白在体内和体外的表达。

实例5：用于抑制人ANGPTL3表达的其它siRNA的确定

方法

所用方法与实例2中所用的方法相同。

结果

为了确定更多对靶向人ANGPTL3有用的siRNA，对实例2所示的设计和选择标准进行了调整，允许与食蟹猕猴(食蟹猴)存在一种不匹配。此外，所有相关siRNA序列要么与除ANGPTL3以外的任何人转录物存在3种以上的不匹配，要么在最多一个人类基因中存在2种匹配；不符合这两个标准之一的序列被过滤。从而产生49种其它的siRNA(参见表1，构建体163-211)。此外，三个siRNA(siRNA#013、siRNA#014和siRNA#015的扩展变体)被纳入分析(参见表1，构建体212-214)。

如上所述，52个siRNA均采用具有固定模式的核苷酸生成(参见表2，构建体163-214)。为了测试52个siRNA减少ANGPTL3表达的能力，用0.1nM或1.0nM的每个siRNA来转染人Hep3B细胞和食蟹猴原代肝细胞，并培养48小时。培养后，测量每个样本中ANGPTL3的mRNA表达，并与利用非靶向对照siRNA处理的细胞进行比较(图8和图9)。选择在人Hep3B中的mRNA表达减少至少75％，或在食蟹猴肝细胞中减少至少70％的11种浓度为1.0nM的siRNA进行进一步确定。令人惊讶的是，尽管存在单个核苷酸不匹配，在人体细胞中具有活性的大多数siRNA也能在食蟹猴肝细胞中发挥作用。

在人Hep3B细胞中，对所选11个siRNA进行IC₅₀测量(表8)和细胞毒性测定(图10)。在移除示出＜30％的NT对照活力/毒性比(50nM时)的一个siRNA(siRNA#173)后，根据其人IC₅₀值选择四个siRNA与GalNAc缀合(表8)。

表8其它所选siRNA的活性

化合物	I_max	IC₅₀[nM]	选择GalNAc缀合
				siRNA#165	0.919	4.19E-02	X
siRNA#166	0.875	5.58E-01
				siRNA#168	0.866	1.15E-01
siRNA#169	0.949	6.47E-02
				siRNA#171	0.940	5.21E-03	X
siRNA#172	0.942	3.99E-02	X
				siRNA#173	0.961	6.07E-02
siRNA#177	0.967	1.30E-01
				siRNA#189	0.902	2.67E-01
siRNA#210	0.947	6.43E-02
				siRNA#212	0.915	2.84E-02	X

综上所述，这些结果表明，尽管食蟹猕猴中存在单个核苷酸不匹配，但仍能确定能够有效抑制人ANGPTL3 mRNA表达和食蟹猕猴ANGPTL3 mRNA表达的siRNA。

实例6：用于抑制人ANGPTL3表达和食蟹猴ANGPTL3表达的活性GalNAc缀合siRNA的确定

方法

所用方法与实例3中的方法相同。

结果

在选择如实例5所示的其它有效siRNA后，发明人继续证明了在GalNAc缀合物适用于体内传递肝特异性siRNA的情况下，所选分子是否保持活性。他们还评估了这种活性是否能在关键临床前物种——食蟹猕猴(食蟹猴)的细胞中保持。

IC₅₀的测量结果证明，所有被测试siRNA缀合物在通过自由摄取传递到人原代肝细胞时均保持活性(表9；第一轮筛选产生的两个siRNA被列为参考)，其中IC₅₀值为1.91 nM至9.68nM。然而，令人惊讶的是，自由摄取GalNAc-siRNA后的性能排名与转染辅助摄取未结合的siRNA后的性能排名不同(表8)。这再次表明，siRNA似乎具有基于其序列的固有特性，使其在GalNAc缀合物的应用中具有不同的敲低效力。

表9其它所选GalNAc缀合siRNA在人原代肝细胞中的I_max和IC₅₀

化合物	I_max	IC₅₀[nM]
			siRNA#1 65-c	0.786	3.45
siRNA#171-c	0.904	1.91
			siRNA#1 72-c	0.620	8.15
siRNA#212-c	0.741	9.68
			siRNA#01 3-c	0.873	2.09
siRNA#01 5-c	0.846	1.97

在食蟹猴肝细胞中测得的IC₅₀活性(表10)比在人肝细胞中观察到的异质性小(0.406nM至0.987nM)，而I_max也存在类似变化(食蟹猴为0.605至0.892，而人类为0.620至0.904)，但不同的siRNA示出最佳I_max(人类中的是siRNA#171-c，食蟹猴中的是siRNA#013-c)。

表10其它所选GalNAc缀合siRNA在食蟹猴原代肝细胞中的I_max和IC₅₀

化合物	I_max	IC₅₀[nM]
			siRNA#165-c	0.719	9.87E-01
siRNA#171-c	0.605	8.48E-01
			siRNA#172-c	N/A	N/A
siRNA#212-c	0.752	9.12E-01
			siRNA#013-c	0.892	4.06E-01
siRNA#015-c	0.864	8.22E-01

N/A：无可测量活性。

这些出乎意料的观察结果再次强调了使用功能性体外测定进行活性量化和分子选择的要求。

实例7：用于抑制人ANGPTL3表达的其它GalNAc缀合siRNA的体外和体内特性表征

方法

所用方法与实例4相同。

结果

通过检查从三个不同的健康供体分离的人原代PMBC在转染siRNA后分泌的干扰素α 2a(图11)，在人体细胞中进行人原代细胞对4种额外GalNAc-siRNA靶向ANGPTL3(如实例5所示)的免疫反应的体外测量。对于任何一个被测试GalNAc-siRNA，在人PBMC中没有观察到免疫刺激的迹象。

而且，还通过测定其它ANGPTL3 GalNAc-siRNA的相对稳定性和半衰期，在50％小鼠血清中测试它们的体外核酸酶稳定性(表11)。半衰期在24小时与72小时之间。

表11体外血清稳定性

化合物	t_1/2
		siRNA#165-c	24h
siRNA#171-c	72h
		siRNA#172-c	48h
siRNA#212-c	72h

在人原代肝细胞中进行细胞毒性测定，以排除具有毒性潜力的GalNAc-siRNA，以进行进一步选择(图12)。没有观察到任何分子具有明显剂量依赖性毒性作用。这些结果表明，我们选择的siRNA在GalNAc缀合物中应用通常不具有细胞毒性。

剂量依赖性ANGPTL3蛋白敲低通过量化用三种不同浓度(0.1nM、1nM和1000nM)的GalNAc-siRNA处理的人原代肝细胞上清液中的ANGPTL3水平来确认(图13)。这些数据证实，用我们的GalNAc-siRNA获得的成功mRNA敲低，可靠地转化为相应的靶蛋白减少。

最后，在表达人ANGPTL3的体内小鼠模型(图14)中，对三种GalNAc-siRNA进行并列测试(实例2至实例4)。经皮下施用10mg/kg的所选化合物后，与用非靶向对照处理的动物相比，靶蛋白水平降低60％至80％(KD_max)。根据不同的化合物，在治疗后第20天与第45天之间，水平恢复到最大敲低水平的50％(KD₅₀)。到第90天，各组均恢复到基线水平。

综上所述，发明人已成功确定其它siRNA在GalNAc缀合物的背景下，强烈降低人ANGPTL3 mRNA及其转化的蛋白在体内和体外的表达。

实例8：GalNAc缀合ANGPTL3 siRNA序列的优化

方法

修饰GalNAc siRNA序列的生成

如PCT专利文献WO 2019/170731所述，用式(I)修饰核苷酸进一步优化GalNAcsiRNA序列的合成。所有寡核苷酸均在ABI 394合成器上合成。市售(Sigma Aldrich)DNA-、RNA-、2′-OMe-RNA和带标准保护基团的2′-脱氧-F-RNA-亚磷酰胺(例如5′-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷-3′-O-(N,N-二异丙基-2-氰乙基-亚磷酰胺、5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿嘧啶-′-O-(N,N-二异丙基-2-氰乙基)-亚磷酰胺、5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N4-胞苷-3′-O-(N,N-二异丙基-2-氰乙基)-亚磷酰胺、5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N6-苯甲酰基-腺苷-3′-O-(N,N-二二异异常丙-2-氰乙基)-亚磷酰胺、5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N2-异丁酰-鸟苷-′-O-(N，N-二异丙基-2-氰乙基)-亚磷酰胺、5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-O-甲基-尿嘧啶-′-O-(N，N-二异丙基-)2-氰乙基)-亚磷酰胺、5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-O-甲基-N4-胞苷-′-O-(N，N-二异丙基-2-氰乙基)-亚磷酰胺、5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-O-甲基-N6-苯甲酰-腺苷-3′-O-(N，N-二异丙基-2-氰乙基)-亚磷酰胺、5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-O-甲基-N2-异丁酰-鸟苷-′-O-(N，N-二异丙基-2-氰乙基)-亚磷酰胺、5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脱氧-氟-尿嘧啶-′-O-(N，N-二异丙基-2-氰乙基)-亚磷酰胺、5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脱氧-氟-N4-胞苷-3′-O-(N，N-二异丙基-2-氰乙基)-亚磷酰胺、以及5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脱氧-氟-N6-苯甲酰-腺苷-3′-O-(N，N-二异丙基-2-氰乙基)-亚磷酰胺和5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脱氧-氟-N2-异丁酰-鸟苷-′-O-(N,N-二异丙基-2-氰乙基)-亚磷酰胺)，以及相应的固相载体材料(载有40μmol/g，ChemGenes)均用于自动化寡核苷酸合成。

磷酰胺构建块使用0.1M的乙腈溶液，并且用5-(双-3，5-三氟甲基苯基)-1H-四唑(活化剂42，0.25M乙腈溶液，Sigma-Aldrich)进行活化。标准磷酰胺偶联的反应时间为200s。在本文所述的磷酰胺的情况下，偶联时间为300s。作为封端剂，使用THF中的乙酸酐(ABI的capA，Sigma-Aldrich)和THF中的N-甲基咪唑(ABI中的capB，Sigma-Adrich)。作为氧化试剂，使用THF/吡啶/水(0.02M；用于ABI的氧化剂，Sigma Aldrich)中的碘。另外，用0.05M的3-((N,N-二甲基-氨基亚甲基)氨基)-3H-1，2，4-二噻唑-5-硫酮(DDTT)溶液在吡啶/乙腈(1：1)中进行PS氧化。DMT保护基的脱保护在DCM(DCA deblock，Sigma-Aldrich)中使用二氯乙酸进行。用NH₃(32％的水溶液/乙醇，v/v3：1)实现固相载体的最终裂解和脱保护(酰基和氰乙基保护基)。采用NMP/NEt₃/HF(3：1.5：2)处理，以实现TBDMS脱保护。

在固相载体材料或通用连接剂-固相载体材料(载有39μmol/g，AMChemicals LLC)上，合成3′端带有本文所述构建块的寡核苷酸以及表A中所示的相应磷酰胺。

用HPLC分析粗品，用离子交换法或制备HPLC法进行单链纯化。

离子交换：净化器，(Thermo Fisher Scientific DNAPac PA200半制备离子交换柱，8μm颗粒，22mm宽x 250mm长)。

缓冲液A：1.5L的H₂O、2.107g的NaClO₄、438mg的EDTA、1.818g的TRIS、540.54g的尿素，pH＝7.4。

缓冲液B：1.5L的H₂O、105.34g的NaClO₄、438mg的EDTA、1.818g的TRIS、40.54g的尿素，pH＝7.4。

通过添加4体积的乙醇并且在-20℃下储存进行诱导，经沉淀来分离寡核苷酸。

预制备HPLC：Agilent 1100系列制备HPLC(Waters C18 OBD^TM制备柱/>5μm，10mm x 100mm)。洗脱液：(0.1M的乙腈/水)。冷冻干燥后，将产品溶于1.0mL的2.5M NaCl溶液和4.0mL的H₂O。沉淀后加入20mL的乙醇，在-20℃下储存18小时，并分离出相应的Na⁺-盐。

通过LC/MS-TOF法完成单链的最终分析。对于双链的形成，将等量的正义链和反义链在1 x PBS缓冲液中混合，并加热到85℃，持续10分钟。然后慢慢冷却到室温。用LC/MS-TOF法对siRNA双链进行最终分析。

按实例1所述进行siRNA双链的退火。表3示出每个siRNA的序列(包括核苷酸修饰)。

小鼠血清中的siRNA稳定性

表3中列出的优化ANGPTL3 siRNA的稳定性按照实例1所述进行测定，但以下情况例外：siRNA在37℃下培养0小时、24小时、48小时、72小时、96小时和168小时。蛋白酶K购自Qiagen(产品编号：19133)，并且HPLC分析在Agilent Technologies 1260 Infinity II仪器上使用1260DAD检测器进行。

细胞培养及基于细胞的测定。

人Hep3B细胞、原代人肝细胞和原代人PBMC均按照实例2至实例7所述进行分离和培养。mRNA的分析按实例2所述进行。如实例2所述，在5nM和50nM的siRNA转染人Hep3B细胞72小时后，测量细胞毒性。如实例4所述，对人PBMC上清液中的IFN α蛋白浓度进行量化。

体内试验

如实例4所述，在用AAV8载体编码来自ApoA2启动子的人ANGPTL3 mRNA转导的小鼠中，测量修饰GalNAc-ANGPTL3 siRNA的体内活性。与实例4相比，每个治疗组的5只C57BL/6雄鼠皮下注射单次siRNA的剂量为5mg/kg。

ANGPTL3 ELIS4测定法

如实例4所述，对用修饰GalNAc-siRNA处理的小鼠血清ANGPTL3蛋白水平进行量化。

结果

54种不同的siRNA修饰模式被设计并应用于三种预选siRNA序列(siRNA#013、siRNA#051和siRNA#165)。在各自siRNA正义链的5′端使用三个连续修饰GalNAc缀合核苷酸，合成3x 54个siRNA分子库(siRNA#013-c-01至siRNA#013-c-54、siRNA#051-c-01至siRNA#051-c-54、以及siRNA#165-c-01至siRNA#165-c-54，表3)。

在50％的小鼠血清中测试162个修饰ANGPTL3 siRNA的核酸酶稳定性。如表12所示，与具有固定模式的2′-O-甲基和2′-氟修饰核苷酸的亲本序列相比，几个分子的稳定性显著提高。对于从siRNA#013-c和siRNA#051-c衍生的构建体，血清半衰期从亲本构建体模式的约72小时提高到168小时或更长时间。对于源自siRNA#165-c的构建体，血清半衰期从大约24小时提高到96小时或更长时间。

表12体外血清稳定性

siRNA构建体	t_1/2	siRNA构建体	t1/2	siRNA构建体	t_1/2
						siRNA#013-c	＝72h	siRNA#051-c	＝72h	siRNA#165-c	＝24h
siRNA#013-c-01	>96h	siRNA#051-c-01	>168h	siRNA#165-c-01	>96h
						siRNA#013-c-02	>96h	siRNA#051-c-02	>168h	siRNA#165-c-02	>96h
siRNA#013-c-03	>96h	siRNA#051-c-03	>168h	siRNA#165-c-03	>96h
						siRNA#013-c-04	>72h	siRNA#051-c-04	>96h	siRNA#165-c-04	>48h
siRNA#013-c-05	>96h	siRNA#051-c-05	>168h	siRNA#165-c-05	>96h
						siRNA#013-c-06	>96h	siRNA#051-c-06	>168h	siRNA#165-c-06	>96h
siRNA#013-c-07	>96h	siRNA#051-c-07	>168h	siRNA#165-c-07	>96h
						siRNA#013-c-08	>48h	siRNA#051-c-08	>96h	siRNA#165-c-08	>72h
siRNA#013-c-09	>96h	siRNA#051-c-09	>168h	siRNA#165-c-09	＝168h
						siRNA#013-c-10	>96h	siRNA#051-c-10	>168h	siRNA#165-c-10	＝96h

接下来，在自由摄取条件下，用浓度为1 nM、10nM和100nM的修饰siRNA来评估162个修饰GalNAc-siRNA在原代人肝细胞中的敲低效力。亲本siRNA#013-c、siRNA#051-c和siRNA#165-c构建体被用作阳性对照。数据在图15A至图15F中示出。

根据体外敲低活性和核酸酶稳定性数据，为三个亲本构建体中的每一个亲本构建体选择八种修饰变体。在进行体内活性测试之前，测试3x 8个修饰构建体在人PBMC中刺激先天免疫的能力(图16)以及在人Hep3B细胞中的一般细胞毒性(图17)。在这两个试验中，没有观察到明显的不利影响。

最后，使用上述表达人ANGPTL3 mRNA的人源化小鼠模型(图18A至18C)对3x 8个所选修饰GalNAc-siRNA构建体进行体内测试。在以单次皮下施用5mg/kg的所选化合物后，与用PBS处理的动物相比，靶蛋白水平降低高达约95％(KD_max)。到第63天，最持久的优化分子尚未恢复到最大敲低量的50％(KD₅₀)，而所有三种亲本构建体在这一点上示出＜15％的剩余活性。

综上所述，发明人已证明成功确定了siRNA在GalNAc缀合物的背景下，强烈降低人ANGPTL3 mRNA及其转化的蛋白在体内和体外的表达。他们还证明了通过使用修饰核苷酸引入优化的修饰模式，意外地显著提高了siRNA的体内效力。尽管稳定性与体外性能之间存在不牢靠的相关性，但根据非体内数据，无法系统地预测某些修饰siRNA的体内效力。

ANGPTL3序列

人ANGPTL3 mRNA序列(SEQ ID NO：1181)

/>

人ANGPTL3多肽序列(SEQ ID NO：1182)

食蟹猴ANGPTL3 mRNA序列(SEQ ID NO：1183)

食蟹猴ANGPTL3多肽序列(SEQ ID NO：1184)

/>

Claims

1.一种双链核糖核酸(dsRNA)，所述dsRNA通过靶向ANGPTL3基因RNA转录本上的靶序列来抑制人血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)基因的表达，其中所述dsRNA包括包含正义序列的正义链和包含反义序列的反义链，其中所述正义序列与所述靶序列至少是90％相同的，并且其中所述靶序列为SEQ ID NO：1181的核苷酸143-161、135-153、1535-1553、143-163、144-162、145-163、150-168、151-169、1528-1546、1530-1548、1532-1550、1533-1551、1602-1620、2612-2630、或2773-2791。

2.根据权利要求1所述的dsRNA，其中所述正义链与所述反义链在15至25个连续核苷酸区域中相互互补。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的dsRNA，其中所述正义链与所述反义链的长度不超过30个核苷酸。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的dsRNA，其中所述靶序列是SEQ ID NO：1181的核苷酸143-161、135-153、1535-1553、143-163、144-162、145-163、或150-168。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA包括反义序列，所述反义序列与选自SEQ ID NO：227-229、SEQ ID NO：261-265、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：343、SEQID NO：356、SEQ ID NO：379、SEQ ID NO：385、SEQ ID NO：386，以及SEQ ID NO：426组成的组中的核苷酸序列至少是90％相同的。

6.根据权利要求1所述的dsRNA，其中所述正义序列与所述反义序列是互补的，其中：

a)所述正义序列包括选自SEQ ID NO：13-15、SEQ ID NO：47-51、SEQ ID NO：55、SEQ IDNO：129、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、以及SEQ ID NO：212组成的组中的核苷酸序列；或

b)所述反义序列包括选自SEQ ID NO：227-229、SEQ ID NO：261-265、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：343、SEQ ID NO：356、SEQ ID NO：379、SEQ ID NO：385、SEQ ID NO：386、以及SEQID NO：426组成的组中的核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的dsRNA，其中所述dsRNA的正义链和反义链分别包括以下核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：227；

b)SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：265；

c)SEQ ID NO：165和SEQ ID NO：379；

d)SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：228；

e)SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：229；

f)SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：261；

g)SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：262；

h)SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：263；

i)SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：264；

j)SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：269；

k)SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：343；

1)SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：356；

m)SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：385；

n)SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：386；或

o)SEQ ID NO：212和SEQ ID NO：426。

8.根据权利要求6所述的dsRNA，其中所述dsRNA的正义链和反义链分别包括以下核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：227；

b)SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：265；

c)SEQ ID NO：165和SEQ ID NO：379；

d)SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：228；

e)SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：229；或

f)SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：385。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA包括一个或多个修饰核苷酸，其中所述一个或多个修饰核苷酸中的至少一个是2′-脱氧-2′-氟-核糖核苷酸、2′-脱氧核糖核苷酸或2′-O-甲基-核糖核苷酸。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA在其正义链或反义链的3′端上包括倒置2′-脱氧核糖核苷酸。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的dsRNA，其中所述正义链和所述反义链中的一条或两条还包括：

a)包含一个或多个核苷酸的5′突出端；和/或

b)包含一个或多个核苷酸的3′突出端。

12.根据权利要求11所述的dsRNA，其中所述dsRNA中的突出端包括2或3个核苷酸。

13.根据权利要求11或12所述的dsRNA，其中所述dsRNA中的突出端包括一个或多个胸腺嘧啶。

14.权利要求1至13中任一项所述的dsRNA，其中所述正义序列和所述反义序列包括交替的2′-O-甲基-核糖核苷酸和2′-脱氧-2′-氟-核糖核苷酸。

15.根据权利要求1所述的dsRNA，其中：

a)所述正义链包括选自SEQ ID NO：441-443、SEQ ID NO：475-479、SEQ ID NO：483、SEQID NO：557、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、以及SEQ IDNO：640组成的组中的核苷酸序列；和/或

b)所述反义链包括选自SEQ ID NO：655-657、SEQ ID NO：689-693、SEQ ID NO：697、SEQID NO：771、SEQ ID NO：784、SEQ ID NO：807、SEQ ID NO：813、SEQ ID NO：814、以及SEQ IDNO：854组成的组中的核苷酸序列。

16.根据权利要求15所述的dsRNA，其中所述dsRNA的正义链和反义链分别包括以下核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：441和SEQ ID NO：655；

b)SEQ ID NO：479和SEQ ID NO：693；

c)SEQ ID NO：593和SEQ ID NO：807；

d)SEQ ID NO：442和SEQ ID NO：656；

e)SEQ ID NO：443和SEQ ID NO：657；

f)SEQ ID NO：475和SEQ ID NO：689；

g)SEQ ID NO：476和SEQ ID NO：690；

h)SEQ ID NO：477和SEQ ID NO：691；

i)SEQ ID NO：478和SEQ ID NO：692；

j)SEQ ID NO：483和SEQ ID NO：697；

k)SEQ ID NO：557和SEQ ID NO：771；

l)SEQ ID NO：570和SEQ ID NO：784；

m)SEQ ID NO：599和SEQ ID NO：813；

n)SEQ ID NO：600和SEQ ID NO：814；或

o)SEQ ID NO：640和SEQ ID NO：854。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA缀合至一个或多个包含或不包含连接子的配体上。

18.根据权利要求18所述的dsRNA，其中所述配体是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，并且所述dsRNA缀合至一个或多个GalNAc。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA是小干扰RNA(siRNA)。

20.根据前述权利要求任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA的一条或两条链包括具有以下结构的一种或多种化合物：

其中：

-B是杂环核碱基，

-Y是O、NH、NR1或N-C(＝O)-R1，其中R1是：

J是O或S，

·-[C(＝O)]m-R2-(O-CH₂-CH₂)p-R3基，其中

m是为0或1的整数，

p是为0到10的整数，

R2是可选地由(C1-C6)烷基、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(＝K)-O-Z3、-O-C(＝K)-Z3、-C(＝K)-N(Z3)(Z4)、或-N(Z3)-C(＝K)-Z4取代的(C1-C20)亚烃基，其中K是O或S，

Z3和Z4中的每一个独立地是H、(C1-C6)烷基，所述Z3和所述Z4中的每一个可选地由选自卤原子和(C1-C6)烷基的一个或多个基团取代，

和

或者R3是细胞靶向部分，

-X1和X2分别独立地是氢原子、(C1-C6)烷基，并且

-Ra、Rb、Rc和Rd中的每一个独立地是H或(C1-C6)烷基，

或其药学上可接受的盐。

21.根据权利要求20所述的dsRNA，包括一个或多个式(I)化合物，其中Y是

a)NR1，R1是非取代(C1-C20)烷基；

d)NR1，R1是环己基；

e)NR1，R1是由(C6-C14)芳基取代的(C1-C20)烷基；

f)NR1，R1是由苯基取代的甲基；

g)N-C(＝O)-R1，R1是可选地取代的(C1-C20)烷基；或

h)N-C(＝O)-R1，R1是甲基或十五烷基。

22.根据权利要求20或21所述的dsRNA，包括一个或多个式(I)化合物，其中B选自由嘧啶、取代嘧啶、嘌呤和取代嘌呤组成的组，或其药学上可接受的盐。

23.根据权利要求20至22中任一项所述的dsRNA，其中R3为式(II)：

其中A1、A2和A3是OH，

24.根据权利要求20至23中任一项所述的dsRNA，其中R3是N-乙酰半乳糖胺(N-acetyl-galactosamine)，或其药学上可接受的盐。

25.根据权利要求20至24中任一项所述的dsRNA，包括表A中的一个或多个核苷酸。

26.根据权利要求20至25所述的dsRNA，包括2至10个式(I)化合物，或其药学上可接受的盐。

27.根据权利要求26所述的dsRNA，其中所述2至10个式(I)化合物位于所述正义链上。

28.根据权利要求20至27中任一项所述的dsRNA，其中所述正义链在5′端上包括2至5个式(I)化合物，和/或在3′端上包括1至3个式(I)化合物。

29.根据权利要求28所述的dsRNA，其中

a)位于所述正义链的5′端上的2至5个式(I)化合物包括lgT3和/或lgT7，可选地包括3个连续lgT3核苷酸；并且/或者

b)位于所述正义链的3′端上的1至3个式(I)化合物包括1T4和/或1T3，可选地包括2个连续1T4。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的dsRNA，包括独立地选自磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸烷基酯和磷酰胺主链连接基的一个或多个核苷间连接基，或其药学上可接受的盐。

31.根据权利要求1所述的dsRNA，选自表1至表3中的dsRNA。

32.根据权利要求1所述的dsRNA，其中：

a)所述正义链包括从选自SEQ ID NO：858、SEQ ID NO：902、SEQ ID NO：907、SEQ IDNO：911、SEQ ID NO：915、SEQ ID NO：934、SEQ ID NO：970、SEQ ID NO：979、以及SEQ ID NO：988组成的组中的核苷酸序列；或

b)所述反义链包括选自SEQ ID NO：1020、SEQ ID NO：1064、SEQ ID NO：1069、SEQ IDNO：1073、SEQ ID NO：1077、SEQ ID NO：1096、SEQ ID NO：1132、SEQ ID NO：1141、以及SEQID NO：1150组成的核苷酸序列。

33.根据权利要求32所述的dsRNA，其中所述dsRNA的所述正义链和所述反义链分别包括以下核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：858和SEQ ID NO：1020；

b)SEQ ID NO：902和SEQ ID NO：1064；

c)SEQ ID NO：907和SEQ ID NO：1069；

d)SEQ ID NO：911和SEQ ID NO：1073；

e)SEQ ID NO：915和SEQ ID NO：1077；

f)SEQ ID NO：934和SEQ ID NO：1096；

g)SEQ ID NO：970和SEQ ID NO：1132；

h)SEQ ID NO：979和SEQ ID NO：1141；或

i)SEQ ID NO：988和SEQ ID NO：1150。

34.一种药物组合物，包括根据权利要求1至33中任一项所述的dsRNA和药学上可接受的赋形剂。

35.根据权利要求1至33中任一项所述的dsRNA或权利要求34的组合物，所述dsRNA或所述组合物用于抑制ANGPTL3在有此需要的人中的表达。

36.根据权利要求35的dsRNA或组合物所述的用途，其中所述ANGPTL3基因在人肝脏中的表达被所述dsRNA所抑制。

37.根据权利要求1至36中任一项所述的dsRNA或权利要求34所述的组合物，所述dsRNA或所述组合物用于治疗或预防有此需要的人中的ANGPTL3相关病症。

38.根据权利要求37所述的dsRNA或组合物的用途，其中所述ANGPTL3相关病症是脂代谢紊乱。

39.根据权利要求38所述的dsRNA或组合物的用途，其中所述脂代谢紊乱是高甘油三酯血症。

40.一种用于治疗和/或预防一种或多种ANGPTL3相关病症的方法，包括施用权利要求1至33中任一项定义的一种或多种dsRNA，和/或权利要求34中定义的一种或多种药物组合物。