CN115176011A

CN115176011A - 用于抑制pcsk9的组合物和方法

Info

Publication number: CN115176011A
Application number: CN202080073296.3A
Authority: CN
Inventors: B·布鲁纳; K·杰恩-霍夫曼; S·谢德勒; P·里弗
Original assignee: Sanofi Aventis France
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 2019-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2022-10-11
Also published as: US20220290156A1; JP2022546040A; EP4022061A1; WO2021037972A1

Abstract

本文尤其提供了靶向PCSK9的dsRNA组合物、抑制PCSK9基因表达的方法以及治疗一种或多种与PCSK9基因表达相关的疾病的方法。

Description

用于抑制PCSK9的组合物和方法

技术领域

本公开文本涉及靶向蛋白质原转换酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)的dsRNA组合物、抑制PCSK9基因表达的方法以及治疗一种或多种与PCSK9基因表达相关的疾病的方法。

序列表的提交

本说明书中公开了用作参考的核酸序列。相同的序列也出于专利事务目的在根据标准要求格式化的序列表中呈现。如果与标准序列表存在任何序列差异，本说明书中描述的序列应作为参考。

背景技术

PCSK9是枯草杆菌蛋白酶丝氨酸蛋白酶家族的成员。其他八种哺乳动物枯草杆菌蛋白酶PCSK1-8是蛋白质原转换酶，它们加工分泌途径中的多种蛋白质并在多种生物过程中发挥作用。已经提出PCSK9在胆固醇代谢中发挥作用。PCSK9信使RNA(mRNA)表达在小鼠中通过膳食胆固醇喂食下调(Maxwell,K.N.(2003)J.Lipid Res.44,2109-2119)，在HepG2细胞中通过他汀类药物上调(Duboc,G.(2004)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.24,1454-1459)，并且在甾醇调节元件结合蛋白(SREBP)转基因小鼠中上调(Horton,J.D.(2003)PNAS100 12027-12032)，这类似于胆固醇生物合成酶和低密度脂蛋白受体(LDLR)。此外，已经发现PCSK9错义突变与常染色体显性高胆固醇血症的形式相关(Abifadel,M.(2003)Nat.Genet.34,154-156；Timms,K.M.(2004)Hum.Genet.114,349-353；Leren,T.P.(2004)Clin.Genet.65,419-422)。因为单核苷酸多态性(SNP)已经与日本人群的胆固醇水平相关，所以PCSK9也可能在确定普通人群的低密度脂蛋白(LDL)胆固醇水平方面发挥作用(Shioji,K.(2004)J.Genet.49,109-114)。

常染色体显性高胆固醇血症(ADH)是单基因疾病，其中患者展现出升高的总胆固醇水平和LDL胆固醇水平、腱黄色瘤和过早动脉粥样硬化(Rader,D.J.(2003)J.Clin.Invest.111,1795-1803)。ADH和隐性形式常染色体隐性高胆固醇血症(ARH)的发病机制(Cohen,J.C.(2003)Curr.Opin.Lipidol.14,121-127)是由于肝脏对于LDL摄取的缺陷。阻碍LDL摄取的LDLR突变或LDL上的与LDLR结合的蛋白质载脂蛋白B中的突变可能导致ADH。ARH是由低密度脂蛋白受体衔接蛋白1(LDLRAP1)蛋白中的突变导致的，这种蛋白质是经由它与网格蛋白的相互作用而胞吞LDLR-LDL复合物所必需的。

过表达研究指出PCSK9在控制LDLR水平中以及因此在控制肝脏的LDL摄取中的作用(Maxwell,K.N.(2004)PNAS 101,7100-7105；Benjannet,S.等人(2004)J.Biol.Chem.279,48865-48875；Park,S.W.(2004)J.Biol.Chem.279,50630-50638)。小鼠中腺病毒介导的小鼠或人PCSK9过表达导致总胆固醇水平和LDL胆固醇水平升高；而在LDLR敲除动物中没有发现此效应(Maxwell,K.N.(2004)PNAS 101,7100-7105；Benjannet,S.等人(2004)J.Biol.Chem.279,48865-48875；Park,S.W.(2004)J.Biol.Chem.279,50630-50638)。另外，PCSK9过表达导致肝脏LDLR蛋白严重减少，而没有影响LDLR mRNA水平、SREBP蛋白水平、或细胞核与细胞质SREBP蛋白比率。

已经在小鼠模型中设计出PCSK9功能丧失突变(Rashid等人(2005)PNAS,102,5374-5379)，并且已经在人类个体中鉴定出PCSK9功能丧失突变(Cohen等人(2005)NatureGenetics 37:161-165)。在这两种情况下，PCSK9功能丧失都导致总LDL胆固醇(LDL-C)降低。研究了与PCSK9基因中的序列改变相关的血浆LDL-C终身降低的影响，并且数据指示血浆LDL-C水平的中度终身降低与冠状动脉事件发生率的大幅降低相关，并且赋予针对冠心病的保护。(Cohen等人(2006)N.Engl.J.Med.354:1264-1272)。

已经显示双链RNA分子(dsRNA)以称为RNA干扰(RNAi)的高度保守调节机制阻断基因表达。WO 99/32619披露了长度为至少25个核苷酸的dsRNA抑制秀丽隐杆线虫(C.elegans)中基因表达的用途。还显示dsRNA在其他生物体中降解靶RNA，所述生物体包括植物(参见例如，WO 99/53050；WO 99/61631)、果蝇(Drosophila)(参见例如，Yang,D.等人(2000)Curr.Biol.10:1191-1200)和哺乳动物(参见例如，WO 00/44895)。此天然机制现在已经成为开发用于治疗由基因的异常或不期望的调节导致的障碍的新类别药剂的焦点。

由于PCSK9在调节LDL胆固醇中的重要性和心血管疾病(如高胆固醇血症)的流行，持续需要鉴定PCSK9表达的抑制剂(如dsRNA)并且测试这样的抑制剂的功效和不期望的副作用(如细胞毒性)。

本文中引用的所有参考文献，包括专利申请、专利出版物、非专利文献和UniProtKB/Swiss-Prot登录号均通过引用以其整体并入本文，如同每个单独的参考文献被具体地且单独地指出通过引用并入。

发明内容

为了满足这些和其他需要，本文提供了一种可用于抑制蛋白质原转换酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCKS9)基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)。

因此，在一个方面，本文提供了一种双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链，其中所述第一序列与所述第二序列互补，并且其中所述第一序列包含选自SEQ ID NO:6-11和310-321的序列。

根据另一个方面，本公开文本提供了一种双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链，其中所述第一序列与所述第二序列互补，其中所述第一序列包含选自SEQ ID NO:6-11和310-321的序列，其中所述dsRNA任选地是小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)，并且其中所述dsRNA任选地抑制蛋白质原转换酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)基因的表达。

在另一个实施方案中，本公开文本提供了一种双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链，其中所述第一序列与所述第二序列互补，其中所述第一序列包含选自SEQ ID NO:6-11和310-321的序列，其中所述选择的序列包含小于30％的GC，其中所述dsRNA任选地是小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)，并且其中所述dsRNA任选地抑制蛋白质原转换酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)基因的表达。

在一些实施方案中，所述dsRNA包含(1)在所述有义链中的UUUUAUUAAUAUGGUGACU(SEQ ID NO:6)和在所述反义链中的AGUCACCAUAUUAAUAAAA(SEQ ID NO:373)；(2)在所述有义链中的UAUUAAUAUGGUGACUUUU(SEQ ID NO:7)和在所述反义链中的AAAAGUCACCAUAUUAAUA(SEQ ID NO:374)；(3)在所述有义链中的AUUAAUAUGGUGACUUUUU(SEQ ID NO:8)和在所述反义链中的AAAAAGUCACCAUAUUAAU(SEQ ID NO:375)；(4)在所述有义链中的UUAAUAUGGUGACUUUUUA(SEQ ID NO:9)和在所述反义链中的UAAAAAGUCACCAUAUUAA(SEQ IDNO:376)；(5)在所述有义链中的UAAUAUGGUGACUUUUUAA(SEQ ID NO:10)和在所述反义链中的UUAAAAAGUCACCAUAUUA(SEQ ID NO:377)；(6)在所述有义链中的UAUGGUGACUUUUUAAAAU(SEQ ID NO:11)和在所述反义链中的AUUUUAAAAAGUCACCAUA(SEQ ID NO:378)；(7)在所述有义链中的UUAUUAAUAUGGUGACUUU(SEQ ID NO:310)和在所述反义链中的AAAGUCACCAUAUUAAUAA(SEQ ID NO:380)；(8)在所述有义链中的AUAUGGUGACUUUUUAAAA(SEQID NO:311)和在所述反义链中的UUUUAAAAAGUCACCAUAU(SEQ ID NO:381)；(9)在所述有义链中的AUUUUUAUUAAUAUGGUGACU(SEQ ID NO:312)和在所述反义链中的AGUCACCAUAUUAAUAAAAAU(SEQ ID NO:382)；(10)在所述有义链中的UUUUAUUAAUAUGGUGACUUU(SEQ ID NO:313)和在所述反义链中的AAAGUCACCAUAUUAAUAAAA(SEQ ID NO:383)；(11)在所述有义链中的UUUAUUAAUAUGGUGACUUUU(SEQ ID NO:314)和在所述反义链中的AAAAGUCACCAUAUUAAUAAA(SEQ ID NO:384)；(12)在所述有义链中的UAUUAAUAUGGUGACUUUUUA(SEQ ID NO:315)和在所述反义链中的UAAAAAGUCACCAUAUUAAUA(SEQ ID NO:385)；(13)在所述有义链中的AAUAUGGUGACUUUUUAAAAU(SEQ ID NO:316)和在所述反义链中的AUUUUAAAAAGUCACCAUAUU(SEQ ID NO:386)；(14)在所述有义链中的GCAUUUUUAUUAAUAUGGUGACU(SEQ ID NO:317)和在所述反义链中的AGUCACCAUAUUAAUAAAAAUGC(SEQ ID NO:387)；(15)在所述有义链中的AUUUUUAUUAAUAUGGUGACUUU(SEQ ID NO:318)和在所述反义链中的AAAGUCACCAUAUUAAUAAAAAU(SEQ ID NO:388)；(16)在所述有义链中的UUUUUAUUAAUAUGGUGACUUUU(SEQ ID NO:319)和在所述反义链中的AAAAGUCACCAUAUUAAUAAAAA(SEQ ID NO:389)；(17)在所述有义链中的UUUAUUAAUAUGGUGACUUUUUA(SEQ ID NO:320)和在所述反义链中的UAAAAAGUCACCAUAUUAAUAAA(SEQ ID NO:390)；或(18)在所述有义链中的UUAUUAAUAUGGUGACUUUUUAA(SEQ ID NO:321)和在所述反义链中的UUAAAAAGUCACCAUAUUAAUAA(SEQ ID NO:391)。在一些实施方案中，所述dsRNA包含(1)在所述有义链中的CCAUUUUAUUAAUAUGGUGACUinvdT(SEQ ID NO:176)和在所述反义链中的AGUCACCAUAUUAAUAAAAdTdT(SEQ ID NO:177)；(2)在所述有义链中的CCAUAUUAAUAUGGUGACUUUUinvdT(SEQ ID NO:180)和在所述反义链中的AAAAGUCACCAUAUUAAUAdTdT(SEQ ID NO:181)；(3)在所述有义链中的CCAAUUAAUAUGGUGACUUUUUinvdT(SEQ ID NO:182)和在所述反义链中的AAAAAGUCACCAUAUUAAUdTdT(SEQ ID NO:183)；(4)在所述有义链中的CCAUUAAUAUGGUGACUUUUUAinvdT(SEQ ID NO:184)和在所述反义链中的UAAAAAGUCACCAUAUUAAdTdT(SEQ ID NO:185)；(5)在所述有义链中的CCAUAAUAUGGUGACUUUUUAAinvdT(SEQ ID NO:186)和在所述反义链中的UUAAAAAGUCACCAUAUUAdTdT(SEQ ID NO:187)；(6)在所述有义链中的CCAUAUGGUGACUUUUUAAAAUinvdT(SEQ ID NO:188)和在所述反义链中的AUUUUAAAAAGUCACCAUAdTdT(SEQ ID NO:189)；(7)在所述有义链中的CCAUUAUUAAUAUGGUGACUUUinvdT(SEQ ID NO:322)和在所述反义链中的AAAGUCACCAUAUUAAUAAdTdT(SEQ ID NO:323)；(8)在所述有义链中的CCAAUAUGGUGACUUUUUAAAAinvdT(SEQ ID NO:324)和在所述反义链中的UUUUAAAAAGUCACCAUAUdtdt(SEQ ID NO:325)；(9)在所述有义链中的CCAAUUUUUAUUAAUAUGGUGACUinvdT(SEQ ID NO:326)和在所述反义链中的AGUCACCAUAUUAAUAAAAAUdTdT(SEQ ID NO:327)；(10)在所述有义链中的CCAUUUUAUUAAUAUGGUGACUUUinvdT(SEQ ID NO:328)和在所述反义链中的AAAGUCACCAUAUUAAUAAAAdTdT(SEQ ID NO:329)；(11)在所述有义链中的CCAUUUAUUAAUAUGGUGACUUUUinvdT(SEQ ID NO:330)和在所述反义链中的AAAAGUCACCAUAUUAAUAAAdTdT(SEQ ID NO:331)；(12)在所述有义链中的CCAUAUUAAUAUGGUGACUUUUUAinvdT(SEQ ID NO:332)和在所述反义链中的UAAAAAGUCACCAUAUUAAUAdTdT(SEQ ID NO:333)；(13)在所述有义链中的CCAAAUAUGGUGACUUUUUAAAAUinvdT(SEQ ID NO:334)和在所述反义链中的AUUUUAAAAAGUCACCAUAUUdTdT(SEQ ID NO:335)；(14)在所述有义链中的CCAGCAUUUUUAUUAAUAUGGUGACUinvdT(SEQ ID NO:336)和在所述反义链中的AGUCACCAUAUUAAUAAAAAUGCdTdT(SEQ ID NO:337)；(15)在所述有义链中的CCAAUUUUUAUUAAUAUGGUGACUUUinvdT(SEQ ID NO:338)和在所述反义链中的AAAGUCACCAUAUUAAUAAAAAUdTdT(SEQ ID NO:339)；(16)在所述有义链中的CCAUUUUUAUUAAUAUGGUGACUUUUinvdT(SEQ ID NO:340)和在所述反义链中的AAAAGUCACCAUAUUAAUAAAAAdTdT(SEQ ID NO:341)；(17)在所述有义链中的CCAUUUAUUAAUAUGGUGACUUUUUAinvdT(SEQ ID NO:342)和在所述反义链中的UAAAAAGUCACCAUAUUAAUAAAdTdT(SEQ ID NO:343)；或(18)在所述有义链中的CCAUUAUUAAUAUGGUGACUUUUUAAinvdT(SEQ ID NO:344)和在所述反义链中的UUAAAAAGUCACCAUAUUAAUAAdTdT(SEQ ID NO:345)。在一些实施方案中，所述第一序列与UUGUAGCAUUUUUAUUAAUAUGGUGACUUUUUAAAAUAAAAACAAACA(SEQ ID NO:2)的至少15个连续核苷酸相同并且不是GCAUUUUUAUUAAUAUGGU(SEQ ID NO:5)、UUUGUAGCAUUUUUAUUAAUAUGGU(SEQID NO:576)或AUUUUUAUUAAUAUGGUGA(SEQ ID NO:577)中的一个。

在另一个方面，本公开文本涉及一种双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链，其中仅所述第一序列与所述第二序列互补，并且其中所述第一序列是SEQ ID NO:3、4和13中的一个。在另一个方面，本公开文本涉及一种双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链，其中仅所述第一序列与所述第二序列互补，其中所述第一序列是SEQ ID NO:3、4和13中的一个，其中所述dsRNA任选地是小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)，并且其中所述dsRNA任选地抑制蛋白质原转换酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)基因的表达。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种dsRNA，所述dsRNA包括包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链，其中仅所述第一序列与所述第二序列互补，其中所述第一序列是SEQID NO:3、4和13中的一个，其中所述第一序列包含小于30％的GC，其中所述dsRNA任选地是小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)，并且其中所述dsRNA任选地抑制蛋白质原转换酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)基因的表达。在一些实施方案中，所述dsRNA包含：(19)在所述有义链中的UUGUAGCAUUUUUAUUAAU(SEQ ID NO:3)和在所述反义链中的AUUAAUAAAAAUGCUACAA(SEQ ID NO:370)；(20)在所述有义链中的GUAGCAUUUUUAUUAAUAU(SEQ ID NO:4)和在所述反义链中的AUAUUAAUAAAAAUGCUAC(SEQ ID NO:371)；或(21)在所述有义链中的GAGUGUGAAAGGUGCUGAU(SEQ ID NO:13)和在所述反义链中的AUCAGCACCUUUCACACUC(SEQ ID NO:379)。在一些实施方案中，所述dsRNA包含：(19)在所述有义链中的CCAUUGUAGCAUUUUUAUUAAUinvdT(SEQ ID NO:162)和在所述反义链中的AUUAAUAAAAAUGCUACAAdTdT(SEQ ID NO:163)；(20)在所述有义链中的CCAGUAGCAUUUUUAUUAAUAUinvdT(SEQ ID NO:166)和在所述反义链中的AUAUUAAUAAAAAUGCUACdTdT(SEQ ID NO:167)；或(21)在所述有义链中的CCAGAGUGUGAAAGGUGCUGAUinvdT(SEQ ID NO:290)和在所述反义链中的AUCAGCACCUUUCACACUCdTdT(SEQ ID NO:291)。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述第一序列和所述第二序列各自的长度为小于或等于30个核苷酸。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述第一序列和所述第二序列各自的长度为至少19个核苷酸和/或小于或等于23个核苷酸。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述dsRNA是小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述dsRNA包含一种或多种经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述一种或多种经修饰的核苷酸中的至少一种是2'-O-甲基核苷酸、5'-硫代磷酸酯核苷酸或连接至胆固醇衍生物或亲脂性部分的末端核苷酸。在一些实施方案中，所述一种或多种经修饰的核苷酸中的至少一种是2'-氟代、2'-脱氧、2'-O-甲氧基乙基、约束乙基(cEt)、脱氧、反向脱氧、反向双脱氧、锁核酸、脱碱基、2'-氨基、2'-烷基、吗啉代、氨基磷酸酯或含非天然碱基的核苷酸。在一些实施方案中，所述dsRNA包含一个或多个2'-O-甲基核苷酸和一个或多个2'-氟代核苷酸。在一些实施方案中，所述dsRNA包含以模式OMe-F-OMe-F或F-OMe-F-OMe的两个或更多个2'-O-甲基核苷酸和两个或更多个2'-氟代核苷酸，其中OMe表示2'-O-甲基核苷酸，并且其中F表示2'-氟代核苷酸。在一些实施方案中，所述dsRNA包含多达10个各自为2'-O-甲基核苷酸的连续核苷酸或多达10个各自为2'-氟代核苷酸的连续核苷酸。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述dsRNA包含一个或多个硫代磷酸酯基团。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述dsRNA不包含硫代磷酸酯基团。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述dsRNA包含一个或多个磷酸三酯基团。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述dsRNA不包含磷酸三酯基团。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述dsRNA经由接头附接至一个或多个GalNAc衍生物。在一些实施方案中，所述dsRNA经由三价分支接头附接至三个GalNAc衍生物。在一些实施方案中，所述一个或多个GalNAc衍生物中的至少一个附接至所述dsRNA的有义链的3'末端、反义链的3'末端或有义链的5'末端。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述有义链和所述反义链中的一条或两条还包括包含一个或多个核苷酸的5'突出端。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述有义链和所述反义链中的一条或两条还包括包含一个或多个核苷酸的3'突出端。在一些实施方案中，所述3'突出端包含两个核苷酸。在一些实施方案中，所述突出端包含一个或多个胸腺嘧啶。

在一些实施方案中，所述dsRNA的一条或两条链包含一种或多种具有式(I)的结构的化合物：

其中：

- B是杂环核碱基；

- L1和L2中的一个是将所述式(I)的化合物连接至多核苷酸的核苷间连接基团，并且L1和L2中的另一个是H、保护基团、磷部分或将所述式(I)的化合物连接至多核苷酸的核苷间连接基团，

- Y是O、NH、NR1或N-C(＝O)-R1，其中R1是：

(C1-C20)烷基，其任选地被一个或多个选自卤原子、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、

(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基、(C5-C14)杂芳基、-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1、-CN、

-C(＝J)-O-Z1、-O-C(＝J)-Z1、-C(＝J)-N(Z1)(Z2)和-N(Z1)-C(＝J)-Z2的基团取代，其中J是O或S，

Z1和Z2各自独立地是H、(C1-C6)烷基，所述(C1-C6)烷基任选地被一个或多个选自卤原子和(C1-C6)烷基的基团取代，

(C3-C8)环烷基，其任选地被一个或多个选自卤原子和(C1-C6)烷基的基团取代，基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，其中

m是意指0或1的整数，

p是范围为0至10的整数，

R2是(C1-C20)亚烷基，其任选地被(C1-C6)烷基、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、

-C(＝K)-O-Z3、-O-C(＝K)-Z3、-C(＝K)-N(Z3)(Z4)或-N(Z3)-C(＝K)-Z4取代，其中

K是O或S，

Z3和Z4各自独立地是H、(C1-C6)烷基，所述(C1-C6)烷基任选地被一个或多个选自卤原子和(C1-C6)烷基的基团取代，并且

R3选自氢原子、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C3-C8)环烷基、(C3-C14)杂环、

(C6-C14)芳基或(C5-C14)杂芳基，或者R3是细胞靶向部分，

- X1和X2各自独立地是氢原子、(C1-C6)烷基，并且

- Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地是H或(C1-C6)烷基，

或者是其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述dsRNA包含一种或多种式(I)的化合物，其中Y是：

a)NR1，且R1是未经取代的(C1-C20)烷基；

b)NR1，且R1是未经取代的(C1-C16)烷基，其包括选自甲基、异丙基、丁基、辛基和十六烷基的烷基；

c)NR1，且R1是(C3-C8)环烷基，其任选地被一个或多个选自卤原子和(C1-C6)烷基的基团取代；

d)NR1，且R1是环己基；

e)NR1，且R1是被(C6-C14)芳基取代的(C1-C20)烷基；

f)NR1，且R1是被苯基取代的甲基；

g)N-C(＝O)-R1，且R1是任选经取代的(C1-C20)烷基；或

h)N-C(＝O)-R1，且R1是甲基或十五烷基。

在一些实施方案中，所述dsRNA包含一种或多种式(I)的化合物，其中B选自嘧啶、经取代的嘧啶、嘌呤和经取代的嘌呤，或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，R3具有式(II)

其中A1、A2和A3是OH，

A4是OH或NHC(＝O)-R5，其中R5是任选地被卤原子取代的(C1-C6)烷基，或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，R3是N-乙酰基-半乳糖胺，或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述dsRNA包含一种或多种来自表A的核苷酸。

在一些实施方案中，所述dsRNA包含2至10个式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述2至10个式(I)的化合物在所述有义链上。

在一些实施方案中，所述有义链在所述5'末端包含二至五个式(I)的化合物，和/或在所述3'末端包含一至三个式(I)的化合物。

在一些实施方案中，

a)在所述有义链的5'末端的二至五个式(I)的化合物包含lgT3，任选地包含三个连续lgT3核苷酸；以及/或者

b)在所述有义链的3'末端的一至三个式(I)的化合物包含lT4；任选地包含两个连续lT4。

在一些实施方案中，所述dsRNA包含一个或多个核苷间连接基团，所述核苷间连接基团独立地选自磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基-膦酸酯和氨基磷酸酯主链连接基团，或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述dsRNA选自表2-4中的dsRNA。

在一些实施方案中，

a)所述有义链包含选自SEQ ID NO:578、585、587、620、621、622和627的核苷酸序列；以及/或者

b)所述反义链包含选自SEQ ID NO:589、591、631、632、634、635和639的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述dsRNA的有义链和反义链分别包含以下的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO:578和589；[C027.001]

b)SEQ ID NO:620和631；[C027.003]

c)SEQ ID NO:585和591；[C027.001#40]

d)SEQ ID NO:587和591；[C027.001#58]

e)SEQ ID NO:621和634；[C027.003#03]

f)SEQ ID NO:622和632；[C027.003#06]

g)SEQ ID NO:622和635；和[C027.003#08]

h)SEQ ID NO:627和639。[C027.003#47]

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述dsRNA抑制蛋白质原转换酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)基因的表达。在一些实施方案中，所述PCSK9基因是人PCSK9基因(例如，包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列)。在一些实施方案中，所述PCSK9基因是非人PCSK9基因。在一些实施方案中，所述PCSK9基因是非人灵长类PCSK9基因(例如，食蟹猴PCSK9，如由UniprotKB登录号G7NVZ1表示的)。

在另一个方面，本公开文本涉及一种编码一种或多种本文所述的dsRNA的载体。

在另一个方面，本公开文本涉及一种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含一种或多种本文所述的dsRNA和/或载体。

在另一个方面，本公开文本涉及一种制品或试剂盒，其包含一种或多种本文所述的dsRNA和/或载体。

在另一个方面，本公开文本涉及一种组合物，其包含一种或多种本文所述的dsRNA和/或载体。在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述组合物包含递送媒介物。在一些实施方案中，所述递送媒介物选自脂质体、脂质体复合物、复合物和纳米颗粒。

在另一个方面，本公开文本涉及一种抑制受试者的PCSK9基因表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的一种或多种本文所述的dsRNA和/或一种或多种本文所述的组合物。在另一个方面，本公开文本涉及一种或多种本文所述的dsRNA和/或一种或多种本文所述的组合物在抑制受试者的PCSK9基因表达的方法中的用途。在另一个方面，本公开文本涉及一种或多种本文所述的dsRNA和/或一种或多种本文所述的组合物，其用于制造用于抑制受试者的PCSK9基因表达的药物。在另一个方面，本公开文本涉及一种治疗或预防有需要的受试者的PCSK9介导的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的一种或多种本文所述的dsRNA和/或一种或多种本文所述的组合物。在另一个方面，本公开文本涉及一种或多种本文所述的dsRNA和/或一种或多种本文所述的组合物在治疗或预防有需要的受试者的PCSK9介导的疾病的方法中的用途。在另一个方面，本公开文本涉及一种或多种本文所述的dsRNA和/或一种或多种本文所述的组合物，其用于制造用于治疗或预防有需要的受试者的PCSK9介导的疾病的药物。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述PCSK9基因在所述受试者的肝脏中的表达被所述dsRNA抑制。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述PCSK9介导的障碍是高胆固醇血症。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述施用是皮下施用、静脉内施用或肺部施用。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述受试者是人。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述施用导致所述受试者的血清胆固醇减少。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用有效量的一种或多种用于治疗或预防PCSK9介导的疾病的另外的治疗剂。

应当理解，本文描述的各种实施方案的一种、一些或全部特性都可以组合以形成本公开文本的其他实施方案。本公开文本的这些和其他方面对于本领域技术人员而言将变得清楚。

附图说明

图1示出与阳性对照处理和阴性对照处理相比，在未转染的人Hep3B细胞中或在用递增浓度的14种靶向PCSK9的不同测试siRNA转染的人Hep3B细胞中PCSK9 mRNA表达的qPCR分析。*指示此测定中示出最有效的PCSK9表达降低的siRNA。

图2示出与阳性对照处理和阴性对照处理相比，在未转染的人C3A细胞中或在用递增浓度的14种靶向PCSK9的不同测试siRNA转染的人C3A细胞中PCSK9 mRNA表达的qPCR分析。*指示此测定中示出最有效的PCSK9表达降低的siRNA。

图3A和图3B示出对于用靶向PCSK9的siRNA转染的细胞的细胞毒性测定的结果。图3A示出对于用靶向PCSK9的siRNA转染的人Hep3B细胞的细胞毒性测定的结果。图3B示出对于用靶向PCSK9的siRNA转染的人C3A细胞的细胞毒性测定的结果。

图4示出与阳性对照处理和阴性对照处理相比，在未转染的人Hep3B细胞中或在用递增浓度的60种靶向PCSK9的不同测试siRNA转染的人Hep3B细胞中PCSK9 mRNA表达的qPCR分析。*指示此测定中示出最有效的PCSK9表达降低的siRNA。

图5示出与阳性对照处理和阴性对照处理相比，在用递增浓度的五种靶向PCSK9的不同测试siRNA转染的人C3A细胞中PCSK9 mRNA表达的qPCR分析。*指示此测定中示出最有效的PCSK9表达降低的siRNA。

图6A和图6B示出对于用靶向PCSK9的siRNA转染的细胞的细胞毒性测定的结果。图6A示出对于用靶向PCSK9的siRNA转染的人Hep3B细胞的细胞毒性测定的结果。图6B示出对于用靶向PCSK9的siRNA转染的人C3A细胞的细胞毒性测定的结果。

图7示出，如通过ELISA测定所测定的，对于用递增浓度的十种靶向PCSK9的测试siRNA转染的细胞，分泌到人C3A细胞培养物的上清液中的PCSK9蛋白的量。

图8示出如通过ELISA所测定的分泌到用三种不同浓度的靶向PCSK9的siRNA转染的人C3A细胞培养物的上清液中的PCSK9蛋白的量。

图9示出在三种不同浓度的靶向PCSK9的siRNA在人原代肝细胞中自由摄取期间的细胞毒性测定的结果。

图10示出如通过ELISA所测定的释放到从三种供体中分离并用靶向PCSK9的siRNA转染的人外周血单个核细胞(PBMC)的上清液中的干扰素α(IFNα)蛋白的量。

图11示出靶向PCSK9的siRNA在50％小鼠血清中的体外血清稳定性和相对半衰期。

图12示出靶向PCSK9的siRNA的体外分析的结果汇总。

图13A示出如通过ELISA所测量的在第0天用单一10mg/kg皮下剂量的所指示的靶向PCSK9的siRNA处理的人PCSK9转基因小鼠中随时间历程的血清PCSK9水平。图13B示出如用COBAS INTEGRA仪器所测定的在这些相同的小鼠中的血清总胆固醇水平。图13C示出如用COBAS INTEGRA仪器所测定的第3天血清样品中的急性毒性测量的结果。图13D示出如用COBAS INTEGRA仪器所测定的第10天血清样品中的急性毒性测量的结果。AST＝天冬氨酸转氨酶；ALT＝丙氨酸转氨酶；BUN＝血尿素氮。

图14A示出与阳性对照处理和阴性对照处理相比，在未转染的人Hep3B细胞中或在用两种不同浓度的靶向PCSK9的另外的测试siRNA转染的人Hep3B细胞中PCSK9mRNA表达的qPCR分析。图14B示出与阳性对照处理和阴性对照处理相比，在未转染的人C3A细胞中或在用两种不同浓度的靶向PCSK9的另外的测试siRNA转染的人C3A细胞中PCSK9 mRNA表达的qPCR分析。箭头指示在Hep3B细胞系和C3A细胞系两者中，在0.1nM浓度下示出>50％的PCSK9敲低或在1nM浓度下示出>85％的PCSK9敲低的siRNA。

图15示出在用两种不同浓度的靶向PCSK9的另外的测试siRNA转染的Hep3B细胞和C3A细胞中的细胞毒性测定的结果。X指示与LV2阴性对照相比在50nM浓度下具有>50％毒性的siRNA。

图16A示出对于所测试的siRNA，在人Hep3B细胞中的计算的IC₅₀值与在人C3A细胞中的计算的IC₅₀值之间的相关性。图16B示出对于靶向PCSK9的另外的测试siRNA，在人Hep3B细胞中的计算的I_max值与在人C3A细胞中的计算的I_max值之间的相关性。

图17示出描绘在用100nM和1000nM GalNAc-siRNA处理的人原代肝细胞中相对LV2非沉默对照归一化的残留PCSK9 mRNA表达水平的曲线图，所述GalNAc-siRNA来自基于亲本序列C027.001、C027.002和C027.003的优化文库。

图18示出如通过ELISA所测定的释放到从三种供体中分离并用靶向PCSK9的siRNA转染的人外周血单个核细胞(PBMC)的上清液中的干扰素α2a(IFNα2a)蛋白的量(以pg/mL计)。

图19A-图19C是示出在第0天用单一剂量的42种优化的PCSK9 GalNAc-siRNA和相应的亲本分子以6mg/kg皮下处理的人PCSK9转基因小鼠中血清PCSK9水平的相对量的曲线图。图19A-图19C表示对于分别基于亲本序列C027.001、C027.002和C027.003的优化的PCSK9 GalNAc-siRNA的数据。相对于用PBS媒介物对照处理的动物表示蛋白质表达。通过ELISA定量人PCSK9水平，误差条指示SEM。图19D和图19E示出如用COBAS INTEGRA仪器所测定的在siRNA给药后在第14天(图19D)和第28天(图19E)在这些相同的小鼠中的血清LDL胆固醇水平。

具体实施方式

以下描述阐述了示例性方法、参数等。然而，应认识到，这样的描述并不旨在作为对本公开文本的范围的限制，而是旨在作为示例性实施方案的描述而提供。

1.定义

除非内容另外明确规定，否则如在本说明书和所附权利要求中所用的，单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种分子”任选地包括两种或更多种这样的分子的组合等。

如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文提及“约”某一值或参数包括(并描述)涉及所述值或参数本身的实施方案。

应理解的是，本文所述的本公开文本的方面和实施方案包括“包含(comprising)”方面和实施方案、“由方面和实施方案组成(consisting)”以及“基本上由方面和实施方案组成(consisting essentially of)”。应理解的是，使用术语“包含”或等同词语的实施方案的公开内容还涵盖其中“包含”被“在于”替代的实施方案。

如本文所用，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”包括天然存在的或经修饰的核苷酸，如下文进一步详述，或替换性替代部分。本领域普通技术人员应理解的是，核苷酸中的鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶可以被其他部分替代而基本上不改变包含带有这种替代部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对特性。例如而不限于，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸发生碱基配对。因此，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本公开文本的核苷酸序列中被含有例如肌苷的核苷酸替代。包含此类替代部分的序列作为本公开文本的实施方案被包括在内。

如本文所用，术语“PCSK9”是指蛋白质原转换酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9基因或蛋白(也称为FH3、HCHOLA3、NARC-1和NARC1)。如本文所用，术语“PCSK9”包括人PCSK9，其氨基酸和核苷酸序列可以在例如NCBI参考序列：NM_174936.3中见到；小鼠PCSK9，其氨基酸和核苷酸序列可以在例如NCBI参考序列：NM_153565.2中见到；大鼠PCSK9，其氨基酸和核苷酸序列可以在例如NCBI参考序列：NM_199253.2中见到。PCSK9 mRNA序列的另外的例子可使用例如GenBank容易地得到。

如本文所用，“靶序列”是指在靶基因例如PCSK9基因或其部分的转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，所述mRNA分子包括作为对初级转录产物进行的RNA加工的产物的mRNA。

如本文所用，术语“包含序列的链”是指包含核苷酸链的寡核苷酸，所述核苷酸链由使用标准核苷酸命名法提及的序列描述。

如本文所用，并且除非另外指示，否则如本领域普通技术人员将理解，术语“互补”在用于描述与第二核苷酸序列有关的第一核苷酸序列时，是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力。这包括在第一核苷酸序列或第二核苷酸序列的整个长度上包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸的碱基配对。此类序列在本文中可以称为相对于彼此“完全互补”。当第一序列在本文中称为相对于第二序列“基本上互补”时，这两个序列可以是完全互补的，或者它们在杂交时可以形成一个或多个但不超过4、3或2个错配碱基对，同时保留了在与它们的最终应用最相关的条件下杂交的能力。然而，当两个寡核苷酸被设计成在杂交时形成一个或多个单链突出端时，关于互补性的确定，此类突出端不应被认为是错配。例如，包含长度为21个核苷酸的第一寡核苷酸和长度为23个核苷酸的第二寡核苷酸的双链RNA(dsRNA)出于本公开文本的目的仍可以称为“完全互补的”，其中第二寡核苷酸包含与第一寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列。在实现关于其杂交能力的上述要求的情况下，“互补”序列还可以包括以下或完全由以下形成：非沃森-克里克(non-Watson-Crick)碱基对和/或由非天然的和经修饰的核苷酸形成的碱基对。如从它们的使用的背景下将理解，术语“互补的”、“完全互补的”和“基本上互补的”可以关于在dsRNA的有义链与dsRNA的反义链之间或在dsRNA的反义链与靶序列之间的碱基匹配而被使用。如本文所用，与mRNA的至少一部分“基本上互补”的多核苷酸是指与目的mRNA(例如，编码PCSK9的mRNA)的连续部分基本上互补的多核苷酸。例如，如果序列与编码PCSK9的mRNA的不间断部分基本上互补，则多核苷酸与PCSK9 mRNA的至少一部分基本上互补。

如本文所用，术语“双链RNA”或“dsRNA”是指具有双链体结构的一个或多个核糖核酸分子的复合物，所述双链体结构包含两条反平行和基本上互补(如上定义)的核酸链。形成双链体结构的这两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或者它们可以是单独的RNA分子。在单独的RNA分子的情况下，这样的dsRNA在文献中通常称为短干扰RNA(siRNA)。当两条链是一个较大分子的一部分，因此通过在形成双链体结构的第一链的3'末端与第二链的5'末端之间的不间断核苷酸链连接时，这种连接RNA链称为“发夹环”、“短发夹RNA”或“shRNA”。当这两条链通过除了在形成双链体结构的第一链的3'-末端与第二链的5'-末端之间的不间断核苷酸链之外的手段共价连接时，这种连接结构称为“接头”。RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是dsRNA的最短链中的寡核苷酸的数目减去双链体中存在的任何突出端。除了双链体结构外，dsRNA还可以包含一个或多个核苷酸突出端。另外，如本文所用，术语“dsRNA”可以包括核糖核苷酸的化学修饰，包括多个核苷酸处的实质性修饰并且包括本文公开的或本领域已知的所有类型的修饰。出于本公开文本的目的，任何这样的修饰(如在siRNA型分子中所用)都被“dsRNA”涵盖。

在一些实施方案中，所述dsRNA包含经修饰的核糖核苷，包括脱氧核糖核苷，包括例如一个或多个脱氧核糖核苷突出端、在dsRNA的双链部分内的一个或多个脱氧核糖核苷等。然而，不言而喻的是，在任何情况下都是由术语“dsRNA”涵盖的双链DNA分子。

如本文所用，术语“核苷酸突出端”是指当dsRNA的第一链的3'末端延伸超出第二链的5'末端或反之时从dsRNA的双链体结构突出的一个或多个未配对的核苷酸。“平端”或“平末端”意指在dsRNA的这个末端没有未配对的核苷酸，即没有核苷酸突出端。“平末端化的”dsRNA是在其整个长度上都是双链的dsRNA，即在此分子的任一末端都没有核苷酸突出端。为了清楚起见，在确定dsRNA是具有突出端还是平末端化的时，不考虑缀合至dsRNA的3'末端和/或5'末端的化学帽或非核苷酸化学部分。

如本文所用，术语“反义链”是指dsRNA的包括与靶序列基本上互补的序列的链。

如本文所用，术语“有义链”是指dsRNA的包括与反义链的区域基本上互补的序列的链。

如本文所用，如本领域普通技术人员应理解的，术语“引入细胞中”意指促进摄取或吸收到细胞中。dsRNA的吸收或摄取可以通过非辅助性扩散或主动细胞过程发生或者通过辅助药剂或装置发生。此术语的含义不限于体外细胞；也可以将dsRNA“引入细胞中”，其中所述细胞是活生物体的一部分。在这种情况下，引入细胞中将包括递送至生物体。例如，对于体内递送，可以将dsRNA注射到组织位点中或进行全身性施用。体内递送还可以由β-葡聚糖递送系统介导(参见例如，Tesz,G.J.等人(2011)Biochem J.436(2):351-62)。体外引入细胞中包括本领域已知的方法，如电穿孔和脂质体转染。另外的方法在下文中描述或在本领域中已知。

如本文所用，术语“靶基因”是指被本公开文本的dsRNA靶向以抑制表达的目的基因，例如PCSK9。

如本文所用，术语“PCSK9相关疾病”旨在包括与PCSK9基因或蛋白相关的任何疾病。这种疾病可能是由例如PCSK9蛋白的过量产生、PCSK9基因突变、PCSK9蛋白的异常切割、PCSK9与其他蛋白或其他内源或外源物质之间的异常相互作用导致的。示例性PCSK9相关疾病包括而不限于脂血症，例如高脂血症，和其他形式的脂质失衡，如高胆固醇血症、高甘油三酯血症，以及与这些障碍相关的病理性病症，如心脏和循环系统疾病。

如本文所用，在提及PCSK9基因的情况下，术语“抑制……表达(inhibit theexpression of)”或“抑制……表达(inhibiting expression of)”是指，与第二细胞或细胞群(对照细胞)相比，如通过可以从第一细胞或细胞群分离的转录自PCSK9基因的mRNA的量减少所显示，至少部分地遏制PCSK9基因的表达，在所述第一细胞或细胞群中PCSK9基因被转录并且所述第一细胞或细胞群已被处理使得PCSK9基因的表达受到抑制，所述第二细胞或细胞群与所述第一细胞或细胞群基本上相同但未被如此处理。如本文所用，术语“抑制”可与“减少”、“沉默”、“下调”、“遏制”和其他相似术语互换使用，并且包括任何水平的抑制。抑制度通常根据(((对照细胞中的mRNA)-(经处理的细胞中的mRNA))/(对照细胞中的mRNA))·100％表示。

可替代地，抑制度可以根据在功能上与PCSK9基因转录相关的参数的减小而给出，所述参数例如由细胞分泌的PCSK9基因编码的蛋白质的量，或显示特定表型(例如，细胞凋亡)的细胞的数目。原则上，可以组成型地或通过基因组工程化和通过任何适当的测定来确定在任何表达靶标的细胞中的PCSK9基因沉默。然而，当需要参考以确定给定dsRNA是否在特定程度上抑制PCSK9基因的表达并因此被本公开文本所涵盖时，以下实施例中提供的测定应用作这样的参考。

如本文所用，在PCSK9表达的背景下，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”等是指由靶基因表达介导的病理性过程的缓解或减轻。在本公开文本的背景下，在涉及下文陈述的任何其他病症(除了由靶标表达介导的病理性过程之外)情况下，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”等是指缓解或减轻与这样的病症相关的一种或多种症状。例如，在高脂血症的背景下，治疗将包括血清脂质水平降低。

如本文所用，关于疾病或障碍的术语“预防”或“延迟进展”(及其语法变体)涉及疾病的预防性治疗，例如在怀疑患有所述疾病或处于患上所述疾病的风险中的个体中。预防可以包括但不限于预防或延迟疾病的发作或进展和/或将疾病的一种或多种症状维持在期望的或亚病理性水平。例如，在高脂血症的背景下，预防可以包括将在怀疑患有高脂血症或处于患上高脂血症的风险中的个体中的血清脂质水平维持在期望的水平。

如本文所用，术语“治疗有效量”和“预防有效量”是指在治疗、预防或管理由靶基因表达(例如，PCSK9基因表达)介导的病理性过程或由靶基因表达(例如，PCSK9基因表达)介导的病理性过程的明显症状方面提供治疗益处的量。治疗有效的具体量可以由普通执业医生容易地确定，并且可以根据本领域已知的因素而变化，所述因素例如由靶基因表达(例如，PCSK9基因表达)介导的病理性过程的类型、患者的病史和年龄、由靶基因表达(例如，PCSK9基因表达)介导的病理性过程的阶段以及抑制由靶基因表达(例如，PCSK9基因表达)介导的过程的其他药剂的施用。

如本文所用，术语“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)、兔和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，所述个体或受试者是人。

2.双链RNA(dsRNA)

本公开文本的某些方面涉及靶向PCSK9的双链核糖核酸(dsRNA)分子。在一些实施方案中，所述dsRNA包含两条链，即包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链，其中第一链和第二链充分互补以杂交形成双链体结构。在一些实施方案中，所述有义链包含与所述反义链中的第二序列基本上互补或完全互补的第一序列。在一些实施方案中，所述反义链中的第二序列与靶序列基本上互补或完全互补。在一些实施方案中，所述靶序列源自在靶基因表达期间形成的mRNA(例如，在PCSK9基因表达期间形成的mRNA)的序列。在一些实施方案中，所述PCSK9基因是人PCSK9基因，例如，如本文所述。在一些实施方案中，所述PCSK9基因是非人PCSK9基因。在一些实施方案中，所述PCSK9基因是非人灵长类PCSK9基因(例如，食蟹猴PCSK9(UniprotKB登录号G7NVZ1))。在一些实施方案中，所述dsRNA抑制PCSK9基因的表达。在一些实施方案中，所述dsRNA是小干扰RNA(siRNA)。在一些实施方案中，所述dsRNA是短发夹RNA(shRNA)。

在一些实施方案中，所述dsRNA的有义链和反义链在两个单独分子中。在一些实施方案中，在所述两个单独分子的有义链中的第一序列与在所述两个单独分子的反义链中的第二序列之间形成双链体区。在一些实施方案中，所述dsRNA是siRNA。在一些实施方案中，所述两个单独分子不是彼此共价连接的。在一些实施方案中，所述两个单独分子彼此共价连接。在一些实施方案中，所述两个单独分子通过除了发夹环之外的手段彼此共价连接。在一些实施方案中，所述两个单独分子经由连接结构(本文中称为“共价接头”)彼此共价连接。

在一些实施方案中，第一序列(在有义链中)和第二序列(在反义链中)各自的长度可以在9-30个核苷酸的范围内。例如，每个序列的长度可以在12-30个核苷酸之间、14-30个核苷酸之间、15-30个核苷酸之间、25-30个核苷酸之间、27-30个核苷酸之间、15-26个核苷酸之间、15-23个核苷酸之间、15-22个核苷酸之间、15-21个核苷酸之间、15-20个核苷酸之间、15-19个核苷酸之间、15-18个核苷酸之间、15-17个核苷酸之间、17-30个核苷酸之间、17-23个核苷酸之间、17-21个核苷酸之间、17-19个核苷酸之间、18-30个核苷酸之间、18-26个核苷酸之间、18-25个核苷酸之间、18-23个核苷酸之间、18-22个核苷酸之间、18-21个核苷酸之间、18-20个核苷酸之间、19-30个核苷酸之间、19-25个核苷酸之间、19-24个核苷酸之间、19-23个核苷酸之间、19-22个核苷酸之间、19-21个核苷酸之间、19-20个核苷酸之间、20-30个核苷酸之间、20-26个核苷酸之间、20-25个核苷酸之间、20-24个核苷酸之间、20-23个核苷酸之间、20-22个核苷酸之间、20-21个核苷酸之间、21-30个核苷酸之间、21-26个核苷酸之间、21-25个核苷酸之间、21-24个核苷酸之间、21-23个核苷酸之间或21-22个核苷酸之间。在一些实施方案中，每个序列的长度为大于或等于9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个核苷酸。在一些实施方案中，每个序列的长度为小于或等于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。也就是说，每个序列的长度可以在具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的上限和9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的独立选择的下限的任何核苷酸数范围内，其中所述下限小于所述上限。在一些实施方案中，每个序列的长度为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，所述第一序列和所述第二序列各自的长度为小于或等于30个核苷酸。在一些实施方案中，所述第一序列和所述第二序列各自的长度为至少19个且小于或等于23个核苷酸。在一些实施方案中，所述第一序列和所述第二序列的长度是不同的核苷酸数。在一些实施方案中，所述第一序列比所述第二序列长1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸中的任一者。在一些实施方案中，所述第二序列比所述第一序列长1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸中的任一者。在一些实施方案中，所述第一序列和所述第二序列的长度是相同的核苷酸数。

在一些实施方案中，所述有义链和所述反义链各自的长度可以在9-36个核苷酸的范围内。例如，每条链的长度可以在12-30个核苷酸之间、14-30个核苷酸之间、15-30个核苷酸之间、25-30个核苷酸之间、27-30个核苷酸之间、15-26个核苷酸之间、15-23个核苷酸之间、15-22个核苷酸之间、15-21个核苷酸之间、15-20个核苷酸之间、15-19个核苷酸之间、15-18个核苷酸之间、15-17个核苷酸之间、17-30个核苷酸之间、17-23个核苷酸之间、17-21个核苷酸之间、17-19个核苷酸之间、18-30个核苷酸之间、18-26个核苷酸之间、18-25个核苷酸之间、18-23个核苷酸之间、18-22个核苷酸之间、18-21个核苷酸之间、18-20个核苷酸之间、19-30个核苷酸之间、19-25个核苷酸之间、19-24个核苷酸之间、19-23个核苷酸之间、19-22个核苷酸之间、19-21个核苷酸之间、19-20个核苷酸之间、20-30个核苷酸之间、20-26个核苷酸之间、20-25个核苷酸之间、20-24个核苷酸之间、20-23个核苷酸之间、20-22个核苷酸之间、20-21个核苷酸之间、21-30个核苷酸之间、21-26个核苷酸之间、21-25个核苷酸之间、21-24个核苷酸之间、21-23个核苷酸之间或21-22个核苷酸之间。在一些实施方案中，每条链的长度为大于或等于9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸。在一些实施方案中，每条链的长度为小于或等于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸。也就是说，每条链的长度可以在具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36的上限和9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35的独立选择的下限的任何核苷酸数范围内，其中所述下限小于所述上限。在一些实施方案中，每条链的长度为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸。在一些实施方案中，所述有义链和所述反义链的长度是相同的核苷酸数。在一些实施方案中，所述有义链和所述反义链的长度是不同的核苷酸数。

在一些实施方案中，所述第一序列(在有义链中)和所述第二序列(在反义链中)包含小于30％的GC。“小于30％的GC”意指，与第一序列和/或第二序列的总核苷酸含量相比，所述序列的小于30％的核苷酸是G(鸟嘌呤)或C(胞嘧啶)。G(鸟嘌呤)和C(胞嘧啶)核苷酸含量还包括经修饰的G和C核苷酸。此类修饰描述于下文中，并且包括例如2'-O-甲基鸟苷(mG)、2'-O-甲基胞苷(mC)、2'-氟鸟苷(fG)、2'-氟胞苷(fC)或锁鸟嘌呤和胞嘧啶(lG和lC)。不希望受任何理论的束缚，诸位发明人已经注意到，包含小于30％的GC含量的本公开文本的dsRNA在敲低人PCSK9表达方面展现出更高的功效。

突出端

在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA在有义链和反义链之一或两者的3'-末端、5'-末端或两端包含一个或多个突出端。在一些实施方案中，所述一个或多个突出端改善dsRNA的稳定性和/或抑制活性。

在一些实施方案中，所述突出端包含一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或六个或更多个核苷酸。例如，突出端可以包含1-6个核苷酸、2-6个核苷酸、3-6个核苷酸、4-6个核苷酸、5-6个核苷酸、1-5个核苷酸、2-5个核苷酸、3-5个核苷酸、4-5个核苷酸、1-4个核苷酸、2-4个核苷酸、3-4个核苷酸、1-3个核苷酸、2-3个核苷酸或1-2个核苷酸。在一些实施方案中，所述突出端的长度为一个、两个、三个、四个、五个或六个核苷酸。

在一些实施方案中，本公开文本的突出端包含一个或多个核糖核苷酸。在一些实施方案中，本公开文本的突出端包含一个或多个脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，所述突出端包含一个或多个胸腺嘧啶。

在一些实施方案中，所述dsRNA包含位于反义链的3'末端的突出端。在一些实施方案中，所述dsRNA包含在反义链的5'末端的平末端。在一些实施方案中，所述dsRNA包含位于反义链的3'末端的突出端和在反义链的5'末端的平末端。在一些实施方案中，所述dsRNA包含位于有义链的3'末端的突出端。在一些实施方案中，所述dsRNA包含在有义链的5'末端的平末端。在一些实施方案中，所述dsRNA包含位于有义链的3'末端的突出端和在有义链的5'末端的平末端。在一些实施方案中，所述dsRNA包含位于dsRNA的有义链的3'末端和反义链的3'末端两者的突出端。

在一些实施方案中，所述dsRNA包含位于反义链的5'末端的突出端。在一些实施方案中，所述dsRNA包含在反义链的3'末端的平末端。在一些实施方案中，所述dsRNA包含位于反义链的5'末端的突出端和在反义链的3'末端的平末端。在一些实施方案中，所述dsRNA包含位于有义链的5'末端的突出端。在一些实施方案中，所述dsRNA包含在有义链的3'末端的平末端。在一些实施方案中，所述dsRNA包含位于有义链的5'末端的突出端和在有义链的3'末端的平末端。在一些实施方案中，所述dsRNA包含位于dsRNA的有义链的5'末端和反义链的3'末端两者的突出端。

在一些实施方案中，所述突出端是有义链比反义链长的结果。在一些实施方案中，所述突出端是反义链比有义链长的结果。在一些实施方案中，所述突出端是相同长度的有义链和反义链交错的结果。在一些实施方案中，所述突出端与靶mRNA形成错配。在一些实施方案中，所述突出端与靶mRNA互补。

在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA包括包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链，其中所述第一序列和所述第二序列是基本上互补的或互补的。在一些实施方案中，所述第一序列和所述第二序列是基本上互补的或互补的，并且形成dsRNA的双链体区。在一些实施方案中，所述dsRNA的双链体区的长度为9-36个核苷酸对。例如，双链体区的长度可以在12-30个核苷酸对之间、14-30个核苷酸对之间、15-30个核苷酸对之间、15-26个核苷酸对之间、15-23个核苷酸对之间、15-22个核苷酸对之间、15-21个核苷酸对之间、15-20个核苷酸对之间、15-19个核苷酸对之间、15-18个核苷酸对之间、15-17个核苷酸对之间、17-30个核苷酸对之间、27-30个核苷酸对之间、17-23个核苷酸对之间、17-21个核苷酸对之间、17-19个核苷酸对之间、18-30个核苷酸对之间、18-26个核苷酸对之间、18-25个核苷酸对之间、18-24个核苷酸对之间、18-23个核苷酸对之间、18-22个核苷酸对之间、18-21个核苷酸对之间、18-20个核苷酸对之间、19-30个核苷酸对之间、19-25个核苷酸对之间、19-24个核苷酸对之间、19-23个核苷酸对之间、19-22个核苷酸对之间、19-21个核苷酸对之间、19-20个核苷酸对之间、20-30个核苷酸对之间、20-26个核苷酸对之间、20-25个核苷酸对之间、20-24个核苷酸对之间、20-23个核苷酸对之间、20-22个核苷酸对之间、20-21个核苷酸对之间、21-30个核苷酸对之间、21-26个核苷酸对之间、21-25个核苷酸对之间、21-24个核苷酸对之间、21-23个核苷酸对之间、或21-22个核苷酸对之间。在一些实施方案中，所述dsRNA的双链体区的长度为大于或等于9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸对。在一些实施方案中，所述dsRNA的双链体区的长度为小于或等于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸对。也就是说，所述dsRNA的双链体区的长度可以在具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36的上限和9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35的独立选择的下限的任何核苷酸对数范围内，其中所述下限小于所述上限。在一些实施方案中，所述双链体区的长度为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸对。如果使用多于一种dsRNA，则与一种或多种另外的dsRNA相比，每种dsRNA的双链体区可以具有相同或不同的长度。

靶序列以及dsRNA中的第一序列和第二序列

在一些实施方案中，所述靶序列源自PCSK9基因(如人PCSK9基因)。本领域已知所述人PCSK9基因和相关mRNA序列。在一些实施方案中，靶mRNA具有NCBI参考序列NM_174936.3中所示的序列。在一些实施方案中，人PCSK9 cDNA具有序列GTCCGATGGGGCTCTGGTGGCGTGATCTGCGCGCCCCAGGCGTCAAGCACCCACACCCTAGAAGGTTTCCGCAGCGACGTCGAGGCGCTCATGGTTGCAGGCGGGCGCCGCCGTTCAGTTCAGGGTCTGAGCCTGGAGGAGTGAGCCAGGCAGTGAGACTGGCTCGGGCGGGCCGGGACGCGTCGTTGCAGCAGCGGCTCCCAGCTCCCAGCCAGGATTCCGCGCGCCCCTTCACGCGCCCTGCTCCTGAACTTCAGCTCCTGCACAGTCCTCCCCACCGCAAGGCTCAAGGCGCCGCCGGCGTGGACCGCGCACGGCCTCTAGGTCTCCTCGCCAGGACAGCAACCTCTCCCCTGGCCCTCATGGGCACCGTCAGCTCCAGGCGGTCCTGGTGGCCGCTGCCACTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCCTGGGTCCCGCGGGCGCCCGTGCGCAGGAGGACGAGGACGGCGACTACGAGGAGCTGGTGCTAGCCTTGCGTTCCGAGGAGGACGGCCTGGCCGAAGCACCCGAGCACGGAACCACAGCCACCTTCCACCGCTGCGCCAAGGATCCGTGGAGGTTGCCTGGCACCTACGTGGTGGTGCTGAAGGAGGAGACCCACCTCTCGCAGTCAGAGCGCACTGCCCGCCGCCTGCAGGCCCAGGCTGCCCGCCGGGGATACCTCACCAAGATCCTGCATGTCTTCCATGGCCTTCTTCCTGGCTTCCTGGTGAAGATGAGTGGCGACCTGCTGGAGCTGGCCTTGAAGTTGCCCCATGTCGACTACATCGAGGAGGACTCCTCTGTCTTTGCCCAGAGCATCCCGTGGAACCTGGAGCGGATTACCCCTCCACGGTACCGGGCGGATGAATACCAGCCCCCCGACGGAGGCAGCCTGGTGGAGGTGTATCTCCTAGACACCAGCATACAGAGTGACCACCGGGAAATCGAGGGCAGGGTCATGGTCACCGACTTCGAGAATGTGCCCGAGGAGGACGGGACCCGCTTCCACAGACAGGCCAGCAAGTGTGACAGTCATGGCACCCACCTGGCAGGGGTGGTCAGCGGCCGGGATGCCGGCGTGGCCAAGGGTGCCAGCATGCGCAGCCTGCGCGTGCTCAACTGCCAAGGGAAGGGCACGGTTAGCGGCACCCTCATAGGCCTGGAGTTTATTCGGAAAAGCCAGCTGGTCCAGCCTGTGGGGCCACTGGTGGTGCTGCTGCCCCTGGCGGGTGGGTACAGCCGCGTCCTCAACGCCGCCTGCCAGCGCCTGGCGAGGGCTGGGGTCGTGCTGGTCACCGCTGCCGGCAACTTCCGGGACGATGCCTGCCTCTACTCCCCAGCCTCAGCTCCCGAGGTCATCACAGTTGGGGCCACCAATGCCCAAGACCAGCCGGTGACCCTGGGGACTTTGGGGACCAACTTTGGCCGCTGTGTGGACCTCTTTGCCCCAGGGGAGGACATCATTGGTGCCTCCAGCGACTGCAGCACCTGCTTTGTGTCACAGAGTGGGACATCACAGGCTGCTGCCCACGTGGCTGGCATTGCAGCCATGATGCTGTCTGCCGAGCCGGAGCTCACCCTGGCCGAGTTGAGGCAGAGACTGATCCACTTCTCTGCCAAAGATGTCATCAATGAGGCCTGGTTCCCTGAGGACCAGCGGGTACTGACCCCCAACCTGGTGGCCGCCCTGCCCCCCAGCACCCATGGGGCAGGTTGGCAGCTGTTTTGCAGGACTGTATGGTCAGCACACTCGGGGCCTACACGGATGGCCACAGCCGTCGCCCGCTGCGCCCCAGATGAGGAGCTGCTGAGCTGCTCCAGTTTCTCCAGGAGTGGGAAGCGGCGGGGCGAGCGCATGGAGGCCCAAGGGGGCAAGCTGGTCTGCCGGGCCCACAACGCTTTTGGGGGTGAGGGTGTCTACGCCATTGCCAGGTGCTGCCTGCTACCCCAGGCCAACTGCAGCGTCCACACAGCTCCACCAGCTGAGGCCAGCATGGGGACCCGTGTCCACTGCCACCAACAGGGCCACGTCCTCACAGGCTGCAGCTCCCACTGGGAGGTGGAGGACCTTGGCACCCACAAGCCGCCTGTGCTGAGGCCACGAGGTCAGCCCAACCAGTGCGTGGGCCACAGGGAGGCCAGCATCCACGCTTCCTGCTGCCATGCCCCAGGTCTGGAATGCAAAGTCAAGGAGCATGGAATCCCGGCCCCTCAGGAGCAGGTGACCGTGGCCTGCGAGGAGGGCTGGACCCTGACTGGCTGCAGTGCCCTCCCTGGGACCTCCCACGTCCTGGGGGCCTACGCCGTAGACAACACGTGTGTAGTCAGGAGCCGGGACGTCAGCACTACAGGCAGCACCAGCGAAGGGGCCGTGACAGCCGTTGCCATCTGCTGCCGGAGCCGGCACCTGGCGCAGGCCTCCCAGGAGCTCCAGTGACAGCCCCATCCCAGGATGGGTGTCTGGGGAGGGTCAAGGGCTGGGGCTGAGCTTTAAAATGGTTCCGACTTGTCCCTCTCTCAGCCCTCCATGGCCTGGCACGAGGGGATGGGGATGCTTCCGCCTTTCCGGGGCTGCTGGCCTGGCCCTTGAGTGGGGCAGCCTCCTTGCCTGGAACTCACTCACTCTGGGTGCCTCCTCCCCAGGTGGAGGTGCCAGGAAGCTCCCTCCCTCACTGTGGGGCATTTCACCATTCAAACAGGTCGAGCTGTGCTCGGGTGCTGCCAGCTGCTCCCAATGTGCCGATGTCCGTGGGCAGAATGACTTTTATTGAGCTCTTGTTCCGTGCCAGGCATTCAATCCTCAGGTCTCCACCAAGGAGGCAGGATTCTTCCCATGGATAGGGGAGGGGGCGGTAGGGGCTGCAGGGACAAACATCGTTGGGGGGTGAGTGTGAAAGGTGCTGATGGCCCTCATCTCCAGCTAACTGTGGAGAAGCCCCTGGGGGCTCCCTGATTAATGGAGGCTTAGCTTTCTGGATGGCATCTAGCCAGAGGCTGGAGACAGGTGCGCCCCTGGTGGTCACAGGCTGTGCCTTGGTTTCCTGAGCCACCTTTACTCTGCTCTATGCCAGGCTGTGCTAGCAACACCCAAAGGTGGCCTGCGGGGAGCCATCACCTAGGACTGACTCGGCAGTGTGCAGTGGTGCATGCACTGTCTCAGCCAACCCGCTCCACTACCCGGCAGGGTACACATTCGCACCCCTACTTCACAGAGGAAGAAACCTGGAACCAGAGGGGGCGTGCCTGCCAAGCTCACACAGCAGGAACTGAGCCAGAAACGCAGATTGGGCTGGCTCTGAAGCCAAGCCTCTTCTTACTTCACCCGGCTGGGCTCCTCATTTTTACGGGTAACAGTGAGGCTGGGAAGGGGAACACAGACCAGGAAGCTCGGTGAGTGATGGCAGAACGATGCCTGCAGGCATGGAACTTTTTCCGTTATCACCCAGGCCTGATTCACTGGCCTGGCGGAGATGCTTCTAAGGCATGGTCGGGGGAGAGGGCCAACAACTGTCCCTCCTTGAGCACCAGCCCCACCCAAGCAAGCAGACATTTATCTTTTGGGTCTGTCCTCTCTGTTGCCTTTTTACAGCCAACTTTTCTAGACCTGTTTTGCTTTTGTAACTTGAAGATATTTATTCTGGGTTTTGTAGCATTTTTATTAATATGGTGACTTTTTAAAATAAAAACAAACAAACGTTGTCCTAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:1)。

在一些实施方案中，dsRNA反义链包含与靶序列的12与30个之间的核苷酸基本上互补或互补的序列。例如，反义链中的序列可以与靶序列的12-30个之间的核苷酸、14-30个之间的核苷酸、15-30个之间的核苷酸、15-26个之间的核苷酸、15-23个之间的核苷酸、15-22个之间的核苷酸、15-21个之间的核苷酸、15-20个之间的核苷酸、15-19个之间的核苷酸、15-18个之间的核苷酸、15-17个之间的核苷酸、17-30个之间的核苷酸、27-30个之间的核苷酸、17-23个之间的核苷酸、17-21个之间的核苷酸、17-19个之间的核苷酸、18-30个之间的核苷酸、18-26个之间的核苷酸、18-25个之间的核苷酸、18-23个之间的核苷酸、18-22个之间的核苷酸、18-21个之间的核苷酸、18-20个之间的核苷酸、19-30个之间的核苷酸、19-25个之间的核苷酸、19-24个之间的核苷酸、19-23个之间的核苷酸、19-22个之间的核苷酸、19-21个之间的核苷酸、19-20个之间的核苷酸、20-30个之间的核苷酸、20-26个之间的核苷酸、20-25个之间的核苷酸、20-24个之间的核苷酸、20-23个之间的核苷酸、20-22个之间的核苷酸、20-21个之间的核苷酸、21-30个之间的核苷酸、21-26个之间的核苷酸、21-25个之间的核苷酸、21-24个之间的核苷酸、21-23个之间的核苷酸、或21-22个之间的核苷酸基本上互补或互补。在一些实施方案中，反义链中的序列可以与靶序列的大于或等于12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个核苷酸基本上互补或互补。在一些实施方案中，反义链中的序列可以与靶序列的小于或等于13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸基本上互补或互补。也就是说，反义链中的序列可以与靶序列的具有13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的上限和12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的独立选择的下限的任何核苷酸数范围基本上互补或互补，其中所述下限小于所述上限。在一些实施方案中，反义链中的序列可以与12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸基本上互补或互补。如果使用多于一种dsRNA，则与一种或多种另外的dsRNA相比，每种dsRNA的互补区域可以具有相同或不同的长度。

在一些实施方案中，所述靶序列包含UUGUAGCAUUUUUAUUAAUAUGGUGACUUUUUAAAAUAAAAACAAACA(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，所述靶序列包含GAGUGUGAAAGGUGCUGAUGGCCCUCAUCU(SEQ ID NO:12)。在一些实施方案中，靶序列(例如，本公开文本的dsRNA的有义链的第一序列)是表1A中描述的序列。

表1A：siRNA序列信息。

在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA包括包含第一序列的有义链。在一些实施方案中，所述第一序列包含表1A中示出的靶序列。在一些实施方案中，所述第一序列是表1A中示出的靶序列。在一些实施方案中，所述第一序列包含选自SEQ ID NO:3-11、13和310-321的序列。在一些实施方案中，所述第一序列包含选自SEQ ID NO:6-11和310-321的序列。在一些实施方案中，所述第一序列是选自SEQ ID NO:3-11、13和310-321的序列。在一些实施方案中，所述第一序列是选自SEQ ID NO:3、4和13的序列。在一些实施方案中，所述第一序列不是GCAUUUUUAUUAAUAUGGU(SEQ ID NO:5)、UUUGUAGCAUUUUUAUUAAUAUGGU(SEQ ID NO:576)或AUUUUUAUUAAUAUGGUGA(SEQ ID NO:577)中的一个。

在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA包含第一序列，所述第一序列包含选自SEQ ID NO:6-11和310-321的序列，其中所述选自SEQ ID NO:6-11和310-321的序列包含小于30％的GC。在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA包含第一序列，所述第一序列包含选自SEQ ID NO:6-11和310-321的序列，其中所述第一序列包含小于30％的GC。在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA包含第一序列，所述第一序列是SEQ ID NO:3、4和13中的一个，其中所述第一序列包含小于30％的GC。

在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA包括包含第二序列的反义链。在一些实施方案中，所述第二序列与所述第一序列(即，在有义链中)基本上互补或完全互补。在一些实施方案中，所述第二序列与所述第一序列(即，在有义链中)基本上互补，并且所述第二链包含与所述第一链的至少一个错配(例如，一个错配、两个错配、三个错配或四个错配)。在一些实施方案中，所述第二序列与所述第一序列(即，在有义链中)基本上互补，并且所述第二链包含与所述第一链的一个或两个错配。在一些实施方案中，所述第二序列与选自SEQ IDNO:3-11、13和310-321的序列基本上互补，其中所述第二链包含与选自SEQ ID NO:3-11、13和310-321的序列的至少一个错配(例如，一个错配、两个错配、三个错配或四个错配)。在一些实施方案中，所述第二序列与选自SEQ ID NO:3-11、13和310-321的序列基本上互补，其中所述第二链包含与选自SEQ ID NO:3-11、13和310-321的序列的一个或两个错配。在一些实施方案中，所述第二序列与所述第一序列(即，在有义链中)完全互补。在一些实施方案中，所述第二序列与选自SEQ ID NO:3-11、13和310-321的序列完全互补。

在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA包含与选自SEQ ID NO:3-11和310-321的序列基本上互补的第二序列，其中所述第二序列包含小于30％的GC。在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA包含与选自SEQ ID NO:3-11和310-321的序列完全互补的第二序列，其中所述第二序列包含小于30％的GC。

在一些实施方案中，所述第二序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12内的序列基本上互补或完全互补。在一些实施方案中，所述第二序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12的至少15个连续核苷酸基本上互补或完全互补。在一些实施方案中，所述第二序列与SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:12的至少19个连续核苷酸基本上互补或完全互补。在一些实施方案中，所述第二序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12的小于或等于30个连续核苷酸基本上互补或完全互补。在一些实施方案中，所述第二序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12的至少19个且小于或等于23个连续核苷酸基本上互补或完全互补。在一些实施方案中，所述第二序列包含表1B中示出的序列。在一些实施方案中，所述第二序列是表1B中示出的序列。

表1B：siRNA第二序列信息。

siRNA	第二序列(5'→3')
		B001	AUUAAUAAAAAUGCUACAA(SEQ ID NO:370)
B003	AUAUUAAUAAAAAUGCUAC(SEQ ID NO:371)
		B006	ACCAUAUUAAUAAAAAUGC(SEQ ID NO:372)
B008	AGUCACCAUAUUAAUAAAA(SEQ ID NO:373)
		B010	AAAAGUCACCAUAUUAAUA(SEQ ID NO:374)
B011	AAAAAGUCACCAUAUUAAU(SEQ ID NO:375)
		B012	UAAAAAGUCACCAUAUUAA(SEQ ID NO:376)
B013	UUAAAAAGUCACCAUAUUA(SEQ ID NO:377)
		B014	AUUUUAAAAAGUCACCAUA(SEQ ID NO:378)
C051	AUCAGCACCUUUCACACUC(SEQ ID NO:379)
		C209.016	AAAGUCACCAUAUUAAUAA(SEQ ID NO:380)
C217.013	UUUUAAAAAGUCACCAUAU(SEQ ID NO:381)
		C218.003	AGUCACCAUAUUAAUAAAAAU(SEQ ID NO:382)
C218.005	AAAGUCACCAUAUUAAUAAAA(SEQ ID NO:383)
		C218.006	AAAAGUCACCAUAUUAAUAAA(SEQ ID NO:384)
C218.008	UAAAAAGUCACCAUAUUAAUA(SEQ ID NO:385)
		C218.012	AUUUUAAAAAGUCACCAUAUU(SEQ ID NO:386)
C219.001	AGUCACCAUAUUAAUAAAAAUGC(SEQ ID NO:387)
		C219.003	AAAGUCACCAUAUUAAUAAAAAU(SEQ ID NO:388)
C219.004	AAAAGUCACCAUAUUAAUAAAAA(SEQ ID NO:389)
		C219.006	UAAAAAGUCACCAUAUUAAUAAA(SEQ ID NO:390)
C219.007	UUAAAAAGUCACCAUAUUAAUAA(SEQ ID NO:391)

在一些实施方案中，dsRNA或本公开文本的dsRNA的反义链中的第二序列包含与靶序列的一个或多个错配。在一些实施方案中，所述靶序列是SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，所述dsRNA或所述dsRNA的反义链中的第二序列包含与所述靶序列的不超过4、3或2个错配。在一些实施方案中，所述dsRNA或所述dsRNA的反义链中的第二序列包含与所述靶序列的不超过1个错配。在一些实施方案中，所述一个或多个错配不位于互补区的中心。在一些实施方案中，所述一个或多个错配位于所述互补区的5'末端和/或3'末端的五个、四个、三个、两个或一个核苷酸内。例如，对于与PCSK9基因的区域互补的23个核苷酸的dsRNA链，所述dsRNA通常在dsRNA链与PCSK9 mRNA之间的互补区的中心13个核苷酸内不含任何错配。

在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA包含表2或表3中描述的有义链和/或反义链。尽管表2中示出的示例性siRNA包括修饰，但是也考虑序列相同但修饰数目/模式/类型不同的siRNA。具有相同序列但不具有2'-O-Me和2'-氟修饰的siRNA示于表3中。在一些实施方案中，dsRNA包含表3中示出的有义链，但缺少5'CCA和/或3'invdT。在一些实施方案中，dsRNA包含表3中示出的反义链，但缺少3'dTdT。

表2：siRNA序列(具有修饰)。

mX＝2'-O-Me核苷酸

fX＝2'-F核苷酸

dX＝DNA核苷酸

invdX＝反向dX

表3：siRNA序列(不具有O-Me和F修饰)。

invdX＝反向dX核苷酸

在一些实施方案中，所述dsRNA包含PCT公开案WO 2019/170731中描述的一种或多种经修饰的核苷酸，其披露内容以其整体并入本文。在此类经修饰的核苷酸中，核糖环被六元杂环替代。这种经修饰的核苷酸具有式(I)的结构：

其中：

- B是杂环核碱基；

- Y是O、NH、NR1或N-C(＝O)-R1，其中R1是：

(C1-C20)烷基，其任选地被一个或多个选自卤原子、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基、(C5-C14)杂芳基、-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1、

-CN、-C(＝J)-O-Z1、-O-C(＝J)-Z1、-C(＝J)-N(Z1)(Z2)和-N(Z1)-C(＝J)-Z2的基团取代，其中

J是O或S，

m是意指0或1的整数，

p是范围为0至10的整数，

R2是(C1-C20)亚烷基，其任选地被(C1-C6)烷基、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、

-CN、-C(＝K)-O-Z3、-O-C(＝K)-Z3、-C(＝K)-N(Z3)(Z4)或-N(Z3)-C(＝K)-Z4取代，其中

K是O或S，

(C6-C14)芳基或(C5-C14)杂芳基，或者R3是细胞靶向部分，

- X1和X2各自独立地是氢原子、(C1-C6)烷基，并且

- Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地是H或(C1-C6)烷基，

或者是其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，Y是NR1，R1是未经取代的(C1-C20)烷基，并且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有对于通式(I)或其药学上可接受的盐所定义的相同含义。

在一些实施方案中，Y是NR1，R1是未经取代的(C1-C16)烷基，其包括选自甲基、异丙基、丁基、辛基、十六烷基的烷基，并且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有对于通式(I)或其药学上可接受的盐所定义的相同含义。

在一些实施方案中，Y是NR1，R1是(C3-C8)环烷基，其任选地被一个或多个选自卤原子和(C1-C6)烷基的基团取代，并且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有对于通式(I)或其药学上可接受的盐所定义的相同含义。

在一些实施方案中，Y是NR1，R1是环己基，并且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有对于通式(I)或其药学上可接受的盐所定义的相同含义。

在一些实施方案中，Y是NR1，R1是被(C6-C14)芳基取代的(C1-C20)烷基，并且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有对于通式(I)或其药学上可接受的盐所定义的相同含义。

在一些实施方案中，Y是NR1，R1是被苯基取代的甲基，并且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有对于通式(I)或其药学上可接受的盐所定义的相同含义。

在一些实施方案中，Y是N-C(＝O)-R1，R1是任选经取代的(C1-C20)烷基，并且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有对于通式(I)或其药学上可接受的盐所定义的相同含义。

在一些实施方案中，Y是N-C(＝O)-R1，R1选自甲基和十五烷基，并且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有对于通式(I)或其药学上可接受的盐所定义的相同含义。

在一些实施方案中，所述dsRNA包含一种或多种式(I)的化合物，其中Y是

a)NR1，其中R1是未经取代的(C1-C20)烷基；

b)NR1，其中R1是未经取代的(C1-C16)烷基，其包括选自甲基、异丙基、丁基、辛基和十六烷基的烷基；

c)NR1，其中R1是(C3-C8)环烷基，其任选地被一个或多个选自卤原子和(C1-C6)烷基的基团取代；

d)NR1，其中R1是环己基；

e)NR1，其中R1是被(C6-C14)芳基取代的(C1-C20)烷基；

f)NR1，其中R1是被苯基取代的甲基；

g)N-C(＝O)-R1，其中R1是任选经取代的(C1-C20)烷基；或

h)N-C(＝O)-R1，其中R1是甲基或十五烷基。

在一些实施方案中，B选自嘧啶、经取代的嘧啶、嘌呤和经取代的嘌呤，或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述dsRNA中的核苷间连接基团独立地选自磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基-膦酸酯和氨基磷酸酯主链连接基团，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述dsRNA包含一个或多个核苷间连接基团，所述核苷间连接基团独立地选自磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基-膦酸酯和氨基磷酸酯主链连接基团，或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述dsRNA包含2至10个式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，所述2至10个式(I)的化合物在所述有义链上。

在另外的实施方案中，所述dsRNA包含一个或多个靶向核苷酸或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，R3具有式(II)：

其中A1、A2和A3是OH，

可以用于制备具有式(I)核苷酸的经修饰siRNA的前体在下表A中举例说明。表A示出用于寡核苷酸合成的亚磷酰胺核苷酸类似物的例子。在(2S,6R)非对映异构体系列中，作为核苷酸前体的亚磷酰胺缩写为“pre-l”，核苷酸类似物缩写为“l”，其后是核碱基和数字，其指定了式(I)中的基团Y。为了区分两种立体化学，类似物(2R,6R)-非对映异构体用另外的“b”指示。靶核苷酸前体、靶核苷酸类似物和固体支持物如上所述缩写，但用“lg”替代“l”。

表A

式(I)的经修饰的核苷酸可以掺入所述dsRNA的有义链和/或反义链的5'末端、3'末端或两端。例如，一个或多个(例如，1、2、3、4或5个或更多个)经修饰的核苷酸可以掺入所述dsRNA的有义链的5'末端。在一些实施方案中，一个或多个(例如，1、2、3个或更多个)经修饰的核苷酸定位在有义链的5'末端，其中经修饰的核苷酸不与反义序列互补，但可以任选地与反义链的对应3'末端处的相等或更少数目的互补核苷酸配对。

在一些实施方案中，所述dsRNA可以包含具有长度为17、18或19个核苷酸的有义序列的有义链，其中三至五个式(I)的核苷酸(例如，三个连续的lgT3或lgT7，具有或不具有另外的式(I)的核苷酸)置于有义序列的5'末端，使得有义链的长度为20、21或22个核苷酸。在此类实施方案中，有义链可以在有义序列的3'处另外包含两个连续的式(I)的核苷酸(例如，1T4或lT3)，使得有义链的长度为22、23或24个核苷酸。所述dsRNA可以包含长度为19个核苷酸的反义序列，其中所述反义序列可以另外连接至在其3'末端的2个经修饰的核苷酸或脱氧核糖核苷酸(例如，dT)，使得反义链的长度为21个核苷酸。在另外的实施方案中，所述dsRNA的有义链仅含有天然存在的核苷酸间键(磷酸二酯键)，而反义链可以任选地含有非天然存在的核苷酸间键。例如，反义链可以在其5'末端和/或3'末端附近或在其5'末端和/或3'末端在主链中含有硫代磷酸酯键。

在一些实施方案中，使用式(I)的经修饰的核苷酸避免了对其他RNA修饰(如使用非天然存在的核苷酸间键)的需要，从而简化了dsRNA的化学合成。此外，式(I)的经修饰的核苷酸可以容易地制备为含有细胞靶向部分，如GalNAc衍生物(其包括GalNAc本身)，增强掺入此类核苷酸的dsRNA的递送效率。另外，已经显示，例如在有义链上掺入式(I)的经修饰的核苷酸的dsRNA显著改善dsRNA的稳定性和治疗效力。

在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA包含在双链核糖核酸(dsRNA)中描述的有义链和/或反义链，其中所述dsRNA包括包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链，其中所述第一序列与所述第二序列互补，其中所述第一序列包含选自SEQ ID NO:6-11和310-321的序列。表4中的siRNA可以包含任何一种或多种下列修饰：mX＝2'-O-甲基-核苷酸，fX＝2'-氟代核苷酸，lX＝锁核苷酸，dT＝脱氧胸苷，lgT3＝lgT3核苷酸类似物，lT4＝lT4核苷酸类似物，PO＝磷酸二酯连接；并且PS＝硫代磷酸酯连接。

表4：优化的PCSK9 GalNAc siRNA

在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA包括：

a)包含选自SEQ ID NO:578、585、587、620、621、622和627的核苷酸序列的有义链；和/或

b)包含选自SEQ ID NO:589、591、631、632、634、635和639的核苷酸序列的反义链。

a)SEQ ID NO:578和589；[C027.001]

b)SEQ ID NO:620和631；[C027.003]

c)SEQ ID NO:585和591；[C027.001#40]

d)SEQ ID NO:587和591；[C027.001#58]

e)SEQ ID NO:621和634；[C027.003#03]

f)SEQ ID NO:622和632；[C027.003#06]

g)SEQ ID NO:622和635；和[C027.003#08]

h)SEQ ID NO:627和639；[C027.003#47]

在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA(例如，第一dsRNA)与一种或多种另外的dsRNA(例如，至少第二dsRNA)用于方法或组合物(例如，药物组合物)中。在一些实施方案中，所述第二dsRNA也靶向PCSK9。在一些实施方案中，所述第二dsRNA靶向PCSK9的不同于所述第一dsRNA所靶向区域的区域。在一些实施方案中，所述第二dsRNA靶向源自在除PCSK9基因之外的靶基因的表达期间形成的mRNA序列的序列。在一些实施方案中，所述第二dsRNA靶向与PCSK9相互作用的基因和/或参与脂质代谢或胆固醇代谢的基因。

dsRNA修饰

在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA包含一种或多种修饰。修饰可以包括本领域已知的任何修饰，包括例如末端修饰、碱基修饰、糖修饰/替代和主链修饰。末端修饰可以包括例如5'末端修饰(如磷酸化、缀合、反向连接等)和3'末端修饰(如缀合物、DNA核苷酸、反向连接等)。碱基修饰可以包括例如用稳定碱基、去稳定碱基、与扩展的配偶体库发生碱基配对的碱基、碱基去除(脱碱基核苷酸)或缀合碱基替代。糖修饰/替代可以包括例如在2'或4'位的修饰或糖的替代。主链修饰可以包括例如磷酸二酯连接的修饰或替代。

本公开文本的dsRNA可以包括一种或多种本领域已知的经修饰的核苷酸，所述经修饰的核苷酸包括2'-O-甲基修饰的核苷酸，2'-氟修饰的核苷酸，2'-脱氧修饰的核苷酸，2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸，包含交替的核苷酸间连接(如硫代磷酸酯(thiophosphate)和硫代磷酸酯(phosphorothioate)(例如，5'-硫代磷酸酯))的经修饰的核苷酸，磷酸三酯修饰的核苷酸，末端连接至胆固醇衍生物或亲脂性部分的经修饰的核苷酸，肽核酸(PNA；参见Nielsen等人(1991)Science 254,1497-1500)，约束乙基(cEt)修饰的核苷酸，反向脱氧修饰的核苷酸，反向双脱氧修饰的核苷酸，锁核酸修饰的核苷酸，脱碱基修饰的核苷酸，2'-氨基修饰的核苷酸，2'-烷基修饰的核苷酸，吗啉代修饰的核苷酸，氨基磷酸酯修饰的核苷酸，在寡核苷酸的糖或碱基的其他位点包含修饰的经修饰的核苷酸，和含非天然碱基的经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述一种或多种经修饰的核苷酸中的至少一种是2'-O-甲基核苷酸、5'-硫代磷酸酯核苷酸或连接至胆固醇衍生物或亲脂性部分的末端核苷酸。在寡核苷酸的核苷中掺入2'-O-甲基、2'-O-乙基、2'-O-丙基、2'-O-烯丙基、2'-O-氨基烷基或2'-脱氧-2'-氟代基团可以赋予寡核苷酸增强的杂交特性和/或增强的核酸酶稳定性。另外，含有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸可以具有增强的核酸酶稳定性。

在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA包含一个或多个2'-O-甲基核苷酸和一个或多个2'-氟代核苷酸。在一些实施方案中，所述dsRNA包含两个或更多个2'-O-甲基核苷酸和两个或更多个2'-氟代核苷酸。在一些实施方案中，所述dsRNA包含交替模式的两个或更多个2'-O-甲基核苷酸(OMe)和两个或更多个2'-氟代核苷酸(F)，所述交替模式例如模式OMe-F-OMe-F或模式F-OMe-F-OMe。在一些实施方案中，所述dsRNA包含多达10个连续核苷酸，所述连续核苷酸各自是2'-O-甲基核苷酸。在一些实施方案中，所述dsRNA包含多达10个连续核苷酸，所述连续核苷酸各自是2'-氟代核苷酸。

在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA包含一个或多个硫代磷酸酯基团。在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA包含两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、或10个或更多个硫代磷酸酯基团。在一些实施方案中，所述dsRNA不包含硫代磷酸酯基团。

在一些实施方案中，所述dsRNA包含一个或多个磷酸三酯基团。在一些实施方案中，所述dsRNA包含两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、或10个或更多个磷酸三酯基团。在一些实施方案中，所述dsRNA不包含磷酸三酯基团。

在一些实施方案中，所述dsRNA包含两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、或10个或更多个本文所述的不同的经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述dsRNA包含多达两个连续的经修饰的核苷酸、多达三个连续的经修饰的核苷酸、多达四个连续的经修饰的核苷酸、多达五个连续的经修饰的核苷酸、多达六个连续的经修饰的核苷酸、多达七个连续的经修饰的核苷酸、多达八个连续的经修饰的核苷酸、多达九个连续的经修饰的核苷酸、或多达10个连续的经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述连续的经修饰的核苷酸是相同的经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述连续的经修饰的核苷酸是两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、或十个或更多个不同的经修饰的核苷酸。

dsRNA缀合物

本公开文本的dsRNA可以化学/物理地连接至一个或多个配体、部分或缀合物。在一些实施方案中，所述dsRNA经由接头缀合/附接至一个或多个配体。可以使用本领域已知的任何接头，包括例如三价分支接头。将配体缀合至dsRNA可以改变其分布，增强其细胞吸收和/或靶向特定组织和/或被一种或多种特定细胞类型(例如，肝细胞)摄取，和/或增强dsRNA药剂的寿命。在一些实施方案中，将疏水性配体缀合至dsRNA以促进直接渗透细胞膜和/或跨细胞(例如，肝细胞)摄取。

在一些实施方案中，所述dsRNA经由接头附接至一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物。在一些实施方案中，所述dsRNA经由接头附接至三个或更多个GalNAc衍生物。在一些实施方案中，所述接头是三价分支接头。在一些实施方案中，所述dsRNA经由三价分支接头附接至三个或更多个GalNAc衍生物。在一些实施方案中，所述一个或多个GalNAc衍生物附接至所述dsRNA的有义链的3'末端、反义链的3'末端、有义链的5'末端和/或反义链的5'末端。

示例性和非限制性的缀合物和接头描述于例如Biessen等人,BioconjugateChem.13(2):295-302(2002)；Cedillo等人,Molecules 22(8):E1356(2017)；Grijalvo等人,Genes9(2):E74(2018)；Huang等人,Molecular Therapy:Nucleic Acids 6:116-132(2017)；Nair等人,J.Am.Chem.Soc.136:16958-16961(2014)；Ostergaard等人,Bioconjugate Chem.26:1451-1455(2015)；Springer等人,Nucleic Acid Therapeutics28(3):109-118(2018)；以及美国专利8,106,022、9,127,276和8,927,705中。GalNAc缀合可以通过本领域熟知的方法(例如，如上述文献中所述)容易地进行。

在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA附接至以下化合物。

在一些实施方案中，所述配体是一种或多种靶向基团(例如，细胞或组织靶向剂)，例如，对共配体具有特异性亲和力的一种或多种蛋白质、糖蛋白、肽或分子。此类配体可以包括而不限于结合到指定细胞类型(如肝细胞)的凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如抗体。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑素细胞激素、凝集素、糖蛋白、表面活性剂蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸酯、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12或生物素。

配体可以包括例如天然存在的物质，如蛋白质、碳水化合物(例如，N-乙酰基-葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺)、脂多糖、脂质、重组或合成分子(如合成聚合物)、聚胺、α螺旋肽、凝集素、维生素和辅因子。在一些实施方案中，所述配体是一种或多种染料、交联剂、多环芳族烃、肽缀合物(例如，触角足肽、Tat肽)、聚乙二醇(PEG)、酶、半抗原、转运/吸收促进剂、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺或咪唑簇)、人血清白蛋白(HSA)或LDL。

在一些实施方案中，所述dsRNA缀合至一种或多种胆固醇衍生物或亲脂性部分。本领域已知的任何亲脂性化合物可以缀合至所述dsRNA，所述亲脂性化合物包括而不限于胆固醇或胆固醇衍生物；胆酸；维生素(如叶酸、维生素A、维生素E(生育酚)、生物素、吡哆醛)；胆汁酸或脂肪酸缀合物，包括饱和的和不饱和的两者(如月桂酰(C₁₂)、豆蔻酰(C₁₄)和棕榈酰(C₁₆)、硬脂酰(C₁₈)和二十二烷酰(C₂₂)、石胆酸和/或石胆酸油胺缀合物(石胆酸-油烯基，C₄₃))；聚合物主链或支架(如PEG、三乙二醇(TEG)、六乙二醇(HEG)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、流体动力学聚合物)；类固醇(如二氢睾酮)；萜烯(如三萜烯)；阳离子脂质或肽；和/或脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子可以结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。基于脂质的配体可以用于调节(例如，控制)缀合物与靶组织的结合。例如，与HSA更强地结合的脂质或基于脂质的配体将不太可能靶向肾，因此不太可能从体内清除。所述靶组织可以是肝脏，包括肝脏的实质细胞。

I.组合物

本公开文本的某些方面涉及包含如本文所述的dsRNA的组合物(例如，药物组合物)。在一个实施方案中，所述组合物(例如，药物组合物)还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述组合物(例如，药物组合物)可用于治疗与PCSK9基因的表达或活性相关的疾病或障碍。在一些实施方案中，所述与PCSK9基因的表达相关的疾病或障碍是脂血症(例如，高脂血症)和/或其他形式的脂质失衡，如高胆固醇血症、高甘油三酯血症，以及与这些障碍相关的病理性病症，如心脏和循环系统疾病。本公开文本的组合物(例如，药物组合物)基于递送模式配制，包括例如经配制用于经由肠胃外递送而递送至肝脏的组合物。

本公开文本的组合物(例如，药物组合物)可以以足以抑制PCSK9基因的表达的剂量施用。在一些实施方案中，dsRNA的合适剂量在0.01mg/kg-200mg/kg受者体重的范围内。

本领域普通技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排，这些因素包括但不限于，疾病或障碍的严重程度、先前治疗、受试者的总体健康状况和/或年龄、以及存在的一种或多种其他疾病。此外，用治疗有效量的药物组合物治疗受试者可以包括单一治疗或一系列治疗。可以使用常规方法或基于使用适当动物模型的体内测试来估计如本文所公开的dsRNA的有效剂量和体内半衰期。

本公开文本的dsRNA分子可以配制在药学上可接受的载体或稀释剂中。药学上可接受的载体可以是液体或固体，并且可以根据考虑的计划的施用方式来选择，以提供期望的体积、稠度和其他相关的转运和化学特性。可以使用任何已知的药学上可接受的载体或稀释剂，包括例如水、盐水溶液、粘合剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(例如，乳糖和其他糖、明胶或硫酸钙)、润滑剂(例如，淀粉、聚乙二醇或乙酸钠)、崩解剂(例如，淀粉或淀粉羟乙酸钠)、钙盐(例如，硫酸钙、氯化钙、磷酸钙等)和润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)。

本公开文本的dsRNA分子可以配制成组合物(例如，药物组合物)，所述组合物含有与其他分子、分子结构或核酸混合物混合、包封、缀合或以其他方式缔合的dsRNA。例如，包含一种或多种如本文所述的dsRNA的组合物可以含有其他治疗剂，如其他降脂剂(例如，他汀类)。在一些实施方案中，所述组合物(例如，药物组合物)还包含递送媒介物(如本文所述)。

II.制备dsRNA的方法

本公开文本的dsRNA可以通过本领域已知的任何方法合成。例如，dsRNA可以通过使用自动合成仪、通过体外转录和纯化(例如，使用可商购的体外RNA合成试剂盒)、通过从细胞(例如，包含编码dsRNA的表达盒/载体的细胞)转录和纯化等合成。

经修饰的dsRNA的制备

本公开文本的带有连接的序列特异性核苷的配体缀合的dsRNA和配体-分子可以通过本领域已知的任何方法组装，包括例如通过在合适的DNA合成仪上利用标准的核苷酸或核苷前体、或已经带有连接部分的核苷酸或核苷缀合物前体、已经带有配体分子的配体-核苷酸或核苷-缀合的前体、或带有非核苷配体的构建块来组装。

本公开文本的配体缀合的dsRNA可以通过本领域已知的任何方法合成，包括例如通过使用带有侧反应性官能团(如连接分子与dsRNA附接得到的侧反应性官能团)的dsRNA合成。在一些实施方案中，此反应性寡核苷酸可以与市售配体、带有各种保护基中的任一种的合成配体或具有附接的连接部分的配体直接反应。在一些实施方案中，所述方法通过使用已经与配体适当缀合并且可以进一步附接至固体支持物材料的核苷单体来促进配体缀合的dsRNA的合成。在一些实施方案中，带有附接至dsRNA的3'末端的芳烷基配体的dsRNA通过首先将单体构建块经由长链氨基烷基共价附接至受控孔玻璃支持物；然后，经由标准固相合成技术将核苷酸结合至与固体支持物结合的单体构建块上来制备。所述单体构建块可以是核苷或与固相合成相容的其他有机化合物。

在一些实施方案中，使用DNA合成仪制备在5'-末端具有氨基的本公开文本的官能化核苷序列，然后使其与所选配体的活性酯衍生物反应。活性酯衍生物是本领域普通技术人员熟知的。氨基与活性酯的反应产生寡核苷酸，其中所选配体通过连接基团附接至5'-位。5'-末端的氨基可以利用5'-氨基修饰剂C6试剂制备。在一些实施方案中，配体分子通过使用配体-核苷亚磷酰胺在5'-位缀合至寡核苷酸，其中所述配体直接或经由接头间接连接至5'-羟基。此类配体-核苷亚磷酰胺通常在自动化合成程序结束时使用，以提供在5'-末端带有配体的配体-缀合的寡核苷酸。

III.载体和dsRNA递送

本公开文本的dsRNA可以直接或间接递送。在一些实施方案中，通过向受试者施用包含所述dsRNA的组合物(例如，药物组合物)来直接递送所述dsRNA。在一些实施方案中，通过施用一种或多种本文所述的载体间接递送所述dsRNA。

递送

本公开文本的dsRNA可以通过本领域已知的任何方法递送，包括例如通过改编递送核酸分子的方法以用于递送dsRNA(参见例如，Akhtar,S.等人(1992)TrendsCell.Biol.2(5):139-144；WO 94/02595)，或经由本领域已知的另外的方法递送(参见例如，Kanasty,R.等人(2013)Nature Materials 12:967-977；Wittrup,A.和Lieberman,J.(2015)Nature Reviews Genetics 16:543-552；Whitehead,K.等人(2009)Nature ReviewsDrug Discovery 8:129-138；Gary,D.等人(2007)121(1-2):64-73；Wang.J.等人(2010)AAPS J.12(4):492-503；Draz,M.等人(2014)Theranostics 4(9):872-892；Wan,C.等人(2013)Drug Deliv.And Transl.Res.4(1):74-83；Erdmann,V.A.和Barciszewski,J.(编辑)(2010)“RNA Technologies and Their Applications”,Springer-Verlag BerlinHeidelberg,DOI 10.1007/978-3-642-12168-5；Xu,C.和Wang,J.(2015)Asian Journal ofPharmaceutical Sciences 10(1):1-12)。

在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA通过包含所述dsRNA的递送媒介物递送。在一些实施方案中，所述递送媒介物是脂质体、脂质体复合物、复合物或纳米颗粒。

脂质体配制品

脂质体是具有由亲脂性材料形成的膜和水性内部的单层和多层囊泡。在一些实施方案中，脂质体是由布置成一个或多个球形双层的两亲性脂质构成的囊泡。所述水性部分含有待递送的组合物。阳离子脂质体具有能够与细胞壁融合的优点。脂质体的优点包括例如从天然磷脂获得的脂质体是生物相容的和生物可降解的；脂质体可以掺入宽范围的水溶性药物和脂溶性药物中；脂质体可以保护在它们的内部区室中的包封药物免于代谢和降解(Rosoff，在Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,Marcel Dekker,Inc.,纽约州纽约市,第1卷，第245页中)。在脂质体配制品的制备中，重要的考虑是脂质表面电荷、囊泡尺寸和脂质体的水性体积。例如，工程化的阳离子脂质体和空间稳定的脂质体可以用于递送所述dsRNA。参见，例如Podesta等人(2009)MethodsEnzymol.464,343-54；美国专利号5,665,710。

核酸-脂质颗粒

在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA被完全包封在脂质配制品中，例如，形成核酸-脂质颗粒，例如，SPLP、pSPLP或SNALP。如本文所用，术语“SNALP”是指稳定的核酸-脂质颗粒，包括SPLP。如本文所用，术语“SPLP”是指包含包封在脂质囊泡内的质粒DNA的核酸-脂质颗粒。核酸-脂质颗粒(例如，SNALP)通常含有阳离子脂质、非阳离子脂质和防止颗粒聚集的脂质(例如，PEG-脂质缀合物)。SNALP和SPLP可用于全身性应用，因为它们在静脉内(i.v.)注射后展现出延长的循环寿命，并且在远端位点(例如，与施用位点物理上分开的位点)累积。SPLP包括“pSPLP”，其包括如PCT公开号WO 00/03683中所示的包封的缩合剂-核酸复合物。

在一些实施方案中，当存在于核酸-脂质颗粒中时，dsRNA在水性溶液中抗核酸酶降解。核酸-脂质颗粒及其制备方法披露于例如美国专利号5,976,567；6,534,484；6,815,432；以及PCT申请号WO 96/40964中。

在一些实施方案中，所述核酸-脂质颗粒包含阳离子脂质。可以使用本领域已知的任何阳离子脂质或其混合物。在一些实施方案中，所述核酸-脂质颗粒包含非阳离子脂质。可以使用本领域已知的任何非阳离子脂质或其混合物。在一些实施方案中，所述核酸-脂质颗粒包含缀合的脂质(例如，以防止聚集)。可以使用本领域已知的任何缀合的脂质。

另外的配制品

为了成功地在体内递送dsRNA分子，考虑的重要因素包括：(1)所递送的分子的生物稳定性，(2)防止非特异性效应，和(3)所递送的分子在靶组织中的累积。dsRNA的非特异性效应可以通过局部施用，例如通过直接注射或植入组织中或局部施用制剂而最小化。为了全身性施用dsRNA以治疗疾病，所述dsRNA可以经修饰或替代性地使用药物递送系统递送；两种方法都用以防止所述dsRNA在体内被内切核酸酶和外切核酸酶快速降解。RNA或药物载体的修饰还可以允许dsRNA组合物靶向靶组织并避免不期望的脱靶效应。如上所述，dsRNA分子可以通过与亲脂性基团(如胆固醇)化学缀合而被修饰，以增强细胞摄取并防止降解。在一些实施方案中，使用药物递送系统(如纳米颗粒、树状聚合物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统)递送所述dsRNA。带正电荷的阳离子递送系统促进dsRNA分子(带负电荷)的结合，并且还增强在带负电荷的细胞膜处的相互作用，以允许dsRNA被细胞有效摄取。阳离子脂质、树状聚合物或聚合物可以结合至dsRNA，或经诱导以形成包裹dsRNA的囊泡或胶束(参见例如，Kim S.H.等人(2008)Journal of Controlled Release 129(2):107-116)。囊泡或胶束的形成进一步防止dsRNA在全身性施用时降解。本领域已知用于制备和施用阳离子-dsRNA复合物的方法。在一些实施方案中，dsRNA与环糊精形成复合物用于全身性施用。

编码dsRNA的载体

本公开文本的dsRNA可以由重组载体编码。在一些实施方案中，所述载体是DNA载体或RNA载体。在一些实施方案中，所述载体是质粒、粘粒或病毒载体。在一些实施方案中，所述载体与在原核细胞中表达相容。在一些实施方案中，所述载体与在大肠杆菌中表达相容。在一些实施方案中，所述载体与在真核细胞中表达相容。在一些实施方案中，所述载体与在酵母细胞中表达相容。在一些实施方案中，所述载体与在脊椎动物细胞中表达相容。可以使用本领域已知的能够编码所述dsRNA的任何表达载体，包括例如源自腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒(例如，慢病毒(LV)、弹状病毒、鼠白血病病毒等)、疱疹病毒、SV40病毒、多瘤病毒、乳头瘤病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒(例如，正痘或禽痘)等的载体。病毒载体或病毒源载体的向性可以通过用包膜蛋白或来自一种或多种其他病毒的其他表面抗原假型化载体、或通过取代不同的病毒衣壳蛋白(视情况而定)来修饰。例如，慢病毒载体可以是具有来自水疱性口炎病毒(VSV)、狂犬病毒、埃博拉病毒(Ebola)、莫科拉病毒(Mokola)等的表面蛋白的假型。通过工程化载体以表达不同的衣壳蛋白血清型，可以制备AAV载体以靶向不同的细胞。例如，在血清型2基因组上表达血清型2衣壳的AAV载体称为AAV 2/2。AAV2/2载体中的此血清型2衣壳基因可以被血清型5衣壳基因替代以产生AAV 2/5载体。构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术先前已有描述，例如Rabinowitz等人(2002)J.Virol.76:791-801。

本领域已知重组载体的选择、将核酸序列插入载体中以表达dsRNA的方法以及将载体递送至一种或多种目的细胞中的方法。参见例如，Domburg(1995)Gene Therap.2:301-310；Eglitis(1998)Biotechniques 6:608-614；Miller(1990)Hum.Gene Therap.1:5-14；Anderson(1998)Nature 392:25-30；Xia等人(2002)Nat.Biotech.20:1006-1010；Robinson等人(2003)Nat.Genet.33:401-406；Samulski等人(1987)J.Virol.61:3096-3101；Fisher等人(1996)J.Virol.70:520-532；Samulski等人(1989)J.Virol.63-3822-3826；美国专利号5,252,479；美国专利号5,139,941；WO 94/13788；以及WO 93/24641。

可用于递送如本文所述的dsRNA的载体可以包括足以在期望的靶细胞或组织中表达dsRNA的调节元件(例如，异源启动子、增强子等)。在一些实施方案中，所述载体包含连接至一个或多个异源启动子的一个或多个编码所述dsRNA的序列。可以使用本领域已知的能够表达dsRNA的任何异源启动子，包括例如U6或H1 RNA pol III启动子、T7启动子和巨细胞病毒启动子。所述一种或多种异源启动子可以是诱导型启动子、阻遏型启动子、调节型启动子和/或组织特异性启动子。另外的启动子的选择在本领域普通技术人员的能力范围内。在一些实施方案中，选择所述调节元件以提供组成型表达。在一些实施方案中，选择所述调节元件以提供调节型/诱导型/阻遏型表达。在一些实施方案中，选择所述调节元件以提供组织特异性表达。在一些实施方案中，所述调节元件和编码所述dsRNA的序列形成转录单位。

本公开文本的dsRNA可以从插入DNA或RNA载体中的转录单位表达(参见例如，Couture,A等人(1996)TIG 12:5-10；WO 00/22113；WO 00/22114；以及美国专利号6,054,299)。表达可以是瞬时的(在数小时至数周的数量级上)或持续的(数周至数月或更久)，这取决于所使用的具体构建体和靶组织或细胞类型。这些转基因可以作为线性构建体、环状质粒或病毒载体引入，所述载体可以是整合或非整合载体。所述转基因也可以构建为允许其作为染色体外质粒遗传(Gassmann等人(1995)PNAS 92:1292)。

在一些实施方案中，dsRNA的有义链和反义链在单独的表达载体上编码。在一些实施方案中，所述有义链和所述反义链在共同引入(例如，通过转染或感染)到相同靶细胞中的两个单独的表达载体上表达。在一些实施方案中，所述有义链和所述反义链在相同的表达载体上编码。在一些实施方案中，所述有义链和所述反义链从位于相同表达载体上的单独启动子转录。在一些实施方案中，所述有义链和所述反义链从相同表达载体上的相同启动子转录。在一些实施方案中，所述有义链和所述反义链从相同启动子转录为通过接头多核苷酸序列连接的反向重复序列，使得dsRNA具有茎环结构。

IV.细胞

本公开文本的某些方面涉及一种或多种包含如本文所述的dsRNA的分离的细胞，或一种或多种包含编码如本文所述的dsRNA的载体的细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞是原核细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞是真核细胞。本领域已知的任何真核细胞可以包含本文所述的dsRNA或载体，包括例如酵母细胞、SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(经亚克隆以在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞托利细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；Hep3B细胞；C3A细胞；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；CHO细胞(如DHFR-CHO细胞，例如ATCC CRL-9096)；TRI细胞(Mather等人,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；骨髓瘤细胞系(如NS0和Sp2/0)；以及来自受试者的原代细胞(如从人或非人灵长类动物分离的原代细胞)。

V.使用dsRNA的方法

本公开文本的某些方面涉及用于抑制哺乳动物的PCSK9基因的表达的方法，所述方法包括施用有效量的一种或多种本公开文本的dsRNA、一种或多种本公开文本的载体或包含一种或多种本公开文本的dsRNA的本公开文本的组合物(例如，药物组合物)。本公开文本的某些方面涉及治疗和/或预防一种或多种PCSK9介导的疾病或障碍的方法，所述方法包括施用一种或多种本公开文本的dsRNA和/或一种或多种本公开文本的载体和/或包含一种或多种本公开文本的dsRNA的组合物(例如，药物组合物)。在一些实施方案中，下调受试者的PCSK9表达减轻所述受试者的PCSK9介导的疾病或障碍的一种或多种症状。dsRNA的例子描述于第II部分中。

在一些实施方案中，与治疗前水平相比，治疗后受试者的PCSK9基因的表达被抑制了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、或约100％。在一些实施方案中，与治疗前水平相比，治疗后PCSK9基因的表达被抑制了至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约75倍、或至少约100倍。在一些实施方案中，所述PCSK9基因在所述受试者的肝脏中被抑制。

在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者患有或已被诊断为患有PCSK9介导的障碍或疾病。在一些实施方案中，所述受试者被怀疑患有PCSK9介导的障碍或疾病。在一些实施方案中，所述受试者处于患上PCSK9介导的障碍或疾病的风险中。

本文所述的dsRNA和组合物(例如，药物组合物)可以用于治疗脂血症(例如，高脂血症)和/或其他形式的脂质失衡，如高胆固醇血症、高甘油三酯血症，以及与这些障碍相关的病理性病症，如心脏和循环系统疾病。在一些实施方案中，所述方法包括向具有杂合LDLR基因型的受试者施用有效量的所述dsRNA。

在一些实施方案中，通过任何本文所述的方法抑制PCSK9基因表达的效应导致受试者中胆固醇水平降低。在一些实施方案中，抑制PCSK9基因表达的效应导致受试者的血液中胆固醇降低。在一些实施方案中，抑制PCSK9基因表达的效应导致受试者的血清中胆固醇降低。在一些实施方案中，与治疗前水平相比，胆固醇水平降低了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％或更多。在一些实施方案中，与治疗前水平相比，胆固醇水平降低了至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍或更多。

本文所述的dsRNA或组合物(例如，药物组合物)可以通过本领域已知的任何手段施用，包括而不限于口服或肠胃外途径，包括静脉内、肌内、皮下、肺部、透皮和气道(气溶胶)施用。典型地，当治疗患有高脂血症的哺乳动物时，dsRNA分子经由肠胃外手段全身性施用。在一些实施方案中，所述dsRNA和/或组合物通过皮下施用来施用。在一些实施方案中，所述dsRNA和/或组合物通过静脉内施用来施用。在一些实施方案中，所述dsRNA和/或组合物通过肺部施用来施用。

当疾病状态的一个或多个参数存在统计学显著的改善时，或由于不会恶化或发展原本预期的症状，dsRNA的治疗或预防效果是明显的。例如，疾病的可测量参数的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的有利变化可以指示有效的治疗。给定dsRNA或包含所述dsRNA的组合物的功效也可以使用本领域已知的给定疾病或障碍的实验动物模型来判断。当使用实验动物模型时，当观察到标记物或症状的统计学显著降低时，证明了治疗的功效。

另外的药剂

在一些实施方案中，本公开文本的dsRNA与一种或多种另外的治疗剂组合施用。在一些实施方案中，所述dsRNA和另外的治疗剂在同一组合物中组合施用。在一些实施方案中，所述dsRNA和另外的治疗剂作为单独组合物的一部分施用。在一些实施方案中，所述单独组合物并行施用。在一些实施方案中，首先将包含所述dsRNA的组合物施用到受试者，然后将所述另外的治疗剂施用到所述受试者。在一些实施方案中，首先将包含所述另外的治疗剂的组合物施用到所述受试者，然后将包含所述dsRNA的组合物施用到所述受试者。

另外的治疗剂的例子包括本领域已知的治疗脂质障碍(如高胆固醇血症、动脉粥样硬化或血脂异常)的任何治疗剂。例如，所述另外的药剂可以是HMG-CoA还原酶抑制剂(例如，他汀类)、贝特类、胆汁酸螯合剂、烟酸、抗血小板剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂(例如，氯沙坦钾)、酰基CoA胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制剂、胆固醇吸收抑制剂、胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂、微粒体甘油三酯转移蛋白(MTTP)抑制剂、胆固醇调节剂、胆汁酸调节剂或过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)激动剂中的一种或多种。特定例子包括而不限于阿托伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、氟伐他汀、西立伐他汀、瑞舒伐他汀、依折麦布、苯扎贝特、氯贝特、非诺贝特、吉非贝齐、环丙贝特、考来烯胺、考来替泊、考来维仑和烟酸。适合与靶向PCSK9的dsRNA一起施用的示例性组合疗法包括例如烟酸/洛伐他汀、氨氯地平/阿托伐他汀和依折麦布/辛伐他汀。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种指导最终用户(例如，照护者或受试者)如何施用本文所述的dsRNA的方法。所述方法包括任选地为所述最终用户提供一个或多个剂量的所述dsRNA，以及指导所述最终用户按照本文所述的方案施用所述dsRNA，从而指导所述最终用户。

患者的鉴定

在一些实施方案中，本公开文本提供了通过基于受试者需要LDL降低、LDL降低而HDL不降低、ApoB降低或总胆固醇降低来选择所述受试者而治疗所述受试者的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用足以降低所述受试者的LDL水平或ApoB水平(例如，基本上不降低HDL水平)的量的dsRNA。

遗传倾向性在靶基因相关疾病(例如高脂血症)的发展中起作用。因此，需要dsRNA的受试者可以通过获得家族史，或例如筛选一种或多种遗传标记物或变体来鉴定。涉及高脂血症的基因的例子可以包括而不限于LDL受体(LDLR)、载脂蛋白(ApoAl、ApoB、ApoE等)、胆固醇酯转移蛋白(CETP)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、肝脂肪酶(LIPC)、内皮脂肪酶(EL)、卵磷脂:胆固醇基酰基转移酶(LCAT)。

保健提供者(如医生、护士或家庭成员)可以在开处方或施用dsRNA之前获得家族史。另外，可以进行测试以确定基因型或表型。例如，可以在将PCSK9 dsRNA施用到受试者之前，对来自所述受试者的样品(例如，血液样品)进行DNA测试，以鉴定PCSK9基因型和/或表型。在一些实施方案中，进行测试以鉴定相关的基因型和/或表型，例如LDLR基因型。本领域已知具有LDLR基因的遗传变体的例子(Costanza等人(2005)Am.J.Epidemiol.15；161(8):714-24；Yamada等人(2008)J.Med.Genet.Jan；45(1):22-8；以及Boes等人(2009)Exp.Gerontol.44:136-160)。

VI.试剂盒和制品

本公开文本的某些方面涉及可用于治疗和/或预防如上所述的PCSK9介导的障碍或疾病的制品或试剂盒，其包含如本文所述的一种或多种dsRNA、一种或多种载体或一种或多种组合物(例如，一种或多种药物组合物)中的一种或多种。所述制品或试剂盒还可以包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)制成。所述容器容纳有效治疗或预防所述疾病的组合物本身或与另一种组合物组合的组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉输液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述组合物中的至少一种活性剂是本文所述的dsRNA。所述标签或包装插页指示将所述组合物用于治疗PCSK9介导的障碍或疾病。在一些实施方案中，疾病是脂血症(例如，高脂血症)和/或其他形式的脂质失衡，如高胆固醇血症、高甘油三酯血症，以及与这些障碍相关的病理性病症，如心脏和循环系统疾病。此外，所述制品或试剂盒可以包含(a)其中容纳组合物的第一容器，其中所述组合物包含本文所述的dsRNA；和(b)其中容纳组合物的第二容器，其中所述组合物包含第二治疗剂。本公开文本的此实施方案中的制品或试剂盒还可以包括指示组合物可以用于治疗特定疾病的包装插页。可替代地或另外地，所述制品或试剂盒可以还包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器容纳药学上可接受的缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)和葡萄糖溶液。所述制品或试剂盒还可以包括从商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。

在不限制本公开文本的情况下，下文出于说明的目的描述本公开文本的多个实施方案。

项1：一种双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链，其中所述第一序列与所述第二序列互补，并且其中所述第一序列包含选自SEQ ID NO:6-11和310-321的序列。

项2：根据项1所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含：

(1)在所述有义链中的CCAUUUUAUUAAUAUGGUGACUinvdT(SEQ ID NO:176)和在所述反义链中的AGUCACCAUAUUAAUAAAAdTdT(SEQ ID NO:177)，

(2)在所述有义链中的CCAUAUUAAUAUGGUGACUUUUinvdT(SEQ ID NO:180)和在所述反义链中的AAAAGUCACCAUAUUAAUAdTdT(SEQ ID NO:181)，

(3)在所述有义链中的CCAAUUAAUAUGGUGACUUUUUinvdT(SEQ ID NO:182)和在所述反义链中的AAAAAGUCACCAUAUUAAUdTdT(SEQ ID NO:183)，

(4)在所述有义链中的CCAUUAAUAUGGUGACUUUUUAinvdT(SEQ ID NO:184)和在所述反义链中的UAAAAAGUCACCAUAUUAAdTdT(SEQ ID NO:185)，

(5)在所述有义链中的CCAUAAUAUGGUGACUUUUUAAinvdT(SEQ ID NO:186)和在所述反义链中的UUAAAAAGUCACCAUAUUAdTdT(SEQ ID NO:187)，

(6)在所述有义链中的CCAUAUGGUGACUUUUUAAAAUinvdT(SEQ ID NO:188)和在所述反义链中的AUUUUAAAAAGUCACCAUAdTdT(SEQ ID NO:189)，

(7)在所述有义链中的CCAUUAUUAAUAUGGUGACUUUinvdT(SEQ ID NO:322)和在所述反义链中的AAAGUCACCAUAUUAAUAAdTdT(SEQ ID NO:323)，

(8)在所述有义链中的CCAAUAUGGUGACUUUUUAAAAinvdT(SEQ ID NO:324)和在所述反义链中的UUUUAAAAAGUCACCAUAUdtdt(SEQ ID NO:325)，

(9)在所述有义链中的CCAAUUUUUAUUAAUAUGGUGACUinvdT(SEQ ID NO:326)和在所述反义链中的AGUCACCAUAUUAAUAAAAAUdTdT(SEQ ID NO:327)，

(10)在所述有义链中的CCAUUUUAUUAAUAUGGUGACUUUinvdT(SEQ ID NO:328)和在所述反义链中的AAAGUCACCAUAUUAAUAAAAdTdT(SEQ ID NO:329)，

(11)在所述有义链中的CCAUUUAUUAAUAUGGUGACUUUUinvdT(SEQ ID NO:330)和在所述反义链中的AAAAGUCACCAUAUUAAUAAAdTdT(SEQ ID NO:331)，

(12)在所述有义链中的CCAUAUUAAUAUGGUGACUUUUUAinvdT(SEQ ID NO:332)和在所述反义链中的UAAAAAGUCACCAUAUUAAUAdTdT(SEQ ID NO:333)，

(13)在所述有义链中的CCAAAUAUGGUGACUUUUUAAAAUinvdT(SEQ ID NO:334)和在所述反义链中的AUUUUAAAAAGUCACCAUAUUdTdT(SEQ ID NO:335)，

(14)在所述有义链中的CCAGCAUUUUUAUUAAUAUGGUGACUinvdT(SEQ ID NO:336)和在所述反义链中的AGUCACCAUAUUAAUAAAAAUGCdTdT(SEQ ID NO:337)，

(15)在所述有义链中的CCAAUUUUUAUUAAUAUGGUGACUUUinvdT(SEQ ID NO:338)和在所述反义链中的AAAGUCACCAUAUUAAUAAAAAUdTdT(SEQ ID NO:339)，

(16)在所述有义链中的CCAUUUUUAUUAAUAUGGUGACUUUUinvdT(SEQ ID NO:340)和在所述反义链中的AAAAGUCACCAUAUUAAUAAAAAdTdT(SEQ ID NO:341)，

(17)在所述有义链中的CCAUUUAUUAAUAUGGUGACUUUUUAinvdT(SEQ ID NO:342)和在所述反义链中的UAAAAAGUCACCAUAUUAAUAAAdTdT(SEQ ID NO:343)，或

(18)在所述有义链中的CCAUUAUUAAUAUGGUGACUUUUUAAinvdT(SEQ ID NO:344)和在所述反义链中的UUAAAAAGUCACCAUAUUAAUAAdTdT(SEQ ID NO:345)。

项3：一种双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链，其中仅所述第一序列与所述第二序列互补，并且其中所述第一序列是SEQ ID NO:3、4和13中的一个。

项4：根据项3所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含：

(19)在所述有义链中的CCAUUGUAGCAUUUUUAUUAAUinvdT(SEQ ID NO:162)和在所述反义链中的AUUAAUAAAAAUGCUACAAdTdT(SEQ ID NO:163)，

(20)在所述有义链中的CCAGUAGCAUUUUUAUUAAUAUinvdT(SEQ ID NO:166)和在所述反义链中的AUAUUAAUAAAAAUGCUACdTdT(SEQ ID NO:167)，或

(21)在所述有义链中的CCAGAGUGUGAAAGGUGCUGAUinvdT(SEQ ID NO:290)和在所述反义链中的AUCAGCACCUUUCACACUCdTdT(SEQ ID NO:291)。

项5：根据项1-4中任一项所述的dsRNA，其中所述第一序列和所述第二序列各自的长度为小于或等于30个核苷酸。

项6：根据项1-5中任一项所述的dsRNA，其中所述第一序列和所述第二序列各自的长度为至少19个且小于或等于23个核苷酸。

项7：根据项1-6中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA是小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。

项8：根据项1-7中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含一种或多种经修饰的核苷酸。

项9：根据项8所述的dsRNA，其中所述一种或多种经修饰的核苷酸中的至少一种是2'-O-甲基核苷酸、5'-硫代磷酸酯核苷酸或连接至胆固醇衍生物或亲脂性部分的末端核苷酸。

项10：根据项8所述的dsRNA，其中所述一种或多种经修饰的核苷酸中的至少一种是2'-氟代、2'-脱氧、2'-O-甲氧基乙基、约束乙基(cEt)、反向脱氧、反向双脱氧、锁核酸、脱碱基、2'-氨基、2'-烷基、吗啉代、氨基磷酸酯或含非天然碱基的核苷酸。

项11：根据项10所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含一个或多个2'-O-甲基核苷酸和一个或多个2'-氟代核苷酸。

项12：根据项11所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含以模式OMe-F-OMe-F或F-OMe-F-OMe的两个或更多个2'-O-甲基核苷酸和两个或更多个2'-

氟代核苷酸，

其中OMe表示2'-O-甲基核苷酸，并且其中F表示2'-氟代核苷酸。

项13：根据项11所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含多达10个各自为2'-O-甲基核苷酸的连续核苷酸或多达10个各自为2'-氟代核苷酸的连续核苷酸。

项14：根据项1-13中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含一个或多个硫代磷酸酯基团。

项15：根据项1-13中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA不包含硫代磷酸酯基团。

项16：根据项1-15中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含一个或多个磷酸三酯基团。

项17：根据项1-15中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA不包含磷酸三酯基团。

项18：根据项1-17中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA经由接头附接至一个或多个GalNAc衍生物。

项19：根据项18所述的dsRNA，其中所述dsRNA经由三价分支接头附接至三个GalNAc衍生物。

项20：根据项18或项19所述的dsRNA，其中所述一个或多个GalNAc衍生物中的至少一个附接至所述dsRNA的有义链的3'末端、反义链的3'末端或有义链的5'末端。

项21：根据项1、3和5-20中任一项所述的dsRNA，其中所述有义链和所述反义链中的一条或两条还包括包含一个或多个核苷酸的5'突出端。

项22：根据项1、3和5-21中任一项所述的dsRNA，其中所述有义链和所述反义链中的一条或两条还包括包含一个或多个核苷酸的3'突出端。

项23：根据项22所述的dsRNA，其中所述3'突出端包含两个核苷酸。

项24：根据项21-23中任一项所述的dsRNA，其中所述突出端包含一个或多个胸腺嘧啶。

项25：根据项1-24中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA抑制蛋白质原转换酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)基因的表达。

项26：根据项1所述的dsRNA，其中所述dsRNA的一条或两条链包含一种或多种具有式(I)的结构的化合物：

其中：

- B是杂环核碱基；

- Y是O、NH、NR1或N-C(＝O)-R1，其中R1是：

m是意指0或1的整数，

p是范围为0至10的整数，

K是O或S，

(C6-C14)芳基或(C5-C14)杂芳基，或者R3是细胞靶向部分，

- X1和X2各自独立地是氢原子、(C1-C6)烷基，并且

- Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地是H或(C1-C6)烷基，

或者是其药学上可接受的盐。

项27：根据项26所述的dsRNA，其包含一种或多种式(I)的化合物，其中Y是：

a)NR1，R1是未经取代的(C1-C20)烷基；

b)NR1，R1是未经取代的(C1-C16)烷基，其包括选自甲基、异丙基、丁基、辛基和十六烷基的烷基；

c)NR1，R1是(C3-C8)环烷基，其任选地被一个或多个选自卤原子和(C1-C6)烷基的基团取代；

d)NR1，R1是环己基；

e)NR1，R1是被(C6-C14)芳基取代的(C1-C20)烷基；

f)NR1，R1是被苯基取代的甲基；

g)N-C(＝O)-R1，R1是任选经取代的(C1-C20)烷基；或

h)N-C(＝O)-R1，R1是甲基或十五烷基。

项28：根据项26或27所述的dsRNA，其包含一种或多种式(I)的化合物，其中B选自嘧啶、经取代的嘧啶、嘌呤和经取代的嘌呤，或其药学上可接受的盐。

项29：根据项26至28中任一项所述的dsRNA，其中R3具有式(II)

其中A1、A2和A3是OH，

项30：根据项26至29中任一项所述的dsRNA，其中R3是N-乙酰基-半乳糖胺，或其药学上可接受的盐。

项31：根据项26至30中任一项所述的dsRNA，其包含一种或多种来自表A的核苷酸。

项32：根据项26至31中任一项所述的dsRNA，其包含2至10个式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。

项33：根据项32所述的dsRNA，其中所述2至10个式(I)的化合物在所述有义链上。

项34：根据项26至33所述的dsRNA，其中所述有义链在所述5'末端包含二至五个式(I)的化合物，和/或在所述3'末端包含一至三个式(I)的化合物。

项35：根据项26至34中任一项所述的dsRNA，其中

项36：根据项26至35中任一项所述的dsRNA，其包含一个或多个核苷间连接基团，所述核苷间连接基团独立地选自磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基-膦酸酯和氨基磷酸酯主链连接基团，或其药学上可接受的盐。

项37：根据项26至36中任一项所述的dsRNA，其选自表2-4中的dsRNA。

项38：根据项26至37中任一项所述的dsRNA，其中：

项39：根据项38所述的dsRNA，其中所述dsRNA的有义链和反义链分别包含以下的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO:578和589；[C027.001]

b)SEQ ID NO:620和631；[C027.003]

c)SEQ ID NO:585和591；[C027.001#40]

d)SEQ ID NO:587和591；[C027.001#58]

e)SEQ ID NO:621和634；[C027.003#03]

f)SEQ ID NO:622和632；[C027.003#06]

g)SEQ ID NO:622和635；和[C027.003#08]

h)SEQ ID NO:627和639。[C027.003#47]

项40：一种载体，其编码根据项1-39中任一项所述的dsRNA。

项41：一种分离的宿主细胞，其包含根据项1-39中任一项所述的dsRNA或根据项40所述的载体。

项42：一种试剂盒，其包含根据项1-39中任一项所述的dsRNA。

项43：一种组合物，其包含根据项1-39中任一项所述的dsRNA。

项44：根据项43所述的组合物，其还包含药学上可接受的载体。

项45：根据项43或项44所述的组合物，其还包含递送媒介物。

项46：根据项31所述的组合物，其中所述递送媒介物选自脂质体、脂质体复合物、复合物和纳米颗粒。

项47：一种抑制受试者的PCSK9基因表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据项1-39中任一项所述的dsRNA或根据项44所述的组合物。

项48：一种治疗或预防有需要的受试者的PCSK9介导的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据项1-39中任一项所述的dsRNA或根据项44所述的组合物。

项49：根据项48所述的方法，其中所述PCSK9介导的障碍是高胆固醇血症。

项50：根据项48-49中任一项所述的方法，其中所述PCSK9基因在所述受试者的肝脏中的表达被所述dsRNA抑制。

项51：根据项48-50中任一项所述的方法，其中所述施用是皮下施用、静脉内施用或肺部施用。

项52：根据项48-51中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

项53：根据项48-52中任一项所述的方法，其中所述施用导致所述受试者的血清胆固醇减少。

项54：根据项48-53中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用有效量的一种或多种用于治疗或预防PCSK9介导的疾病的另外的治疗剂。

尽管出于清楚理解的目的，已通过说明和实施例的方式详细地描述了前述公开文本，但所述描述和实施例不应当被解释为限制本公开文本的范围。

实施例

通过参考以下实施例将更全面地理解本公开文本。然而，它们不应被解读为限制本公开文本的范围。应理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且根据它们进行的各种修改或改变应为本领域技术人员知晓，并且应包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。

实施例1：用于抑制人PCSK9表达的siRNA的鉴定

方法

siRNA产生

使用固相寡核苷酸合成产生siRNA，包括阴性对照siRNA(“LV2阴性对照”和“LV2阴性对照2”)。阳性对照siRNA s48694购自Ambion。每种siRNA(包括核苷酸修饰)的序列示于上述表2中。

细胞和组织培养物

如下培养人Hep3B细胞和人C3A细胞。使人Hep3B细胞在37℃、5％CO₂和95％RH下生长，并且在补充有10％FBS的EMEM培养基(ATCC，目录号30-2003)中培育。人C3A细胞在37℃、5％CO₂和95％RH下生长，并且在补充有10％FBS的MEM培养基(ThermoFisher，目录号41090)中培育。

转染

对于敲低实验，在96孔板中使用20,000个细胞/孔的Hep3B细胞或C3A细胞。根据制造商的方案，在反向转染装置中使用0.2μl/孔的

RNAiMAX转染试剂(ThermoFisher)用所指示浓度的siRNA转染细胞，并且在不更换培养基的情况下孵育48h。通常，对每个测试样品进行N＝4次技术重复。为了测试siRNA相关毒性，如上所述转染15,000个Hep3B细胞或C3A细胞，并孵育72h。

mRNA表达分析

在siRNA转染后48小时，根据制造商的方案，包括程序中的DNA酶步骤，通过使用Promega的SV96总RNA分离系统(目录号Z3500)收获细胞RNA。

对于cDNA合成，使用来自ThermoFisher的逆转录酶试剂盒(目录号N8080234)。使用1.2μl 10xRT缓冲液、2.64μl MgCl₂(25mM)、2.4μl dNTP(10mM)、0.6μl随机六聚体(50μM)、0.6μl Oligo(dT)16(50μM)、0.24μl RNA酶抑制剂(20U/μl)和0.3μl Multiscribe(50U/μl)以12μl的总体积从30ng RNA进行cDNA合成。将样品在25℃下孵育10分钟，并且在42℃下孵育60分钟。通过加热至95℃保持5分钟停止反应。

通过qPCR使用来自ThermoFisher的TaqMan通用PCR主混合物(目录号4305719)和

基因表达测定Hs00545399_m1定量PCSK9 mRNA水平。在以下PCR条件下，用ABIPrism 7900以技术重复进行PCR：在50℃下2分钟，在95℃下10分钟，40次在95℃下15秒和在60℃下1分钟的循环。将PCR设置为单一(simplex)PCR，在一个反应中检测靶基因(PCSK9)并且在第二个反应中检测用于归一化的管家基因(RPL37A)。在1xPCR主混合物中用于PCR反应的最终体积是12.5μl，使用最终浓度为50nM的RPL37A引物和200nM的探针。应用ΔΔCt方法计算靶转录物的相对表达水平。基于LV2非沉默siRNA对照序列的水平，通过归一化计算PCSK9表达的百分比。

IC₅₀测量

使用10倍稀释步骤，用浓度范围为10nM-0.01pM的所指示的siRNA转染Hep3B细胞或C3A细胞。通过应用Biostat-Speed统计计算工具计算每种siRNA的半最大抑制浓度(IC₅₀)。根据Ratkovsky和Reedy(1986)使用4参数逻辑模型获得结果。在SAS v9.1.3软件中使用莱文贝格-马夸特(Levenberg-Marquardt)算法通过非线性回归获得调整。

ELISA测定

在用所指示浓度的siRNA转染后48小时通过R&D Systems的人PCSK9QuantikineELISA试剂盒(目录号DPC900)定量在25,000个C3A细胞的培养物的上清液中的PCSK9蛋白浓度。根据制造商的方案，使用50μl未稀释的细胞培养上清液进行ELISA测定。基于非沉默siRNA对照序列的平均水平通过归一化计算PCSK9表达的百分比。

细胞毒性

在转染15,000个Hep3B细胞或C3A细胞的培养物后72小时，通过确定每个样品中细胞活力/毒性的比率，测量每种siRNA的细胞毒性。根据制造商的方案，通过使用

(Promega，目录号G7570)测定确定细胞内ATP含量来测量细胞活力。根据制造商的方案，使用ToxiLight^TM测定(Lonza，目录号LT07-217)测量上清液中的细胞毒性。

结果

为了鉴定可用于靶向人PCSK9的siRNA，应用以下标准。首先，计算机鉴定来自如NM_174936.3(SEQ ID NO:1)中所示的人PCSK9 mRNA序列的19聚体，其中采用18个核苷酸的重叠。在第一轮过滤后，鉴定出715种潜在的目的siRNA。接下来，排除与已知SNP(经鉴定在高加索人群中出现率大于10％)重叠的所有19聚体，留下692种19聚体序列的池。然后将所有692种19聚体与食蟹猴(Macaca fascicularis)的PCSK9 mRNA序列比对，并且排除与食蟹猴PCSK9具有多于1个错配的所有序列，留下130种具有0个错配的siRNA序列和另外的267种具有1个错配的siRNA序列。

然后进行计算机分析以鉴定人转录组(RefSeq RNA版本2015-10-20)中的任何潜在的脱靶转录物。没有考虑在肝组织中RNAseq表达(Illumina Body Atlas)FPKM＜0.5的人脱靶序列。所有目的siRNA序列与除PCSK9之外的任何人转录物具有多于两个错配，或者与四个或更少的人基因具有两个错配；过滤掉不满足这两个标准之一的序列。过滤后，留下229种潜在的siRNA。进行最终过滤步骤以鉴定出具有小于30％GC含量的siRNA序列，并且鉴定出14种siRNA用于功能表征。所有14种这样的siRNA都识别人PCSK9的3'非翻译区(UTR)中的靶序列。

如上所述，用具有2'O-甲基和2'-氟代基团但不具有另外的修饰(如GalNAc配体或硫代磷酸酯)的核苷酸产生这14种siRNA。为了测试这14种siRNA降低PCSK9表达的能力，将人Hep3B细胞用0.1nM或1.0nM的每种siRNA转染并孵育48小时。孵育后，测量每个样品中PCSK9的mRNA表达，并且与阳性对照和阴性对照比较(图1)。这14种siRNA中的九种示出最有效的hPCSK9抑制，在1.0nM浓度下PCSK9 mRNA表达降低至少80％，并且在0.1nM浓度下PCSK9mRNA表达降低至少50％。

在人C3A细胞中进一步测试了这14种目的siRNA的活性，所述细胞的特征在于PCSK9表达水平比在Hep3B细胞中高(图2)。siRNA是在以下浓度下测试的：0.5nM、0.05nM和0.005nM。在此更严格的测定中，这14种siRNA中的五种示出对hPCSK9表达的最有效抑制(B001、B003、B006、B013和B014)。这些siRNA在0.5nM浓度下使PCSK9mRNA表达降低至少80％，并且在0.05nM浓度下使PCSK9 mRNA表达降低至少50％。

接下来，在用这14种目的siRNA转染后72小时，测量在Hep3B细胞和C3A细胞中的细胞毒性。出人意料的是，对于所测试的任何siRNA，在Hep3B细胞或C3A细胞中都没有显示明显的细胞毒性，即使是在以高达50nM的浓度使用时也是如此(图3A和图3B)。

总之，这些结果证实鉴定出了能够在多种人细胞系中有效抑制PCSK9表达而无显著细胞毒性的siRNA。

实施例2：用于抑制人PCSK9表达的另外的siRNA的表征

如上所述选择另外的siRNA序列，不同的是对具有30％-65％G+C含量的序列进行过滤。如实施例1中所述产生60种siRNA。这些siRNA识别在人PCSK9的整个5'UTR、3'UTR和开放阅读框(ORF)中分布的靶标。

为了测试这60种siRNA降低PCSK9表达的能力，将人Hep3B细胞用0.1nM或1.0nM的每种siRNA转染并孵育48小时。孵育后，测量每个样品中PCSK9的mRNA表达，并且与阳性对照和阴性对照比较(图4)。这60种siRNA中的五种示出对hPCSK9表达的有效抑制，在1.0nM浓度下使PCSK9 mRNA表达降低至少86％。

在人C3A细胞中进一步测试了60种siRNA中五种最有效的siRNA的活性(图5)。siRNA是在以下浓度下测试的：0.5nM、0.05nM和0.005nM。所测试的siRNA中的三种示出对hPCSK9表达的有效抑制，在0.5nM浓度下使PCSK9 mRNA表达降低至少75％。

接下来，在siRNA转染后72小时，测量在Hep3B细胞和C3A细胞中的细胞毒性(图6A和图6B)。一种siRNA(C060)在两种细胞系中均引起显著的细胞毒性，而另一种siRNA(C052)在C3A细胞中引起显著的细胞毒性。基于上述C3A细胞和Hep3B细胞中活性和细胞毒性数据的结果，选择10种siRNA用于IC₅₀测量(B001、B003、B006、B008、B010、B013、B014和C051)。这十种siRNA都具有类似的效力。如通过ELISA测定所测量，特别是在所测试的更高浓度下，进一步发现这十种siRNA减少C3A细胞中的hPCSK9蛋白(图7)。

这些实验的结果汇总在表A中。每种siRNA的含有其hPCSK9靶序列的部分示于表B中。

表A：siRNA的功能活性。

表B：siRNA序列信息。

与实施例1中描述的14种siRNA相比，这60种siRNA具有显著较低比例的有效敲低hPCSK9表达的siRNA(与来自实施例1的9/14相比，5/60在Hep3B细胞中有效)。不希望受理论的束缚，认为来自实施例1的siRNA可以展现出更高的功效，这归因于它们的更低G+C含量和/或靶向PCSK9的特定区域(例如，3'UTR)。总之，这些结果进一步说明了人PCSK9表达的有效siRNA敲低的不可预测性。此外，使用这60种siRNA序列获得的结果进一步强调了实施例1中描述的siRNA的功效和低水平的细胞毒性。

实施例3：PCSK9 siRNA分子的体外评价和体内评价

方法

siRNA产生

siRNA(包括阴性对照siRNA)是使用固相寡核苷酸合成产生的。

细胞和组织培养物

人C3A细胞在37℃、5％CO₂和95％RH下生长，并且在补充有10％FBS的MEM培养基(ThermoFisher，目录号41090)中培育。

人外周血单个核细胞(PBMC)从大约16mL来自三名健康供体的血液中分离，根据制造商的说明书，将所述血液收集在涂有肝素钠的真空采血管(BD，德国海德尔堡)中。

人原代肝细胞和食蟹猴原代肝细胞如下培养：将冷冻保存的细胞解冻，并使用铺板和解冻试剂盒(PTK-1，Primacyt)铺板，并在37℃、5％CO₂和95％RH下孵育。铺板6小时后，将培养基更换为补充有1％FBS的维持培养基(KLC-MM，KaLy-Cell)。

转染

对于在C3A细胞中的敲低实验，在96孔板中使用25,000个细胞/孔。根据制造商的方案，在反向转染装置中使用0.2μl/孔的

RNAiMAX转染试剂(ThermoFisher)用所指示浓度的siRNA转染细胞，并且在不更换培养基的情况下孵育48h。通常，对每个测试样品进行N＝4次技术重复。

对于人PBMC的转染，将100nM的siRNA在总体积为150μL的无血清RPMI培养基中用每96-孔(n＝2)0.3μL Lipofectamine 2000反向转染到1x10⁵ PBMC中，历时24小时。单链RNA(“R-0006”)和DNA(“CpG ODN”)寡核苷酸以及双链未修饰的siRNA和2'-O-甲基修饰的siRNA(“132/161”)用作对照。

mRNA表达分析

在siRNA转染后48小时或在自由siRNA摄取后72小时，根据制造商的方案，包括程序中的DNA酶步骤，通过使用Promega的SV96总RNA分离系统(目录号Z3500)收获细胞RNA。

通过qPCR使用ThermoFisher TaqMan通用PCR主混合物(目录号4305719)和

基因表达测定Hs00545399_m1和Mf03418189_m1(分别用于人样品和食蟹猴样品)定量PCSK9 mRNA水平。在以下PCR条件下，用ABI Prism 7900以技术重复进行PCR：在50℃下2分钟，在95℃下10分钟，40次在95℃下15秒和在60℃下1分钟的循环。将PCR设置为单一(simplex)PCR，在一个反应中检测靶基因(PCSK9)并且在第二个反应中检测用于归一化的管家基因(RPL37A)。在1xPCR主混合物中用于PCR反应的最终体积是12.5μl，使用最终浓度为50nM的RPL37A引物和200nM的探针。应用ΔΔCt方法计算靶转录物的相对表达水平。基于LV2非沉默siRNA对照序列的水平，通过归一化计算PCSK9表达的百分比。

IC₅₀测量

使用8倍稀释步骤，用浓度范围为25nM-0.1pM的所指示的siRNA转染C3A细胞。通过应用Biostat-Speed统计计算工具计算每种siRNA的半最大抑制浓度(IC₅₀)。根据Ratkovsky和Reedy(1986)使用4参数逻辑模型获得结果。在SAS v9.1.3软件中使用莱文贝格-马夸特(Levenberg-Marquardt)算法通过非线性回归获得调整。

对于人原代肝细胞和食蟹猴原代肝细胞中的IC₅₀测量，使用5倍稀释步骤，在自由摄取条件下，用浓度范围为10μM-0.005nM的siRNA，将96孔板中的70,000个细胞孵育72小时。

ELISA测定

在用所指示浓度的siRNA转染后48小时通过R&D Systems的人PCSK9 QuantikineELISA试剂盒(目录号DPC900)定量在C3A细胞的上清液中的PCSK9蛋白浓度。根据制造商的方案，使用50μl未稀释的细胞培养上清液进行ELISA测定。基于非沉默siRNA对照序列的平均水平通过归一化计算PCSK9表达的百分比。

如下定量PBMC上清液中的IFNα蛋白浓度：应用基于MesoScale Discovery的技术的自建电化学发光测定并使用泛IFNα单克隆捕获抗体(MT1/3/5，Mabtech)，使用25μL的细胞培养上清液测量IFNα浓度。

细胞毒性

在自由摄取条件下与50,000个人原代肝细胞一起孵育72小时后，通过确定每个样品中细胞活力/毒性的比率来测量每种siRNA的细胞毒性。根据制造商的方案，通过使用

核酸酶稳定性

测试siRNA在50％小鼠血清中的核酸酶稳定性。为此目的，将160μL小鼠血清(Sigma，目录号M5905)在37℃下孵育0、8、24、32、48、56和72小时。在每个时间点，取出21μL反应物并且在65℃下用23μL终止溶液(对于3,000μL终止溶液：1123μL组织与细胞裂解溶液(Tissue&Cell Lysis Solution)(Epicentre，目录号MTC096H)、183μL20mg/mL蛋白酶K(Sigma，目录号P2308)、1694μL水)淬灭30分钟。在Waters 2695分离模块和2487双吸光度检测器上进行HPLC分析之前，将33μL无RNA酶的水添加到每个样品中。使用DNApac PA200分析柱(Thermo Scientific，目录号063000)和以下梯度通过HPLC分析50μL的溶液：

时间(min)	流速(mL/min)	缓冲液A％*	缓冲液B％**
				0	1	75	25
20	1	35	65

*缓冲液A：20mM磷酸钠(Sigma，目录号342483)，pH 11；

**缓冲液B：20mM磷酸钠(Sigma，目录号342483)、1M溴化钠(Sigma，目录号02119)，pH 11。

小鼠模型

以下实验中使用的雌性小鼠携带编码全长人PCSK9的转基因，并敲除对应的小鼠PCSK9。转基因模型(品系“hTg-mKO系#2”)经由Univalor Inc从IRCM(Institut deRecherches Cliniques do Montréal)获得授权。

体内测量

使用相同的R&D Systems的人PCSK9 Quantikine ELISA试剂盒(目录号DPC900)在1:40的预稀释下测定用siRNA处理的小鼠中的血清PCSK9水平。对于给药前值，计算相对PCSK9血清水平。

用COBAS INTEGRA仪器和Roche的LDLC3测定或Horiba的ABX Pentra LDL直接CP测定来测定用PCSK9 siRNA处理的转基因小鼠中的血清总胆固醇水平和LDL胆固醇水平。

使用标准临床化学测定用COBAS INTEGRA仪器测定血清AST、ALT和BUN水平。

结果

体外缀合并表征如表A和表B中所示的10个PCSK9 siRNA序列。使用人C3A细胞对siRNA进行IC₅₀测量(表C)。用所指示的siRNA转染的人C3A细胞中的IC₅₀值在9.7pM-125.0pM范围内。

表C：10种siRNA在人C3A细胞中的IC₅₀活性

siRNA：	IC<sub>50</sub>(pM)：	I<sub>max</sub>％：
			C032.001	114.0	79.6
C032.004	76.3	86.1
			C032.005	23.7	88.4
C032.006	70.9	87.4
			C032.007	-	84.6
C032.008	88.1	83.2
			C032.009	125.0	86.3
C032.010	9.7	86.7
			C032.011	15.4	89.6
C032.012	12.7	90.3

通过定量用三种不同浓度(25nM、0.39nM和0.0061nM)的siRNA转染的C3A细胞的上清液中的PCSK9水平来证实PCSK9蛋白敲低(图8)。

还使用至原代细胞中的自由摄取来测量每种siRNA的IC₅₀。用siRNA处理食蟹猴原代肝细胞，并且计算每种siRNA的IC₅₀(表D)。IC₅₀值在94.2nM-486.0nM范围内。siRNA序列C032.004和C032.005(与食蟹猴PCSK9没有错配)示出良好的剂量依赖性敲低活性，而序列C032.012(与猕猴物种有一个错配)则示出较低程度的剂量依赖性敲低活性。

表D：自由摄取条件下10种siRNA在食蟹猴原代肝细胞中的IC₅₀活性

siRNA：	IC<sub>50</sub>(nM)：	I<sub>max</sub>％：	注：
				C032.001	n.a.	n.a.	1MM cyno
C032.004	94.2	55.8	0MM cyno
				C032.005	117.0	66.7	0MM cyno
C032.006	n.a.	n.a.	1MM cyno
				C032.007	n.a.	n.a.	1MM cyno
C032.008	n.a.	n.a.	1MM cyno
				C032.009	n.a.	n.a.	1MM cyno
C032.010	n.a.	n.a.	1MM cyno
				C032.011	n.a.	n.a.	1MM cyno
C032.012	486.0	30.9	1MM cyno

n.a.＝无活性

MM＝错配

将人原代肝细胞也用siRNA处理，并且计算每种siRNA在此人原代细胞类型中的IC₅₀(表E)。IC₅₀值在9.4nM-189.0nM范围内。在自由摄取条件下，还检查siRNA在此人原代细胞类型中的细胞毒性(图9)。对于任何测试的siRNA，没有观察到剂量依赖性细胞毒性效应。

表E：自由摄取条件下10种siRNA在人原代肝细胞中的IC₅₀活性

siRNA：	IC<sub>50</sub>(nM)：	I<sub>max</sub>％：
			C032.001	36.3	70.9
C032.004	14.6	56.7
			C032.005	16.7	64.4
C032.006	17.2	61.4
			C032.007	27.7	72.6
C032.008	9.4	54.1
			C032.009	189.0	35.4
C032.010	34.7	50.6
			C032.011	17.6	61.6
C032.012	11.7	72.3

通过检查从三名不同的健康供体分离的人原代PMBC响应于siRNA的转染而分泌的干扰素α的产生(图10)，测量siRNA在人原代细胞中的免疫反应。对于任何测试的siRNA，都没有观察到人PBMC中的免疫刺激迹象。

还测试了10种PCSK9 siRNA在50％鼠血清中的体外核酸酶稳定性，并且确定相对稳定性和半衰期(图11)。尽管所有siRNA都是至少24小时稳定的，但化合物C032.005被鉴定为最稳定的，它在最晚的测量时间点(72小时)很少或没有降解。

来自体外分析的结果的汇总示于图12中。接下来，与非沉默对照siRNA相比，检查单次皮下注射10mg/kg的10种缀合siRNA对血清PCSK9蛋白水平(图13A)以及血清总胆固醇水平(图13B)的体内影响。体内功效实验中使用的小鼠携带编码全长人PCSK9的转基因，并敲除了对应的小鼠PCSK9。siRNA C032.005、C032.007和C032.012在PCSK9减少方面具有几乎相同的模式，在第3天与第7天之间的最大PCSK9敲低为大约49％-52％，在第17天与第21天之间回到基线。siRNA C032.006对PCSK9水平具有最大活性，在第10天最大敲低为65％，在第52天回到基线水平。使用siRNA C032.005和C032.012获得总胆固醇水平的最高降低，最大降低分别为19％和22％。有趣的是，对于siRNA C032.006，没有观察到对胆固醇水平的重大影响，尽管它对PCSK9水平具有最大影响。

在人PCSK9转基因小鼠中相同的体内研究的第3天(图13C)和第10天(图13D)，测量血清样品中的急性毒理学参数。用任何测试的化合物都没有检测到明显的肝毒性(如由AST水平和ALT水平所确定)或肾毒性(如由BUN水平所确定)。总之，PCSK9 siRNA C032.012的良好体外概况也转化成相关转基因小鼠模型中的体内情况。此外，siRNA C032.005在PCSK9和总胆固醇抑制方面展现出良好的体内概况。两种另外的siRNA(C032.006和C032.007)在体内被鉴定为具有有效的PCSK9抑制，但是有趣的是，这两种siRNA对降低胆固醇水平都没有重大影响。

实施例4：另外的测试PCSK9 siRNA分子的体外评价

方法

除非另有指示，否则所有实验都如上述实施例中所述进行。

结果

使用较松散的脱靶过滤标准并且允许siRNA长度的更大变化(19聚体、21聚体和23聚体)设计靶向PCSK9的另一组siRNA，并合成这些另外的siRNA。接下来，使用0.1nM和1nMsiRNA转染测试它们在人Hep3B细胞(图14A)和人C3A细胞(图14B)中敲低PCSK9 mRNA表达的能力。还在这两种人细胞类型中在5nM和50nM浓度下测试转染的siRNA的相对细胞毒性(图15)。当用siRNA C209.021处理时，在两种人细胞类型中都观察到了毒性作用。使用人Hep3B细胞(表F)和人C3A细胞(表G)，对于15个最具活性且无毒的序列计算siRNA的IC₅₀值。人Hep3B细胞中的IC₅₀值在3.3pM-45.2pM范围内，而人C3A细胞中的IC₅₀值在14.1pM-102.0pM范围内。使用siRNA C209.016在两种细胞类型中获得最佳最大敲低。

表F：另外的PCSK9 siRNA在Hep3B细胞中的IC₅₀活性

表G：另外的PCSK9 siRNA在C3A细胞中的IC₅₀活性

siRNA：	IC<sub>50</sub>(pM)：	I<sub>max</sub>％：
			C217.001	102.0	94.4
C217.011	50.7	93.4
			C217.013	31.0	92.0
C217.014	17.4	93.4
			C218.003	40.8	92.2
C218.005	46.7	95.7
			C218.006	49.7	90.3
C218.008	51.4	91.9
			C218.012	33.2	94.4
C219.001	33.8	88.9
			C219.003	86.3	95.3
C219.004	66.1	93.5
			C219.006	73.4	93.1
C219.007	65.4	94.2
			C209.016	14.1	96.8
S48694(Ambion)	41.5	91.4

最后，进行比较以理解在Hep3B细胞中计算的IC₅₀值与在C3A细胞中计算的IC₅₀值之间的相关性(图16A)，以及在这两种细胞类型中的I_max值之间的相关性(图16B)。

总之，此实施例提供的数据表明，两种另外的PCSK9 siRNA序列(C209.016和C218.012)在所有应用的体外测定中都具有良好的活性概况。与C032.012相比，C218.012代表核苷酸延伸序列。

实施例5：GalNAc缀合的PCSK9 siRNA序列的前导优化

方法

除非另有指示，否则所有实验都如上述实施例中所述进行。GalNAc-siRNA(包括包含上述核苷酸类似物的那些)基于如WO 2019/170731中所述的所指示序列(见上述序列表)产生。

结果

基于来自实施例3和实施例4的结果，选择了三个亲本PCSK9 siRNA序列(siRNA IDB014/C032.012/C217.014、B006/C032.006/C217.001和C209.016/C217.007)，并且每个分子在相应siRNA有义链的5'末端合成有三个连续的GalNAc缀合的核苷酸类似物(siRNA IDC027.001、C027.002和C027.003；上表4)。然后将siRNA ID C027.001、C027.002和C027.003的亲本序列用于优化活动，所述优化活动对于每个siRNA序列包括66种不同的化学修饰。所得序列和修饰模式示于上表4中。

在冷冻保存的人原代肝细胞中，在自由摄取条件下，使用10nM、100nM和1000nM浓度的PCSK9 GalNAc-siRNA测试这些优化文库的体外活性。如图17中所绘，与亲本序列C027.002相比，基于亲本序列C027.001和C027.003的优化文库被鉴定为展现出更高的总体体外活性。值得注意的是，鉴定出强烈削弱分子的siRNA活性的许多修饰模式，特别是对于亲本序列C027.002而言。在另一个方面，鉴定出导致与相应亲本分子相比改善的敲低活性的大量序列修饰。

为了评价优化的PCSK9 GalNAc-siRNA的改善的稳定性特征，测定优化文库在50％小鼠血清中的体外半衰期。如表H中所证实，鉴定出与相应亲本分子相比具有改善的核酸酶稳定性的大量修饰，这对于亲本siRNA ID C027.001的优化文库是最明显的。

表H：优化的PCSK9 GalNAc-siRNA构建体在50％小鼠血清中的核酸酶稳定性

在体内活性测试之前，基于siRNA活性、稳定性以及化学考虑，对siRNA IDC027.001、C027.002和C027.003的三个不同亲本序列中的每一个选择14种siRNA修饰。在人PBMC测定中使用作为读数的分泌到上清液的IFNα2a测量免疫刺激潜力(图18)。对于任何测试的PCSK9 GalNAc-siRNA，都没有观察到人PBMC中的免疫刺激迹象。

接下来，将基于三个不同亲本序列的198种优化PCSK9 GalNAc-siRNA中的总共42种用于人PCSK9转基因小鼠中的体内药理学测试，并与相应的亲本分子C027.001、C027.002和C027.003进行比较(图19A-图19C)。当与用PBS媒介物对照处理的动物相比时，在以单一6mg/kg剂量皮下施用选择的化合物后，对于三个相应的优化文库，在第7天与第14天之间实现86％(C027.001#58)、62％(C027.002#19)和82％(C027.003#08)的最大靶PCSK9蛋白敲低(KD_max)。对于分别展现出32％和31％的KD_max值并在给药后3周回到基线的亲本序列文库C027.001和C027.003，体内活性的增加是最显著的。有趣的是，亲本序列文库C027.002(KD_max＝52％)的效力增加不太明显。这也反映在KD₅₀水平(50％最大敲低)方面，对于文库C027.002的最佳分子(C027.002#19)，在约第20天达到KD₅₀。而对于分子C027.001#40和C027.003#08，文库C027.001和C027.003分别在约第26天和约第30天达到KD₅₀。在此研究中，在PCSK9水平(KD_max和KD₅₀)方面鉴定为具有总体最佳体内药理学概况的分子是C027.001#40、C027.001#58、C027.003#03、C027.003#06、C027.003#08和C027.003#47。

在同一研究中，在siRNA给药后第14天和第28天测量血清LDL胆固醇(LDL-c)(图19D和图19E)。此分析证实鉴定出与相应亲本序列相比具有改善的体内药理学概况的大量优化分子。siRNA ID C027.003#06在给药后第14天达到32％的最大LDL-c降低。

实施例中使用的所选siRNA的汇总示于下表I中。

表I：实施例中使用的siRNA。

Claims

1.一种双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链，其中所述第一序列与所述第二序列互补，其中所述第一序列包含选自SEQID NO:6-11和310-321的序列，其中所述dsRNA任选地是小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)，并且其中所述dsRNA任选地抑制蛋白质原转换酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)基因的表达。

2.根据权利要求1所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含：

3.一种双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链，其中仅所述第一序列与所述第二序列互补，其中所述第一序列是SEQ IDNO:3、4和13中的一个，其中所述dsRNA任选地是小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)，并且其中所述dsRNA任选地抑制蛋白质原转换酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)基因的表达。

4.根据权利要求3所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含：

5.根据权利要求1-4中任一项所述的dsRNA，其中所述第一序列和所述第二序列各自的长度为小于或等于30个核苷酸，并且任选地其中所述第一序列和所述第二序列各自的长度为至少19个且小于或等于23个核苷酸。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含一种或多种经修饰的核苷酸；

其中所述一种或多种经修饰的核苷酸中的至少一种任选地是2'-O-甲基核苷酸、5'-硫代磷酸酯核苷酸或连接至胆固醇衍生物或亲脂性部分的末端核苷酸；

其中所述一种或多种经修饰的核苷酸中的至少一种任选地是2'-氟代、2'-脱氧、2'-O-甲氧基乙基、约束乙基(cEt)、脱氧、反向脱氧、反向双脱氧、锁核酸、脱碱基、2'-氨基、2'-烷基、吗啉代、氨基磷酸酯或含非天然碱基的核苷酸；

其中所述dsRNA任选地包含一个或多个2'-O-甲基核苷酸和一个或多个2'-氟代核苷酸；

其中所述dsRNA任选地包含以模式OMe-F-OMe-F或F-OMe-F-OMe的两个或更多个2'-O-甲基核苷酸和两个或更多个2'-氟代核苷酸，

其中OMe表示2'-O-甲基核苷酸，并且其中F表示2'-氟代核苷酸；并且

其中所述dsRNA任选地包含多达10个各自为2'-O-甲基核苷酸的连续核苷酸或多达10个各自为2'-氟代核苷酸的连续核苷酸。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的dsRNA，其中：

(a)所述dsRNA包含一个或多个硫代磷酸酯基团，或者

(b)所述dsRNA不包含硫代磷酸酯基团。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的dsRNA，其中：

(a)所述dsRNA包含一个或多个磷酸三酯基团，或者

(b)所述dsRNA不包含磷酸三酯基团。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA经由接头附接至一个或多个GalNAc衍生物；其中任选地所述dsRNA经由三价分支接头附接至三个GalNAc衍生物；并且其中任选地所述一个或多个GalNAc衍生物中的至少一个附接至所述dsRNA的有义链的3'末端、反义链的3'末端或有义链的5'末端。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的dsRNA，其中所述有义链和所述反义链中的一条或两条还包括：

(a)包含一个或多个核苷酸的5'突出端，其中所述5'突出端任选地包含一个或多个胸腺嘧啶；和/或

(b)包含一个或多个核苷酸的3'突出端，其中所述3'突出端任选地包含两个核苷酸，并且其中所述3'突出端任选地包含一个或多个胸腺嘧啶。

11.根据权利要求1所述的dsRNA，其中所述dsRNA的一条或两条链包含一种或多种具有式(I)的结构的化合物：

其中：

-B是杂环核碱基；

-L1和L2中的一个是将所述式(I)的化合物连接至多核苷酸的核苷间连接基团，并且L1和L2中的另一个是H、保护基团、磷部分或将所述式(I)的化合物连接至多核苷酸的核苷间连接基团，

-Y是O、NH、NR1或N-C(＝O)-R1，其中R1是：

(C1-C20)烷基，其任选地被一个或多个选自卤原子、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基、(C5-C14)杂芳基、-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1、-CN、-C(＝J)-O-Z1、-O-C(＝J)-Z1、-C(＝J)-N(Z1)(Z2)和-N(Z1)-C(＝J)-Z2的基团取代，其中

J是O或S，

(C3-C8)环烷基，其任选地被一个或多个选自卤原子和(C1-C6)烷基的基团取代，

基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，其中

m是意指0或1的整数，

p是范围为0至10的整数，

R2是(C1-C20)亚烷基，其任选地被(C1-C6)烷基、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(＝K)-O-Z3、-O-C(＝K)-Z3、-C(＝K)-N(Z3)(Z4)或-N(Z3)-C(＝K)-Z4取代，其中

K是O或S，

R3选自氢原子、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C3-C8)环烷基、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基或(C5-C14)杂芳基，或者R3是细胞靶向部分，

-X1和X2各自独立地是氢原子、(C1-C6)烷基，并且

-Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地是H或(C1-C6)烷基，

或者是其药学上可接受的盐。

12.根据权利要求11所述的dsRNA，其包含一种或多种式(I)的化合物，其中Y是：

a)NR1，R1是未经取代的(C1-C20)烷基；

d)NR1，R1是环己基；

e)NR1，R1是被(C6-C14)芳基取代的(C1-C20)烷基；

f)NR1，R1是被苯基取代的甲基；

g)N-C(＝O)-R1，R1是任选经取代的(C1-C20)烷基；或

h)N-C(＝O)-R1，R1是甲基或十五烷基。

13.根据权利要求11或12所述的dsRNA，其包含一种或多种式(I)的化合物，其中B选自嘧啶、经取代的嘧啶、嘌呤和经取代的嘌呤，或其药学上可接受的盐。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的dsRNA，其中R3具有式(II)

其中A1、A2和A3是OH，

15.根据权利要求11至14中任一项所述的dsRNA，其中R3是N-乙酰基-半乳糖胺，或其药学上可接受的盐。

16.根据权利要求11至15中任一项所述的dsRNA，其包含一种或多种来自表A的核苷酸。

17.根据权利要求11至16中任一项所述的dsRNA，其包含2至10个式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。

18.根据权利要求17所述的dsRNA，其中所述2至10个式(I)的化合物在所述有义链上。

19.根据权利要求11至18中任一项所述的dsRNA，其中所述有义链在所述5'末端包含二至五个式(I)的化合物，和/或在所述3'末端包含一至三个式(I)的化合物。

20.根据权利要求11至19中任一项所述的dsRNA，其中

21.根据权利要求1至20中任一项所述的dsRNA，其包含一个或多个核苷间连接基团，所述核苷间连接基团独立地选自磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基-膦酸酯和氨基磷酸酯主链连接基团，或其药学上可接受的盐。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的dsRNA，其选自表2-4中的dsRNA。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的dsRNA，其中：

24.根据权利要求23所述的dsRNA，其中所述dsRNA的有义链和反义链分别包含以下的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO:578和589；[C027.001]

b)SEQ ID NO:620和631；[C027.003]

c)SEQ ID NO:585和591；[C027.001#40]

d)SEQ ID NO:587和591；[C027.001#58]

e)SEQ ID NO:621和634；[C027.003#03]

f)SEQ ID NO:622和632；[C027.003#06]

g)SEQ ID NO:622和635；[C027.003#08]和

h)SEQ ID NO:627和639；[C027.003#47]。

25.一种载体，其编码根据权利要求1-24中任一项所述的dsRNA。

26.一种分离的宿主细胞，其包含根据权利要求1-24中任一项所述的dsRNA或根据权利要求25所述的载体。

27.一种组合物，其包含根据权利要求1-24中任一项所述的dsRNA，其中任选地所述组合物还包含药学上可接受的载体，其中任选地所述组合物还包含递送媒介物，并且其中任选地所述递送媒介物选自脂质体、脂质体复合物、复合物和纳米颗粒。

28.根据权利要求1-24中任一项所述的dsRNA或根据权利要求27所述的组合物，其用于抑制受试者的PCSK9基因表达的方法中，其中任选地所述PCSK9基因在所述受试者的肝脏中的表达被所述dsRNA抑制，并且其中任选地所述受试者是人。

29.根据权利要求1-24中任一项所述的dsRNA或根据权利要求27所述的组合物，其用于治疗或预防有需要的受试者的PCSK9介导的疾病的方法中，其中任选地所述PCSK9介导的障碍是高胆固醇血症，其中任选地所述PCSK9基因在所述受试者的肝脏中的表达被所述dsRNA抑制，并且其中任选地所述受试者是人。