JP2010503382A - 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いたプロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害 - Google Patents

低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いたプロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害 Download PDF

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Abstract

本発明は、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子発現及び／又は活性の調節に応答する形質、疾病及び症状の研究、診断及び治療のための化合物、組成物及び方法に関する。本発明は、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子発現経路に関与する遺伝子の発現及び／又は活性の調節に応答する形質、疾病及び症状又はこのような形質、疾病及び症状の維持若しくは発達を媒介するその他の細胞プロセスに関連する化合物、組成物及び方法にも関する。具体的には、本発明は、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子発現に対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができる、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子（このような小核酸分子のカクテル及びこのような小核酸分子の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調合物を含む。）などの小核酸分子を含む二本鎖核酸分子に関する。本発明は、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡなどの小核酸分子にも関し、及び内因性ＲＮＡ又はかかる内因性ＲＮＡと結合したタンパク質（例えば、ＲＩＳＣ）の調節機能を妨害することによって遺伝子発現を調節するために、内因性ＲＮＡ分子（内因性ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（例えば、ｍｉＲＮＡ阻害剤）又は内因性低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（例えば、ｓｉＲＮＡ阻害剤）など）の機能を阻害し得るその他の小核酸分子又はＲＩＣＳの機能を阻害し得る（例えば、ＲＩＳＣ阻害剤）その他の小核酸分子（このような小核酸分子のカクテル及びこのような小核酸分子の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調合物を含む。）に関する。かかる小核酸分子は、例えば、高脂血症、高コレステロール血症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病（例えばＩ型及び／又はＩＩ型糖尿尿）、インシュリン抵抗性、肥満及び／又は対象若しくは生物中の遺伝子発現若しくは活性に関連した他の病状、症状若しくは形質などの（但し、これらに限定されない。）代謝性疾患、形質及び症状を予防、阻害又は抑制する組成物を提供する上で有用である。

Description

本願は、２００６年３月６日に出願された一部継続出願第１１／３６９，１０８号である２００６年７月１７日に出願された米国特許出願第１１／４８７，７８８号の一部継続出願である。本願はまた、２００３年７月１４日に出願された仮出願第６０／４８７，２１４号の利益を主張する２００４年７月１４日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／２２６５８号の一部継続出願である２００４年８月２０日に出願された米国特許出願第１０／９２３，５３６号の一部継続出願である２００５年４月４日に出願された米国特許出願第１１／０９８，３０３号の一部継続出願である２００５年８月１７日に出願された米国特許出願第１１／２０５，６４６号の一部継続出願である２００５年９月２３日に出願された米国特許出願第１１／２３４，７３０号の一部継続出願である２００５年１２月８日に出願された米国特許出願第１１／２９９，２５４号の一部継続出願である。本願はまた、２００３年２月２０日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５３４６号の一部継続出願及び２００３年２月２０日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８号（そのどちらも、２００２年２月２０日に出願された米国仮出願第６０／３５８，５８０号、２００２年３月１１日に出願された米国仮出願第６０／３６３，１２４号、２００２年６月６日に出願された米国仮出願第６０／３８６，７８２号、２００２年８月２９日に出願された米国仮出願第６０／４０６，７８４号、２００２年９月５日に出願された米国仮出願第６０／４０８，３７８号、２００２年９月９日に出願された米国仮出願第６０／４０９，２９３号、及び２００３年１月１５日に出願された米国仮出願第６０／４４０，１２９号の利益を主張する。）の一部継続出願である、２００３年５月２３日に出願された米国特許出願第１０／４４４，８５３号の一部継続出願である、２００３年１０月２３日に出願された米国特許出願第１０／６９３，０５９号の一部継続出願である、２００３年１１月２４日に出願された米国特許出願第１０／７２０，４４８号の一部継続出願である、２００４年１月１４日に出願された米国特許出願第１０／７５７，８０３号の一部継続出願である、２００４年４月１６日に出願された米国特許出願第１０／８２６，９６６号の一部継続出願である、２００４年５月２４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１６３９０号の一部継続出願である。本願はまた、２００１年５月１８日に出願された米国仮出願第６０／２９２，２１７号、２００２年３月６日に出願された米国仮出願第６０／３６２，０１６号、２００１年７月２０日に出願された米国仮出願第６０／３０６，８８３号及び２００１年８月１３日に出願された米国仮出願第６０／３１１，８６５号の利益を主張する、２００２年５月１７日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１５８７６号の一部継続出願である、２００３年４月３０日に出願された米国特許出願第１０／４２７，１６０号の一部継続出願である、２００４年２月１３日に出願された米国特許出願第１０／７８０，４４７号の一部継続出願である、２００４年４月３０日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／１３４５６号の一部継続出願である。本願はまた、２００３年１２月３日に出願された米国特許出願第１０／７２７，７８０号の一部継続出願である。本願はまた、２００４年２月１０日に出願された米国仮出願第６０／５４３，４８０号の利益を主張する、２００５年２月９日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０５／０４２７０号の一部継続出願である。本願はまた、２００５年２月１４日に出願された米国仮特許出願第６０／６５２，７８７号、２００５年５月６日に出願された米国仮特許出願第６０／６７８，５３１号、２００５年７月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／７０３，９４６号及び２００５年１１月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／７３７，０２４号の利益を主張する、２００６年２月１４日に出願された米国特許出願第１１／３５３，６３０号の一部継続出願である。本願は、図面を含めて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、列記されている全出願の利益を主張するものである。
本発明は、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子発現及び／又は活性の調節に応答した形質、疾患及び症状の研究、診断及び治療のための化合物、組成物及び方法に関する。本発明は、かかる形質、疾患及び症状の持続又は発生を媒介するプロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子発現経路又は他の細胞プロセスに関与する遺伝子の発現及び／又は活性の調節に応答する形質、疾患及び症状に関係した化合物、組成物及び方法も対象とする。具体的には、本発明は、小核酸分子のカクテル及び小核酸分子の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調合物を含めて、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子発現に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る又は媒介する、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子などの小核酸分子を含めた、核酸分子に関する。本発明は、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡなどの小核酸分子にも関し、内因性ＲＮＡ又は内因性ＲＮＡと結合したタンパク質（例えば、ＲＩＳＣ）の調節機能を妨害することによってＰＣＳＫ９遺伝子発現を調節するために、内因性ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の機能を阻害し得る小核酸分子（例えば、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、内因性低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の機能を阻害し得る小核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ阻害剤）などの内因性ＲＮＡ分子の機能を阻害し得る小核酸分子、ＲＩＳＣの機能を阻害し得る小核酸分子（例えば、ＲＩＳＣ阻害剤）にも関し、かかる小核酸分子のカクテル及びかかる小核酸分子の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調合物にも関する。本発明は、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡなどの小核酸分子にも関し、並びに内因性ＲＮＡ又はかかる内因性ＲＮＡと結合したタンパク質（例えば、ＲＩＳＣ）の調節機能を妨害することによってＰＣＳＫ９遺伝子発現を調節するために、内因性ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（例えば、ｍｉＲＮＡ阻害剤）若しくは内因性低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（例えば、ｓｉＲＮＡ阻害剤）などの内因性ＲＮＡ分子の機能を阻害し得るその他の小核酸分子又はＲＩＣＳの機能を阻害し得るその他の小核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ阻害剤）（かかる小核酸分子のカクテル及びかかる小核酸分子の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を含む。）に関する。かかる小核酸分子は、例えば、高脂血症、高コレステロール血症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病（例えばＩ型及び／又はＩＩ型糖尿尿）、インシュリン抵抗性、肥満及び／又は対象若しくは生物中のＰＣＳＫ９遺伝子発現若しくは活性に関連した他の病状、症状若しくは形質などの（但し、これらに限定されない。）代謝性疾患、形質及び症状を予防、阻害又は抑制する組成物を提供する上で有用である。
以下は、ＲＮＡｉに関係する関連技術の考察である。この考察は、以下の本発明の理解のためにのみ提供される。要旨は、下記研究が本発明の従来技術であることを認めるものではない。
ＲＮＡ干渉とは、動物において低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す（Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３； Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６； Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９５０−９５１； Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，４０２，１２８−１２９； Ｓｈａｒｐ，１９９９，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，１３：１３９−１４１及びＳｔｒａｕｓｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，８８６）。植物における対応するプロセス（Ｈｅｉｆｅｔｚ他、国際公開第９９／６１６３１号）は、転写後遺伝子サイレンシング又はＲＮＡサイレンシングと一般に称され、真菌ではクエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）とも称される。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を防止するのに使用される、進化的に保存された細胞防御機構であると考えられ、多様な叢及び門によって一般に共有されている（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１５，３５８）。外来遺伝子発現からのかかる保護は、相同な一本鎖ＲＮＡ又はウイルスのゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介して、ウイルス感染に由来する、又は宿主ゲノム中へのトランスポゾンエレメントの無作為な組み込みに由来する、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に応じて進化してきた可能性があると考えられる。細胞中にｄｓＲＮＡが存在すると、まだ十分に解明されていない機序を通じてＲＮＡｉ応答を誘発する。この機序は、リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断をもたらす、ｄｓＲＮＡによって媒介されるプロテインキナーゼＰＫＲ及び２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素の活性化に起因するインターフェロン応答など、二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼを含む他の公知の機序とは異なると考えられる（例えば、米国特許第６，１０７，０９４号；同５，８９８，０３１号； Ｃｌｅｍｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ＆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．，１７，５０３−５２４； Ａｄａｈ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．，８，１１８９参照）。
細胞中に長鎖ｄｓＲＮＡが存在すると、ダイサーと称するリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される（Ｂａｓｓ，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２３５； Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３； Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３）。ダイサーは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡ小片へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与する（Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３； Ｂａｓｓ，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２３５； Ｂｅｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３）。ダイサー活性に由来する低分子干渉ＲＮＡは、典型的には約２１から約２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対の二本鎖を含む（Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３； Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８）。ダイサーは、構造の保存された前駆体ＲＮＡからの、翻訳調節に関係する２１及び２２ヌクレオチドのｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切り出しにも関係する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４）。ＲＮＡｉ応答は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般に称する、エンドヌクレアーゼ複合体も特徴とする。ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的である領域の中央で起こる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８）。
ＲＮＡｉは種々の系で研究されている。Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６は、線虫においてＲＮＡｉを観察した最初であった。Ｂａｈｒａｍｉａｎ ａｎｄ Ｚａｒｂｌ，１９９９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９，２７４−２８３及びＷｉａｎｎｙ ａｎｄ Ｇｏｅｔｚ，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２，７０は、ほ乳動物系においてｄｓＲＮＡによって媒介されるＲＮＡｉを記述している。Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３は、ｄｓＲＮＡが移入されたショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡｉを記述している。Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４及びＴｕｓｃｈｌ他、国際公開第０１／７５１６４号は、ヒト胚性腎臓及びＨｅＬａ細胞を含めた培養ほ乳動物細胞において、合成２１ヌクレオチドＲＮＡ二本鎖の導入によって誘導されるＲＮＡｉを記述している。ショウジョウバエ胚溶解物における最近の研究（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０，６８７７及びＴｕｓｃｈｌ他、国際公開第０１／７５１６４号）によって、効率的ＲＮＡｉ活性を媒介するのに必要である、ｓｉＲＮＡの長さ、構造、化学組成及び配列に対する一定の要件が明らかになった。これらの研究によれば、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二本鎖は、３’末端ジヌクレオチドオーバーハングを含むときに最も活性である。また、一方又は両方のｓｉＲＮＡ鎖を２’−デオキシ（２’−Ｈ）又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで完全に置換すると、ＲＮＡｉ活性が消失するのに対して、２’−デオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）による３’末端ｓｉＲＮＡオーバーハングヌクレオチドの置換は許容されることが判明した。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中央における単一のミスマッチ配列も、ＲＮＡｉ活性を消失させることが判明した。また、これらの研究は、標的ＲＮＡ中の切断部位の位置が、ｓｉＲＮＡガイド配列の３’末端ではなくガイド配列の５’末端によって規定されることも示している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０，６８７７）。他の研究によれば、ｓｉＲＮＡ二本鎖の標的相補鎖上の５’リン酸がｓｉＲＮＡ活性に必要であり、ＡＴＰを利用してｓｉＲＮＡ上の５’リン酸部分が維持される（Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９）。
幾つかの研究によれば、２ヌクレオチド３’オーバーハングを有する２１量体ｓｉＲＮＡ二本鎖の３’末端ヌクレオチドオーバーハングセグメントをデオキシリボヌクレオチドで置換しても、ＲＮＡｉ活性に有害作用を及ぼさない。ｓｉＲＮＡ各末端のヌクレオチドを４個までデオキシリボヌクレオチドで置換することは十分許容されると報告されているが、デオキシリボヌクレオチドで完全に置換するとＲＮＡｉ活性が失われる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０，６８７７及びＴｕｓｃｈｌ他、国際公開第０１／７５１６４号）。また、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（前掲）は、ｓｉＲＮＡを２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換するとＲＮＡｉ活性が完全に消失することも報告している。Ｌｉ他、国際公開第００／４４９１４号及びＢｅａｃｈ他、国際公開第０１／６８８３６号は、ｓｉＲＮＡが、窒素又は硫黄ヘテロ原子の少なくとも１個を含むようにするリン酸−糖骨格又はヌクレオシドの修飾を含み得ることを示唆している。しかし、どちらの出願も、かかる修飾がｓｉＲＮＡ分子においてどの程度許容されるかを仮定しておらず、かかる修飾ｓｉＲＮＡの更なるガイダンスや例も提供していない。Ｋｒｅｕｔｚｅｒ他、カナダ特許出願第２，３５９，１８０号も、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼＰＫＲの活性化に対抗するために、ｄｓＲＮＡコンストラクトにおいて使用されるある種の化学修飾、具体的には２’−アミノ又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、及び２’−Ｏ又は４’−Ｃメチレン架橋を含むヌクレオチドを記載している。しかし、Ｋｒｅｕｔｚｅｒ他も、同様に、これらの修飾がｄｓＲＮＡ分子においてどの程度許容されるかに関する例又はガイダンスを提供していない。
Ｐａｒｒｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６，１０７７−１０８７は、線虫において、長鎖（＞２５ｎｔ）ｓｉＲＮＡ転写物を用いて、ｕｎｃ−２２遺伝子を標的としたある種の化学修飾を試験した。Ｐａｒｒｉｓｈ等は、Ｔ７及びＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを用いてチオリン酸ヌクレオチド類似体を組み入れることによって、これらのｓｉＲＮＡ転写物にチオリン酸残基を導入することを記述しており、２個のホスホロチオアート修飾塩基を有するＲＮＡのＲＮＡｉとしての有効性がかなり低下したことを認めた。また、Ｐａｒｒｉｓｈ等によれば、２個を超える残基のホスホロチオアート修飾によって、ＲＮＡがインビトロで著しく不安定化し、干渉活性を評価することができなかった（同書、１０８１）。Ｐａｒｒｉｓｈ等は、長鎖ｓｉＲＮＡ転写物においてヌクレオチド糖の２’位におけるある種の修飾も試験し、リボヌクレオチドをデオキシヌクレオチドで置換すると、特にウリジンからチミジンへの置換、及び／又はシチジンからデオキシシチジンへの置換の場合には、干渉活性がかなり低下することを見出した（同書）。また、Ｐａｒｒｉｓｈ等は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖における、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル及び３−（アミノアリル）ウラシルによるウラシルの置換、及びイノシンによるグアノシンの置換を含めて、ある種の塩基修飾を試験した。４−チオウラシル及び５−ブロモウラシル置換は許容されると考えられたが、Ｐａｒｒｉｓｈは、イノシンを一方の鎖に組み入れると干渉活性がかなり低下することを報告した。Ｐａｒｒｉｓｈは、５−ヨードウラシル及び３−（アミノアリル）ウラシルをアンチセンス鎖に組み入れても、ＲＮＡｉ活性がかなり低下することも報告した。
より長鎖のｄｓＲＮＡの使用が記述された。例えば、Ｂｅａｃｈ他、国際公開第０１／６８８３６号は、内因的に誘導されたｄｓＲＮＡを用いて遺伝子発現を減ずる特別な方法を記述している。Ｔｕｓｃｈｌ他、国際公開第０１／７５１６４号は、ショウジョウバエインビトロＲＮＡｉ系、並びにある種の機能的ゲノム用途及びある種の治療用途への特定のｓｉＲＮＡ分子の使用を記述している。ただし、Ｔｕｓｃｈｌ，２００１，Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２，２３９−２４５は、インターフェロン応答を活性化するおそれがあるために、ＲＮＡｉを使用して、遺伝病又はウイルス感染を治療し得ることに疑念を抱いている。Ｌｉ他、国際公開第００／４４９１４号は、ある標的遺伝子の発現を減じるための特定の長鎖の（１４１ｂｐ−４８８ｂｐ）、酵素的に合成された、又はベクターによって発現されたｄｓＲＮＡの使用を記載している。Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ他、国際公開第０１／３６６４６号は、ある種の長鎖の（５５０ｂｐ−７１４ｂｐ）、酵素的に合成された、又はベクターによって発現されたｄｓＲＮＡ分子を用いて、ほ乳動物細胞における特定の遺伝子の発現を阻害するある種の方法を記載している。Ｆｉｒｅ他、国際公開第９９／３２６１９号は、線形動物における遺伝子発現の阻害に用いられる細胞にある種の長鎖ｄｓＲＮＡ分子を導入する特別な方法を記載している。Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ他、国際公開第００／０１８４６号は、特定の長鎖ｄｓＲＮＡ分子を用いて、細胞において特別な表現型を与える原因になる特殊な遺伝子を特定するある種の方法を記載している。Ｍｅｌｌｏ他、国際公開第０１／２９０５８号は、ｄｓＲＮＡによって媒介されるＲＮＡｉに関与する特殊な遺伝子の特定について記載している。Ｐａｃｈｕｃｋ他、国際公開第００／６３３６４号は、ある種の長鎖（少なくとも２００ヌクレオチド）ｄｓＲＮＡコンストラクトを記載している。Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ他、国際公開第９９／０７４０９号は、ある種の抗ウイルス剤と組み合わせた特別なｄｓＲＮＡ分子からなる特定の組成物を記載している。Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ他、国際公開第９９／５３０５０号及び１９９８，ＰＮＡＳ，９５，１３９５９−１３９６４は、ある種のｄｓＲＮＡを用いて、植物細胞における核酸の形質発現を減少させる、ある種の方法を記載している。Ｄｒｉｓｃｏｌｌ他、国際公開第０１／４９８４４号は、標的生物体における遺伝子サイレンシングの促進に用いられる特定のＤＮＡ発現コンストラクトを記載している。
他の研究者も、種々のＲＮＡｉ系及び遺伝子サイレンシング系について報告している。例えば、Ｐａｒｒｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６，１０７７−１０８７は、線虫のｕｎｃ−２２遺伝子を標的とした、特定の化学修飾ｄｓＲＮＡコンストラクトを記載している。Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ、国際公開第０１／３８５５１号は、ある種のｄｓＲＮＡを用いて、植物におけるポリコーム遺伝子発現を調節するある種の方法を記載している。Ｃｈｕｒｉｋｏｖ他、国際公開第０１／４２４４３号は、ある種のｄｓＲＮＡを用いて、生物体の遺伝的特性を改変するある種の方法を記載している。Ｃｏｇｏｎｉ他、国際公開第０１／５３４７５号は、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）サイレンシング遺伝子を単離するある種の方法、及びその使用を記載している。Ｒｅｅｄ他、国際公開第０１／６８８３６号は、植物におけるある種の遺伝子サイレンシング方法を記載している。Ｈｏｎｅｒ他、国際公開第０１／７０９４４号は、トランスジェニック線形動物をパーキンソン病モデルとして用い、ある種のｄｓＲＮＡを用いた、ある種の薬物スクリーニング方法を記載している。Ｄｅａｋ他、国際公開第０１／７２７７４号は、ショウジョウバエにおいてＲＮＡｉに関係し得る、ショウジョウバエ由来のある種の遺伝子産物を記載している。Ａｒｎｄｔ他、国際公開第０１／９２５１３号は、ＲＮＡｉを増強する因子を用いることによって遺伝子抑制を媒介するある種の方法を記載している。Ｔｕｓｃｈｌ他、国際公開第０２／４４３２１号は、ある種の合成ｓｉＲＮＡコンストラクトを記載している。Ｐａｃｈｕｋ他、国際公開第００／６３３６４号、及びＳａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ他、国際公開第０１／０４３１３号は、ベクターによって発現されたある種の（２５０ｂｐを超える）長鎖ｄｓＲＮＡｓを用いて、ある種のポリヌクレオチド配列の機能を阻害するある種の方法及び組成物を記載している。Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉ他、国際公開第０２／３８８０５号は、ＲＮＡｉによって特定されたある種の線虫遺伝子を記載している。Ｋｒｅｕｔｚｅｒ他、国際公開第０２／０５５６９２号、同０２／０５５６９３号及び欧州特許第１１４４６２３号Ｂ１は、ｄｓＲＮＡを用いて遺伝子発現を阻害するある種の方法を記載している。Ｇｒａｈａｍ他、国際公開第９９／４９０２９号及び同０１／７０９４９号並びにオーストラリア特許第４０３７５０１号は、ベクターによって発現されたある種のｓｉＲＮＡ分子を記載している。Ｆｉｒｅ他、米国特許第６，５０６，５５９号は、ＲＮＡｉを媒介するある種の長鎖ｄｓＲＮＡ（２９９ｂｐ−１０３３ｂｐ）コンストラクトを用いて、遺伝子発現をインビトロで阻害するある種の方法を記載している。Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ，１１０，５６３−５７４は、Ｈｅｌａ細胞においてＲＮＡ干渉を媒介するある種の５’リン酸化一本鎖ｓｉＲＮＡを含めた、ある種の一本鎖ｓｉＲＮＡコンストラクトを記載している。Ｈａｒｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，８３−１０５は、化学的及び構造的に修飾されたある種のｓｉＲＮＡ分子を記載している。Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｒａｎａ，２００３，ＲＮＡ，９，１０３４−１０４８は、化学的及び構造的に修飾されたある種のｓｉＲＮＡ分子を記載している。Ｗｏｏｌｆ他、国際公開第０３／０６４６２６号及び同０３／０６４６２５号は、ある種の化学修飾ｓＲＮＡコンストラクトを記載している。Ｈｏｒｎｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１，２６３−２７０は、形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ７を介した低分子干渉ＲＮＡによる、ＩＦＮアルファの配列特異的な強力な誘導を記載している。Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ： ２０ Ｍａｒｃｈ ２００５は、合成ｓｉＲＮＡによる、ほ乳動物の自然免疫応答の配列依存的刺激を記載している。Ｙｕｋｉ他、国際公開第０５／０４９８２１号及び同０４／０４８５６６号は、低分子干渉ＲＮＡ配列、及び最適化された活性を有するある種の低分子干渉ＲＮＡ配列を設計するある種の方法を記載している。Ｓａｉｇｏ他、米国特許出願公開第２００４０５３９３３２号は、ＲＮＡ干渉を実現する、低分子干渉ＲＮＡ配列を含めた、オリゴ又はポリヌクレオチド配列を設計するある種の方法を記載している。Ｔｅｉ他、国際公開第０３／０４４１８８号は、標的遺伝子の少なくとも部分ヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ及びＲＮＡを含む二本鎖ポリヌクレオチドを、細胞、組織又は個々の生物体に移入することを含む、標的遺伝子の発現を阻害するある種の方法を記載している。
Ｍａｔｔｉｃｋ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２７−１５２８； Ｃｌａｖｅｒｉｅ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２９−１５３０； Ｓｅｔｈｕｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，２００６，ＲＮＡ，１２，１９２−１９７及びＣｚｅｃｈ，２００６ ＮＥＪＭ，３５４，１１： １１９４−１１９５； Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ他、米国特許出願公開第２００５０２２７２５６号及びＴｕｓｃｈｌ他、米国特許出願公開第２００５０１８２００５号はすべて、ｍｉＲＮＡ機能を立体的遮断によって阻害し得るアンチセンス分子を記載しており、参照によりその全体を本明細書に組み込む。
Ｌａｌａｎｎｅ他、２００５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６，１３１２−１３１９は、ＰＣＳＫ９を標的とするある種のｓｉＲＮＡ分子を記載している。
国際公開第９９／６１６３１号 米国特許第６，１０７，０９４号 米国特許第５，８９８，０３１号 国際公開第０１／７５１６４号 国際公開第００／４４９１４号 国際公開第０１／６８８３６号 カナダ特許出願第２，３５９，１８０号 国際公開第０１／３６６４６号 国際公開第９９／３２６１９号 国際公開第００／０１８４６号 国際公開第０１／２９０５８号 国際公開第００／６３３６４号 国際公開第９９／０７４０９号 国際公開第９９／５３０５０号 国際公開第０１／４９８４４号 国際公開第０１／３８５５１号 国際公開第０１／４２４４３号 国際公開第０１／５３４７５号 国際公開第０１／７０９４４号 国際公開第０１／７２７７４号 国際公開第０１／９２５１３号 国際公開第０２／４４３２１号 国際公開第０１／０４３１３号 国際公開第０２／３８８０５号 国際公開第０２／０５５６９２号 国際公開第０２／０５５６９３号 欧州特許第１１４４６２３号Ｂ１ 国際公開第９９／４９０２９号 国際公開第０１／７０９４９号 オーストラリア特許第４０３７５０１号 米国特許第６，５０６，５５９号 国際公開第０３／０６４６２６号 国際公開第０３／０６４６２５号 国際公開第０５／０４９８２１号 国際公開第０４／０４８５６６号 米国特許出願公開第２００４０５３９３３２号 国際公開第０３／０４４１８８号 米国特許出願公開第２００５０２２７２５６号 米国特許出願公開第２００５０１８２００５号
Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３ Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６ Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９５０−９５１ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，４０２，１２８−１２９ Ｓｈａｒｐ，１９９９，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，１３：１３９−１４１ Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，８８６ Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１５，３５８ Ｃｌｅｍｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ＆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．，１７，５０３−５２４ Ａｄａｈ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．，８，１１８９ Ｂａｓｓ，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２３５ Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３ Ｂｅｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３ Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８ Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４ Ｂａｈｒａｍｉａｎ ａｎｄ Ｚａｒｂｌ，１９９９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９，２７４−２８３ Ｗｉａｎｎｙ ａｎｄ Ｇｏｅｔｚ，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２，７０ Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４ Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０，６８７７ Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９ Ｐａｒｒｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６，１０７７−１０８７ Ｔｕｓｃｈｌ，２００１，Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２，２３９−２４５ Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ他、１９９８，ＰＮＡＳ，９５，１３９５９−１３９６４ Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ，１１０，５６３−５７４ Ｈａｒｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，８３−１０５ Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｒａｎａ，２００３，ＲＮＡ，９，１０３４−１０４８ Ｈｏｒｎｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１，２６３−２７０ Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ： ２０ Ｍａｒｃｈ ２００５ Ｍａｔｔｉｃｋ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２７−１５２８ Ｃｌａｖｅｒｉｅ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２９−１５３０ Ｓｅｔｈｕｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，２００６，ＲＮＡ，１２，１９２−１９７ Ｃｚｅｃｈ，２００６ ＮＥＪＭ，３５４，１１： １１９４−１１９５ Ｌａｌａｎｎｅ他、２００５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６，１３１２−１３１９
本発明は、高脂血症、高コレステロール血症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病（例えばＩ型及び／又はＩＩ型糖尿尿）、インシュリン抵抗性、肥満及び／又はＰＣＳＫ９遺伝子発現又は活性に関連した他のあらゆる疾患、形質及び症状を含む（但し、これらに限定されない。）代謝性疾患形質及び症状の発症又は維持に関連するＰＣＳＫ９遺伝子などのプロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を調整するのに有用な化合物、組成物及び方法に関する。本発明は、ＰＣＳＫ９遺伝子発現の経路及び／又は活性に関与する他の遺伝子の発現及び活性を、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって、小核酸分子を用いて調節するのに有用である化合物、組成物及び方法にも関する。特に、本発明は、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子などの小核酸分子を特徴とし、ＰＣＳＫ９遺伝子発現の経路及び／又は活性に関与する、ＰＣＳＫ９遺伝子及び／又は他の遺伝子の発現を調節するのに使用する方法を特徴とする。
本発明は、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及び内因性ＲＮＡ又は内因性ＲＮＡと結合したタンパク質（例えば、ＲＩＳＣ）の調節機能を妨害することによってＰＣＳＫ９遺伝子発現を調節するために、内因性ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（例えば、ｍｉＲＮＡ阻害剤）若しくは内因性低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（例えば、ｓｉＲＮＡ阻害剤）などの内因性ＲＮＡ分子の機能を阻害することができる他の核酸小分子又はＲＩＣＳの機能を阻害することができる他の小核酸分子（例えば、ＲＩＳＣ阻害剤）に関する。かかる分子を本明細書ではＲＮＡｉ阻害剤と総称する。
本発明のｓｉＮＡ又はＲＮＡｉ阻害剤は、無修飾でも、又は化学修飾されていてもよい。本発明のｓｉＮＡ又はＲＮＡｉ阻害剤は、化学合成することができ、ベクターから発現させることができ、又は酵素的に合成することができる。本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって、細胞における標的遺伝子発現又は活性を調節することができる種々の化学修飾合成低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子も特徴とする。本発明は、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はＲＩＳＣと相互作用し、したがって細胞又は生物体におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、翻訳阻害又は転写サイレンシングを下方制御又は阻害することによって、細胞におけるＲＮＡｉ活性を調節することができる、化学修飾された種々の合成低分子核酸（ｓｉＮＡ）分子も特徴とする。化学修飾ｓｉＮＡ及び／又はＲＮＡｉ阻害剤を使用すると、インビボでのヌクレアーゼ分解に対する抵抗性が増大することによって、及び／又は細胞内取り込みが改善されることによって、未変性ｓｉＮＡ分子及び／又はＲＮＡｉ阻害剤の種々の性質が改善される。また、初期に発表された研究に反して、完全に修飾されたｓｉＮＡを含めて、複数の化学修飾を有する本発明のｓｉＮＡ分子は、そのＲＮＡｉ活性を保持する。したがって、出願人は、未変性ｓｉＲＮＡの活性を保持する、又は更に改善する、（本明細書ではｓｉＮＡと総称する）化学的に修飾されたｓｉＲＮＡを本明細書で教示する。本発明のｓｉＮＡ分子は、種々の治療、予防、獣医学、診断、標的確認（ｔａｒｇｅｔ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）、ゲノム発見、遺伝子工学及び薬理ゲノミクスの各適用分野に有用である試薬及び方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、１つ又はそれ以上のｓｉＮＡ分子及び／又はＲＮＡｉ阻害剤並びに表Ｉに示されているＧｅｎＢａｎｋ受付番号及びＵＳＳＮ１０／９２３，５３６号及びＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８号（何れも、参照により本明細書に組み込まれる。）によって参照される配列を含む遺伝子コード配列などの、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（ＰＣＳＫ９）をコードする遺伝子及び／又はＰＣＳＫ９経路遺伝子（本明細書において、一般に「ＰＣＳＫ９」と称される。）の発現を独立に又は組み合わせて調節する方法に関する。本明細書において一般にＰＣＳＫ９と称されるが、神経アポトーシス制御転換酵素１又はＮＡＲＣ−１としても知られる例示的なプロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子を参照しながら、本発明の種々の態様及び実施形態を以下に記述する。本発明は、かかる形質、疾患及び症状の持続又は発生を媒介するプロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（ＰＣＳＫ９）遺伝子発現経路又は他の細胞プロセスに関与する遺伝子の発現及び／又は活性の調節に応答する形質、疾患及び症状に関係した化合物、組成物及び方法も対象とする。しかしながら、かかる参照は、単なる例示にすぎず、本発明の種々の態様及び実施形態は、変異体ＰＣＳＫ９遺伝子、ＰＣＳＫ９遺伝子のスプライスバリアント、種から種への又は対象から対象へのＰＣＳＫ９バリアント並びにＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８号及びＵＳＳＮ１０／９２３，５３６号（何れも、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているある種の遺伝子を含む他のＰＣＳＫ９経路遺伝子などの別のＰＣＳＫ９遺伝子を発現する他の遺伝子も対象とする。かかる追加の遺伝子の標的部位は、本明細書の例示的なＰＣＳＫ９標的遺伝子及び配列に対する本明細書に記載の方法を用いて分析することができる。したがって、他の遺伝子の調節、及び他の遺伝子のかかる調節の効果は、本明細書に記載したとおりに実施し、決定し、及び測定することができる。換言すれば、以下に定義し、記載した実施形態に列挙する「ＰＣＳＫ９」という用語は、ＰＣＳＫ９ポリペプチドをコードする遺伝子、ＰＣＳＫ９調節ポリヌクレオチド（例えば、ＰＣＳＫ９ｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ）、変異体ＰＣＳＫ９遺伝子、及びＰＣＳＫ９遺伝子のスプライスバリアント、並びに遺伝子発現及び／又は活性のＰＣＳＫ９経路に関与する他の遺伝子など、本明細書の疾患、形質及び症状の発生及び／又は持続に関連する遺伝子を包含するものとする。したがって、「ＰＣＳＫ９」という用語が本明細書で定義されるように、「ＰＣＳＫ９」という用語に関連して本明細書に記載した実施形態の各々は、「標的」という用語によって網羅されるタンパク質、ペプチド、ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド分子の全部に適用可能である。包括的に、かかる遺伝子標的を本明細書では一般に「標的」配列とも称する。
一実施形態において、本発明は、ＰＣＳＫ９ＲＮＡ又はＤＮＡの異なる領域（例えば、本明細書に記載のものなどの２つの異なる標的部位、又はＰＣＳＫ９標的若しくはＰＣＳＫ９経路標的の任意の組合せ）、コード標的と非コード標的の両方などの異なるポリヌクレオチド標的を標的とした、本発明の２種類以上の異なるｓｉＮＡ分子及び／又はＲＮＡｉ阻害剤（例えば、ｓｉＮＡ、二本鎖形成性（ｄｕｐｌｅｘ ｆｏｒｍｉｎｇ）ｓｉＮＡ若しくは多官能ｓｉＮＡ又はその任意の組合せ）を含む組成物を特徴とする。ｓｉＮＡ分子のかかるプールは、治療効果を増大し得る。
一実施形態において、本発明は、ＰＣＳＫ９ＲＮＡ又はＤＮＡの異なる領域（例えば、本明細書の２つの異なる標的部位、又はＰＣＳＫ９標的若しくはＰＣＳＫ９経路標的の任意の組合せ）、コード標的と非コード標的の両方などの異なるポリヌクレオチド標的に対して特異性を有する、本発明の２種類以上の異なるｓｉＮＡ分子（例えば、ｓｉＮＡ、二本鎖形成性（ｆｏｍｉｎｇ）ｓｉＮＡ若しくは多官能ｓｉＮＡ又はその任意の組合せ）のプールを特徴とする。ここで、プールは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の異なるＰＣＳＫ９標的を標的にするｓｉＮＡ分子を含む。
異なる生物体間、又は異なる対象間でＰＣＳＫ９ゲノムの配列が変わり得るために、広範な治療用途向けのｓｉＮＡ分子を選択するには、ＰＣＳＫ９遺伝子の保存領域を含む必要があると考えられる。一実施形態において、本発明は、ＰＣＳＫ９ゲノムの保存領域を、又は異なるＰＣＳＫ９標的間で保存された領域を標的にするｓｉＮＡ分子及び／又はＲＮＡｉ阻害剤に関する。種々のＰＣＳＫ９標的の保存領域を標的にするように設計されたｓｉＮＡ分子及び／又はＲＮＡｉ阻害剤は、多様な患者集団において、ＰＣＳＫ９標的遺伝子発現を効率的に阻害することができる。
一実施形態において、本発明は、二本鎖の一方が標的核酸分子又はその一部における所定のヌクレオチド配列に対して相補性を有するヌクレオチド配列を含む、ｓｉＮＡ分子などの二本鎖核酸分子を特徴とする。一実施形態において、所定のヌクレオチド配列は、本明細書に記載のヌクレオチド標的配列であり得る。別の実施形態において所定のヌクレオチド配列は、当分野で公知の標的配列又は経路標的配列である。
一実施形態において、本発明は、標的遺伝子の発現を下方制御する、又は標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記ｓｉＮＡ分子は、約１５から約２８個の塩基対を含む。例えば、一実施形態において、本発明は、標的遺伝子の発現を下方制御する又は標的ＲＮＡの切断を誘導する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、前記ｓｉＮＡ分子は約１８から約２８の塩基対を含む。
一実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡの切断を誘導する二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記ｓｉＮＡ分子は、約１５から約２８個の塩基対を含む。
一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による標的ＲＮＡの切断を誘導する二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子は第１の鎖と第２の鎖を含み、ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８から約２８（例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８）ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の第１の鎖は、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって標的ＲＮＡの切断を誘導するのに十分な相補性を標的ＲＮＡに対して有するヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は、第１の鎖に相補的であるヌクレオチド配列を含む。特定の一実施形態において例えば、ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８から約２７ヌクレオチド長である。
一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による標的ＲＮＡの切断を誘導する二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子は第１の鎖と第２の鎖を含み、ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８から約２３（例えば、約１８、１９、２０、２１、２２又は２３）ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の第１の鎖は、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって標的ＲＮＡの切断を誘導するのに十分な相補性を標的ＲＮＡに対して有するヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は、第１の鎖に相補的であるヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による標的ＲＮＡの切断を誘導する、化学合成された二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８から約２８ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の１本の鎖は、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって標的ＲＮＡの切断を誘導するのに十分な相補性を標的ＲＮＡに対して有するヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による標的ＲＮＡの切断を誘導する、化学合成された二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８から約２３ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の１本の鎖は、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって標的ＲＮＡの切断を誘導するのに十分な相補性を標的ＲＮＡに対して有するヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本発明は、標的遺伝子の発現を下方制御する、又は標的ＲＮＡの切断を誘導する、ｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、例えば、標的遺伝子又はＲＮＡはタンパク質コード配列を含む。一実施形態において、本発明は、標的遺伝子の発現を下方制御する、又は標的ＲＮＡの切断を誘導する、ｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、例えば、標的遺伝子又はＲＮＡは、標的遺伝子発現に関与する非コード配列又は調節エレメント（例えば、非コードＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）を含む。
本発明の別の実施形態において、ｄｓＲＮＡの鎖は１００塩基（又は塩基対）又はそれ以下である。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡの鎖は、７０塩基長未満である。これらの実施形態に関して、ｄｓＲＮＡ鎖の各々は５から７０、１０から６５、２０から６０、３０から５５、４０から５０塩基又は塩基対の長さであり得る。ある種の態様において、鎖の各々は１５から３０塩基対の長さであるが、別の態様において、鎖の各々は１９から２３塩基対の長さである。３０塩基対に等しい又は３０塩基対より少ない相補的領域を有するｄｓＲＮＡ、例えば、鎖の各々が３０塩基若しくは３０塩基より少ない長さであるもの又はステム若しくは相補的部分が若しくは３０塩基対より少ない若しくは３０塩基対に等しい一本鎖ヘアピンＲＮＡは、哺乳動物の細胞の抗ウイルス応答を回避することができるので特に好ましい。従って、ヘアピンｄｓＲＮＡ（一つの鎖）は、３０塩基対又はそれより少ない相補的領域を有する７０又はそれより少ない塩基長であり得る。
ヘアピン干渉ＲＮＡ：ヘアピン干渉ＲＮＡは、ステムループ又はヘアピン構造中に干渉ＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含む単一分子（例えば、単一オリゴヌクレオチド鎖）である（例えば、ｓｈＲＮＡ）。例えば、ｓｈＲＮＡは、その中において、センス干渉ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドが、短いスペーサーによって、逆方向相補的アンチセンス干渉ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドに連結されているＤＮＡベクターから発現され得る。選択された発現ベクターに対して必要とされれば、制限部位を形成する３’末端Ｔ及びヌクレオチドが付加され得る。得られたＲＮＡ転写物は、それ自体の上に折り畳んで、ステムループ構造を形成する。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、疾病又は症状（例えば、高コレステロール血症、高脂血症及び心血管疾患）と関連するＰＣＳＫ９ハプロタイプ多型から生じるＰＣＳＫ９タンパク質の発現を下方制御し又は阻害するために使用される。ＰＣＳＫ９遺伝子又はＰＣＳＫ９タンパク質又はＲＮＡレベルの分析は、このような多型を有する対象又は本明細書に記載されている形質、症状若しくは疾病を発症するリスクを有する対象を同定するために使用することができる。これらの対象は、治療、例えば、本発明のＲＮＡｉコンストラクト及びＰＣＳＫ９遺伝子発現に関連する疾病を治療する上で有用な他のあらゆる組成物での治療に適している。従って、ＰＣＳＫ９タンパク質又はＲＮＡレベルの分析は、対象を治療する際の治療の種類及び治療の期間を決定するために使用することができる。ＰＣＳＫ９タンパク質又はＲＮＡレベルのモニタリングは、治療結果を予測するために、並びに形質、症状又は疾病に関連するある種のＰＣＳＫ９タンパク質のレベル及び／又は活性を調節する化合物及び組成物の効力を決定するために使用することができる。
さらに、上に及び本願中の他の箇所に詳述されている本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡの一部に、生理的条件下でハイブリッド形成する。このような組成物の投与は、コレステロールの発現を弱め、対象の標的ｍＲＮＡを調節する。
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡは、標的遺伝子又は標的遺伝子ファミリー（例えば、異なるＰＣＳＫ９遺伝子）の発現を阻害するために使用される。ここで、遺伝子又は遺伝子ファミリーの配列は、配列相同性を共有する。かかる相同配列は、例えば配列アラインメントによって、当分野で公知のとおりに特定することができる。ｓｉＮＡ分子は、例えば、完全な相補配列を用いて、又は追加の標的配列を与え得る非標準塩基対、例えばミスマッチ及び／又はゆらぎ塩基対を導入することによって、かかる相同配列を標的とするように設計することができる。ミスマッチが特定された場合には、非標準塩基対（例えば、ミスマッチ及び／又はゆらぎ塩基）を用いて、１個を超える遺伝子配列を標的にするｓｉＮＡ分子を作製することができる。非限定的例において、ＵＵ、ＣＣ塩基対などの非標準塩基対を用いて、配列相同性を共有する異なるポリヌクレオチド標的の配列を標的にすることができるｓｉＮＡ分子を作製する。したがって、本発明のｓｉＮＡを使用する一利点は、相同遺伝子間で保存されたヌクレオチド配列に相補的である核酸配列を含むように単一のｓｉＮＡを設計できることである。この手法においては、異なる遺伝子を標的にするために１個を超えるｓｉＮＡ分子を用いる代わりに、単一のｓｉＮＡを用いて１個を超える遺伝子の発現を阻害することができる。
一実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡ（例えば、コード又は非コードＲＮＡ）に対するＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は、表Ｉ、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８、米国仮出願第６０／３６３，１２４号及び／又はＵＳＳＮ１０／９２３，５３６に示されたＧｅｎＢａｎｋ受付番号を有する配列などの任意のＲＮＡ配列に相補的である配列を含む。別の実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は、変種コード配列を有する、例えば、本明細書に記載の、又は当分野で公知の疾患、形質、障害及び／又は症状の持続及び／又は発生に関連することが当分野で知られている他の変異遺伝子を有するＲＮＡに相補的である配列を含む。表ＩＩＩ及びＩＶに示されている化学修飾又は本明細書に記載されているその他の化学修飾は、本発明の任意のｓｉＮＡコンストラクトに適用することができる。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＰＣＳＫ９遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用し、それによってＰＣＳＫ９遺伝子発現のサイレンシングを媒介し得るヌクレオチド配列を含む。ここで、例えば、ｓｉＮＡは、クロマチン構造又はＰＣＳＫ９遺伝子のメチル化パターンを調節して、ＰＣＳＫ９遺伝子の転写を防止する細胞プロセスによって、ＰＣＳＫ９遺伝子発現の調節を媒介する。
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子を用いて、対象又は生物体において形質、疾患又は症状に関連するハプロタイプ多型から生じるタンパク質の発現を下方制御又は阻害する。遺伝子又はタンパク質若しくはＲＮＡレベルを分析することによって、かかる多型を有する対象、又は本明細書に記載の形質、症状若しくは疾患を発生するリスクのある対象を特定することができる。これらの対象は、治療、例えば、本発明のｓｉＮＡ分子、及び標的遺伝子発現に関係する疾患の治療に有用である任意の他の組成物を用いた治療に適している。したがって、タンパク質又はＲＮＡレベルを分析することによって、対象を治療する治療タイプ及び療法のコースを決定することができる。タンパク質又はＲＮＡレベルを監視することによって、治療の成果を予測し、また、形質、障害、症状又は疾患に関連したある種のタンパク質のレベル及び／又は活性を調節する化合物及び組成物の効力を求めることができる。
本発明の一実施形態においてｓｉＮＡ分子は、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。ｓｉＮＡは、センス鎖を更に含み、前記センス鎖は、標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部を含む。
別の実施形態においてｓｉＮＡ分子は、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を含む。ｓｉＮＡ分子は、センス領域を更に含み、前記センス領域は、標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部を含む。
別の実施形態において、本発明は、ヌクレオチド配列を含むｓｉＮＡ分子、例えば、標的遺伝子のヌクレオチド配列又は配列の一部に相補的である、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域中のヌクレオチド配列を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、領域、例えば、標的遺伝子配列又はその一部を含む配列に相補的である、ｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス領域を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のセンス領域又はセンス鎖は、標的ポリヌクレオチド配列に相補的である、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域又はアンチセンス鎖の部分に相補的である。
更に別の実施形態において、本発明は、配列を含むｓｉＮＡ分子、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８、米国仮出願第６０／３６３，１２４号及び／又はＵＳＳＮ１０／９２３，５３６に示されたＧｅｎＢａｎｋ受付番号によって表される配列を含む配列又は配列の一部に相補的である、ｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス配列を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。表ＩＩＩ及びＩＶ中の化学修飾及び本明細書に記載されているその他の化学修飾は、本発明の任意のｓｉＮＡコンストラクトに適用することができる。表ＶＩに記載のＬＮＰ調合物は、本明細書の任意のｓｉＮＡ分子又はｓｉＮＡ分子の組合せに適用することができる。
本発明の一実施形態においてｓｉＮＡ分子は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。ここで、アンチセンス鎖は、ＰＣＳＫ９標的ＲＮＡ配列又はその一部に相補的である。前記ｓｉＮＡは、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを有するセンス鎖を更に含む。前記センス鎖と前記アンチセンス鎖は、異なるヌクレオチド配列であり、各鎖中の少なくとも約１５ヌクレオチドは、他方の鎖に相補的である。
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子（例えば、二本鎖核酸又はポリヌクレオチド分子）は、標的ＲＮＡ配列又はその一部に相補的である、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを有するアンチセンス（ガイド）鎖を含む。一実施形態において標的ＲＮＡ配列の少なくとも１５ヌクレオチド（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド）は、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス（ガイド）鎖に相補的である。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子（例えば、二本鎖核酸又はポリヌクレオチド分子）は、標的ＲＮＡの配列又はその一部を含む、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを有するセンス（パッセンジャー）鎖を含む。一実施形態において標的ＲＮＡ配列の少なくとも１５ヌクレオチド（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドは、本発明のｓｉＮＡ分子のセンス（パッセンジャー）鎖を含む。
本発明の別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを有するアンチセンス領域を含む。ここで、アンチセンス領域は、標的ＤＮＡ配列に相補的である。前記ｓｉＮＡは、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを有するセンス領域を更に含む。前記センス領域と前記アンチセンス領域は線状分子に含まれ、センス領域は、アンチセンス領域に相補的である少なくとも約１５ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされるＲＮＡの発現を調節するＲＮＡｉ活性を有する。ＰＣＳＫ９遺伝子はある程度の配列相同性を共有するので、ｓｉＮＡ分子は、異なるＰＣＳＫ９標的間で共有される配列、又は特定のＰＣＳＫ９標的に特有の配列を選択することによって、ＰＣＳＫ９遺伝子のあるクラスを標的にするように設計することができる。したがって、一実施形態においてｓｉＮＡ分子は、１種類のｓｉＮＡ分子を用いてＰＣＳＫ９遺伝子のあるクラスを標的にするために、幾つかの遺伝子変種間で相同性を有するＰＣＳＫ９ＲＮＡ配列の保存された領域を標的にするように設計することができる。したがって、一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体における１つ又はそれ以上のＰＣＳＫ９アイソフォーム又は変種の発現を調節する。別の実施形態においてｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡｉ活性を媒介するのに必要な高度の特異性のために、特定のＰＣＳＫ９ポリヌクレオチド配列（例えば、単一のＰＣＳＫ９アイソフォーム又はＰＣＳＫ９一塩基多型（ＳＮＰ））に特有の配列を標的にするように設計することができる。
一実施形態においてＲＮＡ干渉遺伝子サイレンシング応答の媒介物質として作用する本発明の核酸又はポリヌクレオチド分子は、二本鎖核酸分子である。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド間の約１５から約３０塩基対を含有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド分子からなる。更に別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１から約３（例えば、約１、２又は３）ヌクレオチドのオーバーハング末端を有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド分子、例えば、約１９塩基対と３’末端モノヌクレオチド、ジヌクレオチド又はトリヌクレオチドオーバーハングとを有する約２１ヌクレオチド二本鎖を含む。更に別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、両末端が平滑末端である、又は両末端の一方が平滑末端である、平滑末端を有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド分子を含む。
一実施形態において二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドオーバーハングを含む。「オーバーハング」とは、二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（分子の２本の鎖の間で塩基対を形成していないヌクレオチド配列の末端部分を意味する（例えば、図６参照）。一実施形態において、本発明の二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（分子は、二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（分子の一方又は両方の鎖の３’末端にヌクレオチド又は非ヌクレオチドオーバーハングを含み得る。例えば、本発明の二本鎖核酸分子は、二本鎖分子のガイド鎖若しくはアンチセンス鎖／領域の３’末端に、パッセンジャー鎖若しくはセンス鎖／領域の３’末端に、又はガイド鎖若しくはアンチセンス鎖／領域とパッセンジャー鎖若しくはセンス鎖／領域の両方に、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドオーバーハングを含み得る。別の実施形態において、本発明の二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（（ｓｉＮＡ）分子のヌクレオチドオーバーハング部分は、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ（ＦＡＮＡ）、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、汎用塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）、非環式、又は５−Ｃ−メチルヌクレオチドを含む。別の実施形態において、本発明の二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（（ｓｉＮＡ）分子の非ヌクレオチドオーバーハング部分は、グリセリル、脱塩基又は反転（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）デオキシ脱塩基非ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、本発明の二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（（例えば、ｓｉＮＡ）分子のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の標的ポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチドに対応する。したがって、かかる実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド配列に基づく配列を含む。ここで、本発明のｓｉＮＡ分子のガイド鎖又はアンチセンス鎖／領域のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドに相補的であり得、本発明のｓｉＮＡ分子のパッセンジャー鎖又はセンス鎖／領域のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドを含み得る。かかるヌクレオチドオーバーハングは、ｓｉＲＮＡへの未変性ｄｓＲＮＡのダイサープロセシングから生成する配列を含む。
一実施形態において、本発明の二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（（例えば、ｓｉＮＡ）分子のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド配列に相補的であり、本明細書に記載したとおりに化学修飾されていてもよい。したがって、一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のガイド鎖又はアンチセンス鎖／領域のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチド、すなわち、ｓｉＮＡ分子のガイド鎖又はアンチセンス鎖／領域中のオーバーハングヌクレオチドのヌクレオチド位置に相補的である、標的ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチド位置に相補的であり得る。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のパッセンジャー鎖又はセンス鎖／領域のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチド、すなわち、ｓｉＮＡ分子中のパッセンジャー鎖又はセンス鎖／領域中のオーバーハングヌクレオチドの同じヌクレオチド位置に対応する標的ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチド位置を含み得る。一実施形態においてオーバーハングは、標的ポリヌクレオチド配列の一部に相補的である２個のヌクレオチド（例えば、３’−ＧＡ、３’−ＧＵ、３’−ＧＧ、３’ＧＣ、３’−ＣＡ、３’−ＣＵ、３’−ＣＧ、３’ＣＣ、３’−ＵＡ、３’−ＵＵ、３’−ＵＧ、３’ＵＣ、３’−ＡＡ、３’−ＡＵ、３’−ＡＧ、３’−ＡＣ、３’−ＴＡ、３’−ＴＵ、３’−ＴＧ、３’−ＴＣ、３’−ＡＴ、３’−ＵＴ、３’−ＧＴ、３’−ＣＴ）オーバーハングを含む。一実施形態においてオーバーハングは、標的ポリヌクレオチド配列の一部に相補的でない２個のヌクレオチド（例えば、３’−ＧＡ、３’−ＧＵ、３’−ＧＧ、３’ＧＣ、３’−ＣＡ、３’−ＣＵ、３’−ＣＧ、３’ＣＣ、３’−ＵＡ、３’−ＵＵ、３’−ＵＧ、３’ＵＣ、３’−ＡＡ、３’−ＡＵ、３’−ＡＧ、３’−ＡＣ、３’−ＴＡ、３’−ＴＵ、３’−ＴＧ、３’−ＴＣ、３’−ＡＴ、３’−ＵＴ、３’−ＧＴ、３’−ＣＴ）オーバーハングを含む。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハングヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハングヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドがプリンヌクレオチドである場合には、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、及び／又はオーバーハングヌクレオチドがピリミジンヌクレオチドである場合には、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド若しくは２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチドである。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハング中のプリンヌクレオチドは（存在するときには）２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハング中のピリミジンヌクレオチドは（存在するときには）２’−デオキシ−２’−フルオロ又は２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチドである。
一実施形態において、本発明の二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド配列に相補的でなく、本明細書に記載したとおりに化学修飾されていてもよい。一実施形態においてオーバーハングは、標的ポリヌクレオチド配列の一部に相補的でない３’−ＵＵオーバーハングを含む。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。
一実施形態において、本発明の二本鎖核分子（例えば、ｓｉＮＡ）は、２又は３個のヌクレオチドオーバーハングを含み、オーバーハング中のヌクレオチドは同じであり、又は異なる。一実施形態において、本発明の二本鎖核分子（例えば、ｓｉＮＡ）は、２又は３個のヌクレオチドオーバーハングを含み、オーバーハング中のヌクレオチドは、同じであり、又は異なり、オーバーハング中の１個以上のヌクレオチドは、塩基、糖及び／又はリン酸骨格において化学修飾されている。
一実施形態において、本発明は、タンパク質をコードするＲＮＡ又はＰＣＳＫ９標的遺伝子の発現に関連する非コードＲＮＡなどのＰＣＳＫ９標的核酸分子に特異的である１個以上の化学修飾ｓｉＮＡコンストラクトを特徴とする。一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の１個以上の化学修飾を含む核酸分子に特異的である、ＲＮＡベースのｓｉＮＡ分子（例えば、２’−ＯＨヌクレオチドを含むｓｉＮＡ）を特徴とする。かかる化学修飾の非限定的例としては、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、４’−チオリボヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド（例えば、参照により本明細書に組み込む、２００４年１１月５日に出願されたＵＳＳＮ１０／９８１，９６６参照）、「汎用塩基」ヌクレオチド、「非環式」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ（ＦＡＮＡ、例えば、Ｄｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４，１６６９−１６７５参照）及び末端グリセリル及び／又は反転デオキシ脱塩基残基の組み入れが挙げられるが、これらだけに限定されない。これらの化学修飾は、種々のｓｉＮＡコンストラクト（例えば、ＲＮＡベースのｓｉＮＡコンストラクト）において使用すると、細胞におけるＲＮＡｉ活性を維持し、同時に、これらの化合物の血清安定性を劇的に増大させることが判明した。
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載の化学修飾（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、４’−チオリボヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、ＬＮＡ）をｓｉＮＡ分子の内部位置に含む。「内部位置」とは、ｓｉＮＡ二本鎖の塩基対形成位置を意味する。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持しつつ、修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドを使用して、安定性、活性、毒性、免疫応答及び／又は生物学的利用能などのインビトロ又はインビボ特性を改善することができる。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子中に存在するヌクレオチドの総数の百分率として修飾ヌクレオチドを含み得る。したがって、本発明のｓｉＮＡ分子は、約５％から約１００％の修飾ヌクレオチド（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の修飾ヌクレオチド）を一般に含み得る。例えば、一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子中のヌクレオチド位置の約５％から約１００％（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の修飾ヌクレオチド）は、２’糖修飾、例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチドなどの核酸糖修飾を含む。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子中のヌクレオチド位置の約５％から約１００％（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の修飾ヌクレオチド）は、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）又は６−アザピリミジン又は６−アルキルピリミジン（例えば６−メチルウリジン）、プロピン修飾などの核酸塩基修飾を含む。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子中のヌクレオチド位置の約５％から約１００％（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の修飾ヌクレオチド）は、本明細書の式Ｉの骨格修飾などの核酸骨格修飾を含む。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子中のヌクレオチド位置の約５％から約１００％（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の修飾ヌクレオチド）は、核酸糖、塩基若しくは骨格修飾又はその任意の組合せ（例えば、本明細書の核酸糖、塩基、骨格又は非ヌクレオチド修飾の任意の組合せ）を含む。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の修飾ヌクレオチドを含む。所与のｓｉＮＡ分子中に存在する修飾ヌクレオチドの実際の割合は、ｓｉＮＡ中に存在するヌクレオチドの総数に依存する。ｓｉＮＡ分子が一本鎖である場合には、修飾率は、一本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するヌクレオチドの総数に基づき得る。同様に、ｓｉＮＡ分子が二本鎖である場合には、修飾率は、センス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖とアンチセンス鎖の両方中に存在するヌクレオチドの総数に基づき得る。
本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、核酸又はポリヌクレオチド分子内の種々の場所に修飾されたヌクレオチドを含み得る。一実施形態において、本発明の二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ分子）は、ｓｉＮＡ二本鎖内部の塩基対形成位置に修飾ヌクレオチドを含む。例えば、内部位置は、１９塩基対と２個のヌクレオチド３’オーバーハングとを有する２１ヌクレオチドｓｉＮＡ二本鎖のセンス鎖若しくは領域又はアンチセンス鎖若しくは領域のどちらかの５’末端から約３から約１９ヌクレオチドの位置を含み得る。別の実施形態において、本発明の二本鎖核酸又はポリヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の非塩基対形成領域、すなわちオーバーハング領域に修飾ヌクレオチドを含む。「非塩基対形成」とは、核酸又はポリヌクレオチド分子のセンス鎖又はセンス領域とアンチセンス鎖又はアンチセンス領域との間でヌクレオチドが塩基対を形成していないことを意味する。オーバーハングヌクレオチドは、対応する標的ポリヌクレオチド配列に相補的であり得、又は対応する標的ポリヌクレオチド配列と塩基対を形成し得る（例えば、図６Ｃ参照）。例えば、オーバーハング位置は、１９塩基対と２個のヌクレオチド３’オーバーハングとを有する２１ヌクレオチドｓｉＮＡ二本鎖のセンス鎖若しくは領域又はアンチセンス鎖若しくは領域のどちらかの５’末端から約２０及び約２１ヌクレオチドの位置を含み得る。別の実施形態において、本発明の二本鎖核酸又はポリヌクレオチド分子は、核酸又はポリヌクレオチド分子の末端位置に修飾ヌクレオチドを含む。例えば、かかる末端領域としては、核酸又はポリヌクレオチド分子のセンス及び／又はアンチセンス鎖若しくは領域の３’と５’の両方の位置に対して、３’位置、５’位置が挙げられる。別の実施形態において、本発明の二本鎖核酸又はポリヌクレオチド分子は、塩基対形成位置若しくは内部位置、非塩基対形成領域若しくはオーバーハング領域、及び／又は末端領域、又はその任意の組合せにおいて、修飾ヌクレオチドを含む。
本発明の一態様は、標的遺伝子の発現を下方制御する、又は標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。一実施形態において二本鎖核酸又はポリヌクレオチド分子は、１個又はそれ以上の化学修飾を含み、二本鎖核酸又はポリヌクレオチドの各鎖は約２１ヌクレオチド長である。一実施形態において、二本鎖核酸又はポリヌクレオチド分子は、リボヌクレオチドを含まない。別の実施形態において、二本鎖核酸又はポリヌクレオチド分子は、１個以上のリボヌクレオチドを含む。一実施形態において、二本鎖核酸又はポリヌクレオチド分子の各鎖は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを独立に含む。ここで、各鎖は、他方の鎖のヌクレオチドに相補的である約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを含む。一実施形態において二本鎖核酸又はポリヌクレオチドの鎖の一方は、標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、分子の他方の鎖は、標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部にかなり類似したヌクレオチド配列を含む。
別の実施形態において、本発明は、アンチセンス領域とセンス領域を含み、標的遺伝子の発現を下方制御する、又は標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域は、標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部にかなり類似したヌクレオチド配列を含む。一実施形態においてアンチセンス領域とセンス領域は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを独立に含む。ここで、アンチセンス領域は、センス領域のヌクレオチドに相補的である約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、本発明は、センス領域とアンチセンス領域を含み、標的遺伝子の発現を下方制御する、又は標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域は、標的遺伝子によってコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、アンチセンス領域に相補的であるヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、平滑末端、すなわち、オーバーハングヌクレオチドを含まない末端を含む。例えば、本明細書に記載の修飾を含み（例えば、式Ｉ−ＶＩＩのヌクレオチド、「Ｓｔａｂ ００」−「Ｓｔａｂ ３６」若しくは「Ｓｔａｂ ３Ｆ」−「Ｓｔａｂ ３６Ｆ」を含むｓｉＮＡコンストラクト（表ＩＶ）、又はその任意の組合せを含み）、及び／又は本明細書に記載の任意の長さを含むｓｉＮＡ分子は、平滑末端、すなわちオーバーハングヌクレオチドを含まない末端を含み得る。
一実施形態において、本発明の任意の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、１個以上の平滑末端を含み得る。すなわち、ここで、平滑末端は、オーバーハングヌクレオチドを含まない。一実施形態において平滑末端ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子の各鎖中に存在するヌクレオチドと同数の塩基対を有する。別の実施形態においてｓｉＮＡ分子は１個の平滑末端を含む。例えば、アンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端はオーバーハングヌクレオチドを含まない。別の例において、ｓｉＮＡ分子は１個の平滑末端を含む。例えば、アンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端はオーバーハングヌクレオチドを含まない。別の例において、ｓｉＮＡ分子は２個の平滑末端を含む。例えば、アンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端、及びアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端は、オーバーハングヌクレオチドを含まない。平滑末端ｓｉＮＡ分子は、例えば、約１５から約３０ヌクレオチド（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド）を含み得る。平滑末端ｓｉＮＡ分子中に存在する他のヌクレオチドは、例えば、ミスマッチ、バルジ、ループ又はゆらぎ塩基対を含み、ｓｉＮＡ分子の活性を調節して、ＲＮＡ干渉を媒介することができる。
「平滑末端」とは、対称な末端、又はオーバーハングヌクレオチドを含まない二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子の末端を意味する。二本鎖ｓｉＮＡ分子の２本の鎖は、末端にオーバーハングヌクレオチドを含まずに整合する。例えば、平滑末端ｓｉＮＡコンストラクトは、ｓｉＮＡ分子のセンス領域とアンチセンス領域の間で相補的である末端ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、本発明は、標的遺伝子の発現を下方制御する、又は標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は、２個の別々のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられ、第１の断片はセンス領域を含み、第２の断片はｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。センス領域は、ポリヌクレオチドリンカー、非ヌクレオチドリンカーなどのリンカー分子を介してアンチセンス領域と連結し得る。
一実施形態において、本発明の二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、ＲＮＡｉ活性を維持又は増強する位置にリボヌクレオチドを含む。一実施形態においてリボヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖又はセンス領域中に存在し、ＲＩＳＣ内での酵素によるセンス鎖又はセンス領域の切断を可能にすることによってＲＮＡｉ活性を付与し得る（例えば、ＲＩＳＣ中でＡＧＯ２酵素によって切断される、１９塩基対二本鎖のパッセンジャー鎖の位置９など、パッセンジャー鎖、センス鎖又はセンス領域の切断位置に存在するリボヌクレオチド。例えば、Ｍａｔｒａｎｇａ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｅｌｌ，１２３：１−１１４及びＲａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｅｌｌ，１２３：６２１−６２９を参照されたい。）。別の実施形態においてｓｉＮＡ分子の（アンチセンス鎖又はアンチセンス領域としても知られる）ガイド鎖又はガイド領域の５’末端にある１個以上（例えば、１、２、３、４又は５個）のヌクレオチドはリボヌクレオチドである。
一実施形態において、本発明の二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、ＲＩＳＣ複合体中での酵素によるパッセンジャー鎖又はパッセンジャー領域の切断を可能にする（センス鎖又はセンス領域としても知られる）パッセンジャー鎖又はパッセンジャー領域内の位置に１個以上のリボヌクレオチドを含む（例えば、ＡＧＯ２酵素によって、ＲＩＳＣ中で切断される、１９塩基対二本鎖のパッセンジャー鎖の位置９など、パッセンジャー鎖の位置に存在するリボヌクレオチド。例えば、Ｍａｔｒａｎｇａ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｅｌｌ，１２３：１−１１４及びＲａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｅｌｌ，１２３：６２１−６２９を参照されたい。）。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、少なくとも２、３、４、５個又はそれを超える、同じでも、異なっていてもよい化学修飾を含む。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、少なくとも２、３、４、５個又はそれを超える異なる化学修飾を含む。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）であって、二本鎖核酸分子は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）個の塩基対を含み、ｓｉＮＡ分子の各鎖中のヌクレオチド位置の１つ以上（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個）は、化学修飾を含む。別の実施形態においてｓｉＮＡは、少なくとも２、３、４、５個又はそれを超える異なる化学修飾を含む。
一実施形態において、本発明は、標的遺伝子の発現を下方制御する、又は標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）個の塩基対を含み、ｓｉＮＡ分子の各鎖は１個以上の化学修飾を含む。一実施形態において二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、少なくとも２個の（例えば、２、３、４、５個又はそれを超える）異なる化学修飾、例えば、異なるヌクレオチド糖、塩基又は骨格修飾を含む。別の実施形態において二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は、標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、二本鎖ｓｉＮＡ分子の他方の鎖は、標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部にかなり類似したヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は、標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、二本鎖ｓｉＮＡ分子の他方の鎖は、標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部にかなり類似したヌクレオチド配列を含む。別の実施形態においてｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを含み、各鎖は、他方の鎖のヌクレオチドに相補的である少なくとも約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを含む。標的遺伝子は、例えば、本明細書で言及する配列、又は参照により本明細書に組み込む配列を含み得る。標的遺伝子は、例えば、本明細書のＧｅｎＢａｎｋ受付番号によって参照される配列を含み得る。
一実施形態において、本発明の二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子の各鎖は、本明細書の任意の「Ｓｔａｂ ００」−「Ｓｔａｂ ３６」又は「Ｓｔａｂ ３Ｆ」−「Ｓｔａｂ ３６Ｆ」（表ＩＶ）修飾パターン、その任意の組合せなどの異なる化学修飾パターンを含む（表ＩＶ参照）。種々の修飾パターンを有するかかるｓｉＮＡ分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖の非限定的例を表ＩＩＩ並びに図４及び５に示す。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、リボヌクレオチドを含まない。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、１個以上のリボヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるリボヌクレオチド）を含む。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、ＰＣＳＫ９標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を含み、ＰＣＳＫ９標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部にかなり類似したヌクレオチド配列を含むセンス領域を更に含む。別の実施形態においてアンチセンス領域とセンス領域は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを各々含む。アンチセンス領域は、センス領域のヌクレオチドに相補的である少なくとも約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを含む。一実施形態において二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、少なくとも２個の（例えば、２、３、４、５個又はそれを超える）異なる化学修飾、例えば、異なるヌクレオチド糖、塩基又は骨格修飾を含む。ＰＣＳＫ９標的遺伝子は、例えば、本明細書で言及する配列、又は参照により本明細書に組み込む配列を含み得る。別の実施形態においてｓｉＮＡは二本鎖核酸分子であり、ｓｉＮＡ分子の２本の鎖の各々は、約１５から約４０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、２３、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０）ヌクレオチドを独立に含み、ｓｉＮＡ分子の鎖の１本は、ＰＣＳＫ９標的遺伝子の核酸配列又はその一部に相補的である少なくとも約１５（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５又はそれを超える）ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、センス領域及びアンチセンス領域を含み、アンチセンス領域は、ＰＣＳＫ９標的遺伝子によってコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、アンチセンス領域に相補的であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態においてｓｉＮＡ分子は、２個の別々のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられ、第１の断片はセンス領域を含み、第２の断片はｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。別の実施形態においてセンス領域は、リンカー分子を介してアンチセンス領域と連結されている。別の実施形態においてセンス領域は、ヌクレオチド、非ヌクレオチドリンカーなどのリンカー分子を介してアンチセンス領域と連結されている。一実施形態において二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、少なくとも２個の（例えば、２、３、４、５個又はそれを超える）異なる化学修飾、例えば、異なるヌクレオチド糖、塩基又は骨格修飾を含む。ＰＣＳＫ９標的遺伝子は、例えば、本明細書で言及する配列、又は参照により本明細書に組み込む配列を含み得る。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、１個又はそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個又はそれを超える）２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジン修飾を含む（例えば、ｓｉＮＡの１個以上又は全部のピリミジン（例えば、Ｕ又はＣ）位置が２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで修飾されている。）。一実施形態において２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジン修飾は、センス鎖中に存在する。一実施形態において２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジン修飾は、アンチセンス鎖中に存在する。一実施形態において２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジン修飾は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖中とアンチセンス鎖中の両方に存在する。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、１個又はそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個又はそれを超える）２’−Ｏ−メチルプリン修飾を含む（例えば、ｓｉＮＡの１個以上又は全部のプリン（例えば、Ａ又はＧ）位置が２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで修飾されている。）。一実施形態において２’−Ｏ−メチルプリン修飾は、センス鎖中に存在する。一実施形態において２’−Ｏ−メチルプリン修飾は、アンチセンス鎖中に存在する。一実施形態において２’−Ｏ−メチルプリン修飾は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖中とアンチセンス鎖中の両方に存在する。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、１個又はそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個又はそれを超える）２’−デオキシプリン修飾を含む（例えば、ｓｉＮＡの１個以上又は全部のプリン（例えば、Ａ又はＧ）位置が２’−デオキシヌクレオチドで修飾されている。）。一実施形態において２’−デオキシプリン修飾は、センス鎖中に存在する。一実施形態において２’−デオキシプリン修飾は、アンチセンス鎖中に存在する。一実施形態において２’−デオキシプリン修飾は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖中とアンチセンス鎖中の両方に存在する。
一実施形態において、本発明は、センス領域とアンチセンス領域を含み、標的遺伝子の発現を下方制御する、又は標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域は、標的遺伝子によってコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、アンチセンス領域に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ｓｉＮＡ分子は、１個以上の修飾ピリミジン及び／又はプリンヌクレオチドを有する。一実施形態において二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、少なくとも２個の（例えば、２、３、４、５個又はそれを超える）異なる化学修飾、例えば、異なるヌクレオチド糖、塩基又は骨格修飾を含む。一実施形態においてセンス領域中のピリミジンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチド又は２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域中に存在するプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の実施形態においてセンス領域中のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域中に存在するプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。別の実施形態においてセンス領域中のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域中に存在するプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。一実施形態においてアンチセンス領域中のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス領域中に存在するプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル又は２’−デオキシプリンヌクレオチドである。上記ｓｉＮＡ分子のいずれかの別の実施形態においてセンス鎖の非相補領域（例えば、オーバーハング領域）中に存在する任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
一実施形態において、本発明は、標的遺伝子の発現を下方制御する、又は標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は、２個の別々のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられ、第１の断片はセンス領域を含み、第２の断片はｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。センス領域を含む断片は、断片の５’末端に、３’末端に、又は５’末端と３’末端の両方に、末端キャップ部分を含む。一実施形態において末端キャップ部分は、反転デオキシ脱塩基部分又はグリセリル部分である。一実施形態においてｓｉＮＡ分子の２個の断片の各々は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを独立に含む。別の実施形態においてｓｉＮＡ分子の２個の断片の各々は、約１５から約４０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、２３、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０）ヌクレオチドを独立に含む。非限定的例において、ｓｉＮＡ分子の２個の断片の各々は、約２１ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、本発明は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、又は本明細書及び参照により本明細書に組み込む２００４年１１月５日に出願されたＵＳＳＮ１０／９８１，９６６に記載の任意の他の修飾ヌクレオシド／ヌクレオチドである。一実施形態において、本発明は、少なくとも２個の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、又は本明細書及び参照により本明細書に組み込む２００４年１１月５日に出願されたＵＳＳＮ１０／９８１，９６６に記載の任意の他の修飾ヌクレオシド／ヌクレオチドからなる群から選択される。修飾ヌクレオチド／ヌクレオシドは、同じでも、異なっていてもよい。ｓｉＮＡは、例えば、約１５から約４０ヌクレオチド長であり得る。一実施形態においてｓｉＮＡ中に存在する全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオピリミジンヌクレオチドである。一実施形態においてｓｉＮＡ中の修飾ヌクレオチドは、少なくとも１個の２’−デオキシ−２’−フルオロシチジン又は２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。別の実施形態においてｓｉＮＡ中の修飾ヌクレオチドは、少なくとも１個の２’−デオキシ−２’−フルオロシチジン及び少なくとも１個の２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。一実施形態においてｓｉＮＡ中に存在する全ウリジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドである。一実施形態においてｓｉＮＡ中に存在する全シチジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンヌクレオチドである。一実施形態においてｓｉＮＡ中に存在する全アデノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンヌクレオチドである。一実施形態においてｓｉＮＡ中に存在する全グアノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンヌクレオチドである。ＳｉＮＡは、ホスホロチオアート結合などの少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合を更に含み得る。一実施形態において２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチドを有する場所など、リボヌクレアーゼによる切断に敏感である、ｓｉＮＡ中の特に選択された場所に存在する。
一実施形態において、本発明は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子中に導入することを含む、リボヌクレアーゼによる切断に対するｓｉＮＡ分子の安定性を増大させる方法を特徴とする。ここで、修飾ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。一実施形態においてｓｉＮＡ中に存在する全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。一実施形態においてｓｉＮＡ中の修飾ヌクレオチドは、少なくとも１個の２’−デオキシ−２’−フルオロシチジン又は２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。別の実施形態においてｓｉＮＡ中の修飾ヌクレオチドは、少なくとも１個の２’−フルオロシチジン及び少なくとも１個の２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。一実施形態においてｓｉＮＡ中に存在する全ウリジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドである。一実施形態においてｓｉＮＡ中に存在する全シチジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンヌクレオチドである。一実施形態においてｓｉＮＡ中に存在する全アデノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンヌクレオチドである。一実施形態においてｓｉＮＡ中に存在する全グアノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンヌクレオチドである。ＳｉＮＡは、ホスホロチオアート結合などの少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合を更に含み得る。一実施形態において２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチドを有する場所など、リボヌクレアーゼによる切断に敏感である、ｓｉＮＡ中の特に選択された場所に存在する。
一実施形態において、本発明は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドをｓｉＮＡ分子中に導入することを含む、リボヌクレアーゼによる切断に対する核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子の安定性を増大させる方法を特徴とする。ここで、修飾ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチドである。一実施形態においてｓｉＮＡ中に存在する全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノピリミジンヌクレオチドである。一実施形態においてｓｉＮＡ中の修飾ヌクレオチドは、少なくとも１個の２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノシチジン又は２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノウリジンヌクレオチドを含む。別の実施形態においてｓｉＮＡ中の修飾ヌクレオチドは、少なくとも１個の２’−フルオロシチジン及び少なくとも１個の２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノウリジンヌクレオチドを含む。一実施形態においてｓｉＮＡ中に存在する全ウリジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノウリジンヌクレオチドである。一実施形態においてｓｉＮＡ中に存在する全シチジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノシチジンヌクレオチドである。一実施形態においてｓｉＮＡ中に存在する全アデノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノアデノシンヌクレオチドである。一実施形態においてｓｉＮＡ中に存在する全グアノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノグアノシンヌクレオチドである。ＳｉＮＡは、ホスホロチオアート結合などの少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合を更に含み得る。一実施形態において２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチドを有する場所など、リボヌクレアーゼによる切断に敏感である、ｓｉＮＡ中の特に選択された場所に存在する。
一実施形態において、本発明は、センス領域とアンチセンス領域を含み、標的遺伝子の発現を下方制御する、又は標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域は、標的遺伝子によってコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、アンチセンス領域に相補的であるヌクレオチド配列を含む。アンチセンス領域中に存在するプリンヌクレオチドは、２’−デオキシ−プリンヌクレオチドを含む。代替の実施形態においてアンチセンス領域中に存在するプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドを含む。上記実施形態のいずれにおいても、アンチセンス領域は、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合をアンチセンス領域の３’末端に含み得る。或いは、上記実施形態のいずれにおいても、アンチセンス領域は、グリセリル修飾をアンチセンス領域の３’末端に含み得る。上記ｓｉＮＡ分子のいずれかの別の実施形態においてアンチセンス鎖の非相補領域（例えば、オーバーハング領域）中に存在する任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）のアンチセンス領域は、疾患又は形質特異的対立遺伝子に関連した一塩基多型（ＳＮＰ）を含む配列など、対象又は生物体における特定の疾患又は形質に関係する対立遺伝子に特有の配列を有する内因性転写物の一部に相補的である配列を含む。したがって、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、特定の対立遺伝子に特有な配列であって、疾患、症状又は形質に関係する対立遺伝子に対して選択的なＲＮＡｉを媒介する特異性をもたらす配列に相補的である配列を含み得る。
一実施形態において、本発明は、標的遺伝子の発現を下方制御する、又は標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は、２個の別々のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられ、第１の断片はセンス領域を含み、第２の断片はｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。一実施形態において二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約２１ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の各断片の約１９ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補ヌクレオチドと塩基対を形成し、ｓｉＮＡ分子の各断片の少なくとも２個の３’末端ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の断片のヌクレオチドと塩基対を形成しない。別の実施形態においてｓｉＮＡ分子は二本鎖核酸分子であり、各鎖は約１９ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の各断片のヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補ヌクレオチドと塩基対を形成して、少なくとも約１５（例えば、１５、１６、１７、１８又は１９）塩基対を形成し、ｓｉＮＡ分子の一方又は両方の末端は平滑末端である。一実施形態においてｓｉＮＡ分子の各断片の２個の３’末端ヌクレオチドの各々は、２’−デオキシ−チミジンなどの２’−デオキシ−ピリミジンヌクレオチドである。一実施形態においてｓｉＮＡ分子の各断片の２個の３’末端ヌクレオチドの各々は、２’−Ｏ−メチルウリジン、シチジン、チミジンなどの２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである。別の実施形態においてｓｉＮＡ分子の各断片の全ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補ヌクレオチドと塩基対を形成する。別の実施形態においてｓｉＮＡ分子は、センス領域及びアンチセンス領域を有する、約１９から約２５塩基対の二本鎖核酸分子であり、アンチセンス領域の約１９ヌクレオチドは、標的遺伝子によってコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対を形成する。別の実施形態においてアンチセンス領域の約２１ヌクレオチドは、標的遺伝子によってコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対を形成する。上記実施形態のいずれにおいても、前記アンチセンス領域を含む断片の５’末端は、リン酸基を含んでいてもよい。
一実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡ配列の発現を阻害する二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まず、二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１５から約３０ヌクレオチドである。一実施形態においてｓｉＮＡ分子は２１ヌクレオチド長である。非リボヌクレオチド含有ｓｉＮＡコンストラクトの例は、Ｓｔａｂ ７／８、Ｓｔａｂ ７／１１、Ｓｔａｂ ８／８、Ｓｔａｂ １８／８、Ｓｔａｂ １８／１１、Ｓｔａｂ １２／１３、Ｓｔａｂ ７／１３、Ｓｔａｂ １８／１３、Ｓｔａｂ ７／１９、Ｓｔａｂ ８／１９、Ｓｔａｂ １８／１９、Ｓｔａｂ ７／２０、Ｓｔａｂ ８／２０、Ｓｔａｂ １８／２０、Ｓｔａｂ ７／３２、Ｓｔａｂ ８／３２、Ｓｔａｂ １８／３２など、センス／アンチセンスケミストリーの任意の組合せの表ＩＶに示す安定化ケミストリーの組合せである（例えば、Ｓｔａｂ ７、８、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０又は３２のセンス若しくはアンチセンス鎖又はその任意の組合せを有する任意のｓｉＮＡ）。本明細書では、数字で表したＳｔａｂケミストリーは、表ＩＶに示すケミストリーの２’−フルオロと２’−ＯＣＦ３の両方のバージョンを含み得る。例えば、「Ｓｔａｂ ７／８」は、Ｓｔａｂ ７／８とＳｔａｂ ７Ｆ／８Ｆの両方を指すなど。一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ干渉による標的ＲＮＡの切断を誘導する、化学合成された二本鎖ＲＮＡ分子を特徴とする。ここで、前記ＲＮＡ分子の各鎖は約１５から約３０ヌクレオチド長である。ＲＮＡ分子の一方の鎖は、ＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって標的ＲＮＡの切断を誘導するのに十分な相補性を、標的ＲＮＡに対して有するヌクレオチド配列を含む。ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、デオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチドなど、又はその任意の組合せなど、ただしこれらだけに限定されない、本明細書に記載の１個以上の化学修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。
一実施形態において、本発明の標的ＲＮＡは、タンパク質をコードする配列を含む。
一実施形態において、本発明の標的ＲＮＡは、非コードＲＮＡ配列（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなど）を含む。例えば、Ｍａｔｔｉｃｋ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２７−１５２８； Ｃｌａｖｅｒｉｅ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２９−１５３０； Ｓｅｔｈｕｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，２００６，ＲＮＡ，１２，１９２−１９７及びＣｚｅｃｈ，２００６ ＮＥＪＭ，３５４，１１： １１９４−１１９５を参照されたい。
一実施形態において、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子を含む医薬品を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子を含む活性成分を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害する、下方制御する、又は減少させるための二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子の使用を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は１個以上の化学修飾を含み、二本鎖ｓｉＮＡの各鎖は独立に約１５から約３０又はそれを超える（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０又はそれを超える）ヌクレオチド長である。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、１個以上の化学修飾を含む二本鎖核酸分子であり、ｓｉＮＡ分子の２個の断片の各々は、約１５から約４０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、２３、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０）ヌクレオチドを独立に含み、鎖の１本は、標的コードＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的である少なくとも１５ヌクレオチドを含む。非限定的例において、ｓｉＮＡ分子の２個の断片の各々は、約２１ヌクレオチドを含む。別の実施形態においてｓｉＮＡ分子は、１個以上の化学修飾を含む二本鎖核酸分子であり、各鎖は約２１ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の各断片の約１９ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補ヌクレオチドと塩基対を形成し、ｓｉＮＡ分子の各断片の少なくとも２個の３’末端ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の断片のヌクレオチドと塩基対を形成しない。別の実施形態においてｓｉＮＡ分子は、１個以上の化学修飾を含む二本鎖核酸分子であり、各鎖は約１９ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の各断片のヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補ヌクレオチドと塩基対を形成して、少なくとも約１５（例えば、１５、１６、１７、１８又は１９）塩基対を形成し、ｓｉＮＡ分子の一方又は両方の末端は平滑末端である。一実施形態においてｓｉＮＡ分子の各断片の２個の３’末端ヌクレオチドの各々は、２’−デオキシ−チミジンなどの２’−デオキシ−ピリミジンヌクレオチドである。一実施形態においてｓｉＮＡ分子の各断片の２個の３’末端ヌクレオチドの各々は、２’−Ｏ−メチルウリジン、シチジン、チミジンなどの２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである。別の実施形態においてｓｉＮＡ分子の各断片の全ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補ヌクレオチドと塩基対を形成する。別の実施形態においてｓｉＮＡ分子は、センス領域及びアンチセンス領域を有し、かつ、１個以上の化学修飾を含む、約１９から約２５塩基対の二本鎖核酸分子であり、アンチセンス領域の約１９ヌクレオチドは、標的遺伝子によってコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対を形成する。別の実施形態においてアンチセンス領域の約２１ヌクレオチドは、標的遺伝子によってコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対を形成する。上記実施形態のいずれにおいても、前記アンチセンス領域を含む断片の５’末端は、リン酸基を含んでいてもよい。
一実施形態において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害する、下方制御する、又は減少させる、二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子の使用を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、他方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖である。一実施形態において各鎖は、ヌクレオチド、糖、塩基、骨格修飾などの同じでも、異なっていてもよい、少なくとも２個の（例えば、２、３、４、５個又はそれを超える）化学修飾を有する。一実施形態において二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するピリミジンヌクレオチドの大多数は、糖修飾を含む。一実施形態において二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するプリンヌクレオチドの大多数は、糖修飾を含む。
一実施形態において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害する、下方制御する、又は減少させる、二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、他方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖である。一実施形態において各鎖は、ヌクレオチド、糖、塩基、骨格修飾などの同じでも、異なっていてもよい、少なくとも２個の（例えば、２、３、４、５個又はそれを超える）化学修飾を有する。一実施形態において二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するピリミジンヌクレオチドの大多数は、糖修飾を含む。一実施形態において二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するプリンヌクレオチドの大多数は、糖修飾を含む。
一実施形態において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害する、下方制御する、又は減少させる、二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は、タンパク質をコードする標的ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、他方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり、二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するピリミジンヌクレオチドの大多数は、糖修飾を含む。一実施形態においてｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１５から約３０個又はそれを超える（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０個又はそれを超える）ヌクレオチドを含み、他方の鎖のヌクレオチドに相補的である少なくとも約１５ヌクレオチドを含む。一実施形態においてｓｉＮＡ分子は、２個のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられ、第１の断片はｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、第２の断片はｓｉＮＡ分子のセンス領域のヌクレオチド配列を含む。一実施形態においてセンス鎖は、ポリヌクレオチドリンカー、非ヌクレオチドリンカーなどのリンカー分子を介して、アンチセンス鎖と連結されている。更なる実施形態においてセンス鎖中に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域中に存在するプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の実施形態においてセンス鎖中に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域中に存在するプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。更に別の実施形態においてアンチセンス鎖中に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の実施形態においてアンチセンス鎖は、１個以上の２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド及び１個以上の２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドを含む。別の実施形態においてアンチセンス鎖中に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。更なる実施形態においてセンス鎖は、３’末端及び５’末端を含み、末端キャップ部分（例えば、反転チミジンなどの反転デオキシ脱塩基部分又は反転デオキシヌクレオチド部分）は、センス鎖の５’末端、３’末端、又は５’末端と３’末端の両方に存在する。別の実施形態においてアンチセンス鎖は、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合をアンチセンス鎖の３’末端に含む。別の実施形態においてアンチセンス鎖は、グリセリル修飾を３’末端に含む。別の実施形態においてアンチセンス鎖の５’末端は、リン酸基を含んでいてもよい。
二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するピリミジンヌクレオチドの大多数が糖修飾を含む、標的遺伝子の発現を阻害し、下方制御し、又は低下させる二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子の上記実施形態のいずれにおいても、ｓｉＮＡ分子の２本の鎖の各々は、約１５から約３０個又はそれを超える（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０個又はそれを超える）ヌクレオチドを含み得る。一実施形態においてｓｉＮＡ分子の各鎖の約１５から約３０個又はそれを超える（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０個又はそれを超える）ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の鎖の相補ヌクレオチドと塩基対を形成する。別の実施形態においてｓｉＮＡ分子の各鎖の約１５から約３０個又はそれを超える（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０個又はそれを超える）ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の鎖の相補ヌクレオチドと塩基対を形成する。ここで、ｓｉＮＡ分子の各鎖の少なくとも２個の３’末端ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成しない。別の実施形態においてｓｉＮＡ分子の各断片の２個の３’末端ヌクレオチドの各々は、２’−デオキシ−チミジンなどの２’−デオキシ−ピリミジンである。一実施形態においてｓｉＮＡ分子の各鎖は、ｓｉＮＡ分子の他方の鎖の相補ヌクレオチドと塩基対を形成する。一実施形態においてアンチセンス鎖の約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドは、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対を形成する。一実施形態においてアンチセンス鎖の約１８から約２５（例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）ヌクレオチドは、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対を形成する。
一実施形態において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害する二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、他方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖である。一実施形態において各鎖は、ヌクレオチド 糖、塩基、骨格修飾などの少なくとも２個の（例えば、２、３、４、５個又はそれを超える）異なる化学修飾を有する。一実施形態において二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するピリミジンヌクレオチドの大多数は、糖修飾を含む。一実施形態において二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するプリンヌクレオチドの大多数は、糖修飾を含む。一実施形態においてアンチセンス鎖の５’末端は、リン酸基を含んでいてもよい。
一実施形態において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害する二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、他方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖である。二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するピリミジンヌクレオチドの大多数は、糖修飾を含む。アンチセンス鎖のヌクレオチド配列又はその一部は、標的ＲＮＡの非翻訳領域のヌクレオチド配列又はその一部に相補的である。
一実施形態において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害する二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、他方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖である。二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するピリミジンヌクレオチドの大多数は、糖修飾を含む。アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列、又は標的ＲＮＡ中に存在するその一部に相補的である。
一実施形態において、本発明は、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と医薬として許容される担体又は希釈剤とを含む組成物を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、本発明の２種類又はそれ以上のｓｉＮＡ分子（例えば、標的ＲＮＡの異なる領域を標的にするｓｉＮＡ分子、又は標的ＲＮＡ及び細胞標的を標的にするｓｉＮＡ分子）及び医薬として許容される担体又は希釈剤を特徴とする。
非限定的例において、化学修飾ヌクレオチドを核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子に導入することは、外因的に送達される未変性ＲＮＡ分子に固有のインビボでの安定性及び生物学的利用能の潜在的限界を克服する強力なツールとなる。例えば、化学修飾核酸分子を使用すると、化学修飾核酸分子は、血清中でより長い半減期を有する傾向にあるので、所与の治療効果に対する特定の核酸分子の用量を減少させることができる。また、ある種の化学修飾は、特定の細胞又は組織を標的にすることによって、及び／又は核酸分子の細胞内取り込みを改善することによって、核酸分子の生物学的利用能を改善することができる。したがって、化学修飾核酸分子の活性が未変性核酸分子よりも低い場合でも、例えば、全ＲＮＡ（ａｌｌ−ＲＮＡ）核酸分子と比較したときに、分子の安定性及び／又は送達が改善されたために、修飾核酸分子の全活性が、未変性分子の全活性よりも大きくなり得る。未変性無修飾ｓｉＮＡとは異なり、化学修飾ｓｉＮＡは、ヒトにおけるインターフェロン活性又は免疫賦活を活性化する可能性も最小化し得る。したがって、これらの諸性質は、研究と治療の両方の適用分野における使用を含めて、種々のインビトロ及びインビボでの設定において、未変性ｓｉＲＮＡ又は最小限に修飾されたｓｉＲＮＡがＲＮＡｉを媒介する能力を更に改善する。出願人は、対応する無修飾ｓｉＲＮＡ分子又は最小限に修飾されたｓｉＲＮＡ分子よりもＲＮＡｉ活性が改善された化学修飾ｓｉＮＡ分子を本明細書に記述する。本明細書に開示する化学修飾ｓｉＮＡモチーフは、無修飾活性ｓｉＲＮＡ又は最小限に修飾された活性ｓｉＲＮＡにかなり類似したＲＮＡｉ活性を維持する能力を提供し（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０：６８７７−６８８８参照）、同時に治療への応用に適切なヌクレアーゼ耐性及び薬物動態学的（ｐｈａｒｍａｃｏｋｅｔｉｃ）諸性質を提供する。
本明細書に記載の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子の実施形態のいずれにおいても、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合を前記アンチセンス領域の３’末端に含み得る。本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、アンチセンス領域は、約１から約５個のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を前記アンチセンス領域の５’末端に含み得る。本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、本発明のｓｉＮＡ分子の３’末端ヌクレオチドオーバーハングは、核酸糖、塩基又は骨格において化学修飾されたリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含み得る。本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、３’末端ヌクレオチドオーバーハングは、１個以上の汎用塩基リボヌクレオチドを含み得る。本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、３’末端ヌクレオチドオーバーハングは、１個以上の非環式ヌクレオチドを含み得る。
本発明の一実施形態は、核酸分子の発現が可能であるように、本発明の少なくとも１種類のポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子をコードする核酸配列を含む、発現ベクターを提供する。本発明の別の実施形態は、かかる発現ベクターを含むほ乳動物細胞を提供する。ほ乳動物細胞は、ヒト細胞であり得る。発現ベクターのｓｉＮＡ分子は、センス領域及びアンチセンス領域を含み得る。アンチセンス領域は、標的をコードするＲＮＡ又はＤＮＡ配列に相補的である配列を含み得る。センス領域は、アンチセンス領域に相補的である配列を含み得る。ｓｉＮＡ分子は、相補センス及びアンチセンス領域を有する２本の異なる鎖を含み得る。ｓｉＮＡ分子は、相補センス及びアンチセンス領域を有する一本鎖を含み得る。
一実施形態において、本発明は、細胞内で、又は再構成されたインビトロ系内でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、化学修飾は、骨格が修飾された式Ｉのヌクレオチド間結合を含む１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）ヌクレオチドを含む。
Figure 2010503382
 式中、各Ｒ１及びＲ２は独立に、天然でも、化学修飾されていてもよい、ｓｉＮＡ分子構造に含まれ得る、又はｓｉＮＡ分子との結合点として役立ち得る、任意のヌクレオチド、非ヌクレオチド又はポリヌクレオチドであり、各Ｘ及びＹは独立にＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル又は置換アルキルであり、各Ｚ及びＷは独立にＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アルカリール、アラルキル又はアセチルであり、Ｗ、Ｘ、Ｙ及びＺは全部がＯとは限らない。別の実施形態において、本発明の骨格修飾は、ホスホノアセタート及び／又はチオホスホノアセタートヌクレオチド間結合を含む（例えば、Ｓｈｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１，４１０９−４１１８参照）。
例えば任意のＺ、Ｗ、Ｘ及び／又はＹが硫黄原子を独立に含む、式Ｉの化学修飾ヌクレオチド間結合は、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）二本鎖の一方又は両方のオリゴヌクレオチド鎖中に、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖中に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、式Ｉの１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）化学修飾ヌクレオチド間結合を、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含み得る。例えば、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、式Ｉの約１から約５個又はそれを超える（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超える）化学修飾ヌクレオチド間結合を、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の５’末端に含み得る。別の非限定的例において、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、式Ｉの化学修飾ヌクレオチド間結合を有する１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）ピリミジンヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖に含み得る。更に別の非限定的例において、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、式Ｉの化学修飾ヌクレオチド間結合を有する１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）プリンヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖に含み得る。別の実施形態において式Ｉのヌクレオチド間結合を有する本発明のｓｉＮＡ分子は、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドも含む。
一実施形態において、本発明は、細胞内で、又は再構成されたインビトロ系内でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、化学修飾は、式ＩＩの１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含む。
Figure 2010503382
 式中、各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は独立に、いずれもｓｉＮＡ分子の構造に含まれ得る、又はｓｉＮＡ分子との結合点として役立ち得る、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリール若しくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキル（ａｌｋｌｙｌ）アミノ、置換シリル、又は式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及び／又はＶＩＩのいずれかの基であり、Ｒ９は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ又はＣＦ２であり、Ｂは、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、２−アミノアデノシン、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリンなどのヌクレオシド塩基、又は標的ＲＮＡに相補的でも、非相補的でもよい任意の他の非天然塩基、又はフェニル、ナフチル、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ネブラリン、ピリドン、ピリジノンなどの非ヌクレオシド塩基、又は標的ＲＮＡに相補的でも、非相補的でもよい任意の他の非天然汎用塩基である。一実施形態においてＲ３及び／又はＲ７は、抱合部分（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｍｏｉｅｔｙ）及びリンカー（例えば、本明細書に記載の、又は当分野で公知の、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）を含む。抱合部分の非限定的例としては、天然タンパク質リガンド由来のペプチドなどの細胞受容体のリガンド；細胞のＺＩＰコード配列を含めたタンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；葉酸塩、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどのビタミン及び他の補因子；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー；リン脂質；コレステロール；ステロイド及びＰＥＩ、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミンが挙げられる。一実施形態において、本発明の式ＩＩのヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。一実施形態において、本発明の式ＩＩのヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。一実施形態において、本発明の式ＩＩのヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。
式ＩＩの化学的に修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ二本鎖の一方又は両方のオリゴヌクレオチド鎖中に、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖中に存在し得る。本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、式ＩＩの１個以上の化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含み得る。例えば、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、式ＩＩの約１から約５個又はそれを超える（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超える）化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の５’末端に含み得る。別の非限定的例において、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、約１から約５個又はそれを超える（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超える）式ＩＩの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端に含み得る。
一実施形態において、本発明は、細胞内で、又は再構成されたインビトロ系内でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、化学修飾は、式ＩＩＩの１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含む。
Figure 2010503382
 式中、各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は独立に、いずれもｓｉＮＡ分子の構造に含まれ得る、又はｓｉＮＡ分子との結合点として役立ち得る、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリール若しくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキル（ａｌｋｌｙｌ）アミノ、置換シリル、又は式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及び／又はＶＩＩのいずれかの基であり、Ｒ９は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ又はＣＦ２であり、Ｂは、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、２−アミノアデノシン、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリンなどのヌクレオシド塩基、又は標的ＲＮＡに相補的又は非相補的であるように使用することができる任意の他の非天然塩基、又はフェニル、ナフチル、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ネブラリン、ピリドン、ピリジノンなどの非ヌクレオシド塩基、又は標的ＲＮＡに相補的でも、非相補的でもよい任意の他の非天然汎用塩基である。一実施形態においてＲ３及び／又はＲ７は、抱合部分及びリンカー（例えば、本明細書に記載の、又は当分野で公知の、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）を含む。抱合部分の非限定的例としては、天然タンパク質リガンド由来のペプチドなどの細胞受容体のリガンド；細胞のＺＩＰコード配列を含めたタンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；葉酸塩、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどのビタミン及び他の補因子；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー；リン脂質；コレステロール；ステロイド及びＰＥＩ、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミンが挙げられる。
式ＩＩＩの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ二本鎖の一方又は両方のオリゴヌクレオチド鎖中に、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖中に存在し得る。本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、式ＩＩＩの１個以上の化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含み得る。例えば、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、式ＩＩＩの約１から約５個又はそれを超える（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超える）化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の５’末端に含み得る。別の非限定的例において、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、約１から約５個又はそれを超える（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超える）式ＩＩＩの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端に含み得る。
別の実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、式ＩＩ又はＩＩＩのヌクレオチドを含む。ここで、式ＩＩ又はＩＩＩのヌクレオチドは、反転した配置である。例えば、式ＩＩ又はＩＩＩのヌクレオチドは、一方又は両方のｓｉＮＡ鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端と５’末端の両方においてなど、３’−３’、３’−２’、２’−３’又は５’−５’配置でｓｉＮＡコンストラクトに連結されている。
一実施形態において、本発明は、細胞内で、又は再構成されたインビトロ系内でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、化学修飾は、式ＩＶの５’末端リン酸基を含む。
Figure 2010503382
 式中、各Ｘ及びＹは独立にＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル又はアルキルハロであり、各Ｚ及びＷは独立にＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アルカリール、アラルキル、アルキルハロ又はアセチルであり、Ｗ、Ｘ、Ｙ及びＺは全部がＯとは限らず、ＹはｓｉＮＡ分子との結合点として役立つ。
一実施形態において、本発明は、標的に相補的である鎖上に、例えば、標的ＲＮＡに相補的である鎖上に、式ＩＶの５’末端リン酸基を有する核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は、全ＲＮＡ ｓｉＮＡ分子を含む。別の実施形態において、本発明は、標的に相補的である鎖上に式ＩＶの５’末端リン酸基を有するｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は、一方又は両方の鎖の３’末端上に、約１から約４（例えば、約１、２、３又は４）個のデオキシリボヌクレオチドを有する、約１から約３（例えば、約１、２又は３）ヌクレオチド３’末端ヌクレオチドオーバーハングも含む。別の実施形態において式ＩＶの５’末端リン酸基は、本発明のｓｉＮＡ分子の、例えば、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの化学修飾を有するｓｉＮＡ分子の、標的に相補的である鎖上に存在する。
一実施形態において、本発明は、細胞内で、又は再構成されたインビトロ系内でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、化学修飾は、１個以上のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含む。例えば、非限定的例において、本発明は、１本のｓｉＮＡ鎖中に約１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合を有する化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）を特徴とする。更に別の実施形態において、本発明は、両方のｓｉＮＡ鎖中に約１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合を個々に有する化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）を特徴とする。ホスホロチオアートヌクレオチド間結合は、ｓｉＮＡ二本鎖の一方又は両方のオリゴヌクレオチド鎖中に、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖中に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、１個以上のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含み得る。例えば、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、約１から約５個又はそれを超える（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超える）連続したホスホロチオアートヌクレオチド間結合を、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の５’末端に含み得る。別の非限定的例において、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）ピリミジンホスホロチオアートヌクレオチド間結合を、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖中に含み得る。更に別の非限定的例において、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）プリンホスホロチオアートヌクレオチド間結合を、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖中に含み得る。
二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子の各鎖は、異なる化学修飾パターンを含むように、１個以上の化学修飾を有し得る。異なる修飾パターンを生じ得る修飾スキームの幾つかの非限定的例を本明細書に示す。
一実施形態において、本発明は、センス鎖が、１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）２−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、及び／又は約１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）汎用塩基修飾ヌクレオチドを含み、末端キャップ分子をセンス鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含んでいてもよく、アンチセンス鎖が、約１から約１０又はそれを超える、具体的には約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）汎用塩基修飾ヌクレオチドを含み、末端キャップ分子をアンチセンス鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含んでいてもよい、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。別の実施形態において、センス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾されており、１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は３’末端、５’末端、又は３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子を、同じ鎖又は異なる鎖中に、有しても、有さなくてもよい。
別の実施形態において、本発明は、センス鎖が、約１から約５個、具体的には約１、２、３、４又は５個のホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超える）２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超える）汎用塩基修飾ヌクレオチドを含み、末端キャップ分子をセンス鎖の３末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含んでいてもよく、アンチセンス鎖が、約１から約５又はそれを超える、具体的には約１、２、３、４、５個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）汎用塩基修飾ヌクレオチドを含み、末端キャップ分子をアンチセンス鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含んでいてもよい、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。別の実施形態において、センス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾されており、約１から約５個又はそれを超える、例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は３’末端、５’末端、又は３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子を、同じ鎖又は異なる鎖中に、有しても、有さなくてもよい。
一実施形態において、本発明は、センス鎖が、１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は約１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）汎用塩基修飾ヌクレオチドを含み、末端キャップ分子をセンス鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含んでいてもよく、アンチセンス鎖が、約１から約１０個又はそれを超える、具体的には約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）汎用塩基修飾ヌクレオチドを含み、末端キャップ分子をアンチセンス鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含んでいてもよい、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。別の実施形態においてセンス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾されている。１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は３’末端、５’末端、又は３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子は、同じ鎖又は異なる鎖中に、存在しても、しなくてもよい。
別の実施形態において、本発明は、ここで、アンチセンス鎖が、約１から約５又はそれを超える、具体的には約１、２、３、４、５個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）汎用塩基修飾ヌクレオチドを含み、末端キャップ分子をセンス鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含んでいてもよく、アンチセンス鎖が、約１から約５個又はそれを超える、具体的には約１、２、３、４、５個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、１、８、９、１０個又はそれを超える）汎用塩基修飾ヌクレオチドを含み、末端キャップ分子をアンチセンス鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含んでいてもよい、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。別の実施形態においてセンス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾されており、約１から約５個、例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は３’末端、５’末端、又は３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子を、同じ鎖又は異なる鎖中に、有しても、有さなくてもよい。
一実施形態において、本発明は、約１から約５個又はそれを超える（具体的には約１、２、３、４、５個又はそれを超える）ホスホロチオアートヌクレオチド間結合をｓｉＮＡ分子の各鎖中に有する化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
別の実施形態において、本発明は、２’−５’ヌクレオチド間結合を含む核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。２’−５’ヌクレオチド間結合は、一方又は両方のｓｉＮＡ配列鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に存在し得る。また、２’−５’ヌクレオチド間結合は、一方又は両方のｓｉＮＡ配列鎖内の種々の他の位置に存在し得る。例えば、ｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖中のピリミジンヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間結合を含めた約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるは、２’−５’ヌクレオチド間結合を含み得る。又はｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖中のプリンヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間結合を含めた約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるは、２’−５’ヌクレオチド間結合を含み得る。
別の実施形態において、本発明の化学的に修飾された核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、その一方又は両方が化学修飾され得る２本の鎖を有する二本鎖を含む。ここで、各鎖は独立に約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチド長であり、二本鎖は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）個の塩基対を有し、化学修飾は式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を含む。例えば、本発明の例示的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、その一方又は両方が式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの化学修飾又はその任意の組合せで化学修飾され得る２本の鎖を有する二本鎖を含む。ここで、各鎖は、２ヌクレオチド３’末端ヌクレオチドオーバーハングを各々有する、約２１ヌクレオチドからなり、二本鎖は約１９塩基対を有する。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、一本鎖ヘアピン構造を含み、該ｓｉＮＡは、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）個の塩基対を有する約３６から約７０（例えば、約３６、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７０）ヌクレオチド長であり、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を含む化学修飾又はその任意の組合せを含み得る。例えば、本発明の例示的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの化学修飾又はその任意の組合せで化学修飾された、約４２から約５０（例えば、約４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０）個のヌクレオチドを有する線状オリゴヌクレオチドを含む。ここで、線状オリゴヌクレオチドは、約１９から約２１（例えば、１９、２０又は２１）個の塩基対と２ヌクレオチド３’末端ヌクレオチドオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成する。別の実施形態において、本発明の線状ヘアピンｓｉＮＡ分子は、ステムループモチーフを含み、ｓｉＮＡ分子のループ部分は生分解性である。例えば、本発明の線状ヘアピンｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のループ部分のインビボでの分解によって、約２個のヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチドオーバーハングなどの３’末端オーバーハングを有する二本鎖ｓｉＮＡ分子が生成し得るように設計される。
別の実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、ヘアピン構造を含み、該ｓｉＮＡは、約３から約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）個の塩基対を有する、約２５から約５０（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０）ヌクレオチド長であり、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を含む１個以上の化学修飾又はその任意の組合せを含み得る。例えば、本発明の例示的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの１個以上の化学修飾又はその任意の組合せで化学修飾された、約２５から約３５（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５）個のヌクレオチドを有する、線状オリゴヌクレオチドを含む。ここで、線状オリゴヌクレオチドは、約３から約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）個の塩基対、及び本明細書に記載したとおりに化学修飾され得る５’末端リン酸基（例えば、式ＩＶの５’末端リン酸基）を有する、ヘアピン構造を形成する。別の実施形態において、本発明の線状ヘアピンｓｉＮＡ分子は、ステムループモチーフを含み、ｓｉＮＡ分子のループ部分は生分解性である。一実施形態において、本発明の線状ヘアピンｓｉＮＡ分子は、非ヌクレオチドリンカーを含むループ部分を含む。
別の実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、非対称ヘアピン構造を含み、該ｓｉＮＡは、約３から約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）個の塩基対を有する、約２５から約５０（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０）ヌクレオチド長であり、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を含む１個以上の化学修飾又はその任意の組合せを含み得る。例えば、本発明の例示的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの１個以上の化学修飾又はその任意の組合せで化学修飾された、約２５から約３５（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５）個のヌクレオチドを有する、線状オリゴヌクレオチドを含む。ここで、線状オリゴヌクレオチドは、約３から約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）個の塩基対、及び本明細書に記載したとおりに化学修飾され得る５’末端リン酸基（例えば、式ＩＶの５’末端リン酸基）を有する、非対称ヘアピン構造を形成する。一実施形態において、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、ステムループモチーフを含み、ｓｉＮＡ分子のループ部分は生分解性である。別の実施形態において、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、非ヌクレオチドリンカーを含むループ部分を含む。
別の実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、センス及びアンチセンス領域を含む別々のポリヌクレオチド鎖を有する非対称二本鎖構造を含み、アンチセンス領域は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチド長であり、センス領域は、約３から約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）ヌクレオチド長であり、センス領域及びアンチセンス領域は、少なくとも３個の相補ヌクレオチドを有し、ｓｉＮＡは、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を含む１個以上の化学修飾又はその任意の組合せを含み得る。例えば、本発明の例示的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、センス及びアンチセンス領域を含む別々のポリヌクレオチド鎖を有する非対称二本鎖構造を含み、アンチセンス領域は、約１８から約２３（例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、又は２３）ヌクレオチド長であり、センス領域は、約３から約１５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）ヌクレオチド長であり、センス領域アンチセンス領域は、少なくとも３個の相補ヌクレオチドを有し、ｓｉＮＡは、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を含む１個以上の化学修飾又はその任意の組合せを含み得る。別の実施形態において非対称二本鎖ｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載したとおりに化学修飾され得る５’末端リン酸基（例えば、式ＩＶの５’末端リン酸基）も有し得る。
別の実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、環状核酸分子を含み、該ｓｉＮＡは、約１５から約３０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個）の塩基対を有する約３８から約７０（例えば、約３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７０）ヌクレオチド長であり、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を含む化学修飾又はその任意の組合せを含み得る。例えば、本発明の例示的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの化学修飾又はその任意の組合せで化学修飾された、約４２から約５０（例えば、約４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０）個のヌクレオチドを有する環状オリゴヌクレオチドを含む。ここで、環状オリゴヌクレオチドは、約１９個の塩基対及び２個のループを有するダンベル状構造を形成する。
別の実施形態において、本発明の環状核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、２個のループモチーフを含み、ｓｉＮＡ分子の一方又は両方のループ部分は生分解性である。例えば、本発明の環状ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のループ部分のインビボでの分解によって、約２個のヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチドオーバーハングなどの３’末端オーバーハングを有する二本鎖ｓｉＮＡ分子が生成し得るように設計される。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、少なくとも１個の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）脱塩基部分、例えば、式Ｖの化合物を含む。
Figure 2010503382
 式中、各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は独立に、いずれもｓｉＮＡ分子の構造に含まれ得る、又はｓｉＮＡ分子との結合点として役立ち得る、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリール若しくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキル（ａｌｋｌｙｌ）アミノ、置換シリル、又は式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及び／又はＶＩＩのいずれかの基であり、Ｒ９は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ又はＣＦ２である。一実施形態においてＲ３及び／又はＲ７は、抱合部分及びリンカー（例えば、本明細書に記載の、又は当分野で公知の、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）を含む。抱合部分の非限定的例としては、天然タンパク質リガンド由来のペプチドなどの細胞受容体のリガンド；細胞のＺＩＰコード配列を含めたタンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；葉酸塩、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどのビタミン及び他の補因子；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー；リン脂質；コレステロール；ステロイド及びＰＥＩ、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミンが挙げられる。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、少なくとも１個の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）反転脱塩基部分、例えば、式ＶＩの化合物を含む。
Figure 2010503382
 式中、各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は独立に、いずれもｓｉＮＡ分子の構造に含まれ得る、又はｓｉＮＡ分子との結合点として役立ち得る、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリール若しくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキル（ａｌｋｌｙｌ）アミノ、置換シリル、又は式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及び／又はＶＩＩのいずれかの基であり、Ｒ９は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ又はＣＦ２であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ８又はＲ１３は、本発明のｓｉＮＡ分子との結合点として役立つ。一実施形態においてＲ３及び／又はＲ７は、抱合部分及びリンカー（例えば、本明細書に記載の、又は当分野で公知の、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）を含む。抱合部分の非限定的例としては、天然タンパク質リガンド由来のペプチドなどの細胞受容体のリガンド；細胞のＺＩＰコード配列を含めたタンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；葉酸塩、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどのビタミン及び他の補因子；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー；リン脂質；コレステロール；ステロイド及びＰＥＩ、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミンが挙げられる。
別の実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、少なくとも１個の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）置換ポリアルキル部分、例えば、式ＶＩＩの化合物を含む。
Figure 2010503382
 式中、各ｎは独立に整数１から１２であり、各Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は独立に、いずれもｓｉＮＡ分子の構造に含まれ得る、又はｓｉＮＡ分子との結合点として役立ち得る、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリール若しくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキル（ａｌｋｌｙｌ）アミノ、置換シリル、又は式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及び／又はＶＩＩのいずれかの基である。一実施形態においてＲ３及び／又はＲ１は、抱合部分及びリンカー（例えば、本明細書に記載の、又は当分野で公知の、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）を含む。抱合部分の非限定的例としては、天然タンパク質リガンド由来のペプチドなどの細胞受容体のリガンド；細胞のＺＩＰコード配列を含めたタンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；葉酸塩、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどのビタミン及び他の補因子；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー；リン脂質；コレステロール；ステロイド及びＰＥＩ、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミンが挙げられる。
「ＺＩＰコード」配列とは、細胞のトポロジー形成シグナル伝達（ｔｏｐｏｇｅｎｉｃ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）によって媒介される輸送に関与する任意のペプチド又はタンパク質配列を意味する（例えば、Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０６（１５０１）：１５０５参照）。
二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子内の各ヌクレオチドは、式Ｉ−ＶＩＩＩのいずれかの構造を含む化学修飾を独立に有し得る。したがって、一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子の１個以上のヌクレオチド位置は、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を有する化学修飾、又は本明細書の任意の他の修飾を含む。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子の各ヌクレオチド位置は、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を有する化学修飾、又は本明細書の任意の他の修飾を含む。
一実施形態において、本発明の二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子の一方又は両方の鎖の１個以上のヌクレオチド位置は、式１−ＶＩＩのいずれかの構造を有する化学修飾、又は本明細書の任意の他の修飾を含む。一実施形態において、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖の各ヌクレオチド位置は、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を有する化学修飾、又は本明細書の任意の他の修飾を含む。
別の実施形態において、本発明は、式ＶＩＩの化合物を特徴とする。ここで、Ｒ１及びＲ２はヒドロキシル（ＯＨ）基であり、ｎ＝１であり、Ｒ３は、Ｏを含み、本発明の二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子の一方又は両方の鎖の３’末端、５’末端、若しくは３’末端と５’末端の両方との、又は本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子との、結合点である。この修飾を本明細書では「グリセリル」と称する（例えば、図１０の修飾６）。
別の実施形態において、本発明の化学的に修飾されたヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩのいずれかの部分）は、本発明のｓｉＮＡ分子の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方にある。例えば、化学的に修飾されたヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩの部分）は、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子のアンチセンス鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖とセンス鎖の両方の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に存在し得る。一実施形態において化学修飾ヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩの部分）は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端及び３’末端並びにアンチセンス鎖の３’末端に存在する。一実施形態において化学修飾ヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩの部分）は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端及び３’末端並びにアンチセンス鎖の３’末端の末端位置に存在する。一実施形態において化学修飾ヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩの部分）は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端及び３’末端並びにアンチセンス鎖の３’末端の２つの末端位置に存在する。一実施形態において化学修飾ヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩの部分）は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端及び３’末端並びにアンチセンス鎖の３’末端の最後から２番目の位置に存在する。また、式ＶＩＩの部分は、本明細書に記載のヘアピンｓｉＮＡ分子の３’末端又は５’末端に存在し得る。
別の実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、式Ｖ又はＶＩの脱塩基残基を含む。ここで、式ＶＩ又はＶＩの脱塩基残基は、一方又は両方のｓｉＮＡ鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端と５’末端の両方におけるなどの３’−３’、３’−２’、２’−３’又は５’−５’配置でｓｉＮＡコンストラクトと連結されている。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）ロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）ヌクレオチドを、例えば、ｓｉＮＡ分子の５’末端に、３’末端に、５’末端と３’末端の両方に、又はその任意の組合せに含む。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）４’−チオヌクレオチドを、例えば、ｓｉＮＡ分子の５’末端に、３’末端に、５’末端と３’末端の両方に、又はその任意の組合せに含む。
別の実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）非環式ヌクレオチドを、例えば、ｓｉＮＡ分子の５’末端に、３’末端に、５’末端と３’末端の両方に、又はその任意の組合せに含む。
一実施形態において、本発明の化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、１個以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４ １５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれを超える）２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ、ＦＡＮＡ若しくは脱塩基化学修飾又はその任意の組合せを有するセンス鎖又はセンス領域を含む。
一実施形態において、本発明の化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、１個以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４ １５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれを超える）２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ、ＦＡＮＡ若しくは脱塩基化学修飾又はその任意の組合せを有するアンチセンス鎖又はアンチセンス領域を含む。
一実施形態において、本発明の化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、１個以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４ １５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれを超える）２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ、ＦＡＮＡ若しくは脱塩基化学修飾又はその任意の組合せを各々有する、センス鎖又はセンス領域及びアンチセンス鎖又はアンチセンス領域を含む。
一実施形態において、本発明は、センス領域を含む本発明の化学的に修飾された低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。）。
一実施形態において、本発明は、センス領域を含む本発明の化学的に修飾された低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、ＦＡＮＡピリミジンヌクレオチドである（例えば、全ピリミジンヌクレオチドはＦＡＮＡピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドはＦＡＮＡピリミジンヌクレオチドである。）。
一実施形態において、本発明は、アンチセンス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。）。
一実施形態において、本発明は、センス領域及びアンチセンス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域及びアンチセンス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。）。
一実施形態において、本発明は、センス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。）。
一実施形態において、本発明は、アンチセンス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。）。
一実施形態において、本発明は、センス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。）、センス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。）。
一実施形態において、本発明は、センス領域を含む本発明の化学的に修飾された低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、センス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり（例えば、全プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。）、前記センス領域中に存在する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
一実施形態において、本発明は、センス領域を含む本発明の化学的に修飾された低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、センス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）。
一実施形態において、本発明は、センス領域を含む本発明の化学的に修飾された低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、センス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである。）、前記センス領域中に存在する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
一実施形態において、本発明は、アンチセンス領域を含む本発明の化学的に修飾された低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、アンチセンス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである。）。
一実施形態において、本発明は、アンチセンス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、アンチセンス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである。）、前記アンチセンス領域中に存在する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
一実施形態において、本発明は、アンチセンス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、アンチセンス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。）。
一実施形態において、本発明は、アンチセンス領域を含む本発明の化学的に修飾された低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、アンチセンス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである。）。
一実施形態において、本発明は、センス領域及びアンチセンス領域を含む、細胞内で、又は再構成されたインビトロ系内でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る、本発明の化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する１個以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、センス領域中に存在する１個以上のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり（例えば、全プリンヌクレオチドは２−デオキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。）、アンチセンス領域中に存在する１個以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、アンチセンス領域中に存在する１個以上のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）。センス領域及び／又はアンチセンス領域は、センス及び／又はアンチセンス配列の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に存在してもよい、本明細書に記載の、又は図１０に示す、任意の修飾などの末端キャップ修飾を有し得る。センス及び／又はアンチセンス領域は、約１から約４（例えば、約１、２、３又は４）個の２’−デオキシヌクレオチドを有する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを更に含んでいてもよい。オーバーハングヌクレオチドは、１個以上の（例えば、約１、２、３、４又はそれを超える）ホスホロチオアート、ホスホノアセタート及び／又はチオホスホノアセタートヌクレオチド間結合を更に含み得る。これらの化学修飾ｓｉＮＡの非限定的例を本明細書の図４及び５並びに表ＩＩＩに示す。上記実施形態のいずれにおいても、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは、或いは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである。）、アンチセンス領域中に存在する１個以上のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）。また、これらの実施形態のいずれにおいても、センス領域中に存在する１個以上のプリンヌクレオチドは、或いは、プリンリボヌクレオチドであり（例えば、全プリンヌクレオチドはプリンリボヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドはプリンリボヌクレオチドである。）、アンチセンス領域中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである。）。さらに、これらの実施形態のいずれにおいても、センス領域中に存在する、及び／又はアンチセンス領域中に存在する、１個以上のプリンヌクレオチドは、或いは、２’−デオキシヌクレオチド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群から選択される（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群から選択され、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群から選択される。）。
別の実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子中に、好ましくは本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖中に、ただし場合によってはセンス鎖中及び／又はアンチセンスとセンスの両方の鎖中に、存在する任意の修飾ヌクレオチドは、天然リボヌクレオチドと類似した諸性質又は諸特性を有する修飾ヌクレオチドを含む。例えば、本発明は、「リボ様」又は「Ａ型ヘリックス」配置としても知られる、ノーザンコンホメーション（例えば、ノーザン擬回転サイクル。例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ｅｄ．，１９８４参照）を有する修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。したがって、本発明のｓｉＮＡ分子中に、好ましくは本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖中に、ただし場合によってはセンス鎖中及び／又はアンチセンスとセンスの両方の鎖中に、存在する化学修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡｉ媒介能力を同時に維持しながら、ヌクレアーゼ分解に耐性がある。ノーザン配置を有するヌクレオチドの非限定的例としては、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）；２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド；２’−メチル−チオ−エチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが挙げられる。
一実施形態において、本発明の二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子のセンス鎖は、反転デオキシ脱塩機（ａｂａｉｓｃ）部分などの末端キャップ部分を、センス鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含む（例えば、図１０参照）。
一実施形態において、本発明は、細胞内で、又は再構成されたインビトロ系内でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド分子（例えば、ｓｉＮＡ）を特徴とする。ここで、化学修飾は、化学修飾ｓｉＮＡ分子と共有結合した抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を含む。本発明で企図する抱合体の非限定的例としては、図面を含めて、参照によりその全体を本明細書に組み込む、２００３年４月３０日に出願された、Ｖａｒｇｅｅｓｅ他、ＵＳＳＮ１０／４２７，１６０に記載の抱合体及びリガンドが挙げられる。別の実施形態において抱合体は、生分解性リンカーを介して、化学修飾ｓｉＮＡ分子と共有結合している。一実施形態において抱合分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’末端で結合している。別の実施形態において抱合分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の５’末端で結合している。更に別の実施形態において抱合分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖若しくは両方の鎖又はその任意の組合せの３’末端と５’末端の両方で結合している。一実施形態において、本発明の抱合分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子を細胞などの生物系に送達するのを促進する分子を含む。別の実施形態において化学修飾ｓｉＮＡ分子と結合した抱合分子は、コレステロール、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン又は天然に存在するタンパク質リガンド由来のペプチドなどの細胞受容体に対するリガンド；細胞のＺＩＰコード配列を含めたタンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；葉酸塩、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどのビタミン及び他の補因子；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー；リン脂質；コレステロール；ステロイド及びＰＥＩ、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミンである。本発明で企図する、化学修飾ｓｉＮＡ分子と結合し得る具体的抱合分子の例は、参照により本明細書に組み込む、２００２年７月２２日に出願された、Ｖａｒｇｅｅｓｅ他、米国逐次番号１０／２０１，３９４号に記載されている。使用される抱合体のタイプ、及び本発明のｓｉＮＡ分子の抱合の程度は、ＲＮＡｉ活性を媒介するｓｉＮＡの能力を同時に維持しながら、ｓｉＮＡコンストラクトの改善された薬物動態学的プロファイル、生物学的利用能、及び／又は安定性について評価することができる。したがって、当業者は、例えば当分野で一般に公知である動物モデルにおいて、種々の抱合体で修飾されたｓｉＮＡコンストラクトをスクリーニングして、ｓｉＮＡ抱合複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）が、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持しながら、改善された諸性質を有するかどうかを判定することができる。
一実施形態において、本発明は、本発明の低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡは、ｓｉＮＡのセンス領域をｓｉＮＡのアンチセンス領域と連結する、ヌクレオチド、非ヌクレオチド又は混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーを更に含む。一実施形態においてヌクレオチド、非ヌクレオチド、又は混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーを使用して、例えば、抱合部分をｓｉＮＡと結合させる。一実施形態において、本発明のヌクレオチドリンカーは、≧２ヌクレオチド長、例えば、約３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド長のリンカーであり得る。別の実施形態においてヌクレオチドリンカーは核酸アプタマーであり得る。本明細書では「アプタマー」又は「核酸アプタマー」とは、標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味し、核酸分子は、その自然な状況において標的分子によって認識される配列を含む配列を有する。或いは、アプタマーは、標的分子が核酸と自然には結合しない場合、標的分子と結合する核酸分子であり得る。標的分子は、対象となる任意の分子であり得る。例えば、アプタマーを使用して、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合させることができ、それによって天然のリガンドとタンパク質の相互作用を防止することができる。これは非限定的例であり、当業者は、他の実施形態を当分野で一般に公知である技術によって容易に作製できることを認識されたい。（例えば、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３； Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，２０００，Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７４，５； Ｓｕｎ，２０００，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．，２，１００； Ｋｕｓｓｅｒ，２０００，Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，２７； Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，８２０及びＪａｙａｓｅｎａ，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，１６２８を参照されたい。）。
更に別の実施形態において、本発明の非ヌクレオチドリンカーは、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）又は他の重合体化合物（例えば、２から１００エチレングリコール単位を含むポリエチレングリコールなどのポリエチレングリコール）を含む。具体例としては、参照により本明細書に組み込む、Ｓｅｅｌａ ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９０，７５：６３５３及びＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９８７，１５：３１１３； Ｃｌｏａｄ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９１，１１３：６３２４； Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９１，１１３：５１０９； Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９３，２１：２５８５及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９３，３２：１７５１； Ｄｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９０，２５：６３５３； ＭｃＣｕｒｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９１，７０：２８７； Ｊｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９９３，３４：３０１； Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９１，３０：９９１４； Ａｒｎｏｌｄ他、国際公開第８９／０２４３９号；Ｕｓｍａｎ他、国際公開第９５／０６７３１号；Ｄｕｄｙｃｚ他、国際公開第９５／１１９１０号並びにＦｅｒｅｎｔｚ ａｎｄ Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９１，７７３：４０００に記載のものが挙げられる。「非ヌクレオチド」とは、糖置換及び／又はリン酸置換を含めて、１個又はそれ以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖に組み入れることができ、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡｉ活性を保持し又はＲＮＡｉ阻害剤がその阻害活性を保持するのを可能にする、任意の基又は化合物を更に意味する。この基又は化合物は、例えば糖のＣ１位に、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミンなどの一般に認識されているヌクレオチド塩基を含まない点で、脱塩基であり得る。
標的化部分
本発明の一実施形態において、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）剤の特性（その薬理学的特性を含む。）は、例えば、リガンド、例えば、係留されたリガンドの導入によって、影響を受け、調整され得る。多様な物質（例えば、リガンド）をｓｉＮＡ剤に、例えば、リガンド結合された単量体サブユニットの担体に係留させることができる。例は、リガンド結合された単量体サブユニットに関して以下に記載されており（但し、好ましいに過ぎない。）、物質は、ｓｉＮＡ剤の他の点に連結することができる。
好ましい実施形態において、リガンドである部分は、好ましくは共有結合によって、直接に又は介在する係留を介して間接に担体へ連結される。ある種の実施形態において、リガンドは、介在する係留を介して担体へ付着される。リガンドが結合された単量体が成長している鎖中に取り込まれると、リガンド又は係留されたリガンドは、リガンドが結合された単量体上に存在し得る。幾つかの実施形態において、「前駆体」リガンド結合された単量体サブユニットが成長している鎖中に取り込まれた後に、リガンドは、「前駆体」リガンド結合された単量体サブユニット中に取り込まれ得る。例えば、例えば、アミノ末端化された係留（例えば、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２）を有する単量体は、成長しているセンス又はアンチセンス鎖中に取り込まれ得る。その後の操作において、すなわち、前駆体単量体サブユニットの鎖中への取り込み後、リガンドの求電子性基をリガンド結合された前駆単量体サブユニット係留の末端の求核性基と結合することによって、続いて、求電子性基、例えば、ペンタフルオロフェニルエステル又はアルデヒド基を有するリガンドをリガンド結合された前駆体単量体に付着させることができる。
別の実施形態において、リガンドは、その中にリガンドが取り込まれる核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）の分布、標的化又は寿命を変化させる。ある種の実施形態において、リガンドは、例えば、このようなリガンドが存在しない種と比べて、選択された標的（例えば、分子、細胞又は細胞種）、区画（例えば、細胞又は臓器区画、身体の組織、臓器又は領域）に対して増強された親和性を与える。
好ましい実施形態において、リガンドは、輸送、ハイブリッド形成及び特異性特性を改善することができ、得られた天然の又は修飾されたオリゴリボヌクレオチド又は本明細書に記載されている単量体及び／又は天然又は修飾されたリボヌクレオチドのあらゆる組み合わせを含むポリマー性分子のヌクレアーゼ耐性も改善し得る。
一般に、リガンドは、例えば、取り込みを増強するための治療改変剤、例えば、分布をモニターするための診断化合物又はレポーター基、架橋剤、ヌクレアーゼ耐性付与部分及び天然の又は異常な核酸塩基を含むことができる。一般的な例には、親油性物質、脂質、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化されたリトコール酸）、ビタミン（例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビオチン、ピリドキサール）、炭水化物、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリン標的化分子、ポリカチオン物質、ペプチド、ポリアミン及びペプチド模倣物が含まれる。
別の実施形態において、リガンドには、天然に存在する物質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）又はグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン又はヒアルロン酸）、アミノ酸又は脂質を含むことができる。リガンドは、組み換え又は合成分子（合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸など）でもあり得る。ポリアミノ酸の例には、ポリアミノ酸が含まれ、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ポリ（Ｌ−ラクチド−コグリコリド）共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー又はポリホスファジンである。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、偽ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣物ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、陽イオン性部分（例えば、陽イオン性脂質、陽イオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩又はα螺旋ペプチド）が含まれる。
さらに別の実施形態において、リガンドには、標的誘導基、例えば、細胞又は組織標的誘導剤、例えば、肝細胞又は空腸の細胞などの特定の細胞種に結合する、レクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパク質（例えば抗体）が含まれ得る。標的誘導基は、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化されたポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホナート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、フォラート、ビタミンＢ１２、ビオチン又はＲＧＤペプチド若しくはＲＧＤペプチド模倣物であり得る。抗体は完全な抗体である必要はなく、その断片も含み得る。２００４年１１月１５日に出願された２００５／０２５０７２２、ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＡ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＳｙｋｍＲＮＡ配列に標的化されるＲＮＡｉコンストラクトの使用を含む方法を教示する、２００４年１１月１５日出願されたＵＳ２００５０２６７０５９を参照されたい。Ｓｏｎｇ Ｅ，Ｚｈｕ Ｐ，Ｌｅｅ Ｓ−Ｋ，Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ Ｄ，Ｋｕｓｓｍａｎ Ｓ，Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ ＤＭ，Ｆｅｎｇ Ｙ，Ｐａｌｌｉｓｅｒ Ｄ，Ｗｅｉｎｅｒ ＤＢ，Ｓｈａｎｋａｒ Ｐ，Ｍａｒａｓｃｏ ＷＡ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ Ｊ． Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｖｉａ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．２００６年６月１日に、インターネット上で公開されたＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００５； ９：３４７−３５１； Ｔｅｄ Ｃ． Ｃｈｕ，Ｋａｒｅｎ Ｙ． Ｔｗｕ，Ａｎｄｒｅｗ Ｄ． Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｍａｔｔｈｅｗ Ｌｅｖｙ，Ａｐｔａｍｅｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４：ｅ７３も参照されたい。
一実施形態において、リガンドの例には、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭水化物（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工のエンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、グリセロール（例えば、そのエステル及びエーテル、例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９又はＣ２０アルキル、例えば、１，３−ビス−Ｏ−（ヘキサデシル）グリセロール、１，３−ビス−Ｏ−（オクタデシル）グリセロール）、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸（ｃｈｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、ジメトキシトリチル又はフェノキサジン）及びペプチド連結物（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスファート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換されたアルキル、放射線標識されたマーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール連結物）、テトラアザ大環状分子のＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ又はＡＰが含まれる。
別の実施形態において、リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質又はペプチド、例えば、共リガンドに対して特異的な親和性を有する分子、又は抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞又は骨細胞などの特定の細胞種に結合する抗体であり得る。リガンドは、ホルモン及びホルモン受容体も含み得る。リガンドは、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース又は多価フコースなどの非ペプチド性の種も含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子又はＮＦ−ＫＢの活性化因子であり得る。
本発明の他の実施形態において、リガンドは、例えば、細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、微小繊維及び／又は中間繊維を破壊することによって、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）剤の細胞内への取り込みを増加させることができる物質、例えば、薬物であり得る。薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノライド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スウィンホライドＡ、インダノシン又はミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であり得る。ｓｉＲＮＡ剤の細胞内への取り込みを増加させることができるリガンドも、本発明の範囲に属する。
脂質又は脂質をベースとする分子も、想定されるリガンドである。このような脂質又は脂質をベースとする分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を結合し得る。例えば、ＨＳＡ結合リガンドは、連結物の標的組織（例えば、肝臓の実質性細胞を含む肝臓組織）への分布を可能とする。ＨＳＡを結合することができる他の分子も、リガンドとして使用することができる。例えば、ネプロキシン又はアスピリンを使用することができる。脂質又は脂質をベースとするリガンドは、（ａ）連結物の崩壊に対する耐性を増加させることができ、（ｂ）標的細胞又は細胞膜中への標的化又は輸送を増加させることができ、及び／又は（ｃ）血清タンパク質、例えばＨＳＡへの結合を調整するために使用することができる。例えば、ＲＮＡｉ剤を送達するための脂質をベースとする分子を提供する、２００４年７月１６日に出願されたＵＳ２００５／００６４５９５号及びその中に引用される参考文献を参照されたい。この公報の内容は、参照により、全体が本明細書中に組み込まれる。
脂質をベースとするリガンドは、標的組織への連結物の結合を調節するために、例えば制御するために使用することができる。例えば、ＨＳＡにより強く結合する脂質又は脂質をベースとするリガンドは、腎臓に標的化される可能性がより少なく、従って、身体から排除される可能性がより少ない。ＨＳＡにより弱く結合する脂質又は脂質をベースとするリガンドは、連結物を腎臓に標的化するために使用することができる。
本発明の別の実施形態において、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖している細胞によって取り込まれる部分、例えばビタミンである。これらは、例えば、悪性又は非悪性種の、例えば癌細胞の望ましくない細胞増殖によって特徴付けられる疾患を治療するのに特に有用である。典型的なビタミンには、ビタミンＡ、Ｅ及びＫが含まれる。他の典型的なビタミンは、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール又は癌細胞によって取り込まれる他のビタミン若しくは栄養素である。ＨＳＡ及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。
本発明の別の実施形態において、リガンドは、細胞浸透剤、好ましくは、らせん状細胞浸透剤である。一実施形態において、細胞浸透剤は両親媒性である。典型的な細胞浸透剤は、ｔａｔ又はアンテノペディアなどのペプチドである。細胞浸透剤がペプチドである場合には、ペプチジル模倣物、インベルトマー（ｉｎｖｅｒｔｏｍｅｒ）、非ペプチド又は偽ペプチド結合及びＤ−アミノ酸の使用など、修飾され得る。らせん状薬剤はα−らせん状薬剤であり、α−らせん状薬剤は好ましくは親油性相及び疎油性相を有する。
増殖細胞中に濃縮されたマーカーを標的とするペプチドも使用することができる。例えば、ＲＧＤ含有ペプチド及びペプチド模倣物は癌細胞、特に、αｖβ３インテグリンを提示する細胞を標的とすることができる。従って、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含有する環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド及び合成ＲＧＤ模倣物を使用することができる。ＲＧＤに加えて、αｖβ３インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞及び血管新生を調節するために使用することができる。この種の好ましい連結物には、ＰＥＣＡＭ−１、ＰＣＳＫ９又は他の癌遺伝子、例えば、本明細書に記載されている癌遺伝子を標的とする核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）剤が含まれる。
糖、例えば、ガラクトース及び／又はその類縁体を取り込む標的誘導剤は、特に有用である。これらの薬剤は、特に、肝臓の実質細胞を標的とする。例えば、標的化部分は、互いに約１５オングストローム離れた２以上の、又は、好ましくは、２若しくは３個のガラクトース部分を含み得る。あるいは、標的化部分は、ガラクトースに結合されたグルコースである乳糖（例えば、３つの乳糖部分）であり得る。標的化部分は、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−Ａｃ−グルコサミンでもあり得る。マンノース又はマンノース−６−リン酸標的化部分は、マクロファージ標的化のために使用することができる。
リガンドは、ペプチド又はペプチド模倣物であり得る。ペプチド模倣物（本明細書において、オリゴペプチド模倣物とも称される。）は、天然のペプチドと類似する確定された三次元構造へ折り畳むことができる分子である。ｉＲＮＡ剤へのペプチド及びペプチド模倣物の付着は、例えば、細胞の認識及び吸収を増強することによって、ｉＲＮＡの薬物動態学的分布に影響を及ぼすことができる。ペプチド又はペプチド模倣物部分は、約５から５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０又は５０アミノ酸長であり得る。
５’−リン酸の修飾
本発明のある種の実施形態において、ｓｉＲＮＡ剤は５’リン酸化されており、又は５’末端にホスホリル類縁体を含む。アンチセンス鎖の５’−リン酸修飾には、ＲＩＳＣによって媒介される遺伝子サイレンシングと適合的であるものが含まれる。適切な修飾には、５’−一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化された又はメチル化されていない）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）及び修飾された又は修飾されていない全てのキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオリン酸（ホスホロチオアート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノジチオリン酸（ホスホロジチオアート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオラート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄置換された一リン酸、二リン酸及び三リン酸のあらゆる更なる組み合わせ（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸など）、５’−ホスホルアミダート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルカリホスホナート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホナート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）が含まれる。
本発明の一実施形態において、センス鎖を不活化し、活性なＲＩＳＣの形成を妨げることによって、オフターゲット効果を潜在的に低減するために、センス鎖は修飾することも可能である。これは、センス鎖の５’−リン酸化を抑制する修飾によって、例えば、５’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドでの修飾によって達成することができる（Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＡＴＰ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｅｌｌ １０７，３０９−３２１参照）。リン酸化を抑制する他の修飾（例えば、Ｏ−ＭｅではなくＨによって、単に５’−ＯＨを置換する）も使用することができる。あるいは、大型の嵩高い基を５’−リン酸に添加し、これをホスホジエステル結合に変化させ得る。
一実施形態において、本発明は、細胞内で、又は再構成されたインビトロ系内でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、２個の別々のオリゴヌクレオチドから組み立てられるｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖は、リボヌクレオチドを含まない（例えば、ｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖は、１００％化学的に修飾される。）。例えば、ｓｉＮＡ分子は、単一のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、ｓｉＮＡのセンス及びアンチセンス領域は、オリゴヌクレオチド中に存在するリボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まない、別々のオリゴヌクレオチドを含む。別の例において、ｓｉＮＡ分子は、単一のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、ｓｉＮＡのセンス領域とアンチセンス領域は、本明細書に記載のヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーによって連結又は環化され、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中に存在するリボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まない。出願人は、驚くべきことに、ｓｉＮＡ分子内のリボヌクレオチド（例えば、２’ヒドロキシル基を有するヌクレオチド）の存在がＲＮＡｉ活性の維持に不要である、又は必須でないことを見出した。したがって、一実施形態において、ｓｉＮＡ内の全位置は、細胞中でＲＮＡｉ活性を維持するｓｉＮＡ分子の能力が持続する程度に、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ若しくはＶＩＩ又はその任意の組合せのヌクレオチド及び又は非ヌクレオチドなどの化学修飾ヌクレオチド及び／又は非ヌクレオチドを含むことができる。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（ｓｉＮＡ）分子は、標的核酸配列に対して相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含み、細胞又は再構成されたインビトロ系においてＲＮＡｉ活性を媒介する、一本鎖ｓｉＮＡ分子である。別の実施形態において、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は、５’末端リン酸基を含む。別の実施形態において、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は、５’末端リン酸基及び３’末端リン酸基を含む（例えば、２’，３’−環式リン酸）。別の実施形態において、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを含む。更に別の実施形態において、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載の１個以上の化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含む。例えば、ｓｉＮＡ分子内の全位置は、細胞中でＲＮＡｉ活性を維持するｓｉＮＡ分子の能力が持続する程度に、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せなどの化学修飾ヌクレオチドを含み得る。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、標的核酸配列に対して相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含み、細胞又は再構成されたインビトロ系において、ＲＮＡｉ活性を媒介する、又はＲＮＡｉ活性を交互に調節する、一本鎖ｓｉＮＡ分子である。ここで、ｓｉＮＡ中に存在する１個以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、アンチセンス領域中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである。）、アンチセンス配列の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に存在してもよい、本明細書に記載の、又は図１０に示す、任意の修飾などの末端キャップ修飾。ＳｉＮＡは、約１から約４又はそれを超える（例えば、約１、２、３、４又はそれを超える）末端２’−デオキシヌクレオチドをｓｉＮＡ分子の３’末端に更に含んでいてもよい。ここで、末端ヌクレオチドは、１個以上の（例えば、１、２、３、４又はそれを超える）ホスホロチオアート、ホスホノアセタート及び／又はチオホスホノアセタートヌクレオチド間結合を更に含み得、ｓｉＮＡは、５’末端リン酸基などの末端リン酸基を更に含んでいてもよい。これらの実施形態のいずれにおいても、アンチセンス領域中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、或いは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり、又は複数のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。）。また、これらの実施形態のいずれにおいても、ｓｉＮＡ中に存在する任意のプリンヌクレオチド（すなわち、センス及び／又はアンチセンス領域中に存在するプリンヌクレオチド）は、或いは、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドはＬＮＡヌクレオチドであり、又は複数のプリンヌクレオチドはＬＮＡヌクレオチドである。）。また、これらの実施形態のいずれにおいても、ｓｉＮＡ中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、或いは、２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドであり、又は複数のプリンヌクレオチドは２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドである。）。別の実施形態において、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在する任意の修飾ヌクレオチドは、天然リボヌクレオチドと類似した諸性質又は諸特性を有する修飾ヌクレオチドを含む。例えば、本発明は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎコンホメーション（例えば、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ擬回転サイクル。例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ｅｄ．，１９８４参照）を有する修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。したがって、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在する化学修飾ヌクレオチドは、好ましくは、ＲＮＡｉ媒介能力を同時に維持しながら、ヌクレアーゼ分解に耐性がある。
一実施形態において、本発明の化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、２個以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４ １５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれを超える）２’−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル）修飾又はその任意の組合せを有するセンス鎖又はセンス領域を含む。別の実施形態において、２’−Ｏ−アルキル修飾は、ｓｉＮＡのセンス鎖又はセンス領域中の、位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１など、又は位置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０などの交互の位置にある。
一実施形態において、本発明の化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、２個以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４ １５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれを超える）２’−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル）修飾又はその任意の組合せを有するアンチセンス鎖又はアンチセンス領域を含む。別の実施形態において、２’−Ｏ−アルキル修飾は、ｓｉＮＡのアンチセンス鎖又はアンチセンス領域中の、位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１など、又は位置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０などの交互の位置にある。
一実施形態において、本発明の化学修飾低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、２個以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４ １５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれを超える）２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ若しくは脱塩基化学修飾又はその任意の組合せを各々有する、センス鎖又はセンス領域及びアンチセンス鎖又はアンチセンス領域を含む。別の実施形態において、２’−Ｏ−アルキル修飾は、ｓｉＮＡのセンス鎖又はセンス領域中の、位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１など、又は位置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０などの交互の位置にある。別の実施形態において、２’−Ｏ−アルキル修飾は、ｓｉＮＡのアンチセンス鎖又はアンチセンス領域中の、位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１など、又は位置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０などの交互の位置にある。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、（例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドなどの式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの）化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、ｓｉＮＡ分子の１個以上の鎖又は領域内の交互の位置に含む。例えば、かかる化学修飾は、ｓｉＮＡの３’末端又は５’末端から第１又は第２のヌクレオチドで始まる、ＲＮＡベースのｓｉＮＡ分子の１つ置きの位置に導入することができる。非限定的例において、ｓｉＮＡの各鎖が２１ヌクレオチド長である、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、各鎖の位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１は、（例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドなどの式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの化合物で）化学修飾されている。別の非限定的例において、ｓｉＮＡの各鎖が２１ヌクレオチド長である、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、各鎖の位置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０は、（例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドなどの式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの化合物で）化学修飾されている。一実施形態において、二本鎖ｓｉＮＡ分子の１本の鎖は、位置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０の化学修飾、並びに位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１の化学修飾を含む。かかるｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載の末端キャップ部分及び／又は骨格修飾を更に含み得る。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は以下の特徴を含む。すなわち、プリンヌクレオチドが、ｓｉＮＡ分子の（ガイド配列又はガイド鎖とも称する）アンチセンス鎖又はアンチセンス領域の５’末端に（例えば、５’末端から１、２、３、４、５又は６位の末端ヌクレオチド位置のいずれかに）存在する場合には、かかるプリンヌクレオシドはリボヌクレオチドである。別の実施形態において、プリンリボヌクレオチドは、存在するときには、ｓｉＮＡ分子の（パッセンジャー鎖とも称する）センス鎖又はセンス領域のヌクレオチドと塩基対を形成する。かかるプリンリボヌクレオチドは、それ以外は修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ安定化モチーフ中に存在し得る。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は以下の特徴を含む。すなわち、ピリミジンヌクレオチドが、ｓｉＮＡ分子の（ガイド配列又はガイド鎖とも称する）アンチセンス鎖又はアンチセンス領域の５’末端に（例えば、５’末端から１、２、３、４、５又は６位の末端ヌクレオチド位置のいずれかに）存在する場合には、かかるピリミジンヌクレオシドはリボヌクレオチドである。別の実施形態において、ピリミジンリボヌクレオチドは、存在するときには、ｓｉＮＡ分子の（パッセンジャー鎖とも称する）センス鎖又はセンス領域のヌクレオチドと塩基対を形成する。かかるピリミジンリボヌクレオチドは、それ以外は修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ安定化モチーフ中に存在し得る。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は以下の特徴を含む。すなわち、ピリミジンヌクレオチドが、ｓｉＮＡ分子の（ガイド配列又はガイド鎖とも称する）アンチセンス鎖又はアンチセンス領域の５’末端に（例えば、５’末端から１、２、３、４、５又は６位の末端ヌクレオチド位置のいずれかに）存在する場合には、かかるピリミジンヌクレオシドは修飾ヌクレオチドである。別の実施形態において、修飾ピリミジンヌクレオチドは、存在するときには、ｓｉＮＡ分子の（パッセンジャー鎖とも称する）センス鎖又はセンス領域のヌクレオチドと塩基対を形成する。修飾ピリミジンヌクレオチドの非限定的例としては、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドなどの式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの修飾ピリミジンヌクレオチドが挙げられる。
一実施形態において、本発明は、構造ＳＩを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
Figure 2010503382
 式中、各Ｎは独立に非修飾であり得る又は化学的に修飾され得るヌクレオチドであり、各Ｂは存在しても、しなくてもよい末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］は、任意のプリンヌクレオチドが、存在するときには、リボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは独立に、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは独立に、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。
一実施形態において、本発明は、構造ＳＩＩを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
Figure 2010503382
 式中、各Ｎは独立にヌクレオチドであり、各Ｂは存在しても、しなくてもよい末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］は、任意のプリンヌクレオチドが、存在するときには、リボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドはリボヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、リボヌクレオチドであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。
一実施形態において、本発明は、構造ＳＩＩＩを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
Figure 2010503382
 式中、各Ｎは独立に非修飾であり得る又は化学的に修飾され得るヌクレオチドであり、各Ｂは存在しても、しなくてもよい末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］は、任意のプリンヌクレオチドが、存在するときには、リボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、リボヌクレオチドであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。
一実施形態において、本発明は、構造ＳＩＶを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
Figure 2010503382
 式中、各Ｎは独立に非修飾であり得る又は化学的に修飾され得るヌクレオチドであり、各Ｂは存在しても、しなくてもよい末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］は、任意のプリンヌクレオチドが、存在するときには、リボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。
一実施形態において、本発明は、構造ＳＶを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
Figure 2010503382
 式中、各Ｎは独立に非修飾であり得る又は化学的に修飾され得るヌクレオチドであり、各Ｂは存在しても、しなくてもよい末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］は、任意のプリンヌクレオチドが、存在するときには、リボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは、リボ様配置（例えば、ノーザン又はＡ型ヘリックス配置）のヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは、リボ様配置（例えば、ノーザン又はＡ型ヘリックス配置）のヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。
一実施形態において、本発明は、構造ＳＶＩを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
Figure 2010503382
 式中、各Ｎは独立に非修飾であり得る又は化学的に修飾され得るヌクレオチドであり、各Ｂは存在しても、しなくてもよい末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］は、アンチセンス鎖（下側の鎖）の５’末端をセンス鎖（上側の鎖）の５’末端よりも熱的に不安定にする配列を含むヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは独立に、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは独立に、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。
一実施形態において、本発明は、構造ＳＶＩＩを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
Figure 2010503382
 式中、各Ｎは独立に非修飾であり得る又は化学的に修飾され得るヌクレオチドであり、各Ｂは存在しても、しなくてもよい末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドであり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４に相補的であり、どの（Ｎ）ヌクレオチドも２’−Ｏ−メチル及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。
一実施形態において、本発明は、構造ＳＶＩＩＩを有する二本鎖核酸分子を特徴とする。
Figure 2010503382
 式中、各Ｎは独立に非修飾であり得る又は化学的に修飾され得るヌクレオチドであり、各Ｂは存在しても、しなくてもよい末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］はアンチセンス鎖（下側の鎖）の５’末端をセンス鎖（上側の鎖）の５’末端よりも熱的に不安定にする配列を含むヌクレオチド位置であり、［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約１５の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、Ｘ６は約１から約４の整数であり、Ｘ７は約９から約１５の整数であり、ＮＸ７、ＮＸ６及びＮＸ３は、ＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは独立に、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは、［Ｎ］ヌクレオチド以外の２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは独立に、［Ｎ］ヌクレオチド以外の、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。
一実施形態において、本発明は、構造ＳＩＸを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
Figure 2010503382
 式中、各Ｎは独立に非修飾であり得る又は化学的に修飾され得るヌクレオチドであり、各Ｂは存在しても、しなくてもよい末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは独立に、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは独立に、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。
一実施形態において、本発明は、構造ＳＸを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
Figure 2010503382
 式中、各Ｎは独立に非修飾であり得る又は化学的に修飾され得るヌクレオチドであり、各Ｂは存在しても、しなくてもよい末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドはリボヌクレオチドであり、センス鎖中に存在する任意のプリンヌクレオチド（上側の鎖）はリボヌクレオチドであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。
一実施形態において、本発明は、構造ＳＸＩを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
Figure 2010503382
 式中、各Ｎは独立に非修飾であり得る又は化学的に修飾され得るヌクレオチドであり、各Ｂは存在しても、しなくてもよい末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、リボヌクレオチドであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。
一実施形態において、本発明は、構造ＳＸＩＩを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
Figure 2010503382
 式中、各Ｎは独立に非修飾であり得る又は化学的に修飾され得るヌクレオチドであり、各Ｂは存在しても、しなくてもよい末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。
一実施形態において、本発明は、構造ＳＸＩＩＩを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
Figure 2010503382
 式中、各Ｎは独立に非修飾であり得る又は化学的に修飾され得るヌクレオチドであり、各Ｂは存在しても、しなくてもよい末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは、リボ様配置（例えば、ノーザン又はＡ型ヘリックス配置）のヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは、リボ様配置（例えば、ノーザン又はＡ型ヘリックス配置）のヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。
一実施形態において、本発明は、構造ＳＸＩＶを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
Figure 2010503382
 式中、各Ｎは独立に非修飾であり得る又は化学的に修飾され得るヌクレオチドであり、各Ｂは存在しても、しなくてもよい末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約１５の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、Ｘ６は約１から約４の整数であり、Ｘ７は約９から約１５の整数であり、ＮＸ７、ＮＸ６及びＮＸ３は、ＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは独立に、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは、［Ｎ］ヌクレオチド以外の２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは独立に、［Ｎ］ヌクレオチド以外の、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。
一実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、核酸分子のアンチセンス鎖又はアンチセンス領域の５’末端に末端リン酸基を含む。
一実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、Ｘ５＝１、２又は３；各Ｘ１及びＸ２＝ｌ又は２；Ｘ３＝１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０並びにＸ４＝１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０を含む。
一実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、Ｘ５＝１；各Ｘ１及びＸ２＝２；Ｘ３＝１９並びにＸ４＝１８を含む。
一実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、Ｘ５＝２；各Ｘ１及びＸ２＝２；Ｘ３＝１９並びにＸ４＝１７を含む。
一実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、Ｘ５＝３；各Ｘ１及びＸ２＝２；Ｘ３＝１９並びにＸ４＝１６を含む。
一実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、センス鎖又はセンス領域の３’及び５’末端にＢを含む。
一実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、アンチセンス鎖又はアンチセンス領域の３’末端にＢを含む。
一実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、センス鎖又はセンス領域の３’及び５’末端、並びにアンチセンス鎖又はアンチセンス領域の３’末端にＢを含む。
一実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、核酸分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の３’末端上の第１の末端（Ｎ）に、１個以上のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を更に含む。例えば、二本鎖核酸分子は、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合、例えば、（ＮｓＮ）を含むオーバーハングヌクレオチド位置を有する、Ｘ１及び／又はＸ２＝２を含み得る。ここで、「ｓ」はホスホロチオアートを示す。
一実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである（Ｎ）ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、２’−デオキシヌクレオチドである（Ｎ）ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、アンチセンス（下側の）鎖のＮ及び［Ｎ］ヌクレオチドに相補的である標的ポリヌクレオチド配列（例えば、ＰＣＳＫ９標的及び／又はＰＣＳＫ９経路標的配列）中のヌクレオチドに相補的である（Ｎ）ヌクレオチドをアンチセンス鎖（下側の鎖）中に含む。
一実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、標的ポリヌクレオチド配列の約１５から約３０ヌクレオチドの隣接ヌクレオチド配列（例えば、ＰＣＳＫ９標的及び／又はＰＣＳＫ９経路標的配列）を含む（Ｎ）ヌクレオチドをセンス鎖（上側の鎖）中に含む。
一実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、センス鎖の隣接（Ｎ）及びＮヌクレオチド配列が標的核酸配列（例えば、ＰＣＳＫ９標的及び／又はＰＣＳＫ９経路標的配列）のヌクレオチド配列を含むように、アンチセンス（下側の）鎖に相補的である標的ポリヌクレオチド配列（例えば、ＰＣＳＫ９標的及び／又はＰＣＳＫ９経路標的配列）に対応するヌクレオチド配列を含む（Ｎ）ヌクレオチドをセンス鎖（上側の鎖）中に含む。
一実施形態において、構造ＳＶＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子のセンス（上側の）鎖の５’末端のみにＢを含む。
一実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、不対末端ヌクレオチドをアンチセンス（下側の）鎖の５’末端に更に含む。不対ヌクレオチドは、センス（上側の）鎖と相補的でない。一実施形態において、不対の末端ヌクレオチドは、アンチセンス（下側の）鎖のＮ及び［Ｎ］ヌクレオチドに相補的である標的ポリヌクレオチド配列に相補的である。別の実施形態において、不対の末端ヌクレオチドは、アンチセンス（下側の）鎖のＮ及び［Ｎ］ヌクレオチドに相補的である標的ポリヌクレオチド配列に相補的でない。
一実施形態において、構造ＳＶＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、Ｘ６＝１及びＸ３＝１０を含む。
一実施形態において、構造ＳＶＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、Ｘ６＝２及びＸ３＝９を含む。
一実施形態において、本発明は、表ＶＩに示されている調合物の何れかとして、例えば、ＬＮＰ−０５１、ＬＮＰ−０５３、ＬＮＰ−０５４、ＬＮＰ−０６９、ＬＮＰ−０７３、ＬＮＰ−０７７、ＬＮＰ−０８０、ＬＮＰ−０８２、ＬＮＰ−０８３、ＬＮＰ−０６０、ＬＮＰ−０６１、ＬＮＰ−０８６、ＬＮＰ−０９７、ＬＮＰ−０９８、ＬＮＰ−０９９、ＬＮＰ−１００、ＬＮＰ−１０１、ＬＮＰ−１０２、ＬＮＰ−１０３又はＬＮＰ−１０４（表ＶＩ参照）のいずれかとして調合された、二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子又はＲＮＡｉ阻害剤を含む組成物を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、互いに相補的である第１の鎖と第２の鎖を各々有する、第１の二本鎖核酸分子と第２の二本鎖核酸分子とを含む組成物を特徴とする。ここで、第１の二本鎖核酸分子の第２の鎖は、第１の標的配列に相補的である配列を含み、第２の二本鎖核酸分子の第２の鎖は、第２の標的又は経路標的配列（例えば、ＰＣＳＫ９）に相補的である配列を含む。一実施形態において、組成物は、陽イオン性脂質、中性脂質及びポリエチレングリコール抱合体を更に含む。一実施形態において、組成物は、陽イオン性脂質、中性脂質、ポリエチレングリコール抱合体及びコレステロールを更に含む。一実施形態において、組成物は、ポリエチレングリコール抱合体、コレステロール及び界面活性剤を更に含む。一実施形態において、陽イオン性脂質は、ＣＬｉｎＤＭＡ、ｐＣＬｉｎＤＭＡ、ｅＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ及びＤＭＬＢＡからなる群から選択される。一実施形態において、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＯＢＡ及びコレステロールからなる群から選択される。一実施形態において、ポリエチレングリコール抱合体は、ＰＥＧ−ジミリストイルグリセリン及びＰＥＧ−コレステロールからなる群から選択される。一実施形態において、ＰＥＧは２ＫＰＥＧである。一実施形態において、界面活性剤は、パルミチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール及びリノレイルアルコールからなる群から選択される。一実施形態において、陽イオン性脂質はＣＬｉｎＤＭＡであり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ポリエチレングリコール抱合体は２ＫＰＥＧ−ＤＭＧであり、コレステロールはコレステロールであり、界面活性剤はリノレイルアルコールである。一実施形態において、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＳＰＣ、２ＫＰＥＧ−ＤＭＧ、コレステロール及びリノレイルアルコールは、それぞれ４３：３８：１０：２：７のモル比で存在する。
本明細書の実施形態のいずれにおいても、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡ干渉の阻害によって、１個以上の標的の発現を調節する。一実施形態において、ＲＮＡ干渉は、ＲＩＳＣによって媒介される標的の切断（例えば、ｓｉＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ干渉）である。一実施形態において、ＲＮＡ干渉は、標的の翻訳阻害（例えば、ｍｉＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ干渉）である。一実施形態において、ＲＮＡ干渉は、標的の転写阻害（例えば、ｓｉＲＮＡによって媒介される転写サイレンシング）である。一実施形態において、ＲＮＡ干渉は細胞質中で起こる。一実施形態において、ＲＮＡ干渉は核中で起こる。
本明細書の実施形態のいずれにおいても、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、内因性ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどの内因性標的ＲＮＡの阻害によって、又はＲＩＳＣの阻害によって、１個以上の標的の発現を調節する。
一実施形態において、本発明は、ｍｉＲＮＡ阻害、ｓｉＲＮＡ阻害又はＲＩＳＣ阻害によって、１個以上の遺伝子標的の発現を調節する１種類以上のＲＮＡｉ阻害剤を特徴とする。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ阻害剤は、１個以上の標的ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子に相補的である１本以上の鎖を有する、本明細書に記載の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子である。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ阻害剤は、標的ｍｉＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡ分子又はその一部に相補的であるアンチセンス分子である。本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤は、約１０から約４０ヌクレオチド長（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０ヌクレオチド長）の長さであり得る。本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤は、本明細書に記載の１個以上の修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含み得る（例えば、本明細書の式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの分子、又はその任意の組合せを参照されたい。）。一実施形態において、本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤は、１個以上又は全部の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含み得る。一実施形態において、本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤は、１個以上又は全部の２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含み得る。一実施形態において、本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤は、１個以上又は全部の（２’−メトキシエトキシ又はＭＯＥとしても知られる）２’−Ｏ−メトキシ−エチルヌクレオチドを含み得る。一実施形態において、本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤は、１個以上又は全部のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含み得る。一実施形態において、アンチセンスＲＮＡ阻害剤又は本発明は、アンチセンスＲＮＡ阻害剤の３’末端に、５’末端に、又は５’末端と３’末端の両方に末端キャップ部分を含み得る。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ阻害剤は、調節可能なアプタマーなど、ＲＩＳＣに対する結合親和性を有する核酸アプタマーである（例えば、Ａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，ＲＮＡ，１２：７１０−７１６参照）。本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤は、約１０から約５０ヌクレオチド長（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０ヌクレオチド長）の長さであり得る。本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤は、本明細書に記載の１個以上の修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含み得る（例えば、本明細書の式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの分子、又はその任意の組合せを参照されたい。）。一実施形態において、本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤は、１個以上又は全部の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含み得る。一実施形態において、本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤は、１個以上又は全部の２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含み得る。一実施形態において、本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤は、１個以上又は全部の（２’−メトキシエトキシ又はＭＯＥとしても知られる）２’−Ｏ−メトキシ−エチルヌクレオチドを含み得る。一実施形態において、本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤は、１個以上又は全部のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含み得る。一実施形態において、アプタマーＲＮＡ阻害剤又は本発明は、アプタマーＲＮＡ阻害剤の３’末端に、５’末端に、又は５’末端と３’末端の両方に末端キャップ部分を含み得る。
一実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾されていても、無修飾でもよい、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含む。）、及び（ｂ）細胞における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞内の標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾されていても、無修飾でもよい、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列は、標的ＲＮＡの配列と同一である、又はかなり類似した配列を含む。）、及び（ｂ）細胞における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞内の標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾されていても、無修飾でもよい、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含む。）、及び（ｂ）細胞における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞内の１個を超える標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾されていても、無修飾でもよい、本発明の１個以上のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列は、標的ＲＮＡの配列と同一である、又はかなり類似した配列を含む。）、及び（ｂ）細胞における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞内の２個以上の標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾されていても、無修飾でもよい、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列は、標的ＲＮＡの配列と同一である、又はかなり類似した配列を含む。）、及び（ｂ）細胞における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞内の１個を超える標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾されていても、無修飾でもよい、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、標的及び対応する調節物質遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列は、標的ＲＮＡの配列と同一である、又はかなり類似した配列を含む。）、及び（ｂ）細胞における標的及び対応する調節物質の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞内の標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えばｓｉＮＡ）分子は、生体外用途における試薬として使用される。例えば、ｓｉＮＡ試薬は、治療効果のために、対象に移植された組織又は細胞中に導入される。細胞及び／又は組織は、外植片をその後に移植される生物体又は対象から得ることができ、又は別の生物体又は対象から移植前に得ることができる。ｓｉＮＡ分子を使用して、細胞又は組織中の１個以上の遺伝子の発現を調節することができ、細胞又は組織は、所望の表現型を獲得し、又はインビボで移植したときに機能することができる。一実施形態において、患者由来のある種の標的細胞を採取する。採取されたこれらの細胞を、これらの細胞によるｓｉＮＡの取り込みに適切な条件下で（例えば、細胞中へのｓｉＮＡの送達を促進するために、陽イオン性脂質、リポソームなどの送達試薬を用いて、又は電気穿孔法などの技術を用いて）、細胞内の特定のヌクレオチド配列を標的にしたｓｉＮＡと接触させる。次いで、同じ患者又は他の患者に細胞を再導入する。
一実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含む。）、及び（ｂ）組織外植片における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、特定の生物体由来の組織外植片の細胞にｓｉＮＡ分子を導入することを含む、組織外植片における標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。別の実施形態において、この方法は、組織が得られた生物体に、又は別の生物体に、生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、組織外植片を戻すことを更に含む。
一実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列は、標的ＲＮＡの配列と同一である、又はかなり類似した配列を含む。）、及び（ｂ）組織外植片における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、特定の生物体由来の組織外植片の細胞にｓｉＮＡ分子を導入することを含む、組織外植片における標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。別の実施形態において、この方法は、組織が得られた生物体に、又は別の生物体に、生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、組織外植片を戻すことを更に含む。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含む。）、及び（ｂ）組織外植片における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、特定の生物体由来の組織外植片の細胞にｓｉＮＡ分子を導入することを含む、組織外植片中の１個を超える標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。別の実施形態において、この方法は、組織が得られた生物体に、又は別の生物体に、生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、組織外植片を戻すことを更に含む。
一実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含む。）、及び（ｂ）対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、ｓｉＮＡ分子を対象又は生物体に導入することを含む、対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。標的タンパク質又はＲＮＡのレベルは、当分野で周知の種々の方法によって求めることができる。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含む。）、及び（ｂ）対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、ｓｉＮＡ分子を対象又は生物体に導入することを含む、対象又は生物体における１個を超える標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。標的タンパク質又はＲＮＡのレベルは、当分野で公知のとおりに求めることができる。
一実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡは、標的遺伝子のＲＮＡに対して相補性を有する一本鎖配列を含む。）、及び（ｂ）細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞（例えば、肝臓又は脂肪組織細胞）内の標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡは、標的遺伝子のＲＮＡに対して相補性を有する一本鎖配列を含む。）、及び（ｂ）細胞における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、細胞をインビトロ又はインビボでｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、細胞（例えば、肝臓又は脂肪組織細胞）内の１個を超える標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡは、標的遺伝子のＲＮＡに対して相補性を有する一本鎖配列を含む。）、及び（ｂ）組織外植片における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、特定の対象又は生物体から得られた組織外植片の細胞をｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、組織外植片（（例えば、一生物体から別の生物体に移植することができる、又は器官、組織若しくは細胞が得られた同じ生物体に戻すことができる、肝臓又は任意の他の器官、組織又は細胞）における標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。別の実施形態において、この方法は、組織が得られた対象若しくは生物体に、又は別の対象若しくは生物体に、対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、組織外植片を戻すことを更に含む。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡは、標的遺伝子のＲＮＡに対して相補性を有する一本鎖配列を含む。）、及び（ｂ）組織外植片における標的遺伝子の発現を調節するのに適切な条件下で、特定の対象又は生物体から得られた組織外植片の細胞にｓｉＮＡ分子を導入することを含む、組織外植片（例えば、一生物体から別の生物体に移植することができる、器官、組織若しくは細胞が得られた同じ生物体に戻すことができる、肝臓又は任意の他の器官、組織又は細胞）における１個を超える標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。別の実施形態において、この方法は、組織が得られた対象若しくは生物体に、又は別の対象若しくは生物体に、対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、組織外植片を戻すことを更に含む。
一実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡは、標的遺伝子のＲＮＡに対して相補性を有する一本鎖配列を含む。）、及び（ｂ）組織外植片におけるＰＣＳＫ９標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、特定の対象又は生物体から得られた組織外植片の細胞をｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、組織外植片（（例えば、一生物体から別の生物体に移植することができる、又は組織若しくは細胞が得られた同じ生物体に戻すことができる、皮膚、毛髪、肺又は他の任意の組織又は細胞）における標的遺伝子（例えば、ＰＣＳＫ９）の発現を調節する方法を特徴とする。別の実施形態において、この方法は、組織が得られた対象若しくは生物体に、又は別の対象若しくは生物体に、対象又は生物体におけるＰＣＳＫ９標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、組織外植片を戻すことを更に含む。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡは、標的遺伝子のＲＮＡに対して相補性を有する一本鎖配列を含む。）、及び（ｂ）組織外植片における標的遺伝子の発現を調節するのに適切な条件下で、特定の対象又は生物体から得られた組織外植片の細胞にｓｉＮＡ分子を導入することを含む、組織外植片（例えば、一生物体から別の生物体に移植することができる、組織若しくは細胞が得られた同じ生物体に戻すことができる、皮膚、毛髪、肺又は任意の他の組織又は細胞）における１個を超える標的遺伝子（例えば、ＰＣＳＫ９）の発現を調節する方法を特徴とする。別の実施形態において、この方法は、組織が得られた対象若しくは生物体に、又は別の対象若しくは生物体に、対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、組織外植片を戻すことを更に含む。
一実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡは、標的遺伝子のＲＮＡに対して相補性を有する一本鎖配列を含む。）、及び（ｂ）対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、ｓｉＮＡ分子を対象又は生物体に導入することを含む、対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡは、標的遺伝子のＲＮＡに対して相補性を有する一本鎖配列を含む。）、及び（ｂ）対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、ｓｉＮＡ分子を対象又は生物体に導入することを含む、対象又は生物体における１個を超える標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節するのに適切な条件下で、対象又は生物体を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含む、対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。
別の実施形態において、本発明は、対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、対象又は生物体を１つ又はそれ以上の本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含む、対象又は生物体における２以上の標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡは、ＰＣＳＫ９遺伝子のＲＮＡに対して相補性を有する一本鎖配列を含む。）、及び（ｂ）対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、ｓｉＮＡ分子を対象又は生物体に導入することを含む、対象又は生物体における標的遺伝子（例えば、ＰＣＳＫ９）の発現を調節する方法を特徴とする。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡは、ＰＣＳＫ９遺伝子のＲＮＡに対して相補性を有する一本鎖配列を含む。）、及び（ｂ）対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、ｓｉＮＡ分子を対象又は生物体に導入することを含む、対象又は生物体における２以上の標的遺伝子（例えば、ＰＣＳＫ９）の発現を調節する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、対象又は生物体を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含む、対象又は生物体における標的遺伝子（例えば、ＰＣＳＫ９）の発現を調節する方法を特徴とする。
ＶＩＩ．核酸をベースとしたＲＮＡｉコンストラクトの送達
本発明のＲＮＡｉを実施するために核酸を送達するための適切な方法には、本明細書に記載されているように、又は当業者に公知であるように、細胞小器官、細胞、組織又は生物中に核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ（ウイルス及び非ウイルスベクターを含む。）を導入することができる実質的に全ての方法が含まれると考えられる。このような方法には、微小注射（Ｈａｒｌａｎ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５；米国特許第５，７８９，２１５号、参照により本明細書に組み込まれる。）を含む注射による（米国特許第５，９９４，６２４号；同第５，９８１，２７４号；同第５，９４５，１００号；同第５，７８０，４４８号；同第５，７３６，５２４号；同第５，７０２，９３２号；同第５，６５６，６１０号；同第５，５８９，４６６号及び同第５，５８０，８５９号（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。）；電気穿孔による（米国特許第５，３８４，２５３号、参照により本明細書に組み込まれる。）；リン酸カルシウム沈殿による（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ，１９７３； Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，１９８７；Ｒｉｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０）；ＤＥＡＥ−デキストランに続いてポリエチレングリコールを使用することによる（Ｇｏｐａｌ，１９８５）；直接的な音波負荷（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７）；リポソームによって媒介される形質移入による（Ｎｉｃｏｌａｕ ａｎｄ Ｓｅｎｅ，１９８２； Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９７９； Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７； Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８０； Ｋａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８９； Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）；微粒子銃（ＰＣＴ出願国際公開第９４／０９６９９号及び９５／０６１２８号；米国特許第５，６１０，０４２号；同第５，３２２，７８３号；同第５，５６３，０５５号；同第５，５５０，３１８号；同第５，５３８，８７７号及び同第５，５３８，８８０号、各々、参照により、本明細書に組み込まれる。）； 炭化ケイ素繊維での撹拌による（Ｋａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０；米国特許第５，３０２，５２３号及び同第５，４６４，７６５号、各々、参照により、本明細書に組み込まれる。）；アグロバクテリウムによって媒介される形質転換による（米国特許第５，５９１，６１６号及び同第５，５６３，０５５号、各々、参照により、本明細書に組み込まれる。）； 又はＰＥＧによって媒介される原形質体の形質転換による（Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３； 米国特許第４，６８４，６１１号及び同第４，９５２，５００、各々、参照により、本明細書に組み込まれる。）；乾燥／阻害によって媒介されるＤＮＡの取り込みによる（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５）などのＤＮＡの直接的な送達が含まれるが、これらに限定されない。これらのような技術の適用を通じて、細胞小器官、細胞、組織又は生物は、安定に又は一過性に形質転換され得る。
ｄｓＲＮＡを生成するために、発現ベクターが細胞内に導入され得る数多くの方法が存在する。本発明のある種の実施形態において、発現ベクターは、ウイルス又はウイルスゲノムから誘導される加工されたベクターを含むのに対して、他の実施形態において、発現ベクターは非ウイルスベクターである。他の発現系も容易に利用可能である。
感染症並びに他の疾病及び症状の予防及び治療などの目的のための、ヒト及び他の哺乳動物中でのＲＮＡｉの効果的な使用は、ＲＮＡｉ誘導性物質、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ誘導性ベクター（すなわち、細胞内におけるその存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの産生をもたらすベクター）を、その中で転写物の阻害剤が望まれる細胞へ効率的に送達することによって増強されることが当業者によって理解される。ヒトにおいて使用するために、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ誘導性ベクター（例えば、ＤＮＡベクター）などのＲＮＡｉ誘導性物質の細胞内取り込みを促進する非ウイルス法を使用することが好ましい場合があり得る。
これに従って、本発明の実施形態は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及び／又はＲＮＡｉ誘導性ベクターの細胞への増強された送達のために、様々な非ウイルス送達剤の何れかを含む組成物を提供する。本明細書に記載されている送達剤は、完全な状態のウイルスではなくＲＮＡ又はＤＮＡの送達を増強するために主として使用されることが予想されるが、後者の目的のためのそれらの使用は除外されない。
本明細書において使用される「送達」の広義の概念は、ＲＮＡｉ誘導性物質の細胞性取り込み及びｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを細胞内ＲＮＡｉ機構に対して利用可能とすることに関与するその後のあらゆる段階（例えば、エンドソームからのｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの放出）に加えて、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ誘導性ベクターなどのＲＮＡｉ誘導性物質を、体内へのその進入部位から、ＲＮＡｉ誘導性物質がその中で機能する細胞の位置へ輸送することを含む。一般に、本明細書に記載されている送達剤は、ＲＮＡ若しくはベクターの送達用ビヒクル若しくは担体としての役割を果たし、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを細胞内ＲＮＡｉ機構に対して利用可能とするプロセスにおける１つ若しくはそれ以上の工程を促進し、及び／又は体内でＲＮＡｉ誘導性物質を保護若しくは安定化するための補助をする。
一実施形態において、本発明は、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ転写物へ標的化される１つ又はそれ以上のＲＮＡｉ誘導性物質と並びに陽イオン性ポリマー、修飾された陽イオン性ポリマー、ペプチド分子輸送体（アルギニン又はヒスチジンが豊富なペプチドを含む。）、脂質（陽イオン性脂質、中性脂質及びこれらの組み合わせを含む。）、リポソーム、リポポリプレックス、非陽イオン性ポリマー、修飾された非陽イオン性ポリマー、クロロキン、ブピバカイン及び標的組織又は細胞中への導入に適した界面活性剤などの（但し、これらに限定されない。）様々な送達剤の何れかとを含む組成物を提供する。ある種の送達剤は、送達を増加させる、又はその中で特定の転写物が阻害されることが望まれる細胞への１つ又はそれ以上のＲＮＡｉ誘導性物質の選択的送達を増加させる部分を取り込むように修飾される。
本発明のある種の実施形態において、疾病若しくは症状又はこれらの症候は、異常なＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ発現、例えば、変異体ＰＣＳＫ９又はｍＲＮＡ転写物によってコードされるポリペプチドの異常な機能的活性と関連し、これらによって特徴付けられ、又はこれらを特徴とする。本発明の好ましい実施形態において、RNAi誘導性組成物の投与は、標的mＲＮＡ転写物、例えば、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡの発現を阻害し、これにより疾病を治療する。ある種の実施形態において、RNAi誘導性組成物の投与は、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ転写物を阻害し、これにより、組成物の投与前に比べてＬＤＬ発現を低下させる。従って、別の実施形態において、本発明は、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ転写物へ標的化されるＲＮＡｉ誘導性物質と並びに陽イオン性ポリマー、修飾された陽イオン性ポリマー、ペプチド分子輸送体（アルギニン又はヒスチジンが豊富なペプチドを含む。）、脂質（陽イオン性脂質、中性脂質及びこれらの組み合わせを含む。）、リポソーム、リポポリプレックス、非陽イオン性ポリマー、修飾された非陽イオン性ポリマー、クロロキン、ブピバカイン及び肺内への導入に適した界面活性剤からなる群から選択される送達剤を含む組成物を投与する工程を含む、細胞若しくは組織内のＰＣＳＫ９のレベルに媒介され若しくは関係し、又は細胞若しくは組織内のＰＣＳＫ９のレベルに応答する疾病又は症状を治療する方法を提供する。本発明の好ましい実施形態において、ＲＮＡｉ誘導性物質はｓｉＲＮＡである。ある種の好ましい実施形態において、ＲＮＡｉ誘導剤はｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ誘導性ベクターである。 発明のＲＮＡｉコンストラクト含有組成物は、高コレステロール血症、高リポタンパク血症Ｉ型、高リポタンパク血症ＩＩ型、高リポタンパク血症ＩＩＩ型、高リポタンパク血症ＩＶ型、高リポタンパク血症Ｖ型、続発性高トリグリセリド血症及び家族性レシチンコレステロールアシル転移酵素欠乏症を含む高脂血症；並びに冠動脈心疾患（ＣＨＤ）、脳血管疾患（ＣＶＤ）、大動脈狭窄、末梢血管疾患、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、心筋梗塞（心臓発作）、脳血管疾患（卒中）、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、狭心症（安定性及び不安定性）、心房細動、不整脈、弁膜症及び／又はうっ血性心不全又は他のあらゆる形質などの心血管疾患を予防し、阻害し、又は治療するために使用することができる。ある種の実施形態において、組成物は、単独で、又は他の治療法と組み合わせて投与することができる。
本発明のある種の好ましい実施形態において、前記組成物は、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡを発現する心臓の組織又は細胞へのＲＮＡｉ誘導性物質の強化された送達を与える。しかしながら、本明細書に記載されている様々な送達剤の効力は、特定の細胞種に限定されるものではない。従って、本発明の様々な実施形態は、体内のあらゆる細胞、組織又は実質臓器へのＲＮＡｉ誘導性物質の送達を包含する。本発明の様々な実施形態は、血管の壁中の細胞、例えば、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、マクロファージなどへの、及び血液自体の中の細胞、例えば、リンパ球、好中球などへのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ誘導性ベクターなどのＲＮＡｉ誘導性物質の送達も包含する。
（ｉ）陽イオン性ポリマー及び修飾された陽イオン性ポリマー−「Ｈａｎ，Ｓ． Ｏ．，ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２：３０２−３１７」は、陽イオン性ポリマーをベースとした系がＤＮＡ形質移入のための担体として効率的であることを報告した。ＤＮＡの細胞性取り込みを促進する陽イオン性ポリマーの能力は、一つには、陽イオン性ポリマーがＤＮＡに結合し、より効率的なエンドサイトーシスのために、巨大なプラスミドＤＮＡ分子をより小さなＤＮＡ／ポリマー複合体へ凝縮する能力に起因すると考えられるものと思われる。複数の研究者が、ＤＮＡ／陽イオン性ポリマー複合体は、細胞表面糖タンパク質の負に帯電したシアル酸残基とのそれらの静電的相互作用のために、生物接着物質としても作用することを提唱した。「Ｓｏａｎｅ，Ｒ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１７８：５５−６５ （１９９９）」を参照されたい。また、幾つかの陽イオン性ポリマーは、エンドソームの膜の破壊を促進し、従って、サイトゾル中へのＤＮＡの放出を促進するように見受けられる（Ｐｕｔｎａｍ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｙ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｂａｌａｎｃｅ ｏｆ ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎｉ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１２００−１２０５．３２ （２００１）。
従って、本発明の実施形態は、（ｉ）ＲＮＡｉ誘導性物質（核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）物質がＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ標的転写物へ標的誘導される。）及び（ｉｉ）陽イオン性ポリマーを含む組成物を提供する。さらに、本発明は、このような組成物を投与することによって標的転写物を阻害する方法を提供する。
一般に、陽イオン性ポリマーは、概ね生理的なｐＨ、例えば、約７．０から７．６の範囲のｐＨ、好ましくは約７．２から７．６の範囲の、より好ましくは約７．４のｐＨで正に帯電するポリマーである。このような陽イオン性ポリマーには、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン（ＰＬＡ）、ポリヒスチジン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｂｏｕｓｓｉｆ ｅｔ ａｌ，Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７２９７−７３０１ （１９９５））（例えば、「Ｋｕｎａｔｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ８９（１）：１１３−２５．７６ （２００３）」中に記載されているような直鎖ＰＥＩ及び低分子量ＰＥＩを含む。）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びキトサンが含まれるが、これらに限定されない。これらのポリマーの幾つかは、第一級アミン基、イミン基、グアニジン基及び／又はイミダゾール基を含むことが理解される。好ましい陽イオン性ポリマーは、比較的低い毒性及び高いＤＮＡ形質移入効率を有する。２００３年９月２９日に出願され、ＣｈｅｎＪｉａｎｚｈｕ他に付与された「ＵＳ２００５０００８６１７，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ａｎｄ ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ」（以下、’６１７特許出願）を参照されたい。引用されている各参考文献の全内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。
いかなる理論にも拘泥することを望むものではないが、ＰＥＩなどの陽イオン性ポリマーは、細胞表面の陰イオン性プロテオグリカンと相互作用し、エンドサイトーシスによって細胞内に入ることができる正に帯電した粒子へとＤＮＡを緻密化又は凝縮すると考えられる。このようなポリマーは、エンドソームのｐＨを緩衝化し、ＤＮＡを分解から保護する「プロトンスポンジ」として作用するという特性を有し得る。継続的なプロトンの流入は、エンドソームの浸透圧性膨潤及び破裂も誘導し、これは、ＤＮＡ粒子が細胞質へ散逸する機序を与える。これらの教示が本発明のＲＮＡｉ誘導性物質及びＤＮＡベクターに対しても等しく適用されることは、’６１７特許出願の教示から明確である。さらに、’６１７出願中の発明者らは、ｓｈＲＮＡの合成のためのテンプレートを与え、このような様々な薬剤を用いた標的転写物の阻害をもたらす、哺乳動物対象中の細胞へのｓｉＲＮＡ及びＤＮＡベクターの効果的な送達を具体的に示した。８５−８７；’６１７出願中に引用された米国特許第６，０１３，２４０号も参照されたい。同様に、ＷＯ９６０２６５５は、ＰＥＩ及び本発明の実施において有用な他の陽イオン性ポリマーに関するさらなる情報を提供する。本発明のある種の実施形態において、ｊｅｔＰＥＴＴＭとして知られる市販のＰＥＩ試薬（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）（ＰＥＩの直鎖形態（米国特許第６，０１３，２４０号））を使用し得る。
ある種の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ誘導性物質は、「水力学的形質移入」のような当業者に公知の技術を介して送達され得る。例えば、教示（例えば、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ，ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４１８，３８−３９ （２００２），ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１，６３９−６４４ （２００３）を参照されたい。）から明らかであるように、体内の実質臓器及び組織へ、ＲＮＡｉ誘導性物質を静脈内送達するためのこのような技術は公知であることが注目される。
様々なさらなる陽イオン性ポリマーも使用し得る。ジアクリラート及びアミン単量体から得られる新規陽イオン性ポリマー及びオリゴマーの巨大ライブラリーが開発され、ＤＮＡ形質移入において検査されている。例えば、「Ｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ，Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｄｅｇｒａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：８１５５−８１５６ （２００１）」は、７個のジアクリラート単量体と２０個のアミン単量体から得られる１４０のポリマーのライブラリーの開発を報告する。類似の又は同一の方法を用いて、より大きなライブラリーを作製することが可能である。このライブラリーの１４０のメンバーのうち、７０が十分に水溶性であることが見出された（２ｍｇ／ｍｌ、２５ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ＝５．０）。電気泳動移動度シフトによって示されたように、７０の水溶性ポリマーのうち５６がＤＮＡと相互作用した。最も重要なことに、５６のポリマーのうち２つがＣＯＳ−７細胞中へのＤＮＡ形質移入を媒介した。新規ポリマーの形質移入効率はＰＥＩより４から８倍高く、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と等しく、又はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００より優れていた。従って、別の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子及びポリ（β−アミノエステル（Ｌｙｎ上記を参照）である陽イオン性ポリマーを含む組成物並びにこのような組成物を投与することによって、標的遺伝子発現、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡを阻害する方法を提供する。上記ポリ（β−アミノエステル）は、Ｌａｎｇｅｒ他によって、２００２年９月１９日に出願され、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙ（ｂｅｔａ−ａｍｉｎｏ ｅｓｔｅｒｓ） ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ」という名称の公開された米国特許出願２００２０１３１９５１にさらに記載されている。ＲＮＡｉ誘導性物質の送達を促進するために使用するための陽イオン性ポリマーは、ポリマーを構成する主な単量体サブユニット以外の１つ又はそれ以上の残基を取り込むように修飾され得ることが注目される。例えば、ポリマーの末端に１つ若しくはそれ以上の別の残基を付加し得、又はポリマーはポリマーを構成する主な単量体以外の残基によって連結され得る。
同じくＲＮＡｉ誘導性物質の送達を強化するために使用し得るさらなる陽イオン性ポリマーには、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリラート（ｐＤＭＡＥＭＡ）並びにその第四級アミン類縁体ポリ（２−トリメチルアミノ）エチルメタクリラート（ｐＴＭＡＥＭＡ）、ポリ［ａ−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸（ＰＡＧＡ）及びポリ（４−ヒドロキシ−１−プロリンエステル）が含まれる。これらの薬剤のさらなる記述に関しては、Ｈａｎ（２０００）を参照されたい。’６１７出願を参照されたい。
（ｉｉ）ペプチド分子輸送体−ある種の実施形態において、本発明は、ペプチド分子輸送体とともに、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡに対して特異的である本明細書に記載されているＲＮＡ誘導性物質の何れか１つ又はそれ以上を含む組成物を提供する。研究者は、様々なペプチドが核酸に対する送達剤として作用することができることを示した。（本明細書において使用されるポリペプチドは、約５０アミノ酸長より短ければ「ペプチド」であると考えられる。）。例えば、ＨＩＶＴａｔタンパク質（Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ．Ｃｅｌｌ ５５：１１８９−１１９３，（１９８８））、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質（Ｅｌｌｉｏｔｔ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ａ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｅｌｌ ８８：２２３−２３３ （１９９７）及びドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のアンテナペディアタンパク質（Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｎｅｕｒａｌ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１８６４−１８６８ （１９９９））などの転写因子は、細胞表面から形質膜を透過することができる。膜透過のために必要なペプチドセグメントは１１から３４アミノ酸残基からなり、高度にアルギニンに富んでおり、しばしば、アルギニンリッチペプチド（ＡＲＰ）又はペネトラチンと称される。ずっと大きなポリペプチドと共有結合されると、ＡＲＰは、形質膜を横切って、融合されたポリペプチドを輸送することができる（Ｆａｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｔａｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：６６４−６６８（１９９４）；Ｓｃｈｗａｒｚｅ ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２ （１９９９） 及びＤｅｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｏｊａｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｔｈｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：８４−８７ （１９９８））。
同様に、オリゴヌクレオチドがＡＲＰに共有結合されると、オリゴヌクレオチドは、細胞によって、ずっと素早く取り込まれた。’６１７特許出願中の参考文献４９及び５０を参照されたい。また、最近の研究、「Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａｎ ａｂｕｎｄａｎｔ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｓ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：５８３６−５８４０ （２００１）」は、８つのアルギニンのポリマーが、この膜貫通輸送に十分であることを示した。陽イオン性ポリマーと同様に、ＡＲＰも正に帯電されており、ＲＮＡを結合できるようであり、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをＡＲＰに共有結合するために、おそらく不要であることが推測される。
従って、一実施形態において、本発明は、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ転写物へ標的化されるｓｉＲＮＡである少なくとも１つのＲＮＡｉ誘導性物質及びペプチド分子輸送体を含む組成物並びにこのような組成物を投与することによって標的転写物発現を阻害する方法を提供する。ペプチド分子輸送体には、参考文献４６から５１、１２０及び１３４から１３６に記載されているもの並びに’６１７特許出願に詳述されているような当業者に自明なこれらの変形物が含まれるが、これらに限定されない。アルギニンに富むペプチドには、アルギニン残基のみからなるペプチドが含まれる。
好ましいペプチド分子輸送体は、約５０アミノ酸長未満である。本発明のある種の実施形態において、ペプチド分子輸送体は約７と３４アミノ酸の間の長さを有するペプチドである。好ましいペプチドの多くはアルギニンに富む。本発明のある種の実施形態において、ペプチドが少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％のアルギニンを含めば、ペプチドはアルギニンに富む。本発明のさらに別の実施形態において、ペプチド分子輸送体は６と２０アルギニン残基の間を含むアルギニンに富むペプチドである。さらに別の実施形態において、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ誘導性物質とペプチド分子輸送体とは共有結合されるのに対して、本発明の別の実施形態において、ＲＮＡｉ誘導性物質とペプチド分子輸送体は一緒に混合されるが、互いに共有結合されない。
さらに別の実施形態において、本発明は、ペプチド分子輸送体としてヒスチジンに富むペプチドを特徴とする。「Ｋｉｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｒｉｃｈ ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１８； １００（４）：１５６４−８ （２００３）」を参照されたい。ヒスチジンに富むペプチドは、アルギニンに富むペプチドに関して記載されているようなヒスチジン残基の長さ及びパーセントを呈し得る。従って、本発明の一実施形態は、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ転写物へ標的化される少なくとも１つのＲＮＡｉ誘導性物質及びヒスチジンに富むペプチドを含む組成物並びにこのような組成物を投与することによって標的転写物の発現を阻害する方法を提供する。
対象中の細胞へのＲＮＡｉ誘導性物質の送達を促進するさらなるペプチド又は修飾されたペプチドも、本発明の組成物中で使用され得る。例えば、リジンに富むペプチドのファミリーを記載する「ＭｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｏｔｅｎｔ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｒｅｄｕｃｔｉｖｅｌｙ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ａｇｅｎｔｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５（１４）：９９７０−９９７７（２０００）」を参照されたい。ジスルフィド結合の形成のためのスルフヒドリル残基を含むペプチドがポリエチレングリコール（ＥＰＧ）（血清タンパク質への非特異的な結合を減少させると考えられている。）を取り込み得ることを記載する「Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１３：２３２−２３９ （２００２））も参照されたい。
ガラクトース又はマンノース残基などの部分を含む糖ペプチドは、本発明に従って、ＲＮＡｉ誘導性物質の選択的取り込みを増強させるためにも使用され得る。このような糖ペプチドは、ジスルフィド結合の形成用のスルフヒドリル基も含み得る。Ｐａｒｋｓら上記。さらに、本発明は、細胞内小胞からの核酸の排出を増強する様々な薬剤の投与を包含する。このような薬剤には、例えば、「Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｅ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｖｉａ ｔｈｅ ｐｏｒｔａｌ ｖｅｉｎ ａｎｄ ｂｉｌｅ ｄｕｃｔ．Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．，５：２０９−２１８，２００３」に詳述されているようなクロロキン及び「Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ Ｃ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ＤＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｌｏｃａｌ ａｎｅｓｔｈｅｔｉｃ ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４６８：２０−３０（２０００）」に詳述されているようなブピバカインが含まれる。排出増強剤は、全身的に、経口的に及び／又は局所的に（例えば、作用の所望される部位に又はその近くに）投与され得る。排出増強剤は、ＲＮＡｉ誘導物質と一緒に又は別個に送達され得る。
本発明は、送達剤の細胞内への輸送を促進するためのペプチド分子輸送体を取り込むために、本明細書に記載されている他の送達剤（例えば、ポリマー性送達剤）の修飾を包含する。
Ｃ．さらなるポリマー性送達剤
ある種の実施形態において、本発明は、ＲＮＡｉ誘導性物質及び上記のものに加えて、修飾されたポリマーを含む様々なポリマー性送達剤の何れかを含む組成物を提供する。さらに、本発明は、細胞中でのＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ転写物の発現を阻害する方法及びＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ又はそのコードされるタンパク質によって伴われる又は媒介される疾病又は症状を治療又は予防する方法を提供する。
適切な送達剤には、細胞へのＤＮＡの送達を増強することが示されている様々な薬剤が含まれる。これらには、上述されているものなどの陽イオン性ポリマーの修飾された様式、例えば、ポリ（Ｌ−ヒスチジン）−グラフト−ポリ（Ｌ−リジン）ポリマー（Ｂｅｎｎｓ ｅｔ ａｌ，ｐＨ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｈｉｃｌｅ：Ｎ−Ａｃ−ｐｏｌｙ（Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）−ｇｒａｆｔ−ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ） Ｃｏｍｂ Ｓｈａｐｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１１：６３７−６４５（２０００））、ポリヒスチジン−ＰＥＧ（Ｐｕｔｎａｍ ｅｔ ａｌ，Ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ＰＥＧ：ＤＮＡ ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４：４４２５−４４３３（２００３））、ホラート−ＰＥＧ−グラフト−ポリエチレンイミン（Ｂｅｎｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｆｏｌａｔｅ− ＰＥＧ−ｆｏｌａｔｅ−ｇｒａｆｔ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ，Ｊ．Ｃｏｎｔ．Ｒｅｌｅａｓｅ７９：２５５−２６９（２００２））、ポリエチレンイミン−デキストランサルファート（Ｔｉｙａｂｏｏｎｃｈａｉ ｅｔ ａｌ，Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｍｉｍｉｎｅ−ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９：１９１−２０２（２００３））が含まれる。ポリマーは分岐又は直鎖であり得、グラフトされていてもよく、又はグラフトされていなくてもよい。
ある種の実施形態において、ポリマーはＲＮＡｉ誘導性物質と複合体を形成し、次いで、これは対象に投与される。複合体は、ナノ粒子又はナノ複合材料と称され得る。ポリマーの何れもが、補体活性化及び他の血漿タンパク質の結合を低下させるのに有用であるＰＥＧ又は他の親水性ポリマーを取り込むように修飾され得る。陽イオン性ポリマーには、複数の修飾を施し得る。例えば、陽イオン性ポリマーは、ポリマーの負電荷を低下させる部分（例えば、イミダゾール）を取り込むように修飾され得、ＰＥＧなどの第二の部分でさらに修飾され得る。
さらに、上記陽イオン性ポリマーとは異なる様々なポリマー及びポリマーマトリックスも使用し得る。このようなポリマーには、多数の非陽イオン性ポリマー、すなわち、生理的ｐＨで陽性電荷を有しないポリマーが含まれる。このようなポリマーは、ある種の利点、例えば、低下した細胞毒性を有し得、幾つかの事例では、ＦＤＡの承認を有し得る。多数の適切なポリマーが、他の文脈において薬物及び遺伝子送達を増強することが示されている。このようなポリマーには、例えば、本発明のＲＮＡｉ誘導性物質を送達するためのナノ粒子へ調合され得る、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）（ＰＬＧ）及びポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）（ＰＬＧＡ）（Ｐａｎｙａｍ ｅｔ ａｌ，Ｒａｐｉｄ ｅｎｄｏ−ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ ｏｆ ｐｏｌｙ（ＤＬ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌ− ｉｄｅ） ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１６：１２１７−１２２６ （２００２））が含まれる。先述のものの共重合体及び組み合わせも使用し得る。本発明のある種の実施形態において、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ミクロＲＮＡ又はベクターを凝縮するために、陽イオン性ポリマーが使用され、凝縮された複合体はＰＬＧＡ又は別の非陽イオン性ポリマーによって保護される。使用され得る他のポリマーには、ポリビニルアルコール、又はＰｌｕｒｏｎｉｃ８５と複合体化され得るポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジウムブロミド）などの非凝縮ポリマーが含まれる。本発明において使用する他のポリマーには、陽イオン性と非陽イオン性ポリマーの間の組み合わせが含まれる。例えば、ポリ（乳酸・コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）グラフト化されたポリ（Ｌ−リジン）（Ｊｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）−ｇ−ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌ− ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ） ｍｉｃｅｌｌｅｓ ｆｏｒ ｌｏｗ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｃａｒｒｉｅｒｓ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，８２（１）：１５９−６６ （２００２））並びにＰＬＡ、ＰＬＧ又はＰＬＧＡ及び上述のような陽イオン性ポリマー又は修飾された陽イオン性ポリマーの何れかを含む他の組み合わせを使用し得る。
Ｄ．標的化部分を取り込む修飾された送達剤
本発明は、細胞への送達剤の送達を強化し、及び／又はその中で標的転写物を阻害することが望まれる細胞への送達剤の選択的送達を強化する部分を取り込むための送達剤の何れかの修飾も包含する。このような薬剤は、「送達強化剤」又は「標的化部分」と称される。
（ｉ）その中で阻害が望まれる細胞（例えば、呼吸器上皮細胞）によって発現される分子に特異的に結合する抗体又は抗体断片、（ｉｉ）その中で阻害が望まれる細胞によって発現される分子に特異的に結合するリガンドを含む（但し、これらに限定されない。）様々な標的化部分の何れをも使用し得る。
本発明のある種の好ましい実施形態において、抗体又はリガンドの結合は結合された複合体の内部移行を誘導する。本発明のある種の実施形態において、送達を増加し、又は選択性を強化するために、送達強化剤（例えば、抗体、抗体断片又はリガンド）は、ＲＮＡｉ誘導性ベクター（例えば、ＤＮＡベクター）に連結される。核酸に又は本明細書に記載されている様々な送達剤に抗体又はリガンドを連結するための方法は、本分野において周知である。例えば、１９９４−９５ＰｉｅｒｃｅＣａｔａｌｏｇに最初に公開された「“Ｃｒｏｓｓ− Ｌｉｎｋｉｎｇ”，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ及びその中に引用されている参考文献並びに「Ｗｏｎｇ Ｓ Ｓ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣＰｒｅｓｓＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９１」を参照されたい。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物中での標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、対象又は生物を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象又は生物中でのＰＣＳＫ９遺伝子発現又はＰＣＳＫ９活性に関連する疾病、疾患、形質又は症状を治療又は予防する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物体におけるＰＣＳＫ９遺伝子発現の阻害剤の発現を調節するのに適切な条件下で、対象又は生物体を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含む、対象又は生物体における１つ又はそれ以上の代謝性疾患、形質又は症状を治療又は予防する方法を特徴とする。一実施形態において、ＰＣＳＫ９遺伝子発現の阻害剤はｍｉＲＮＡである。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物中でのＰＣＳＫ９標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、対象又は生物を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含む、対象又は生物中の１つ又はそれ以上の代謝性疾患、形質又は症状を治療又は予防する方法を特徴とし、該方法によって、代謝性疾患、形質又は症状の治療又は予防を達成することができる。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物中でのＰＣＳＫ９標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、対象又は生物を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含む、対象又は生物中の１つ又はそれ以上の心血管疾患、形質又は症状を治療又は予防する方法を特徴とし、該方法によって、心血管疾患、形質又は症状の治療又は予防を達成することができる。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物中での標的遺伝子発現の阻害剤の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適した条件下で、対象又は生物を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含む、対象又は生物中の１つ又はそれ以上の心血管疾患、形質又は症状を治療又は予防する方法を特徴とする。一実施形態において、標的遺伝子発現の阻害剤はｍｉＲＮＡである。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物中でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、対象又は生物を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含む、対象又は生物中の高血圧を治療又は予防する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物中でのＰＣＳＫ９の発現を調節するのに適した条件下で、対象又は生物を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含む、対象又は生物中の冠動脈血栓を治療又は予防する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物中でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、対象又は生物を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含む、対象又は生物中の卒中を治療又は予防する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物中でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、対象又は生物を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含む、対象又は生物中の脂質症候群（ｌｉｐｉｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を治療又は予防する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物中でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、対象又は生物を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含む、対象又は生物中の高血糖を治療又は予防する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物中でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、対象又は生物を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含む、対象又は生物中の高トリグリセリド血症を治療又は予防する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物中でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、対象又は生物を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含む、対象又は生物中の高脂血症を治療又は予防する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物中でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、対象又は生物を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含む、対象又は生物中の虚血を治療又は予防する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物中でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、対象又は生物を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含む、対象又は生物中のうっ血性心不全を治療又は予防する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物中でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、対象又は生物を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含む、対象又は生物中の心筋梗塞を治療又は予防する方法を特徴とする。
別の実施形態において、本発明は、対象又は生物を本発明の１つ又はそれ以上の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させること、関連する組織又は細胞、例えば、肝臓、膵臓、小腸、脂肪組織又は疾患、形質若しくは症状に関与する細胞及び組織などへの局所投与を介して、本発明のｓｉＮＡ分子と代謝又は生物を接触させることを含む、対象又は生物中での２以上の標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。一実施形態において、本発明は、対象又は生物中での代謝性及び／又は心血管疾患、形質若しくは症状の維持又は発達に関与する組織又は細胞などの関連する組織又は細胞に（ｓｉＮＡの静脈内、筋肉内、皮下又はＧＩ投与を介するなど）全身投与を介して、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。本発明のｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体における適切な組織又は細胞を標的にするために、本明細書に記載するとおりに、又はその他当分野で公知のとおりに、処方又は連結することができる。ｓｉＮＡ分子は、対象又は生物中の心血管疾患、形質、疾患又は症状の治療又は予防のための、本分野で公知であるその他の治療的処置及び様式と組み合わせることができる。一実施形態において、心血管疾患は、高血圧、冠動脈血栓、発作、脂質症候群、高血糖、高トリグリセリド血症、高脂血症、虚血、うっ血性心不全及び心筋梗塞からなる群から選択される。
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子又は二本鎖核酸分子は、米国仮特許出願第６０／６７８，５３１号、及び２００５年７月２９日に出願された、関係する米国仮特許出願第６０／７０３，９４６号、２００５年１１月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／７３７，０２４号（Ｖａｒｇｅｅｓｅ他）に記載されている組成物として処方される。
細胞、対象又は生物において、１つ若しくはそれ以上のＰＣＳＫ９標的の発現を調節するための、又はＰＣＳＫ９関連疾患、形質、症状若しくは表現型を治療若しくは予防するための本明細書の方法の何れにおいても、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、ＲＮＡ干渉を介して、１つ又はそれ以上のＰＣＳＫ９標的の発現を調節する。一実施形態において、ＲＮＡ干渉は、ＲＩＣＳによって媒介されるＰＣＳＫ９標的の切断（例えば、ｓｉＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ干渉）である。一実施形態において、ＲＮＡ干渉は、ＰＣＳＫ９標的の翻訳の阻害（例えば、ｍｉＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ干渉）である。一実施形態において、ＲＮＡ干渉は、ＰＣＳＫ９標的の転写の阻害（例えば、ｓｉＲＮＡによって媒介される転写サイレンシング）である。一実施形態において、ＲＮＡ干渉は細胞質中で起こる。一実施形態において、ＲＮＡ干渉は核内で起こる。
本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、種々の核酸分子のＲＮＡｉターゲティングによって、標的（例えば、ＰＣＳＫ９）遺伝子発現を下方制御又は阻害するように設計することができる。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子を用いて、例えば異質染色質サイレンシング又は転写阻害によって、標的遺伝子に対応する種々のＤＮＡを標的にする。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子を用いて、例えばＲＮＡ標的切断又は翻訳阻害によって、標的遺伝子に対応する種々のＲＮＡを標的にする。かかるＲＮＡの非限定的例としては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、又はｍｉＲＮＡ及び他の低分子ＲＮＡを含む調節エレメント（例えば、Ｍａｔｔｉｃｋ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２７−１５２８及びＣｌａｖｅｒｉｅ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２９−１５３０参照）、標的遺伝子の代替ＲＮＡスプライスバリアント、標的遺伝子の転写後修飾ＲＮＡ、標的遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡ、及び／又はＲＮＡテンプレートが挙げられる。代替（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）スプライシングによって、適切なエキソンを用いて区別される転写物ファミリーが生成する場合には、本発明によって適切なエキソンを介して遺伝子発現を阻害して、遺伝子ファミリーメンバーの機能を特異的に阻害する、又は区別することができる。例えば、選択的にスプライスされた膜貫通領域を含むタンパク質は、膜結合型と分泌型の両方で発現され得る。膜貫通領域を含むエキソンを標的にするために本発明を使用して、タンパク質の分泌型に対立するものとして、膜結合型の薬剤ターゲティングの機能的結果を判定することができる。これらのＲＮＡ分子のターゲティングに関係した本発明の非限定的適用例としては、治療薬剤用途、化粧品用途、獣医学用途、創薬用途、分子診断及び遺伝子機能用途、並びに、例えば本発明のｓｉＮＡ分子を用いた一塩基多型マッピングによる、遺伝子地図が挙げられる。かかる適用例は、公知の遺伝子配列を用いて、又は発現配列タグ（ＥＳＴ）から利用可能な部分配列から、実施することができる。
別の実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を用いて、相同配列を有するＰＣＳＫ９ファミリー遺伝子（例えば、全ての公知のＰＣＳＫ９イソタイプ、またはＰＣＳＫ９イソタイプの選択されたグループ）などの遺伝子ファミリーに対応する保存配列を標的にする。したがって、複数のＰＣＳＫ９遺伝子又はＲＮＡ標的を標的にしたｓｉＮＡ分子によって、治療効果を増大させることができる。さらに、他のＰＣＳＫイソタイプを避けることによって、毒性が回避され得る。
別の実施形態において、本発明の酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、１つ又は複数の遺伝子ファミリー（ＰＣＳＫ９ファミリー遺伝子など）に対応する保存された配列を標的化するために使用される。例えば、本発明は、標的化される受容体遺伝子の保存された配列を標的化することによって、単一のｓｉＮＡ分子を用いて、２以上のＰＣＳＫ９遺伝子配列を標的化すること（切断又は発現若しくは機能の阻害）を特徴とする。従って、複数のＰＣＳＫ９標的を標的とするｓｉＮＡ分子は、増大した治療効果を与え得る。
一実施形態において、種々の用途における遺伝子機能の経路を特徴づけるために、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を使用することができる。例えば、経路中の標的遺伝子の活性を阻害して、遺伝子機能分析、ｍＲＮＡ機能分析又は翻訳分析において、特徴づけられていない遺伝子の機能を明らかにするために、本発明を使用することができる。、薬剤開発に向かって、種々の疾患及び症状に関与する標的遺伝子経路候補を決定するために、本発明を使用することができる。、例えば、対象又は生物中の、例えばＰＣＳＫ９遺伝子発現又は活性と関連する代謝性及び／又は心血管疾病、疾患、形質及び症状の進行及び／又は維持に関与する遺伝子発現の経路を理解するために、本発明を使用することができる。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子及び／又は方法は、Ｇｅｎｂａｎｋ受付によって参照されるＲＮＡをコードする遺伝子、例えば、表Ｉに示されているＧｅｎｂａｎｋ受付番号又はＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８号、米国仮特許出願第６０／３６３，１２４号又はＵＳＳＮ１０／９２３，５３６号（これらの全てが、参照により、本明細書に組み込まれる。）に示されているＧｅｎｂａｎｋ受付番号によって本明細書で参照されるＲＮＡ配列をコードする標的遺伝子の発現を下方制御するために使用される。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節するのに適切な条件下で、対象又は生物体を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含み、それによって代謝の疾患、形質又は症状を治療又は予防を達成することができる、対象又は生物体における１つ又はそれ以上の代謝の疾患、形質又は症状を治療又は予防する方法を特徴とする。一実施形態において、本発明は、関連する組織又は細胞への局所投与を介して、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。一実施形態において、本発明は、対象又は生物体（例えば、肝臓、すい臓、小腸、脂肪の組織又は細胞）における代謝の疾患、形質又は症状の持続又は発生に関与する組織又は細胞など、関連する組織又は細胞に（ｓｉＮＡの静脈内、筋肉内、皮下、ＧＩ投与などによって）全身投与することによって、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。本発明のｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体（例えば、肝臓、すい臓、小腸、脂肪の組織又は細胞）における適切な組織又は細胞を標的にするために、本明細書に記載するとおりに、又は当分野で公知のとおりに、処方又は抱合することができる。ｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体における代謝の疾患、形質又は症状の治療又は予防のための当分野で公知の他の治療処置及び様式と組み合わせることができる。一実施形態において、代謝性疾患は、糖尿病（例えば、Ｉ型及び／又はＩＩ型糖尿病）、インスリン抵抗性、肥満、又は睡眠時無呼吸、裂孔ヘルニア、逆流性食道炎（ｅｓｏｐｈａｇｉｓｉｔｉｓ）、骨関節炎、痛風、体重増加に関連した癌、胆石症、腎結石、肺高血圧症、不妊症、循環器疾患、正常値を超える重量、及び正常値を超える脂質レベル、尿酸レベル若しくはシュウ酸塩レベルを含めて、ただしこれらだけに限定されない関連症状からなる群から選択される。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節するのに適切な条件下で、対象又は生物体を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含み、それによって減量することができる、対象又は生物体における減量方法を特徴とする。一実施形態において、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば、肝臓、すい臓、小腸、脂肪の組織又は細胞に局所投与することによって、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。一実施形態において、本発明は、関連する組織又は細胞に（ｓｉＮＡの静脈内、筋肉内、皮下、ＧＩ投与などによって）全身投与することによって、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。本発明のｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体における適切な組織又は細胞を標的にするために、本明細書に記載するとおりに、又は当分野で公知のとおりに、処方又は抱合することができる。ｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体における減量のための当分野で公知の他の治療処置及び様式と組み合わせることができる。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物体における標的遺伝子（例えば、ＰＣＳＫ９）の発現を調節するのに適切な条件下で、対象又は生物体を本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子と接触させることを含み、これによって代謝性及び／又は心血管疾病、疾患及び／又は症状の治療又は予防を達成することができる、対象又は生物体における心血管疾病、疾患及び／又は症状を治療又は予防する方法を特徴とする。一実施形態において、本発明は、関連する組織又は細胞（代謝性及び／又は心血管疾病、疾患又は症状によって冒された組織又は細胞など）への局所投与を介して、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。一実施形態において、本発明は、代謝性及び／又は心血管疾病、疾患又は症状によって冒された組織又は細胞などの関連する組織又は細胞に（ｓｉＮＡの静脈内又は皮下投与などによって）全身投与することによって、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。本発明のｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体における適切な組織又は細胞を標的にするために、本明細書に記載するとおりに、又は当分野で公知のとおりに、処方又は抱合することができる。ｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体における心血管疾病、形質、疾患又は症状の治療又は予防のための当分野で公知の他の治療処置及び様式と組み合わせることができる。
一実施形態において、本発明は、対象又は生物中での標的遺伝子（例えば、ＰＣＳＫ９）の発現を調節するのに適した条件下で、対象又は生物を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象又は生物中での遺伝子発現に関連する疾病、疾患、形質又は症状を治療又は予防する方法を特徴とする。遺伝子発現の低下、従って、各タンパク質／ＲＮＡのレベルの低下は、疾病、疾患、形質又は症状の症候を幾分緩和する。
一実施形態において、本発明は、医薬として許容される担体又は希釈剤中に、ＰＥＧインターフェロン及び１つ又はそれ以上の本発明の二本鎖核酸分子又はｓｉＮＡ分子を含む組成物を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、医薬として許容される担体又は希釈剤中に、（例えば、アトルバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン）、トルセトラピブ及びＪＴＴ−７０５などの他のＰＣＳＫ９阻害剤、並びにα−１アドレナリン作動性アンタゴニスト（例えば、プラゾシン）、β−アドレナリン作動性アンタゴニスト（例えば、プロプラノロール、ナドロール、チモロール、メトプロロール、ピンドロール）などの降圧薬、併用α／βアドレナリン作動性アンタゴニスト（例えば、ラベタオール）、アドレナリン作動性神経細胞遮断薬（例えば、グアネチジン、レセルピン）、中枢神経作動性降圧薬（例えば、クロニジン、メチルドパ、グアナベンズ）、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル）を含む抗アンギオテンシンＩＩ剤、及びベラパミル、ジルチアゼム、ニフェジピン）、利尿薬（例えば、ヒドロクロロチアジド、フロルタリドン、フロセミド、トリアムテレン）及び直接的血管拡張薬（例えば、ヒドララジン、ミノキシジル、ニトロプルシド、ジアゾキシド）（但し、これらに限定されない。）と並びに１つ又はそれ以上の本発明の二本鎖核酸分子又はｓｉＮＡ分子とを含む組成物を特徴とする。
一実施形態において、本発明の治療方法は、スタチン（例えば、アトルバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン）、トルセトラピブ及びＪＴＴ−７０５などの他のＰＣＳＫ９阻害剤、並びにα−１アドレナリン作動性アンタゴニスト（例えば、プラゾシン）、β−アドレナリン作動性アンタゴニスト（例えば、プロプラノロール、ナドロール、チモロール、メトプロロール、ピンドロール）などの降圧薬、併用α／βアドレナリン作動性アンタゴニスト（例えば、ラベタオール）、アドレナリン作動性神経細胞遮断薬（例えば、グアネチジン、レセルピン）、中枢神経作動性降圧薬（例えば、クロニジン、メチルドパ、グアナベンズ）、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル）を含む抗アンギオテンシンＩＩ剤、及びベラパミル、ジルチアゼム、ニフェジピン）、利尿薬（例えば、ヒドロクロロチアジド、フロルタリドン、フロセミド、トリアムテレン）及び直接的血管拡張薬（例えば、ヒドララジン、ミノキシジル、ニトロプルシド、ジアゾキシド）並びにこれらの組み合わせなどの１つ又はそれ以上の他の治療様式と組み合わせた、本発明の二本鎖核酸分子の投与を特徴とする。別の実施形態において、このような組み合わせ療法は、本明細書中の実施形態の何れにおいても使用することができる。
本発明の治療又は予防方法のいずれにおいても、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）を対象に治療コースとして投与することができ、例えば、治療コースを通して１日１回、治療コースを通して２日ごとに１回、治療コースを通して３日ごとに１回、治療コースを通して４日ごとに１回、治療コースを通して５日ごとに１回、治療コースを通して６日ごとに１回、治療コースを通して１週間に１回、治療コースを通して隔週で１回、治療コースを通して１か月に１回などの種々の時間間隔で投与することができる。一実施形態において、治療コースは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０週ごとに１回である。一実施形態において、治療コースは、約１から約５２週間又はそれ以上（例えば、無期限）である。一実施形態において、治療コースは、約１から約４８か月間又はそれ以上（例えば、無期限）である。
一実施形態において、治療又は予防のコースは、固定間隔（例えば、１×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×又はそれ以上）で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超える週ごとに１回などの初期治療コースと、それに続く追加の固定間隔（例えば、１×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×又はそれを超える）で４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０又はそれを超える週ごとに１回などの治療維持コースとを含む。本発明の治療又は予防方法のいずれにおいても、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）は、本明細書に記載の、又は当分野で公知のとおりに、単独療法として単体で、又は追加の療法と組み合わせて、本明細書に記載するとおりに、又は当分野で公知のとおりに、対象に全身投与することができる。全身投与としては、例えば、当分野で一般に公知である、肺（吸入、噴霧など） 静脈内、皮下、筋肉内、カテーテル法、鼻咽頭（ｎａｓｏｐｈａｒａｎｇｅａｌ）、経皮又は経口／胃腸投与が挙げられる。
本発明の治療又は予防の方法のいずれにおいても、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）は、当分野で公知のとおりに、単独療法として単体で、又は追加の療法と組み合わせて、本明細書に記載するとおりに、又は当分野で公知のとおりに、対象に局所的に、又は局所組織に、投与することができる。局所投与としては、例えば、当分野で一般に公知である、関連組織への吸入、噴霧、カテーテル法、移植、直接注射、皮膚／経皮投与、ステント術、点耳／点眼又は門脈投与、又は任意の他の局所投与技術、方法若しくは手順が挙げられる。
一実施形態において、本発明は、（ａ）所定の複雑性を有する核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）コンストラクトのライブラリーを作製すること、及び（ｂ）標的ＲＮＡ配列内のＲＮＡｉ標的部位を決定するのに適切な条件下で、上記（ａ）のｓｉＮＡコンストラクトを分析することを含む、方法を特徴とする。一実施形態において、（ａ）のｓｉＮＡ分子は、一定の長さ、例えば、約２３ヌクレオチド長の鎖を有する。別の実施形態において、（ａ）のｓｉＮＡ分子は異なる長さ、例えば約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチド長の鎖を有する。一実施形態において、アッセイは、本明細書に記載の、再構成されたインビトロｓｉＮＡアッセイを含み得る。別の実施形態において、アッセイは、標的ＲＮＡが発現される細胞培養系を含み得る。別の実施形態において、標的ＲＮＡ断片の切断の検出可能なレベルを、例えば、ゲル電気泳動、ノーザンブロット分析又はＲＮＡｓｅ保護アッセイによって分析して、標的ＲＮＡ配列内の最も適切な標的部位を決定する。標的ＲＮＡ配列は、例えば、インビトロ系のクローニング及び／又は転写によって、また、インビボ系における細胞発現によって、当分野で公知のとおりに得ることができる。
一実施形態において、本発明は、（ａ）４Ｎなどの所定の複雑性を有する核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）コンストラクトの無作為化ライブラリーを作製すること（ここで、Ｎは、ｓｉＮＡコンストラクト鎖の各々における塩基対形成ヌクレオチドの数である（例えば、１９塩基対を含む、２１ヌクレオチドセンス鎖及びアンチセンス鎖を有するｓｉＮＡコンストラクトの場合、複雑性は４１９となる。）。）、及び（ｂ）標的標的ＲＮＡ配列内のＲＮＡｉ標的部位を決定するのに適切な条件下で、上記（ａ）のｓｉＮＡコンストラクトを分析することを含む、方法を特徴とする。別の実施形態において、（ａ）のｓｉＮＡ分子は、一定の長さ、例えば、約２３ヌクレオチド長の鎖を有する。更に別の実施形態において、（ａ）の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は異なる長さ、例えば約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチド長の鎖を有する。一実施形態において、アッセイは、本明細書の実施例６に記載の、再構成されたインビトロｓｉＮＡアッセイを含み得る。別の実施形態において、アッセイは、標的ＲＮＡが発現される細胞培養系を含み得る。別の実施形態において、標的ＲＮＡ断片の切断の検出可能なレベルを、例えば、ゲル電気泳動、ノーザンブロット分析又はＲＮＡｓｅ保護アッセイによって分析して、標的ＲＮＡ配列内の最も適切な標的部位を決定する。標的ＲＮＡ配列は、例えば、インビトロ系のクローニング及び／又は転写によって、また、インビボ系における細胞発現によって、当分野で公知のとおりに得ることができる。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）標的遺伝子によってコードされるＲＮＡ標的の配列を解析すること、（ｂ）（ａ）のＲＮＡの１個以上の領域に相補的である配列を有する核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）の１組以上を合成すること、及び（ｃ）標的ＲＮＡ配列内のＲＮＡｉ標的を決定するのに適切な条件下で（ｂ）のｓｉＮＡ分子を分析することを含む、方法を特徴とする。一実施形態において、（ｂ）のｓｉＮＡ分子は、一定の長さ、例えば、約２３ヌクレオチド長の鎖を有する。別の実施形態において、（ｂ）のｓｉＮＡ分子は異なる長さ、例えば約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチド長の鎖を有する。一実施形態において、アッセイは、本明細書に記載の、再構成されたインビトロｓｉＮＡアッセイを含み得る。別の実施形態において、アッセイは、標的ＲＮＡが発現される細胞培養系を含み得る。標的ＲＮＡ断片の切断の検出可能なレベルを、例えば、ゲル電気泳動、ノーザンブロット分析又はＲＮＡｓｅ保護アッセイによって分析して、標的ＲＮＡ配列内の最も適切な標的部位を決定する。標的ＲＮＡ配列は、例えば、インビトロ系のクローニング及び／又は転写によって、また、インビボ系における発現によって、当分野で公知のとおりに得ることができる。
「標的部位」とは、標的配列に相補的である配列をそのアンチセンス領域内に含むｓｉＮＡコンストラクトによって媒介される切断のために「標的にされ」る標的ＲＮＡ内の配列を意味する。
「切断の検出可能なレベル」とは、標的ＲＮＡの無作為分解によって生成されるＲＮＡのバックグラウンドを超えて、切断産物を識別するのに十分な程度の標的ＲＮＡの切断（及び切断された生成物ＲＮＡの形成）を意味する。標的ＲＮＡの１−５％からの切断産物の生成は、大部分の検出方法のバックグラウンドを超えて検出するのに十分である。
一実施形態において、本発明は、医薬として許容される担体又は希釈剤中に、本発明の化学修飾され得る核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を含む、組成物を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、医薬として許容される担体又は希釈剤中に、化学修飾され得る、１個以上の遺伝子を標的にした、本発明のｓｉＮＡ分子を含む、医薬組成物を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、対象における疾患、形質又は症状の診断に適切な条件下で、本発明の組成物を対象に投与することを含む、対象における疾患、形質又は症状を診断する方法を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、対象における疾患、形質又は症状の治療又は予防に適切な条件下で、単独で、又は１種類以上の他の治療化合物と併せて、本発明の組成物を対象に投与することを含む、対象における代謝及び／又は循環器の疾患、形質、症状又は障害などの疾患、形質又は症状を治療又は予防する方法を特徴とする。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含む。）、（ｂ）細胞、組織、対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節するのに適切な条件下で、細胞、組織、対象又は生物体にｓｉＮＡ分子を導入すること、及び（ｃ）細胞、組織、対象又は生物体における任意の表現型の変化を評価することによって、遺伝子の機能を明らかにすることを含む、標的遺伝子標的を確認する方法を特徴とする。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含む。）、（ｂ）生物系における標的遺伝子の発現を調節するのに適切な条件下で、生物系にｓｉＮＡ分子を導入すること、及び（ｃ）生物系における任意の表現型の変化を評価することによって、遺伝子の機能を明らかにすることを含む、標的を確認する方法を特徴とする。
「生物系」とは、ヒト又は動物を含めて、ただしこれらだけに限定されない生物学的出所から得られる精製又は未精製の材料を意味し、この系は、ＲＮＡｉ活性に必要な成分を含む。「生物系」という用語は、例えば、細胞、組織、対象若しくは生物体又はその抽出物を含む。生物系という用語は、インビトロでの状況において使用することができる、再構成されたＲＮＡｉ系も含む。
「表現型の変化」とは、本発明の核酸又はポリヌクレオチド分子（例えば、ｓｉＮＡ）による接触又は処理に応じて起こる、細胞の任意の検出可能な変化を意味する。かかる検出可能な変化としては、当分野で公知の方法によって評価することができる、形状、サイズ、増殖、運動性、タンパク質発現若しくはＲＮＡ発現又は他の物理的若しくは化学的変化が挙げられるが、これらだけに限定されない。検出可能な変化としては、発現タンパク質、又は分析可能な任意の他の細胞成分を特定するのに用いられる、Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）、種々のタグなどのレポーター遺伝子／分子の発現も挙げられる。
一実施形態において、本発明は、例えば、細胞、組織、対象又は生物体を含めて、生物系における標的遺伝子の発現の調節に使用することができる、本発明の化学修飾され得る核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を含むキットを特徴とする。別の実施形態において、本発明は、例えば、細胞、組織、対象又は生物体を含めて、生物系における１個を超える標的遺伝子の発現の調節に使用することができる、本発明の化学修飾され得る１個を超えるｓｉＮＡ分子を含む、キットを特徴とする。
一実施形態において、本発明は、本発明の化学修飾され得る１個又はそれ以上の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を含む細胞を特徴とする。別の実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を含む細胞は、ほ乳動物細胞である。更に別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子を含む細胞は、ヒト細胞である。
一実施形態において、本発明の化学修飾され得る核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子の合成は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の２本の相補鎖の合成と、（ｂ）二本鎖ｓｉＮＡ分子を得るのに適切な条件下で２本の相補鎖を一緒にアニーリングすることを含む。別の実施形態において、ｓｉＮＡ分子の２本の相補鎖の合成は、固相オリゴヌクレオチド合成による。更に別の実施形態において、ｓｉＮＡ分子の２本の相補鎖の合成は、固相直列オリゴヌクレオチド合成による。
一実施形態において、本発明は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の第１のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成すること（ここで、第１のオリゴヌクレオチド配列鎖は、ｓｉＮＡの第２のオリゴヌクレオチド配列鎖の合成の足場として使用することができる切断可能なリンカー分子を含む。）、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチド配列鎖の足場の上にｓｉＮＡの第２のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成すること（ここで、第２のオリゴヌクレオチド配列鎖は、ｓｉＮＡ二本鎖の精製に使用することができる化学部分を更に含む。）、（ｃ）２本のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖がハイブリッド形成して、安定な二本鎖を形成するのに適切な条件下で、（ａ）のリンカー分子を切断すること、及び（ｄ）第２のオリゴヌクレオチド配列鎖の化学部分を利用してｓｉＮＡ二本鎖を精製することを含む、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）二本鎖分子を合成する方法を特徴とする。一実施形態において、上記（ｃ）におけるリンカー分子の切断は、例えばメチルアミンなどのアルキルアミン塩基を用いた加水分解条件下で、オリゴヌクレオチドの脱保護中に起こる。一実施形態において、この合成方法は、ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）、ポリスチレンなどの固体支持体上での固相合成を含む。ここで、（ａ）の第１の配列は、固体支持体を足場として用いて、スクシニルリンカーなどの切断可能なリンカー上で合成される。第２の鎖の合成用足場として用いた（ａ）の切断可能なリンカーは、固体支持体によって誘導体化されたリンカーと類似の反応性を含み得る。したがって、固体支持体によって誘導体化されたリンカーと（ａ）の切断可能なリンカーの切断は、同時に起こる。別の実施形態において、結合したオリゴヌクレオチド配列を単離するのに使用することができる（ｂ）の化学部分は、本明細書に記載のトリチルオン（ｔｒｉｔｙｌ−ｏｎ）合成戦略に使用することができるトリチル基、例えば、ジメトキシトリチル基を含む。更に別の実施形態において、ジメトキシトリチル基などの化学部分を、例えば酸性条件を用いて、精製中に除去する。
更なる実施形態において、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）合成方法は、溶液相合成又は混成相合成であり、ｓｉＮＡ二本鎖の両方の鎖は、第２の配列の合成用足場として作用する第１の配列に結合した切断可能なリンカーを用いて、タンデム合成される。別々のｓｉＮＡ配列鎖のハイブリダイゼーションに適切な条件下でリンカーを切断すると、二本鎖ｓｉＮＡ分子が形成される。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の１本のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成すること（ここで、この配列は、別のオリゴヌクレオチド配列の合成用足場として使用することができる切断可能なリンカー分子を含む。）、（ｂ）第１の配列鎖に対して相補性を有する第２のオリゴヌクレオチド配列を（ａ）の足場上に合成すること（ここで、第２の配列は、二本鎖ｓｉＮＡ分子の他方の鎖を含み、結合したオリゴヌクレオチド配列の単離に使用することができる化学部分を更に含む。）、（ｃ）切断可能なリンカーによって連結された両方のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖を含む完全長配列を単離するのに適切な条件下で、また、２本のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖がハイブリッド形成して、安定な二本鎖を形成するのに適切な条件下で、第２のオリゴヌクレオチド配列鎖の化学部分を利用して（ｂ）の生成物を精製することを含む、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）二本鎖分子を合成する方法を特徴とする。一実施形態において、上記（ｃ）におけるリンカー分子の切断は、例えば加水分解条件下で、オリゴヌクレオチドの脱保護中に起こる。別の実施形態において、上記（ｃ）におけるリンカー分子の切断は、オリゴヌクレオチドの脱保護後に起こる。別の実施形態において、この合成方法は、ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）、ポリスチレンなどの固体支持体上での固相合成を含む。ここで、（ａ）の第１の配列は、固体支持体を足場として用いて、スクシニルリンカーなどの切断可能なリンカー上で合成される。第２の鎖の合成用足場として用いた（ａ）の切断可能なリンカーは、固体支持体によって誘導体化されたリンカーと類似の反応性又は異なる反応性を含み得る。したがって、固体支持体によって誘導体化されたリンカーと（ａ）の切断可能なリンカーの切断は、同時又は逐次的に起こる。一実施形態において、結合したオリゴヌクレオチド配列の単離に使用することができる（ｂ）の化学部分は、トリチル基、例えば、ジメトキシトリチル基を含む。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）第１と第２の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成すること（ここで、第１の配列は第２の配列に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチド配列は、切断可能なリンカーによって第２の配列に連結されており、末端５’保護基、例えば、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基（５’−Ｏ−ＤＭＴ）は、第２の配列を有するオリゴヌクレオチド上に残る。）、（ｂ）オリゴヌクレオチドを脱保護し、それによって２個のオリゴヌクレオチド配列を連結しているリンカーが切断されること、及び（ｃ）二本鎖ｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、例えば本明細書に記載のトリチルオン合成戦略によって、（ｂ）の生成物を精製することを含む、二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を単一の合成プロセスで作製する方法を特徴とする。
別の実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子の合成方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｃａｒｉｎｇｅ他、米国特許第５，８８９，１３６号、同６，００８，４００号及び同６，１１１，０８６号の教示を含む。
一実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチド（例えば、ＰＣＳＫ９ＲＮＡ又はＤＮＡ標的）に対してＲＮＡｉを媒介する核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）コンストラクトを特徴とする。ここで、ｓｉＮＡコンストラクトは、ｓｉＮＡコンストラクトのヌクレアーゼ耐性を増大させる、１個以上の化学修飾、例えば、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの１個以上の化学修飾又はその任意の組合せを含む。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）ヌクレアーゼ耐性の増大したｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、ヌクレアーゼ耐性の増大した核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を生成する方法を特徴とする。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド（例えば、表ＩＶに示すｓｉＮＡモチーフ）又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）毒物学的プロファイルが改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、毒物学的プロファイルが改善された（例えば、免疫賦活性が減弱された、又は免疫賦活性がない）核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を生成する方法を特徴とする。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子と、本明細書に記載の、又は当分野で公知の送達ビヒクル若しくは送達粒子とを含むｓｉＮＡ調合物を生成すること、及び（ｂ）毒物学的プロファイルが改善されたｓｉＮＡ調合物の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ調合物を評価することを含む、毒物学的プロファイルが改善された（例えば、免疫賦活性が減弱された、又は免疫賦活性がない）核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）調合物を生成する方法を特徴とする。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド（例えば、表ＩＶに示すｓｉＮＡモチーフ）又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）インターフェロン応答を刺激しないｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、細胞、対象又は生物体においてインターフェロン応答を刺激しない（例えば、インターフェロン応答がない、又はインターフェロン応答が減弱された）核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を生成する方法を特徴とする。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子と、本明細書に記載の、又は当分野で公知の送達ビヒクル若しくは送達粒子とを含むｓｉＮＡ調合物を生成すること、及び（ｂ）インターフェロン応答を刺激しないｓｉＮＡ調合物の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ調合物を評価することを含む、細胞、対象又は生物体においてインターフェロン応答を刺激しない（例えば、インターフェロン応答がない、又はインターフェロン応答が減弱された）核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）調合物を生成する方法を特徴とする。一実施形態において、インターフェロンは、インターフェロンアルファを含む。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド（例えば、表ＩＶに示すｓｉＮＡモチーフ）又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）サイトカイン応答を刺激しないｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、細胞、対象又は生物体において炎症性又は炎症誘発性サイトカインを刺激しない（例えば、サイトカイン応答がない、又はサイトカイン応答が減弱された）核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を生成する方法を特徴とする。一実施形態において、サイトカインは、インターロイキン６（ＩＬ−６）などのインターロイキン及び／又は腫よう壊死アルファ（ＴＮＦ−α）を含む。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子と、本明細書に記載の、又は当分野で公知の送達ビヒクル若しくは送達粒子とを含むｓｉＮＡ調合物を生成すること、及び（ｂ）サイトカイン応答を刺激しないｓｉＮＡ調合物の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ調合物を評価することを含む、細胞、対象又は生物体において炎症性又は炎症誘発性サイトカインを刺激しない（例えば、サイトカイン応答がない、又はサイトカイン応答が減弱された）ｓｉＮＡ調合物を生成する方法を特徴とする。一実施形態において、サイトカインは、インターロイキン６（ＩＬ−６）などのインターロイキン及び／又は腫よう壊死アルファ（ＴＮＦ−α）を含む。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド（例えば、表ＩＶに示すｓｉＮＡモチーフ）又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）ＴＬＲ応答を刺激しないｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、細胞、対象又は生物体においてトール様受容体（ＴＬＲ）を刺激しない（例えば、ＴＬＲ応答がない、又はＴＬＲ応答が減弱された）核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を生成する方法を特徴とする。一実施形態において、ＴＬＲは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及び／又はＴＬＲ９を含む。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子と、本明細書に記載の、又は当分野で公知の送達ビヒクル若しくは送達粒子とを含むｓｉＮＡ調合物を生成すること、及び（ｂ）ＴＬＲ応答を刺激しないｓｉＮＡ調合物の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ調合物を評価することを含む、細胞、対象又は生物体においてトール様受容体（ＴＬＲ）を刺激しない（例えば、ＴＬＲ応答がない、又はＴＬＲ応答が減弱された）核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）調合物を生成する方法を特徴とする。一実施形態において、ＴＬＲは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及び／又はＴＬＲ９を含む。
一実施形態において、本発明の化学的に修飾された核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、化学的修飾を持たない又はより少ない化学的修飾を有する対応するｓｉＲＮＡ分子と比べて、改善された毒性学的特性を有する。
一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による標的ＲＮＡの切断を誘導する、化学合成された二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、（ａ）前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８から約３８ヌクレオチド長であり、（ｂ）前記ｓｉＮＡ分子の１本の鎖は、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって標的ＲＮＡの切断を誘導するのに十分な相補性を、前記標的ＲＮＡに対して有するヌクレオチド配列を含み、（ｃ）前記ｓｉＮＡ分子内のヌクレオチド位置は、対応する無修飾ｓｉＲＮＡ分子のレベルよりも低いレベルにｓｉＮＡ分子の免疫賦活性を低下させるように化学修飾されている。かかるｓｉＮＡ分子は、無修飾又は最小限に修飾されたｓｉＮＡよりも改善された毒物学的プロファイルを有すると言われる。
「改善された毒物学的プロファイル」とは、化学修飾又は調合された核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）コンストラクトが、細胞、対象又は生物体において、無修飾ｓｉＮＡ、調合されていないｓｉＮＡ、より少数の修飾を有するｓｉＮＡ分子、又は改善された毒物学（ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）を付与するにはさほど有効でない修飾を有するｓｉＮＡ分子よりも毒性が減少していることを意味する。かかるｓｉＮＡ分子は、「改善されたＲＮＡｉ活性」を有するとも考えられる。非限定的例において、毒物学的プロファイルが改善されたｓｉＮＡ分子及び調合物は、細胞、対象又は生物体において、無修飾ｓｉＮＡ、調合されていないｓｉＮＡ、より少数の修飾を有するｓｉＮＡ分子、又は改善された毒物学を付与するにはさほど有効でない修飾を有するｓｉＮＡ分子よりも低下した、減少した、又は減弱されたオフターゲット及び／又は免疫賦活性応答など、低下したオフターゲット効果及び／又は免疫賦活性を伴う。一つの例において、かかる改善された毒物学的プロファイルは、抑制された又は低下されたオフターゲット効果によって特徴付けられ得る。別の例において、かかる改善された毒物学的プロファイルは、インターフェロン（例えば、インターフェロンアルファ）、炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６などのインターロイキン、及び／又はＴＮＦ−アルファ）及び／又はトール様受容体（例えば、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８及び／又はＴＬＲ−９）の誘導の減少又は抑止など、抑止された又は減少した免疫賦活によって特徴付けられ得る。一実施形態において、毒物学的プロファイルが改善されたｓｉＮＡ分子又は調合物は、リボヌクレオチドを含まない。一実施形態において、毒物学的プロファイルが改善されたｓｉＮＡ分子又は調合物は、５個未満のリボヌクレオチド（例えば、１、２、３又は４個のリボヌクレオチド）を含む。一実施形態において、毒物学的プロファイルが改善されたｓｉＮＡ分子又は調合物は、Ｓｔａｂ ７、Ｓｔａｂ ８、Ｓｔａｂ １１、Ｓｔａｂ １２、Ｓｔａｂ １３、Ｓｔａｂ １６、Ｓｔａｂ １７、Ｓｔａｂ １８、Ｓｔａｂ １９、Ｓｔａｂ ２０、Ｓｔａｂ ２３、Ｓｔａｂ ２４、Ｓｔａｂ ２５、Ｓｔａｂ ２６、Ｓｔａｂ ２７、Ｓｔａｂ ２８、Ｓｔａｂ ２９、Ｓｔａｂ ３０、Ｓｔａｂ ３１、Ｓｔａｂ ３２、Ｓｔａｂ ３３、Ｓｔａｂ ３４、Ｓｔａｂ ３５、Ｓｔａｂ ３６又はその任意の組合せを含む（表ＩＶ参照）。本明細書では、数字で表したＳｔａｂケミストリーは、表ＩＶに示すケミストリーの２’−フルオロと２’−ＯＣＦ３の両方のバージョンを含む。例えば、「Ｓｔａｂ ７／８」は、Ｓｔａｂ ７／８とＳｔａｂ ７Ｆ／８Ｆの両方を指すなど。一実施形態において、毒物学的プロファイルが改善されたｓｉＮＡ分子又は調合物は、本発明のｓｉＮＡ分子、及び図面を含めて、参照によりその全体を本明細書に組み込む米国特許出願公開第２００３００７７８２９号に記載された調合物を含む。
一実施形態において、所与の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子に付随する免疫賦活性応答レベルは、本明細書に記載のとおりに測定することができ、又は例えば、特定のｓｉＮＡ分子の免疫賦活性応答を定量するアッセイにおいて、ＰＫＲ／インターフェロン応答、増殖、Ｂ細胞活性化及び／又はサイトカイン産生のレベルを求めることによって、当分野で公知のとおりに測定することができる（例えば、その全体を参照により組み込む、Ｌｅｉｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２６，３１３−９及び米国特許第５，９６８，９０９号を参照されたい。）。一実施形態において、低下した免疫賦活性応答は、無修飾又は最小限に修飾されたｓｉＲＮＡ分子と比較して約１０％及び約１００％、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％低下した免疫賦活性応答である。一実施形態において、ｓｉＮＡ分子に関連した免疫賦活性応答は、化学修飾の程度によって調節することができる。例えば、修飾ｓｉＮＡ分子中のヌクレオチド位置の約１０％から約１００％、（例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％又は少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％）を有するｓｉＮＡ分子を、本明細書に記載の対応する免疫賦活性度を有するように選択することができる。
一実施形態において、低下した免疫賦活性応答の程度を、ＲＮＡｉ活性を最適化するために選択する。例えば、ある程度の免疫賦活を保持することは、ウイルス感染を治療するために好ましい場合がある。この場合、免疫賦活の１００％未満の減少が、最大の抗ウイルス活性に好ましい場合があるのに対して（例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の免疫賦活の減少）、非特異的毒性又はオフターゲット（ｏｆｆ ｔａｒｇｅｔ）効果を防止するのに最小の免疫賦活性を有する核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を用いて、内因性遺伝子標的の発現を阻止することが好ましい場合もある（例えば、約９０％から約１００％の免疫賦活の減少）。
一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による標的ＲＮＡの切断を誘導する、化学合成された二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、（ａ）前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８から約３８ヌクレオチド長であり、（ｂ）前記ｓｉＮＡ分子の１本の鎖は、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって標的ＲＮＡの切断を誘導するのに十分な相補性を、前記標的ＲＮＡに対して有するヌクレオチド配列を含み、（ｃ）前記ｓｉＮＡ分子の１個以上のヌクレオチドは、対応する無修飾ｓｉＲＮＡ分子のレベルよりも低いレベルにｓｉＮＡ分子の免疫賦活性を低下させるように化学修飾されている。一実施形態において、各鎖は、他方の鎖のヌクレオチドに相補的である少なくとも約１８個のヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子の免疫賦活性を低下させる修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を有するアンチセンス領域を含み、センス領域を更に含む。ここで、前記センス領域は、前記標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部にかなり類似したヌクレオチド配列を含む。その一実施形態において、アンチセンス領域及びセンス領域は、約１８から約３８ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス領域は、センス領域のヌクレオチドに相補的である少なくとも約１８ヌクレオチドを含む。その一実施形態において、センス領域中のピリミジンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである。その別の実施形態において、センス領域中のプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。その更に別の実施形態において、センス領域に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。その別の実施形態において、前記アンチセンス領域のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。その更に別の実施形態において、前記アンチセンス領域のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。その更に別の実施形態において、前記アンチセンス領域中に存在するプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドを含む。別の実施形態において、アンチセンス領域は、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合を前記アンチセンス領域の３’末端に含む。別の実施形態において、アンチセンス領域は、グリセリル修飾を前記アンチセンス領域の３’末端に含む。
別の実施形態において、ｓｉＮＡ分子の免疫賦活性を低下させる修飾ヌクレオチドを含む核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の構造上の特徴のいずれかを含み得る。別の実施形態において、ｓｉＮＡ分子の免疫賦活性を低下させる修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の化学修飾のいずれかを含み得る。
一実施形態において、本発明は、（ａ）１個以上の修飾ヌクレオチド分子をｓｉＮＡに導入すること、及び（ｂ）無修飾ヌクレオチドを有する対応するｓｉＮＡ分子よりも免疫賦活性が低下したｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、ｓｉＮＡ分子の免疫賦活性を低下させる化学修飾ヌクレオチドを有する、化学合成された二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を生成する方法を特徴とする。ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８から約３８ヌクレオチド長である。ＳｉＮＡ分子の１本の鎖は、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって標的ＲＮＡの切断を誘導するのに十分な相補性を、標的ＲＮＡに対して有する、ヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、低下した免疫賦活性は、ｓｉＮＡが細胞、組織又は生物体に導入されるのに応答した、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫よう壊死アルファ（ＴＮＦ−α）などの炎症性又は炎症誘発性サイトカインの抑止された、又は低下した誘導を含む。別の実施形態において、低下した免疫賦活性は、ｓｉＮＡが細胞、組織又は生物体に導入されるのに応答した、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９などのトール様受容体（ＴＬＲ）の抑止された、又は低下した誘導を含む。別の実施形態において、低下した免疫賦活性は、ｓｉＮＡが細胞、組織又は生物体に導入されるのに応答した、インターフェロンアルファなどのインターフェロンの抑止された、又は低下した誘導を含む。
一実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉを媒介する核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）コンストラクトを特徴とする。ここで、ｓｉＮＡコンストラクトは、ｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖とアンチセンス鎖の結合親和性を調節する本明細書に記載の１個以上の化学修飾を含む。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）ｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖の結合親和性が増加したｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖の結合親和性が増加した核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を生成する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉを媒介する核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）コンストラクトを特徴とする。ここで、ｓｉＮＡコンストラクトは、ｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス鎖と細胞内の相補的標的ＲＮＡ配列との結合親和性を調節する本明細書に記載の１個以上の化学修飾を含む。
一実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉを媒介する核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）コンストラクトを特徴とする。ここで、ｓｉＮＡコンストラクトは、ｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス鎖と細胞内の相補的標的ＤＮＡ配列との結合親和性を調節する本明細書に記載の１個以上の化学修飾を含む。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補的標的ＲＮＡ配列との結合親和性が増加したｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補的標的ＲＮＡ配列との結合親和性が増加した核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を生成する方法を特徴とする。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補的標的ＤＮＡ配列との結合親和性が増加した核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補的標的ＤＮＡ配列との結合親和性が増加したｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉを媒介する核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）コンストラクトを特徴とする。ここで、ｓｉＮＡコンストラクトは、化学修飾ｓｉＮＡコンストラクトに対して配列相同性を有する追加の内因性ｓｉＮＡ分子を生成し得る細胞ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を調節する、本明細書に記載の１個以上の化学修飾を含む。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）化学修飾ｓｉＮＡ分子に対して配列相同性を有する追加の内因性ｓｉＮＡ分子を生成し得る細胞ポリメラーゼの高いポリメラーゼ活性を媒介し得るｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、化学修飾ｓｉＮＡ分子に対して配列相同性を有する追加の内因性ｓｉＮＡ分子を生成し得る細胞ポリメラーゼの高いポリメラーゼ活性を媒介し得る核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を生成する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチドに対してｓｉＮＡを媒介する化学修飾された核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）コンストラクトを特徴とする。ここで、化学修飾は、かかるｓｉＮＡコンストラクトによって媒介されるＲＮＡｉの効力を減少させるように、ｓｉＮＡと、標的ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子及び／又はタンパク質、又はＲＮＡｉに必須である他の因子との相互作用をさほど引き起こさない。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）ＲＮＡｉ特異性が改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、ポリヌクレオチド標的に対するＲＮＡｉ特異性が改善された核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を生成する方法を特徴とする。一実施形態において、改善された特異性は、無修飾ｓｉＮＡ分子に比較して低いオフターゲット効果を有することを含む。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖又は領域の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に末端キャップ部分を導入すると、センス鎖又はセンス領域に対して相補性を有する対応する標的に対するＲＮＡｉ活性のテンプレートとしてセンス鎖又はセンス領域が作用するのを阻止することによって、ｓｉＮＡが、改善された特異性を有するようにすることができる。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）ＲＮＡｉ活性が改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、標的ポリヌクレオチドに対するＲＮＡｉ活性が改善された核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を生成する方法を特徴とする。
更に別の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）標的ＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性が改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、標的ＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性が改善された核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）を生成する方法を特徴とする。
更に別の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）標的ＤＮＡに対するＲＮＡｉ活性が改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、標的ＤＮＡに対するＲＮＡｉ活性が改善された核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を生成する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉを媒介する核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）コンストラクトを特徴とする。ここで、ｓｉＮＡコンストラクトは、ｓｉＮＡのコレステロール抱合などのｓｉＮＡコンストラクトの細胞内取り込みを調節する本明細書に記載の１個以上の化学修飾を含む。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）細胞内取り込みが改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、細胞内取り込みが改善された、標的ポリヌクレオチドに対する核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を生成する方法を特徴とする。
一実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉを媒介する核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）コンストラクトを特徴とする。ここで、ｓｉＮＡコンストラクトは、例えば、ｓｉＮＡコンストラクトの薬物動態学を改善する、ポリエチレングリコールなどの高分子抱合体、若しくは等価な抱合体を結合させることによって、又は特定の組織タイプ若しくは細胞タイプをインビボで標的にする抱合体を結合させることによって、ｓｉＮＡコンストラクトの生物学的利用能を増大させる、本明細書に記載の１個以上の化学修飾を含む。かかる抱合体の非限定的例は、参照により本明細書に組み込む、Ｖａｒｇｅｅｓｅ他、米国逐次番号第１０／２０１，３９４号に記述されている。
一実施形態において、本発明は、（ａ）抱合体をｓｉＮＡ分子構造に導入すること、及び（ｂ）生物学的利用能が改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、生物学的利用能が改善された、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を生成する方法を特徴とする。かかる抱合体としては、天然タンパク質リガンド由来のペプチドなどの細胞受容体のリガンド；細胞のＺＩＰコード配列を含めたタンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；葉酸塩、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどのビタミン及び他の補因子；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー；リン脂質；コレステロール；コレステロール誘導体、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミンなどが挙げられる。
一実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡ配列又はその一部に相補的である第１のヌクレオチド配列と、前記第１の配列に対して相補性を有する第２の配列とを含む、二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記第２の配列は、ＲＮＡ干渉を効率的に媒介するガイド配列としてもはや作用しないように、及び／又はＲＮＡｉを促進する細胞タンパク質によって認識されるように、化学修飾されている。一実施形態において、ｓｉＮＡの第１のヌクレオチド配列は、本明細書に記載のとおりに化学修飾されている。一実施形態において、ｓｉＮＡの第１のヌクレオチド配列は修飾されていない（例えば、全ＲＮＡである。）。
一実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡ配列又はその一部に相補的である第１のヌクレオチド配列と、前記第１の配列に対して相補性を有する第２の配列とを含む、二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、第２の配列は、ガイド配列として、又は標的核酸（例えば、ＲＮＡ）配列に相補的である配列としてＲＮＡｉ経路に入るのを阻止するように、設計又は修飾されている。一実施形態において、ｓｉＮＡの第１のヌクレオチド配列は、本明細書に記載のとおりに化学修飾されている。一実施形態において、ｓｉＮＡの第１のヌクレオチド配列は修飾されていない（例えば、全ＲＮＡである。）。かかる設計又は修飾は、ｓｉＮＡの活性を高め、及び／又は本発明のｓｉＮＡ分子の特異性を改善すると予想される。これらの修飾は、オフターゲット効果及び／又は付随する毒性を最小化することも予想される。
一実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡ配列又はその一部に相補的である第１のヌクレオチド配列と、前記第１の配列に対して相補性を有する第２の配列とを含む、二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記第２の配列は、ＲＮＡ干渉を媒介するガイド配列として作用することができない。一実施形態において、ｓｉＮＡの第１のヌクレオチド配列は、本明細書に記載のとおりに化学修飾されている。一実施形態において、ｓｉＮＡの第１のヌクレオチド配列は修飾されていない（例えば、全ＲＮＡである。）。
一実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡ配列又はその一部に相補的である第１のヌクレオチド配列と、前記第１の配列に対して相補性を有する第２の配列とを含む、二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記第２の配列は、末端５’ヒドロキシル（５’−ＯＨ）又は５’リン酸基を持たない。
一実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡ配列又はその一部に相補的である第１のヌクレオチド配列と、前記第１の配列に対して相補性を有する第２の配列とを含む、二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記第２の配列は、末端キャップ部分を前記第２の配列の５’末端に含む。一実施形態において、末端キャップ部分は、反転脱塩基、反転デオキシ脱塩基、反転ヌクレオチド部分、図１０に示す基、アルキル若しくはシクロアルキル基、複素環、又は第２の配列がＲＮＡｉのガイド配列若しくはテンプレートとして役立つＲＮＡｉ活性を阻止する任意の他の基を含む。
一実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡ配列又はその一部に相補的である第１のヌクレオチド配列と、前記第１の配列に対して相補性を有する第２の配列とを含む、二本鎖低分子干渉核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記第２の配列は、末端キャップ部分を前記第２の配列の５’末端及び３’末端に含む。一実施形態において、各末端キャップ部分は、反転脱塩基、反転デオキシ脱塩基、反転ヌクレオチド部分、図１０に示す基、アルキル若しくはシクロアルキル基、複素環、又は第２の配列がＲＮＡｉのガイド配列若しくはテンプレートとして役立つＲＮＡｉ活性を阻止する任意の他の基を個々に含む。
一実施形態において、本発明は、（ａ）１個以上の化学修飾をｓｉＮＡ分子構造に導入すること、及び（ｂ）特異性が改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、標的核酸（例えば、遺伝子、その対応するＲＮＡなどのＤＮＡ又はＲＮＡ）の発現を下方制御又は阻害する、特異性が改善された本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を生成する方法を特徴とする。別の実施形態において、特異性の改善に使用される化学修飾は、ｓｉＮＡ分子の５’末端、３’末端、又は５’末端と３’末端の両方の末端キャップ修飾を含む。末端キャップ修飾は、例えば、図１０に示す構造（例えば、反転デオキシ脱塩基部分）、又はｓｉＮＡ分子の一部（例えば、センス鎖）がオフターゲット核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介できないようにする任意の他の化学修飾を含み得る。
「改善された特異性」とは、本発明の修飾された核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子が、修飾されていない又は最小限に修飾されたｓｉＮＡ分子に比べて、低下した又はより少ないオフターゲット効果を有することを意味する。オフターゲット効果は、ＲＮＡｉ又は毒性をもたらし得る予定されていない標的に対する他の生物活性（免疫賦活応答など）を有するｓｉＮＡ分子から生じ得る。
一実施形態において、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、ＲＩＳＣによって媒介される、対応する標的ＲＮＡ配列の分解のガイド配列としてｓｉＮＡ分子のアンチセンス配列のみが役立ち得るように設計される。これは、ＲＮＡｉ機構によってセンス鎖がガイド配列として認識されないようにする化学修飾をセンス鎖に導入して、ｓｉＮＡのセンス配列を不活性化することによって実施することができる。一実施形態において、かかる化学修飾は、ｓｉＮＡのセンス鎖の５’末端における任意の化学基、又はＲＮＡ干渉を媒介するガイド配列としてのセンス鎖を不活性にするのに役立つ任意の他の基を含む。これらの修飾は、例えば、センス鎖の５’末端が、遊離５’ヒドロキシル（５’−ＯＨ）も、遊離５’リン酸基（例えば、リン酸、二リン酸、三リン酸、環式リン酸など）ももはや持たない分子をもたらし得る。かかるｓｉＮＡコンストラクトの非限定的例は、「Ｓｔａｂ ９／１０」、「Ｓｔａｂ ７／８」、「Ｓｔａｂ ７／１９」、「Ｓｔａｂ １７／２２」、「Ｓｔａｂ ２３／２４」、「Ｓｔａｂ ２４／２５」及び「Ｓｔａｂ ２４／２６」（例えば、Ｓｔａｂ ７、９、１７、２３又は２４センス鎖を有する任意のｓｉＮＡ）ケミストリー及びその変種など、本明細書に記載されている（表ＩＶ参照）。ここで、ｓｉＮＡのセンス鎖の５’末端及び３’末端は、ヒドロキシル基もリン酸基も含まない。本明細書では、数字で表したＳｔａｂケミストリーは、表ＩＶに示すケミストリーの２’−フルオロと２’−ＯＣＦ３の両方のバージョンを含む。例えば、「Ｓｔａｂ ７／８」は、Ｓｔａｂ ７／８とＳｔａｂ ７Ｆ／８Ｆの両方を指すなど。
一実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡ分子の鎖又は一部がＲＮＡｉ活性に対するテンプレート又はガイド配列として作用しないようにする１個以上の化学修飾をｓｉＮＡ分子構造に導入することを含む、標的核酸（例えば、遺伝子、その対応するＲＮＡなどのＤＮＡ又はＲＮＡ）の発現を下方制御又は阻害する、特異性が改善された本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を生成する方法を特徴とする。一実施形態において、ｓｉＮＡ分子の不活性鎖又はセンス領域は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖又はセンス領域、すなわち標的核酸配列に対して相補性を持たない、ｓｉＮＡの鎖又は領域である。一実施形態において、かかる化学修飾は、５’ヒドロキシル（５’−ＯＨ）も５’リン酸基も含まないｓｉＮＡのセンス鎖又は領域の５’末端における任意の化学基、又はＲＮＡ干渉を媒介するガイド配列としてのセンス鎖若しくはセンス領域を不活性にするのに役立つ任意の他の基を含む。かかるｓｉＮＡコンストラクトの非限定的例は、「Ｓｔａｂ ９／１０」、「Ｓｔａｂ ７／８」、「Ｓｔａｂ ７／１９」、「Ｓｔａｂ １７／２２」、「Ｓｔａｂ ２３／２４」、「Ｓｔａｂ ２４／２５」及び「Ｓｔａｂ ２４／２６」（例えば、Ｓｔａｂ ７、９、１７、２３又は２４センス鎖を有する任意のｓｉＮＡ）ケミストリー及びその変種など、本明細書に記載されている（表ＩＶ参照）。ここで、ｓｉＮＡのセンス鎖の５’末端及び３’末端は、ヒドロキシル基もリン酸基も含まない。本明細書では、数字で表したＳｔａｂケミストリーは、表ＩＶに示すケミストリーの２’−フルオロと２’−ＯＣＦ３の両方のバージョンを含む。例えば、「Ｓｔａｂ ７／８」は、Ｓｔａｂ ７／８とＳｔａｂ ７Ｆ／８Ｆの両方を指すなど。
一実施形態において、本発明は、（ａ）複数の無修飾ｓｉＮＡ分子を生成すること、（ｂ）標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介するのに活性であるｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子をスクリーニングすること、及び（ｃ）化学修飾（例えば、本明細書に記載の、又は当分野で公知の化学修飾）を（ｂ）の活性ｓｉＮＡ分子に導入することを含む、標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介するのに活性である核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子をスクリーニングする方法を特徴とする。一実施形態において、この方法は、標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介するのに活性である化学修飾ｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ｃ）の化学修飾ｓｉＮＡ分子を再スクリーニングすることを更に含む。
一実施形態において、本発明は、（ａ）複数の化学修飾ｓｉＮＡ分子（例えば、本明細書に記載の、又は当分野で公知のｓｉＮＡ分子）を生成すること、及び（ｂ）標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介するのに活性である化学修飾ｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子をスクリーニングすることを含む、標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介するのに活性である化学的に修飾された核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子をスクリーニングする方法を特徴とする。
「リガンド」という用語は、受容体などの別の化合物と直接的又は間接的に相互作用し得る、薬物、ペプチド、ホルモン、神経伝達物質などの任意の化合物又は分子を指す。リガンドと相互作用する受容体は、細胞の表面に存在し得、又は細胞間及び／又は細胞内受容体であり得る。リガンドと受容体の相互作用は、生化学反応をもたらし得、又は単なる物理的相互作用若しくは会合であり得る。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）賦形剤調合物をｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）生物学的利用能が改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、生物学的利用能が改善された、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を生成する方法を特徴とする。かかる賦形剤としては、シクロデキストリンなどのポリマー、脂質、陽イオン性脂質、ポリアミン、リン脂質、ナノ粒子、受容体、リガンドなどが挙げられる。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）生物学的利用能が改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、生物学的利用能が改善された本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を生成する方法を特徴とする。
別の実施形態において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）化合物と共有結合し得る。結合するＰＥＧは、任意の分子量とすることができ、好ましくは約１００から約５０，０００ダルトン（Ｄａ）とすることができる。
本発明は、単独で使用することができ、又は試料及び／又は対象を試験するためにＲＮＡをインビトロ若しくはインビボで導入するのに必要な試薬の少なくとも１種類を含むキットの１構成要素として使用することができる。例えば、キットの好ましい成分としては、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子、及び（例えば、脂質、及び当分野で公知の他の移入方法を用いて）本明細書に記載の目的細胞へのｓｉＮＡの導入を促進するビヒクルが挙げられる（例えば、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ他、米国特許第６，３９５，７１３号参照）。キットは、遺伝子機能及び／又は活性の測定、薬物の最適化、創薬などにおける標的確認に使用することができる（例えば、Ｕｓｍａｎ他、米国特許出願第６０／４０２，９９６号参照）。かかるキットは、キットの使用者が本発明を実施できるようにする説明書も含むことができる。
本明細書では「低分子干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉核酸分子」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」又は「化学修飾低分子干渉核酸分子」、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」又は遺伝子サイレンシングを配列特異的に媒介することによって、遺伝子発現又はウイルス複製を阻害又は下方制御することができる任意の核酸分子を指す。これらの用語は、個々の核酸分子、複数のかかる核酸分子、又はかかる核酸分子のプールも表し得る。ＳｉＮＡは、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む二本鎖核酸分子であり得る。ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列、及び標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列又はその一部を有するセンス領域を含む。ＳｉＮＡは、一方の鎖がセンス鎖であり、他方がアンチセンス鎖である、２個の別々のオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。ここで、アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補的である（すなわち、アンチセンス鎖とセンス鎖が二本鎖又は二本鎖構造を形成するなど、各鎖は、他方の鎖中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ここで、例えば、二本鎖領域は、約１５から約３０、例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０塩基対である。アンチセンス鎖は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を含む（例えば、ｓｉＮＡ分子の約１５から約２５個又はそれを超えるヌクレオチドは、標的核酸又はその一部に相補的である）。或いは、ｓｉＮＡは、単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、ｓｉＮＡの自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域は、核酸リンカー又は非核酸リンカーによって連結されている。ＳｉＮＡは、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む、二本鎖、非対称二本鎖、ヘアピン又は非対称ヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであり得る。ここで、アンチセンス領域は、別個の標的核酸分子中のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列、及び標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列又はその一部を有するセンス領域を含む。ＳｉＮＡは、２個以上のループ構造と、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む軸（ｓｔｅｍ）とを有する、環状一本鎖ポリヌクレオチドであり得る。ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列、及び標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を有するセンス領域を含み、環状ポリヌクレオチドは、インビボ又はインビトロでプロセシングを受けて、ＲＮＡｉを媒介し得る活性なｓｉＮＡ分子を生成し得る。ＳｉＮＡは、標的核酸分子中のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドも含み得る（例えば、かかるｓｉＮＡ分子は、標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列がｓｉＮＡ分子内に存在する必要がない。）。一本鎖ポリヌクレオチドは、５’リン酸（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ．，１１０，５６３−５７４及びＳｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，１０，５３７−５６８参照）、５’，３’−二リン酸などの末端リン酸基を更に含み得る。ある実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、別々のセンス及びアンチセンス配列又は領域を含む。ここで、センス領域とアンチセンス領域は、当分野で公知のヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合しており、又はイオン相互作用、水素結合、ファン デル ワールス相互作用、疎水的相互作用及び／又はスタッキング相互作用によって交互に非共有結合している。ある実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子の発現を阻害するように、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書では、ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含む分子に必ずしも限定されず、化学修飾ヌクレオチド及び非ヌクレオチドも包含する。ある実施形態において、本発明の低分子干渉核酸分子は、２’ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠く。出願人は、ある実施形態において、ＲＮＡｉを媒介するのに２’ヒドロキシル基を有するヌクレオチドの存在が不要である低分子干渉核酸を記述する。したがって、本発明の低分子干渉核酸分子は、リボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まなくてもよい。しかし、ＲＮＡｉを維持するのにｓｉＮＡ分子内のリボヌクレオチドの存在が不要であるかかるｓｉＮＡ分子は、２’−ＯＨ基を有する１個以上のヌクレオチドを含む、結合したリンカー、又は他の結合若しくは会合した基、部分若しくは鎖を有し得る。場合によっては、ｓｉＮＡ分子は、ヌクレオチド位置の約５、１０、２０、３０、４０又は５０％においてリボヌクレオチドを含み得る。本発明の修飾低分子干渉核酸分子は、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド「ｓｉＭＯＮ」とも称し得る。本明細書ではｓｉＮＡという用語は、配列特異的ＲＮＡｉを媒介し得る核酸分子、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）などの記述に用いられる他の用語と同義であるものとする。本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的例を本明細書の図４−６及び表ＩＩ及びＩＩＩに示す。かかるｓｉＮＡ分子は、リボザイム、アンチセンス、三重鎖形成、アプタマー、２，５−Ａキメラ、デコイオリゴヌクレオチドなど、遺伝子発現の阻害を媒介する、当分野で公知の他の核酸技術とは異なる。
「ＲＮＡ干渉」又は「ＲＮＡｉ」とは、当分野で一般に公知であり、低分子干渉核酸分子によって媒介される、細胞における遺伝子発現を阻害又は下方制御する生物学的プロセスである。例えば、Ｚａｍｏｒｅ ａｎｄ Ｈａｌｅｙ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５１９−１５２４； Ｖａｕｇｈｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２５−１５２６； Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３； Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９； Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；及びＫｒｅｕｔｚｅｒ他、国際公開第００／４４８９５号；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ他、国際公開第０１／３６６４６号；Ｆｉｒｅ、国際公開第９９／３２６１９号；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ他、国際公開第００／０１８４６号；Ｍｅｌｌｏ及びＦｉｒｅ、国際公開第０１／２９０５８号；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ、国際公開第９９／０７４０９号及びＬｉ他、国際公開第００／４４９１４号；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９； Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７； Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；及びＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７； Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２０５６−６０； ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，ＲＮＡ，８，８４２−８５０； Ｒｅｉｎｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００２，ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖ．，１６，１６１６−１６２６；及びＲｅｉｎｈａｒｔ ＆ Ｂａｒｔｅｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３１を参照されたい。）。また、本明細書では、ＲＮＡｉという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、エピジェネティクスなどの配列特異的ＲＮＡ干渉の記述に用いられる他の用語と同義であるものとする。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子を用いて、転写後レベル又は転写前レベルで遺伝子をエピジェネティックにサイレンシングすることができる。非限定的例において、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現のエピジェネティックな調節は、遺伝子発現を変える、クロマチン構造又はメチル化パターンの、ｓｉＮＡによって媒介される改変に起因し得る（例えば、Ｖｅｒｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６７２−６７６； Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６６９−６７２； Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９； Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７； Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８及びＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７参照）。別の非限定的例において、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の調節は、ＲＩＳＣを介した、ｓｉＮＡによって媒介されるＲＮＡ（コード又は非コードＲＮＡ）の切断、又は当分野で公知の翻訳阻害に起因し得る。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の調節は、転写阻害に起因し得る（例えば、Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，２１６−２２２参照）。
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、二本鎖形成性オリゴヌクレオチド「ＤＦＯ」である（例えば、図１４−１５、並びに２００３年１２月３日に出願されたＶａｉｓｈ他、ＵＳＳＮ１０／７２７，７８０、及び２００４年５月２４日出願された国際ＰＣＴ出願第ＵＳ０４／１６３９０号参照）。
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は多官能ｓｉＮＡである（例えば、図１６−２８、並びに２００４年２月１０日に出願されたＪａｄｈａｖ他、ＵＳＳＮ６０／５４３，４８０、及び２００４年５月２４日に出願された国際ＰＣＴ出願第ＵＳ０４／１６３９０号参照）。一実施形態において、本発明の多官能ｓｉＮＡは、例えば、ＰＣＳＫＲＮＡの２個以上の領域を標的にした配列を含み得る（例えば、表ＩＩ及びＩＩＩの標的配列参照）。一実施形態において、本発明の多官能ｓｉＮＡは、１つ又はそれ以上のＰＣＳＫ９コード又は非コード配列を標的とする配列を含むことができる。一実施形態において、本発明の多官能ｓｉＮＡは１つ又はそれ以上のＰＣＳＫ９ＲＮＡを標的とする配列及び１つ又はそれ以上のＴｏｒｅ２コード又は非コード配列を含むことができる。
本明細書では「非対称ヘアピン」とは、アンチセンス領域と、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含み得るループ部分と、センス領域がアンチセンス領域と塩基対を形成して、ループを有する二本鎖を形成するのに十分な相補ヌクレオチドを有する程度にアンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含むセンス領域とを含む、線状ｓｉＮＡ分子を意味する。例えば、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、細胞又はインビトロ系においてＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さを有するアンチセンス領域（例えば、約１５から約３０、又は約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチド）と、約４から約１２（例えば、約４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２）個のヌクレオチドを含むループ領域と、アンチセンス領域に相補的である約３から約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）個のヌクレオチドを有するセンス領域とを含み得る。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、化学修飾され得る５’末端リン酸基も含み得る。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部分は、本明細書に記載のヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子又は抱合分子を含み得る。
本明細書では「非対称二本鎖」とは、センス領域及びアンチセンス領域を含む２本の別々の鎖を有する核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を意味する。ここで、センス領域は、センス領域がアンチセンス領域と塩基対を形成して、二本鎖を形成するのに十分な相補ヌクレオチドを有する程度にアンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む。例えば、本発明の非対称二本鎖ｓｉＮＡ分子は、細胞又はインビトロ系においてＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さを有するアンチセンス領域（例えば、約１５から約３０、又は約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチド）と、アンチセンス領域に相補的である約３から約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）個のヌクレオチドを有するセンス領域とを含み得る。
「ＲＮＡｉ阻害剤」とは、細胞又は生物体におけるＲＮＡ干渉機能又は活性を下方制御、減少又は阻害し得る任意の分子を意味する。ＲＮＡｉ阻害剤は、ＲＩＳＣなどのタンパク質成分、又はｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどの核酸成分を含めて、ＲＮＡｉ経路の任意の成分と相互作用することによって、又は該成分の機能を妨害することによって、ＲＮＡｉを下方制御、減少又は阻害し得る（例えば、ＲＮＡｉによって媒介される標的ポリヌクレオチドの切断、翻訳阻害、又は転写サイレンシング）。ＲＮＡｉ阻害剤は、ＲＩＳＣ、ｍｉＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡ又は細胞若しくは生物体におけるＲＮＡｉ経路の任意の他の成分と相互作用する、又はその機能を妨害する、ｓｉＮＡ分子、アンチセンス分子、アプタマー又は小分子であり得る。ＲＮＡｉを阻害することによって（例えば、ＲＮＡｉによって媒介される標的ポリヌクレオチドの切断、翻訳阻害、又は転写サイレンシング）、本発明のＲＮＡｉ阻害剤を用いて、標的遺伝子の発現を調節（例えば、上方制御又は下方制御）することができる。一実施形態において、本発明のＲＮＡ阻害剤を用いて、翻訳阻害、転写サイレンシング、又はＲＩＳＣによって媒介されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の切断による遺伝子発現の内因的下方制御又は阻害を妨害（例えば、減少又は阻止）することによって、遺伝子発現を上方制御する。したがって、遺伝子発現の内因的抑制、サイレンシング又は阻害の機序を妨害することによって、本発明のＲＮＡｉ阻害剤を用いて、機能喪失に起因する疾患、形質又は症状の治療のために、遺伝子発現を上方制御することができる。一実施形態において、「ＲＮＡｉ阻害剤」という用語は、例えば、機能喪失の疾患、形質及び／又は症状の治療のために、遺伝子発現を増大させる効果を有する、本明細書の種々の実施形態における「ｓｉＮＡ」という用語の代わりに使用される。
本明細書では「アプタマー」又は「核酸アプタマー」とは、標的分子に特異的に結合するポリヌクレオチドを意味し、核酸分子は、その自然な状況において標的分子によって認識される配列とは異なる配列を有する。或いは、アプタマーは、標的分子が核酸と自然には結合しない場合、標的分子と結合する核酸分子であり得る。標的分子は、対象となる任意の分子であり得る。例えば、アプタマーを使用して、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合させることができ、それによって天然のリガンドとタンパク質の相互作用を防止することができる。これは非限定的例であり、当業者は、他の実施形態を当分野で一般に公知である技術によって容易に作製できることを認識されたい。例えば、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３； Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，２０００，Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，５； Ｓｕｎ，２０００，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．，２，１００； Ｋｕｓｓｅｒ，２０００，Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，２７； Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，８２０及びＪａｙａｓｅｎａ，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，１６２８を参照されたい。本発明のアプタマー分子は、当分野で一般に公知のとおりに、又は本明細書に記載のとおりに、化学修飾され得る。
本明細書では「アンチセンス核酸」という用語は、ＲＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸；Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６５，５６６）相互作用によって標的ＲＮＡと結合し、立体的相互作用によって、又はＲＮａｓｅ Ｈによって媒介される標的認識によって、標的ＲＮＡの活性を変える核酸分子を指す（総説として、Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ，１９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，１００４及びＷｏｏｌｆ他、米国特許第５，８４９，９０２号を参照されたい。）。典型的には、アンチセンス分子は、アンチセンス分子の単一の隣接配列に沿った標的配列に相補的である。しかし、ある実施形態において、アンチセンス分子は、基質分子がループを形成するように基質と結合し得、及び／又はアンチセンス分子がループを形成するように結合し得る。したがって、アンチセンス分子は、２個の（さらには、それを超える）非隣接基質配列に相補的であり得、又はアンチセンス分子の２個の（さらには、それを超える）非隣接配列部分は、標的配列に相補的であり得、又は両方である。現在のアンチセンス戦略の総説については、Ｓｃｈｍａｊｕｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２７４，２１７８３−２１７８９，Ｄｅｌｉｈａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ，１５，７５１−７５３，Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎ． Ａ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，７，１５１，Ｃｒｏｏｋｅ，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３１３，３−４５； Ｃｒｏｏｋｅ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈ． ｇｅｎｅｔ． Ｅｎｇ． Ｒｅｖ．，１５，１２１−１５７，Ｃｒｏｏｋｅ，１９９７，Ａｄ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４０，１−４９を参照されたい。また、２’−ＭＯＥ及び当分野で公知の他の修飾によって修飾された、アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスを用いて、ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用によってＲＮＡを標的にすることができ、それによって二本鎖中の標的ＲＮＡを消化するＲＮａｓｅ Ｈを活性化することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅ Ｈ切断を活性化し得る１個以上のＲＮＡｓｅ Ｈ活性化領域を含み得る。アンチセンスＤＮＡは、化学的に合成することができ、又は一本鎖ＤＮＡ発現ベクター若しくはその等価物を用いて発現させることができる。本発明のアンチセンス分子は、当分野で一般に公知のとおりに、又は本明細書に記載のとおりに、化学修飾され得る。
「調節する」とは、遺伝子の発現、又は１個以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子若しくは等価なＲＮＡ分子のレベル、又は１個以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性を、発現、レベル又は活性が、調節物質の非存在下で認められるものよりも大きく、又は小さくなるように、上方制御又は下方制御することを意味する。例えば、「調節する」という用語は「阻害する」を意味し得るが、「調節する」という言葉の使用はこの定義に限定されない。
「阻害する」、「下方制御する」又は「減少する」とは、遺伝子の発現、又は１個以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子若しくは等価なＲＮＡ分子のレベル、又は１個以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）の非存在下で認められるものよりも低下することを意味する。一実施形態において、ｓｉＮＡ分子による阻害、下方制御又は減少は、不活性又は減弱された分子の存在下で認められるレベルよりも低い。別の実施形態において、ｓｉＮＡ分子による阻害、下方制御又は減少は、例えば、スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）配列又はミスマッチを有するｓｉＮＡ分子の存在下で認められるレベルよりも低い。別の実施形態において、本発明の核酸分子による遺伝子発現の阻害、下方制御又は減少は、核酸分子の存在下の方が、核酸分子の非存在下よりも大きい。一実施形態において、遺伝子発現の阻害、下方制御又は減少は、ＲＮＡｉによって媒介される標的核酸分子（例えばＲＮＡ）の切断、翻訳阻害などの転写後サイレンシングと関連がある。一実施形態において、遺伝子発現の阻害、下方制御又は減少は、ＤＮＡメチル化パターン及びＤＮＡクロマチン構造の変化などによる転写前サイレンシングと関連がある。
「上方制御する」又は「促進する」とは、遺伝子の発現、又は１個以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子若しくは等価なＲＮＡ分子のレベル、又は１個以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）の非存在下で認められるものよりも増加することを意味する。一実施形態において、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の上方制御又は促進は、不活性又は減弱された分子の存在下で認められるレベルよりも高い。別の実施形態において、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の上方制御又は促進は、例えば、スクランブル配列又はミスマッチを有するｓｉＮＡ分子の存在下で認められるレベルよりも高い。別の実施形態において、本発明の核酸分子による遺伝子発現の上方制御又は促進は、核酸分子の存在下の方が、核酸分子の非存在下よりも大きい。一実施形態において、遺伝子発現の上方制御又は促進は、上方制御される目的遺伝子の発現を下方制御、阻害又はサイレンシングする、ＲＮＡｉによって媒介されるコード又は非コードＲＮＡ標的の切断又はサイレンシングなどのＲＮＡによって媒介される遺伝子サイレンシングの阻害と関連がある。遺伝子発現の下方制御は、例えば、負のフィードバック、拮抗作用などを介して、コードＲＮＡ又はそのコードされたタンパク質によって誘導され得る。遺伝子発現の下方制御は、例えば、翻訳阻害、クロマチン構造、メチル化、ＲＩＳＣによって媒介されるＲＮＡ切断、又は翻訳阻害を介して、遺伝子の発現を停止させることによって、目的遺伝子の調節制御を有する非コードＲＮＡによって誘導され得る。したがって、目的遺伝子を下方制御、抑制又はサイレンシングする標的を阻害又は下方制御することによって、治療のために目的遺伝子の発現を上方制御又は促進することができる。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ阻害剤を用いて、ＲＮＡｉ又は遺伝子サイレンシングを阻害することによって、遺伝子発現を上方制御する。例えば、特定の遺伝子の１個の対立遺伝子が変異（例えば、フレームシフト、ミスセンス又はナンセンス変異）を保有して、変異遺伝子によってコードされるタンパク質の機能喪失をもたらすハプロ不全の場合などにおいて、本発明のＲＮＡｉ阻害剤を用いて、遺伝子発現を上方制御することによって、機能喪失の疾患及び症状を治療することができる。かかる場合においては、ＲＮＡｉ阻害剤を用いて、野生型又は機能的対立遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を上方制御することができ、したがって変異遺伝子又はヌル対立遺伝子を補うことによって、ハプロ不全を矯正することができる。別の実施形態において、本明細書の、又は当分野で公知の疾患、形質又は症状の治療などにおいて、本発明のｓｉＮＡ分子を用いて、有毒な機能獲得型（ｔｏｘｉｃ ｇａｉｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）対立遺伝子の発現を下方制御しつつ、本発明のＲＮＡｉ阻害剤を同時に用いて、野生型又は機能的対立遺伝子の発現を上方制御する（例えば、Ｒｈｏｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１０１：１１１４７−１１１５２及びＭｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００５，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１１５：２０１０−２０１７参照）。
「遺伝子」又は「標的遺伝子」若しくは「標的ＤＮＡ」とは、ＲＮＡをコードする核酸、例えば、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含めて、ただしこれだけに限定されない核酸配列を意味する。遺伝子又は標的遺伝子は、ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、その前駆体ＲＮＡなどの機能性ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）又は非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）もコードし得る。かかる非コードＲＮＡは、機能的又は調節性細胞プロセスに関与するｆＲＮＡ又はｎｃＲＮＡの活性の調節において、ｓｉＮＡによって媒介されるＲＮＡ干渉の標的核酸分子として役立ち得る。したがって、疾患をもたらす異常なｆＲＮＡ又はｎｃＲＮＡ活性を本発明のｓｉＮＡ分子によって調節することができる。ｆＲＮＡ及びｎｃＲＮＡを標的にしたｓｉＮＡ分子を用いて、遺伝子刷り込み、転写、翻訳、核酸プロセシング（例えば、アミノ基転移、メチル化など）などの細胞プロセスに介入することによって、対象、生物体又は細胞の遺伝子型又は表現型を操作又は変化させることもできる。標的遺伝子は、細胞、内在性遺伝子、導入遺伝子、又は感染後に細胞中に存在する病原体、例えば、ウイルスの遺伝子などの外因性遺伝子に由来する遺伝子であり得る。標的遺伝子を含む細胞は、任意の生物体、例えば、植物、動物、原生動物、ウイルス、細菌若しくは真菌に由来し得、又はこれらに含まれ得る。植物の非限定的例としては、単子葉植物、双子葉植物又は裸子植物が挙げられる。動物の非限定的例としては、脊椎動物又は無脊椎動物が挙げられる。真菌の非限定的例としては、カビ又は酵母が挙げられる。総説については、例えば、Ｓｎｙｄｅｒ ａｎｄ Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３００，２５８−２６０を参照されたい。
「非標準塩基対」とは、ｆｌｉｐｐｅｄミスマッチ、単一の水素結合ミスマッチ、トランス型ミスマッチ、３塩基（ｔｒｉｐｌｅ ｂａｓｅ）相互作用及び４塩基（ｑｕａｄｒｕｐｌｅ ｂａｓｅ）相互作用を含めた、ミスマッチ及び／又はゆらぎ塩基対などの任意の非ワトソン クリック塩基対を意味する。かかる非標準塩基対の非限定的例としては、ＡＣ逆フーグスティーン、ＡＣゆらぎ、ＡＵ逆フーグスティーン、ＧＵゆらぎ、ＡＡ Ｎ７アミノ、ＣＣ ２−カルボニル−アミノ（Ｈ１）−Ｎ３−アミノ（Ｈ２）、ＧＡ ｓｈｅａｒｅｄ型、ＵＣ ４−カルボニル−アミノ、ＵＵイミノ−カルボニル、ＡＣ逆ゆらぎ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｗｏｂｂｌｅ）、ＡＵフーグスティーン、ＡＵ逆ワトソン クリック（ｒｅｖｅｒｓｅ Ｗａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ）、ＣＧ逆ワトソン クリック、ＧＣ Ｎ３−アミノ−アミノＮ３、ＡＡ Ｎ１−アミノ対称、ＡＡ Ｎ７−アミノ対称、ＧＡ Ｎ７−Ｎ１アミノ−カルボニル、ＧＡ＋カルボニル−アミノＮ７−Ｎ１、ＧＧ Ｎ１−カルボニル対称、ＧＧ Ｎ３−アミノ対称、ＣＣカルボニル−アミノ対称、ＣＣ Ｎ３−アミノ対称、ＵＵ ２−カルボニル−イミノ対称、ＵＵ ４−カルボニル−イミノ対称、ＡＡアミノ−Ｎ３、ＡＡ Ｎ１−アミノ、ＡＣアミノ２−カルボニル、ＡＣ Ｎ３−アミノ、ＡＣ Ｎ７−アミノ、ＡＵアミノ−４−カルボニル、ＡＵ Ｎ１−イミノ、ＡＵ Ｎ３−イミノ、ＡＵ Ｎ７−イミノ、ＣＣカルボニル−アミノ、ＧＡアミノ−Ｎ１、ＧＡアミノ−Ｎ７、ＧＡカルボニル−アミノ、ＧＡ Ｎ３−アミノ、ＧＣアミノ−Ｎ３、ＧＣカルボニル−アミノ、ＧＣ Ｎ３−アミノ、ＧＣ Ｎ７−アミノ、ＧＧアミノ−Ｎ７、ＧＧカルボニル−イミノ、ＧＧ Ｎ７−アミノ、ＧＵアミノ−２−カルボニル、ＧＵカルボニル−イミノ、ＧＵイミノ−２−カルボニル、ＧＵ Ｎ７−イミノ、ｐｓｉＵイミノ−２−カルボニル、ＵＣ ４−カルボニル−アミノ、ＵＣイミノ−カルボニル、ＵＵイミノ−４−カルボニル、ＡＣ Ｃ２−Ｈ−Ｎ３、ＧＡカルボニル−Ｃ２−Ｈ、ＵＵイミノ−４−カルボニル２カルボニル−Ｃ５−Ｈ、ＡＣアミノ（Ａ）Ｎ３（Ｃ）−カルボニル、ＧＣイミノアミノ−カルボニル、Ｇｐｓｉイミノ−２−カルボニルアミノ−２−カルボニル及びＧＵイミノアミノ−２−カルボニル塩基対が挙げられるが、これらだけに限定されない。
本明細書において使用される「ＰＣＳＫ９」とは、表Ｉに示されているＰＣＳＫ９Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号によってコードされるなどの、ＰＣＳＫ９活性を有する全てのプロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９またはＰＣＳＫ９タンパク質、ペプチド又はポリペプチドを意味する。ＰＣＳＫ９という用語は、ＰＣＳＫ９活性を有する全てのＰＣＳＫ９タンパク質、ペプチド又はポリペプチドの発現をコードし又は制御する核酸配列も表す。「ＰＣＳＫ９」という用語は、他のＰＣＳＫ９イソフォーム、変異体ＰＣＳＫ９遺伝子、ＰＣＳＫ９遺伝子のスプライスバリアント及びＰＣＳＫ９遺伝子多型を含む、様々な対象又は生物に由来するＰＣＳＫ９配列など、他のＰＣＳＫ９コード配列を含むものとする。
「ＰＣＳＫ９経路標的」とは、ＡｐｏＢ、ＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−２、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ１Ｄ、脂肪酸結合タンパク質５、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケクシン９）、ＬＸＲ標的遺伝子、メタロプロテアーゼドメイン１１、アポトーシス阻害６及びＦ−ボックスのみのタンパク質３などの標的を含む、遺伝子発現又は活性のＰＣＳＫ９経路に関与するあらゆる標的を意味する。
本明細書では「標的」とは、本明細書中のＧｅｎｂａｎｋ受付番号によってコードされる（表Ｉ参照）、及び／又は参照により本明細書に組み込む、ＵＳＳＮ１０／９２３，５３６号及び／又はＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８に記載のＧｅｎｂａｎｋ受付番号などによってコードされる任意の標的タンパク質、ペプチド又はポリペプチドを意味する。「標的」という用語は、本明細書及び／又は米国仮出願第６０／３６３，１２４号、ＵＳＳＮ１０／９２３，５３６及び／又はＵＳＳＮＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８に記載のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号を有する配列によってコードされるタンパク質、ペプチド、ポリペプチドなどの任意の標的タンパク質、ペプチド又はポリペプチドをコードする核酸配列又は標的ポリヌクレオチド配列も指す。対象となる標的としては、標的ＤＮＡ、標的ＲＮＡなどの標的ポリヌクレオチド配列が挙げられる。「標的」という用語は、異なるアイソフォーム、変異標的遺伝子、標的ポリヌクレオチドのスプライスバリアント、標的多型、非コードポリヌクレオチド配列（例えば、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ）、本明細書に記載の他の調節ポリヌクレオチド配列などの他の配列も含むものとする。したがって、本発明の種々の実施形態において、標的ＲＮＡに対して相補性を有する本発明の二本鎖核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）を用いて、ｍｉＲＮＡ又は他のｎｃＲＮＡ活性を阻害又は下方制御することができる。一実施形態において、ｍｉＲＮＡ又はｎｃＲＮＡ活性を阻害することによって、ｍｉＲＮＡ又はｎｃＲＮＡ活性に依存する遺伝子発現（例えば、本明細書に記載の、又は当分野で公知の遺伝子標的）又はウイルス複製（例えば、本明細書に記載されている又はその他本分野において公知のウイルス標的）を下方制御又は阻害することができる。別の実施形態において、ｍｉＲＮＡ又はｎｃＲＮＡに対して相補性を有する本発明の二本鎖核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）によってｍｉＲＮＡ又はｎｃＲＮＡ活性を阻害することによって、ｍｉＲＮＡ又はｎｃＲＮＡによって下方制御、抑制又はサイレンシングされる標的遺伝子発現（例えば、本明細書に記載の、又は当分野で公知の遺伝子標的）を上方制御又は促進することができる。かかる遺伝子発現の上方制御は、当分野で一般に公知である機能喪失又はハプロ不全に関連した疾患及び症状を治療するために使用することができる。
「経路標的」又は「宿主標的」とは、遺伝子発現若しくは活性又は細胞若しくは宿主タンパク質若しくはこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの経路に関与するあらゆる標的又はＰＣＳＫ９発現及び／又はウイルス、細菌若しくはその他の病原性感染及び／又は複製にその他関与している標的を意味する。例えば、任意の所与の標的は、生物学的経路における上流、下流又は変更遺伝子を含み得る、関係する経路標的を有し得る。これらの経路及び宿主標的遺伝子は、本明細書の疾患、症状及び形質の治療において相加又は相乗効果をもたらし得る。
一実施形態において、標的は、標的ＲＮＡ又はその一部のいずれかである。
一実施形態において、標的は、任意の標的ＤＮＡ又はその一部である。
一実施形態において、標的は、任意の標的ｍＲＮＡ又はその一部である。
一実施形態において、標的は、任意の標的ｍｉＲＮＡ又はその一部である。
一実施形態において、標的は、任意の標的ｓｉＲＮＡ又はその一部である。
一実施形態において、標的は、任意の標的ｓｔＲＮＡ又はその一部である。
一実施形態において、標的は、標的及び又は経路標的又はその一部である。
一実施形態において、標的は、本明細書、及び／又は米国仮出願第６０／３６３，１２４号、ＵＳＳＮ１０／９２３，５３６及び／又はＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８号に記載の標的配列のいずれか（例えば、１個以上）又はその一部である。一実施形態において、標的は、表Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩに示す標的配列のいずれか（例えば、１個以上）又はその一部である。別の実施形態において、標的は、表ＩＩ又はＩＩＩに示す任意の（例えば、１個以上の）上側の鎖、又は下側の鎖の標的配列に対応するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ若しくはｓｔＲＮＡ又はその一部である。別の実施形態において、標的は、本明細書又は米国仮出願第６０／３６３，１２４号、ＵＳＳＮ１０／９２３，５３６及び／又はＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８に記載の配列に対応する任意の（例えば、１個以上）配列に対応する任意のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｓｔＲＮＡである。
「相同配列」とは、遺伝子、遺伝子転写物及び／又は非コードポリヌクレオチドなどの１個以上のポリヌクレオチド配列によって共有されるヌクレオチド配列を意味する。例えば、相同配列は、サイトカインとその対応する受容体など、遺伝子ファミリーの異なるメンバー、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質アイソフォーム、完全に異なる遺伝子などの関係するが異なるタンパク質をコードする２個以上の遺伝子によって共有されるヌクレオチド配列であり得る。相同配列は、非コードＤＮＡ又はＲＮＡ、制御配列、イントロン、転写制御又は調節部位など、２個以上の非コードポリヌクレオチドによって共有されるヌクレオチド配列であり得る。相同配列は、１個を超えるポリヌクレオチド配列によって共有される保存配列領域も含み得る。相同性は、完全な相同性（例えば、１００％）である必要はなく、部分的相同配列も本発明によって企図される（例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％など）。
「保存配列領域」とは、ポリヌクレオチド中の１個以上の領域のヌクレオチド配列が、世代間で、又は生物系、対象若しくは生物体間でさほど変化しないことを意味する。ポリヌクレオチドは、コード及び非コードのＤＮＡ及びＲＮＡを含み得る。
「センス領域」とは、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に対して相補性を有する、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子のヌクレオチド配列を意味する。また、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含み得る。一実施形態において、ｓｉＮＡ分子のセンス領域をセンス鎖又はパッセンジャー鎖と称する。
「アンチセンス領域」とは、標的核酸配列に対して相補性を有する、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）のヌクレオチド配列を意味する。また、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、ｓｉＮＡ分子のセンス領域に対して相補性を有する核酸配列を含んでいてもよい。一実施形態において、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域をアンチセンス鎖又はガイド鎖と称する。
「標的核酸」又は「標的ポリヌクレオチド」とは、発現又は活性を調節すべき任意の核酸配列（例えば、任意の標的及び／又は経路標的配列）を意味する。標的核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。一実施形態において、本発明の標的核酸は標的ＲＮＡ又はＤＮＡである。
「相補性」とは、核酸が、伝統的なワトソン−クリック、又は本明細書に記載の他の非伝統的なタイプによって別の核酸配列と水素結合を形成し得ることを意味する。一実施形態において、各鎖が１５から３０ヌクレオチド長である、ｓｉＮＡ分子などの本発明の二本鎖核酸分子は、二本鎖核酸分子の２本の鎖間の約１０％から約１００％（例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％）の相補性を含む。別の実施形態において、一方の鎖がセンス鎖であり、他方の鎖がアンチセンス鎖であり、各鎖が１５から３０ヌクレオチド長である、ｓｉＮＡ分子などの本発明の二本鎖核酸分子は、二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖中のヌクレオチド配列と、標的ＲＮＡ、標的ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡなどのその対応する標的核酸分子のヌクレオチド配列との間で、少なくとも約１０％から約１００％（例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％）の相補性を含む。一実施形態において、一方の鎖がセンス領域と称するヌクレオチド配列を含み、他方の鎖がアンチセンス領域と称するヌクレオチド配列を含み、各鎖が１５から３０ヌクレオチド長である、ｓｉＮＡ分子などの本発明の二本鎖核酸分子は、二本鎖核酸分子のセンス領域とアンチセンス領域の間で、約１０％から約１００％（例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％）の相補性を含む。本発明の核分子に関連して、その相補配列との核酸分子の結合自由エネルギーは、核酸の関連機能、例えば、ＲＮＡｉ活性が進行するのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの測定は当分野で周知である（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＣＳＨ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ＬＩＩ ｐｐ．１２３−１３３； Ｆｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７； Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０９：３７８３−３７８５参照）。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合を形成（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）し得る、核酸分子中の隣接残渣の百分率を示す（例えば、１０ヌクレオチドを有する第２の核酸配列と塩基対を形成した、第１のオリゴヌクレオチド中の合計１０ヌクレオチドのうちの５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチドは、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％相補的である。）。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖又はセンス領域とアンチセンス鎖又はアンチセンス領域との間で完全な相補性を有する。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、対応する標的核酸分子と完全に相補的である。「完全に相補的」とは、核酸配列の全隣接残基が第２の核酸配列中の同数の隣接残基と水素結合することを意味する。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、１個以上の標的核酸分子又はその一部に相補的である、約１５から約３０個又はそれを超える（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０個又はそれを超える）ヌクレオチドを含む。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖若しくはセンス領域とアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域との間で、又はｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間で部分的相補性（すなわち、１００％未満の相補性）を有する。例えば、部分的相補性は、ｓｉＮＡ構造内の種々のミスマッチ又は非塩基対形成ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５個又はそれを超えるミスマッチ又は非塩基対形成ヌクレオチド）を含み得る。これは、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖若しくはセンス領域とアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域との間で、又はｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間で生じるバルジ、ループ又はオーバーハングをもたらし得る。
一実施形態において、本発明の二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、核酸分子のセンス鎖又はセンス領域とアンチセンス鎖又はアンチセンス領域との間で完全な相補性を有する。一実施形態において、ｓｉＮＡ分子などの本発明の二本鎖核酸分子は、対応する標的核酸分子に完全に相補的である。
一実施形態において、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子などの本発明の二本鎖核酸分子は、二本鎖核酸分子のセンス鎖若しくはセンス領域とアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域との間で、又は核酸分子のアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間で部分的相補性（すなわち、１００％未満の相補性）を有する。例えば、部分的相補性は、二本鎖核酸分子構造内の種々のミスマッチ又は非塩基対形成ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５個又はそれを超えるミスマッチ又はヌクレオチドバルジなどの非塩基対形成ヌクレオチド）を含み得る。これは、二本鎖核酸分子のセンス鎖若しくはセンス領域とアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域との間で、又は二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間で生じるバルジ、ループ又はオーバーハングをもたらし得る。
一実施形態において、本発明の二本鎖核酸分子は、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。「ミクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡ切断、翻訳抑制／阻害又は異質染色質サイレンシングによって、標的メッセンジャーＲＮＡの発現を調節する低分子二本鎖ＲＮＡを意味する（例えば、Ａｍｂｒｏｓ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３１，３５０−３５５； Ｂａｒｔｅｌ，２００４，Ｃｅｌｌ，１１６，２８１−２９７； Ｃｕｌｌｅｎ，２００４，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，１０２，３−９； Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎａｔ． Ｒｅｖ． ｇｅｎｅｔ．，５，５２２−５３１； Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｇｅｎｅ，３４２，２５−２８参照）。一実施形態において、本発明のミクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ分子のセンス鎖若しくはセンス領域とアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域との間で、又はｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間で部分的相補性（すなわち、１００％未満の相補性）を有する。例えば、部分的相補性は、二本鎖核酸分子構造内の種々のミスマッチ又は非塩基対形成ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５個又はそれを超えるミスマッチ又はヌクレオチドバルジなどの非塩基対形成ヌクレオチド）を含み得る。これは、ｍｉＲＮＡのセンス鎖若しくはセンス領域とアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域との間で、又はｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間で生じるバルジ、ループ又はオーバーハングをもたらし得る。
一実施形態において、ＰＣＳＫ９遺伝子発現を下方制御する、又は減少させる、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、本明細書に記載するとおりに、又は当分野で公知のとおりに、対象又は生物体における代謝性及び／又は心血管及び関連疾患、障害、症状又は形質の予防又は治療に使用される。
「代謝性疾患」とは、当分野で公知である、代謝経路に影響を及ぼす任意の疾患又は症状を意味する。代謝性疾患は、遺伝性酵素異常（先天性代謝異常）のために先天的に、又は内分泌器官の疾患、若しくは肝臓などの代謝に重要な器官の不全のために後天的に、異常な代謝過程をもたらし得る。一実施形態において、代謝性疾患としては、高脂血症、高コレステロール血症、循環器疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、糖尿病（例えば、Ｉ型及び／又はＩＩ型糖尿病）、インスリン抵抗性及び／又は肥満が挙げられる。
「心血管疾患」とは、冠動脈心疾患（ＣＨＤ）、脳血管疾患（ＣＶＤ）、大動脈弁狭窄、末梢血管疾患、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、心筋梗塞（心臓発作）、脳血管疾患（卒中）、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、（安定及び不安定な）アンギナ、心房細動、不整脈、弁膜（ｖａｖｕｌａｒ）症、うっ血性心不全、高コレステロール血症、Ｉ型高リポタンパク血症、ＩＩ型高リポタンパク血症、ＩＩＩ型高リポタンパク血症、ＩＶ型高リポタンパク血症、Ｖ型高リポタンパク血症、二次性高トリグリセリド血症、及び家族性レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ欠損症を含めて、ただしこれらだけに限定されない心臓及び脈管構造に影響を及ぼす疾患又は症状を意味する。
本発明の一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子の各配列は独立に約１５から約３０ヌクレオチド長であり、特定の実施形態において、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ二本鎖は、約１５から約３０塩基対（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）を独立に含む。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子の１本以上の鎖は、標的核酸分子に相補的である約１５から約３０ヌクレオチド（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）を独立に含む。更に別の実施形態において、ヘアピン又は環状構造を含む本発明のｓｉＮＡ分子は、約３５から約５５（例えば、約３５、４０、４５、５０又は５５）ヌクレオチド長、又は約３８から約４４（例えば、約３８、３９、４０、４１、４２、４３又は４４）ヌクレオチド長であり、約１５から約２５（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）塩基対を含む。本発明の例示的なｓｉＮＡ分子を表ＩＩ及びＩＩＩ及び／又は図４−５に示す。
本明細書では「細胞」は、その通常の生物学的意味で使用され、多細胞生物全体を指すのではなく、例えば、具体的にヒトを指すのではない。細胞は、生物体、例えば、トリ、植物、及びヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、ネコなどのほ乳動物中に存在し得る。細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞）でも真核細胞（例えば、ほ乳動物又は植物細胞）でもよい。細胞は、体細胞又は生殖系列起源、全能性又は多能性、分裂又は非分裂であり得る。細胞は、配偶子若しくは胚、幹細胞、又は完全に分化した細胞に由来することもでき、又はこれらを含み得る。細胞は、当分野で一般に認識されている、単離細胞、精製細胞、又は実質的な精製細胞であり得る。
本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、直接添加され、又は陽イオン性脂質と複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成することができ、リポソームに入れることができ、又は標的細胞若しくは組織に送達することができる。核酸又は核酸複合体は、関連組織に生体外で、又は肺に局所送達することによってインビボで、生体高分子に組み入れて、又は組み入れずに、局所投与することができる。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、表ＩＩ−ＩＩＩ及び／又は図４−５に示す配列を含む。かかる核酸分子の例は、これらの表及び図に規定された配列から本質的になる。また、表ＩＶに記載の化学修飾コンストラクト、及び表ＶＩに示す脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調合物は、本発明の任意のｓｉＮＡ配列、又はｓｉＮＡ配列の群に適用することができる。
別の態様においては、本発明は、本発明の１種類以上の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を含むほ乳動物細胞を提供する。１種類以上のｓｉＮＡ分子は、本発明の標的ポリヌクレオチド内の同じ、又は異なる部位を独立に標的にすることができる。
「ＲＮＡ」とは、少なくとも１個のリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分精製ＲＮＡなどの単離ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換え産生されたＲＮＡ、並びに１個以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は変化によって天然ＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含む。かかる変化は、ｓｉＮＡの末端への、又は内部的に、例えば、ＲＮＡの１個以上のヌクレオチドにおけるなどの非ヌクレオチド材料の付加を含み得る。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド、化学合成ヌクレオチド、デオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドも含み得る。これらの改変ＲＮＡは、類似体、又は天然ＲＮＡの類似体と称することができる。
「対象」とは、外植された細胞のドナー若しくはレシピエント、又は細胞自体である、生物体を意味する。「対象」とは、本発明の核酸分子を投与することができる生物体も指す。対象は、ヒト又はヒト細胞を含めて、ほ乳動物又はほ乳動物細胞であり得る。一実施形態において、対象は乳児（例えば、１月齢未満、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２月齢の対象）である。一実施形態において、対象は幼児（例えば、１、２、３、４、５又は６歳）である。一実施形態において、対象は（例えば、約６５歳を超える）高齢者である。
本明細書では「化学修飾」とは、未変性のｓｉＲＮＡ又はＲＮＡのヌクレオチドとは異なる、ヌクレオチドの化学構造の任意の修飾を意味する。「化学修飾」という用語は、本明細書に記載の、又は当分野で公知の、修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドを用いた、未変性のｓｉＲＮＡ又はＲＮＡのヌクレオシド及びヌクレオチドの付加、置換又は修飾を包含する。かかる化学修飾の非限定的例としては、本明細書の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ若しくはＶＩＩのいずれかの組成物、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、４’−チオリボヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド（例えば、参照により本明細書に組み込む、２００４年１１月５日に出願されたＵＳＳＮ１０／９８１，９６６参照）、ＦＡＮＡ、「汎用塩基」ヌクレオチド、「非環式」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、末端グリセリル及び／又は反転デオキシ脱塩基残基の組み入れ、又は本明細書の式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの修飾が挙げられるが、これらだけに限定されない。一実施形態において、本発明の核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡなど）は、化学修飾によって部分的に修飾されている（例えば、約５％、１０，％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％修飾）。別の実施形態において、本発明の核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡなど）は、化学修飾によって完全に修飾されている（例えば、約１００％修飾）。
本明細書では「ホスホロチオアート」という用語は、式Ｉのヌクレオチド間結合を指す。式中、Ｚ及び／又はＷは硫黄原子を含む。したがって、ホスホロチオアートという用語は、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合とホスホロジチオアートヌクレオチド間結合の両方を指す。
本明細書では「ホスホノアセタート」という用語は、式Ｉのヌクレオチド間結合を指す。式中、Ｚ及び／又はＷは、アセチル基、又は保護されたアセチル基を含む。
本明細書では「チオホスホノアセタート」という用語は、式Ｉのヌクレオチド間結合を指す。式中、Ｚは、アセチル基、又は保護されたアセチル基を含み、Ｗは、硫黄原子、又はアセチル基、若しくは保護されたアセチル基を含み、Ｚは硫黄原子を含む。
本明細書では「汎用塩基」という用語は、天然ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基の各々とほとんど差別なく塩基対を形成するヌクレオチド塩基類似体を指す。汎用塩基の非限定的例としては、当分野で公知である、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル及び他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、並びに３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、６−ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体が挙げられる（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７−２４４７参照）。
本明細書では「非環式ヌクレオチド」という用語は、例えば、リボース炭素（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４又はＣ５）のいずれかが、独立に、又は組み合わせて、ヌクレオチドから欠けている、非環式リボース糖を有する任意のヌクレオチドを指す。
本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、個々に、又は組み合わせて、又は他の薬物と併せて、対象又は生物体における、本明細書に記載の、又は当分野で公知の、疾患、障害、症状及び形質の予防又は治療に使用することができる。例えば、ｓｉＮＡ分子は、治療に適した条件下で、別々に又は１つ若しくはそれ以上の薬物と組み合わせて、対象に投与することが可能であり、又は当業者に自明の他の適切な細胞に投与することができる。
本発明の核酸分子は、対象又は生物中の、本明細書に記載されている又は本分野においてその他公知の、高脂血症、高コレステロール血症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病（例えば、Ｉ型及び／又はＩＩ型糖尿病）、インシュリン抵抗性、肥満症状、疾患形質を予防又は治療するために、別々に、又は他の薬物と組み合わせて若しくは一緒に使用することができる。
例えば、核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、治療に適した条件下で、別々に又は１つ若しくはそれ以上の薬物と組み合わせて、対象に投与することが可能であり、又は当業者に自明の他の適切な細胞に投与することができる。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、別々に又は１つ若しくはそれ以上の薬物と組み合わせて、治療に適した条件下で、対象に投与することが可能であり、又は当業者に自明の他の適切な細胞に投与することができる。
更なる実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体において、予防又は治療するために、他の公知の治療と併用することができる。例えば、当分野で公知である対象又は生物体における本明細書に記載の疾患、障害、症状及び形質を予防又は治療するために、前記分子を１つ以上の公知の化合物、治療又は手順と併用することができる。
一実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡ分子の発現が可能であるように、本発明の少なくとも１種類のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。例えば、ベクターは、二本鎖を含むｓｉＮＡ分子の両方の鎖をコードする配列を含み得る。ベクターは、自己相補的であり、したがってｓｉＮＡ分子を形成する、単一の核酸分子をコードする配列も含み得る。かかる発現ベクターの非限定的例は、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５； Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７； Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００及びＮｏｖｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５に記載されている。
別の実施形態において、本発明は、本発明の発現ベクターを含むほ乳動物細胞、例えば、ヒト細胞を特徴とする。
更に別の実施形態において、本発明の発現ベクターは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号、例えば、本明細書、又は米国仮出願第６０／３６３，１２４号、ＵＳＳＮ１０／９２３，５３６及び／又はＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８に記載のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号によって参照されるＲＮＡ分子に対して相補性を有するｓｉＮＡ分子の配列を含む。
一実施形態において、本発明の発現ベクターは、同じでも、異なっていてもよい、２個以上のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。
本発明の別の態様においては、標的ＲＮＡ分子と相互作用し、標的ＲＮＡ分子（例えば、本明細書のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号によって参照される標的ＲＮＡ分子）をコードする遺伝子を下方制御するｓｉＮＡ分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターに挿入される転写単位から発現される。組み換えベクターは、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターであり得る。ｓｉＮＡを発現するウイルスベクターは、これらだけに限定されないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス又はアルファウイルスに基づいて構築することができる。ｓｉＮＡ分子を発現可能である組み換えベクターは、本明細書に記載のとおりに送達し、標的細胞中に存続させることができる。或いは、ｓｉＮＡ分子の一過性発現を与えるウイルスベクターを使用することができる。かかるベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。発現後、ｓｉＮＡ分子は、結合し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって遺伝子の機能又は発現を下方制御する。ｓｉＮＡを発現するベクターの送達は、静脈内又は筋肉内投与によって、対象から外植された標的細胞に投与し、続いて対象に再導入することによって、所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段によってなど、全身的であり得る。
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書に記載されているｓｉＲＮＡを細胞又は生物中に導入し、及び標的特異的なＲＮＡｉが起こり得るような条件下に細胞又は生物を維持すること、細胞又は生物の特徴又は特性を決定すること、及び適切な対照に対して前記特徴又は特性を比較することによって（比較によって、候補タンパク質が薬物発見のための適切な標的であるかどうかについての情報が得られる。）、薬物発見のための適切な標的として候補タンパク質を確認する方法を提供する。
典型的な実施形態は、（ａ）分解のための遺伝子のｍＲＮＡを標的とする本発明のＲＮＡｉコンストラクトを細胞又は生物中に導入すること、（ｂ）ｍＲＮＡの分解がその中で起こり、遺伝子の減少した発現をもたらす条件下で、（ａ）の細胞又は生物を維持すること、及び前記細胞又は生物上での前記遺伝子の減少した発現の効果を測定することを含み、減少した発現が効果を有すれば、遺伝子産物が薬物発見のための標的である、遺伝子産物が薬物発見のための適切な標的であるかどうかを評価する方法を提供する。
「ベクター」とは、所望の核酸の送達に使用される任意の核酸技術及び／又はウイルス技術を意味する。
本発明の他の特徴及び効果は、以下の好ましい実施形態の説明、及び特許請求の範囲から明らかになるはずである。
図１は、ｓｉＮＡ分子の合成のためのスキームに関する非限定的な例を示す。相補的ｓｉＮＡ配列鎖である鎖１及び鎖２は、直列で合成され、固体支持体上で固相合成のために使用される開裂可能なリンカーと同一又は別異であり得る、コハク酸ヌクレオチド又は脱塩基コハク酸塩等の開裂可能な連結によって接続される。合成は、固相又は液相の何れかであり得、示されている例において、合成は固相合成である。合成は、ジメトキシトリチル基等の保護基が直列型オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドにおいて変化しないままであるように実施される。オリゴヌクレオチドの開裂及び脱保護の際、２つのｓｉＮＡ鎖は、ｓｉＮＡ二本鎖を形成するように自発的にハイブリダイズし、これにより、末端保護基の特性を利用することによって、例えば末端保護基を有する二本鎖／オリゴヌクレオチドのみが単離される精製法においてトリチルを適用することによって前記二本鎖を精製できる。 図２は、本発明の方法によって合成される精製されたｓｉＮＡ二本鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。示されている２つのピークは、個別のｓｉＮＡ配列鎖の推定質量に相当する。本結果は、直列型合成から生じたｓｉＮＡ二本鎖が、トリチルを適用する単純な精製法を使用して、単一の実体として精製できることを示す。 図３は、ＲＮＡｉに関与する標的ＲＮＡ分解に関する非限定的な提唱された機序の提示を示す。外来の一本鎖ＲＮＡ、例えばウイルス、トランスポゾン、又は他の外因性ＲＮＡからＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によって生じる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ダイサー酵素を活性化し、ダイサー酵素が次にｓｉＮＡ二本鎖を発生させる。あるいは、合成の又は発現されたｓｉＮＡは、適切な手段によって細胞中へ直接導入することができる。標的ＲＮＡを認識する活性型ｓｉＮＡ複合体が形成し、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体による標的ＲＮＡの分解又はＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）による更なるＲＮＡの合成を生じ、これがダイサーを活性化でき、更なるｓｉＮＡ分子を生じ、これによりＲＮＡｉ反応を増幅できる。 図４ＡないしＦは、本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例を示す。前記図において、Ｎは、何れかのヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、シトシン、ウリジン、又は場合によってチミジン）を表し、例えばチミジンは、括弧付きの（Ｎ Ｎ）によって指定される突出領域において置換できる。多様な修飾が、ｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖に関して示されている。（Ｎ Ｎ）ヌクレオチド位置は、本明細書に記載のとおりに化学的に修飾することができ（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ等）、対応する標的核酸配列から誘導され得、又は誘導されえない（例えば、図６Ｃを参照されたい。）。更に、図４に示されている配列は、場合によって、センス鎖の５’末端から９番目の位置に又はガイド鎖の５’末端にある１１個のヌクレオチド位置を計数することによってガイド鎖の５’末端を基礎とした１１番目の位置にリボヌクレオチドを含み得る（図６Ｃ参照）。 図４Ａ：センス鎖は、２１個のヌクレオチドを含み、この中で、２つの末端の３’ヌクレオチドは、場合によって塩基対形成され、存在する全てのヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載の他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除くリボヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、場合によって、３’末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、ここで、２つの末端の３’ヌクレオチドは場合によって標的ＲＮＡ配列と相補的であり、存在する全てのヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載されている他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除くリボヌクレオチドである。「ｓ」として示される、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又は本明細書に記載されている他の修飾されたヌクレオチド間連結等の修飾されたヌクレオチド間連結は、アンチセンス鎖において（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを場合によって接続する。 図４Ｂ：センス鎖は、２１個のヌクレオチドを含み、ここで、２つの末端３’ヌクレオチドは場合によって塩基対形成され、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、２’デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載されている他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除く２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、場合によって３’末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、ここ中で、２つの末端の３’ヌクレオチドは場合によって塩基対形成され、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、２’デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載の他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除く２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドである。「ｓ」として示される、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又は本明細書に記載された他の修飾されたヌクレオチド間連結等の修飾されたヌクレオチド間連結は、センス鎖及びアンチセンス鎖において（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを場合によって接続する。 図４Ｃ：センス鎖は、５’末端及び３’末端のキャップ部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、ここで、２つの末端３’ヌクレオチドは場合によって塩基対形成され、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載の他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除く２’−Ｏ−メチル又は２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、場合によって３’末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、その中で、２つの末端の３’ヌクレオチドは、場合によって標的ＲＮＡ配列と相補的であり、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載の他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除く２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドである。「ｓ」として示される、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又は本明細書に記載の他の修飾されたヌクレオチド間連結等の修飾されたヌクレオチド間連結は、アンチセンス鎖において（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを場合によって接続する。 図４Ｄ：センス鎖は、５’末端及び３’末端のキャップ部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、その中で、２つの末端３’ヌクレオチドは場合によって塩基対形成され、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載の他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除く２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、場合によって３’末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、その中で、２つの末端の３’ヌクレオチドは場合によって標的ＲＮＡ配列と相補的であり、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載の他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除く２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドである。「ｓ」として示される、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又は本明細書に記載の他の修飾されたヌクレオチド間連結等の修飾されたヌクレオチド間連結は、アンチセンス鎖において（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを場合によって接続する。 図４Ｅ：センス鎖は、５’末端及び３’末端のキャップ部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、その中で、２つの末端３’ヌクレオチドは場合によって塩基対形成され、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載の他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除く２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、場合によって３’末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、ここで、２つの末端の３’ヌクレオチドは場合によって標的ＲＮＡ配列と相補的であり、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載されている他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除く２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドである。「ｓ」として示される、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又は本明細書に記載されている他の修飾されたヌクレオチド間連結等の修飾されたヌクレオチド間連結は、アンチセンス鎖において（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを場合によって接続する。 図４Ｆ：センス鎖は、５’末端及び３’末端のキャップ部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、ここで、２つの末端３’ヌクレオチドは場合によって塩基対形成され、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載の他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除く２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、場合によって３’末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、ここで、２つの末端の３’ヌクレオチドは、場合によって標的ＲＮＡ配列と相補的であり、１つの３’末端ホスホロチオアートヌクレオチド間連結を有し、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載の他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除く２’デオキシヌクレオチドである。「ｓ」として示される、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又は本明細書に記載されている他の修飾されたヌクレオチド間連結等の修飾されたヌクレオチド間連結は、アンチセンス鎖において（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを場合によって接続する。コンストラクトＡないしＦのアンチセンス鎖は、本発明の何れかの標的核酸配列と相補的な配列を含む。更に、グリセリル部分（Ｌ）が、図４ＡないしＦに示される何れかのコンストラクトのためのアンチセンス鎖の３’末端に存在するとき、修飾されたヌクレオチド間連結は場合によって存在する。 図５ＡないしＦは、本発明の化学的に修飾された具体的なｓｉＮＡ配列の非限定的な例を示す。ＡないしＦは、図４ＡないしＦに記載されている化学的修飾をＰＣＳＫ９ｓｉＮＡ核酸配列に当てはまる。このような化学的修飾は、あらゆるＰＣＳＫ９配列及び／又はＰＣＳＫ９多型に対しても適用することができる。更に、図５に示される配列は、場合によって、センス鎖の５’末端から９番目の位置に又はガイド鎖の５’末端にある１１個のヌクレオチド位置を計数することによってガイド鎖の５’末端を基礎とした１１番目の位置にリボヌクレオチドを含み得る（図６Ｃ参照）。更に、図５に示されている配列は、アンチセンス鎖の５’末端の最大約４個の位置における末端リボヌクレオチド（例えば、アンチセンス鎖の５’末端での約１、２、３、又は４個の末端リボヌクレオチド）及び／又は細胞標的配列を場合によって含み得る。 図６ＡないしＣは、本発明の異なるｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例を示す。 図６Ａに示されている例（コンストラクト１、２、及び３）は、１９個の代表的な塩基対を有するが、本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されている塩基対の何れかの数を含む。括弧の領域は、例えば長さ約１、２、３、又は４個のヌクレオチド、好ましくは約２個のヌクレオチドを含むヌクレオチドのオーバーハングを表す。コンストラクト１及び２は、ＲＮＡ干渉活性のために独立して使用できる。コンストラクト２は、生分解性リンカーとして場合によって設計できるポリヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーを含み得る。ある実施形態において、コンストラクト２に示されているループ構造は、インビボ及び／又はインビトロでのコンストラクト１の形成をもたらす生分解性リンカーを含み得る。別の例において、コンストラクト３は、同一原理の下でコンストラクト２を作製するために使用することが可能であり、ここで、リンカーは、インビボ及び／又はインビトロでの活性型ｓｉＮＡコンストラクト２を作製するために使用され、前記コンストラクト２は、インビボ及び／又はインビトロで活性型ｓｉＮＡコンストラクト１を作製するために、別の生分解性リンカーを場合によって利用できる。このように、ｓｉＮＡコンストラクトの安定性及び／又は活性は、インビボ又はインビトロで及び／又はインビトロで使用するためのｓｉＮＡコンストラクトの設計に基づいて調節できる。 図６Ｂに示されている例は、ミクロＲＮＡ等の、突出部、バルジ、ループ及び部分的な相補性から生じるステムループを含み得る、本発明の二本鎖核酸分子の異なる変動を表す。バルジ、ループ、及びステムループを有するこのようなモチーフは一般的に、ミクロＲＮＡの特徴である。バルジ、ループ及びステムループは、本発明の二本鎖核酸分子の１つの鎖又は両方の鎖において約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のヌクレオチドのミスマッチ又はバルジ等の部分的な相補性の何れかの程度から生じ得る。 図６Ｃに示される例は、ジヌクレオチド３’突出部を有する２つの２１ヌクレオチド配列の１９塩基対二本鎖を含む本発明のモデルの二本鎖核酸分子を表す。上の鎖（１）は、センス鎖（パッセンジャー鎖）を表し、中間の鎖（２）は、アンチセンス（ガイド鎖）を表し、下の鎖（３）は、標的ポリヌクレオチド配列を表す。ジヌクレオチド突出部（ＮＮ）は、標的ポリヌクレオチドから誘導された配列を含み得る。例えば、ガイド鎖中の３’−（ＮＮ）配列は、標的ポリヌクレオチドの５’−［ＮＮ］配列と相補的であり得る。更に、パッセンジャー鎖の５’−（ＮＮ）配列は、標的ポリヌクレオチド配列の５’−［ＮＮ］配列と同一の配列を含み得る。他の実施形態において、突出部（ＮＮ）は、例えばガイド鎖中の３’−（ＮＮ）配列が標的ポリヌクレオチドの５’−［ＮＮ］配列と相補的ではなく、パッセンジャー鎖の５’−（ＮＮ）配列が標的ポリヌクレオチド配列の５’−［ＮＮ］配列とは異なる配列を含み得る標的ポリヌクレオチド配列からは誘導されない。更なる実施形態において、全ての（ＮＮ）ヌクレオチドは、例えば２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、及び／又は本明細書の他の修飾のように化学的に修飾される。更に、パッセンジャー鎖は、パッセンジャー鎖のリボヌクレオチド位置Ｎを含み得る。示されている代表的な１９塩基対２１塩基長の二本鎖に関して、位置Ｎは、パッセンジャー鎖の３’末端からの９個のヌクレオチドであり得る。しかしながら、異なる長さの二本鎖において、位置Ｎは、ガイド鎖の５’末端から１１個のヌクレオチド位置を計数し、パッセンジャー鎖中の対応する塩基対形成したヌクレオチドを選ぶことによって、ガイド鎖の５’末端をベースに決定される。Ａｇｏ２による開裂は、矢印によって示されるように、位置１０と位置１１との間で生じる。更なる実施形態において、ガイド鎖の５’末端から１０個及び１１個のヌクレオチド位置を計数し、パッセンジャー鎖中の相当の塩基対形成したヌクレオチドを選ぶことによって、ガイド鎖の５’末端をベースにした位置１０及び位置１１にある２つのリボヌクレオチドＮＮが存在する。 図７ＡないしＣは、ｓｉＮＡヘアピン状コンストラクトを作製するための発現カセットを作製する際に利用されるスキームの図を示したものである。 図７Ａ：５’制限部位（Ｒ１）配列の後に、所定の標的配列と同一の配列を有する領域（ｓｉＮＡのセンス領域）が続くＤＮＡオリゴマーが合成され、ここで、センス領域は例えば、長さ約１９、２０、２１、又は２２個のヌクレオチド（Ｎ）を含み、その後に例えば約３ないし約１０個のヌクレオチドを含む所定の配列（Ｘ）のループ配列が続く。 図７Ｂ：次に、合成コンストラクトはＤＮＡポリメラーゼにより伸長され、標的配列に対する特異性を有し、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を有するｓｉＮＡ転写産物を生じる自己相補的配列を有するヘアピン状構造を生じる。 図７Ｃ：配列を直鎖化するためにコンストラクトは（例えば約９５℃に）加熱し、これにより、プライマーを使用して、相補的な第二ＤＮＡ鎖を第一鎖の３’制限配列へと伸長することが可能となる。二本鎖ＤＮＡは次に、細胞中での発現のために適切なベクター中に挿入される。コンストラクトは、３’末端ヌクレオチド突出部が、例えば制限部位を設計すること及び／又はＰａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２９，５０５−５０８に記載されているとおりポリＵ末端領域を利用することによって転写から生じるように設計できる。 図８ＡないしＣは、二本鎖ｓｉＮＡコンストラクトを作製するための発現カセットを作製する際に利用されるスキームの図を示したものである。 図８Ａ：５’制限（Ｒ１）部位配列の後に、所定の標的配列と同一の配列を有する領域（ｓｉＮＡのセンス領域）が続くＤＮＡオリゴマーが合成され、ここでセンス領域は例えば、長さ約１９、２０、２１、又は２２個のヌクレオチド（Ｎ）を含み、その後に規定された配列（Ｘ）のループ配列に隣接する３’制限部位（Ｒ２）が続く。 図８Ｂ：次に、合成コンストラクトがＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、自己相補的配列を有するヘアピン状構造を生じる。 図８Ｃ：コンストラクトは、Ｒ１及びＲ２に特異的な制限酵素によって加工され、二本鎖ＤＮＡを生じ、次に、前記ＤＮＡが細胞中での発現のために適切なベクター中に挿入される。転写カセットは、Ｕ６プロモーター領域が、ｓｉＮＡの個別のセンス鎖及びアンチセンス鎖を生じる二本鎖ＤＮＡの各側と隣接するように設計される。ポリＴ末端配列は、前記コンストラクトへ付加でき、得られた転写産物中にＵ字型突出部を生じ得る。 図９ＡないしＥは、メッセンジャーＲＮＡ等の特定の標的核酸配列内でｓｉＮＡにより媒介されたＲＮＡ干渉のための標的部位を決定するために使用される方法の図を示したものである。 図９Ａ：ｓｉＮＡオリゴヌクレオチドのプールが合成され、ここで、ｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス領域は、標的核酸配列にわたって標的部位との相補性を有し、センス領域は、ｓｉＮＡのアンチセンス領域との配列相補性を含む。 図９ＢからＣ：（図９Ｂ）配列はプールされ、細胞中へのベクターの形質移入がｓｉＮＡの発現を生じる（図９Ｃ）ように、ベクター中へと挿入される。 図９Ｄ：細胞は、標的核酸配列の調節と関連した表現型の変化に基づいて選択される。 図９Ｅ：ｓｉＮＡは、選択された細胞から単離され、標的核酸配列内での有効な標的部位を同定するために配列決定される。 図１０は、例えば、（１）［３−３’］逆方向デオキシリボース、（２）デオキシリボヌクレオチド、（３）［５’−３’］−３’−デオキシリボヌクレオチド、（４）［５’−３’］−リボヌクレオチド、（５）［５’−３’］−３’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、（６）３’−グリセリル、（７）［３’−５’］−３’−デオキシリボヌクレオチド、（８）［３’−３’］−デオキシリボヌクレオチド、（９）［５’−２’］−デオキシリボヌクレオチド、及び（１０）［５−３’］−ジデオキシリボヌクレオチドを含む、本発明のｓｉＮＡ配列の３’末端を安定化させるために使用できる異なる安定化化学反応（１ないし１０）の非限定的な例を示す。図に示されている修飾された及び修飾されていない主鎖の化学反応に加え、これらの化学反応は、本明細書に記載の異なる主鎖の修飾、例えば式Ｉを有する主鎖修飾と組み合わせられ得る。更に、示されている５’から示された末端の修飾までの２’−デオキシヌクレオチドは、本明細書に記載の、修飾された又は修飾されていない別のヌクレオチド又は非ヌクレオチドであり得、例えば式ＩないしＶＩＩの何れか又はその何れかの組み合わせを有する修飾であり得る。 図１１は、ＲＮＡ干渉活性を媒介する能力を保存しながら、ヌクレアーゼ耐性を有する本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを同定するために使用される戦略の非限定的な例を示す。化学的修飾は、教育された設計因子（例えば、２’−修飾を導入すること、塩基修飾、主鎖修飾、末端キャップ修飾等）をベースにしたｓｉＮＡコンストラクト中へ導入される。修飾したコンストラクトは、適切な系（例えば、示されているヌクレアーゼ耐性のためのヒト血清、又はＰＫ／送達因子のための動物モデル）において検査される。並行して、ｓｉＮＡコンストラクトは、例えばルシフェラーゼリポーターアッセイ等の細胞培養系においてＲＮＡ干渉活性に関して検査される。次に、ＲＮＡ干渉活性を維持しながら特定の特徴を有する先導ｓｉＮＡコンストラクトが同定され、更に修飾することができ、もう一度アッセイできる。この同一アプローチは、改善された薬物動態学的特性、送達、及びＲＮＡ干渉活性を有するｓｉＮＡ−抱合体分子を同定するのに使用できる。 図１２は、直鎖及び二本鎖コンストラクト及びその非対称性誘導体を含む、本発明のリン酸化されたｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。 図１３は、本発明の化学的に修飾された末端リン酸基の非限定的な例を示す。 図１４Ａは、標的核酸配列中に同定された回文構造核酸配列及び／又は反復核酸配列を利用する自己相補的なＤＦＯコンストラクトを設計するのに使用される方法論の非限定的な例を示している。（ｉ）回文構造配列又は反復配列は、核酸標的配列中で同定される。（ｉｉ）標的核酸配列及び回文構造配列と相補的な配列が設計される。（ｉｉｉ）相補的な配列の非回文構造部分／反復部分の逆方向の反復配列が、相補的な配列の３’末端に付加され、核酸標的と相補的な配列を含む自己相補的ＤＦＯ分子を生じる。（ｉｖ）ＤＦＯ分子は、自己重合して二本鎖オリゴヌクレオチドを形成できる。 図１４Ｂは、二本鎖を形成するオリゴヌクレオチド配列に関する非限定的な代表例を示す。 図１４Ｃは、二本鎖を形成する代表的なオリゴヌクレオチド配列の自己重合模式図の非限定的な例を示す。 図１４Ｄは、二本鎖を形成する代表的なオリゴヌクレオチド配列の模式的な自己重合の後の、遺伝子発現の調節を生じる標的核酸配列との相互作用に関する非限定的な例を示す。 図１５は、目的の何れかの標的核酸配列と相補的な配列を有するＤＦＯコンストラクト中へ組み込まれる回文構造核酸配列及び／又は反復核酸配列を利用する自己相補的なＤＦＯコンストラクトのデザインに関する非限定的な例を示す。これらの回文構造配列／反復配列の組み込みによって、各鎖が、例えばＲＮＡ干渉による標的遺伝子発現の調節を仲介できる二本鎖を、ＤＦＯコンストラクトのデザインが形成できる。第一に、標的配列が同定される。次に、相補的な配列が生じ、その中で、（Ｘ又はＹとして示される）ヌクレオチド又は非ヌクレオチド修飾が、（図中でＸＹＸＹＸＹとして示される）人工的な回文構造を生じる相補的な配列中に導入される。非回文構造／反復相補的配列の逆方向の反復は、相補的な配列の３’末端へ付加され、核酸標的と相補的な配列を含む自己相補的なＤＦＯを生じる。ＤＦＯは、自己重合して二本鎖オリゴヌクレオチドを形成できる。 図１６は、異なる標的核酸配列のＲＮＡ干渉によって誘導される開裂を各々媒介することができる２つの個別のポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。図１６Ａは、第一標的核酸配列と相補的な第一領域（相補性領域１）及び第二標的核酸配列と相補的な第二領域（相補性領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで、第一及び第二相補性領域は、多機能性ｓｉＮＡ中の各ポリヌクレオチド配列の３’末端に配置されている。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列の点線部分は、ｓｉＮＡ二本鎖の相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列との相補性は有しない。図１６Ｂは、第一標的核酸配列と相補的な第一領域（相補性領域１）及び第二標的核酸配列と相補的な第二領域（相補性領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで、第一及び第二相補性領域は、多機能性ｓｉＮＡ中の各ポリヌクレオチド配列の５’末端に配置される。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列の点線部分は、ｓｉＮＡ二本鎖の相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列との相補性は有しない。 図１７は、異なる標的核酸配列のＲＮＡ干渉によって誘導される開裂を各々媒介することができる別個の領域を含む単一ポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。 図１７Ａは、第一標的核酸配列と相補的な第一領域（相補性領域１）及び第二標的核酸配列と相補的な第二領域（相補性領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここでで、第二相補性領域は、多機能性ｓｉＮＡ中のポリヌクレオチド配列の３’末端に配置されている。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列の点線部分は、ｓｉＮＡ二本鎖の相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列との相補性は有しない。 図１７Ｂは、第一標的核酸配列と相補的な第一領域（相補性領域１）及び第二標的核酸配列と相補的な第二領域（相補性領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで、第一相補性領域は、多機能性ｓｉＮＡ中のポリヌクレオチド配列の５’末端に配置される。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列の点線部分は、ｓｉＮＡ二本鎖の相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列との相補性は有しない。ある実施形態において、これらの多機能性ｓｉＮＡコンストラクトは、インビボ又はインビトロで加工され、図１６に示されているような多機能性ｓｉＮＡコンストラクトを生じる。 図１８は、異なる標的核酸配列のＲＮＡ干渉によって誘導された開裂を各々媒介することができる２つの個別のポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで、多機能性ｓｉＮＡコンストラクトは更に、自己相補的領域、回文構造領域、又は反復領域を含み、従って、より短い二機能性ｓｉＮＡコンストラクトが、異なる標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介することができる。 図１８Ａは、第一標的核酸配列と相補的な第一領域（相補性領域１）及び第二標的核酸配列と相補的な第二領域（相補性領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで、第一及び第二相補性領域は、多機能性ｓｉＮＡ中の各ポリヌクレオチド配列の３’末端に配置されており、第一及び第二相補性領域は更に、自己相補的領域、回文構造領域、又は反復領域を含む。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列の点線部分は、ｓｉＮＡ二本鎖の相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列との相補性は有しない。 図１８Ｂは、第一標的核酸配列と相補的な第一領域（相補性領域１）及び第二標的核酸配列と相補的な第二領域（相補性領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで、第一及び第二相補性領域は、多機能性ｓｉＮＡ中の各ポリヌクレオチド配列の５’末端に配置され、第一及び第二相補性領域は更に、自己相補的領域、回文構造領域、又は反復領域を含む。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列の点線部分は、ｓｉＮＡ二本鎖の相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列との相補性を有しない。 図１９は、異なる標的核酸配列のＲＮＡ干渉によって誘導された開裂を各々媒介することができる別個の領域を含む単一ポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで、多機能性ｓｉＮＡコンストラクトは更に、自己相補的領域、回文構造領域、又は反復領域を含み、従って、より短い二機能性ｓｉＮＡコンストラクトが、異なる標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介することができる。 図１９Ａは、第一標的核酸配列と相補的な第一領域（相補性領域１）及び第二標的核酸配列と相補的な第二領域（相補性領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで、第二相補性領域は、多機能性ｓｉＮＡ中のポリヌクレオチド配列の３’末端に配置され、第一及び第二相補性領域は更に、自己相補的領域、回文構造領域、又は反復領域を含む。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列の点線部分は、ｓｉＮＡ二本鎖の相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列との相補性は有しない。 図１９Ｂは、第一標的核酸配列と相補的な第一領域（相補性領域１）及び第二標的核酸配列と相補的な第二領域（相補性領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで、第一相補性領域は、多機能性ｓｉＮＡ中のポリヌクレオチド配列の５’末端に配置され、第一及び第二相補性領域は更に、自己相補的領域、回文構造領域、又は反復領域を含む。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列の点線部分は、ｓｉＮＡ二本鎖の相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列との相補性は有しない。ある実施形態において、これらの多機能性ｓｉＮＡコンストラクトは、インビボ又はインビトロで加工され、図１８に示されるような多機能性ｓｉＮＡコンストラクトを生じる。 図２０は、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子が、異なるタンパク質（例えば、本明細書のＰＣＳＫ９標的の何れか）、例えばサイトカイン及びその対応する受容体、異なるウイルス系、ウイルス感染又は複製に関与するウイルス及び細胞内タンパク質、又は疾病の進行の持続に関与する共通の又は異なる生物学的経路に関与する異なるタンパク質をコードする個別のＲＮＡ分子等の、２つの個別の標的核酸分子をどのように標的化できるかに関する非限定的な例を示す。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各鎖は、個別の標的核酸分子との相補性を有する領域を含む。多機能性ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡの各鎖がＲＩＳＣ複合体によって利用され、その対応する標的のＲＮＡ干渉によって媒介される開裂を開始できるように設計される。これらのデザイン因子は、ｓｉＮＡコンストラクトの各末端の脱安定化を含み得る（例えば、Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ，１１５，１９９−２０８を参照されたい。）。このような脱安定化は、例えばグアノシン−シチジン塩基対、代替的な塩基対（例えば、ゆらぎ）を使用することによって、又は本分野で公知のように末端ヌクレオチドの位置で化学的に修飾されたヌクレオチドを脱安定化することによって達成できる。 図２１は、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子が、ＲＮＡの別のコード領域、ＲＮＡのコード及び非コード領域、又はＲＮＡの選択的スプライシング変異体領域等の、同一標的核酸分子内の２つの個別の標的核酸配列を標的化する方法に関する非限定的な例を示す。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各鎖は、標的核酸分子の個別の領域との相補性を有する領域を含む。多機能性ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡの各鎖がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体によって利用され、その相当する標的領域のＲＮＡ干渉により媒介される開裂を開始できるように設計される。これらのデザイン因子は、ｓｉＮＡコンストラクトの各末端の脱安定化を含み得る（例えば、Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ，１１５，１９９−２０８を参照されたい。）。このような脱安定化は、例えばグアノシン−シチジン塩基対、代替的な塩基対（例えば、ゆらぎ）を使用することによって、又は本分野で公知のように末端ヌクレオチドの位置で化学的に修飾されたヌクレオチドを脱安定化することによって達成できる。 図２２（ＡないしＨ）は、本発明の繋ぎ止められた多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例を示す。示されている例において、リンカー（例えば、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）は、２つのｓｉＮＡ領域（例えば、２つのセンス領域、２つのアンチセンス領域、あるいは１つのセンス領域及び１つのアンチセンス領域の両者）を接続する。第一標的配列及び第二標的配列に対応する個別のセンス（又はセンス及びアンチセンス）配列は、多機能性ｓｉＮＡ中のそれらの対応するセンス及び／又はアンチセンス配列とハイブリダイズする。更に、多様な抱合体、リガンド、アプタマー、ポリマー又はリポーター分子は、選択的な又は改善された送達特性及び／又は薬物動態学的特性のためのリンカー領域へ結合することができる。 図２２（ＡないしＨ）は、本発明の繋ぎ止められた多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例を示す。示されている例において、リンカー（例えば、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）は、２つのｓｉＮＡ領域（例えば、２つのセンス領域、２つのアンチセンス領域、あるいは１つのセンス領域及び１つのアンチセンス領域の両者）を接続する。第一標的配列及び第二標的配列に対応する個別のセンス（又はセンス及びアンチセンス）配列は、多機能性ｓｉＮＡ中のそれらの対応するセンス及び／又はアンチセンス配列とハイブリダイズする。更に、多様な抱合体、リガンド、アプタマー、ポリマー又はリポーター分子は、選択的な又は改善された送達特性及び／又は薬物動態学的特性のためのリンカー領域へ結合することができる。 図２３は、多様なデンドリマーベースの多機能性ｓｉＮＡデザインの非限定的な例を示す。 図２４は、超分子の多様な多機能性ｓｉＮＡデザインの非限定的な例を示す。 図２５は、３０ヌクレオチドの前駆体のｓｉＮＡコンストラクトを使用するダイサーにより可能となった多機能性ｓｉＮＡデザインの非限定的な例を示す。３０塩基対の二本鎖は、ダイサーによって何れかの末端から２２塩基対及び８塩基対の産物へと開裂される（８塩基対断片は示されていない。）。表示を簡単にするため、ダイサーによって生成された突出部は示されていないが、補うことができる。３つの標的化配列が示されている。必要とされる重なった配列同一性は、灰色の箱型によって示されている。親の３０塩基対のｓｉＮＡのＮは、これが安定化した化学反応において検査される場合、ダイサー開裂を可能にする２’−ＯＨ位置の示唆される部位である。ダイサーＲＮａｓｅＩＩＩによる３０塩基長二本鎖の加工は、正確な２２＋８開裂を付与しないが、むしろ、密接に関連する一連の産物を生じる（２２＋８が一次的な部位である。）ことに留意されたい。それゆえ、ダイサーによる加工は、一連の活性型ｓｉＮＡを生じる。 図２６は、４０ヌクレオチドの前駆体のｓｉＮＡコンストラクトを使用するダイサーにより可能となった多機能性ｓｉＮＡデザインの非限定的な例を示す。４０塩基対の二本鎖は、ダイサーによって何れかの末端から２０塩基対の産物へと開裂される。表示を簡単にするために、ダイサーによって生じたオーバーハングは示されていないが、補うことが可能である。４つの標的化配列が示されている。相同性を有する標的配列は、箱型によって囲まれている。このデザインフォーマットは、より大きなＲＮＡへと拡張できる。化学的に安定化されたｓｉＮＡがダイサーによって結合される場合、戦略的に配置されたリボヌクレオチド結合によって、多機能性デザインのより大規模なレパートリーを可能とするデザイナー開裂産物が可能となる。例えば、約２２ヌクレオチドのダイサー標準物質に限定されない開裂産物によって、例えば約３ないし約１５のヌクレオチドに及ぶ標的配列同一性重複を有する多機能性ｓｉＮＡコンストラクトが可能となる。 図２７は、本発明の更なる多機能性ｓｉＮＡコンストラクトデザインの非限定的な例を示す。ある実施形態において、抱合体、リガンド、アプタマー、標識又は他の部分が、多機能性ｓｉＮＡの一領域へ結合し、送達特性又は薬物動態学的特性を改善することができる。 図２８は、本発明の更なる多機能性ｓｉＮＡコンストラクトデザインの非限定的な例を示す。ある実施形態において、抱合体、リガンド、アプタマー、標識又は他の部分が、多機能性ｓｉＮＡの一領域へ結合し、送達特性又は薬物動態学的特性を改善することができる。 図２９は、本発明のコレステロールによって抱合されたｓｉＮＡ分子を合成するために使用できるコレステロールにより連結されたホスホラミダイトの非限定的な例を示す。コレステロール部分がｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端へ連結された例が示されている。 図３０は、ＰＣＳＫ９を安定に発現している細胞及び対照細胞株中でのＰＣＳＫ９サイレンシングのウェスタンブロット分析の非限定的な例を示す。 図３１は、対照細胞株及びＰＣＳＫ９発現細胞株によるｄｉＩ−ＬＤＬ取り込み（蛍光標識されたＬＤＬ粒子）の非限定的な例を示す。 図３２は、Ｈｅｐａ１から６細胞中でのＰＣＳＫ９ＳｈＲＮＡプラスミドのインビトロスクリーニングの非限定的な例を示す。 図３３は、Ｈｅｐａ１から６細胞中でのマウスＰＣＳＫ９のＡｄ−ＰＣＳＫ９ＳｈＲＮＡ媒介性ノックダウンを確認するデータの非限定的な例を示す。 図３４Ａは、Ｃ５７ＢＬ６マウスの肝臓中でのアデノウイルスによって媒介されるＰＣＳＫ９の阻害の非限定的な例を示している。 図３４Ｂは、血漿ＬＤＬレベルに対する肝臓ノックダウンの非限定的な例を示している。 図３５は、体重に対するＰＣＳＫ９の肝臓ノックダウンの非限定的な例を示している。
本発明の核酸分子の作用機序
以下の考察は、現在公知である低分子干渉ＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ干渉の提案されている機序を考察するものであり、限定的なものではなく、従来技術と認めるものでもない。出願人は、本明細書において、化学修飾低分子干渉核酸が、ｓｉＲＮＡ分子と類似の、又は改善されたＲＮＡｉ媒介能力を有し、改善された安定性及び活性をインビボで有すると予想されることを示す。したがって、この考察は、ｓｉＲＮＡのみに限定されず、ｓｉＮＡ全体にあてはまる。「改善されたＲＮＡｉ媒介能力」又は「改善されたＲＮＡｉ活性」とは、インビトロ及び／又はインビボで測定されたＲＮＡｉ活性を含むものとする。ここで、ＲＮＡｉ活性は、本発明のｓｉＮＡのＲＮＡｉ媒介能力とｓｉＮＡの安定性の両方を反映している。本発明では、これらの活性の成果は、全ＲＮＡ ｓｉＲＮＡ、又は複数のリボヌクレオチドを含むｓｉＮＡよりも、インビトロ及び／又はインビボで増加し得る。ｓｉＮＡ分子の活性又は安定性は減少し得る場合もあるが（すなわち、１０倍未満）、ｓｉＮＡ分子の全体的活性は、インビトロ及び／又はインビボで増強される。
ＲＮＡ干渉とは、動物において、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）。植物における対応するプロセスは、転写後遺伝子サイレンシング又はＲＮＡサイレンシングと一般に称し、真菌においてはクエリングとも称される。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、多様な叢及び門によって一般に共有されている、外来遺伝子の発現を防止するのに使用される、進化的に保存された細胞防御機構であると考えられる（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｔｒｅｎｄｓ ｇｅｎｅｔ．，１５，３５８）。外来遺伝子発現からのかかる保護は、相同な一本鎖ＲＮＡ又はウイルスのゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介して、ウイルス感染に由来する、又は宿主ゲノム中へのトランスポゾンエレメントの無作為な組み込みに由来する、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に応じて進化してきたと考えられる。細胞中にｄｓＲＮＡが存在すると、特徴がまだ十分に明らかになっていない機序によってＲＮＡｉ応答が誘発される。この機序は、リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断をもたらす、ｄｓＲＮＡによって媒介されるプロテインキナーゼＰＫＲ及び２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素の活性化に起因するインターフェロン応答とは異なると考えられる。
細胞中に長鎖ｄｓＲＮＡが存在すると、ダイサーと称するリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡ小片へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与する（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３）。ダイサー活性に由来する低分子干渉ＲＮＡは、典型的には約２１から約２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対の二本鎖を含む。ダイサーは、構造の保存された前駆体ＲＮＡからの、翻訳調節に関係する２１及び２２ヌクレオチドのｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切り出しにも関係する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４）。ＲＮＡｉ応答は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般に称する、ｓｉＲＮＡを含むエンドヌクレアーゼ複合体も特徴とする。ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡと相同である配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のガイド配列に相補的である領域の中央で起こる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８）。また、ＲＮＡ干渉は、恐らくはクロマチン構造を調節し、それによって標的遺伝子配列の転写を防止する細胞機序によって、低分子ＲＮＡ（例えば、ミクロＲＮＡ、すなわちｍｉＲＮＡ）によって媒介される遺伝子サイレンシングも含み得る（例えば、Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８及びＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７）。したがって、本発明のｓｉＮＡ分子を用いて、ＲＮＡ転写物との相互作用によって、又は特定の遺伝子配列との相互作用によって、遺伝子サイレンシングを媒介することができる。かかる相互作用は、転写レベル又は転写後レベルで遺伝子サイレンシングを生じる。
ＲＮＡｉは種々の系で研究されている。Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６は、線虫においてＲＮＡｉを観察した最初であった。Ｗｉａｎｎｙ ａｎｄ Ｇｏｅｔｚ，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２，７０は、マウス胚においてｄｓＲＮＡによって媒介されるＲＮＡｉを記載している。Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３は、ｄｓＲＮＡが移入されたショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡｉを記述している。Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４は、ヒト胚性腎臓及びＨｅＬａ細胞を含めた培養ほ乳動物細胞において、合成２１ヌクレオチドＲＮＡ二本鎖の導入によって誘導されるＲＮＡｉを記述している。ショウジョウバエ胚溶解物における最近の研究によって、効率的ＲＮＡｉ活性を媒介するのに必要である、ｓｉＲＮＡの長さ、構造、化学組成及び配列に対する一定の要件が明らかになった。これらの研究によれば、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二本鎖は、２個の２ヌクレオチド３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含むときに最も活性である。また、一方又は両方のｓｉＲＮＡ鎖を２’−デオキシ又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換するとＲＮＡｉ活性が消失するのに対して、デオキシヌクレオチドによる３’末端ｓｉＲＮＡヌクレオチドの置換は許容されることが判明した。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中央におけるミスマッチ配列も、ＲＮＡｉ活性を消失させることが判明した。また、これらの研究は、標的ＲＮＡ中の切断部位の位置が、ｓｉＲＮＡガイド配列の３’末端ではなく５’末端によって規定されることも示している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０，６８７７）。他の研究によれば、ｓｉＲＮＡ二本鎖の標的相補鎖上の５’リン酸がｓｉＲＮＡ活性に必要であり、ＡＴＰを利用してｓｉＲＮＡ上の５’リン酸部分が維持される（Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９）。しかし、５’リン酸を欠くｓｉＲＮＡ分子は、外因的に導入したときに活性であり、ｓｉＲＮＡコンストラクトの５’リン酸化がインビボで起こり得ることを示唆している。
本発明の二本鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）
一実施形態において、本発明は、二本鎖オリゴヌクレオチドを自己組織化し得る二本鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。本発明の二本鎖形成性オリゴヌクレオチドは、化学合成することができ、又は転写単位及び／又はベクターから発現させることができる。本発明のＤＦＯ分子は、種々の治療、診断、農業、獣医学、標的確認、ゲノム発見、遺伝子工学及び薬理ゲノミクスの各適用分野に有用である試薬及び方法を提供する。
出願人は、二本鎖形成性オリゴヌクレオチド、すなわちＤＦＯ分子に限定されないが、本明細書では便宜上そのように称される、ある種のオリゴヌクレオチドが、遺伝子発現の配列特異的調節の強力な媒介物質であることを本明細書で示す。本発明のオリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチドを自己組織化するように設計されている線状ポリヌクレオチド配列のクラスである点で、当分野で公知である他の核酸配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）とは異なる。二本鎖オリゴヌクレオチドの各鎖は、標的核酸分子に相補的であるヌクレオチド配列を含む。したがって、本発明の核酸分子は、二本鎖の各鎖が同じポリヌクレオチド配列を含み、標的核酸分子に相補的であるヌクレオチド配列を含む、機能的二本鎖を自己組織化することができる。
一般に、二本鎖オリゴヌクレオチドは、２個の異なるオリゴヌクレオチド配列を組み立てることによって形成される。ここで、一方の鎖のオリゴヌクレオチド配列は、他方の鎖のオリゴヌクレオチド配列に相補的である。かかる二本鎖オリゴヌクレオチドは、２個の別々のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、又はそれ自体の上で折り重なって二本鎖構造を形成する単一の分子から組み立てられ、当分野ではヘアピンステムループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ、すなわち短鎖ヘアピンＲＮＡ）と称されることが多い。当分野で公知であるこれらの二本鎖オリゴヌクレオチドはすべて、二本鎖の各鎖が異なるヌクレオチド配列を有する点で共通の特徴を有する。
当分野で公知の二本鎖核酸分子とは別に、出願人は、一本鎖又は線状オリゴヌクレオチドから出発して、二本鎖核酸分子を形成する、潜在的に費用効果の高い、簡単な新規方法を開発した。本発明によって形成される二本鎖オリゴヌクレオチドの２本の鎖は、同じヌクレオチド配列を有し、互いに共有結合していない。かかる二本鎖オリゴヌクレオチド分子は、当分野で公知である方法及び試薬によって、合成後に容易に連結することができ、本発明の範囲内である。一実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチド（二本鎖形成性オリゴヌクレオチド）は、第１の領域と第２の領域を含む。ここで、一本鎖オリゴヌクレオチドが自己組織化して、二本鎖の一方の鎖のヌクレオチド配列が他方の鎖のヌクレオチド配列と同じである二本鎖オリゴヌクレオチドを形成するように、第２の領域は、第１の領域中のヌクレオチド配列又はその一部の逆方向反復であるヌクレオチド配列を含む。かかる二本鎖形成性オリゴヌクレオチドの非限定的例を図１４及び１５に示す。これらの二本鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）は、ある種の回文構造又は反復配列を含んでいてもよい。かかる回文構造又は反復配列は、ＤＦＯの第１の領域と第２の領域の間に存在する。
一実施形態において、本発明は、標的核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する二本鎖形成性自己相補的核酸配列を含む二本鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）分子を特徴とする。ＤＦＯ分子は、かかる自己相補配列の組立てによって生じる、単一の自己相補配列又は二本鎖を含み得る。
一実施形態において、本発明の二本鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）は、第１の領域と第２の領域を含み、第２の領域は、ＤＦＯ分子から二本鎖オリゴヌクレオチドを組み立てることができるように、第１の領域のヌクレオチド配列の逆方向反復を含むヌクレオチド配列を含む。かかる二本鎖オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を調節する低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）として作用し得る。本発明のＤＦＯ分子によって形成される二本鎖オリゴヌクレオチド二本鎖の各鎖は、標的核酸分子（例えば、ＰＣＳＫ９標的ＲＮＡ）中の同じヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列領域を含み得る。
一実施形態において、本発明は、二本鎖オリゴヌクレオチドに組み立て得る一本鎖ＤＦＯを特徴とする。驚くべきことに、出願人は、自己相補性のヌクレオチド領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを二本鎖オリゴヌクレオチドコンストラクトに容易に組み立て得ることを見出した。かかるＤＦＯは、遺伝子発現を配列特異的に阻害し得る二本鎖に組み立て得る。本発明のＤＦＯ分子は、第２の領域のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する第１の領域を含み、第１の領域の配列は、標的核酸（例えば、ＲＮＡ）に相補的である。ＤＦＯは、二本鎖オリゴヌクレオチドの各鎖の一部が、標的核酸配列に相補的である配列を含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成し得る。
一実施形態において、本発明は、二本鎖オリゴヌクレオチドの２本の鎖が互いに共有結合せず、二本鎖オリゴヌクレオチドの各鎖が、標的核酸分子又はその一部（例えば、ＰＣＳＫ９ＲＮＡ標的）中の同じヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを特徴とする。別の実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドの２本の鎖は、少なくとも約１５、好ましくは少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチドの同一のヌクレオチド配列を共有する。
一実施形態において、本発明のＤＦＯ分子は、式ＤＦＯ−Ｉの構造を含む。
Figure 2010503382
 式中、Ｚは、１個以上の修飾ヌクレオチド（例えば、２−アミノプリン、２−アミノ−１，６−ジヒドロプリン、汎用塩基などの修飾塩基を有するヌクレオチド）を含んでいてもよい、例えば偶数の約２から約２４ヌクレオチド（例えば、約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４ヌクレオチド）長の、回文構造の核酸配列、又は反復核酸配列を含み、Ｘは、例えば約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長の、核酸配列であり、Ｘ’は、例えば配列Ｘ又はその一部に対するヌクレオチド配列相補性を有する約１及び約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長の、核酸配列を含み、ｐは、存在しても、しなくてもよい末端リン酸基を含み、配列ＸとＺは、独立に、又は一緒に、標的核酸配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列又はその一部（例えば、ＰＣＳＫ９ＲＮＡ標的）と相互作用する（例えば、塩基対形成する）のに十分な長さである。例えば、Ｘは、標的ＲＮＡ中のヌクレオチド配列又はその一部に相補的である、約１２から約２１又はそれを超える（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれを超える）ヌクレオチド長の配列を独立に含み得る。別の非限定的例において、Ｘが存在するときに、標的又はその一部（例えば、ＰＣＳＫ９ＲＮＡ標的）に相補的である、ＸとＺの一緒のヌクレオチド配列の長さは、約１２から約２１又はそれを超える（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれを超える）ヌクレオチドである。更に別の非限定的例において、Ｘが存在しないときには、ＰＣＳＫ９標的ＲＮＡ又はその一部に相補的であるＺのヌクレオチド配列の長さは、約１２から約２４又はそれを超える（例えば、約１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又はそれを超える）ヌクレオチドである。一実施形態において、Ｘ、Ｚ及びＸ’は独立に、Ｘ及び／又はＺが、標的又はその一部（例えば、ＰＣＳＫ９ＲＮＡ標的）中のヌクレオチド配列と相互作用する（例えば、塩基対形成する）のに十分な長さのヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドである。一実施形態において、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは同一である。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは異なる。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドＸとＺ、又はＺとＸ’、又はＸ、Ｚ及びＸ’の長さは、同一であり、又は異なる。
配列が、別の配列と相互作用する（すなわち、塩基対形成する）のに「十分な」長さであると本明細書で記述するときには、２個の配列間で形成される結合（例えば、水素結合）の数が、対象となる条件下で２個の配列が二本鎖を形成し得るのに十分であるような長さであることを意味する。かかる条件は、インビトロ（例えば、診断又はアッセイ目的）又はインビボ（例えば、治療目的）であり得る。かかる長さを決定することは簡単であり、定常的なことである。
一実施形態において、本発明は、式ＤＦＯ−Ｉ（ａ）の二本鎖オリゴヌクレオチドコンストラクトを特徴とする。
Figure 2010503382
 式中、Ｚは、１個以上の修飾ヌクレオチド（例えば、２−アミノプリン、２−アミノ−１，６−ジヒドロプリン、汎用塩基などの修飾塩基を有するヌクレオチド）を有する、例えば偶数の約２から約２４ヌクレオチド（例えば、約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４ヌクレオチド）長の、回文構造若しくは反復核酸配列、又は回文構造様若しくは反復様核酸配列を含み、Ｘは、例えば約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長の、核酸配列であり、Ｘ’は、例えば配列Ｘ又はその一部に対するヌクレオチド配列相補性を有する約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長の、核酸配列を含み、ｐは、存在しても、しなくてもよい末端リン酸基を含み、各Ｘ及びＺは、標的核酸配列又はその一部（例えば、ＰＣＳＫ９ＲＮＡ標的）に相補的であるヌクレオチド配列を独立に含み、その一部の標的核酸配列（例えば、ＰＣＳＫ９ＲＮＡ標的）と相互作用するのに十分な長さである。例えば、配列Ｘは、標的ＲＮＡ又はその一部（例えば、ＰＣＳＫ９ＲＮＡ標的）中のヌクレオチド配列に相補的である、約１２から約２１又はそれを超える（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれを超える）ヌクレオチド長の配列を独立に含み得る。別の非限定的例において、標的又はその一部に相補的である、（Ｘが存在するときの）ＸとＺの一緒のヌクレオチド配列の長さは、約１２から約２１又はそれを超える（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれを超える）ヌクレオチドである。更に別の非限定的例において、Ｘが存在しないときには、標的ＲＮＡ又はその一部に相補的であるＺのヌクレオチド配列の長さは、約１２から約２４又はそれを超える（例えば、約１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又はそれを超える）ヌクレオチドである。一実施形態において、Ｘ、Ｚ及びＸ’は独立に、Ｘ及び／又はＺが、標的又はその一部（例えば、ＰＣＳＫ９ＲＮＡ標的）中のヌクレオチド配列と相互作用する（例えば、塩基対形成する）のに十分な長さのヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドである。一実施形態において、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは同一である。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは異なる。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドＸとＺ、又はＺとＸ’、又はＸ、Ｚ及びＸ’の長さは、同一であり、又は異なる。一実施形態において、式ＤＦＯ−Ｉ（ａ）の二本鎖オリゴヌクレオチドコンストラクトは、ミスマッチが、二本鎖オリゴヌクレオチドの標的遺伝子発現阻害能力をさほど低下させない程度に、１個以上、具体的には１、２、３又は４個のミスマッチを含む。
一実施形態において、本発明のＤＦＯ分子は、式ＤＦＯ−ＩＩの構造を含む。
Figure 2010503382
 式中、各Ｘ及びＸ’は独立に約１２ヌクレオチドから約２１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、Ｘは、例えば約１２から約２１ヌクレオチド（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長の核酸配列を含み、Ｘ’は、例えば配列Ｘ又はその一部に対してヌクレオチド配列相補性を有する約１２から約２１ヌクレオチド（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長の、核酸配列を含み、ｐは、存在しても、しなくてもよい末端リン酸基を含み、Ｘは、標的核酸配列（例えば、ＰＣＳＫ９ＲＮＡ）又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、その一部の標的核酸配列と相互作用する（例えば、塩基対形成する）のに十分な長さである。一実施形態において、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは同一である。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは異なる。一実施形態において、オリゴヌクレオチドＸ及びＸ’の長さは、比較的安定な二本鎖オリゴヌクレオチドを形成するのに十分である。
一実施形態において、本発明は、式ＤＦＯ−ＩＩ（ａ）の二本鎖オリゴヌクレオチドコンストラクトを特徴とする。
Figure 2010503382
 式中、各Ｘ及びＸ’は独立に約１２ヌクレオチドから約２１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、Ｘは、例えば約１２から約２１ヌクレオチド（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長の、核酸配列を含み、Ｘ’は、例えば配列Ｘ又はその一部に対してヌクレオチド配列相補性を有する約１２から約２１ヌクレオチド（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長の、核酸配列を含み、ｐは、存在しても、しなくてもよい末端リン酸基を含み、Ｘは、標的核酸配列又はその一部（例えば、ＰＣＳＫ９ＲＮＡ標的）に相補的であるヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列（例えば、ＰＣＳＫ９ＲＮＡ）又はその一部と相互作用する（例えば、塩基対形成する）のに十分な長さである。一実施形態において、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは同一である。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは異なる。一実施形態において、オリゴヌクレオチドＸ及びＸ’の長さは、比較的安定な二本鎖オリゴヌクレオチドを形成するのに十分である。一実施形態において、式ＤＦＯ−ＩＩ（ａ）の二本鎖オリゴヌクレオチドコンストラクトは、ミスマッチが、二本鎖オリゴヌクレオチドの標的遺伝子発現阻害能力をさほど低下させない程度に、１個以上、具体的には１、２、３又は４個のミスマッチを含む。
一実施形態において、本発明は、式ＤＦＯ−Ｉ（ｂ）のＤＦＯ分子を特徴とする。
Figure 2010503382
 式中、Ｚは、他のヌクレオチドとの塩基対形成を促進し得る、１個以上の非標準又は修飾ヌクレオチド（例えば、２−アミノプリン、汎用塩基などの修飾塩基を有するヌクレオチド）を含んでいてもよい、回文構造の核酸配列、又は反復核酸配列を含む。Ｚは、例えば、標的核酸（例えば、ＰＣＳＫ９ＲＮＡ）分子のヌクレオチド配列と相互作用する（例えば、塩基対形成する）のに十分な長さであり得、好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド長、具体的には約１２から約２４ヌクレオチド（例えば、約１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４ヌクレオチド）長であり得る。ｐは、存在しても、しなくてもよい末端リン酸基である。
一実施形態において、式ＤＦＯ−Ｉ、ＤＦＯ−Ｉ（ａ）、ＤＦＯ−Ｉ（ｂ）、ＤＦＯ−ＩＩ（ａ）又はＤＦＯ−ＩＩのいずれかのＤＦＯ分子は、例えば、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド、表ＩＶに記載の安定化ケミストリー、本明細書の種々の実施形態に記載の修飾ヌクレオチドと非ヌクレオチドの任意の他の組合せなど、本明細書に記載の化学修飾を、これらだけに限定されずに含み得る。
一実施形態において、式ＤＦＯ−Ｉ、ＤＦＯ−Ｉ（ａ）及びＤＦＯ−Ｉ（ｂ）のＤＦＯコンストラクトのＺ中の回文構造若しくは反復配列又は修飾ヌクレオチド（例えば、２−アミノプリン、汎用塩基などの修飾塩基を有するヌクレオチド）は、標的核酸配列（例えば、ワトソン クリック塩基対又は非ワトソン クリック塩基対を形成し得る修飾塩基類似体）の一部と相互作用し得る化学修飾ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、本発明のＤＦＯ分子、例えば、式ＤＦＯ−Ｉ又はＤＦＯ−ＩＩのＤＦＯは、約１５から約４０個のヌクレオチド（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個のヌクレオチド）を含む。一実施形態において、本発明のＤＦＯ分子は、１個以上の化学修飾を含む。非限定的例において、化学修飾ヌクレオチド及び／又は非ヌクレオチドを本発明の核酸分子に導入することは、外因的に送達される無修飾ＲＮＡ分子に固有のインビボでの安定性及び生物学的利用能の潜在的限界を克服する強力なツールとなる。例えば、化学修飾核酸分子を使用すると、化学修飾核酸分子は、血清中又は細胞若しくは組織中でより長い半減期を有する傾向にあるので、所与の治療効果に対する特定の核酸分子の用量を減少させることができる。また、ある種の化学修飾は、半減期を延長するだけでなく、特定の器官、細胞又は組織への核酸分子のターゲティングを容易にし、及び／又は核酸分子の細胞内取り込みを改善することによって、核酸分子の生物学的利用能及び／又は効力を改善することができる。したがって、化学修飾核酸分子の活性がインビトロで未変性／無修飾核酸分子よりも低い場合でも、例えば、無修飾ＲＮＡ分子と比較したときに、分子の安定性、効力、有効期間、生物学的利用能及び／又は送達が改善されたために、修飾核酸分子の全活性が、未変性又は無修飾核酸分子よりも大きくなり得る。
本発明の多官能又は多標的ｓｉＮＡ分子
一実施形態において、本発明は、細胞、組織、生物体などの生体系において１個以上の標的遺伝子の発現を調節する多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）分子を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。本発明の多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）分子は、ＰＣＳＫ９標的核酸配列の１個を超える領域を標的にすることができ、又は１個を超える異なる核酸分子（例えば、ＰＣＳＫ９またはＰＣＳＫ９経路のＲＮＡ及び／又はＤＮＡ標的）を標的にすることができる。本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、化学合成することができ、又は転写単位及び／又はベクターから発現させることができる。本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、種々のヒト用途、治療、診断、農業、獣医学、標的確認、ゲノム発見、遺伝子工学及び薬理ゲノミクスの各適用分野に有用である試薬及び方法を提供する。
出願人は、多官能低分子干渉核酸、すなわち多官能ｓｉＮＡ分子に限定されないが、本明細書では便宜上そのように称される、ある種のオリゴヌクレオチドが、遺伝子発現の配列特異的調節の強力な媒介物質であることを本明細書で示す。本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、１個以上の標的核酸分子中の異なる核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を多官能ｓｉＮＡコンストラクトの各鎖が含むように設計されたポリヌクレオチド分子のクラスである点で、当分野で公知である他の核酸配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）とは異なる。したがって、本発明の単一の多官能ｓｉＮＡ分子（一般に二本鎖分子）は、１個を超える（例えば、２、３、４、５個又はそれを超える）異なる標的核酸標的分子を標的にすることができる。本発明の核酸分子は、同じ標的核酸配列の１個を超える（例えば、２、３、４、５個又はそれを超える）領域を標的にすることもできる。したがって、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、１個以上の標的核酸分子の発現を下方制御又は阻害するのに有用である。例えば、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、ＰＣＳＫ９、Ｈ６ＰＤ、ＰＴＰ−１Ｂ、ａｐｏＡＩ／ＣＩＩＩ／ＡＩＶ、ＣＥＴＰ、ＡｐｏＢ、ＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−２、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ１Ｄ、脂肪酸結合タンパク質５、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケクシン９、ＬＸＲ標的遺伝子、メタロプロテアーゼドメイン１１、アポトーシス阻害６及びＦ−ボックスのみのタンパク質３又はこれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される核酸分子を標的する（例えば、これらに対して相補性を有する）ことができる。１個の多官能ｓｉＮＡコンストラクトを用いて１個を超える標的核酸分子の発現を低下させる、又は阻害することによって、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、疾患（例えば、血管形成）に関係する経路内の複数の標的を同時に阻害することができる強力な治療薬のクラスである。かかる同時阻害は、別々の前臨床及び臨床開発労力や複雑な規制認可プロセスが不要である相乗的治療処置戦略をもたらし得る。
標的核酸分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ）の１個を超える領域を標的にする多官能ｓｉＮＡ分子を使用すると、遺伝子発現を強力に阻害すると予想される。例えば、本発明の単一の多官能ｓｉＮＡコンストラクトは、標的核酸分子（例えば、ＰＣＳＫ９ＲＮＡ又はＤＮＡ）の保存領域と可変領域の両方を標的にすることができ、それによって例えば、単一の遺伝子によってコードされるスプライスバリアントを下方制御若しくは阻害して、治療効力を最適化し、毒性を最小化することができ、又は標的核酸分子のコード領域と非コード領域の両方のターゲティングを可能にする。
一般に、二本鎖オリゴヌクレオチドは、２個の異なるオリゴヌクレオチド配列を組み立てることによって形成され、一方の鎖のオリゴヌクレオチド配列は、他方の鎖のオリゴヌクレオチド配列に相補的である。かかる二本鎖オリゴヌクレオチドは、２個の別々のオリゴヌクレオチドから一般に組み立てられる（例えば、ｓｉＲＮＡ）。或いは、二本鎖は、それ自体の上で折り重なる単一の分子から形成され得る（例えば、ｓｈＲＮＡ、すなわち短鎖ヘアピンＲＮＡ）。これらの二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉を媒介することが当分野で知られている。これらの二本鎖オリゴヌクレオチドはすべて、一方のヌクレオチド配列領域（ガイド配列又はアンチセンス配列）のみが標的核酸配列と相補性を有し、他方の鎖（センス配列）が、標的核酸配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、共通の特徴を有する。一般に、アンチセンス配列は、活性なＲＩＳＣ複合体中に保持され、アンチセンス配列と標的配列の相補的塩基対形成によってＲＩＳＣを標的ヌクレオチド配列に誘導して、配列特異的ＲＮＡ干渉を媒介する。一部の細胞培養系においては、あるタイプの無修飾ｓｉＲＮＡが「オフターゲット」効果を示し得ることが当分野で知られている。このオフターゲット効果は、ＲＩＳＣ複合体中のｓｉＲＮＡのアンチセンス配列の代わりにセンス配列の関与が必要であると仮定されている（例えば、Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ，１１５，１９９−２０８参照）。この場合、センス配列は、ＲＩＳＣ複合体を目的標的配列とは異なる配列（オフターゲット配列）に誘導し、オフターゲット配列を阻害すると考えられる。これらの二本鎖核酸分子においては、各鎖は、異なる標的核酸配列に相補的である。しかし、これらのｄｓＲＮＡによって影響を受けるオフターゲットは、完全に予測可能であるわけではなく、非特異的である。
当分野で公知の二本鎖核酸分子とは別に、出願人は、単一の多官能ｓｉＮＡコンストラクトを用いて、１個を超える標的核酸配列の発現を下方制御又は阻害する、潜在的に費用効果の高い簡単な新規方法を開発した。本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、多官能ｓｉＮＡの各鎖又は各領域の一部が、最適な標的核酸配列に相補的であるように、二本鎖又は部分的に二本鎖であるように設計されている。したがって、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、互いに相補的であるターゲティング配列に限定されず、任意の２個の異なる標的核酸配列である。本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、所与の標的核酸配列に相補的である、多官能ｓｉＮＡ分子の各鎖又は各領域が、標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介するのに適切な長さ（例えば、約１６から約２８ヌクレオチド長、好ましくは約１８から約２８ヌクレオチド長）であるように設計されている。標的核酸配列と多官能ｓｉＮＡの鎖又は領域との相補性は、ＲＮＡ干渉による標的核酸配列の切断に十分でなければならない（少なくとも約８塩基対）。本発明の多官能ｓｉＮＡは、（Ｓｃｈｗａｒｚ他、前掲）に記載のものなどのある種のｓｉＲＮＡ配列で見られるオフターゲット効果を最小化すると予想される。
２９塩基対から３６塩基対の長さのｄｓＲＮＡ（Ｔｕｓｃｈｌ他、国際公開第０２／４４３２１号）は、ＲＮＡｉを媒介しないことが報告されている。これらのｄｓＲＮＡが不活性である１つの理由は、恐らく、標的ＲＮＡ配列と相互作用する鎖の代謝回転又は解離の欠如である。ＲＩＳＣ複合体は、標的ＲＮＡの複数のコピーと効率的に相互作用することができず、ＲＮＡｉプロセスの効力及び効率がかなり減少する。驚くべきことに、出願人は、本発明の多官能ｓｉＮＡが、この障害を克服することができ、ＲＮＡｉプロセスの効率及び効力を増大できることを見出した。したがって、本発明のある実施形態において、多官能ｓｉＮＡ分子の各鎖の一部が、ＲＮＡｉを効率的に媒介するのに十分な長さ（例えば、約１５から約２３塩基対）の標的核酸に相補的であるヌクレオチド配列領域と、標的核酸に相補的でないヌクレオチド配列領域とを含むように、約２９から約３６塩基対の長さの多官能ｓｉＮＡを設計することができる。多官能ｓｉＮＡの各鎖中に相補部分と非相補部分の両方を有することによって、多官能ｓｉＮＡは、代謝回転又は解離を妨げる（例えば、各鎖の長さが長すぎて、それぞれの標的核酸配列に対してＲＮＡｉを媒介することができない場合）ことなしに、標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介することができる。また、内部重複領域を有する、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子を設計すると、多官能ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉を媒介するのに好都合な（小さい）サイズ、及び治療薬としての使用に適切なサイズになる（例えば、各鎖は独立に約１８から約２８ヌクレオチド長である。）。非限定的例を図１６−２８に示す。
一実施形態において、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、第１の領域と第２の領域を含み、多官能ｓｉＮＡの第１の領域は、第１の標的核酸分子の核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、多官能ｓｉＮＡの第２の領域は、第２の標的核酸分子の核酸配列に相補的である核酸配列を含む。一実施形態において、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、第１の領域と第２の領域を含み、多官能ｓｉＮＡの第１の領域は、標的核酸分子の第１の領域の核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、多官能ｓｉＮＡの第２の領域は、標的核酸分子の第２の領域の核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、多官能ｓｉＮＡの第１の領域と第２の領域は、ある程度の相補性（例えば、約１から約１０個の相補ヌクレオチド）を共有する別々の核酸配列を含み得る。ある実施形態において、別々の核酸配列を含む複数の多官能ｓｉＮＡコンストラクトは、合成後に、当分野で公知である方法及び試薬によって容易に連結することができ、かかる連結されたコンストラクトは本発明の範囲内である。或いは、多官能ｓｉＮＡの第１の領域と第２の領域は、ヘアピン又はステムループ構造などのある程度の自己相補性を有する単一の核酸配列を含み得る。かかる二本鎖及びヘアピン多官能低分子干渉核酸の非限定的例をそれぞれ図１６及び１７に示す。これらの多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）は、ある種の重複ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。かかる重複ヌクレオチド配列は、多官能ｓｉＮＡの第１の領域と第２の領域の間に存在する（例えば、図１８及び１９参照）。
一実施形態において、本発明は、多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、多官能ｓｉＮＡの各鎖は、異なる標的核酸配列に相補的である核酸配列の第１の領域と、標的配列に相補的でないヌクレオチド配列の第２の領域とを独立に含む。各鎖の標的核酸配列は、同じ標的核酸分子、又は異なる標的核酸分子中に存在する。
別の実施形態において、多官能ｓｉＮＡは２本の鎖を含み、（ａ）第１の鎖は、標的核酸配列に対して配列相補性を有する領域（相補領域１）と、標的ヌクレオチド配列に対して配列相補性を持たない領域（非相補領域１）とを含み、（ｂ）多官能ｓｉＮＡの第２の鎖は、第１の鎖のヌクレオチド配列に相補的である標的ヌクレオチド配列とは異なる標的核酸配列に対して配列相補性を有する領域（相補領域２）と、相補領域２の標的ヌクレオチド配列に対して配列相補性を持たない領域（非相補領域２）とを含み、（ｃ）第１の鎖の相補領域１は、第２の鎖の非相補領域２中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、第２の鎖の相補領域２は、第１の鎖の非相補領域１中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。相補領域１と相補領域２の標的核酸配列は、同じ標的核酸分子、又は異なる標的核酸分子中に存在する。
別の実施形態において、多官能ｓｉＮＡは２本の鎖を含み、（ａ）第１の鎖は、遺伝子（例えば、第１のＰＣＳＫ９遺伝子）に由来する標的核酸配列に対して配列相補性を有する領域（相補領域１）と、相補領域１の標的ヌクレオチド配列に対して配列相補性を持たない領域（非相補領域１）とを含み、（ｂ）多官能ｓｉＮＡの第２の鎖は、相補領域１の遺伝子とは異なる遺伝子（例えば、第２のＰＣＳＫ９遺伝子）に由来する標的核酸配列に対して配列相補性を有する領域（相補領域２）と、相補領域２の標的ヌクレオチド配列に対して配列相補性を持たない領域（非相補領域２）とを含み、（ｃ）第１の鎖の相補領域１は、第２の鎖の非相補領域２中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、第２の鎖の相補領域２は、第１の鎖の非相補領域１中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。
別の実施形態において、多官能ｓｉＮＡは２本の鎖を含み、（ａ）第１の鎖は、遺伝子（例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子）に由来する標的核酸配列に対して配列相補性を有する領域（相補領域１）と、相補領域１の標的ヌクレオチド配列に対して配列相補性を持たない領域（非相補領域１）とを含み、（ｂ）多官能ｓｉＮＡの第２の鎖は、相補領域１の第一の標的核酸配列とは異なる第二の標的核酸配列に対して配列相補性を有する領域（相補領域２）（ただし、相補領域１の標的核酸配列と相補領域２の標的核酸配列はどちらも同じ遺伝子に由来する。）と、相補領域２の標的ヌクレオチド配列に対して配列相補性を持たない領域（非相補領域２）とを含み、（ｃ）第１の鎖の相補領域１は、第２の鎖の非相補領域２中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、第２の鎖の相補領域２は、第１の鎖の非相補領域１中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本発明は、２個の相補核酸配列を含む、多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、第１の配列は、第１の標的核酸分子内のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する第１の領域を含み、第２の配列は、同じ標的核酸分子内の異なるヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する第１の領域を含む。好ましくは、第１の配列の第１の領域は、第２の配列の第２の領域のヌクレオチド配列にも相補的であり、第２の配列の第１の領域は、第１の配列の第２の領域のヌクレオチド配列に相補的である。
一実施形態において、本発明は、２個の相補核酸配列を含む、多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、第１の配列は、第１の標的核酸分子内のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する第１の領域を含み、第２の配列は、第２の標的核酸分子内の異なるヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する第１の領域を含む。好ましくは、第１の配列の第１の領域は、第２の配列の第２の領域のヌクレオチド配列にも相補的であり、第２の配列の第１の領域は、第１の配列の第２の領域のヌクレオチド配列に相補的である。
一実施形態において、本発明は、第１の領域と第２の領域を含む多官能ｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、第１の領域は、第１の標的核酸分子内の核酸配列に相補的である約１８から約２８ヌクレオチドを有する核酸配列を含み、第２の領域は、第２の標的核酸分子内の異なる核酸配列に相補的である約１８から約２８ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本発明は、第１の領域と第２の領域を含む多官能ｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、第１の領域は、標的核酸分子内の核酸配列に相補的である約１８から約２８ヌクレオチドを有する核酸配列を含み、第２の領域は、同じ標的核酸分子内の異なる核酸配列に相補的である約１８から約２８ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本発明は、一方の鎖が、第１の標的核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する第１の領域を含み、他方の鎖が、第２の標的核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する第１の領域を含む、二本鎖多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。第１と第２の標的核酸配列は、別々の標的核酸分子中に存在し得、又は同じ標的核酸分子内の異なる領域であり得る。したがって、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子を用いて、異なる遺伝子、同じ遺伝子のスプライスバリアント、１個以上の遺伝子転写物の変異領域と保存領域の両方、又は同じ若しくは異なる遺伝子若しくは遺伝子転写物のコード配列と非コード配列の両方の発現を標的にすることができる。
一実施形態において、本発明の標的核酸分子は、単一のタンパク質をコードする。別の実施形態において、標的核酸分子は、１個を超えるタンパク質（例えば、１、２、３、４、５個又はそれを超えるタンパク質）をコードする。したがって、本発明の多官能ｓｉＮＡコンストラクトを用いて、幾つかのタンパク質の発現を下方制御又は阻害することができる。例えば、１つのタンパク質をコードする遺伝子に由来する第１の標的核酸配列に対してヌクレオチド配列相補性を有する１本の鎖中の領域を含む多官能ｓｉＮＡ分子、及びＰＣＳＫ９、Ｈ６ＰＤ、ＰＴＰ−１Ｂ、ａｐｏＡＩ／ＣＩＩＩ／ＡＩＶ、ＣＥＴＰ、ＡｐｏＢ、ＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−２、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ１Ｄ、脂肪酸結合タンパク質５、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケクシン９、ＬＸＲ標的遺伝子、メタロプロテアーゼドメイン１１、アポトーシス阻害６及びＦ−ボックスのみのタンパク質３（Ｆ−ｂｏｘ−ｏｎｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ３）又はこれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される２個またはそれ以上のタンパク質（例えば、２つの異なるタンパク質）をコードする遺伝子に由来する標的核酸分子中に存在する第２の標的核酸配列に対してヌクレオチド配列相補性を有する領域を含む第２の鎖（第二の鎖は、、複数のＰＣＳＫ９又はＰＣＳＫ９遺伝子を標的にすることによって、特定の生物学的経路を下方制御、阻害又は遮断することができる。）。
一実施形態において、本発明は、異なる遺伝子ＰＣＳＫ９変種中に存在する保存ヌクレオチド配列を利用する。一方の鎖が、種々のイソフォーム間で保存された１個以上の標的核酸配列に相補的である配列を含み、他方の鎖が、ＰＣＳＫ９、Ｈ６ＰＤ、ＰＴＰ−１Ｂ、ａｐｏＡＩ／ＣＩＩＩ／ＡＩＶ、ＣＥＴＰ、ＡｐｏＢ、ＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−２、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ１Ｄ、脂肪酸結合タンパク質５、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケクシン９、ＬＸＲ標的遺伝子、メタロプロテアーゼドメイン１１、アポトーシス阻害６及びＦ−ボックスのみのタンパク質３のいずれかなどの、標的核酸配列に相補的である配列を含んでいてもよいように、多官能ｓｉＮＡを設計することによって、単一の多官能ｓｉＮＡを用いて、遺伝子疾患に関係する生物学的経路又は生物学的経路中の複数の遺伝子（例えば、高脂血症及び／又はインシュリン耐性）を選択的かつ効果的に調節又は阻害することができる。
一実施形態において、本発明の多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）は、第１の領域と第２の領域を含み、第１の領域は、第１のＰＣＳＫ９標的の第１のＰＣＳＫ９ＲＮＡに相補的であるヌクレオチド配列を含み、第２の領域は、第２のＰＣＳＫ９標的の第２のＰＣＳＫ９ＲＮＡに相補的であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、第１と第２の領域は、同じＰＣＳＫ９標的配列内の異なるＰＣＳＫ９標的部位の共有若しくは保存ＲＮＡ配列、又は異なるＰＣＳＫ９標的配列間の共有ＲＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み得る。
一実施形態において、本発明の二本鎖多官能ｓｉＮＡ分子は、式ＭＦ−Ｉの構造を含む。
Figure 2010503382
 式中、各５’−ｐ−ＸＺＸ’−３’及び５’−ｐ−ＹＺＹ’−３’は独立に、約２０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド長、好ましくは約２０から約２００ヌクレオチド長、約２０から約１００ヌクレオチド長、約２０から約４０ヌクレオチド長、約２０から約４０ヌクレオチド長、約２４から約３８ヌクレオチド長、又は約２６から約３８ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ＸＺは、第１の標的核酸配列に相補的である核酸配列を含み、ＹＺは、第２の標的核酸配列に相補的である核酸配列を含むオリゴヌクレオチドであり、Ｚは、自己相補的である約１から約２４ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチド）長のヌクレオチド配列を含み、Ｘは、領域Ｙ’中に存在するヌクレオチド配列に相補的である、約１から約１００ヌクレオチド長、好ましくは約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長のヌクレオチド配列を含み、Ｙは、領域Ｘ’中に存在するヌクレオチド配列に相補的である、約１から約１００ヌクレオチド長、好ましくは約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長のヌクレオチド配列を含み、各ｐは、独立に存在する、又は存在しない末端リン酸基を含み、各ＸＺ及びＹＺは独立に、それぞれ第１及び第２の標的核酸配列又はその一部と安定に相互作用する（すなわち、塩基対形成する）のに十分な長さである。例えば、各配列Ｘ及びＹは、標的ＲＮＡ又はその一部など、異なる標的核酸分子中の標的ヌクレオチド配列に相補的である、約１２から約２１又はそれを超える（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれを超える）ヌクレオチド長の配列を独立に含み得る。別の非限定的例において、第１の標的核酸配列又はその一部に相補的である、ＸとＺの一緒のヌクレオチド配列の長さは、約１２から約２１又はそれを超える（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれを超える）ヌクレオチドである。別の非限定的例において、第２の標的核酸配列又はその一部に相補的である、ＹとＺの一緒のヌクレオチド配列の長さは、約１２から約２１又はそれを超える（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれを超える）ヌクレオチドである。一実施形態において、第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列は、同じ標的核酸分子（例えば、ＰＣＳＫ９、Ｈ６ＰＤ、ＰＴＰ−１Ｂ、ａｐｏＡＩ／ＣＩＩＩ／ＡＩＶ、ＣＥＴＰ、ＡｐｏＢ、ＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−２、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ１Ｄ、脂肪酸結合タンパク質５、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケクシン９、ＬＸＲ標的遺伝子、メタロプロテアーゼドメイン１１、アポトーシス阻害６及び／又はＦ−ボックスのみのタンパク質３のＲＮＡなどの、ＰＣＳＫ９標的ＲＮＡ又はＰＣＳＫ９経路標的ＲＮＡ）中に存在する。別の実施形態において、第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列は、異なる標的核酸分子（例えば、ＰＣＳＫ９標的ＲＮＡとＰＣＳＫ９経路標的ＲＮＡ）中に存在する。一実施形態において、Ｚは回文構造又は反復配列を含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは同一である。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは異なる。一実施形態において、オリゴヌクレオチドＹとＹ’の長さは同一である。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドＹとＹ’の長さは異なる。一実施形態において、式Ｉ（ａ）の二本鎖オリゴヌクレオチドコンストラクトは、ミスマッチが、二本鎖オリゴヌクレオチドの標的遺伝子発現阻害能力をさほど低下させない程度に、１個以上、具体的には１、２、３又は４個のミスマッチを含む。
一実施形態において、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、式ＭＦ−ＩＩの構造を含む。
Figure 2010503382
 式中、５’−ｐ−ＸＸ’−３’及び５’−ｐ−ＹＹ’−３’は独立に、約２０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド長、好ましくは約２０から約２００ヌクレオチド長、約２０から約１００ヌクレオチド長、約２０から約４０ヌクレオチド長、約２０から約４０ヌクレオチド長、約２４から約３８ヌクレオチド長、又は約２６から約３８ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、Ｘは、第１の標的核酸配列に相補的である核酸配列を含み、Ｙは、第２の標的核酸配列に相補的である核酸配列を含むオリゴヌクレオチドであり、Ｘは、領域Ｙ’中に存在するヌクレオチド配列に相補的である、約１から約１００ヌクレオチド長、好ましくは約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長のヌクレオチド配列を含み、Ｙは、領域Ｘ’中に存在するヌクレオチド配列に相補的である、約１から約１００ヌクレオチド長、好ましくは約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長のヌクレオチド配列を含み、各ｐは、独立に存在する、又は存在しない末端リン酸基を含み、各Ｘ及びＹは独立に、それぞれ第１及び第２の標的核酸配列又はその一部と安定に相互作用する（すなわち、塩基対形成する）のに十分な長さである。例えば、各配列Ｘ及びＹは、標的ＲＮＡ又はその一部など、異なる標的核酸分子中の標的ヌクレオチド配列に相補的である、約１２から約２１又はそれを超える（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれを超える）ヌクレオチド長の配列を独立に含み得る。一実施形態において、第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列は、同じ標的核酸分子（例えば、Ｈ６ＰＤ、ＰＴＰ−１Ｂ，ａｐｏＡＩ／ＣＩＩＩ／ＡＩＶ及び／又はＣＥＴＰＲＮＡなどのＰＣＳＫ９標的ＲＮＡ又はＰＣＳＫ９経路標的ＲＮＡ）中に存在する。別の実施形態において、第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列は、異なる標的核酸分子（例えば、Ｈ６ＰＤ、ＰＴＰ−１Ｂ，ａｐｏＡＩ／ＣＩＩＩ／ＡＩＶ及び／又はＣＥＴＰＲＮＡなどのＰＣＳＫ９標的ＲＮＡおよびＰＣＳＫ９経路標的ＲＮＡ）中に存在する。一実施形態において、Ｚは回文構造又は反復配列を含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは同一である。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは異なる。一実施形態において、オリゴヌクレオチドＹとＹ’の長さは同一である。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドＹとＹ’の長さは異なる。一実施形態において、式Ｉ（ａ）の二本鎖オリゴヌクレオチドコンストラクトは、ミスマッチが、二本鎖オリゴヌクレオチドの標的遺伝子発現阻害能力をさほど低下させない程度に、１個以上、具体的には１、２、３又は４個のミスマッチを含む。
一実施形態において、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、式ＭＦ−ＩＩＩの構造を含む。
Figure 2010503382
 式中、各Ｘ、Ｘ’、Ｙ及びＹ’は独立に、約１５ヌクレオチドから約５０ヌクレオチド長、好ましくは約１８から約４０ヌクレオチド長、又は約１９から約２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、Ｘは、領域Ｙ’中に存在するヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、Ｘ’は、領域Ｙ中に存在するヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、各Ｘ及びＸ’は独立に、それぞれ第１及び第２の標的核酸配列又はその一部と安定に相互作用する（すなわち、塩基対形成する）のに十分な長さであり、Ｗは、配列Ｙ’とＹを連結するヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーであり、多官能ｓｉＮＡは、ＲＮＡ干渉によって第１の標的配列と第２の標的配列の切断を誘導する。一実施形態において、第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列は、同じ標的核酸分子（例えば、ＰＣＳＫ９、Ｈ６ＰＤ、ＰＴＰ−１Ｂ、ａｐｏＡＩ／ＣＩＩＩ／ＡＩＶ、ＣＥＴＰ、ＡｐｏＢ、ＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−２、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ１Ｄ、脂肪酸結合タンパク質５、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケクシン９、ＬＸＲ標的遺伝子、メタロプロテアーゼドメイン１１、アポトーシス阻害６及び／又はＦ−ボックスのみのタンパク質３のＲＮＡなどのＰＣＳＫ９標的ＲＮＡ又はＰＣＳＫ９経路標的ＲＮＡ）中に存在する。別の実施形態において、第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列は、異なる標的核酸分子（例えば、ＰＣＳＫ９、Ｈ６ＰＤ、ＰＴＰ−１Ｂ、ａｐｏＡＩ／ＣＩＩＩ／ＡＩＶ、ＣＥＴＰ、ＡｐｏＢ、ＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−２、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ１Ｄ、脂肪酸結合タンパク質５、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケクシン９、ＬＸＲ標的遺伝子、メタロプロテアーゼドメイン１１、アポトーシス阻害６及び／又はＦ−ボックスのみのタンパク質３のＲＮＡなどのＰＣＳＫ９標的ＲＮＡとＰＣＳＫ９経路標的ＲＮＡ）中に存在する。一実施形態において、領域Ｗは、配列Ｙ’の３’末端を配列Ｙの３’末端と連結する。一実施形態において、領域Ｗは、配列Ｙ’の３’末端を配列Ｙの５’末端と連結する。一実施形態において、領域Ｗは、配列Ｙ’の５’末端を配列Ｙの５’末端と連結する。一実施形態において、領域Ｗは、配列Ｙ’の５’末端を配列Ｙの３’末端と連結する。一実施形態において、末端リン酸基は、配列Ｘの５’末端に存在する。一実施形態において、末端リン酸基は、配列Ｘ’の５’末端に存在する。一実施形態において、末端リン酸基は、配列Ｙの５’末端に存在する。一実施形態において、末端リン酸基は、配列Ｙ’の５’末端に存在する。一実施形態において、Ｗは、生分解性リンカーを介して配列ＹとＹ’を連結する。一実施形態において、Ｗは、抱合体、標識、アプタマー、リガンド、脂質又はポリマーを更に含む。
一実施形態において、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、式ＭＦ−ＩＶの構造を含む。
Figure 2010503382
 式中、各Ｘ、Ｘ’、Ｙ及びＹ’は独立に、約１５ヌクレオチドから約５０ヌクレオチド長、好ましくは約１８から約４０ヌクレオチド長、又は約１９から約２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、Ｘは、領域Ｙ’中に存在するヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、Ｘ’は、領域Ｙ中に存在するヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、各Ｙ及びＹ’は独立に、それぞれ第１及び第２の標的核酸配列又はその一部と安定に相互作用する（すなわち、塩基対形成する）のに十分な長さであり、Ｗは、配列Ｙ’とＹを連結するヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーであり、多官能ｓｉＮＡは、ＲＮＡ干渉によって第１の標的配列と第２の標的配列の切断を誘導する。一実施形態において、第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列は、同じ標的核酸分子（例えば、ＰＣＳＫ９、Ｈ６ＰＤ、ＰＴＰ−１Ｂ、ａｐｏＡＩ／ＣＩＩＩ／ＡＩＶ、ＣＥＴＰ、ＡｐｏＢ、ＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−２、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ１Ｄ、脂肪酸結合タンパク質５、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケクシン９、ＬＸＲ標的遺伝子、メタロプロテアーゼドメイン１１、アポトーシス阻害６及び／又はＦ−ボックスのみのタンパク質３のＲＮＡ）中に存在する。別の実施形態において、第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列は、異なる標的核酸分子（例えば、ＰＣＳＫ９、Ｈ６ＰＤ、ＰＴＰ−１Ｂ、ａｐｏＡＩ／ＣＩＩＩ／ＡＩＶ、ＣＥＴＰ、ＡｐｏＢ、ＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−２、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ１Ｄ、脂肪酸結合タンパク質５、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケクシン９、ＬＸＲ標的遺伝子、メタロプロテアーゼドメイン１１、アポトーシス阻害６及び／又はＦ−ボックスのみのタンパク質３のＲＮＡなどの、ＰＣＳＫ９標的ＲＮＡお呼びＰＣＳＫ９経路標的ＲＮＡ）中に存在する。一実施形態において、領域Ｗは、配列Ｙ’の３’末端を配列Ｙの３’末端と連結する。一実施形態において、領域Ｗは、配列Ｙ’の３’末端を配列Ｙの５’末端と連結する。一実施形態において、領域Ｗは、配列Ｙ’の５’末端を配列Ｙの５’末端と連結する。一実施形態において、領域Ｗは、配列Ｙ’の５’末端を配列Ｙの３’末端と連結する。一実施形態において、末端リン酸基は、配列Ｘの５’末端に存在する。一実施形態において、末端リン酸基は、配列Ｘ’の５’末端に存在する。一実施形態において、末端リン酸基は、配列Ｙの５’末端に存在する。一実施形態において、末端リン酸基は、配列Ｙ’の５’末端に存在する。一実施形態において、Ｗは、生分解性リンカーを介して配列ＹとＹ’を連結する。一実施形態において、Ｗは、抱合体、標識（ｌａｂｌｅ）、アプタマー、リガンド、脂質又はポリマーを更に含む。
一実施形態において、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、式ＭＦ−Ｖの構造を含む。
Figure 2010503382
 式中、各Ｘ、Ｘ’、Ｙ及びＹ’は独立に、約１５ヌクレオチドから約５０ヌクレオチド長、好ましくは約１８から約４０ヌクレオチド長、又は約１９から約２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、Ｘは、領域Ｙ’中に存在するヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、Ｘ’は、領域Ｙ中に存在するヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、各Ｘ、Ｘ’、Ｙ又はＹ’は独立に、それぞれ第１、第２、第３又は第４の標的核酸配列又はその一部と安定に相互作用する（すなわち、塩基対形成する）のに十分な長さであり、Ｗは、配列Ｙ’とＹを連結するヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーであり、多官能ｓｉＮＡは、ＲＮＡ干渉によって第１、第２、第３及び／又は第４の標的配列の切断を誘導する。一実施形態において、第１、第２、第３及び第４の標的核酸配列はすべて同じ標的核酸分子（例えば、ＰＣＳＫ９、Ｈ６ＰＤ、ＰＴＰ−１Ｂ、ａｐｏＡＩ／ＣＩＩＩ／ＡＩＶ、ＣＥＴＰ、ＡｐｏＢ、ＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−２、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ１Ｄ、脂肪酸結合タンパク質５、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケクシン９、ＬＸＲ標的遺伝子、メタロプロテアーゼドメイン１１、アポトーシス阻害６及び／又はＦ−ボックスのみのタンパク質３のＲＮＡなどの、ＰＣＳＫ９標的ＲＮＡ又はＰＣＳＫ９経路標的ＲＮＡ）中に存在する。別の実施形態において、第１、第２、第３及び第４の標的核酸配列は、異なる標的核酸分子（例えば、ＰＣＳＫ９、Ｈ６ＰＤ、ＰＴＰ−１Ｂ、ａｐｏＡＩ／ＣＩＩＩ／ＡＩＶ、ＣＥＴＰ、ＡｐｏＢ、ＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−２、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ１Ｄ、脂肪酸結合タンパク質５、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケクシン９、ＬＸＲ標的遺伝子、メタロプロテアーゼドメイン１１、アポトーシス阻害６及び／又はＦ−ボックスのみのタンパク質３のＲＮＡなどの、ＰＣＳＫ９標的ＲＮＡ及びＰＣＳＫ９経路標的ＲＮＡ）中に独立に存在する。一実施形態において、領域Ｗは、配列Ｙ’の３’末端を配列Ｙの３’末端と連結する。一実施形態において、領域Ｗは、配列Ｙ’の３’末端を配列Ｙの５’末端と連結する。一実施形態において、領域Ｗは、配列Ｙ’の５’末端を配列Ｙの５’末端と連結する。一実施形態において、領域Ｗは、配列Ｙ’の５’末端を配列Ｙの３’末端と連結する。一実施形態において、末端リン酸基は、配列Ｘの５’末端に存在する。一実施形態において、末端リン酸基は、配列Ｘ’の５’末端に存在する。一実施形態において、末端リン酸基は、配列Ｙの５’末端に存在する。一実施形態において、末端リン酸基は、配列Ｙ’の５’末端に存在する。一実施形態において、Ｗは、生分解性リンカーを介して配列ＹとＹ’を連結する。一実施形態において、Ｗは、抱合体、標識、アプタマー、リガンド、脂質又はポリマーを更に含む。
一実施形態において、（例えば、式ＭＦ−ＩからＭＦ−Ｖのいずれかの）本発明の多官能ｓｉＮＡ分子の領域ＸとＹは、同じ標的核酸分子の一部である異なる標的核酸配列に相補的である。一実施形態において、かかる各標的核酸配列は、ＲＮＡ転写物のコード領域内の異なる場所に存在する。一実施形態において、かかる各標的核酸配列は、同じＲＮＡ転写物のコード及び非コード領域を含む。一実施形態において、かかる各標的核酸配列は、交互にスプライスされた転写物の領域、又はかかる交互にスプライスされた転写物の前駆体の領域を含む。
一実施形態において、式ＭＦ−ＩからＭＦ−Ｖのいずれかの多官能ｓｉＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載の式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド、表ＩＶに記載の安定化ケミストリー、本明細書の種々の実施形態に記載の修飾ヌクレオチドと非ヌクレオチドの任意の他の組合せなど、本明細書に記載の化学修飾を、これらだけに限定されずに含み得る。
一実施形態において、式ＭＦ−Ｉ又はＭＦ−ＩＩの多官能ｓｉＮＡコンストラクトのＺ中の回文構造若しくは反復配列又は修飾ヌクレオチド（例えば、２−アミノプリン、汎用塩基などの修飾塩基を有するヌクレオチド）は、標的核酸配列（例えば、ワトソン クリック塩基対又は非ワトソン クリック塩基対を形成し得る修飾塩基類似体）の一部と相互作用し得る化学修飾ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子、例えばＭＦ−ＩからＭＦ−Ｖの多官能ｓｉＮＡの各鎖は、約１５から約４０個のヌクレオチド（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個のヌクレオチド）を独立に含む。一実施形態において、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、１個以上の化学修飾を含む。非限定的例において、化学修飾ヌクレオチド及び／又は非ヌクレオチドを本発明の核酸分子に導入することは、外因的に送達される無修飾ＲＮＡ分子に固有のインビボでの安定性及び生物学的利用能の潜在的限界を克服する強力なツールとなる。例えば、化学修飾核酸分子を使用すると、化学修飾核酸分子は、血清中又は細胞若しくは組織中でより長い半減期を有する傾向にあるので、所与の治療効果に対する特定の核酸分子の用量を減少させることができる。また、ある種の化学修飾は、半減期を延長するだけでなく、特定の器官、細胞又は組織への核酸分子のターゲティングを容易にし、及び／又は核酸分子の細胞内取り込みを改善することによって、核酸分子の生物学的利用能及び／又は効力を改善することができる。したがって、化学修飾核酸分子の活性がインビトロで未変性／無修飾核酸分子よりも低い場合でも、例えば、無修飾ＲＮＡ分子と比較したときに、分子の安定性、効力、有効期間、生物学的利用能及び／又は送達が改善されたために、修飾核酸分子の全活性が、未変性又は無修飾核酸分子よりも大きくなり得る。
別の実施形態において、本発明は、２本の別々の二本鎖ｓｉＮＡから組み立てられ、２本のアンチセンスｓｉＮＡ鎖が、一端で互いに繋留されたその対応するセンス鎖と徐冷されるように、各センス鎖の末端の一方が、他方のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の末端に繋留された、多官能ｓｉＮＡを特徴とする（図２２参照）。繋留鎖（ｔｅｔｈｅｒ）又はリンカーは、当分野で一般に公知であり、本明細書に記載された、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。
一実施形態において、本発明は、２本の別々の二本鎖ｓｉＮＡから組み立てられ、２本のアンチセンスｓｉＮＡ鎖の５’末端が、互いに（反対方向に）離れた位置で、一端で互いに繋留されたその対応するセンス鎖と徐冷されるように、ｓｉＮＡの１本のセンス鎖の５’末端が、他方のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端に繋留された、多官能ｓｉＮＡを特徴とする（図２２（Ａ）参照）。繋留鎖又はリンカーは、当分野で一般に公知であり、本明細書に記載された、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。
一実施形態において、本発明は、２本の別々の二本鎖ｓｉＮＡから組み立てられ、２本のアンチセンスｓｉＮＡ鎖の５’末端が、向かい合って、一端で互いに繋留されたその対応するセンス鎖と徐冷されるように、ｓｉＮＡの１本のセンス鎖の３’末端が、他方のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の３’末端に繋留された、多官能ｓｉＮＡを特徴とする（図２２（Ｂ）参照）。繋留鎖又はリンカーは、当分野で一般に公知であり、本明細書に記載された、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。
一実施形態において、本発明は、２本の別々の二本鎖ｓｉＮＡから組み立てられ、アンチセンスｓｉＮＡ鎖の一方の５’末端が、他方のアンチセンス鎖の３’末端と向かい合って、一端で互いに繋留されたその対応するセンス鎖と徐冷されるように、ｓｉＮＡの１本のセンス鎖の５’末端が、他方のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の３’末端に繋留された、多官能ｓｉＮＡを特徴とする（図２２（Ｃ−Ｄ）参照）。繋留鎖又はリンカーは、当分野で一般に公知であり、本明細書に記載された、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。
一実施形態において、本発明は、２本の別々の二本鎖ｓｉＮＡから組み立てられ、センスｓｉＮＡ鎖の一方の５’末端が、他方のセンス鎖の３’末端と向かい合って、一端で互いに繋留されたその対応するアンチセンス鎖と徐冷されるように、ｓｉＮＡの１本のアンチセンス鎖の５’末端が、他方のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の３’末端に繋留された、多官能ｓｉＮＡを特徴とする（図２２（Ｇ−Ｈ）参照）。一実施形態において、第１のアンチセンス鎖の５’末端と第２のアンチセンス鎖の３’末端との結合は、容易に切断されて（例えば、生分解性リンカー）、多官能ｓｉＮＡの各アンチセンス鎖の５’末端が、ＲＮＡ干渉による標的ＲＮＡの切断を媒介するのに適切な遊離５’末端を有するように設計される。繋留鎖又はリンカーは、当分野で一般に公知であり、本明細書に記載された、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。
一実施形態において、本発明は、２本の別々の二本鎖ｓｉＮＡから組み立てられ、センスｓｉＮＡ鎖の一方の３’末端が、他方のセンス鎖の３’末端と向かい合って、一端で互いに繋留されたその対応するアンチセンス鎖と徐冷されるように、ｓｉＮＡの１本のアンチセンス鎖の５’末端が、他方のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の５’末端に繋留された、多官能ｓｉＮＡを特徴とする（図２２（Ｅ）参照）。一実施形態において、第１のアンチセンス鎖の５’末端と第２のアンチセンス鎖の５’末端との結合は、容易に切断されて（例えば、生分解性リンカー）、多官能ｓｉＮＡの各アンチセンス鎖の５’末端が、ＲＮＡ干渉による標的ＲＮＡの切断を媒介するのに適切な遊離５’末端を有するように設計される。繋留鎖又はリンカーは、当分野で一般に公知であり、本明細書に記載された、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。
一実施形態において、本発明は、２本の別々の二本鎖ｓｉＮＡから組み立てられ、センスｓｉＮＡ鎖の一方の５’末端が、他方のセンス鎖の３’末端と向かい合って、一端で互いに繋留されたその対応するアンチセンス鎖と徐冷されるように、ｓｉＮＡの１本のアンチセンス鎖の３’末端が、他方のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の３’末端に繋留された、多官能ｓｉＮＡを特徴とする（図２２（Ｆ）参照）。一実施形態において、第１のアンチセンス鎖の５’末端と第２のアンチセンス鎖の５’末端との結合は、容易に切断されて（例えば、生分解性リンカー）、多官能ｓｉＮＡの各アンチセンス鎖の５’末端が、ＲＮＡ干渉による標的ＲＮＡの切断を媒介するのに適切な遊離５’末端を有するように設計される。繋留鎖又はリンカーは、当分野で一般に公知であり、本明細書に記載された、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。
上記実施形態のいずれにおいても、第１の標的核酸配列又は第２の標的核酸配列は、ＰＣＳＫ９、Ｈ６ＰＤ、ＰＴＰ−１Ｂ、ａｐｏＡＩ／ＣＩＩＩ／ＡＩＶ、ＣＥＴＰ、ＡｐｏＢ、ＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−２、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ１Ｄ、脂肪酸結合タンパク質５、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケクシン９、ＬＸＲ標的遺伝子、メタロプロテアーゼドメイン１１、アポトーシス阻害６及び／又はＦ−ボックスのみのタンパク質３のＲＮＡ、ＤＮＡ又はその一部を独立に含み得る。一実施形態において、第１の標的核酸配列は、ＰＣＳＫ９標的ＲＮＡ、ＤＮＡ又はこれらの一部及び第２のＰＣＳＫ９ＲＮＡ、ＤＮＡ又はこれらの一部である。一実施形態において、第１の標的核酸配列は、ＰＣＳＫ９、Ｈ６ＰＤ、ＰＴＰ−１Ｂ、ａｐｏＡＩ／ＣＩＩＩ／ＡＩＶ、ＣＥＴＰ、ＡｐｏＢ、ＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−２、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ１Ｄ、脂肪酸結合タンパク質５、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケクシン９、ＬＸＲ標的遺伝子、メタロプロテアーゼドメイン１１、アポトーシス阻害６及び／又はＦ−ボックスのみのンパク質３のＲＮＡ又はこれらの一部などＰＣＳＫ９と関連する疾病プロセスに関与するポリヌクレオチドコード又は非コード配列である。
核酸分子の合成
１００ヌクレオチド長よりも大きい核酸の合成は、自動化された方法では困難であり、かかる分子の治療コストは法外である。本発明では、低分子核酸モチーフ（「低分子」とは、１００ヌクレオチド長以下、好ましくは８０ヌクレオチド長以下、最も好ましくは５０ヌクレオチド長以下の核酸モチーフ、例えば、個々のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド配列、又はタンデム合成されたｓｉＮＡ配列を指す。）は、外因的な送達に好ましくは使用される。これらの分子の構造が簡単であると、タンパク質及び／又はＲＮＡ構造の標的領域に侵入する核酸の能力が増大する。本発明の例示的な分子は化学合成され、他の分子も同様に合成することができる。
オリゴヌクレオチド（例えば、ある種の修飾オリゴヌクレオチド、又はリボヌクレオチドを欠くオリゴヌクレオチドの部分）は、当分野で公知のプロトコルによって、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１，３−１９、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他、国際公開第９９／５４４５９号、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３，２６７７−２６８４、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ．，７４，５９，Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５及びＢｒｅｎｎａｎ、米国特許第６，００１，３１１号に記載したとおりに、合成される。これらの参考文献のすべてを参照により本明細書に組み込む。オリゴヌクレオチドの合成は、５’末端におけるジメトキシトリチル、３’末端におけるホスホルアミダイトなどの一般的な核酸保護基及びカップリング基を利用する。非限定的例において、３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成装置を用いて、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドに対する２．５分間のカップリング段階、及び２’−デオキシヌクレオチド又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドに対する４５秒間のカップリング段階を含む、０．２μｍｏｌ規模のプロトコルによって、小規模合成を実施する。表Ｖは、合成サイクルに使用する試薬の量及び接触時間の概略である。或いは、０．２μｍｏｌ規模の合成を、Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）製装置などの９６ウェルプレート合成装置を用いて、サイクルを最小限度に変更して、実施することができる。ポリマーに結合した５’ヒドロキシルを基準として、３３倍過剰（０．１１Ｍ ６０μＬ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイト及び１０５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍ ６０μＬ＝１５μｍｏｌ）を、２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルに使用することができる。ポリマーに結合した５’ヒドロキシルを基準として、２２倍過剰（０．１１Ｍ ４０μＬ＝４．４μｍｏｌ）のデオキシホスホルアミダイト及び７０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍ ４０μＬ＝１０μｍｏｌ）を、デオキシ残基の各カップリングサイクルに使用することができる。トリチル画分の比色定量によって求められる３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成装置による平均カップリング収率は、典型的には９７．５−９９％である。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成装置用の他のオリゴヌクレオチド合成試薬としては、以下のものが挙げられる。脱トリチル化溶液は、３％ＴＣＡの塩化メチレン溶液（ＡＢＩ）である。キャッピングは、１６％Ｎ−メチルイミダゾールのＴＨＦ溶液（ＡＢＩ）及び１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジンのＴＨＦ溶液（ＡＢＩ）を用いて行われる。酸化溶液は、１６．９ｍＭ Ｉ２、４９ｍＭピリジン、９％水のＴＨＦ溶液（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）である。Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｇｒａｄｅアセトニトリルを試薬瓶から直接使用する。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（０．２５Ｍアセトニトリル溶液）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から調製する。或いは、ホスホロチオアート結合を導入するために、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド、０．０５Ｍアセトニトリル溶液）を使用する。
ＤＮＡを主体にしたオリゴヌクレオチドの脱保護を以下のように実施する。ポリマーに結合したトリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬガラスねじぶた付きバイアルに移し、４０％メチルアミン水溶液（１ｍＬ）の溶液に６５℃で１０分間懸濁させる。−２０℃に冷却後、上清をポリマー支持体から除去する。支持体をＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ／３：１：１ １．０ｍＬで３回洗浄し、ボルテックス撹拌し、次いで上清を第１の上清に添加する。オリゴリボヌクレオチドを含む混合上清を乾燥させて白色粉末にする。一実施形態において、参照によりその全体を本明細書に組み込む、米国特許第６，９９５，２５９号、同６，６８６，４６３号、同６，６７３，９１８号、同６，６４９，７５１号、同６，９８９，４４２号及びＵＳＳＮ１０／１９０，３５９に記載の方法によって、本発明の核酸分子を合成し、脱保護し、分析する。
本発明のある種のｓｉＮＡ分子を含めたＲＮＡに対して用いられる合成方法は、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，１０９，７８４５； Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３及びＷｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３，２６７７−２６８４ Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ．，７４，５９に記載の手順に従い、５’末端におけるジメトキシトリチル、３’末端におけるホスホルアミダイトなどの一般的な核酸保護基及びカップリング基を利用する。非限定的例において、３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成装置を用いて、アルキルシリルで保護されたヌクレオチドに対する７．５分間のカップリング段階、及び２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドに対する２．５分間のカップリング段階を含む、０．２μｍｏｌ規模のプロトコルによって、小規模合成を実施する。表Ｖは、合成サイクルに使用する試薬の量及び接触時間の概略である。或いは、０．２μｍｏｌ規模の合成を、Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）製装置などの９６ウェルプレート合成装置を用いて、サイクルを最小限度に変更して、実施することができる。ポリマーに結合した５’ヒドロキシルを基準として、３３倍過剰（０．１１Ｍ ６０μＬ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイト及び７５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍ ６０μＬ＝１５μｍｏｌ）を、２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルに使用することができる。ポリマーに結合した５’ヒドロキシルを基準として、６６倍過剰（０．１１Ｍ １２０μＬ＝１３．２μｍｏｌ）の、アルキルシリル（リボ）で保護されたホスホルアミダイト、及び１５０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍ １２０μＬ＝３０μｍｏｌ）を、リボ残基の各カップリングサイクルに使用することができる。トリチル画分の比色定量によって求められる３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成装置による平均カップリング収率は、典型的には９７．５−９９％である。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成装置用の他のオリゴヌクレオチド合成試薬としては、以下のものが挙げられる。脱トリチル化溶液は、３％ＴＣＡの塩化メチレン溶液（ＡＢＩ）である。キャッピングは、１６％Ｎ−メチルイミダゾールのＴＨＦ溶液（ＡＢＩ）及び１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジンのＴＨＦ溶液（ＡＢＩ）を用いて行われる。酸化溶液は、１６．９ｍＭ Ｉ２、４９ｍＭピリジン、９％水のＴＨＦ溶液（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）である。Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｇｒａｄｅアセトニトリルを試薬瓶から直接使用する。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（０．２５Ｍアセトニトリル溶液）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から調製する。或いは、ホスホロチオアート結合を導入するために、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド、０．０５Ｍアセトニトリル溶液）を使用する。
ＲＮＡの脱保護は、２ポット（ｔｗｏ−ｐｏｔ）又は１ポット（ｏｎｅ−ｐｏｔ）プロトコルによって実施される。２ポットプロトコルの場合、ポリマーに結合したトリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬガラスねじぶた付きバイアルに移し、４０％メチルアミン水溶液（１ｍＬ）の溶液に６５℃で１０分間懸濁させる。−２０℃に冷却後、上清をポリマー支持体から除去する。支持体をＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ／３：１：１ １．０ｍＬで３回洗浄し、ボルテックス撹拌し、次いで上清を第１の上清に添加する。オリゴリボヌクレオチドを含む混合上清を乾燥させて白色粉末にする。塩基で脱保護されたオリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ／ＨＦ／ＮＭＰ溶液（Ｎ−メチルピロリジノン１．５ｍＬ、ＴＥＡ ７５０μＬ及びＴＥＡ・３ＨＦ １ｍＬの溶液３００μＬで１．４Ｍ ＨＦ濃度にする。）に再懸濁させ、６５℃に加熱する。１．５時間後、オリゴマーを１．５Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３でクエンチする。一実施形態において、参照によりその全体を本明細書に組み込む、米国特許第６，９９５，２５９号、同６，６８６，４６３号、同６，６７３，９１８号、同６，６４９，７５１号、同６，９８９，４４２号及び米国特許出願第１０／１９０，３５９号に記載の方法によって、本発明の核酸分子を合成し、脱保護し、分析する。
或いは、１ポットプロトコルの場合、ポリマーに結合したトリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬガラスねじぶた付きバイアルに移し、３３％エタノール性メチルアミン／ＤＭＳＯ：１／１（０．８ｍＬ）の溶液に６５℃で１５分間懸濁させる。バイアルを室温にし、ＴＥＡ・３ＨＦ（０．１ｍＬ）を添加し、バイアルを６５℃で１５分間加熱する。試料を−２０℃に冷却し、次いで１．５Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３でクエンチする。
トリチルオンオリゴマーを精製する場合、クエンチしたＮＨ４ＨＣＯ３溶液を、アセトニトリル、続いて５０ｍＭ ＴＥＡＡで予洗したＣ−１８含有カートリッジに充填する。充填されたカートリッジを水で洗浄後、ＲＮＡを０．５％ＴＦＡで１３分間脱トリチル化する。次いで、カートリッジを水で再洗浄し、塩を１Ｍ ＮａＣｌで交換し、水で再洗浄する。次いで、オリゴヌクレオチドを３０％アセトニトリルで溶出させる。
平均段階的カップリング収率は、典型的には＞９８％である（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３，２６７７−２６８４）。当業者は、９６ウェル形式を含めて、ただしこれだけに限定されない、上記例よりも大きい、又は小さい合成規模を適合させることができる。
或いは、本発明の核酸分子は、別々に合成し、合成後に、例えばライゲーション（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒ他、国際公開第９３／２３５６９号； Ｓｈａｂａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９，４２４７； Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１； Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ８，２０４）によって、又は合成及び／又は脱保護後のハイブリダイゼーションによって、連結することができる。
本発明のｓｉＮＡ分子は、本明細書の実施例１に記載のタンデム合成法によって合成することもできる。ここで、両方のｓｉＮＡ鎖は、切断可能なリンカーによって分離された単一の隣接オリゴヌクレオチド断片又は鎖として合成される。続いて、切断可能なリンカーを切断して、別々のｓｉＮＡ断片又は鎖を生成する。別々のｓｉＮＡ断片又は鎖は、ハイブリッド形成し、ｓｉＮＡ二本鎖の精製が可能になる。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーでも、非ヌクレオチドリンカーでもよい。本明細書に記載するｓｉＮＡのタンデム合成は、９６ウェルなどのマルチウェル／マルチプレート合成プラットフォーム、又は同様により大きいマルチウェルプラットフォームに容易に適合させることができる。本明細書に記載するｓｉＮＡのタンデム合成は、回分式反応装置、合成カラムなどを使用した大規模合成プラットフォームに容易に適合させることもできる。
ｓｉＮＡ分子は、一方の断片がセンス領域を含み、他方の断片がＲＮＡ分子のアンチセンス領域を含む、２個の異なる核酸鎖又は断片から組み立てることもできる。
本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼに耐性のある基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈで修飾することによって、徹底して修飾して、安定性を高めることができる（総説については、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ １７，３４； Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ３１，１６３を参照されたい。）。ｓｉＮＡコンストラクトは、一般的な方法を用いたゲル電気泳動によって精製することができ、又は高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；その全体を参照により本明細書に組み込む、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（前掲）参照）によって精製することができ、水に再懸濁させることができる。
本発明の別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡベクター中に挿入された転写単位から発現される。組み換えベクターは、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターであり得る。ｓｉＮＡを発現するウイルスベクターは、これらだけに限定されないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス又はアルファウイルスに基づいて構築することができる。ｓｉＮＡ分子を発現可能である組み換えベクターは、本明細書に記載のとおりに送達し、標的細胞中に存続させることができる。或いは、ｓｉＮＡ分子の一過性発現を与えるウイルスベクターを使用することができる。
本発明の核酸分子の活性の最適化
修飾（塩基、糖及び／又はリン酸）を有する化学合成された核酸分子は、血清リボヌクレアーゼによる分解を防止することができ、それによってその抗力を高めることができる（例えば、その全部を参照により本明細書に組み込む、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ他、国際公開第９２／０７０６５号；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １７，３３４；Ｕｓｍａｎ他、国際公開第９３／１５１８７号；Ｒｏｓｓｉ他、国際公開第９１／０３１６２号；Ｓｐｒｏａｔ、米国特許第５，３３４，７１１号；Ｇｏｌｄ他、米国特許第６，３００，０７４号及びＢｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．（前掲）参照）。上記参考文献はすべて、本明細書に記載する核酸分子の塩基、リン酸及び／又は糖部分に対してなし得る種々の化学修飾を記載している。細胞におけるその抗力を増強するように修飾し、核酸分子から塩基を除去して、オリゴヌクレオチド合成時間を短縮し、化学物質の必要性を低下させることが望ましい。
核酸分子に導入して、ヌクレアーゼ安定性及び効力をかなり増強させることができる、糖、塩基及びリン酸の修飾を記述した例が当分野では幾つかある。例えば、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈ、ヌクレオチド塩基修飾でオリゴヌクレオチドを修飾することによって、安定性及び／又は生物活性を増強する（総説については、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ． １７，３４； Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ３１，１６３； Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０を参照されたい。）。核酸分子の糖修飾は、当分野では広範に記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ他、国際公開第９２／０７０６５号；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４４，５６５−５６８； Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５３，３１４−３１７； Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．，１９９２，１７，３３４−３３９； Ｕｓｍａｎ他、国際公開第９３／１５１８７号；Ｓｐｒｏａｔ、米国特許第５，３３４，７１１号及びＢｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２７０，２５７０２； Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ他、国際公開第９７／２６２７０号；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ他、米国特許第５，７１６，８２４号；Ｕｓｍａｎ他、米国特許第５，６２７，０５３号；Ｗｏｏｌｆ他、国際公開第９８／１３５２６号；１９９８年４月２０日に出願されたＴｈｏｍｐｓｏｎ他、ＵＳＳＮ６０／０８２，４０４； Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３９，１１３１； Ｅａｒｎｓｈａｗ ａｎｄ Ｇａｉｔ，１９９８，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），４８，３９−５５； Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９８，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，９９−１３４並びにＢｕｒｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．，５，１９９９−２０１０参照。これらの参考文献のすべてを参照によりその全体を本明細書に組み込む。）。かかる刊行物は、触媒作用を調節せずに、糖、塩基及び／又はリン酸修飾などを核酸分子に組み入れる場所を決定する一般的方法及び戦略を記載しており、参照により本明細書に組み込む。かかる教示を考慮して、細胞においてＲＮＡｉを促進するｓｉＮＡの能力がさほど阻害されない限り、類似の修飾を本明細書に記載のとおりに用いて、本発明のｓｉＮＡ核酸分子を修飾することができる。
一実施形態において、本発明の核酸分子は、参照によりその全体を本明細書に組み込む、ＵＳ２００５００２０５２１に記載したとおりに化学修飾される。
ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート及び／又は５’−メチルホスホナート結合によるオリゴヌクレオチドヌクレオチド間結合の化学修飾は安定性を改善するが、過剰な修飾は幾らかの毒性を生じ、又は活性を低下させ得る。したがって、核酸分子を設計するときには、これらのヌクレオチド間結合の量を最小限に抑えるべきである。これらの結合の濃度を減少させると、毒性が低下し、これらの分子の効力が増加し、特異性が高くなるはずである。
活性を維持又は増強する化学修飾を有する低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。また、かかる核酸は、ヌクレアーゼに対する耐性が無修飾核酸よりも一般に高い。したがって、インビトロ及び／又はインビボでの活性は、さほど低下しないはずである。調節を目的とする場合には、外因的に送達される治療用核酸分子は、最適には、標的ＲＮＡの翻訳が調節されて、望ましくないタンパク質のレベルが低下するまで、細胞内で安定であるべきである。この時間は、病態に応じて数時間から数日まで変動する。ＲＮＡ及びＤＮＡの化学合成が改善されたことによって（（参照により本明細書に組み込む）Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３，２６７７； Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１，３−１９）、上述したように、ヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を高めることによって核酸分子を修飾する能力が拡大した。
一実施形態において、本発明の核酸分子は、１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）Ｇクランプヌクレオチドを含む。Ｇクランプヌクレオチドは、修飾シトシン類似体である。この修飾は、二本鎖内の相補グアニンのワトソン クリック面とフーグスティーン面の両方の水素結合能力を与える。例えば、Ｌｉｎ ａｎｄ Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，１９９８，Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，１２０，８５３１−８５３２を参照されたい。オリゴヌクレオチド内の単一のＧクランプ類似体を置換することによって、相補オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するときのらせんの熱安定性及びミスマッチ識別性を実質的に増強することができる。かかるヌクレオチドを本発明の核酸分子に含めることによって、核酸標的、相補配列又は鋳型鎖に対する親和性と特異性の両方が増強される。別の実施形態において、本発明の核酸分子は、１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）２’，４’−ＣメチレンビシクロヌクレオチドなどのＬＮＡ「ロックされた核酸」ヌクレオチドを含む（例えば、Ｗｅｎｇｅｌ他、国際公開第００／６６６０４号及び同９９／１４２２６号参照）。
別の実施形態において、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子の抱合体及び／又は複合体を特徴とする。かかる抱合体及び／又は複合体を用いて、細胞などの生物系へのｓｉＮＡ分子の送達を容易にすることができる。本発明によって提供される抱合体及び複合体は、治療化合物を細胞膜を越えて輸送し、薬物動態学を変更し、及び／又は本発明の核酸分子の局在化を調節することによって、治療活性を与えることができる。本発明は、小分子、脂質、コレステロール、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、毒素、負に帯電したポリマー及び他のポリマー、例えば、タンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコール又はポリアミンを含めて、ただしこれらだけに限定されない分子を、細胞膜を越えて送達するための新規抱合体及び複合体の設計及び合成を包含する。一般に、記載するトランスポーターは、個々に、又は多成分系の一部として、分解性リンカーと一緒に、又は分解性リンカーなしで、使用するように設計される。これらの化合物は、血清の存在下又は非存在下で、異なる組織に由来する幾つかの細胞タイプへの本発明の核酸分子の送達及び／又は局在化を改善すると予測される（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ及びＣｅｃｈ、米国特許第５，８５４，０３８号参照）。本明細書に記載する分子の抱合体は、生分解性核酸リンカー分子などの生分解性リンカーを介して、生物活性分子に結合し得る。
本明細書では「生分解性リンカー」という用語は、１個の分子を別の分子に、例えば、生物活性分子を本発明のｓｉＮＡ分子に接続する、又は本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖を接続する、生分解性リンカーとして設計される核酸又は非核酸リンカー分子を指す。生分解性リンカーは、特定の組織又は細胞タイプへの送達などの特定の目的のためにその安定性を調節することができるように設計される。核酸を主体とした生分解性リンカー分子の安定性は、種々のケミストリー、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド及び（２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル、他の２’修飾又は塩基修飾ヌクレオチドなどの）化学修飾ヌクレオチドの組合せを用いることによって調節することができる。生分解性核酸リンカー分子は、２量体、３量体、４量体又はより長鎖の核酸分子、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり得、又はリン系結合、例えば、ホスホルアミダート若しくはリン酸ジエステル結合を有する単一のヌクレオチドを含み得る。生分解性核酸リンカー分子は、核酸骨格、核酸糖又は核酸塩基修飾も含み得る。
本明細書では「生分解性」という用語は、生物系における分解、例えば、酵素による分解、又は化学分解を指す。
本明細書では「生物活性分子」という用語は、系において生物学的反応を誘発又は改変し得る化合物又は分子を指す。生物活性ｓｉＮＡ分子単独の、又は本発明によって企図される他の分子と組み合わせた生物活性ｓｉＮＡ分子の、非限定的例としては、治療上活性な分子、例えば、抗体、コレステロール、ホルモン、抗ウイルス剤、ペプチド、タンパク質、化学療法剤、小分子、ビタミン、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素的核酸（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、２，５−Ａキメラ、ｓｉＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アロザイム、アプタマー、デコイ、その類似体など、治療に有効な分子が挙げられる。本発明の生物活性分子としては、他の生物活性分子の薬物動態学及び／又は薬力学を調節することができる分子、例えば、脂質、及びポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、他のポリエーテルなどのポリマーも含まれる。
本明細書では「リン脂質」という用語は、少なくとも１個のリン基（ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｇｒｏｕｐ）を含む疎水性分子を指す。例えば、リン脂質は、リン含有基と、ＯＨ、ＣＯＯＨ、オキソ、アミン又は置換若しくは非置換アリール基で置換されていてもよい飽和又は不飽和アルキル基とを含み得る。
外因的に送達される治療用核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）は、最適には、ＲＮＡの逆転写が調節されて、ＲＮＡ転写物レベルが低下するまで、細胞内で安定であるべきである。核酸分子は、有効な細胞内治療薬として機能するために、ヌクレアーゼに抵抗性である。上述したように、本明細書及び当分野で記述される核酸分子の化学合成が改善されたことによって、ヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を高めることによって核酸分子を修飾する能力が拡大した。
更に別の実施形態において、ＲＮＡｉに関与するタンパク質の酵素活性を維持又は増強する化学修飾を有するｓｉＮＡ分子を提供する。また、かかる核酸は、ヌクレアーゼに対する耐性が無修飾核酸よりも一般に高い。したがって、インビトロ及び／又はインビボでの活性は、さほど低下しないはずである。
本発明の核酸系分子を使用すると、併用療法（例えば、異なる遺伝子を標的とする複数のｓｉＮＡ分子；公知の小分子調節物質とカップリングされた核酸分子；又は異なるモチーフ及び／又は他の化学若しくは生体分子を含めて、分子の組合せを用いた間欠的治療）が可能になることによって、治療がより良好なものになる。ｓｉＮＡ分子を用いた対象の治療は、酵素的核酸分子（リボザイム）、アロザイム、アンチセンス、２，５−Ａオリゴアデニラート、デコイ、アプタマーなどの異なるタイプの核酸分子の組合せも含み得る。
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１個以上の５’及び／又は３’キャップ構造を、例えば、センスｓｉＮＡ鎖のみに、アンチセンスｓｉＮＡ鎖のみに、又は両方のｓｉＮＡ鎖に含む。
「キャップ構造」とは、オリゴヌクレオチドのどちらかの末端に組み入れられた化学修飾を意味する（例えば、参照により本明細書に組み込む、Ａｄａｍｉｃ他、米国特許第５，９９８，２０３号を参照されたい。）。これらの末端修飾は、核酸分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内の送達及び／又は局在化を助け得る。キャップは５’末端（５’キャップ）若しくは３’末端（３’キャップ）に存在し得、又は両方の末端に存在し得る。非限定的例において、５’キャップとしては、グリセリル、反転デオキシ脱塩基残基（部分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオアート結合；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−反転ヌクレオチド部分；３’−３’−反転脱塩基部分；３’−２’−反転ヌクレオチド部分；３’−２’−反転脱塩基部分；１，４−ブタンジオールリン酸；３’−ホスホルアミダート；ヘキシルリン酸；アミノヘキシルリン酸；３’−ホスファート；３’−ホスホロチオアート；ホスホロジチオアート；又は架橋若しくは非架橋メチルホスホナート部分が挙げられるが、これらだけに限定されない。キャップ部分の非限定的例を図１０に示す。
３’キャップの非限定的例としては、グリセリル、反転デオキシ脱塩基残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸；３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１，２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオアート；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−反転ヌクレオチド部分；５’−５’−反転脱塩基部分；５’−ホスホルアミダート；５’−ホスホロチオアート；１，４−ブタンジオールリン酸；５’−アミノ；架橋及び／又は非架橋５’−ホスホルアミダート、ホスホロチオアート及び／又はホスホロジチオアート、架橋又は非架橋メチルホスホナート及び５’−メルカプト部分が挙げられるが、これらだけに限定されない（より詳細には、参照により本明細書に組み込む、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９，１９２５を参照されたい。）。
「非ヌクレオチド」という用語は、糖置換及び／又はリン酸置換を含めて、１個以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖に組み入れることができ、残りの塩基がその酵素活性を示すのを可能にする、任意の基又は化合物を意味する。この基又は化合物は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミンなどの一般に認識されているヌクレオチド塩基を含まず、したがって１’位の塩基を欠く点で、脱塩基である。
「アルキル」基とは、直鎖、分枝鎖、及び環式アルキル基を含めて、飽和脂肪族炭化水素を指す。アルキル基は、１から１２個の炭素を有することが好ましい。より好ましくは、アルキル基は、１から７個の炭素、より好ましくは１から４個の炭素の低級アルキルである。アルキル基は、置換されていても、いなくてもよい。置換されているときには、置換基は、好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ２若しくはＮ（ＣＨ３）２、アミノ又はＳＨである。この用語は、直鎖、分枝鎖及び環式基を含めて、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む不飽和炭化水素基であるアルケニル基も含む。アルケニル基は、１から１２個の炭素を有することが好ましい。より好ましくは、アルケニル基は、１から７個の炭素、より好ましくは１から４個の炭素の低級アルケニルである。アルケニル基は、置換されていても、いなくてもよい。置換されているときには、置換基は、好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ２、ハロゲン、Ｎ（ＣＨ３）２、アミノ又はＳＨである。「アルキル」という用語は、直鎖、分枝鎖及び環式基を含めて、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含む不飽和炭化水素基を有するアルキニル基も含む。アルキニル基は、１から１２個の炭素を有することが好ましい。より好ましくは、アルキニル基は、１から７個の炭素、より好ましくは１から４個の炭素の低級アルキニルである。アルキニル基は、置換されていても、いなくてもよい。置換されているときには、置換基は、好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ２若しくはＮ（ＣＨ３）２、アミノ又はＳＨである。
かかるアルキル基は、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環式アリール、アミド及びエステル基も含み得る。「アリール」基とは、共役したパイ電子系を有する少なくとも１個の環を有する芳香族基を指し、炭素環式アリール、複素環アリール及びビアリール基が含まれる。これらの基はすべて置換されていてもよい。アリール基の好ましい置換基は、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシル、ＳＨ、ＯＨ、シアノ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル及びアミノ基である。「アルキルアリール」基は、（上記）アリール基と共有結合した（上記）アルキル基を指す。炭素環式アリール基は、芳香環の環原子がすべて炭素原子である基である。炭素原子は、置換されていてもよい。複素環式アリール基は、芳香環の環原子として１から３個のヘテロ原子を有する基であり、環原子の残りは炭素原子である。適切なヘテロ原子としては、酸素、硫黄及び窒素が挙げられ、いずれも置換されていてもよい、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−低級アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリルなどが挙げられる。「アミド」とは−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒを指す。式中、Ｒは、アルキル、アリール、アルキルアリール又は水素である。「エステル」とは−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ’を指す。式中、Ｒはアルキル、アリール、アルキルアリール又は水素である。
本明細書において使用される「ヌクレオチド」とは、（標準の）天然塩基、及び当分野で周知の修飾塩基を含むと当分野で認識されているとおりである。かかる塩基は、ヌクレオチド糖部分の１’位に一般に位置する。ヌクレオチドは、塩基、糖及びリン酸基を一般に含む。ヌクレオチドは、糖、リン酸及び／又は塩基成分において無修飾でも、修飾されていてもよい（ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドなどとも区別なく称される。例えば、参照により本明細書に組み込む、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ（前掲）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ他、国際公開第９２／０７０６５号；Ｕｓｍａｎ他、国際公開第９３／１５１８７号；Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ（前掲）を参照されたい。）。Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２，２１８３によって要約された、当分野で公知である修飾核酸塩基の幾つかの例がある。核酸分子中に導入することができる塩基修飾の非限定的例の一部としては、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）、６−アザピリミジン、６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン及び他の塩基修飾（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０；Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ（前掲））が挙げられる。この態様において「修飾塩基」とは、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシン及びウラシル以外のヌクレオチド塩基又はその等価物を意味する。
一実施形態において、本発明は、１個以上のホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、メチルホスホナート、リン酸トリエステル、モルホリノ、アミダート カルバマート、カルボキシメチル、アセトアミダート、ポリアミド、スルホナート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール及び／又はアルキルシリル、置換を含むリン酸骨格修飾を有する修飾ｓｉＮＡ分子を特徴とする。オリゴヌクレオチド骨格修飾の総説については、Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ａｎｄ Ｌｅｕｍａｎｎ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７及びＭｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４−３９を参照されたい。
「脱塩基」とは、糖部分の１’位において、核酸塩基を欠く糖部分、又は核酸塩基の代わりに水素原子（Ｈ）若しくは他の非核酸塩基化学基を有する糖部分を意味する。例えば、Ａｄａｍｉｃ他、米国特許第５，９９８，２０３号を参照されたい。一実施形態において、本発明の脱塩基部分は、リボース、デオキシリボース又はジデオキシリボース糖である。
「無修飾ヌクレオシド」とは、β−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素と結合したアデニン、シトシン、グアニンチミン又はウラシル塩基の１つを意味する。
「修飾ヌクレオシド」とは、無修飾ヌクレオチドの塩基、糖及び／又はリン酸の化学構造中に修飾を含む任意のヌクレオチド塩基を意味する。修飾ヌクレオチドの非限定的例を、式Ｉ−ＶＩＩ及び／又は他の本明細書に記載の修飾によって示す。
本発明の２’修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」とは、修飾されていても、いなくてもよい、２’−ＮＨ２又は２’−Ｏ−ＮＨ２を意味する。かかる修飾基は、例えば、参照によりその全体を本明細書に組み込む、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ他、米国特許第５，６７２，６９５号及びＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ他、米国特許第６，２４８，８７８号に記載されている。
核酸ｓｉＮＡ構造を種々修飾して、これらの分子の有用性を高めることができる。かかる修飾によって、有効期間、インビトロでの半減期、安定性が増大し、かかるオリゴヌクレオチドを標的部位に導入する容易さ、例えば、細胞膜の透過性が増大し、標的細胞を認識して、それに結合する能力が付与される。
核酸分子の投与
本発明のｓｉＮＡ分子は、単独で、又は他の療法と組み合わせて、本明細書に記載の、ＰＣＳＫ９遺伝子又はＰＣＳＫ９経路遺伝子の発現に関係することが当分野で知られている疾患、形質、障害及び／又は症状の予防若しくは治療、及び／又は細胞若しくは組織においてＰＣＳＫ９ポリヌクレオチド、若しくは標的ポリヌクレオチドから発現されるタンパク質のレベルに関係する、又は応答する任意の他の形質、疾患、障害若しくは症状の予防若しくは治療に用いるために適合させることができる。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子及びその調合物又は組成物を、本明細書に記載する、また、当分野で一般に公知である、細胞、対象又は生物体に投与する。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）組成物は、対象に投与するためのリポソームを含めた送達ビヒクル、担体及び希釈剤及びその塩を含むことができ、及び／又は医薬として許容される剤形で存在し得る。核酸分子の送達方法は、その全部を参照により本明細書に組み込む、Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，２，１３９； Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ． Ａｋｈｔａｒ，１９９５，Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｍｏｌ． Ｍｅｍｂｒ． Ｂｉｏｌ．，１６，１２９−１４０； Ｈｏｆｌａｎｄ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，１９９９，Ｈａｎｄｂ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７，１６５−１９２及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，ＡＣＳ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．，７５２，１８４−１９２に記載されている。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ他、米国特許第６，３９５，７１３号及びＳｕｌｌｉｖａｎ他、国際公開第９４／０２５９５号は、核酸分子の一般的送達方法を更に記載している。これらのプロトコルは、実質的にあらゆる核酸分子の送達に利用することができる。核酸分子は、リポソーム封入、イオン泳動、又は生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１０，１０６８−１０７４；Ｗａｎｇ他、国際公開第０３／４７５１８号及び同０３／４６１８５号参照）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）及びＰＬＣＡミクロスフェア（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号及び米国特許出願公開第２００２１３０４３０号参照）、生分解性ナノカプセル剤、生体接着性（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）ミクロスフェアなどの他のビヒクルへの組み入れ、又はタンパク質ベクター（Ｏ’Ｈａｒｅ及びＮｏｒｍａｎｄ、国際公開第００／５３７２２号）を含めて、ただしこれらだけに限定されない、当業者に公知である種々の方法によって細胞に投与することができる。別の実施形態において、本発明の核酸分子は、ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）、ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体などのポリエチレンイミン及びその誘導体と一緒に処方又は複合化することもできる。一実施形態において、本発明の核酸分子は、参照によりその全体を本明細書に組み込む米国特許出願公開第２００３００７７８２９号に記載したとおりに処方される。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、参照によりその全体を本明細書に組み込む、米国仮出願第６０／６７８，５３１号、及び２００５年７月２９日に出願された、関係する米国仮出願第６０／７０３，９４６号、２００５年１１月１５日に出願された米国仮出願第６０／７３７，０２４号、及び２００６年２月１４日に出願されたＵＳＳＮ１１／３５３，６３０（Ｖａｒｇｅｅｓｅ他）に記載された組成物として処方される。かかるｓｉＮＡ調合物を一般に「脂質核酸粒子」（ＬＮＰ）と称する。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、本明細書の表ＶＩに記載の１種類以上のＬＮＰ組成物と一緒に調合される（参照により、本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１１／３５３，６３０号及び１１／５８６，１０２号も参照されたい）。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子及びその調合物又は組成物を、ＵＳ２００６／００６２７５８、ＵＳ２００６／００１４２８９及びＵＳ２００４／００７７５４０に記載のとおりに、肺組織及び細胞に投与する。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を、図面を含めて、参照によりその全体を本明細書に組み込む米国特許出願公開第２００１０００７６６６号に記載のものなどの膜破壊剤（ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）と複合化する。別の実施形態において、膜破壊剤とｓｉＮＡ分子も、図面を含めて、参照によりその全体を本明細書に組み込む米国特許第６，２３５，３１０号に記載の脂質などの陽イオン性脂質又は補助（ｈｅｌｐｅｒ）脂質分子と複合化する。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を、図面を含めて、参照によりその全体を本明細書に組み込む、米国特許出願公開第２００３０７７８２９号、国際公開第００／０３６８３号及び同０２／０８７５４１号に記載の送達系と複合化する。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を、図面を含めて、参照によりその全体を本明細書に組み込む、米国特許出願公開第２００５０２８７５５１号、同２００５０１６４２２０号、同２００５０１９１６２７号、同２００５０１１８５９４号、同２００５０１５３９１９号、同２００５００８５４８６号及び同２００３０１５８１３３号に一般に記載されている送達系と複合化する。
一実施形態において、本発明の核酸分子を、アテロコラーゲン複合化又は抱合によって、骨格組織（例えば、骨、軟骨、腱、靭帯）又は骨転移性腫ように投与する（例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００５，ＰＮＡＳ，１０２，１２１７７−１２１８２参照）。したがって、一実施形態において、本発明は、アテロコラーゲンと複合化された組成物としての１個以上のｄｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する、又は当分野で公知である、リンカーによって、アテロコラーゲンと抱合された１個以上のｓｉＮＡ分子を特徴とする。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子、及びその調合物（例えば、本発明の二本鎖核酸分子のＬＮＰ調合物）を、吸入装置又はネブライザーによって投与されるエアゾール剤又は噴霧乾燥製剤の吸入などによる肺送達によって投与して、核酸分子を関連する肺組織に迅速に局所的に取り込ませる。微粉化核酸組成物の呼吸用乾燥粒子を含む固体粒子組成物は、乾燥又は凍結乾燥した核酸組成物を粉砕し、次いで微粉化組成物を、例えば、４００メッシュスクリーンに通して、大きい凝集物を分解又は分離することによって調製することができる。本発明の核酸組成物を含む固体粒子組成物は、エアゾール剤及び他の治療化合物の形成を容易にするのに役立つ分散剤を含んでいてもよい。適切な分散剤は、ラクトースであり、核酸化合物と１対１重量比などの任意の適切な比で混合することができる。
本発明の核酸組成物を含む液体粒子のエアゾール剤は、ネブライザーなどの任意の適切な手段によって生成され得る（例えば、米国特許第４，５０１，７２９号参照）。ネブライザーは、圧縮ガス、典型的には空気若しくは酸素を細いベンチュリーオリフィスに通して加速することによって、又は超音波振動によって、活性成分の溶液又は懸濁液を治療用エアゾールミストに転換する市販装置である。ネブライザー用に適切な製剤は、製剤の最高４０％ｗ／ｗ、好ましくは２０％ｗ／ｗ未満の活性成分を液体担体中に含む。担体は、典型的には水又は希薄アルコール水溶液であり、好ましくは、例えば塩化ナトリウム又は他の適切な塩を添加することによって、体液と等張にされる。必須でない添加剤としては、製剤が無菌調製されていない場合には防腐剤、例えば、ヒドロキシ安息香酸メチル、抗酸化剤、香味剤、揮発油、緩衝剤、乳化剤、他の処方界面活性剤などが挙げられる。活性組成物を含む固体粒子と界面活性剤のエアゾール剤は、任意の固体粒子エアゾール発生器を用いて同様に生成させることができる。固体粒子治療剤を対象に投与するエアゾール発生器は、上で説明したように、呼吸用粒子を生成し、所定用量の治療用組成物を含有する一定体積のエアゾール剤をヒト投与に適切な速度で生成する。
一実施形態において、本発明の固体粒子エアゾール発生器は吸入器である。吸入器による投与に適切な製剤としては、吸入器によって送達することができる微粉砕散剤が挙げられる。吸入器では、散剤、例えば、本明細書に記載する治療の実施に有効なその一定用量を、典型的にはゼラチン又はプラスチックでできたカプセル又はカートリッジに入れる。カプセル又はカートリッジは、現場で貫通され、又は開口され、吸息又は手動操作のポンプによって装置を通して吸い込まれる空気によって散剤が送達される。吸入器に用いられる散剤は、活性成分のみからなり、又は活性成分と、ラクトースなどの適切な粉末希釈剤と、必須でない界面活性剤とを含む粉末混合物からなる。活性成分は、典型的には、製剤の０．１から１００ｗ／ｗである。説明のためのエアゾール発生器の第２のタイプは、定量吸入器を含む。定量吸入器は、液化噴霧剤中に活性成分の懸濁液剤又は溶液剤を典型的には含む加圧エアゾール分注器である。使用中に、この装置は、一定体積を送達するようになされた弁を通して製剤を吐出して、活性成分を含む微粒子噴霧を生成する。適切な噴霧剤としては、ある種のクロロフルオロ炭素化合物、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、その混合物などが挙げられる。製剤は、１種類以上の共溶媒、例えばエタノール、乳化剤、及びオレイン酸、トリオレイン酸ソルビタンなどの他の処方界面活性剤、抗酸化剤、並びに適切な香味剤を更に含むことができる。他の肺送達方法は、例えば、参照により本明細書に組み込む、米国特許出願公開第２００４００３７７８０号及び米国特許第６，５９２，９０４号、同６，５８２，７２８号、同６，５６５，８８５号に記載されている。
一実施形態において、肺送達に用いられる本明細書の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）及びＬＮＰ組成物及び調合物は、１種類以上の界面活性剤を更に含む。本発明の組成物の取り込みを増大させる適切な界面活性剤又は界面活性剤成分としては、合成及び天然並びに完全型及び切断型の界面活性剤タンパク質Ａ、界面活性剤タンパク質Ｂ、界面活性剤タンパク質Ｃ、界面活性剤タンパク質Ｄ及び界面活性剤タンパク質Ｅ、（ジパルミトイル以外の）二飽和（ｄｉ−ｓａｔｕｒａｔｅｄ）ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン；ホスファチジン酸、ユビキノン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、パルミトイル−リゾホスファチジルコリン、デヒドロエピアンドロステロン、ドリコール、スルファチド（ｓｕｌｆａｔｉｄｉｃ）酸、グリセリン−３−ホスファート、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセリン、グリセロ−３−ホスホコリン、ジヒドロキシアセトン、パルミタート、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）ジアシルグリセロール、ＣＤＰコリン、コリン、コリンリン酸、並びに界面活性剤成分の天然担体ビヒクルである天然及び人工の層状体、オメガ３脂肪酸、ポリエン（ｐｏｌｙｅｎｉｃ）酸、ポリエン（ｐｏｌｙｅｎｏｉｃ）酸、レシチン、パルミチン（ｐａｌｍｉｔｉｎｉｃ）酸、エチレン又はプロピレンオキシドの非イオンブロック共重合体、ポリオキシプロピレン、単量体及び重合体、ポリオキシエチレン、単量体及重合体、デキストラン及び／又はアルカノイル側鎖を有するポリ（ビニルアミン）、Ｂｒｉｊ ３５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、並びに合成界面活性剤ＡＬＥＣ、Ｅｘｏｓｕｒｆ、Ｓｕｒｖａｎ及びＡｔｏｖａｑｕｏｎｅがとりわけ挙げられる。これらの界面活性剤は、調合物中で、単一で、若しくは複数成分の界面活性剤の一部として、又は本明細書の医薬組成物の核酸成分の５’及び／又は３’末端に共有結合付加して、使用することができる。
本発明の組成物は、呼吸に適したサイズの粒子、例えば、吸入後、鼻、口及び喉頭を通過し、気管支及び肺胞を通過するのに十分に小さなサイズの粒子を含む製剤として、呼吸器系に投与することができる。一般に、呼吸用粒子は、約０．５から１０ミクロンのサイズである。エアゾール剤に含まれる呼吸に不適当なサイズの粒子は、咽頭に付着しやすく、えん下されやすい。したがって、エアゾール剤中の呼吸に不適当な粒子の量は、最小限に抑えられる。経鼻投与の場合、鼻腔内に確実に保持するために、１０−５００ｕｍの範囲の粒径が好ましい。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子及びその調合物又は組成物を、当分野で一般に公知であるとおりに、肝臓に投与する（例えば、Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１０，２４４−９； Ｍｕｒａｏ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．，１９，１８０８−１４； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００３，ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０，１８０−７； Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５４，５１−８； Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．，１４９，１６１１−７及びＭａｔｓｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０，１５５９−６６参照）。
一実施形態において本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）は、例えば、特定の臓器又は区画（例えば、眼、眼底、心臓、肝臓、腎臓、膀胱、前立腺、腫瘍、ＣＮＳなど）へ、イオン泳動的に投与される。イオン泳動的送達の非限定的な例は、神経細胞による核酸。神経細胞への核酸の局所投与の例として、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｎｌｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，８，７５は、ｃ−ｆｏｓに対する１５量体ホスホロチオアートアンチセンス核酸分子を微量注入によってラットの脳に投与する研究を記載している。テトラメチルローダミン−イソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）又はフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）で標識されたアンチセンス分子は、注射後３０分で専らニューロンによって吸収された。これらの細胞では、拡散した細胞質染色及び核染色が観察された。神経細胞への核酸の全身投与の例として、Ｅｐａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１０，４６９は、ベータ−シクロデキストリン−アダマンタン−オリゴヌクレオチド抱合体を用いて、神経に分化したＰＣ１２細胞中のｐ７５ニューロトロフィン受容体を標的とした、インビボでのマウス試験を記載している。２週間のＩＰ投与後、後根神経節（ＤＲＧ）細胞において、ｐ７５ニューロトロフィン受容体アンチセンスの顕著な取り込みが認められた。また、ＤＲＧニューロンにおいて、ｐ７５の著しい一貫した下方制御が認められた。ニューロンへの核酸の別のターゲティング手法は、Ｂｒｏａｄｄｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．，８８（４），７３４； Ｋａｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍｏｃｏｌ．，３４０（２／３），１５３； Ｂａｎｎａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７８４（１，２），３０４； Ｒａｊａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｓｙｎａｐｓｅ，２６（３），１９９； Ｗｕ−ｐｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＢｉｏＰｈａｒｍ，１２（１），３２； Ｂａｎｎａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｐｒｏｔｏｃ．，３（１），８３； Ｓｉｍａｎｔｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，７４（１），３９に記載されている。したがって、本発明の核酸分子はRE遺伝子発現の調節のための対立変異体の反復増殖を発現する細胞に送達されやすく取り込まれやすい。本発明の核酸分子の送達、標的化ＲＥは種々の異なる戦略によって提供される。使用することができる中枢神経系送達の伝統的手法としては、鞘内及び脳室内投与、カテーテル及びポンプの埋め込み、傷害若しくは病変の部位における直接注射若しくは潅流、脳動脈系への注射、又は化学物質若しくは浸透圧による血液脳関門の開口が挙げられるが、これらだけに限定されない。他の手法としては、例えば抱合体及び生分解性ポリマーを用いた、種々の輸送及び担体系の使用も挙げられる。また、例えば、Ｋａｐｌｉｔｔ他、米国特許第６，１８０，６１３号及びＤａｖｉｄｓｏｎ、国際公開第０４／０１３２８０号に記載の遺伝子療法によって、ＣＮＳにおいて核酸分子を発現させることができる。
一実施形態において本発明の核酸は中枢神経系（ＣＮＳ）又は末梢神経系（ＰＮＳ）へ投与される。複数の実験がニューロンによる核酸の効果的な生体内取り込みを実証している。神経細胞への核酸の局所投与の例として、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｎｌｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，８，７５は、ｃ−ｆｏｓに対する１５量体ホスホロチオアートアンチセンス核酸分子を微量注入によってラットの脳に投与する研究を記載している。テトラメチルローダミン−イソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）又はフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）で標識されたアンチセンス分子は、注射後３０分で専らニューロンによって吸収された。これらの細胞では、拡散した細胞質染色及び核染色が観察された。神経細胞への核酸の全身投与の例として、Ｅｐａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１０，４６９は、ベータ−シクロデキストリン−アダマンタン−オリゴヌクレオチド抱合体を用いて、神経に分化したＰＣ１２細胞中のｐ７５ニューロトロフィン受容体を標的とした、インビボでのマウス試験を記載している。２週間のＩＰ投与後、後根神経節（ＤＲＧ）細胞において、ｐ７５ニューロトロフィン受容体アンチセンスの顕著な取り込みが認められた。また、ＤＲＧニューロンにおいて、ｐ７５の著しい一貫した下方制御が認められた。ニューロンへの核酸の別のターゲティング手法は、Ｂｒｏａｄｄｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．，８８（４），７３４； Ｋａｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍｏｃｏｌ．，３４０（２／３），１５３； Ｂａｎｎａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７８４（１，２），３０４； Ｒａｊａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｓｙｎａｐｓｅ，２６（３），１９９； Ｗｕ−ｐｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＢｉｏＰｈａｒｍ，１２（１），３２； Ｂａｎｎａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｐｒｏｔｏｃ．，３（１），８３； Ｓｉｍａｎｔｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，７４（１），３９に記載されている。したがって、本発明の核酸分子は、ＣＮＳ及び／又はＰＮＳ中の細胞に送達されやすく、これらの細胞によって取り込まれやすい。
中枢神経系への本発明の核酸分子は、多種多様な戦略によって送達される。使用することができる中枢神経系送達の伝統的手法としては、鞘内及び脳室内投与、カテーテル及びポンプの埋め込み、傷害若しくは病変の部位における直接注射若しくは潅流、脳動脈系への注射、又は化学物質若しくは浸透圧による血液脳関門の開口が挙げられるが、これらだけに限定されない。他の手法としては、例えば抱合体及び生分解性ポリマーを用いた、種々の輸送及び担体系の使用も挙げられる。また、例えば、Ｋａｐｌｉｔｔ他、米国特許第６，１８０，６１３号及びＤａｖｉｄｓｏｎ、国際公開第０４／０１３２８０号に記載の遺伝子療法によって、ＣＮＳにおいて核酸分子を発現させることができる。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）化合物及び組成物は、全身的に又は局所的に、約１−５０週ごと（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０週ごと）に、単独で、又は本明細書の他の化合物及び／又は療法と組み合わせて投与される。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ化合物及び組成物を（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、注入、ポンプ、移植片などによって）全身的に、約１−５０週ごと（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０週ごと）に、単独で、又は本明細書に記載の、及び／又は当分野で公知の他の化合物及び／又は療法と組み合わせて、投与する。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、例えば特定の臓器又は区画（例えば、肺、上咽頭、皮膚、濾胞、眼、眼底、心臓、肝臓、腎臓、ぼうこう、前立腺、腫よう、ＣＮＳなど）に、イオン泳動によって投与される。イオン泳動による送達の非限定的例は、例えば、参照によりその全体を本明細書に組み込む国際公開第０３／０４３６８９号及び同０３／０３０９８９号に記載されている。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子及びその調合物又は組成物は、本分野で一般的に知られているとおりに、肝臓へ投与される（例えば、Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１０，２４４−９； Ｍｕｒａｏ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．，１９，１８０８−１４； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０，１８０−７； Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５４，５１−８； Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．，１４９，１６１１−７； ａｎｄ Ｍａｔｓｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０，１５５９−６６を参照されたい。）。
一実施形態において、本発明は、本発明の核酸分子を、単球及びリンパ球を含めた造血細胞に送達する方法の使用を特徴とする。これらの方法は、Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．，２８５（２），９２０−９２８； Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ，９１（３），８５２−８６２； Ｆｉｌｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．，１３２９（２），３４５−３５６； Ｍａ ａｎｄ Ｗｅｉ，１９９６，Ｌｅｕｋ． Ｒｅｓ．，２０（１１／１２），９２５−９３０及びＢｏｎｇａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２），４６８１−８に詳述されている。かかる方法は、上述したように、オリゴヌクレオチドを造血細胞に移入するために、遊離オリゴヌクレオチド、陽イオン性脂質調合物、ｐＨ感応性リポソーム及び免疫リポソームを含めたリポソーム調合物、及び膜融合ペプチドと抱合されたオリゴヌクレオチドを含めたバイオコンジュゲートの使用を含む。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子及びその調合物又は組成物を、当分野で一般に公知であるとおりに、真皮又はろ胞に直接的に、又は局部的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）（例えば、局所的に（ｌｏｃａｌｌｙ））投与する（例えば、Ｂｒａｎｄ，２００１，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．，３，２４４−８； Ｒｅｇｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ，５，２７５−８９； Ｋａｎｉｋｋａｎｎａｎ，２００２，ＢｉｏＤｒｕｇｓ，１６，３３９−４７； Ｗｒａｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．，９０，８９−１０４及びＰｒｅａｔ ａｎｄ Ｄｕｊａｒｄｉｎ，２００１，ＳＴＰ ＰｈａｒｍａＳｃｉｅｎｃｅｓ，１１，５７−６８参照）。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子及びその調合物又は組成物を、アルコール（例えば、エタノール又はイソプロパノール）、水を含み、ミリスチン酸イソプロピル、カーボマー９８０などの追加の薬剤を含んでいてもよい、ヒドロアルコールゲル調合物によって、直接的に、又は局部的に投与する。
一実施形態において、本発明の送達系としては、例えば、水系及び非水系ゲル、クリーム、多相乳濁液（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水溶液及び非水溶液、ローション、エアゾール、炭化水素基剤及び粉末が挙げられ、可溶化剤、透過促進剤（ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ）（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール及びアミノ酸）、親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィル及びポリビニルピロリドン）などの賦形剤を含むことができる。一実施形態において、医薬として許容される担体は、リポソーム又は経皮促進剤（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｅｎｈａｎｃｅｒ）である。本発明に使用することができるリポソームの例としては、（１）ＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ、陽イオン性脂質Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラパルミト（ｔｅｔｒａｐａｌｍｉｔ）−ｙ−スペルミンとジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１．５（Ｍ／Ｍ）リポソーム調合物（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、（２）Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ ＧＳＶ、陽イオン性脂質とＤＯＰＥの２：１（Ｍ／Ｍ）リポソーム調合物（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、（３）ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ−メチル−アンモニウムメチルスルファート）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）及び（４）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ポリカチオン脂質ＤＯＳＰＡと中性脂質ＤＯＰＥの３：１（Ｍ／Ｍ）リポソーム調合物（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）が挙げられる。
一実施形態において、本発明の送達系としては、貼付剤、錠剤、座剤、ペッサリー、ゲル及びクリームが挙げられ、本発明の送達系は、可溶化剤及びエンハンサー（例えば、プロピレングリコール、胆汁酸塩及びアミノ酸）、他のビヒクル（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステル及び誘導体、並びにヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒアルロン酸などの親水性ポリマー）などの賦形剤も含み得る。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、イオン泳動によって、例えば、真皮又は他の関連組織へ投与される。イオン泳動送達の非限定的な例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ０３／０４３６８９号及びＷＯ０３／０３０９８９号に記載されている。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、ポリエチレンイミン（例えば、線状又は分枝ＰＥＩ）及び／又は、例えば、ガラクトースＰＥＩ、コレステロールＰＥＩ、抗体によって誘導体化されたＰＥＩ、そのポリエチレングリコールＰＥＩ（ＰＥＧ−ＰＥＩ）誘導体などのグラフト（ｇｒａｆｔｅｄ）ＰＥＩを含めたポリエチレンイミン誘導体と一緒に処方され、又は複合化される（例えば、参照により本明細書に組み込む、Ｏｇｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＡＡＰＡ ＰｈａｒｍＳｃｉ，３，１−１１； Ｆｕｒｇｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１４，８４０−８４７； Ｋｕｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｈｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，８１０−８１７； Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｕｌｌ． Ｋｏｒｅａｎ Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，２２，４６−５２； Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１０，５５８−５６１； Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１３，８４５−８５４； Ｅｒｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｐｒｅｐｒｉｎｔ，１，１−１８； Ｇｏｄｂｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９６，５１７７−５１８１； Ｇｏｄｂｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，６０，１４９−１６０； Ｄｉｅｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４，１９０８７−１９０９４； Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｋｌｉｂａｎｏｖ，２００２，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９９，１４６４０−１４６４５及びＳａｇａｒａ、米国特許第６，５８６，５２４号参照）。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、バイオコンジュゲート、例えば、参照により本明細書に組み込む、２００３年４月３０日に出願されたＶａｒｇｅｅｓｅ他、ＵＳＳＮ１０／４２７，１６０、米国特許第６，５２８，６３１号、同６，３３５，４３４号、同６，２３５，８８６号、同６，１５３，７３７号、同５，２１４，１３６号、同５，１３８，０４５号に記載の核酸抱合体を含む。
したがって、本発明は、本発明の１種類以上の核酸を安定剤、緩衝剤などの許容される担体中に含む医薬組成物を特徴とする。本発明のポリヌクレオチドは、安定剤、緩衝剤などを用いて、又は用いないで、医薬組成物を形成する任意の標準手段によって、対象に投与することができ（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質）、導入することができる。リポソーム送達機構を利用することが望ましいときには、リポソームの標準形成プロトコルに従うことができる。本発明の組成物は、クリーム剤、ゲル剤、噴霧剤、オイル剤、及び当分野で公知である、局所、皮膚又は経皮投与に適切な他の組成物として、処方し、使用することもできる。
本発明は、医薬として許容される、上記化合物の調合物も含む。これらの調合物は、上記化合物の塩、例えば、酸付加塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩及びベンゼンスルホン酸塩を含む。
薬理学的組成物、調合物又は塩とは、例えばヒトを含めて、細胞又は対象に投与、例えば全身又は局所投与するのに適切な形態の組成物又は調合物を指す。適切な形態は、用途又は流入経路、例えば経口、経皮若しくは注射に応じて、ある程度決まる。かかる形態は、組成物又は調合物が標的細胞（すなわち、負に帯電した核酸の送達が望ましい細胞）に到達するのを妨害すべきではない。例えば、血流中に注射する薬理学的組成物は、可溶であるべきである。他の因子は、当分野で公知であり、毒性、組成物又は調合物がその効果を発揮するのを防止する形態などの考慮事項を含む。
一実施形態において、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を、医薬として許容される組成物、調合物又は塩として全身投与によって対象に投与する。「全身投与」とは、インビボでの全身吸収、又は血流中の薬物の蓄積と、それに後く全身への分布を意味する。全身吸収に至る投与経路としては、静脈内、皮下、門脈、腹腔内、吸入、噴霧、経口、肺内及び筋肉内が挙げられるが、これらだけに限定されない。これらの投与経路の各々によって、到達可能な患部組織（例えば、肺）が本発明のｓｉＮＡ分子に暴露される。循環中への薬物の流入速度は、分子量又はサイズの関数であることが判明している。本発明の化合物を含むリポソーム又は他の薬物担体を使用すると、例えば、細網内皮系（ＲＥＳ）の組織などのある組織タイプに薬物を潜在的に局在化させることができる。リンパ球、マクロファージなどの細胞の表面と薬物との会合を容易にし得るリポソーム調合物も有用である。この手法は、マクロファージ及びリンパ球による異常細胞の免疫認識の特異性を利用することによって、標的細胞への薬物の送達を促進することができる。
「医薬として許容される調合物」、「医薬として許容される組成物」又は「医薬として許容される塩」とは、本発明の核酸分子を、その所望の活性に最も適切である身体部位に有効に分布させることができる組成物、調合物又は塩を意味する。本発明の核酸分子と一緒に処方するのに適切である薬剤の非限定的例としては、（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ８５などの）Ｐ糖タンパク質阻害剤、徐放性送達用のポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）ミクロスフェアなどの生分解性ポリマー（Ｅｍｅｒｉｃｈ，ＤＦ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８，４７−５８）、及びポリブチルシアノアクリラートでできたものなどの充填（ｌｏａｄｅｄ）ナノ粒子が挙げられる。本発明の核酸分子の送達戦略の他の非限定的例としては、Ｂｏａｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ，８７，１３０８−１３１５； Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４２１，２８０−２８４； Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，９２，５５９２−５５９６； Ｂｏａｄｏ，１９９５，Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，１５，７３−１０７； Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２６，４９１０−４９１６及びＴｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，９６，７０５３−７０５８に記載の材料が挙げられる。医薬として許容される塩の非限定的な例には、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミン及びスペルミジンなどのポリアミンなどの陽イオンと形成される塩、（ｂ）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などの無機酸と形成される塩、（ｃ）有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸（ｃｌｕｃｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレン二スルホン酸、ポリガラクツロン酸（ｐｏｌｙｇａｌａｃｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）などと形成される塩、並びに塩素、臭素及びヨウ素などの原子状陰イオンから形成される塩が含まれる。
本発明は、ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ修飾又は長時間循環型のリポソーム、すなわちステルスリポソーム）を含む表面修飾リポソームと本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子とを含む組成物の使用も特徴とする。これらの調合物は、標的組織における薬物（例えば、ｓｉＮＡ）の蓄積を増加させる方法を与える。このクラスの薬物担体は、単核食細胞系（ＭＰＳ又はＲＥＳ）によるオプソニン作用及び排除に抵抗性であり、それによって、カプセル剤の血液循環時間を延長し、組織暴露を増強することができる（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． １９９５，９５，２６０１−２６２７； Ｉｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． １９９５，４３，１００５−１０１１）。かかるリポソームは、恐らくは新生血管標的組織における溢出及び捕獲によって、腫よう中に選択的に蓄積することが判明している（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５，２６７，１２７５−１２７６； Ｏｋｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長時間循環型リポソームは、特に、ＭＰＳの組織で蓄積することが知られている従来の陽イオン性リポソームに比較して、ＤＮＡ及びＲＮＡの薬物動態学及び薬力学を増強する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９５，４２，２４８６４−２４８７０；Ｃｈｏｉ他、国際公開第９６／１０３９１号；Ａｎｓｅｌｌ他、国際公開第９６／１０３９０号；Ｈｏｌｌａｎｄ他、国際公開第９６／１０３９２号）。長時間循環型リポソームは、肝臓、ひ臓などの代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織における蓄積を回避するその能力に基づいて、陽イオン性リポソームと比較して、薬物をヌクレアーゼ分解からより強く保護する可能性もある。
一実施形態において、本発明のリポソーム調合物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，８５８，２２４号；同６，５３４，４８４号；同６，２８７，５９１号；同６，８３５，３９５号；同６，５８６，４１０号；同６，８５８，２２５号；同６，８１５，４３２号；同６，５８６，００１号；同６，１２０，７９８号；同６，９７７，２２３号；同６，９９８，１１５号；同５，９８１，５０１号；同５，９７６，５６７号；同５，７０５，３８５号；米国特許出願公開第２００６／００１９９１２号；同２００６／００１９２５８号；同２００６／０００８９０９号；同２００５／０２５５１５３号；同２００５／００７９２１２号；同２００５／０００８６８９号；同２００３／００７７８２９号、同２００５／００６４５９５号、同２００５／０１７５６８２号、同２００５／０１１８２５３号；同２００４／００７１６５４号；同２００５／０２４４５０４号；同２００５／０２６５９６１号及び同２００３／００７７８２９号に記載の化合物及び組成物と一緒に処方又は複合化された本発明の二本鎖核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を含む。
本発明は、薬剤として許容される担体又は希釈剤中に薬学的又は治療的有効量の所望の化合物を含む、保存又は投与用に調製された組成物も含む。治療用に許容される担体又は希釈剤は、薬剤分野ではよく知られており、例えば、参照により本明細書に組み込むＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ． １９８５）に記載されている。例えば、防腐剤、安定剤、色素及び香味剤を用意することもできる。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルが含まれる。また、抗酸化剤及び懸濁剤も使用することができる。
薬学的に有効な用量とは、病態の予防、発症の阻止、又は（症候をある程度軽減する、好ましくは症候の全部を軽減する）治療に必要な用量である。薬学的に有効な用量は、疾患のタイプ、用いる組成物、投与経路、治療するほ乳動物のタイプ、検討する特定のほ乳動物の身体特性、併用する薬物療法、及び医薬分野の当業者が認識する他の因子に応じて決まる。一般に、負に帯電したポリマーの効力に応じて、活性成分０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日を投与する。
治療的有効量は、予定される生理的応答を与えるために、治療されるべき対象中の薬物の所望のレベルを与えるために必要とされる組成物中に存在する量を表す。「治療的有効量」とは、レシピエント動物又は患者中に有益な結果をもたらすのに有効な量である。
本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子及びその調合物は、薬剤として許容される従来の無毒の担体、アジュバント及び／又はビヒクルを含む単位用量剤形で、経口的に、局所的に、非経口的に、吸入若しくは噴霧によって、又は直腸に、投与することができる。本明細書では非経口という用語は、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、髄腔内注射又は注入技術などを含む。また、本発明の核酸分子と、薬剤として許容される担体とを含む薬剤を提供する。本発明の１種類以上の核酸分子は、薬剤として許容される１種類以上の無毒の担体及び／又は希釈剤及び／又はアジュバント、並びに必要に応じて他の活性成分と一緒に存在し得る。本発明の核酸分子を含有する医薬組成物は、経口用に適した剤形、例えば、錠剤、トローチ剤、舐剤、水性若しくは油性懸濁液剤、分散性散剤若しくは顆粒剤、乳剤、硬若しくは軟カプセル剤、又はシロップ剤若しくはエリキシル剤とすることができる。
経口用組成物は、医薬組成物製造分野で公知の任意の方法によって調製することができる。かかる組成物は、薬剤的に優れた口当たりの良い製剤を提供するために、１種類以上のかかる甘味剤、香味剤、着色剤又は防腐剤を含むことができる。錠剤は、錠剤の製造に適切である、薬剤として許容される無毒の賦形剤と混合された活性成分を含む。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤、顆粒化剤及び崩壊剤、例えば、コーンスターチ又はアルギン酸、結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン又はアラビアゴム、並びに潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクとすることができる。錠剤は、被覆しなくても、公知技術によって被覆してもよい。かかる被覆を公知技術によって調製して、胃腸管における崩壊及び吸収を遅延させ、それによって長時間の持続作用を得ることができる場合もある。例えば、モノステアリン酸グリセリン、ジステアリン酸グリセリンなどの遅延物質を使用することができる。
経口製剤は、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンと混合された硬ゼラチンカプセル剤とすることもでき、活性成分が水又は油媒体、例えば、落花生油、流動パラフィン又はオリーブ油と混合された軟ゼラチンカプセル剤とすることもできる。
水性懸濁液剤は、水性懸濁液剤の製造に適切な賦形剤と混合された活性材料を含む。かかる賦形剤は、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアラビアゴムであり、分散剤又は湿潤剤は、天然リン脂質、例えば、レシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合物、例えば、ポリオキシエチレンステアレート、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はポリオキシエチレンソルビトールモノオレアートなど脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、又は脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導される部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレアートとすることができる。水性懸濁液剤は、１種類以上の防腐剤、例えば、エチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸、１種類以上の着色剤、１種類以上の香味剤、及びスクロース、サッカリンなどの１種類以上の甘味剤を含むこともできる。
油性懸濁液剤は、植物油中、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油中、又は流動パラフィンなどの鉱物油中に活性成分を懸濁させることによって調剤することができる。油性懸濁液剤は、増粘剤、例えば、蜜ろう、固形パラフィン又はセチルアルコールを含むことができる。甘味剤及び香味剤を添加して、口当たりの良い経口製剤を提供することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤を添加することによって保存することができる。
水を添加することによって水性懸濁液剤を調製するのに適切な分散性散剤及び顆粒剤によって、分散剤又は湿潤剤、懸濁剤及び１種類以上の防腐剤と混合された活性成分が提供される。適切な分散剤若しくは湿潤剤又は懸濁剤は、上で例示したとおりである。追加の賦形剤、例えば、甘味剤、香味剤及び着色剤が存在してもよい。
本発明の医薬組成物は、水中油型乳剤の形にすることもできる。油相は、植物油、鉱油又はこれらの混合物とすることができる。適切な乳化剤は、天然ゴム、例えば、アラビアゴム又はトラガカントゴム、天然リン脂質、例えば、ダイズ、レシチン、及び脂肪酸とヘキシトール、無水物から誘導されるエステル又は部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレアート、及び前記部分エステルとエチレンオキシドの縮合物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートであり得る。乳剤は甘味剤及び香味剤を含むこともできる。
シロップ剤及びエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコース又はスクロースを用いて処方することができる。かかる製剤は、粘滑剤、防腐剤、香味剤及び着色剤を含むこともできる。医薬組成物は、無菌注射用水性又は油性懸濁液剤とすることができる。この懸濁液剤は、上述の適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて公知技術によって処方することができる。無菌注射用製剤は、親らしく許容される無毒の希釈剤又は溶媒の無菌注射液又は懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール溶液とすることもできる。使用可能な許容されるビヒクル及び溶媒は、水、リンゲル液及び等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌不揮発性油が溶媒又は懸濁媒体として従来使用されている。この目的で、合成モノ又はジグリセリドを含めて、任意の無刺激性不揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も注射用製剤に使用することができる。
本発明の核酸分子は、例えば薬物を直腸投与するための、座剤の形で投与することもできる。常温では固体であるが直腸温度では液体であり、したがって直腸内で溶融して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と薬物を混合することによって、これらの組成物を調製することができる。かかる物質としては、カカオ脂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
本発明の核酸分子は、滅菌媒体中で非経口的に投与することができる。薬物は、使用するビヒクル及び濃度に応じて、ビヒクル中に懸濁させても、溶解させてもよい。局所麻酔薬、防腐剤、緩衝剤などのアジュバントをビヒクルに溶解させることも有利である。
約０．１ｍｇから約１４０ｍｇ／キログラム体重／日の投与量レベルが上記症状の治療に有用である（約０．５ｍｇから約７ｇ／対象／日）。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療を受ける患者及び特定の投与方法に応じて変わる。単位用量剤形は、一般に、活性成分約１ｍｇから約５００ｍｇを含む。
特定の対象に対する具体的用量レベルは、用いる具体的化合物の活性、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食餌、投与時間、投与経路、及び排出速度、薬物の組合せ、及び治療を受ける特定の疾患の重篤度を含めて種々の要因に応じて決まることを理解されたい。
ヒト以外の動物に投与する場合には、組成物を動物飼料又は飲料水に添加することもできる。動物が治療上適切な量の組成物をその飼料と一緒に摂取するように、動物飼料及び飲用水組成物を処方することが好都合であり得る。飼料又は飲料水に添加するプレミックスとして組成物を提供することも好都合であり得る。
本発明の核酸分子を他の治療化合物と組み合わせて対象に投与して、全体の治療効果を高めることもできる。ある適応症の治療に複数の化合物を用いると、副作用を減少させつつ、有益な効果を高めることができる。
一実施形態において、本発明は、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子を特定の細胞タイプに適切である組成物を含む。例えば、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２，４４２９−４４３２）は、肝細胞特有のものであり、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）などの分枝ガラクトース末端糖タンパク質と結合する。別の例において、葉酸受容体は、多数の癌細胞において過剰発現される。かかる糖タンパク質、合成複合糖質又は葉酸塩と受容体の結合は、オリゴ糖鎖の分岐度に大きく依存した親和性によって生ずる。例えば、三分岐（ｔｒｉａｔｅｎｎａｒｙ）構造は、二分岐（ｂｉａｔｅｎａｒｒｙ）又は単分岐（ｍｏｎｏａｔｅｎｎａｒｙ）鎖よりも高い親和性で結合する（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｔｅ，１９８０，Ｃｅｌｌ，２２，６１１−６２０； Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２５７，９３９−９４５）。Ｌｅｅ ａｎｄ Ｌｅｅ，１９８７，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．，４，３１７−３２８は、受容体に対する親和性がガラクトースよりも高いＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを炭水化物部分として使用することによって、この高い特異性を得た。この「クラスター形成効果」は、マンノシル末端糖タンパク質又は複合糖質の結合及び取り込みについても記載されている（Ｐｏｎｐｉｐｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，２４，１３８８−１３９５）。ガラクトース、ガラクトサミン又は葉酸塩の抱合体を用いて、外因性化合物を細胞膜を越えて輸送することによって、目標とした送達手法を、例えば、肝疾患、肝臓癌、又は他の癌の治療に提供することができる。バイオコンジュゲートを使用すると、治療に必要な治療化合物の必要用量を削減することもできる。また、本発明の核酸バイオコンジュゲートを使用することによって、治療薬の生物学的利用能、薬力学及び薬物動態パラメータを調節することができる。かかるバイオコンジュゲートの非限定的例は、２００１年８月１３日に出願された、Ｖａｒｇｅｅｓｅ他、ＵＳＳＮ１０／２０１，３９４、及び２００２年３月６日に出願された、Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ他、ＵＳＳＮ６０／３６２，０１６に記載されている。
或いは、本発明のある種の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、細胞内で真核生物プロモーターから発現させることができる（例えば、Ｉｚａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，３４５； ＭｃＧａｒｒｙ ａｎｄ Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８３，３９９； Ｓｃａｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８８，１０５９１−５； Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．，２，３−１５； Ｄｒｏｐｕｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，６６，１４３２−４１； Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，６５，５５３１−４； Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８９，１０８０２−６； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９； Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１２２２−１２２５； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３，２２５９； Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４，４５。当業者は、真核細胞中で任意の核酸を適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現させることができることを認識されたい。かかる核酸の活性は、核酸を酵素的核酸によって一次転写物から放出させることによって、増大させることができる（Ｄｒａｐｅｒ他、国際公開第９３／２３５６９号、及びＳｕｌｌｉｖａｎ他、国際公開第９４／０２５９５号；Ｏｈｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．，２７，１５−６； Ｔａｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，５１２５−３０； Ｖｅｎｔｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５； Ｃｈｏｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６９，２５８５６。
本発明の別の態様においては、本発明のＲＮＡ分子を、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現させることができる（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０）。組み換えベクターは、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターであり得る。核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）を発現するウイルスベクターは、これらだけに限定されないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス又はアルファウイルスに基づいて構築することができる。別の実施形態において、ｐｏｌ ＩＩＩに基づくコンストラクトを用いて、本発明の核酸分子を発現させる（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、米国特許第５，９０２，８８０号及び６，１４６，８８６号参照）。ｓｉＮＡ分子を発現可能である組み換えベクターは、上述のとおりに送達し、標的細胞中に存続させることができる。或いは、核酸分子の一過性発現を与えるウイルスベクターを使用することができる。かかるベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。ｓｉＮＡ分子は、発現後、標的ｍＲＮＡと相互作用して、ＲＮＡｉ応答を生ずる。ｓｉＮＡ分子を発現するベクターの送達は、静脈内又は筋肉内投与によって、対象から外植された標的細胞に投与し、続いて対象に再導入することによって、所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段によってなど、全身的であり得る（総説については、Ｃｏｕｔｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照されたい。）。
一態様において、本発明は、本発明の少なくとも１種類の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。発現ベクターは、ｓｉＮＡ二本鎖の一方若しくは両方の鎖をコードすることができ、又はｓｉＮＡ二本鎖を自己ハイブリッド形成する単一の自己相補鎖をコードすることができる。本発明のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列は、ｓｉＮＡ分子の発現を可能にするように作動可能に結合し得る（例えば、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５； Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７； Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００及びＮｏｖｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５参照）。
別の態様において、本発明は、ａ）転写開始領域（例えば、真核生物ｐｏｌ Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ開始領域）と、ｂ）転写終結領域（例えば、真核生物ｐｏｌ Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ終結領域）と、ｃ）本発明のｓｉＮＡ分子の少なくとも１個をコードする核酸配列とを含む発現ベクターを特徴とする。ここで、前記配列は、ｓｉＮＡ分子の発現及び／又は送達を可能にするように、前記開始領域及び前記終結領域に作動可能に結合している。ベクターは、本発明のｓｉＮＡをコードする配列の５’側又は３’側に作動可能に結合した、タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、及び／又はイントロン（介在配列）を含んでいてもよい。
ｓｉＮＡ分子配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）のプロモーターから駆動され得る。ｐｏｌ ＩＩ又はｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからの転写物は、すべての細胞において高レベルで発現される。所与の細胞タイプにおける所与のｐｏｌ ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適切な細胞中で発現される限り、原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターも用いられる（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｏｓｓ，１９９０，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８７，６７４３−７； Ｇａｏ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ １９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，２８６７−７２； Ｌｉｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７，４７−６６； Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。数名の研究者によれば、かかるプロモーターから発現された核酸分子は、ほ乳動物細胞中で機能し得る（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．，２，３−１５； Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８９，１０８０２−６； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９； Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９０，６３４０−４； Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＥＭＢＯ Ｊ．，１１，４４１１−８； Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ，９０，８０００−４； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３，２２５９； Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ ＆ Ｃｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。より具体的には、Ｕ６核内低分子（ｓｎＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びアデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードする遺伝子に由来する転写単位などの転写単位は、細胞において高濃度のｓｉＮＡなどの所望のＲＮＡ分子を生成するのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（前掲）；Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６（前掲）；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２，２８３０；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ他、米国特許第５，６２４，８０３号；Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４，４５；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ他、国際公開第９６／１８７３６号。上記ｓｉＮＡ転写単位は、ほ乳動物細胞に導入するために、プラスミドＤＮＡベクター、（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクターなどの）ウイルスＤＮＡベクター又は（レトロウイルス、アルファウイルスベクターなどの）ウイルスＲＮＡベクターを含めて、ただしこれらだけに限定されない種々のベクターに組み入れることができる（総説については、Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６（前掲）を参照されたい。）。
別の態様においては、本発明は、本発明の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子の少なくとも１種類をコードする核酸配列を、そのｓｉＮＡ分子の発現が可能であるように含む、発現ベクターを特徴とする。一実施形態において、発現ベクターは、ａ）転写開始領域と、ｂ）転写終結領域と、ｃ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列を含み、該配列は、ｓｉＮＡ分子の発現及び／又は送達を可能にするように、開始領域及び終結領域に作動可能に結合している。
別の実施形態において、発現ベクターは、ａ）転写開始領域と、ｂ）転写終結領域と、ｃ）オープンリーディングフレームと、ｄ）核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列とを含み、該配列は、オープンリーディングフレームの３’末端に作動可能に結合し、ｓｉＮＡ分子の発現及び／又は送達を可能にするように、開始領域、オープンリーディングフレーム及び終結領域に作動可能に結合している。更に別の実施形態において、発現ベクターは、ａ）転写開始領域と、ｂ）転写終結領域と、ｃ）イントロンと、ｄ）少なくとも１個のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列とを含み、該配列は、核酸分子の発現及び／又は送達を可能にするように、開始領域、イントロン及び終結領域に作動可能に結合している。
別の実施形態において、発現ベクターは、ａ）転写開始領域と、ｂ）転写終結領域と、ｃ）イントロンと、ｄ）オープンリーディングフレームと、ｅ）核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列とを含み、該配列は、オープンリーディングフレームの３’末端に作動可能に結合し、ｓｉＮＡ分子の発現及び／又は送達を可能にするように、開始領域、イントロン、オープンリーディングフレーム及び終結領域に作動可能に結合している。
本発明は、短鎖ヘアピンＲＮＡを標的細胞に送達するための方法も包含する。この方法は、本発明のｓｈＲＮＡをコードするプラスミドＤＮＡをその中に含む適切な送達ビヒクル及び医薬として許容される担体を含む調製物の有効量を動物に投与する工程を含む。
従って、一態様において、本発明は、（ｉ）ｍＲＮＡ標的転写物へ標的化されるＲＮＡｉ誘導性物質と、及び（ｉｉ）陽イオン性ポリマー、修飾された陽イオン性ポリマー、ペプチド分子輸送体、肺内への導入に適した界面活性剤、リポソーム、非陽イオン性ポリマー、修飾された非陽イオン性ポリマー、ブピバカイン及びクロロキンからなる群から選択される送達剤を含む組成物を提供する。本発明のある種の実施形態において、送達剤は、目的の細胞への送達又は送達の特異性を増強するために、標的化又は送達増強部分を取り込む。本発明の様々な実施形態において、ＲＮＡｉ誘導性物質はｓｉＲＮＡ、ｓＨＲＮＡまたはＲＮＡｉ誘導性ベクターであり得る。
ＰＣＳＫ９生物学及び生化学
プロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９型（以下、「ＰＣＳＫ９」と称する。）（神経アポトーシス制御転換酵素１（「ＮＡＲＣ−１」）としても知られる。）は、分泌性サブチラーゼファミリーの９番目の要素として同定されたプロテインキナーゼＫ様サブチラーゼである。「Seidah et al.，2003 PNAS 100:928-933」を参照されたい。ＰＣＳＫ９は、例えば、肝細胞、腎臓間葉系細胞、小腸の回腸及び大腸上皮並びに胚性脳終脳神経細胞を含む増殖及び分化可能な細胞中で発現される。Ｓｃｉｄａｈ他、上記。
ＰＣＳＫ９遺伝子（又はＮＡＲＣ−１遺伝子）は、NARC-1タンパク質又はポリペプチドをコードする。これは、セリンプロテアーゼのサブチリシンファミリーの最近発見されたメンバーであり、細胞のコレステロール状態によって制御される。ヒトＰＣＳＫ９に対するタンパク質配列（６９２アミノ酸タンパク質をコードする１２のエキソンを有し、約２２ｋｂ長である。）は、例えば、寄託番号ＮＰ ７７７５９６．２に見出すことができる。ＰＣＳＫ９は、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／３１００７、ＷＯ０１／５７０８１、ＷＯ０２／１４３５８、ＷＯ０１／９８４６８、ＷＯ０２／１０２９９３、ＷＯ０２／１０２９９４、ＷＯ０２／４６３８３、ＷＯ０２／９０５２６、ＷＯ０１／７７１３及びＷＯ０１／３４７６８；米国特許公開ＵＳ２００４／０００９５５３及びＵＳ２００３／０１１９０３８並びに欧州特許公開ＥＰ１４４０９８１、ＥＰ１０６７１８２及びＥＰ１４７１１５２を含む幾つかの特許公報（但し、これらに限定されない。）に開示され、及び／又は特許が請求されている。ＮＡＲＣ−１遺伝子の配列は、特許出願ＷＯ０１／５７０８１及びＷＯ０２／１４３５８に記載されており、Ｓｅｉｄａｈ他（２００３）中で部分的に性質決定されている。
そのＮＡＲＣＩ−１という頭字語は、神経細胞の一次培養中にアポトーシスが誘導された場合に、そのｍＲＮＡが上方制御され、８つの他のサブチラーゼ様プロテイナーゼ（プロタンパク質転換酵素と称される。）と似通っているという事実を反映している（例えば、国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／５７０８１を参照されたい。）。ＰＣは、分泌経路を通して移行する、ホルモン、受容体、表面糖タンパク質の前駆体のプロセッシング（及び活性化）に関与している。これらのうちの７つＰＣ１／３、ＰＣ２、フューリン、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＰＣ５／６及びＰＣ７／ＬＰＣは塩基性部位を認識し、ケクシンサブファミリーに属する。８番目のメンバーであるＳＫＩ−１／Ｓ１Ｐは、サブチラーゼのピロリジンサブファミリーに分類される。これは、ステロール調節エレメント（ＳＲＥ）結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）などの小胞体（ＥＲ）に固着された転写因子のプロセッシングに関与しており、従って、コレステロールの恒常性において中心的な役割を担っている。細胞のコレステロールが低い場合には、ＳＲＥＢＰはＥＲからゴルジ装置へと再配置され、ゴルジ装置において、ＳＫＩ−１ＳＩＰは管腔ループ内で切断する。それらの第一の膜貫通ドメイン中でのメタロプロテアーゼＳ２Ｐによる第二の切断は、核に移動し、標的遺伝子を活性化するサイトゾルのＮ末端領域を開放する。ＳＲＥＢＰ−Ｉｃ（肝臓内で優位なイソフォーム）は脂質生成経路を制御するのに対して、ＳＲＥＢＰ−２は、コレステロール代謝の遺伝子を優先的に活性化する。
ＰＣＳＫ９に対する遺伝子は、ヒト染色体１ｐ３３−ｐ３４．３に局在化している。Ｓｅｉｄａｈ他、上記。ＰＣＳＫ９は、例えば、肝細胞、腎臓間葉系細胞、小腸の回腸及び大腸上皮並びに胚性脳終脳神経細胞を含む増殖及び分化可能な細胞中で発現される。Ｓｅｉｄａｈ他、上記。
ＰＣＳＫ９の当初の合成は、約７２ｋＤａの不活性な酵素前駆体、すなわちチモーゲンの形態であり、これは、小胞体（「ＥＲ」）中での自己触媒的分子内プロセッシングを経て、その機能を活性化する。この内部プロセッシング現象は、ＳＳＶＦＡＱ↓ＳＩＰＷＮＬ１５８モチーフにおいて起こり、最初の３つのＮ末端残基Ｓｅｒｉ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏを与えることが報告されており（Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４８８６５−４８８７５）、小胞体から出るために必要であると報告されている。Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ他、上記。Ｓｅｉｄａｈ他、上記。切断されたタンパク質は、次いで、分泌される。切断されたペプチドは、活性化及び分泌された酵素と会合した状態を保つ。上記。
ＰＣＳＫ９は、肝臓及び神経細胞の分化において役割を果たしていると考えられており（Ｓｅｉｄａｈ他、上記）、胎児期の肝臓内に高度に発現されており、コレステロール恒常性への関与が強く推定されている。最近の研究は、コレステロール生合成又は取り込みにおける具体的な役割を示唆するように見受けられる。コレステロールを与えたラットの研究において、Ｍａｘｗｅｌｌ他は、コレステロール生合成に関与する３つの他の遺伝子と類似の様式でＰＣＳＫ９が下方制御されることを見出した。Ｍａｘｗｅｌｌ他、２００３ Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４４：２１０９−２１１９。興味深いことに、ＰＣＳＫ９の発現は、コレステロール代謝に関与する他の遺伝子で見られるように、ステロール調節エレメント結合タンパク質（「ＳＲＥＢＰ」）によっても制御された。上記。これらの知見は、このような制御がリポタンパク質代謝への関与が推定される他の遺伝子に極めて典型的であることを示したＰＣＳＫ９転写制御の研究によって、後に裏付けられた。「Ｄｕｂｕｃ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．２４：１４５４−１４５９． ＰＣＳＫ９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ｕｐ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｔａｔｉｎｓ ｉｎ ａ ｍａｎｎｅｒ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｌｏｗｅｒｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｒｕｇｓ」、上記。さらに、ＰＣＳＫ９プロモーターは、ステロール調節エレメント及びＳｐＩ部位というコレステロール調節に関与する２つの保存された部位を有していた。ＰＣＳＫ９のアデノウイルス発現は、循環するＬＤＬの時間依存的な顕著な増加をもたらすことが示されている（Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４８８６５−４８８７５）。さらに、ＰＣＳＫ９遺伝子を欠失したマウスは肝臓のＬＤＬ受容体の増加したレベルを有し、ＬＤＬを血漿からより迅速に排除する。「Ｒａｓｈｉｄ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：５３７４−５３７９」。
遺伝子ＰＣＳＫ９中の多数の変異が、血漿中の低密度リポタンパク質（「ＬＤＬ」）粒子の顕著な上昇によって特徴付けられ、早発性の心血管不全をもたらし得る遺伝性代謝疾患である常染色体優性高コレステロール血症（「ＡＤＨ」）とも関連すると結論付けられている。「Ａｂｉｆａｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３４：１５４−１５６； Ｔｉｍｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１４：３４９−３５３； Ｌｅｒｅｎ，２００４ Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．６５：４１９−４２２」を参照。Ａｂｉｆａｄｅｌ他、上記のＳ１２７Ｒ変異に関する、後に公表された研究は、（１）低密度リポタンパク質（「ＬＤＬ」）、超低密度リポタンパク質（「ＶＬＤＬ」）及び中間密度リポタンパク質（「ＩＤＬ」）などのＡｐｏＢ１００含有リポタンパク質の過剰生産並びに（２）前記リポタンパク質の排除又は転化の付随する低下の原因であるより血漿中のより高い総コレステロール及びＡｐｏＢ１００を、このような変異を有する患者が呈することを報告した。Ｏｕｇｕｅｒｒａｍ ｅｔ ａｌ．，２００４Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｃｓ．Ｂｉｏｌ．２４：１４４８−１４５３。
ＰＣＳＫ９は、胎児の肝臓中で高度に発現されている。ＰＣＳＫ９は、後に、成体の肝臓中で減少するが、肝切除術後に著しく増加する。転写物は、終脳、皮膚、腎臓、小腸及び小脳などの特定の領域中でも一過性に検出される。ＰＣＳＫ９は前駆細胞中で優先的に発現され、肝臓及び神経細胞の分化において役割を果たし得るという仮説が立てられている。ヒトでは、ＰＣＳＫ９遺伝子は約２２ｋｂ長であり、６９２アミノ酸タンパク質をコードする１２のエキソンを含む。染色体１ｐ３２上に位置決定されたＰＣＳＫ９は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールの高いレベルによって特徴付けられる常染色体優性高コレステロール血漿（ＡＤＨ）、黄色腫及び冠動脈疾患の高い頻度に関与する第三の遺伝子座として最近同定された。家族性高コレステロール血症の症例の多くは、ＬＤＬ粒子の主成分であるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）及びアポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）をコードする遺伝子中の変異を原因とする。幾つかのフランス人家族の遺伝学的分析によって、２つのエキソン性ＰＣＳＫ９変異であるＳ１２７Ｒ及びＦ２１６Ｌが、本疾病とともに分離するハプロタイプに付随していた。この研究は、ユタ州の大規模な親族内のＤ３７４Ｙ及び２つの日本人の多型であるイントロン１／Ｃ（−１６１）およびＩ４７４Ｖという新しいＰＣＳＫ９変異の同定によって最近確認され、全て、ＬＤＬ−コレステロールの異常に高いレベルを伴っていた。（Ｄｕｂｕｃ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２４：１４５４参照）。
ＰＣＳＫ９機能の現在の理解を基礎とすれば、ＰＣＳＫ９及び他の関連遺伝子の調節は、代謝性疾患に対する新たな治療薬を開発する上で有用である。従って、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）によって媒介されるＲＮＡｉを用いたＰＣＳＫ９の調節は、高脂血症、高コレステロール血症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病（例えば、Ｉ型及び／又はＩＩ型糖尿病）、インシュリン抵抗性、肥満及び／又は対象若しくは生物中のＰＣＳＫ９遺伝子発現若しくは活性と関連する他の病状、症状又は形質など、ＰＣＳＫ９活性及び／又は遺伝子発現に関連する疾病及び症状の治療及び研究に対する新規アプローチとなる。
（実施例）
以下は、本発明の核酸の選択、単離、合成及び活性を示す非限定的例である。
ｓｉＮＡコンストラクトのタンデム合成
本発明の例示的なｓｉＮＡ分子を、切断可能なリンカー、例えば、スクシニル系リンカーを用いて、タンデム合成する。本明細書に記載のタンデム合成の後に、ＲＮＡｉ分子を高収率で与える１段階精製工程が続く。この手法は、ハイスループットＲＮＡｉスクリーニングを支持するｓｉＮＡ合成に極めて適しており、マルチカラム又はマルチウェルの合成プラットフォームに容易に適合させることができる。
５’末端ジメトキシトリチル（５’−Ｏ−ＤＭＴ）基が完全に残るｓｉＮＡオリゴとその相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）のタンデム合成（トリチルオン合成）が完結した後、オリゴヌクレオチドを上述のとおりに脱保護する。脱保護後、ｓｉＮＡ配列鎖を自発的にハイブリッド形成させる。このハイブリダイゼーションによって、一方の鎖が５’−Ｏ−ＤＭＴ基を保持し、相補鎖が末端５’ヒドロキシルを含む、二本鎖が生成する。新規に形成された二本鎖は、一方の分子しかジメトキシトリチル基を持たないにもかかわらず、定常的な固相抽出精製（トリチルオン精製）の間、単一の分子として挙動する。鎖は安定な二本鎖を形成するので、例えばＣ１８カートリッジを用いて、オリゴの対を精製するのに必要であるのは、このジメトキシトリチル基（又は他のトリチル基、他の疎水性部分などの等価な基）のみである。
反転デオキシ脱塩基スクシナート、グリセリルスクシナートリンカーなどのタンデムリンカー（図１参照）、又は等価な切断可能なリンカーを導入するまでは、標準ホスホルアミダイト合成化学反応を用いる。使用可能なリンカー結合条件の非限定的例は、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢｒＯＰ）などの活性化試薬の存在下での、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＡ）及び／又はＤＭＡＰなどのヒンダード塩基を含む。リンカーが結合した後、標準合成化学反応を利用して、第２の配列の合成を完了し、末端５’−Ｏ−ＤＭＴをそのまま残す。合成後、生成したオリゴヌクレオチドを、本明細書に記載の手順に従って脱保護し、適切な緩衝剤、例えば、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ又は１．５Ｍ ＮＨ４Ｈ２ＣＯ３でクエンチする。
ｓｉＮＡ二本鎖の精製は、例えば、アセトニトリル １カラム体積（ＣＶ）、Ｈ２Ｏ ２ＣＶ、及び５０ｍＭ ＮａＯＡｃ ２ＣＶで調整したＷａｔｅｒｓ Ｃ１８ ＳｅｐＰａｋ １ｇカートリッジを用いて、固相抽出によって容易に実施することができる。試料を充填し、次いでＨ２Ｏ又は５０ｍＭ ＮａＯＡｃ １ＣＶで洗浄する。失敗配列（ｆａｉｌｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を１４％ＡＣＮ（５０ｍＭ ＮａＯＡｃ及び５０ｍＭ ＮａＣｌを含む水溶液）１ＣＶで溶出させる。次いで、カラムを例えばＨ２Ｏ １ＣＶで洗浄後、例えば、１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液１ＣＶをカラムに通し、次いで１％ＴＦＡ水溶液１ＣＶをカラムに追加し、約１０分間放置することによって、カラム上で脱トリチル化する。残留ＴＦＡ溶液を除去し、カラムをＨ２Ｏ、続いて１Ｍ ＮａＣｌ １ＣＶ及び追加のＨ２Ｏで洗浄する。次いで、ＳｉＮＡ二本鎖生成物を、例えば、２０％ＣＡＮ水溶液１ＣＶによって溶出させる。
図２は、精製ｓｉＮＡコンストラクトのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の例である。各ピークはｓｉＮＡ二本鎖の個々のｓｉＮＡ鎖の計算質量に対応する。同じ精製ｓｉＮＡは、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）によって分析すると、３本のピークを与える。１本のピークは二本鎖ｓｉＮＡに対応し、２本のピークは別々のｓｉＮＡ配列鎖に対応すると推定される。同じｓｉＮＡコンストラクト（ｃｏｎｔｒａｃｔ）のイオン交換ＨＰＬＣ分析では、単一のピークしか出現しない。以下のルシフェラーゼレポーターアッセイによる精製ｓｉＮＡコンストラクトの試験によれば、別々に合成したオリゴヌクレオチド配列鎖から生成したｓｉＮＡコンストラクトとＲＮＡｉ活性が同じであった。
任意のＲＮＡ配列におけるｓｉＮＡ標的部位候補の特定
ヒトｍＲＮＡ転写物（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって本明細書で参照する配列のいずれか）などの目的ＲＮＡ標的の配列を、例えばコンピュータ折りたたみアルゴリズムによって、標的部位についてスクリーニングする。非限定的例において、Ｇｅｎｂａｎｋなどのデータベースから得られる遺伝子又はＲＮＡ遺伝子転写物の配列を用いて、標的に対して相補性を有するｓｉＮＡ標的を作製する。かかる配列は、データベースから得ることができ、又は当分野で公知のとおりに実験的に決定することができる。既知の標的部位、例えば他の核酸分子、例えばリボザイム又はアンチセンスを用いた研究に基づいて有効な標的部位であると決定された標的部位を用いて、又は変異若しくは欠失を含む部位などの疾患、形質若しくは症状と関連することが知られている標的を用いて、これらの部位を標的にするｓｉＮＡ分子を設計することができる。種々のパラメータを用いて、標的ＲＮＡ配列内の最も適切な標的部位である部位を決定することができる。これらのパラメータとしては、二次又は三次ＲＮＡ構造、標的配列のヌクレオチド塩基組成、標的配列の種々の領域間の相同性の程度、又はＲＮＡ転写物内の標的配列の相対位置が挙げられるが、これらだけに限定されない。これらの決定に基づいて、ＲＮＡ転写物内の任意の数の標的部位を選択して、例えば、インビトロＲＮＡ切断アッセイ、細胞培養又は動物モデルを用いることによって、ｓｉＮＡ分子を効力に関してスクリーニングすることができる。非限定的例において、１から１０００個の標的部位のどこでも、使用するｓｉＮＡコンストラクトのサイズに基づいて、転写物内で選択される。マルチウェル、マルチプレートアッセイなどの当分野で公知の方法を用いてｓｉＮＡ分子をスクリーニングして、標的遺伝子発現の効率的減少を求める、ハイスループットスクリーニングアッセイを開発することができる。
ＲＮＡ中の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）分子標的部位の選択
以下の非限定的段階によって、所与の遺伝子配列又は転写物を標的にしたｓｉＮＡを選択することができる。
１． 標的配列をコンピュータ解析して、標的配列内に含まれる特定の長さのすべての断片又は部分配列、例えば２３ヌクレオチド断片のリストを作成する。この段階は、特化されたＰｅｒｌスクリプトを用いて典型的には実施されるが、Ｏｌｉｇｏ、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅなどの市販配列解析プログラムも同様に使用することができる。
２． ｓｉＮＡは、１個を超える標的配列に対応する場合もある。例えば、同じ遺伝子の異なる転写物を標的にする場合、１個を超える遺伝子の異なる転写物を標的にする場合、又はヒト遺伝子と動物相同体の両方を標的にする場合である。この場合には、特定の長さの部分配列リストを標的の各々について作成し、次いでリストを比較して、各リストにおけるマッチング配列を見つける。次いで、部分配列を、所与の部分配列を含む標的配列の数に従ってランク付けする。標的配列の大部分又はすべてに存在する部分配列を見つけることが目的である。或いは、ランク付けによって、変異標的配列など、標的配列に独特な部分配列を特定することができる。かかる手法によって、変異配列を特異的に標的にし、正常配列を発現させない、ｓｉＮＡの使用が可能になる。
３． ｓｉＮＡ部分配列は、所望の標的配列には存在するが、１個以上の配列には存在しない場合もある。これは、非標的のままにすべきであるパラロガスなファミリーメンバーを有する遺伝子を、ｓｉＮＡが標的にする場合である。上記２の場合と同様に、特定の長さの部分配列リストを標的の各々について作成し、次いでリストを比較して、標的遺伝子中には存在するが、非標的パラログ中には存在しない配列を見つける。
４． ランク付けされたｓｉＮＡ部分配列を更に解析して、ＧＣ含量に従ってランク付けすることができる。３０−７０％ＧＣを含む部位が好ましく、４０−６０％ＧＣを含む部位が更に好ましい。
５． ランク付けされたｓｉＮＡ部分配列を更に解析して、自己折りたたみ及び内部ヘアピンに従ってランク付けすることができる。より弱い内部折りたたみが好ましく、強いヘアピン構造は回避されるべきである。
６． ランク付けされたｓｉＮＡ部分配列を更に解析して、一続きのＧＧＧ又はＣＣＣを配列中に有するか否かによってランク付けすることができる。どちらかの鎖のＧＧＧ（又は更に多いＧ）は、オリゴヌクレオチド合成に問題を生じるおそれがあり、ＲＮＡｉ活性を妨害するおそれがある。したがって、より良好な配列が利用可能であるときには常に回避される。標的鎖においてはＣＣＣを検索する。というのは、ＣＣＣは、アンチセンス鎖ではＧＧＧの位置にあるからである。
７． ランク付けされたｓｉＮＡ部分配列を更に解析して、ジヌクレオチドＵＵ（ウリジンジヌクレオチド）を配列の３’末端に有するか否か、及び／又は（アンチセンス配列に３’ＵＵを生ずる）ＡＡを配列の５’末端に有するか否かによって、ランク付けすることができる。これらの配列によって、末端ＴＴチミジンジヌクレオチドを有するｓｉＮＡ分子の設計が可能になる。
８． ランク付けされた上記部分配列リストから４又は５個の標的部位を選択する。次いで、例えば、２３ヌクレオチドを有する部分配列において、選択した各２３量体部分配列の右側の２１ヌクレオチドをｓｉＮＡ二本鎖の上側（センス）鎖用に設計して、合成し、次いで、選択した各２３量体部分配列の左側の２１ヌクレオチドの逆相補鎖（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）をｓｉＮＡ二本鎖の下側（アンチセンス）鎖用に設計して、合成する（表ＩＩ参照）。（パラグラフ７に記載したように）末端ＴＴ残基が配列にとって望ましい場合には、オリゴを合成する前に、センス鎖とアンチセンス鎖の両方の２個の３’末端ヌクレオチドをＴＴで置換する。
９． ｓｉＮＡ分子をインビトロの細胞培養又は動物モデル系においてスクリーニングして、標的ＲＮＡ配列内の最も活性なｓｉＮＡ分子、又は最も好ましい標的部位を特定する。
１０． 標的核酸配列を選択するときには、別の設計考慮事項を使用することができる。例えば、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，１ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ９３６及びＵｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｈ２４７を参照されたい。
代替手法においては、標的配列に特異的であるｓｉＮＡ構築体のプールを用いて、培養したジャーカット、ＨｅＬａ、Ａ５４９、２９３Ｔ細胞など、標的ＲＮＡを発現する細胞中の標的部位についてスクリーニングする。この手法に用いる一般戦略を図９に示す。標的ＲＮＡを発現する細胞にｓｉＮＡ構築体のプールを移入し、標的阻害に関連した表現型を示す細胞を選別する。ｓｉＮＡ構築体のプールは、適切なベクターに挿入された転写カセットから発現され得る（例えば、図７及び図８参照）。表現型のポジティブな変化（例えば、増殖の減少、標的ｍＲＮＡレベルの低下、又は標的タンパク質発現の減少）を示す細胞から得られたＳｉＮＡの配列を決定して、標的標的ＲＮＡ配列内の最も適切な標的部位を求める。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子を以下の方法によって選択する。以下の指針を編集して、本明細書に記載の化学修飾を含む異常に活性なｓｉＮＡを予測した。これらの規則は、幾つかの異なる標的に対して異常に活性な（標的ｍＲＮＡレベルの＞７５％ノックダウン）ｓｉＮＡと不活性な（標的ｍＲＮＡレベルの＜７５％ノックダウン）ｓｉＮＡとの比較解析から明らかになった。合計２４２個のｓｉＮＡ配列を解析した。２４２個のｓｉＮＡのうち、３５個のｓｉＮＡは異常に活性なグループに分類され、残りのｓｉＮＡは不活性なグループに分類された。異常に活性なｓｉＮＡは、ｓｉＮＡ配列内の特定のヌクレオチド位置におけるある種の塩基に明らかに選択的であった。例えば、Ａ又はＵ核酸塩基は、異常に活性なｓｉＮＡ中のセンス鎖の１９位に圧倒的に存在し、不活性ｓｉＮＡでは逆であった。異常に活性なｓｉＮＡ中のセンス鎖の１５−１９位間のＡ／Ｕリッチ（５塩基のうち３塩基がＡ又はＵ）領域、及び１−５位間のＧ／Ｃリッチ領域（５塩基のうち３塩基がＧ又はＣ）のパターンも存在した。表ＶＩＩに示すように、異常に活性なｓｉＮＡに特徴的であるかかる１２パターンを特定した。すべてのパターンが、異常に活性な各ｓｉＮＡ中に存在するとは限らないことに留意されたい。したがって、異常に活性なｓｉＮＡを予測するアルゴリズムを設計するために、各パターンに対して異なるスコアを割り当てた。異常に活性なｓｉＮＡと不活性ｓｉＮＡにおいてかかるパターンが出現する頻度に応じて、設計パラメータにスコアを割り当てた。１０が最高であった。ある種の核酸塩基がある位置において好ましくない場合には、負のスコアを割り当てた。例えば、センス鎖の９及び１３位において、Ｇヌクレオチドは、異常に活性なｓｉＮＡにおいて好ましくなく、したがって−３（マイナス３）のスコアを割り当てた。各パターンに対する示差的なスコアを表ＶＩＩに示す。パターン＃４は、最大スコアの−１００であった。これは、主に、一続きの４Ｇ又は４Ｃが合成に極めて不適合であり、配列を自己凝集させて、ｓｉＮＡを不活性にし得るので、一続きの４Ｇ又は４Ｃを含む配列を除去するためである。このアルゴリズムを用いて、任意のｓｉＮＡに可能な最高スコアは６６である。妥当なサイズ（約１０００ヌクレオチド）の任意の所与の標的に対して可能なｓｉＮＡ配列は多数あるので、このアルゴリズムは異常に活性なｓｉＮＡを作製するのに有用である。
一実施形態において、表ＶＩＩに示す規則１−１１を用いて、本発明の活性なｓｉＮＡ分子を作製する。別の実施形態において、表ＶＩＩに示す規則１−１２を用いて、本発明の活性なｓｉＮＡ分子を作製する。
ＰＣＳＫ９ｓｉＮＡの設計
ｓｉＮＡ標的部位は、ＰＣＳＫ９ＲＮＡ標的の配列を解析し、上記実施例３に記載した規則に基づいて、又は折りたたみ（標的へのｓｉＮＡの到達性を求めるために解析された任意の所与の配列の構造）に基づいて、標的部位に優先順位を場合によっては付けることによって選択され、又は実施例３に記載したｓｉＮＡ分子のライブラリーを用いることによって選択され、又は本明細書の実施例６に記載するインビトロｓｉＮＡ系を用いることによって選択された。各標的に結合し得るｓｉＮＡ分子を設計した。ｓｉＮＡ分子を、上記アルゴリズムによって選択し、場合によっては、コンピュータ折りたたみによって個々に解析して、ｓｉＮＡ分子が標的配列と相互作用し得るか否かを判断する。ｓｉＮＡ分子の長さを変更して、活性を最適化するように選択することができる。一般に、標的ＲＮＡと結合又は相互作用するのに十分な数の相補ヌクレオチド塩基を選択するが、相補性の程度は、ｓｉＮＡ二本鎖又は種々の長さ又は塩基組成に適応するように調節することができる。かかる方法論を用いることによって、任意の既知のＲＮＡ配列内、例えば、任意の遺伝子転写物に対応するＲＮＡ配列内の部位を標的にするようにｓｉＮＡ分子を設計することができる。
標的配列を解析して、二本鎖ｓｉＮＡを設計する元になる標的を作製する（表ＩＩ）。合成ｓｉＮＡ構築体を作製するために、実施例３に記載のアルゴリズムを利用して、活性な二本鎖構築体及びその化学修飾二本鎖構築体を選択する。例えば、表ＩＩにおいて、ｓｉＮＡ二本鎖の上側（センス鎖）及び下側（アンチセンス鎖）と一緒に標的配列を示す。異なる標的配列間の相同部位（例えば、相同性を共有した約５から約１５ヌクレオチド領域）を探索し、非標準塩基対（例えばＧ：Ｕゆらぎ塩基対形成）又は塩基対のミスマッチを考慮することによって、多官能ｓｉＮＡを設計する。
ＲＮＡｉ活性媒介能力を維持しながら、インビボでの全身投与のためのヌクレアーゼ安定性及び／又は改善された薬物動態学、局在化及び送達特性を備えるように、化学修飾ｓｉＮＡ構築体を本明細書に記載のとおりに設計した（例えば、表Ｖ参照）。本明細書に記載の化学修飾を、本明細書に記載する合成方法、及び当分野で一般に公知である合成方法によって、合成的に導入する。次いで、合成ｓｉＮＡ構築体のヌクレアーゼ安定性を、血清及び／又は細胞／組織抽出物（例えば、肝臓抽出物）中で評価する。合成ｓｉＮＡ構築体のＲＮＡｉ活性も、本明細書に記載のルシフェラーゼレポーターアッセイ、ＲＮＡｉ活性を定量することができる別の適切なアッセイなどの適切なアッセイによって、並行して試験する。ヌクレアーゼ安定性とＲＮＡｉ活性の両方を有する合成ｓｉＮＡ構築体を更に修飾して、安定性及び活性のアッセイにおいて再評価することができる。次いで、安定化された活性ｓｉＮＡ構築体の化学修飾を、任意の選択ＲＮＡを標的にする任意のｓｉＮＡ配列に適用して、例えば標的スクリーニングアッセイに用いて、創薬のためのリードｓｉＮＡ化合物を選択することができる（例えば、図１１参照）。
ｓｉＮＡの化学合成及、精製及び分析
ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡメッセージ中の種々の部位、例えば、本明細書に記載のＲＮＡ配列内の標的配列と相互作用するように設計することができる。ｓｉＮＡ分子の一方の鎖の配列は、上記標的部位配列に相補的である。ｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載の方法によって化学合成することができる。対照配列として用いられる不活性ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子の配列を標的配列に相補的でないようにスクランブルすることによって、合成することができる。一般に、ｓｉＮＡ構築体は、本明細書に記載の固相オリゴヌクレオチド合成方法によって合成することができる（例えば、参照によりその全体を本明細書に組み込む、Ｕｓｍａｎ他、米国特許第５，８０４，６８３号、同５，８３１，０７１号、同５，９９８，２０３号、同６，１１７，６５７号、同６，３５３，０９８号、同６，３６２，３２３号、同６，４３７，１１７号、同６，４６９，１５８号、Ｓｃａｒｉｎｇｅ他、米国特許第６，１１１，０８６号、同６，００８，４００号、同６，１１１，０８６号参照）。
非限定的例において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、当分野で公知のホスホルアミダイト化学反応によって段階的に合成する。標準的なホスホルアミダイト化学反応は、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル、２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、３’−Ｏ−２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト基及び環外アミン保護基（例えば、Ｎ６−ベンゾイルアデノシン、Ｎ４ アセチルシチジン及びＮ２−イソブチリルグアノシン）のいずれかを含むヌクレオシドを使用する。或いは、Ｓｃａｒｉｎｇｅ（前掲）によって記述されたとおりに、２’−Ｏ−シリルエーテルを酸に不安定な２’−Ｏ−オルトエステル保護基と一緒に、ＲＮＡの合成に使用することができる。異なる２’化学反応は異なる保護基を必要とすることがあり、例えば、２’−デオキシ−２’−アミノヌクレオシドは、参照によりその全体を本明細書に組み込む、Ｕｓｍａｎ他、米国特許第５，６３１，３６０号に記載のＮ−フタロイル保護を利用することができる。
固相合成中に、各ヌクレオチドを、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドに（３’から５’方向に）順次付加させる。鎖の３’末端の第１のヌクレオシドを、種々のリンカーによって固体支持体（例えば、ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ又はポリスチレン）に共有結合させる。ヌクレオチド前駆体、リボヌクレオシドホスホルアミダイト及び活性化物質を混合して、第１のヌクレオシドの５’末端に第２のヌクレオシドホスホルアミダイトを結合させる。次いで、支持体を洗浄し、未反応５’ヒドロキシル基を無水酢酸などのキャッピング試薬を用いてキャッピングして、不活性５’アセチル部分を得る。次いで、三価のリン結合を酸化して、より安定なリン酸結合にする。ヌクレオチド付加サイクルの最後に、５’−Ｏ−保護基を適切な条件下（例えば、トリチル系の基については酸性条件、シリル系の基についてはフッ化物）で切断する。後続の各ヌクレオチドについてこのサイクルを繰り返す。
合成条件を変更して、例えば、合成すべきｓｉＮＡの特定の化学組成に応じて、異なるカップリング時間、異なる試薬／ホスホルアミダイト濃度、異なる接触時間、異なる固体支持体及び固体支持体リンカー化学反応を用いることによって、カップリング効率を最適化することができる。ｓｉＮＡの脱保護及び精製は、一般に、参照によりその全体を本明細書に組み込むＵｓｍａｎ他、米国特許第５，８３１，０７１号、同６，３５３，０９８号、同６，４３７，１１７号、及びＢｅｌｌｏｎ他、米国特許第６，０５４，５７６号、同６，１６２，９０９号、同６，３０３，７７３号、又はＳｃａｒｉｎｇｅ（前掲）に記載のとおりに実施することができる。さらに、脱保護条件を変更して、ｓｉＮＡ構築体の可能な最高の収率及び純度を得ることができる。例えば、出願人は、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが不適当な脱保護条件下で分解し得ることを認めた。かかるオリゴヌクレオチドは、メチルアミン水溶液を用いて、約３５℃で３０分間脱保護される。２’−デオキシ−２’−フルオロ含有オリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドも含む場合には、メチルアミン水溶液で約３５℃で３０分間脱保護した後、ＴＥＡ−ＨＦを添加して、反応物（ｒｅａｃｔｉｏｎ）を約６５℃で更に１５分間維持する。ｓｉＮＡの脱保護された一本鎖を、陰イオン交換によって精製して、高収率を維持しながら、高純度を得る。ｓｉＮＡ二本鎖分子を形成するために、一本鎖を食塩水中で等モル比で混合して、二本鎖を形成する。二本鎖ｓｉＮＡを濃縮し、正接（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）ろ過によって脱塩した後、凍結乾燥する。
ｓｉＮＡ組成物の製造
非限定的例において、各ｓｉＮ組成物について、ｓｉＮＡの２本の個々の相補鎖を固相合成によって別々に合成し、次いでイオン交換クロマトグラフィーによって別々に精製する。相補鎖をアニールして、二重鎖（二本鎖）を形成する。次いで、二本鎖を限外ろ過し、凍結乾燥させて、固体ｓｉＮ組成物（例えば、薬剤組成物）を形成する。製造プロセスの非限定的例を表ＶＩＩＩの流れ図に示す。
固相合成
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ（例えば、Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ又はＯｌｉｇｏｐｉｌｏｔ １００ ｐｌｕｓ）などの自動固相合成装置を用いて一本鎖オリゴヌクレオチドをホスホルアミダイト化学反応によって合成する。調節可能な合成カラムに、第１のヌクレオシド残基を用いて誘導体化された固体担体を充填する。酸に不安定な５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基を脱トリチル化して、５’−ヒドロキシルを遊離させることによって合成を開始する。アセトニトリル中のホスホルアミダイト及び適切な活性化物質を合成カラムに同時に送達させて、アミダイトを５’−ヒドロキシルと結合させる。次いで、カラムをアセトニトリルで洗浄する。ヨウ素をカラムにポンプで注入して、亜リン酸トリエステル結合Ｐ（ＩＩＩ）をそのリン酸トリエステルＰ（Ｖ）類似体に酸化する。未反応５’−ヒドロキシル基を、無水酢酸などの試薬を用いて、２，６−ルチジン及びＮ−メチルイミダゾールの存在下でキャップする。次のホスホルアミダイトの組み入れのための脱トリチル化段階によって伸長サイクルを再開する。所望の配列が合成されるまで、このプロセスを繰り返す。合成の最後に末端ジメトキシトリチル基を除去する。
切断及び脱保護
合成終了後、固体支持体及び結合したオリゴヌクレオチドをフィルター漏斗に移し、減圧乾燥させ、反応器に移す。塩基水溶液を添加し、混合物を加熱して、スクシニル結合を切断し、シアノエチルリン酸保護基を除去し、環外アミン保護を脱保護する。
以下のプロセスを、リボヌクレオチドを含まない一本鎖上で実施する。すなわち、固体担体を塩基水溶液で処理した後、混合物を減圧ろ過して、脱保護された粗製合成材料から固体担体を分離する。次いで、固体担体を水でリンスし、その水をろ液と混合する。得られた塩基性溶液を酸で中和して、粗製一本鎖の溶液を得る。
以下のプロセスを、リボヌクレオチドを含む一本鎖上で実施する。すなわち、固体担体を塩基水溶液で処理した後、混合物を減圧ろ過して、脱保護された粗製合成材料から固体担体を分離する。次いで、固体担体をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）でリンスし、そのＤＭＳＯをろ液と混合する。混合物を冷却し、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩などのフッ化物試薬を添加し、溶液を加熱する。反応物を適切な緩衝剤でクエンチして、粗製一本鎖の溶液を得る。
陰イオン交換精製
各粗製一本鎖の溶液をクロマトグラフィー精製によって精製する。生成物を適切な緩衝剤勾配によって溶出させる。画分を密閉無菌容器に収集し、ＨＰＬＣによって分析し、適切な画分を混合して生成物のプールを得る。このプールの純度（ＨＰＬＣ）、アイデンティティ（ＨＰＬＣ）及び濃度（ＵＶ Ａ２６０）を分析する。
アニーリング
生成物のプールの分析に基づいて、（理論吸光係数を用いて計算した）等モル量のセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を反応器に移す。溶液を混合し、二本鎖の純度をクロマトグラフィー法によって分析する。分析によってどちらかの鎖が過剰であることが判明した場合、二本鎖形成（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）が完結するまで追加の非過剰の鎖を滴定する。分析によって標的生成物純度に達したことを確認し、濃縮・脱塩用のクロスフロー（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ）ろ過（ＴＦＦ）システムに材料を移送する。
限外ろ過
アニールした生成物溶液を、適切な分子量カットオフ膜を備えたＴＦＦシステムによって濃縮する。濃縮後、生成物溶液を、注射用水品質の水（ＷＦＩ ｑｕａｌｉｔｙ ｗａｔｅｒ）を用いた透析ろ過によって、ろ液の伝導率が水の伝導率になるまで脱塩する。
凍結乾燥
濃縮溶液を棚状凍結乾燥器中の無菌トレーに移す。次いで、生成物を凍結乾燥させて粉末にする。トレーを凍結乾燥器から取り出し、包装用のクラス１００ Ｌａｍｉｎａｒ Ａｉｒ Ｆｌｏｗ（ＬＡＦ）フードに移す。
薬物物質の包装
凍結乾燥生成物を含む凍結乾燥器トレーをクラス１００ ＬＡＦフード中で開ける。生成物を適切なサイズの無菌容器に移し、次いで密封し、標識する。
薬物物質容器密封システム
凍結乾燥薬物物質のバルクを無菌キャップの付いた無菌ナルゲン容器に詰める。使用する瓶のサイズは、その中に入れる材料の量によって決まる。充填後、各瓶をポリエチレンテープで更に密封する。
分析法及び仕様
原材料及び製造過程の方法
原材料を同定した後、薬物物質製造プロセスに導入する。薬物物質分子に組み入れる重要な原材料を、純度試験又はアッセイ試験によって、適宜、更に試験する。製造過程の試料を、製造プロセスの重要な制御ポイントにおいて試験して、最終薬物物質の品質をモニターし、保証する。
薬物物質分析法及び仕様
オリゴヌクレオチドの分析法及び受入れ基準を採用する規則（Ｃｏｎｔｒｏｌｓ）を確立した後に、バルクｓｉＮ組成物の臨床試験を実施する。以下の試験方法及び受入れ基準は、これらの規則の例を反映している。表ＩＸに、ｓｉＮＡ薬剤組成物の材料仕様例を要約する。
分析法の概要
同定（ＩＤ）試験
ＩＤオリゴヌクレオチド主ピーク：薬物物質をクロマトグラフィー法によって同定する。この測定に用いるデータをＨＰＬＣ試験方法の１つによって作成する（純度試験参照）。薬物物質試料と標準注射のピーク保持時間を比較する。薬物物質の同定は、主ピーク保持時間を好適に比較することによって裏づけられる。
分子量：薬物物質を分光学的方法によって同定する。酢酸アンモニウム水溶液を用いた沈殿によって、分析用の薬物物質試料を調製する。薬物物質の分子量を質量分析法によって測定する。試験を、理論分子量から得られる設定原子質量単位数内で制御する。
融解温度：この方法によって、二本鎖薬物の融解温度（Ｔｍ）を測定して薬物物質の同定を裏づける。溶液試料を加熱しながら、溶液の紫外（ＵＶ）吸光度をモニターする。吸光度は、二本鎖が一本鎖に解離することによって増加するので、Ｔｍは、吸光度曲線の変曲点によって示される。
アッセイ試験
オリゴヌクレオチド含量：このアッセイによって、薬物物質中の総オリゴヌクレオチド含量を測定する。オリゴヌクレオチドは、ＵＶ光を吸収し、極大は２６０ｎｍである。存在するオリゴヌクレオチド種は、残留一本鎖を含めて、二本鎖ｓｉＲＮＡ生成物、及び製造プロセスから得られる他の副次的な関連オリゴヌクレオチド物質からなる。薬物物質試料を正確に計量し、溶解させ、体積測定によって水で希釈する。吸光度を、ＵＶ分光光度計を用いて石英セル中で測定する。総オリゴヌクレオチドアッセイ値を、実験によって測定された実用標準（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｔａｎｄａｒｄ）のモル吸光係数を用いて計算し、固体薬物物質１ミリグラム当たりのナトリウムオリゴヌクレオチドのマイクログラム単位で記録する。
純度試験：１つ以上のクロマトグラフィー法によって純度を測定する。存在する薬物物質の核酸類似体の分離及び数に応じて、直交分離（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）法によってＡＰＩの純度をモニターすることができる。分離は、以下の手段によって実施することができる。
ＳＡＸ−ＨＰＬＣ：オリゴヌクレオチドリン酸ジエステルと分離用緩衝塩勾配を用いた強陰イオン交換ＨＰＬＣカラムとのイオン交換相互作用。
ＲＰ−ＨＰＬＣ：緩衝剤水溶液と有機溶媒との分離用勾配を用いた疎水性逆相ＨＰＬＣカラムと、オリゴヌクレオチドとの分割相互作用。
キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）：ゲル充填キャピラリー内の緩衝液中での分子ふるいによる電気泳動的分離。分離は、電場をかけると起こり、陰イオン性オリゴヌクレオチドは、ゲルマトリックスを通って移動する際に分子サイズによって分離される。すべての分離方法において、ピークは、オリゴヌクレオチド長の順で一般に溶出し、２６０ｎｍのＵＶによって検出される。
他の試験
物理的外観：薬物物質試料を目視検査する。この試験によって、材料が凍結乾燥固体の特性を有することを判定し、固体の色を確認し、可視汚染物質が存在するかどうかを判定する。
菌体内毒素試験：菌体内毒素試験は、９６ウェルプレートにおいて比濁時間分析法を用いたカブトガニの血球抽出成分（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ）（ＬＡＬ）アッセイによって実施される。賦形剤と混合したときに、投与した薬物製品中の内毒素の１日当たりの許容限界を超えないように、薬物物質に対する内毒素の限界を適切に設定する。
好気性生物汚染度（Ａｅｒｏｂｉｃ ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）：好気性生物汚染度は、ＵＳＰ＜６１＞章に基づく方法を用いて、契約した検査室によって実施される。
アセトニトリル含量：残留アセトニトリル分析は、契約した検査室によってガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて実施される。幾つかの他の有機試薬を合成に使用するものの、アセトニトリルは、上流の合成段階に用いられる主要な有機溶媒である。それに続く精製プロセス段階によって、薬物物質中の溶媒が典型的には除去される。他の溶媒は、プロセス開発作業（ｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｗｏｒｋ）の結果に応じてモニターすることができる。溶媒をＩＣＨ限界内に制限する。
含水量：固体エバポレーター装置（オーブン）を用いた体積測定カールフィッシャー（ＫＦ）滴定によって含水量を測定する。水は、典型的には、組成物の数重量パーセントとして核酸薬物物質中に存在し、したがって、モニターされる。
ｐＨ：水で戻した薬物物質のｐＨをモニターして、ヒトの注射に確実に適するようにする。
イオン含量：ナトリウム、塩化物及びホスファートの試験は、契約した検査室によって標準原子吸光及びイオンクロマトグラフィー法を用いて実施される。イオンの一般的モニタリングを実施して、薬物物質を組み入れた薬物製品の重量オスモル濃度が確実に生理学的許容範囲内にあるようにする。
金属含量：関係する金属の試験は、契約した検査室によって、標準の分析方法である誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）分光法を用いて実施される。
ｓｉＮＡ活性を評価するＲＮＡｉインビトロアッセイ
ＲＮＡｉを無細胞系において再現する（ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ）インビトロアッセイによって、標的ＲＮＡ標的を標的にするｓｉＮＡ構築体を評価する。このアッセイは、標的ＲＮＡを用いた使用に適合させた、Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，３１９１−３１９７及びＺａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３に記載の系を含む。シンシチウム胚盤葉に由来するショウジョウバエ抽出物を用いて、ＲＮＡｉ活性をインビトロで再構成する。標的ＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて適切な標的発現プラスミドからインビトロで転写することによって、又は本明細書に記載の化学合成によって、作製される。センスとアンチセンスの各ｓｉＮＡ鎖（例えば、各２０ｕＭ）を、（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウムなどの）緩衝剤中で９０℃で１分間、続いて３７℃で１時間温置することによってアニールし、次いで溶解緩衝剤（例えば、１００ｍＭ酢酸カリウム、ｐＨ７．４の３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、２ｍＭ酢酸マグネシウム）で希釈する。アガロースゲル上でＴＢＥ緩衝剤を用いてゲル電気泳動させ、臭化エチジウムで染色することによって、アニーリングを監視することができる。発酵させた糖蜜寒天上に収集し、じゅう毛膜を除去し、溶解させた、Ｏｒｅｇｏｎ Ｒハエ由来の０から２時間齢の胚を用いて、ショウジョウバエ溶解物を調製する。この溶解物を遠心分離し、上清を単離する。アッセイは、５０％溶解物［ｖｏｌ／ｖｏｌ］、ＲＮＡ（最終濃度１０−５０ｐＭ）及びｓｉＮＡ（最終濃度１０ｎＭ）含有１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］溶解緩衝剤を含有する反応混合物を含む。反応混合物は、１０ｍＭクレアチンリン酸、１０ｕｇ／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ、１００ｕｍ ＧＴＰ、１００ｕＭ ＵＴＰ、１００ｕＭ ＣＴＰ、５００ｕＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１Ｕ／ｕＬ ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び各アミノ酸１００ｕＭも含む。酢酸カリウムの最終濃度を１００ｍＭに調節する。反応物を氷上で前もって集め、２５℃で１０分間プレ温置した後、ＲＮＡを添加し、次いで２５℃で更に６０分間温置する。反応物を１．２５×Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）４体積でクエンチする。標的ＲＮＡの切断をＲＴ−ＰＣＲ分析、又は当分野で公知の他の方法によって評価し、ｓｉＮＡが反応から省略されている対照反応と比較する。
或いは、アッセイ用に内部標識した標的ＲＮＡを、［アルファ−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下でインビトロで転写することによって調製し、スピンクロマトグラフィーによってＧ５０ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムに通し、更に精製せずに標的ＲＮＡとして用いる。場合によっては、標的ＲＮＡを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて５’−３２Ｐ末端標識してもよい。アッセイを上述のとおりに実施し、標的ＲＮＡ、及びＲＮＡｉによって生成する特定のＲＮＡ切断産物をゲルのオートラジオグラフ上で可視化する。完全な対照ＲＮＡ、又はｓｉＮＡのない対照反応から得られたＲＮＡ、及びアッセイによって生成した切断産物を表すバンドをＰＨＯＳＰＨＯＲ ＩＭＡＧＥＲ（登録商標、オートラジオグラフィー）で定量することによって、切断割合を求める。
一実施形態において、このアッセイによって、ｓｉＮＡによって媒介されるＲＮＡｉ切断のための標的ＲＮＡ標的中の標的部位を決定する。ここで、例えば、標識した標的ＲＮＡの電気泳動によりアッセイ反応を分析することによって、又はノザンブロット法によって、また、当分野で周知である他の方法によって、ＲＮＡｉによって媒介される標的ＲＮＡ標的の切断について、複数のｓｉＮＡ構築体をスクリーニングする。
ＰＣＳＫ９標的ＲＮＡの核酸阻害
ヒトＰＣＳＫ９ＲＮＡに標的誘導されるｓｉＮＡ分子を、上述したとおりに設計し、合成する。これらの核酸分子のインビボでの切断活性を、例えば、以下の手順によって試験することができる。ＰＣＳＫ９ＲＮＡ内の標的配列及びヌクレオチドの位置を表ＩＩ及びＩＩＩに示す。
２つの形式によって、ＰＣＳＫ９を標的にするｓｉＮＡの効力を試験する。第１に、細胞培養における試薬を、ＨｅｐＧ２、ジャーカット、ＨｅＬａ、Ａ５４９又は２９３Ｔ細胞を用いて試験して、ＲＮＡ及びタンパク質の阻害の程度を求める。ｓｉＮＡ試薬（例えば、表ＩＩ及びＩＩＩを参照されたい。）を、本明細書に記載のとおりにＰＣＳＫ９標的に対して選択する。適切な移入剤を用いてこれらの試薬を、例えば、ＨｅｐＧ２、ジャーカット、ＨｅＬａ、Ａ５４９又は２９３Ｔ細胞に送達した後に、ＲＮＡ阻害を測定する。アクチンに対する標的ＲＮＡの相対量を、増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング（例えば、ＡＢＩ ７７００ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））によって測定する。無関係な標的に対して作製された各オリゴヌクレオチド配列の混合物を比較し、又は同じ全長及び化学的性質を有するが、各位置で無作為に置換された無作為化ｓｉＮＡ対照を比較する。一次及び二次リード試薬を標的に対して選択し、最適化を実施する。最適な移入剤濃度を選択後、ＲＮＡの経時阻害をリードｓｉＮＡ分子を用いて実施する。
また、細胞プレーティング形式によって、ＲＮＡ阻害を求めることができる。この系は、Ｒｉｃｅ他米国特許第５，８７４，５６５号及び同第６，１２７，１１６号（何れも、参照により、本明細書に組み込まれる。）中に記載されている。
細胞へのｓｉＮＡの送達
細胞（例えば、ＨｅｐＧ２、ジャーカット、ＨｅＬａ、Ａ５４９又は２９３Ｔ細胞）を、移入の前日に、例えば、６ウェル皿の１ウェル当たり１×１０５細胞でＥＧＭ−２（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）中に蒔く。ｓｉＮＡ（最終濃度、例えば２０ｎＭ）と陽イオン性脂質（例えば、最終濃度２μｇ／ｍｌ）を、ポリスチレン管中のＥＧＭ基本培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で３７℃で３０分間複合化させる。ボルテックス撹拌後、複合化したｓｉＮＡを各ウェルに添加し、示した時間温置する。最初の最適化実験の場合、細胞を、例えば１×１０３で、９６ウェルプレートに蒔き、記載したとおりにｓｉＮＡ複合体を添加する。細胞へのｓｉＮＡの送達効率は、脂質と複合化した蛍光ｓｉＮＡを用いて求められる。６ウェル皿中の細胞をｓｉＮＡと一緒に２４時間温置し、ＰＢＳでリンスし、２％パラホルムアルデヒド中で室温で１５分間固定する。ｓｉＮＡの取り込みを蛍光顕微鏡によって可視化する。
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング）及びＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒによるｍＲＮＡの定量
ｓｉＮＡ送達後、例えば、６ウェル用Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡ精製キット又は９６ウェルアッセイ用Ｒｎｅａｓｙ抽出キットを用いて、細胞から全ＲＮＡを調製する。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分析（増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング）の場合、５’末端に共有結合したレポーター色素ＦＡＭ又はＪＯＥ、及び３’末端に結合したクエンチャー色素ＴＡＭＲＡを用いて、二重標識プローブを合成する。１段階ＲＴ−ＰＣＲ増幅は、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用い、全ＲＮＡ １０μｌ、１００ｎＭ順方向プライマー、９００ｎＭ逆方向プライマー、１００ｎＭプローブ、１×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応緩衝剤（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、５．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ ３００μＭ、１０Ｕ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１．２５Ｕ ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤ（登録商標）（ＤＮＡポリメラーゼ）（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０Ｕ Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）からなる反応物５０μｌを用いて実施される。サーマルサイクリング条件は、４８℃３０分間、９５℃１０分間、続いて９５℃１５秒間と６０℃１分間を４０サイクルからなり得る。ｍＲＮＡレベルは、段階希釈された全細胞ＲＮＡ（３００、１００、３３、１１ｎｇ／反応）から作製した標準に対して定量され、並行ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応（増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング）におけるβアクチン又はＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して標準化される。各目的遺伝子について、上側プライマーと下側プライマー及び蛍光標識プローブを設計する。特定のＰＣＲ産物へのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ色素の実時間取り込みは、ガラスキャピラリー管中でｌｉｇｈｔｃｙｌｅｒを用いて測定することができる。各プライマー対に対する検量線を、対照ｃＲＮＡを用いて作成する。値は、各試料におけるＧＡＰＤＨに対する相対発現として表される。
ウエスタンブロット法
核抽出物は、標準マイクロ調製技術（例えば、Ａｎｄｒｅｗｓ ａｎｄ Ｆａｌｌｅｒ，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，２４９９参照）によって調製することができる。上清からのタンパク質抽出物を、例えばＴＣＡ沈殿によって、調製する。等体積の２０％ＴＣＡを細胞上清に添加し、氷上で１時間温置し、５分間遠心分離してペレット化する。ペレットをアセトンで洗浄し、乾燥させ、水に再懸濁させる。細胞タンパク質抽出物を１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰａｇｅ（核抽出物）又は４−１２％Ｔｒｉｓ−グリシン（上清抽出物）ポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、ニトロセルロース膜に移す。非特異的結合は、例えば、５％脱脂乳と一緒に１時間、続いて一次抗体と一緒に４℃で１６時間温置することによって、ブロックすることができる。洗浄後、二次抗体を例えば（１：１０，０００希釈）室温で１時間適用し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてシグナルを検出する。
ＰＣＳＫ９遺伝子発現の下方制御の評価に有用であるモデル
本発明のｓｉＮＡ分子の効力を動物モデルで評価することは、ヒト臨床試験に対する重要な必要条件である。当分野で公知である、癌、増殖性、炎症性、自己免疫性、神経性、眼球、呼吸器、代謝的、聴覚、皮膚などの疾患、症状又は障害の種々の動物モデルは、治療用、化粧用又は研究用の標的遺伝子発現の調節において、本発明の核酸組成物の効力の前臨床評価に使用するために改作することができる。「Goldberg,2004,J Clin Invest.114(5):613-615」は、高脂血症及び糖尿病を含む代謝性疾患用の治療剤を評価するのに有用な動物モデルの概説を与える。これらのモデル及びその他のモデルは、ｓｉＮＡ分子及び本発明の分子の組成物の効力を評価するために使用することができる。従って、ＰＣＳＫ９ＲＮＡを標的として、代謝性及び関連の疾病及び症状を治療する上で本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）で処理された細胞は、無作為化された又は不活性な配列を有する対応する対照核酸分子に比べて減少したＰＣＳＫ９発現能を有すると予想される。非限定的な実施例において、ヒトＴ細胞は培養され、ＰＣＳＫ９発現は、例えば、時間分解された免疫蛍光アッセイによって定量される。ＰＣＳＫ９メッセンジャーＲＮＡ発現は、培養された細胞中でのＲＴ−ＰＣＲを用いて定量される。非処理細胞を、適切な試薬、例えば、リポフェクタミンなどの陽イオン性脂質で形質移入されたｓｉＮＡ分子で処理された細胞と比較し、ＰＣＳＫ９タンパク質とＲＮＡレベルを定量する。次いで、ＰＣＳＫ９発現の用量依存性阻害を確立するために、用量応答アッセイを行う。非限定的な実施例において、「Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，９，５６２」に記載されているとおりに細胞培養実験を改変する。
ＲＮＡｉによって媒介されるＰＣＳＫ９遺伝子発現の阻害
インビトロでのｓｉＮＡによって媒介されるＰＣＳＫ９ＲＮＡの阻害
細胞（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）におけるＰＣＳＫ９ＲＮＡ発現を減少させる効力に関して、ｓｉＮＡ構築体を試験する。移入の時点で細胞が７０−９０％コンフルエントであるように、移入の約２４時間前に、９６ウェルプレートに５，０００−７，５００細胞／ウェル、１００μｌ／ウェルで細胞を蒔く。移入の場合、アニールしたｓｉＮＡを体積５０μｌ／ウェルの移入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、室温で２０分間インキュベートする。ｓｉＮＡ移入混合物を細胞に添加して、体積１５０μｌ中の最終ｓｉＮＡ濃度２５ｍＭとする。各ｓｉＮＡ移入混合物を、３つ組のｓｉＮＡ処理用に３個のウェルに添加する。ｓｉＮＡ移入混合物が連続して存在する下で、細胞を３７°で２４時間インキュベートする。２４時間において、処理細胞の各ウェルからＲＮＡを調製する。移入混合物を含む上清をまず取り出して廃棄し、次いで細胞を溶解させ、各ウェルからＲＮＡを調製する。処理後の標的遺伝子発現を、標的遺伝子及び標準化用対照遺伝子（３６Ｂ４、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット）についてＲＴ−ＰＣＲによって評価する。３つ組データを平均し、標準偏差を各処理について求める。標準化したデータをグラフにし、それぞれの逆対照（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ）ｓｉＮＡと比較した、活性ｓｉＮＡによる標的ｍＲＮＡの減少割合を求める。
ＰＣＳＫ９ＲＮＡ発現のベクターによって媒介されるノックダウン
ＬＤＬ受容体レベルに対するＰＣＳＫ９のｓｉＲＮＡノックダウンの効果を特定するために、２つの安定な細胞株（一方は対照ベクターｐｃＤＮＡを発現し、他方は野生型ＰＣＳＫ９を発現する。）を確立した。ウェスタンブロッティングによって（図３０）、及び蛍光標識されたＬＤＬ粒子の取り込みを測定することによって（図３１）、ＰＣＳＫ９に対して特異的なｓｉＲＮＡの効果を分析した。
図３０Ａを参照すると、データは、ＰＣＳＫ９タンパク質がＰＣＳＫ９を安定に発現されている細胞中においてのみ検出されるのに対して、対照細胞株はＰＣＳＫ９の検出不能なレベルを有することを示している（レーン３及び６を比較されたい。）。ＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡの混合物でこれらの細胞を処理することによって、ＰＣＳＫ９を発現する安定な細胞株中でのＰＣＫＳ９タンパク質の特異的なノックダウンがもたらされた（レーン５）。比較して、非標的化ｓｉＲＮＡはＰＣＳＫ９レベルに対して効果を有さなかった（レーン４）。
さらに、データは、ｓｉＲＮＡによるＰＣＳＫ９の特異的ノックダウンが野生型ＰＣＳＫ９の安定な細胞株中のＬＤＬ受容体レベルの増加をもたらす（図３０Ｂ）が、対照ｐｃＤＮＡ安定細胞株中では増加をもたらさないことを示している。さらに、ＬＤＬ受容体のレベルは有意であり、対照細胞株中では容易に検出された。これに対して、ＰＣＳＫ９を発現する安定な細胞株は、ＬＤＬ受容体タンパク質の大幅に低下した（ほぼ検出不能な）レベルを示した（図３０Ｂ中のレーン３と６を比較されたい。）。この結果は、図３０に示されているｄＩ−ＬＤＬ取り込みアッセイのデータと合致した。
図３１を参照すると、ｄｉＩ−ＬＤＬの取り込みのレベルは、対照の安定な細胞株中でのｓｉＲＮＡ処理によって著しい影響を受けなかった。しかしながら、ＰＣＳＫ９を発現する安定な細胞株中では、ｄｉＩ−ＬＤＬ取り込みの全般的に低いレベルが観察された（レーン４及び６）。従って、ｓｉＲＮＡによるＰＣＳＫ９の特異的なノックダウンは、ｄｉＩ−ＬＤＬ取り込みの増加をもたらし、ＬＤＬ受容体レベルの増加と合致していた。
ＰＣＳＫ９は、記載されている逆転写法によってノックダウンされた。ｓｉＰＯＲＴアミン試薬（１．５μＬ、Ａｍｂｉｏｎから入手）を、室温で１０分間、ＯｐｔｉＭＥＭ（還元された血清、Ｇｉｂｃｏから入手）の１０μＬと混合した（反応Ａ）。別の反応（反応Ｂ）では、ＰＣＳＫ９に対して特異的なｓｉＲＮＡの１０μＭ原液１μＬ（各ｓｉＲＮＡは３．３μＭ）を、室温で１０分間、ＯｐｔｉＭＥＭ（還元された血清）１０μＬと混合する。 以下に列記されているＰＣＳＫ９に対して特異的な３つの二本鎖ｓｉＲＮＡ配列は、Ｐｒｏｌｉｇｏから注文する。
Figure 2010503382
対照ｓｉＲＮＡ配列（非標的化ｓｉＲＮＡ＃１−ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ非標的化ｓｉＲＮＡ＃１Ｄ−００１２１０−０１−０５）は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから注文した。
反応ＡとＢを組み合わせ、９６ウェルプレート中の２０，０００個の細胞を含有する各ウェルにこの混合物２２．５μＬを添加した。細胞培地（ＤＭＥＭ１００μＬ、ピルビン酸ナトリウムとグルタミンが補充された高グルコース培地、抗生物質なし、５％ウシ胎児血清）を各ウェルに添加した。４８時間後、ウェスタンブロットによって、ＰＣＳＫ９タンパク質及びＬＤＬ受容体タンパク質レベルを測定するために、細胞を採集した。
ｄＩ−ＬＤＬ取り込みアッセイのためのプロトコール：
ＬＤＬ取り込みは、ＬＤＬ受容体レベルの機能的な読み取りを与えるための本分野で認められた方法である。９６ウェルのポリＤ−リジン被覆されたプレート（Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号３６６５）中に、２０，０００細胞／ウェルの密度で細胞を播種し、上述のように、ｓｉＲＮＡ形質移入混合物を細胞に添加した。４８時間後に、細胞培地を除去し、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で細胞を洗浄した。無リポタンパク質血清（ＩｎｔｒａＣｅｌから入手）及びｄＩ−ＬＤＬ（１０μｇ／ｍＬの濃度）を含有するＤＭＥＭ培地である混合物Ａ（１００μＬ）を細胞に添加した。非特異的結合を測定するために、４００μｇ／ｍＬの標識されていないＬＤＬも含有する混合物Ａの１００μＬを対照ウェルに添加した。３７℃で６時間、プレートを温置した。２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａから入手、カタログ番号Ａ３０５９）を含有するＴＢＳ（ＢｉｏＲａｄ，＃１７０−６４３５）中で細胞を素早く洗浄した。洗浄工程を反復したが、この時には、洗浄緩衝液を細胞とともに２分間温置した。最後に、ＴＢＳ（ＢＳＡなし）で、細胞を二回（但し、素早く）洗浄した。ＲＩＰＡ緩衝液（ＴｅｋＮｏｖａから入手、＃Ｒ３７９２）１００μＬ中で細胞を溶解し、可溶化液を黒いプレート（Ｆｉｓｈｅｒから入手したＭｉｃｒｏＦｌｕｏｒ２Ｂｌａｃｋ「Ｕ」底プレート）に移した。５２０ｎｍの励起波長及び５８０ｎｍの発光波長を用いて、蛍光をプレート中で測定した。ＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅから入手、カタログ番号２３２２５）を用いて、各ウェル中の総細胞タンパク質を測定し、蛍光単位を総タンパク質に対して標準化した。特異的なＬＤＬ取り込みの量は、（標識されていないＬＤＬの不存在下で）測定された総カウントと標識されていないＬＤＬの存在下で測定されたカウント（非特異的バックグラウンド蛍光）との差である。
実験のプロトコール：
ｓｈＲＮＡの設計：独自のアルゴリズムを用いて、マウスＰＣＳＫ９に対する６ＳｈＲＮＡ配列をＲｏｓｅｔｔａにおいて設計した。ヌクレオチド１５６６から始まるＳｈ２の１９マー配列（ＮＭ １５３５６５）は配列番号９０９ＧＣＡＣＡＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣＡＣＡであり、ヌクレオチド２４０２から始まるＳｈ６配列は、配列番号９１０ＧＴＧＧＣＡＡＧＡＧＴＣＣＡＴＧＡＣＡである。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ技術によって、ＳｈＲＮＡカセットのフォワード及びリバースオリゴを合成した。
Figure 2010503382
ＳｈＲＮＡプラスミドの作製及びスクリーニング：ＳｈＲＮＡカセットのフォワード及びリバースオリゴを徐冷し、ヒトＨ１プロモーターを含有するＧａｔｅｗａｙエントリーベクターｐＥＮＴＲ１ＡＨ１中に連結した。インビトロでこれらのｓｈＲＮＡの効力を評価するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００形質移入試薬を用いて、６つのｐＥＮＴＲ１ＳＨ１−ＰＣＳＫ９ＳｈＲＮＡプラスミドをマウス肝細胞腫細胞Ｈｅｐａ１から６中に形質移入し、形質移入から４８時間後に細胞を採集した。リアルタイムＰＣＲ分析のために、全ＲＮＡを調製した。相対的なｍＲＮＡ発現レベルは、βアクチンの発現に対して標準化した。マウスＰＣＳＫ９及びβＡＣＴＢに対するｔａｑｍａｎプライマー及びプローブの組は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
組み換えアデノウイルス調製物及びインビトロでのノックダウンの確認：ｍＰＣＳＫ９に対するＳｈＲＮＡを発現する組み換えアデノウイルスベクターを作製するために、ＧａｔｅｗａｙをベースとするｐＡｄ−Ｂｌｏｃｋ−ｉＴＤＥＳＴベクター中に選択されたｍＰＣＳＫ９Ｓｈ２及びＳｈ６を組み換えた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。ＨＥＫ２９３細胞中で組み換えアデノウイルスを産生し、ＣｓＣｌ密度勾配超遠心の２つのラウンドによって精製した。透析によって、精製されたウイルスを脱塩し、ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐＹＭ−５０カラム上で濃縮し、使用前に−８０℃中で保存した。Ａｄ−ｍＰＣＳＫ９Ｓｈ２及びＡｄ−ｍＰＣＳＫ９Ｓｈ６が、インビトロにおいて、ｍＲＮＡレベルでＰＣＳＫ９を下方制御するのに機能的であることを確認するために、異なるＭＯＩ（感染効率）で、２つのＳｈＲＮＡアデノウイルスでＨｅｐａ１−６細胞を形質導入し、下流の全ＲＮＡの単離及びリアルタイムＰＣＲ分析のために、形質導入から７２時間後に細胞を採集した。
動物プロトコール：本研究で使用された全ての動物プロトコールは、「Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ」によって承認された。雄のＣ５７ＢＬ６マウスをＴａｃｏｎｉｃＦａｒｍから購入し、別々に飼育した。研究の最初に、９週齢のマウスを等しい平均体重の実験群に分けた。尾静脈を介して、１００μＬ生理的食塩水の最終容量中の２．５×１０９ＰＦＵ／マウスＡｄ−Ｃｏｎｔ、Ａｄ−ＰＣＳＫ９Ｓｈ２又はＡｄ−ＰＣＳＫ９Ｓｈ６をマウスに注射した。注射から４日及び８日後に、体重及び食物摂取を測定した。注射から４日及び８日後に、節食条件下で、血液及び組織を収集するために動物を安楽死させた。
ＬＤＬ測定：本研究でマウスから得た新鮮な血漿をリパーゼ阻害剤で処理し、０．６５μＭフィルターチューブを通してろ過し、次いでＲｏｂｏＦＬＡＮ、ＦＰＬＣ分析装置に適用した。図３２を参照すると、内因性にマウスＰＣＳＫ９を発現しているＨｅｐａ１−６細胞中に、ｐＥＮＴＲ１ＡＨ１ベクター中の６つのＰＣＳＫ９ＳｈＲＮＡを形質移入した。Ｈ１プロモーター及び終結配列を含有するｐＥＮＴＲ１Ａベクターをベクター対照として使用した。ＰＣＳＫ９をノックダウンする上での６つのＰＣＳＫ９ＳｈＲＮＡの効力は、リアルタイムＰＣＲ分析によってアッセイした。図示されているとおり、リアルタイムＰＣＲ分析によって測定されたところによれば、対照と比べて、ｍＰＣＳＫ９Ｓｈ２及びｍＰＣＳＫ９Ｓｈ６は、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ発現レベルを約８０％下方制御した。データの点は、平均±標準偏差を表す（ｎ＝３）。
図３３を参照すると、アデノウイルスによって媒介されたＳｈＲＮＡのノックダウンの効力を確認するために、様々なＭＯＩで、Ａｄ−ＰＣＳＫ９Ｓｈ２及びＡｄ−ＰＣＳＫ９Ｓｈ６をＨｅｐａ１−６細胞中に形質導入した。注射から７２時間後に、細胞を採集し、リアルタイムＰＣＲ分析に供した。ＰＣＳＫ９Ｓｈ２及びＳｈ６は、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡをウイルス用量依存的な様式で低下させた。ＭＯＩ４００において、Ａｄ−ＰＣＳＫ９ｓｈ２及びＡｄ−ＰＣＳＫ９Ｓｈ６は、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡを約９０％低下させた。データの点は、平均±標準偏差を表す（ｎ＝４）。
肝臓中でのＰＣＳＫ９阻害の効果を評価するために、対照ベクターを発現する組み換えアデノウイルスベクターＰＣＳＫ９Ｓｈ２又はＰＣＳＫ９Ｓｈ６を雄のＣ５７／ＢＬ６マウス中に静脈内注射した。このアプローチによるアデノウイルス媒介性発現は肝臓特異的であることが、文献中に詳しく記載されている（Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８，５：７９８； Ｄｅｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００６，５５：２１５９； Ｒａｇｏｚｉｎ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｅ Ｂｉｏｌ．２００５，２５：１４３３）。
図３４を参照すると、ＰＣＳＫ９Ｓｈ２、ＰＣＳＫ９Ｓｈ９又は空のベクターを発現する２．５×１０９ｐｆｕの組み換えアデノウイルスをＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した。注射から４日及び８日後に、摂食条件下で、血液及び組織を収集するために動物を安楽死させた。
図３４Ａに図示されているように、注射から４日後に、ＰＣＳＫ９レベルは、Ａｄ−ＰＣＳＫ９Ｓｈ２によって約５５％、Ａｄ−ＰＳＣＫ９−Ｓｈ６によって約６５％低下した。注射から８日後に、ＰＣＳＫ９レベルは、Ａｄ−ＰＣＳＫ９Ｓｈ２によって約５０％、Ａｄ−ＰＳＣＫ９−Ｓｈ６によって約６５％低下した。データの点は、平均±標準偏差を表す（ｎ＝５）。
図３４Ｂを参照すると、マウス血漿のリポタンパク質特性は、ＲｏｂｏＦｌａｎによって測定した。ＰＣＳＫ９Ｓｈ２又はＳｈ６を発現するアデノウイルスで処理されたマウス中のＬＤＬレベルは、アデノウイルス対照群と同様であった。形質導入から８日後に、Ａｄ−ＰＣＳＫ９ＳｈＲＮＡ６によるＰＣＳＫ９の肝臓のノックダウンはＬＤＬの約８０％の低下をもたらしたのに対して、ＰＣＳＫ９Ｓｈ２を発現するアデノウイルスで処理されたマウス中のＬＤＬレベルは変化しないことが観察された。データの点は、平均±平均値の標準誤差を表す（ｎ＝５）。いかなる仮説にも拘泥するものではないが、８日目におけるＰＣＳＫ９Ｓｈ２及びＳｈ６を発現するアデノウイルスで処理されたマウス間でのＬＤＬレベルの差はｍＲＮＡレベルでのノックダウンの差によって部分的に説明することができると考えられる。
図３５の説明文を参照すると、アデノウイルス形質導入から４日及び８日後に体重及び食物摂取がモニターされた。図示されているように、注射から４日目及び８日目に、対照アデノウイルスで処理されたマウスと比べて、ＰＣＳＫ９Ｓｈ２又はＰＣＳＫ９Ｓｈ６を発現するアデノウイルスで処理されたマウス中での体重及び食物摂取には統計学的に有意な変化が観察されなかった（図示せず）。データの点は、平均±平均値の標準誤差を表す（ｎ＝５）。
ｓｈＲＮＡコンストラクト配列の要約：
配列番号５９７−ｓｈＲＮＡコンストラクト／二重鎖番号１のセンス鎖。
配列番号５９８−ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡのｓｈＲＮＡコンストラクト／二重鎖番号１のアンチセンス鎖。
配列番号５９９−ｓｈＲＮＡコンストラクト／二重鎖番号２のセンス鎖。
配列番号６００−ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡのｓｈＲＮＡコンストラクト／二重鎖番号２のアンチセンス鎖。
配列番号６０１−ｓｈＲＮＡコンストラクト／二重鎖番号３のセンス鎖。
配列番号６０２−ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡのｓｈＲＮＡコンストラクト／二重鎖番号３のアンチセンス鎖。
配列番号６０３−アミノ酸配列−本発明のＲＮＡｉコンストラクトによって標的とされるＰＣＳＫ９ｍＲＮＡによってコードされるヒトＰＣＳＫ９。
配列番号６０４−配列番号５９７に示されているアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡ配列。
配列番号６０５−ＰＣＳＫ９−ｓｈ２に対するフォワードオリゴヌクレオチド（Ｃｅｎｂａｎｋ受付番号ＮＭ １５３５６５から作製）。
配列番号６０６−ＰＣＳＫ９−ｓｈ２に対するリバースオリゴヌクレオチド（Ｃｅｎｂａｎｋ受付番号ＮＭ １５３５６５から作製）。
配列番号６０７−ＰＣＳＫ９−ｓｈ６に対するフォワードオリゴヌクレオチド（Ｃｅｎｂａｎｋ受付番号ＮＭ １５３５６５から作製）。
配列番号６０８−ＰＣＳＫ９−ｓｈ６に対するリバースオリゴヌクレオチド（Ｃｅｎｂａｎｋ受付番号ＮＭ １５３５６５から作製）。
適応症
遺伝子発現調節と関連し得る具体的な症状及び病状には、本明細書に記載されている又は本分野においてその他公知である代謝性及び心血管病、症状又は疾患並びに単独で又は他の療法と組み合わせて、細胞又は組織中の標的（例えば、標的ＰＣＳＫ９タンパク質又は標的ＰＣＳＫ９ポリヌクレオチド）のレベルに関連し又は応答する他のあらゆる疾病、症状又は疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない。このような疾病及び症状の非限定的な例には、高コレステロール血症、脂質代謝異常、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病（例えば、Ｉ型及び／又はＩＩ型糖尿病）、インシュリン抵抗性、肥満及び／又はメタボリックシンドローム、高リポタンパク血症Ｉ型、高リポタンパク血症ＩＩ型、高リポタンパク血症ＩＩＩ型、高リポタンパク血症ＩＶ型、高リポタンパク血症Ｖ型、続発性高トリグリセリド血症及び家族性レシチンコレステロールアシル転移酵素欠乏症を含む高脂血症；並びに冠動脈心疾患（ＣＨＤ）、脳血管疾患（ＣＶＤ）、大動脈狭窄、末梢血管疾患、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、心筋梗塞（心臓発作）、脳血管疾患（卒中）、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、狭心症（安定性及び不安定性）、心房細動、不整脈、弁膜症及び／又はうっ血性心不全などの心血管疾患、又は、単独で若しくは他の療法と組み合わせて、細胞若しくは組織中のＰＣＳＫ９のレベルに関連し又は応答する他のあらゆる形質、疾病又は症状が含まれる。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトと組み合わせて使用することができる化合物の非限定的な例には、スタチン（例えば、アトルバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン）、トルセトラピブ及びＪＴＴ−７０５などの他のＰＣＳＫ９阻害剤、並びにα−１アドレナリン作動性アンタゴニスト（例えば、プラゾシン）、β−アドレナリン作動性アンタゴニスト（例えば、プロプラノロール、ナドロール、チモロール、メトプロロール、ピンドロール）などの降圧薬、併用α／βアドレナリン作動性アンタゴニスト（例えば、ラベタロール）、アドレナリン作動性神経細胞遮断薬（例えば、グアネチジン、レセルピン）、中枢神経作動性降圧薬（例えば、クロニジン、メチルドパ、グアナベンズ）、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル）及びアンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（例えば、ロサルタン）などの抗アンギオテンシンＩＩ剤、カルシウムチャンネル遮断薬（例えば、ベラパミル、ジルチアゼム、ニフェジピン）、利尿薬（例えば、ヒドロクロロチアジド、フロルタリドン、フロセミド、トリアムテレン）及び直接的血管拡張薬（例えば、ヒドララジン、ミノキシジル、ヒドララジン、ニトロプルシド、ジアゾキシド）並びにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。化合物の上記リストは、本明細書中の形質、疾病及び疾患の予防又は治療のために本発明のＲＮＡｉコンストラクト（例えば、ＲＮＡｉコンストラクト）と組み合わせることができる又は本発明のＲＮＡｉコンストラクト（例えば、ＲＮＡｉコンストラクト）とともに使用することができる化合物及び／又は方法の非限定的な例である。当業者は、他の薬物化合物及び治療法は本発明のＲＮＡｉコンストラクト（例えば、ＲＮＡｉコンストラクト）と同様に容易に組み合わせることができること、従って、本発明の範囲に属することを認識する。
インターフェロン
インターフェロンは、本明細書に記載の疾患及び／又は症状を治療するために、本発明のｓｉＮＡ分子と併用することができる化合物の１クラスの非限定的例である。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）は、２５を超えるＩＦＮ−α（Ｐｅｓｔａ，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １１９，３−１４）並びにＩＦＮ−β及びＩＦＮ−ωのファミリーを含む天然サイトカインの１クラスである。同じ遺伝子に進化的に由来するが（Ｄｉａｚ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２２，５４０−５５２）、これらの分子の一次配列には多数の相違があり、生物活性における進化的分岐を暗示している。すべてのＩ型ＩＦＮは、ＩＦＮが細胞表面受容体に結合することから始まる生物学的効果の共通のパターンを共有する（Ｐｆｅｆｆｅｒ ＆ Ｓｔｒｕｌｏｖｉｃｉ，１９９２，Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒｓ ｆｏｒ ＩＦＮ−α／β． Ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．，Ｓ． Ｂａｒｏｎ，Ｄ．Ｈ． Ｃｏｏｐｅｎｈａｖｅｒ，Ｆ． Ｄｉａｎｚａｎｉ，Ｗ．Ｒ． Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ Ｊｒ．，Ｔ．Ｋ． Ｈｕｇｈｅｓ Ｊｒ．，Ｇ．Ｒ． Ｋｉｍｐｅｌ，Ｄ．Ｗ． Ｎｉｅｓｅｌ，Ｇ．Ｊ． Ｓｔａｎｔｏｎ，ａｎｄ Ｓ．Ｋ． Ｔｙｒｉｎｇ，ｅｄｓ． １５１−１６０）。結合に続いて、ヤヌスチロシンキナーゼを含めたチロシンキナーゼ及びＳＴＡＴタンパク質が活性化され、ＩＦＮによって誘導される幾つかの遺伝子産物が産生される（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉ． Ａｍ． ２７０，６８−７５）。ＩＦＮによって誘導される遺伝子産物は、抗ウイルス性、抗増殖性及び免疫調節性効果、サイトカインの誘導、並びにＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩの調節を含めて、Ｉ型ＩＦＮの多面的な生物学的効果の原因である（Ｐｅｓｔｋａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ５６，７２７）。ＩＦＮによって誘導される遺伝子産物の例としては、２−５−オリゴアデニル酸合成酵素（２−５ ＯＡＳ）、β２−ミクログロブリン、ネオプトリン、ｐ６８キナーゼ及びＭｘタンパク質が挙げられる（Ｃｈｅｂａｔｈ ＆ Ｒｅｖｅｌ，１９９２，Ｔｈｅ ２−５ Ａ ｓｙｓｔｅｍ：２−５ Ａ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ｉｓｏｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ． Ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓ． Ｂａｒｏｎ，Ｄ．Ｈ． Ｃｏｏｐｅｎｈａｖｅｒ，Ｆ． Ｄｉａｎｚａｎｉ，Ｗ．Ｒ． Ｊｒ． Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ，Ｔ．Ｋ． Ｊｒ Ｈｕｇｈｅｓ，Ｇ．Ｒ． Ｋｉｍｐｅｌ，Ｄ．Ｗ． Ｎｉｅｓｅｌ，Ｇ．Ｊ． Ｓｔａｎｔｏｎ，ａｎｄ Ｓ．Ｋ． Ｔｙｒｉｎｇ，ｅｄｓ．，ｐｐ．２２５−２３６；Ｓａｍｕｅｌ，１９９２，Ｔｈｅ ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐ１／ｅＩＦ−２ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ． Ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｓ． Ｂａｒｏｎ，Ｄ．Ｈ． Ｃｏｏｐｅｎｈａｖｅｒ，Ｆ． Ｄｉａｎｚａｎｉ，Ｗ．Ｒ． Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ Ｊｒ．，Ｔ．Ｋ． Ｈｕｇｈｅｓ Ｊｒ．，Ｇ．Ｒ． Ｋｉｍｐｅｌ，Ｄ．Ｗ． Ｎｉｅｓｅｌ，Ｇ．Ｈ． Ｓｔａｎｔｏｎ，ａｎｄ Ｓ．Ｋ． Ｔｙｒｉｎｇ，ｅｄｓ． ２３７−２５０；Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ，１９９２，ＭＸ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ． Ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｓ． Ｂａｒｏｎ，Ｄ．Ｈ． Ｃｏｏｐｅｎｈａｖｅｒ，Ｆ． Ｄｉａｎｚａｎｉ，Ｗ．Ｒ． Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ Ｊｒ．，Ｔ．Ｋ． Ｈｕｇｈｅｓ Ｊｒ．，Ｇ．Ｒ． Ｋｉｍｐｅｌ，Ｄ．Ｗ． Ｎｉｅｓｅｌ，Ｇ．Ｈ． Ｓｔａｎｔｏｎ，ａｎｄ Ｓ．Ｋ． Ｔｙｒｉｎｇ，ｅｄｓ． ２１５−２２４）。すべてのＩ型ＩＦＮは類似した生物学的効果を有するが、すべての活性が各Ｉ型ＩＦＮによって共有されるわけではなく、多くの場合において、活性度は、各ＩＦＮサブタイプでかなり実質的に変動する（Ｆｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ． ９，９７−１１４；Ｏｚｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ． １２，５５−５９）。より具体的には、ＩＦＮ−αの異なるサブタイプ、及びＩＦＮ−αの分子ハイブリッドの諸性質についての研究によれば、薬理的諸性質には違いがある（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，１９８７，Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ． ７，５４５−５５１）。これらの薬理的相違は、わずか３個のアミノ酸残基の変化から生じ得る（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４２，１３１２−１３１６）。
公知のＩＦＮ−αサブタイプでは、８５から１６６個のアミノ酸が保存されている。ＩＦＮ−α偽遺伝子を除いて、約２５の公知の異なるＩＦＮ−αサブタイプがある。これらの非対立性サブタイプを対ごとに比較すると、一次配列の違いは、２％から２３％の範囲である。天然ＩＦＮに加えて、コンセンサスインターフェロン（ＣＩＦＮ）として知られる非天然組換えＩ型インターフェロンが治療化合物として合成された（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２６，７４７−７５４）。
インターフェロンは、現在、感染症、自己免疫疾患及び癌を含めて少なくとも１２種類の適応症に使用されている（Ｂｏｒｄｅｎ，１９９２，Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２６，１４９１−１４９２）。自己免疫疾患の場合、ＩＦＮは、リウマチ様関節炎、多発性硬化症及びクローン病の治療に利用されている。癌治療の場合、ＩＦＮは、単独で、又は幾つかの異なる化合物と組み合わせて使用されている。ＩＦＮが使用される特定の癌タイプとしては、へん平上皮癌、黒色腫、副腎腫、血管腫、有毛細胞白血病、カポジ肉腫などが挙げられる。感染症の治療においては、ＩＦＮは、マクロファージの食作用、及びリンパ球の細胞傷害性を増大させ、細胞病原体の増殖を阻害する。ＩＦＮが治療に使用される具体的適応症としては、Ｂ型肝炎、６及び１１型ヒトパピローマウイルス（すなわち、陰部ゆうぜい）（Ｌｅｖｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３２５，６１３−６１７）、慢性肉芽腫症、Ｃ型肝炎ウイルスなどが挙げられる。
慢性ＨＣＶ感染症の治療にＩＦＮアルファを用いた多数の十分に管理された臨床試験によれば、週３回の治療によって、６か月の療法の終わりまでに患者の約５０％（４０％−７０％の範囲）において血清ＡＬＴ値が低下する（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２１，１５０１−１５０６；Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１３，３９３−３９７；Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２６，７４７−７５４；Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２６，１６４０−１６４５）。しかし、インターフェロン治療の休止後、反応のあった患者の約５０％が再発し、「耐久（ｄｕｒａｂｌｅ）」反応率は、血清ＡＬＴ濃度の正常化によって評価して、約２０から２５％であった。また、臨床的エンドポイントとしてＨＣＶ ＲＮＡ値の変化を用いた１型インターフェロン療法の６か月間を調べた試験によれば、療法の終わりまでに患者の最高３５％でＨＣＶ ＲＮＡが消失した（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７（前掲））。しかし、ＡＬＴエンドポイントの場合と同様に、患者の約５０％が療法休止後６か月で再発し、耐久ウイルス学的著効はわずか１２％にすぎない（２３）。４８週間の療法を調べた試験によれば、持続的ウイルス学的著効は、最高２５％である。
ＰＥＧ化インターフェロン、すなわち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と抱合されたインターフェロンは、インターフェロンよりも諸特性が改善された。ＰＥＧ抱合によって受ける利点としては、ＰＥＧのないインターフェロンよりも薬物動態プロファイルが改善され、したがって投与計画がより好都合になり、耐性が改善され、抗ウイルス効力が向上することが挙げられる。かかる改善は、ポリエチレングリコールインターフェロンアルファ２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ、Ｒｏｃｈｅ）とポリエチレングリコールインターフェロンアルファ２ｂ（ＶＴＲＡＦＥＲＯＮ ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ、Ｅｎｚｏｎ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）の両方の臨床試験で実証された。
多官能ｓｉＮＡによる標的ＲＮＡ発現の阻害
多官能ｓｉＮＡの設計
多官能ｓｉＮＡ構築体に対する標的部位を特定した後、異なる標的核酸配列に相補的である、例えば約１８から約２８ヌクレオチド長の、相補領域を有するｓｉＮＡの各鎖を設計する。標的配列に相補的でないが、他方の配列の相補領域に対する相補性を含む、約４から約２２ヌクレオチドの隣接するフランキング領域を有する各相補領域を設計する（例えば、図１６参照）。ヘアピン構築体を同様に設計することができる（例えば、図１７参照）。異なる標的核酸配列間で共有される相補的回文構造又は反復配列を特定することによって、多官能ｓｉＮＡ構築体の全長を短縮することができる（例えば、図１８及び１９参照）。
非限定的例において、単一のｓｉＮＡ分子によって複数の標的をサイレンシングし得る別の多官能ｓｉＮＡ設計の３つの追加のカテゴリーが存在する。第１の方法は、リンカーを利用して、ｓｉＮＡ（又は多官能ｓｉＮＡ）を直接連結させる。これによって、インターフェロン応答を誘発し得る一連の長鎖ＲＮＡを生成せずに、最も強力なｓｉＮＡを連結することができる。第２の方法は、重複した、又は連結された、多官能設計のデンドリマー的な伸長、或いは超分子形式のｓｉＮＡの組織化である。第３の方法は、３０塩基対を超えるヘリックス長を利用する。これらのｓｉＮＡのダイサーによるプロセシングによって、新しい活性５’アンチセンス末端が出現する。したがって、長鎖ｓｉＮＡは、元の５’末端によって規定される部位、及びダイサープロセシングによって作製される新しい末端によって規定される部位を標的にすることができる。（センス鎖とアンチセンス鎖が標的を各々規定する）伝統的な多官能ｓｉＮＡと併用すると、この手法を用いて、例えば４個以上の部位を標的にすることができる。
１． 繋留（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）二官能性ｓｉＮＡ
基本的な考え方は、２本のアンチセンスｓｉＮＡ鎖が単一のセンス鎖とアニールされる多官能ｓｉＮＡの設計に対する新規な取り組みである。センス鎖オリゴヌクレオチドは、リンカー（例えば、本明細書に記載の非ヌクレオチドリンカー）と、アンチセンスｓｉＮＡ鎖にアニールされる２個のセグメントを含む（図２２参照）。リンカーは、ヌクレオチド系リンカーを含んでいてもよい。この手法の幾つかの潜在的利点及び変形としては、これらだけに限定されないが、以下のものが挙げられる。
１． ２個のアンチセンスｓｉＮＡは独立している。したがって、標的部位の選択は、２個の部位間の配列保存の要件によって束縛されない。任意の２個の高活性ｓｉＮＡを組み合わせて、多官能ｓｉＮＡを形成することができる。
２． 相同性を有する標的部位と併用するときには、２個の遺伝子（例えば、異なるアイソフォーム）中に存在する配列を標的にするｓｉＮＡ、この設計を用いて、２個を超える部位を標的にすることができる。例えば、単一の多官能ｓｉＮＡを用いて、２個の異なる標的ＲＮＡのＲＮＡを標的にすることができる。
３． センス鎖とアンチセンス鎖の両方を使用して１個の遺伝子を標的にする多官能ｓｉＮＡも、繋留多機能設計に組み入れることができる。これによって、６個以上の部位を単一の複合体で標的にする可能性が残される。
４． ２個を超えるアンチセンス鎖ｓｉＮＡを単一の繋留センス鎖にアニールすることができる。
５． この設計は、一連の長鎖ｄｓＲＮＡの発生を防止する。したがって、インターフェロン応答を惹起する可能性は低い。
６． リンカー（又は本明細書に記載の抱合体など、リンカーに結合した修飾）は、複合体の薬物動態学的諸性質を改善し、又はリポソームへの複合体の取り込みを改善する。リンカーに導入された修飾は、ｓｉＮＡに直接結合した場合と同じ程度に、ｓｉＮＡ活性に影響を及ぼすべきではない（例えば、図２７及び２８参照）。
７． センス鎖は、アニールされたアンチセンス鎖を越えて伸長して、抱合体が結合するための追加の部位を与え得る。
８． 複合体の極性は、アンチセンス３’末端の両方がリンカーに隣接し、５’末端がリンカーの遠位にあるように、又はその組合せになるように、転換することができる。
デンドリマー及び超分子ｓｉＮＡ
デンドリマーｓｉＮＡ手法においては、ｓｉＮＡの合成は、デンドリマーテンプレートをまず合成することによって開始され、続いて種々の官能性ｓｉＮＡを結合させる。種々の構築体を図２３に示す。結合し得る官能性ｓｉＮＡの数は、使用するデンドリマーの寸法によってのみ限定される。
多官能ｓｉＮＡに対する超分子手法
超分子形式は、デンドリマー合成の難題を簡単にする。この形式では、ｓｉＮＡ鎖は、標準のＲＮＡ化学反応と、それに続く種々の相補鎖のアニーリングによって合成される。個々の鎖の合成は、５’末端における１個のｓｉＮＡのアンチセンスセンス配列、続いてヘキサエチレングリコール（ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｏｌ）などの核酸又は合成リンカー、続いて別のｓｉＮＡの５’から３’方向のセンス鎖を含む。したがって、ｓｉＮＡ鎖の合成は、標準の３’から５’方向に実施され得る。三官能及び四官能ｓｉＮＡの代表例を図２４に示す。種々の鎖が効率的にアニールされる限り、類似の原理に基づいて、より高い官能性のｓｉＮＡ構築体を設計することができる。
ダイサーを使用可能な多官能ｓｉＮＡ
複数の標的の生物情報学的解析によって、異なる標的配列間で共有される、約２から約１４ヌクレオチド長の一連の同一配列を特定することができる。ダイサーによるプロセシングによって、第２の機能的５’アンチセンス部位が出現するように、これらの同一領域を設計して、長鎖ｓｉＮＡヘリックス（例えば、＞３０塩基対）にすることができる（例えば、図２５参照）。例えば、ｓｉＮＡアンチセンス鎖（例えば、３’−ＴＴオーバーハングを有する二本鎖中の２１ヌクレオチド鎖）の最初の１７ヌクレオチドが標的ＲＮＡに相補的であるときには、２５ｎＭで頑強なサイレンシングが認められた。同じ形式の１６ヌクレオチドのみの相補性によって８０％のサイレンシングが認められた。
約３０から４０又はそれを超える塩基対のｓｉＮＡの設計にこの性質を組み入れることによって、更に別の多官能ｓｉＮＡ構築体が得られる。図２５の例は、３０塩基対二本鎖が、Ｄｉｃｅｒ−ＲＮａｓｅＩＩＩによるプロセシング後に、３個の異なる配列を標的にすることができる方法を示している。ウイルス因子、宿主因子メッセージ、所与の経路（例えば、炎症性カスケード）に沿った複数のポイントなど、これらの配列は、同じｍＲＮＡ上、又は別々のＲＮＡ上に存在し得る。また、４０塩基対の二本鎖は、二官能性設計を直列に組み合わせて、４個の標的配列を標的にする単一の二本鎖を与え得る。更に大規模な手法は、１個の多官能二本鎖で５又は６個の標的をサイレンシングし得る相同配列の使用を含み得る。図２５の例は、その達成方法を示している。３０塩基対二本鎖は、ダイサーによってどちらかの末端から２２と８塩基対の生成物に開裂する（８ｂ．ｐ．断片は示さず。）。見やすくするために、ダイサーによって作製されるオーバーハングを示していない（しかし、埋め合わせられ得る。）３個のターゲティング配列を示す。重なった必要な配列同一性を灰色の枠で示す。親の３０ｂ．ｐ． ｓｉＮＡの各Ｎは、安定化された化学反応で試験した場合にダイサー切断を可能にする２’−ＯＨ位置の示唆される部位である。Ｄｉｃｅｒ ＲＮａｓｅ ＩＩＩによる３０量体二本鎖のプロセシングは、正確な２２＋８開裂を与えず、一連の密接に関係した生成物を生成することに留意されたい（２２＋８は主要な部位である。）。したがって、ダイサーによるプロセシングによって、一連の活性なｓｉＮＡが生成する。別の非限定的例を図２６に示す。４０塩基対二本鎖は、ダイサーによって、一方の末端から２０塩基対生成物に開裂する。見やすくするために、ダイサーによって作製されるオーバーハングを示していない（しかし、埋め合わせられ得る。）４個のターゲティング配列を４色、すなわち、青色、淡青色、赤色及びオレンジ色で示す。重なった必要な配列同一性を灰色の枠で示す。この設計形式は、より大きなＲＮＡに拡張することができる。化学的に安定化されたｓｉＮＡがダイサーによって結合する場合には、戦略的に配置されたリボヌクレオチド結合によって、本発明者らの多官能性設計のより広範なレパートリーを可能にする切断産物の設計が可能になり得る。例えば、約２２ヌクレオチドのダイサー標準に限定されない切断産物は、例えば、約３から約１５ヌクレオチドの標的配列同一性の重なりを有する多官能ｓｉＮＡ構築体を可能にし得る。
診断用途
本発明のｓｉＮＡ分子は、種々の応用分野、例えば、臨床、工業、環境、農業及び／又は研究の場面における分子標的（例えば、ＲＮＡ）の特定などの種々の診断用途に使用することができる。ｓｉＮＡ分子のかかる診断上の使用は、再構成されたＲＮＡｉ系の利用、例えば、細胞溶解物、又はある程度精製された細胞溶解物の使用を含む。本発明のｓｉＮＡ分子を診断ツールとして用いて、疾患細胞内の遺伝的浮動及び変異を検査することができ、又は細胞における内因性若しくは外因性の、例えばウイルス性の、ＲＮＡの存在を検出することができる。ｓｉＮＡ活性と標的ＲＮＡの構造との密接な関係によって、分子の任意の領域において、標的ＲＮＡの塩基対形成及び３次元構造を変化させる変異を検出することができる。本発明に記載の複数のｓｉＮＡ分子を使用することによって、インビトロ並びに細胞及び組織におけるＲＮＡの構造及び機能に重要であるヌクレオチド変化をマッピングすることができる。ｓｉＮＡ分子による標的ＲＮＡの切断によって、遺伝子発現を阻害し、疾患又は感染の進行における特定の遺伝子産物の役割を規定することができる。このようにして、他の遺伝子標的を疾患の重要な媒介物質として規定することができる。これらの実験は、併用療法（例えば、異なる遺伝子を標的にする複数のｓｉＮＡ分子、公知の小分子阻害剤と組み合わせたｓｉＮＡ分子、又は組合せｓｉＮＡ分子及び／又は他の化学若しくは生体分子を用いた間欠的治療）が可能になることによって、疾患進行のより良好な治療につながる。本発明のｓｉＮＡ分子の他のインビトロでの使用は、当分野でよく知られており、疾患、感染、又は関係する症状に関連するｍＲＮＡの存在の検出を含む。かかるＲＮＡは、ｓｉＮＡで処理した後、標準の方法、例えば蛍光共鳴発光移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を用いて、切断産物の存在を判定することによって検出される。
特定の例において、標的ＲＮＡの野生型又は変異型のみを切断するｓｉＮＡ分子をアッセイに使用する。第１のｓｉＮＡ分子（すなわち、標的ＲＮＡの野生型のみを切断するｓｉＮＡ分子）を用いて、試料中に存在する野生型ＲＮＡを特定し、第２のｓｉＮＡ分子（すなわち、標的ＲＮＡの変異型のみを切断するｓｉＮＡ分子）を用いて、試料中の変異型ＲＮＡを特定する。反応対照として、野生型と変異型の両方のＲＮＡの合成基質を両方のｓｉＮＡ分子によって切断して、反応における相対ｓｉＮＡ効率、及び「非標的」ＲＮＡ種の切断が存在しないことを実証する。合成基質からの切断産物は、試料集団中の野生型及び変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーの作製にも役立つ。したがって、各分析は２種類のｓｉＮＡ分子、２種類の基質、及び１種類の未知試料を必要とし、これらを組み合わせて６つの反応物にする。各ＲＮＡの完全長及び切断断片をポリアクリルアミドゲルの１レーンで分析できるように、切断産物の存在をＲＮａｓｅ保護アッセイによって判定する。標的細胞における変異ＲＮＡの発現、及び所望の表現型の変化の推定されるリスクを洞察するために、結果を定量することが絶対に必要というわけではない。タンパク質産物が表現型（すなわち、疾患に関係する表現型、又は感染に関係する表現型）の発生に関係しているｍＲＮＡの発現は、リスクを築くのに十分である。比活性の類似したプローブを両方の転写物に使用する場合には、ＲＮＡレベルの定性的比較が適切であり、初期診断コストを削減する。ＲＮＡレベルを定性的に比較しても、定量的に比較しても、変異型と野生型のより高い比率は、より高いリスクと相関する。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、様々な用途において、例えば、臨床的な、産業、環境、農業な及び／又は研究場面での分子標的（例えば、ＲＮＡ）の同定など、様々な診断用途において使用することができる。ＲＮＡｉコンストラクトのこのような診断的使用には、再構成されたＲＮＡｉ系を使用すること、例えば、細胞の可溶化液又は部分的に精製された細胞可溶化液を使用することを含む。本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、罹病した細胞内の遺伝的浮動及び変異を調べるための又は細胞中の内在若しくは外在性の（例えばウイルスの）ＲＮＡの存在を検出するための診断用ツールとして使用することができる。ＲＮＡｉコンストラクト活性と標的ＲＮＡの構造の間の密接な関係によって、標的ＲＮＡの塩基対合及び三次元構造を変化させる分子のあらゆる領域中の変異を検出することが可能となる。本発明に記載されている複数のＲＮＡｉコンストラクトを使用することによって、インビトロ並びに細胞及び組織中でのＲＮＡの構造及び機能にとって重要であるヌクレオチド変化の地図を作成することが可能である。ＲＮＡｉコンストラクトを用いた標的ＲＮＡの切断は、遺伝子発現を阻害し、疾病又は感染の進行における特定の遺伝子産物の役割を確定するために使用することができる。このようにして、他の遺伝的標的は疾病の重要な媒介物質として定義することができる。これらの実験は、併用療法（例えば、異なる遺伝子に標的化される複数のＲＮＡｉコンストラクト、既知の小分子阻害剤と組み合わされたＲＮＡｉコンストラクト又は組み合わせＲＮＡｉコンストラクト及び／又は他の化学分子若しくは生物分子による断続的な治療）の可能性を与えることによって、疾病進行のより優れた治療に結びつく。本発明のＲＮＡｉコンストラクトの他のインビトロでの使用は本分野において周知であり、疾病、感染又は関連症状と関連するｍＲＮＡの存在の検出が含まれる。このようなＲＮＡは、標準的な方法、例えば、蛍光共鳴発光転移（ＦＲＥＴ）を用いて、ＲＮＡｉコンストラクトでの処理後に切断産物の存在を測定することによって検出される。
特定の実施例において、標的ＲＮＡの野生型形態又は変異体形態のみを切断するＲＮＡｉコンストラクトがアッセイのために使用される。試料中に存在する野生型ＲＮＡを同定するために、第一のＲＮＡｉコンストラクト（すなわち、標的ＲＮＡの野生型形態のみを切断するもの）が使用され、試料中の変異体ＲＮＡを同定するために、第二のＲＮＡｉコンストラクト（すなわち、標的ＲＮＡの変異体形態のみを切断するもの）が使用される。反応対照として、反応中での相対的なＲＮＡｉコンストラクト効率及び「標的化されない」ＲＮＡ種の切断が存在しないことを示すために、野生型及び変異体ＰＣＳＫ９ＲＮＡの両者の合成基質が両ＲＮＡｉコンストラクトによって切断される。合成基質から得られる切断産物は、試料集団中の野生型及び変異体ＲＮＡの分析用サイズマーカーを作製する役割も果たす。従って、各分析は、２つのＲＮＡｉコンストラクト（２つの基質と１つの未知の試料）を必要とし、６つの反応中に組み合わされる。各ＲＮＡの完全長及び切断断片がポリアクリルアミドゲルの１つのレーン中で分析できるように、切断産物の存在は、ＲＮアーゼ保護アッセイを用いて測定される。変異体ＲＮＡの発現及び標的細胞中の所望される表現型の変化の推定されるリスクについて洞察するために結果を定量することが絶対に必要というわけではない。そのタンパク質産物が表現型（すなわち、関連する疾病又は関連する感染）の発達に関与すると推定されているｍＲＮＡの発現がリスクを確定するのに十分である。同等の特異的活性のプローブが両転写物に対して使用されるのであれば、ＲＮＡレベルの定性的比較が十分であり、初期診断の費用を低減する。より高い変異体形態：野生型比は、ＲＮＡレベルが定性的に又は定量的に比較されるかどうかを問わず、より高いリスクと相関する。
本明細書で言及するすべての特許及び公報は、本発明が属する分野の当業者の技術レベルを示している。この開示において引用するすべての参考文献を、各参考文献を参照によりその全体を個々に組み込む場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
当業者は、本発明が、その目的を実行して、記載した結果及び効果、並びに本発明に固有の結果及び効果を得るのに、十分に適合していることを容易に理解するはずである。好ましい実施形態の現時点での代表として本明細書に記載する方法及び組成物は、例示的なものであって、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書に記載する方法及び組成物の変更及び他の用途が当業者に生起するはずであるが、それらは、本発明の精神に包含され、特許請求の範囲によって規定される。
本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示する本発明に種々の置換及び改変をなし得ることを、当業者は容易に理解できるはずである。すなわち、かかる追加の実施形態は、本発明及び以下の特許請求の範囲の範囲内である。本発明は、ＲＮＡｉ活性を媒介する、活性の改善された核酸構築体を作製するために、本明細書に記載する化学修飾の種々の組合せ及び／又は置換を試験することを当業者に教示する。かかる活性の改善は、安定性の改善、生物学的利用能の改善、及び／又はＲＮＡｉを媒介する細胞応答の活性化の改善を含み得る。したがって、本明細書に記載する特定の実施形態は限定的なものではなく、ＲＮＡｉ活性が改善されたｓｉＮＡ分子を特定するために、本明細書に記載する修飾の特定の組合せを過度の実験なしに試験し得ることを当業者は容易に理解することができる。
本明細書に説明的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示しない任意の要素、制約の非存在下で適切に実施し得る。すなわち、例えば、本明細書の各例において、「を含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という用語のいずれも、他の２つの用語のどちらかと置換し得る。使用した用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定的な用語ではない。かかる用語及び表現の使用においては、示した、また、記述した特徴又はその一部の任意の等価物を除外することを意図したものではなく、特許請求する本発明の範囲内で種々の改変が可能であることを認識されたい。かくして、本発明を好ましい実施形態、任意の特徴によって具体的に開示したが、本明細書で開示する概念の改変及び変形が当業者によってなされ得るものであり、かかる改変及び変形は、明細書本文及び添付の特許請求の範囲に規定された本発明の範囲内とみなされることを理解すべきである。
また、発明の特徴又は態様がマーカッシュ群又は他の代替物の群によって記載されている場合には、それによって、本発明が、マーカッシュ群又は他の群の任意の個々の構成要素又は構成要素の亜群の観点からも記載されていることを当業者は認識されたい。
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Claims (48)

  1. センス鎖とアンチセンス鎖を含む構造ＳＩＸを有する二本鎖核酸分子
    Figure 2010503382
     （上の鎖はセンス鎖であり、及び下の鎖は二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖であり；前記アンチセンス鎖は、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（ＰＣＳＫ９）ＲＮＡに対して相補的な配列を含み；各Ｎは、独立に、非修飾であり得る又は化学的に修飾され得るヌクレオチドであり；各Ｂは、存在する又は存在しないことができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は非修飾であり得る又は化学的に修飾され得る非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドを表し；［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置を表し；Ｘ１及びＸ２は、独立に、約０から約４の整数であり；Ｘ３は、約９から約３０の整数であり；Ｘ４は、約１１から約３０の整数であり、但し、Ｘ４とＸ５の合計は約１７から３６であり；Ｘ５は、約１から約６の整数であり；並びに
    （ａ）アンチセンス鎖中に存在する何れのピリミジンヌクレオチドも２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外のアンチセンス鎖中に存在する何れのプリンヌクレオチドも、独立に、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組み合わせであり；
    （ｂ）センス鎖中に存在する何れのピリミジンヌクレオチドも２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；センス鎖中に存在する何れのプリンヌクレオチドも、独立に、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組み合わせであり；
    （ｃ）何れの（Ｎ）ヌクレオチドも、場合によって、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドである。）。
  2. センス鎖とアンチセンス鎖を含む構造ＳＸを有する二本鎖核酸分子
    Figure 2010503382
     （上の鎖はセンス鎖であり、及び下の鎖は二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖であり；前記アンチセンス鎖は、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（ＰＣＳＫ９）ＲＮＡに対して相補的な配列を含み；各Ｎは、独立に、非修飾であり得る又は化学的に修飾され得るヌクレオチドであり；各Ｂは、存在する又は存在しないことができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は非修飾であり得る又は化学的に修飾され得る非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドを表し；［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置を表し；Ｘ１及びＸ２は、独立に、約０から約４の整数であり；Ｘ３は、約９から約３０の整数であり；Ｘ４は、約１１から約３０の整数であり、但し、Ｘ４とＸ５の合計は約１７から３６であり；Ｘ５は、約１から約６の整数であり；並びに
    （ａ）アンチセンス鎖中に存在する何れのピリミジンヌクレオチドも２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外のアンチセンス鎖中に存在する何れのプリンヌクレオチドも、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
    （ｂ）センス鎖中に存在する何れのピリミジンヌクレオチドもリボヌクレオチドであり；センス鎖中に存在する何れのプリンヌクレオチドもリボヌクレオチドであり；並びに
    （ｃ）何れの（Ｎ）ヌクレオチドも、場合によって、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドである。）。
  3. センス鎖とアンチセンス鎖を含む構造ＳＸＩを有する二本鎖核酸分子
    Figure 2010503382
     （上の鎖はセンス鎖であり、及び下の鎖は二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖であり；前記アンチセンス鎖は、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（ＰＣＳＫ９）ＲＮＡに対して相補的な配列を含み；各Ｎは、独立に、非修飾であり得る又は化学的に修飾され得るヌクレオチドであり；各Ｂは、存在する又は存在しないことができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は非修飾であり得る又は化学的に修飾され得る非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドを表し；［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置を表し；Ｘ１及びＸ２は、独立に、約０から約４の整数であり；Ｘ３は、約９から約３０の整数であり；Ｘ４は、約１１から約３０の整数であり、但し、Ｘ４とＸ５の合計は約１７から３６であり；Ｘ５は、約１から約６の整数であり；並びに
    （ａ）アンチセンス鎖中に存在する何れのピリミジンヌクレオチドも２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外のアンチセンス鎖中に存在する何れのプリンヌクレオチドも、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
    （ｂ）センス鎖中に存在する何れのピリミジンヌクレオチドも２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；センス鎖中に存在する何れのプリンヌクレオチドもリボヌクレオチドであり；並びに
    （ｃ）何れの（Ｎ）ヌクレオチドも、場合によって、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドである。）。
  4. センス鎖とアンチセンス鎖を含む構造ＳＸＩＩを有する二本鎖核酸分子
    Figure 2010503382
     （上の鎖はセンス鎖であり、及び下の鎖は二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖であり；前記アンチセンス鎖は、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（ＰＣＳＫ９）ＲＮＡに対して相補的な配列を含み；各Ｎは、独立に、非修飾であり得る又は化学的に修飾され得るヌクレオチドであり；各Ｂは、存在する又は存在しないことができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は非修飾であり得る又は化学的に修飾され得る非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドを表し；［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置を表し；Ｘ１及びＸ２は、独立に、約０から約４の整数であり；Ｘ３は、約９から約３０の整数であり；Ｘ４は、約１１から約３０の整数であり、但し、Ｘ４とＸ５の合計は約１７から３６であり；Ｘ５は、約１から約６の整数であり；並びに
    （ａ）アンチセンス鎖中に存在する何れのピリミジンヌクレオチドも２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外のアンチセンス鎖中に存在する何れのプリンヌクレオチドも、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
    （ｂ）センス鎖中に存在する何れのピリミジンヌクレオチドも２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；センス鎖中に存在する何れのプリンヌクレオチドもデオキシリボヌクレオチドであり；並びに
    （ｃ）何れの（Ｎ）ヌクレオチドも、場合によって、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドである。）。
  5. センス鎖とアンチセンス鎖を含む構造ＳＸＩＩＩを有する二本鎖核酸分子
    Figure 2010503382
     （上の鎖はセンス鎖であり、及び下の鎖は二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖であり；前記アンチセンス鎖は、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケクシン９（ＰＣＳＫ９）ＲＮＡに対して相補的な配列を含み；各Ｎは、独立に、非修飾であり得る又は化学的に修飾され得るヌクレオチドであり；各Ｂは、存在する又は存在しないことができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は非修飾であり得る又は化学的に修飾され得る非塩基対形成又はオーバーハングヌクレオチドを表し；［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチドを表し；Ｘ１及びＸ２は、独立に、約０から約４の整数であり；Ｘ３は、約９から約３０の整数であり；Ｘ４は、約１１から約３０の整数であり、但し、Ｘ４とＸ５の合計は約１７から３６であり；Ｘ５は、約１から約６の整数であり；並びに
    （ａ）アンチセンス鎖中に存在する何れのピリミジンヌクレオチドもリボ様、ノーザン又はＡ型ヘリックス立体構造を有するヌクレオチドであり；［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外のアンチセンス鎖中に存在する何れのプリンヌクレオチドも、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
    （ｂ）センス鎖中に存在する何れのピリミジンヌクレオチドもリボ様、ノーザン又はＡ型ヘリックス立体構造を有するヌクレオチドであり；センス鎖中に存在する何れのプリンヌクレオチドも２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；並びに
    （ｃ）何れの（Ｎ）ヌクレオチドも、場合によって、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドである。）。
  6. Ｘ５＝１、２又は３であり；各Ｘ１及びＸ２＝１又は２であり；Ｘ３＝１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０であり及びＸ４＝１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０である、請求項１の二本鎖核酸分子。
  7. Ｘ５＝１、２又は３であり；各Ｘ１及びＸ２＝１又は２であり；Ｘ３＝１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０であり及びＸ４＝１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０である、請求項２の二本鎖核酸分子。
  8. Ｘ５＝１、２又は３であり；各Ｘ１及びＸ２＝１又は２であり；Ｘ３＝１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０であり及びＸ４＝１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０である、請求項３の二本鎖核酸分子。
  9. Ｘ５＝１、２又は３であり；各Ｘ１及びＸ２＝１又は２であり；Ｘ３＝１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０であり及びＸ４＝１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０である、請求項４の二本鎖核酸分子。
  10. Ｘ５＝１、２又は３であり；各Ｘ１及びＸ２＝１又は２であり；Ｘ３＝１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０であり及びＸ４＝１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０である、請求項５の二本鎖核酸分子。
  11. Ｂがセンス鎖の３’末端及び５’末端に並びにアンチセンス鎖の３’末端に存在する、請求項１の二本鎖核酸分子。
  12. Ｂがセンス鎖の３’末端及び５’末端に並びにアンチセンス鎖の３’末端に存在する、請求項２の二本鎖核酸分子。
  13. Ｂがセンス鎖の３’末端及び５’末端に並びにアンチセンス鎖の３’末端に存在する、請求項３の二本鎖核酸分子。
  14. Ｂがセンス鎖の３’末端及び５’末端に並びにアンチセンス鎖の３’末端に存在する、請求項４の二本鎖核酸分子。
  15. Ｂがセンス鎖の３’末端及び５’末端に並びにアンチセンス鎖の３’末端に存在する、請求項５の二本鎖核酸分子。
  16. ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖又はセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の３’末端上の最初の末端（Ｎ）に１つ又はそれ以上のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含む、請求項１の二本鎖核酸分子。
  17. ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖又はセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の３’末端上の最初の末端（Ｎ）に１つ又はそれ以上のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含む、請求項２の二本鎖核酸分子。
  18. ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖又はセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の３’末端上の最初の末端（Ｎ）に１つ又はそれ以上のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含む、請求項３の二本鎖核酸分子。
  19. ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖又はセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の３’末端上の最初の末端（Ｎ）に１つ又はそれ以上のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含む、請求項４の二本鎖核酸分子。
  20. ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖又はセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の３’末端上の最初の末端（Ｎ）に１つ又はそれ以上のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含む、請求項５の二本鎖核酸分子。
  21. 医薬として許容される担体又は希釈剤中に請求項１の二本鎖核酸分子を含む組成物。
  22. 医薬として許容される担体又は希釈剤中に請求項２の二本鎖核酸分子を含む組成物。
  23. 医薬として許容される担体又は希釈剤中に請求項３の二本鎖核酸分子を含む組成物。
  24. 医薬として許容される担体又は希釈剤中に請求項４の二本鎖核酸分子を含む組成物。
  25. 医薬として許容される担体又は希釈剤中に請求項５の二本鎖核酸分子を含む組成物。
  26. 医薬として許容される担体又は希釈剤中に２つ又はそれ以上の請求項１の二本鎖核酸分子を含む組成物。
  27. 医薬として許容される担体又は希釈剤中に２つ又はそれ以上の請求項２の二本鎖核酸分子を含む組成物。
  28. 医薬として許容される担体又は希釈剤中に２つ又はそれ以上の請求項３の二本鎖核酸分子を含む組成物。
  29. 医薬として許容される担体又は希釈剤中に２つ又はそれ以上の請求項４の二本鎖核酸分子を含む組成物。
  30. 医薬として許容される担体又は希釈剤中に２つ又はそれ以上の請求項５に記載５の二本鎖核酸分子を含む組成物。
  31. 請求項１の組成物であり、前記組成物の１つ又はそれ以上の二本鎖核酸分子が第一のＰＣＳＫ９標的に対して相補的である１５から３０個のヌクレオチドを有する配列を含み、及び前記組成物の１つ又はそれ以上の１つ又はそれ以上の二本鎖核酸分子が第二のＰＣＳＫ９標的に対して相補的である１５から３０個のヌクレオチドを有する配列を含む、組成物。
  32. 請求項２の組成物であり、前記組成物の１つ又はそれ以上の二本鎖核酸分子が第一のＰＣＳＫ９標的に対して相補的である１５から３０個のヌクレオチドを有する配列を含み、及び前記組成物の１つ又はそれ以上の１つ又はそれ以上の二本鎖核酸分子が第二のＰＣＳＫ９標的に対して相補的である１５から３０個のヌクレオチドを有する配列を含む、組成物。
  33. 請求項３の組成物であり、前記組成物の１つ又はそれ以上の二本鎖核酸分子が第一のＰＣＳＫ９標的に対して相補的である１５から３０個のヌクレオチドを有する配列を含み、及び前記組成物の１つ又はそれ以上の１つ又はそれ以上の二本鎖核酸分子が第二のＰＣＳＫ９標的に対して相補的である１５から３０個のヌクレオチドを有する配列を含む、組成物。
  34. 請求項４の組成物であり、前記組成物の１つ又はそれ以上の二本鎖核酸分子が第一のＰＣＳＫ９標的に対して相補的である１５から３０個のヌクレオチドを有する配列を含み、及び前記組成物の１つ又はそれ以上の又はそれ以上の二本鎖核酸分子が第二のＰＣＳＫ９標的に対して相補的である１５から３０個のヌクレオチドを有する配列を含む、組成物。
  35. 請求項５の組成物であり、前記組成物の１つ又はそれ以上の二本鎖核酸分子が第一のＰＣＳＫ９標的に対して相補的である１５から３０個のヌクレオチドを有する配列を含み、及び前記組成物の１つ又はそれ以上の１つ又はそれ以上の二本鎖核酸分子が第二のＰＣＳＫ９標的に対して相補的である１５から３０個のヌクレオチドを有する配列を含む、組成物。
  36. 式Ｉの多官能二本鎖核酸分子：
    Figure 2010503382
     （各５’−ｐ−ＸＺＸ’−３’及び５’−ｐ−ＹＺＹ’−３’は、独立に、約２４と約３８ヌクレオチドの間の長さのオリゴヌクレオチドを含み、ＸＺは、第一のＰＣＳＫ９標的核酸配列に対して相補的である核酸配列を含み、ＹＺは第二のＰＣＳＫ９標的核酸配列に対して相補的である核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、Ｚは、領域ＸとＹの間で相補的である、約１から約２４ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含み、Ｘは、領域Ｙ’中に存在するヌクレオチド配列に対して相補的である約１から約２１ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含み、Ｙは、領域Ｘ’中に存在するヌクレオチド配列に対して相補的である、約１から約２１ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含み、ｐは、独立に、存在又は不存在であり得る末端のリン酸基を含み、並びに各前記ＸＺ及び前記ＹＺは、独立に、それぞれ前記第一及び前記第二の標的核酸配列又はこれらの一部と安定に相互作用するのに十分な長さである。）。
  37. 式ＩＩの多官能二本鎖核酸分子：
    Figure 2010503382
     （各５’−ｐ−ＸＸ’−３’及び５’−ｐ−ＹＹ’−３’は、独立に、約２４と約３８ヌクレオチドの間の長さのオリゴヌクレオチドを含み、Ｘは第一のＰＣＳＫ９標的核酸配列に対して相補的である核酸配列を含み、Ｙは第二のＰＣＳＫ９標的核酸配列に対して相補的である核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、前記Ｘは領域Ｙ’中に存在するヌクレオチド配列に対して相補的である、約１から約２１ヌクレオチド長のヌクレオチド配列をさらに含み、前記Ｙは、領域Ｘ’中に存在するヌクレオチド配列に対して相補的である約１から約２１ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含み、ｐは、独立に、存在又は不存在であり得る末端のリン酸基を含み、並びに各前記Ｘ及び前記Ｙは、独立に、それぞれ前記第一及び前記第二の標的核酸配列又はこれらの一部と安定に相互作用するのに十分な長さである。）。
  38. 式Ｉの多官能二本鎖核酸分子：
    Figure 2010503382
     （各５’−ｐ−ＸＺＸ’−３’及び５’−ｐ−ＹＺＹ’−３’は、独立に、約２４と約３８ヌクレオチドの間の長さのオリゴヌクレオチドを含み、ＸＺは、第一のＰＣＳＫ９標的核酸配列に対して相補的である核酸配列を含み、ＹＺはＰＣＳＫ９経路標的核酸配列の第二の核酸配列に対して相補的である核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、Ｚは、領域ＸＺとＹＺの間で相補的である、約１から約２４ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含み、Ｘは、領域Ｙ’中に存在するヌクレオチド配列に対して相補的である約１から約２１ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含み、Ｙは、領域Ｘ’中に存在するヌクレオチド配列に対して相補的である、約１から約２１ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含み、ｐは、独立に、存在又は不存在であり得る末端のリン酸基を含み、並びに各前記ＸＺ及び前記ＹＺは、独立に、それぞれ前記第一及び前記第二の標的核酸配列又はこれらの一部と安定に相互作用するのに十分な長さである。）。
  39. 式ＩＩの多官能二本鎖核酸分子：
    Figure 2010503382
     （各５’−ｐ−ＸＸ’−３’及び５’−ｐ−ＹＹ’−３’は、独立に、約２４と約３８ヌクレオチドの間の長さのオリゴヌクレオチドを含み、Ｘは第一のＰＣＳＫ９標的核酸配列に対して相補的である核酸配列を含み、ＹはＰＣＳＫ９経路標的核酸配列の第二の核酸配列に対して相補的である核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、前記Ｘは領域Ｙ’中に存在するヌクレオチド配列に対して相補的である、約１から約２１ヌクレオチド長のヌクレオチド配列をさらに含み、前記Ｙは、領域Ｘ’中に存在するヌクレオチド配列に対して相補的である約１から約２１ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含み、ｐは、独立に、存在又は不存在であり得る末端のリン酸基を含み、並びに各前記Ｘ及び前記Ｙは、独立に、それぞれ前記第一及び前記第二の標的核酸配列又はこれらの一部と安定に相互作用するのに十分な長さである。）。
  40. 医薬として許容される担体又は希釈剤中に請求項３６の多官能二本鎖核酸分子を含む組成物。
  41. 医薬として許容される担体又は希釈剤中に請求項３７の多官能二本鎖核酸分子を含む組成物。
  42. 医薬として許容される担体又は希釈剤中に請求項３８の多官能二本鎖核酸分子を含む組成物。
  43. 医薬として許容される担体又は希釈剤中に請求項３９の多官能二本鎖核酸分子を含む組成物。
  44. ＬＮＰ−０５１、０５２、０５３、０５４、０６０、０６１、０６９、０７３、０７７、０８０、０８２、０８３、０８６、０９７、０９８、０９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６又は１１７の何れかとして調合された請求項１の二本鎖核酸分子を含む組成物。
  45. 脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として調合された請求項２の二本鎖核酸分子を含む組成物。
  46. 脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として調合された請求項３の二本鎖核酸分子を含む組成物。
  47. 脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として調合された請求項４の二本鎖核酸分子を含む組成物。
  48. 脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として調合された請求項５の二本鎖核酸分子を含む組成物。
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