JP2009520039A - 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いた、ＲＮＡ干渉によって媒介される、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子発現の阻害 - Google Patents

Abstract

本発明は、遺伝子発現及び／又は活性の調節に応答した形質、疾患及び症状の研究、診断及び治療のための化合物、組成物及び方法に関する。本発明は、かかる形質、疾患及び症状の持続又は発生を媒介する遺伝子発現経路又は他の細胞プロセスに関与する遺伝子の発現及び／又は活性の調節に応答する形質、疾患及び症状に関係した化合物、組成物及び方法も対象とする。具体的には、本発明は、小核酸分子のカクテル、及び小核酸分子の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調合物を含めて、遺伝子発現に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子などの小核酸分子を含めた、二本鎖核酸分子に関する。本発明は、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡなどの小核酸分子にも関し、内因性ＲＮＡ又は内因性ＲＮＡと結合したタンパク質（例えば、ＲＩＳＣ）の調節機能を妨害することによって遺伝子発現を調節するために、内因性ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の機能を阻害し得る小核酸分子（例えば、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、内因性低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の機能を阻害し得る小核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ阻害剤）などの内因性ＲＮＡ分子の機能を阻害し得る小核酸分子、ＲＩＳＣの機能を阻害し得る小核酸分子（例えば、ＲＩＳＣ阻害剤）にも関し、かかる小核酸分子のカクテル及びかかる小核酸分子の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調合物にも関する。かかる小核酸分子は、例えば、対象又は生物体における遺伝子発現又は活性に関連した疾患、形質及び症状を予防、阻害又は抑制する組成物を提供するのに有用である。

Description

本願は、（２００２年３月２６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０２／０９１８７の一部継続出願であって、２００２年８月５日に出願された米国特許出願第６０／４０１，１０４号の利益を主張する）２００３年２月２０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０４３号の一部継続出願である、２００３年９月１６日に出願された米国特許出願第１０／６６７，２７１号の一部継続出願である、２００４年９月１５日に出願された米国特許出願第１０／９４２，５６０号の一部継続出願である、２００５年１２月１９日に出願された米国特許出願第１１／３１１，８２６号の一部継続出願である、２００６年８月２５日に出願された米国特許出願第１１／５１０，８７２号の一部継続出願である。本願は、２００２年２月２０日に出願された米国仮出願第６０／３５８，５８０号、２００２年３月１１日に出願された米国仮出願第６０／３６３，１２４号、２００２年６月６日に出願された米国仮出願第６０／３８６，７８２号、２００２年８月２９日に出願された米国仮出願第６０／４０６，７８４号、２００２年９月５日に出願された米国仮出願第６０／４０８，３７８号、２００２年９月９日に出願された米国仮出願第６０／４０９，２９３号、及び２００３年１月１５日に出願された米国仮出願第６０／４４０，１２９号の利益をどちらも主張する、２００３年２月２０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５３４６号の一部継続出願及び２００３年２月２０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８号の一部継続出願である、２００３年５月２３日に出願された米国特許出願第１０／４４４，８５３号の一部継続出願である、２００３年１０月２３日に出願された米国特許出願第１０／６９３，０５９号の一部継続出願である、２００３年１１月２４日に出願された米国特許出願第１０／７２０，４４８号の一部継続出願である、２００４年１月１４日に出願された米国特許出願第１０／７５７，８０３号の一部継続出願である、２００４年４月１６日に出願された米国特許出願第１０／８２６，９６６号（現在、放棄されている。）の一部継続出願である、２００４年５月２４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１６３９０号の一部継続出願である、２００４年８月２０日に出願された米国特許出願第１０／９２３，５３６号の一部継続出願である、２００５年４月４日に出願された米国特許出願第１１／０９８，３０３号の一部継続出願である、２００５年８月１７日に出願された米国特許出願第１１／２０５，６４６号の一部継続出願である、２００５年９月２３日に出願された米国特許出願第１１／２３４，７３０号の一部継続出願である、２００５年１２月８日に出願された米国特許出願第１１／２９９，２５４号の一部継続出願である、２００６年８月１７日に出願された米国特許出願第ＴＢＤの一部継続出願でもある。本願は、２００４年２月１０日に出願された米国仮出願第６０／５４３，４８０号の利益を主張する、２００５年２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０５／０４２７０号の一部継続出願でもある。本願は、２００５年２月１４日に出願された米国仮出願第６０／６５２，７８７号、２００５年５月６日に出願された米国仮出願第６０／６７８，５３１号、２００５年７月２９日に出願された米国仮出願第６０／７０３，９４６号及び２００５年１１月１５日に出願された米国仮出願第６０／７３７，０２４号の利益を主張する、２００６年２月１４日に出願された米国特許出願第１１／３５３，６３０号の一部継続出願でもある。本願は、図面を含めて、参照によりその全体を本明細書に組み込む、上記全出願の利益を主張するものである。

本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子の発現及び／又は活性の調節に応答する形質、疾患及び症状の研究、診断及び治療のための化合物、組成物及び方法に関する。本発明は、かかる形質、疾患及び症状の持続又は発生を媒介するＨＣＶ遺伝子発現経路又は他の細胞プロセスに関与する遺伝子の発現及び／又は活性の調節に応答する形質、疾患及び症状に関係した化合物、組成物及び方法も対象とする。具体的には、本発明は、小核酸分子のカクテル、及び小核酸分子の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調合物を含めて、ＨＣＶ遺伝子発現に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る、又は媒介する、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子などの小核酸分子を含めた、二本鎖核酸分子に関する。本発明は、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡなどの小核酸分子にも関し、内因性ＲＮＡ又は内因性ＲＮＡと結合したタンパク質（例えば、ＲＩＳＣ）の調節機能を妨害することによって遺伝子発現を調節するために、内因性ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の機能を阻害し得る小核酸分子（例えば、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、内因性低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の機能を阻害し得る小核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ阻害剤）などの内因性ＲＮＡ分子の機能を阻害し得る小核酸分子、ＲＩＳＣの機能を阻害し得る小核酸分子（例えば、ＲＩＳＣ阻害剤）にも関し、かかる小核酸分子のカクテル及びかかる小核酸分子の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調合物にも関する。かかる小核酸分子は、例えば、ＨＣＶ感染症、肝不全、肝細胞癌、肝硬変、及び／又は対象又は生物体におけるＨＣＶ感染に関連した他の病態を防止、阻害又は抑制する組成物を提供するのに有用である。

以下は、ＲＮＡｉに関係する関連技術の考察である。この考察は、以下の本発明の理解のためにのみ提供される。要旨（ｓｕｍｍａｒｙ）は、下記研究が本発明の従来技術であることを認めるものではない。

ＲＮＡ干渉とは、動物において低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す（Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｃｅｌｌ， １０１， ２５−３３；Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１， ８０６；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８６， ９５０−９５１；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ， ４０２， １２８−１２９；Ｓｈａｒｐ， １９９９， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．， １３：１３９−１４１及びＳｔｒａｕｓｓ， １９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８６， ８８６）。植物における対応するプロセス（Ｈｅｉｆｅｔｚ他、国際公開第９９／６１６３１号）は、転写後遺伝子サイレンシング又はＲＮＡサイレンシングと一般に称し、真菌ではクエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）とも称する。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を防止するのに使用される、進化的に保存された細胞防御機構であると考えられ、多様な叢及び門によって一般に共有されている（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．， １５， ３５８）。外来遺伝子発現からのかかる防御は、相同な一本鎖ＲＮＡ又はウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介して、ウイルス感染に由来する、又は宿主ゲノム中へのトランスポゾンエレメントの無作為な組み込みに由来する、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に応じて進化してきたと考えられる。細胞中にｄｓＲＮＡが存在すると、特徴がまだ十分に明らかになっていない機序によってＲＮＡｉ応答が誘発される。この機序は、リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断をもたらす、ｄｓＲＮＡによって媒介されるプロテインキナーゼＰＫＲ及び２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素の活性化に起因するインターフェロン応答など、二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼを含む他の公知の機序とは異なると考えられる（例えば、米国特許第６，１０７，０９４号、同５，８９８，０３１号；Ｃｌｅｍｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ＆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．， １７， ５０３−５２４；Ａｄａｈ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ８， １１８９を参照されたい。）。

細胞中に長鎖ｄｓＲＮＡが存在すると、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される（Ｂａｓｓ， ２０００， Ｃｅｌｌ， １０１， ２３５；Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｃｅｌｌ， １０１， ２５−３３；Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ， ４０４， ２９３）。ダイサーは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡ小片へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与する（Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｃｅｌｌ， １０１， ２５−３３；Ｂａｓｓ， ２０００， Ｃｅｌｌ， １０１， ２３５；Ｂｅｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｎａｔｕｒｅ， ４０９， ３６３）。ダイサー活性に由来する低分子干渉ＲＮＡは、典型的には約２１から約２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対の二本鎖を含む（Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｃｅｌｌ， １０１， ２５−３３；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １５， １８８）。ダイサーは、構造の保存された前駆体ＲＮＡからの、翻訳調節に関係する２１及び２２ヌクレオチドのｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切り出しにも関係する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９３， ８３４）。ＲＮＡｉ応答は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般に称する、エンドヌクレアーゼ複合体も特徴とする。ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的である領域の中央で起こる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １５， １８８）。

ＲＮＡｉは種々の系で研究されている。Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１， ８０６は、線虫においてＲＮＡｉを観察した最初であった。Ｂａｈｒａｍｉａｎ ａｎｄ Ｚａｒｂｌ， １９９９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９， ２７４−２８３及びＷｉａｎｎｙ ａｎｄ Ｇｏｅｔｚ， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ２， ７０は、ほ乳動物系においてｄｓＲＮＡによって媒介されるＲＮＡｉを記述している。Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ， ４０４， ２９３は、ｄｓＲＮＡが移入されたショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡｉを記述している。Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｎａｔｕｒｅ， ４１１， ４９４及びＴｕｓｃｈｌ他、国際公開第０１／７５１６４号は、ヒト胚性腎臓細胞及びＨｅＬａ細胞を含めた培養ほ乳動物細胞において、合成２１ヌクレオチドＲＮＡ二本鎖の導入によって誘導されるＲＮＡｉを記述している。ショウジョウバエ胚溶解物における最近の研究（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１， ＥＭＢＯ Ｊ．， ２０， ６８７７及びＴｕｓｃｈｌ他、国際公開第０１／７５１６４号）によって、効率的ＲＮＡｉ活性を媒介するのに必要である、ｓｉＲＮＡの長さ、構造、化学組成及び配列に対する一定の要件が明らかになった。これらの研究によれば、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二本鎖は、３’末端ジヌクレオチドオーバーハングを含むときに最も活性である。また、一方又は両方のｓｉＲＮＡ鎖を２’−デオキシ（２’−Ｈ）又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで完全に置換すると、ＲＮＡｉ活性が消失するのに対して、２’−デオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）による３’末端ｓｉＲＮＡオーバーハングヌクレオチドの置換は許容されることが判明した。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中央における単一のミスマッチ配列も、ＲＮＡｉ活性を消失させることが判明した。また、これらの研究は、標的ＲＮＡ中の切断部位の位置が、ｓｉＲＮＡガイド配列の３’末端ではなくガイド配列の５’末端によって規定されることも示している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１， ＥＭＢＯ Ｊ．， ２０， ６８７７）。他の研究によれば、ｓｉＲＮＡ二本鎖の標的相補鎖上の５’リン酸がｓｉＲＮＡ活性に必要であり、ＡＴＰを利用してｓｉＲＮＡ上の５’リン酸部分が維持される（Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｃｅｌｌ， １０７， ３０９）。

幾つかの研究によれば、２ヌクレオチド３’オーバーハングを有する２１量体ｓｉＲＮＡ二本鎖の３’末端ヌクレオチドオーバーハングセグメントをデオキシリボヌクレオチドで置換しても、ＲＮＡｉ活性に有害作用を及ぼさない。ｓｉＲＮＡ各末端のヌクレオチドを４個までデオキシリボヌクレオチドで置換することは十分許容されると報告されているが、デオキシリボヌクレオチドで完全に置換するとＲＮＡｉ活性が失われる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１， ＥＭＢＯ Ｊ．， ２０， ６８７７及びＴｕｓｃｈｌ他、国際公開第０１／７５１６４号）。また、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（前掲）は、ｓｉＲＮＡを２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換するとＲＮＡｉ活性が完全に消失することも報告している。Ｌｉ他、国際公開第００／４４９１４号及びＢｅａｃｈ他、国際公開第０１／６８８３６号は、ｓｉＲＮＡが、窒素又は硫黄ヘテロ原子の少なくとも１個を含むようにするリン酸−糖骨格又はヌクレオシドの修飾を含み得ることを示唆している。しかし、どちらの出願も、かかる修飾がｓｉＲＮＡ分子においてどの程度許容されるかを仮定しておらず、かかる修飾ｓｉＲＮＡの更なるガイダンスや例も提供していない。Ｋｒｅｕｔｚｅｒ他、カナダ特許出願第２，３５９，１８０号も、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼＰＫＲの活性化に対抗するために、ｄｓＲＮＡ構築体において使用されるある種の化学修飾、具体的には２’−アミノ又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、及び２’−Ｏ又は４’−Ｃメチレン架橋を含むヌクレオチドを記載している。しかし、Ｋｒｅｕｔｚｅｒ他も、同様に、これらの修飾がｄｓＲＮＡ分子においてどの程度許容されるかに関する例又はガイダンスを提供していない。

Ｐａｒｒｉｓｈ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ， ６， １０７７−１０８７は、線虫において、長鎖（＞２５ｎｔ）ｓｉＲＮＡ転写物を用いて、ｕｎｃ−２２遺伝子を標的としたある種の化学修飾を試験した。Ｐａｒｒｉｓｈ等は、Ｔ７及びＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを用いてチオリン酸ヌクレオチド類似体を組み入れることによって、これらのｓｉＲＮＡ転写物にチオリン酸残基を導入することを記述しており、２個のホスホロチオアート修飾塩基を有するＲＮＡのＲＮＡｉとしての有効性がかなり低下したことを認めた。また、Ｐａｒｒｉｓｈ等によれば、２個を超える残基のホスホロチオアート修飾によって、ＲＮＡがインビトロで著しく不安定化し、干渉活性を評価することができなかった（同書、１０８１）。Ｐａｒｒｉｓｈ等は、長鎖ｓｉＲＮＡ転写物においてヌクレオチドの糖の２’位におけるある種の修飾も試験し、リボヌクレオチドをデオキシヌクレオチドで置換すると、特にウリジンからチミジンへの置換、及び／又はシチジンからデオキシシチジンへの置換の場合には、干渉活性がかなり低下することを見いだした（同書）。また、Ｐａｒｒｉｓｈ等は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖における、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル及び３−（アミノアリル）ウラシルによるウラシルの置換、及びイノシンによるグアノシンの置換を含めて、ある種の塩基修飾を試験した。４−チオウラシル及び５−ブロモウラシル置換は許容されると考えられたが、Ｐａｒｒｉｓｈは、イノシンを一方の鎖に組み入れると干渉活性がかなり低下することを報告した。Ｐａｒｒｉｓｈは、５−ヨードウラシル及び３−（アミノアリル）ウラシルをアンチセンス鎖に組み入れても、ＲＮＡｉ活性がかなり低下することも報告した。

より長鎖のｄｓＲＮＡの使用が記述された。例えば、Ｂｅａｃｈ他、国際公開第０１／６８８３６号は、内因的に誘導されたｄｓＲＮＡを用いて遺伝子発現を減ずる特別な方法を記述している。Ｔｕｓｃｈｌ他、国際公開第０１／７５１６４号は、ショウジョウバエインビトロＲＮＡｉ系、並びにある機能的ゲノム用途及びある治療用途への特定のｓｉＲＮＡ分子の使用を記述している。ただし、Ｔｕｓｃｈｌ， ２００１， Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２， ２３９−２４５は、インターフェロン応答を活性化するおそれがあるために、ＲＮＡｉを使用して、遺伝病又はウイルス感染を治療し得ることに疑念を抱いている。Ｌｉ他、国際公開第００／４４９１４号は、ある標的遺伝子の発現を減じるための特定の長鎖の（１４１ｂｐ−４８８ｂｐ）、酵素的に合成された、又はベクターによって発現されたｄｓＲＮＡの使用を記載している。Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ他、国際公開第０１／３６６４６号は、ある種の長鎖の（５５０ｂｐ−７１４ｂｐ）、酵素的に合成された、又はベクターによって発現されたｄｓＲＮＡ分子を用いて、ほ乳動物細胞における特定の遺伝子の発現を阻害するある種の方法を記載している。Ｆｉｒｅ他、国際公開第９９／３２６１９号は、線形動物における遺伝子発現の阻害に用いられる細胞にある種の長鎖ｄｓＲＮＡ分子を導入する特別な方法を記載している。Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ他、国際公開第００／０１８４６号は、特定の長鎖ｄｓＲＮＡ分子を用いて、細胞において特別な表現型を与える原因になる特殊な遺伝子を特定するある種の方法を記載している。Ｍｅｌｌｏ他、国際公開第０１／２９０５８号は、ｄｓＲＮＡによって媒介されるＲＮＡｉに関与する特殊な遺伝子の特定について記載している。Ｐａｃｈｕｃｋ他、国際公開第００／６３３６４号は、ある種の長鎖（少なくとも２００ヌクレオチド）ｄｓＲＮＡ構築体を記載している。Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ他、国際公開第９９／０７４０９号は、ある種の抗ウイルス剤と組み合わせた特別なｄｓＲＮＡ分子からなる特定の組成物を記載している。Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ他、国際公開第９９／５３０５０号及び１９９８， ＰＮＡＳ， ９５， １３９５９−１３９６４は、ある種のｄｓＲＮＡを用いて、植物細胞における核酸の形質発現を減少させる、ある種の方法を記載している。Ｄｒｉｓｃｏｌｌ他、国際公開第０１／４９８４４号は、標的生物体における遺伝子サイレンシングの促進に用いられる特定のＤＮＡ発現構築体を記載している。

他の研究者も、種々のＲＮＡｉ系及び遺伝子サイレンシング系について報告している。例えば、Ｐａｒｒｉｓｈ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ， ６， １０７７−１０８７は、線虫のｕｎｃ−２２遺伝子を標的とした、特定の化学修飾ｄｓＲＮＡ構築体を記載している。Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ、国際公開第０１／３８５５１号は、ある種のｄｓＲＮＡを用いて、植物におけるポリコーム遺伝子発現を調節するある種の方法を記載している。Ｃｈｕｒｉｋｏｖ他、国際公開第０１／４２４４３号は、ある種のｄｓＲＮＡを用いて、生物体の遺伝的特性を改変するある種の方法を記載している。Ｃｏｇｏｎｉ他、国際公開第０１／５３４７５号は、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）サイレンシング遺伝子を単離するある種の方法、及びその使用を記載している。Ｒｅｅｄ他、国際公開第０１／６８８３６号は、植物におけるある種の遺伝子サイレンシング方法を記載している。Ｈｏｎｅｒ他、国際公開第０１／７０９４４号は、トランスジェニック線形動物をパーキンソン病モデルとして用い、ある種のｄｓＲＮＡを用いた、ある種の薬物スクリーニング方法を記載している。Ｄｅａｋ他、国際公開第０１／７２７７４号は、ショウジョウバエにおいてＲＮＡｉに関係し得る、ショウジョウバエ由来のある種の遺伝子産物を記載している。Ａｒｎｄｔ他、国際公開第０１／９２５１３号は、ＲＮＡｉを増強する因子を用いることによって遺伝子抑制を媒介するある種の方法を記載している。Ｔｕｓｃｈｌ他、国際公開第０２／４４３２１号は、ある種の合成ｓｉＲＮＡ構築体を記載している。Ｐａｃｈｕｋ他、国際公開第００／６３３６４号及びＳａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ他、国際公開第０１／０４３１３号は、ベクターによって発現されたある種の（２５０ｂｐを超える）長鎖ｄｓＲＮＡｓを用いて、ある種のポリヌクレオチド配列の機能を阻害するある種の方法及び組成物を記載している。Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉ他、国際公開第０２／３８８０５号は、ＲＮＡｉによって特定されたある種の線虫遺伝子を記載している。Ｋｒｅｕｔｚｅｒ他、国際公開第０２／０５５６９２号、同０２／０５５６９３号及び欧州特許第１１４４６２３号Ｂ１は、ｄｓＲＮＡを用いて遺伝子発現を阻害するある種の方法を記載している。Ｇｒａｈａｍ他、国際公開第９９／４９０２９号及び同０１／７０９４９号並びにオーストラリア特許第４０３７５０１号は、ベクターによって発現されたある種のｓｉＲＮＡ分子を記載している。Ｆｉｒｅ他、米国特許第６，５０６，５５９号は、ＲＮＡｉを媒介するある種の長鎖ｄｓＲＮＡ（２９９ｂｐ−１０３３ｂｐ）構築体を用いて、遺伝子発現をインビトロで阻害するある種の方法を記載している。Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｃｅｌｌ， １１０， ５６３−５７４は、Ｈｅｌａ細胞においてＲＮＡ干渉を媒介するある種の５’リン酸化一本鎖ｓｉＲＮＡを含めた、ある種の一本鎖ｓｉＲＮＡ構築体を記載している。Ｈａｒｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １３， ８３−１０５は、化学的かつ構造的に修飾されたある種のｓｉＲＮＡ分子を記載している。Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｒａｎａ， ２００３， ＲＮＡ， ９， １０３４−１０４８は、化学的かつ構造的に修飾されたある種のｓｉＲＮＡ分子を記載している。Ｗｏｏｌｆ他、国際公開第０３／０６４６２６号及び同０３／０６４６２５号は、ある種の化学修飾ｓＲＮＡ構築体を記載している。Ｈｏｒｎｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １１， ２６３−２７０は、形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ７を介した低分子干渉ＲＮＡによる、ＩＦＮアルファの配列特異的な強力な誘導を記載している。Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ：２０ Ｍａｒｃｈ ２００５は、合成ｓｉＲＮＡによる、ほ乳動物の自然免疫応答の配列依存的刺激を記載している。Ｙｕｋｉ他、国際公開第０５／０４９８２１号及び同０４／０４８５６６号は、低分子干渉ＲＮＡ配列、及び最適化された活性を有するある種の低分子干渉ＲＮＡ配列を設計するある種の方法を記載している。Ｓａｉｇｏ他、米国特許出願公開第２００４０５３９３３２号は、ＲＮＡ干渉を実現する、低分子干渉ＲＮＡ配列を含めた、オリゴ又はポリヌクレオチド配列を設計するある種の方法を記載している。Ｔｅｉ他、国際公開第０３／０４４１８８号は、標的遺伝子の少なくとも部分ヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ及びＲＮＡを含む二本鎖ポリヌクレオチドを、細胞、組織又は個々の生物体に移入することを含む、標的遺伝子の発現を阻害するある種の方法を記載している。

Ｍａｔｔｉｃｋ， ２００５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０９， １５２７−１５２８；Ｃｌａｖｅｒｉｅ， ２００５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０９， １５２９−１５３０；Ｓｅｔｈｕｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．， ２００６， ＲＮＡ， １２， １９２−１９７及びＣｚｅｃｈ， ２００６ ＮＥＪＭ， ３５４， １１：１１９４−１１９５；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ他、米国特許出願公開第２００５０２２７２５６号及びＴｕｓｃｈｌ他、米国特許出願公開第２００５０１８２００５号はすべて、ｍｉＲＮＡ機能を立体的遮断によって阻害し得るアンチセンス分子を記載しており、参照によりその全体を本明細書に組込む。

ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｎａｔｕｒｅ， ４１８， ３８−３９は、マウスにおいてキメラＨＣＶ ＮＳ５Ｂタンパク質／ルシフェラーゼ転写物を標的にする、ある種のｓｉＲＮＡ構築体の使用を記載している。

Ｒａｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００３， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， １００， ２３５−２４０は、Ｈｕｈ７肝細胞癌細胞系においてＨＣＶ ＲＮＡを標的にする、ある種のｓｉＲＮＡ構築体を記載している。

本発明は、ＨＣＶ感染症、肝不全、肝細胞癌、肝硬変、及び／又はＨＣＶ感染に関連した他の病態の発生若しくは持続に関連した遺伝子などの遺伝子の発現を、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって調節するのに有用である、化合物、組成物及び方法に関する。本発明は、さらに、ＨＣＶ遺伝子発現経路及び／又は活性に関与する１個以上の遺伝子の発現及び活性を、小核酸分子を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって調節するのに有用である、化合物、組成物及び方法にも関する。特に、本発明は、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子などの小核酸分子を特徴とし、ＨＣＶ遺伝子の発現及び／又は感染の経路に関与する、ＨＣＶ遺伝子及び／又は他の遺伝子（例えば、細胞又は宿主遺伝子）の発現を調節するのに用いる方法を特徴とする。

本発明は、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡなどの小核酸分子にも関し、内因性ＲＮＡ又は内因性ＲＮＡと結合したタンパク質（例えば、ＲＩＳＣ）の調節機能を妨害することによって遺伝子発現を調節するために、内因性ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の機能を阻害し得る小核酸分子（例えば、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、内因性低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の機能を阻害し得る小核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ阻害剤）などの内因性ＲＮＡ分子の機能を阻害し得る小核酸分子、ＲＩＳＣの機能を阻害し得る小核酸分子（例えば、ＲＩＳＣ阻害剤）にも関する。かかる分子を本明細書ではＲＮＡｉ阻害剤と総称する。

本発明のｓｉＮＡ又はＲＮＡｉ阻害剤は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい。本発明のｓｉＮＡ又はＲＮＡｉ阻害剤は、化学合成することができ、ベクターから発現させることができ、又は酵素的に合成することができる。本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって、細胞における標的遺伝子発現又は活性を調節することができる種々の化学修飾合成低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子も特徴とする。本発明は、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はＲＩＳＣと相互作用し、したがって細胞又は生物体におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、翻訳阻害又は転写サイレンシングを下方制御又は阻害することによって、細胞におけるＲＮＡｉ活性を調節することができる、化学修飾された種々の合成低分子核酸（ｓｉＮＡ）分子も特徴とする。化学修飾ｓｉＮＡ及び／又はＲＮＡｉ阻害剤を使用すると、インビボでのヌクレアーゼ分解に対する抵抗性が増大することによって、及び／又は細胞内取り込みが改善されることによって、未変性ｓｉＮＡ分子及び／又はＲＮＡｉ阻害剤の種々の性質が改善される。また、初期に発表された研究に反して、完全に修飾されたｓｉＮＡを含めて、複数の化学修飾を有する本発明のｓｉＮＡ分子は、そのＲＮＡｉ活性を保持する。したがって、本出願人は、未変性ｓｉＲＮＡの活性を保持する、又は更に改善する、（本明細書ではｓｉＮＡと総称する）化学修飾ｓｉＲＮＡを本明細書で教示する。本発明のｓｉＮＡ分子は、種々の治療、予防、獣医学、診断、標的確認（ｔａｒｇｅｔ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）、ゲノム発見、遺伝子工学及び薬理ゲノミクスの各適用分野に有用である試薬及び方法を提供する。

一実施形態においては、本発明は、本明細書ではＨＣＶと総称する、表Ｉに示すＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって参照される配列を含む配列をコードする遺伝子など、ＨＣＶ感染症、肝不全、肝細胞癌及び肝硬変の持続又は発生に関連するタンパク質などのタンパク質をコードするＨＣＶ及びＨＣＶ関連宿主標的遺伝子の発現を独立に、又は組み合わせて、調節する、１つ以上のｓｉＮＡ分子及び／又はＲＮＡｉ阻害剤並びに方法を特徴とする。本発明の種々の態様及び実施形態を、本明細書ではＨＣＶと総称する例示的Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子に関連して以下に記述する。しかし、かかる参考文献は単なる例示にすぎず、本発明の種々の態様及び実施形態は、変異ＨＣＶ遺伝子、ＨＣＶ遺伝子のスプライスバリアント、異なるＨＣＶ系統をコードする遺伝子などの代わりのＨＣＶ遺伝子を発現する他の遺伝子、並びに本明細書に記載の細胞標的、本明細書のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって参照される細胞標的、その全部を参照により本明細書に組込む、ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８、米国仮出願第６０／３６３，１２４号又は米国特許出願第１０／９２３，５３６号及び米国特許出願第１０／４４４，８５３号に記載の細胞標的など、本明細書では「標的」配列と総称する、ＨＣＶの細胞標的も対象とする。種々の態様及び実施形態は、ＨＣＶ感染症、肝不全、肝細胞癌及び肝硬変の持続及び／又は発生に関与する細胞タンパク質をコードする遺伝子、又はＨＣＶ生活環において利用される細胞タンパク質など、ＨＣＶ感染に関連した他のタンパク質を発現する他の遺伝子を含めて、ＨＣＶ経路に関与する他の遺伝子も対象とする。かかる追加の遺伝子の標的部位は、ＨＣＶに対する本明細書に記載の方法を用いて分析することができる。したがって、他の遺伝子の阻害、及びかかる阻害の効果は、本明細書に記載したとおりに測定することができる。換言すれば、以下に規定する、また、実施形態に列挙する、「標的」及び「標的遺伝子」という用語は、異なるＨＣＶ系統のポリペプチドを含めたＨＣＶポリペプチドをコードする遺伝子、調節性ポリヌクレオチド（例えば、ｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ）、変異ＨＣＶ遺伝子、及びＨＣＶ遺伝子のスプライスバリアント、並びにＨＣＶ遺伝子発現経路、複製及び／又はＨＣＶ活性に関与する細胞遺伝子など、ＨＣＶ感染症の発生及び／又は持続に関連する遺伝子を包含するものとする。また、以下に規定する、また、実施形態に列挙する、「標的」という用語は、本明細書に記載の産物など、ＨＣＶ感染症に関与するＨＣＶウイルス遺伝子産物及び細胞遺伝子産物を包含するものとする。したがって、「標的」という用語に関連して本明細書に記載した実施形態の各々は、本明細書で定義する「ＨＣＶ」という用語によって網羅されるウイルス、細胞及びウイルスタンパク質、ペプチド、ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド分子の全部に適用可能である。包括的に、かかる遺伝子標的を本明細書では「標的」配列とも総称する。

一実施形態においては、本発明は、標的ＲＮＡ又はＤＮＡの異なる領域（例えば、本明細書に記載のものなどの２個の異なる標的部位、又は標的若しくは経路標的の任意の組合せ）、コード標的と非コード標的の両方などの異なるポリヌクレオチド標的を標的としたＨＣＶ ＲＮＡの異なる領域など、異なるポリヌクレオチド標的を標的とした、本発明の２種類以上のｓｉＮＡ分子及び／又はＲＮＡｉ阻害剤（例えば、ｓｉＮＡ、二本鎖形成性（ｄｕｐｌｅｘ ｆｏｒｍｉｎｇ）ｓｉＮＡ若しくは多官能ｓｉＮＡ又はその任意の組合せ）を含む組成物を特徴とする。ｓｉＮＡ分子のかかるプールは、治療効果を増大させることができる。本明細書の２個の異なる標的部位）、異なるウイルス系統（例えば、ＨＣＶ系統同士、ＨＩＶとＨＣＶ、ＨＣＶとＨＢＶなど）、又は異なるウイルス標的と細胞標的（例えば、ＨＣＶ標的と細胞標的）。ｓｉＮＡ分子のかかるプールは、ウイルスの耐性を阻害若しくは克服することができ、又は治療効果を増大させることができる。

一実施形態においては、本発明は、ＨＣＶマイナス鎖、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＨＰＣＫ１Ｓ１、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ−１ｂ系統、ＨＣＶ−Ｋ１−Ｓ１クローン）、全ゲノム；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ５０４８３、９４１０ｎｔに対してＲＮＡｉ特異性を有するｓｉＮＡ分子を特徴とする。

一実施形態においては、本発明は、標的ＨＣＶ ＲＮＡ又はＤＮＡの異なる領域（例えば、本明細書の２個の異なる標的部位、又は標的若しくは宿主／経路標的の任意の組合せ）、コード標的と非コード標的の両方などの異なるＨＣＶポリヌクレオチド標的に対して特異性を有する、本発明の２種類以上のｓｉＮＡ分子（例えば、ｓｉＮＡ、二本鎖形成性（ｆｏｍｉｎｇ）ｓｉＮＡ若しくは多官能ｓｉＮＡ又はその任意の組合せ）のプールを特徴とする。ここで、プールは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える異なる標的を標的にするｓｉＮＡ分子を含む。

一実施形態においては、本発明は、細胞受容体、細胞表面分子、細胞酵素、細胞転写因子、及び／又はサイトカイン、二次メッセンジャー、並びにＬａ抗原（例えば、Ｃｏｓｔａ−Ｍａｔｔｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ２４， ６８６１−７０参照。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３１４２）、ＦＡＳ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００４３）又はＦＡＳリガンド（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００６３９）、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８２５０３．１）、細胞ＰＫＲプロテインキナーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００２６６１．７）、ヒト真核生物開始因子２Ｂ（ｅｌＦ２Ｂガンマ；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２５６２２３、及び／又はｅｌＦ２ガンマ；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６８７４．１）、ヒトＤＥＡＤ Ｂｏｘタンパク質（ＤＤＸ３；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０１８０２１．２）、及びポリピリミジントラクト結合タンパク質などのＨＣＶ ３’−ＵＴＲのポリ（Ｕ）トラクトに結合する細胞タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３１９９１．１及びＸＭ＿０４２９７２．３）を含めて、ただしこれらだけに限定されない細胞アクセサリー分子など、ＨＣＶ感染症の細胞標的である遺伝子の発現を独立に、又は組み合わせて、調節する１種類以上のｓｉＮＡ分子及び方法を特徴とする。かかる細胞標的を、本明細書ではＨＣＶ標的、具体的には「宿主標的」とも総称する。

ＨＣＶゲノムの配列は極めて多様性に富むので、広範な治療用途にｓｉＮＡ分子を選択するには、ＨＣＶゲノムの保存領域を含む必要があり得る。一実施形態においては、本発明は、ＨＣＶゲノムの保存領域を、又は異なる標的間で保存された領域を、標的にするｓｉＮＡ分子及び／又はＲＮＡｉ阻害剤に関する。ＨＣＶゲノムの保存領域の例としては、５’非コード領域（ＮＣＲ。５’非翻訳領域ＵＴＲとも称される。）、コアタンパク質コード領域の５’末端、及び３’−ＮＣＲが挙げられるが、これらだけに限定されない。ＨＣＶゲノムのＲＮＡは、５’キャップ構造とは無関係に翻訳を媒介する、５’−ＮＣＲ中の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６７， ３３３８−４４）。ＨＣＶ ＲＮＡゲノムの完全長配列は、少なくとも１５である、臨床的に分離されたサブタイプ間で非相同である（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ， １９９５， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ２１， ５７０−５８３）。しかし、ＨＣＶの５’−ＮＣＲ配列は、既知の全サブタイプ間で高度に保存され、共有のＩＲＥＳ機構を保存している可能性が最も高い（Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｊ． Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌ．， ７２， ２６９７−２７０４）。したがって、ｓｉＮＡ分子は、５’ＮＣＲ配列などの保存領域を標的にすることによって、ＨＣＶの異なる分離株を標的にするように設計することができる。種々のＨＣＶ分離株の保存領域を標的にするように設計されたｓｉＮＡ分子及び／又はＲＮＡｉ阻害剤は、多様な患者集団におけるＨＣＶ複製を効率的に阻害することができ、ＨＣＶゲノムの非保存領域における変異によって進化したＨＣＶ疑似種に対するｓｉＮＡ分子の有効性を確保することができる。上で述べたように、ＨＣＶの保存ヌクレオチド配列（例えば、種々のＨＣＶ分離株のＲＮＡ中に存在すると予想される配列）と相互作用するようにｓｉＮＡ分子を設計することによって、単一のｓｉＮＡ分子でＨＣＶの全分離株を標的にすることができる。

一実施形態においては、本発明は、二本鎖の一方が標的核酸分子又はその一部における所定のヌクレオチド配列に対して相補性を有するヌクレオチド配列を含む、ｓｉＮＡ分子などの二本鎖核酸分子を特徴とする。一実施形態においては、所定のヌクレオチド配列は、本明細書に記載のヌクレオチド標的配列である。別の実施形態においては、所定のヌクレオチド配列は、当分野で公知の標的配列である。

一実施形態においては、本発明は、標的遺伝子の発現を下方制御する、又は標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。前記ｓｉＮＡ分子は、約１５から約２８個の塩基対を含む。

一実施形態においては、本発明は、標的ＲＮＡの切断を誘導する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。前記ｓｉＮＡ分子は、約１５から約２８個の塩基対を含む。

一実施形態においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的ＲＮＡの切断を誘導する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。この二本鎖ｓｉＮＡ分子は第１の鎖と第２の鎖を含み、ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８から約２８（例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８）ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の第１の鎖は、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって標的ＲＮＡの切断を誘導するのに十分な相補性を標的ＲＮＡに対して有するヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は、第１の鎖に相補的であるヌクレオチド配列を含む。特定の一実施形態においては、例えば、ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８から約２７ヌクレオチド長である。

一実施形態においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的ＲＮＡの切断を誘導する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子は第１の鎖と第２の鎖を含み、ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８から約２３（例えば、約１８、１９、２０、２１、２２又は２３）ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の第１の鎖は、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって標的ＲＮＡの切断を誘導するのに十分な相補性を標的ＲＮＡに対して有するヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は、第１の鎖に相補的であるヌクレオチド配列を含む。

一実施形態においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的ＲＮＡの切断を誘導する、化学合成された二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８から約２８ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の１本の鎖は、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって標的ＲＮＡの切断を誘導するのに十分な相補性を標的ＲＮＡに対して有するヌクレオチド配列を含む。

一実施形態においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的ＲＮＡの切断を誘導する、化学合成された二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８から約２３ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって標的ＲＮＡの切断を誘導するのに十分な相補性を標的ＲＮＡに対して有するヌクレオチド配列を含む。

一実施形態においては、本発明は、標的遺伝子の発現を下方制御する、又は標的ＲＮＡの切断を誘導する、ｓｉＮＡ分子を特徴とし、例えば、標的遺伝子又はＲＮＡはタンパク質コード配列を含む。一実施形態においては、本発明は、標的遺伝子の発現を下方制御する、又は標的ＲＮＡの切断を誘導する、ｓｉＮＡ分子を特徴とし、例えば、標的遺伝子又はＲＮＡは、標的遺伝子発現に関与する非コード配列又は調節エレメント（例えば、非コードＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡなど）を含む。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡを用いて、標的遺伝子又は標的遺伝子ファミリー（例えば、異なるＨＣＶ系統）の発現を阻害する。ここで、遺伝子又は遺伝子ファミリーの配列は、配列相同性を共有する。かかる相同配列は、例えば配列アラインメントによって、当分野で公知のとおりに特定することができる。ｓｉＮＡ分子は、例えば、完全な相補配列を用いて、又は追加の標的配列を与え得る非標準塩基対、例えばミスマッチ及び／又はゆらぎ塩基対を導入することによって、かかる相同配列を標的とするように設計することができる。ミスマッチが特定された場合には、非標準塩基対（例えば、ミスマッチ及び／又はゆらぎ塩基）を用いて、１個を超える遺伝子配列を標的にするｓｉＮＡ分子を作製することができる。非限定的例においては、ＵＵ、ＣＣ塩基対などの非標準塩基対を用いて、配列相同性を共有する異なるポリヌクレオチド標的の配列を標的にすることができるｓｉＮＡ分子を作製する。したがって、本発明のｓｉＮＡを使用する一利点は、相同遺伝子間で保存されたヌクレオチド配列に相補的である核酸配列を含むように単一のｓｉＮＡを設計できることである。この手法においては、異なる遺伝子を標的にするために１種類を超えるｓｉＮＡ分子を用いる代わりに、単一のｓｉＮＡを用いて１個を超える遺伝子の発現を阻害することができる。

一実施形態においては、本発明は、標的ＲＮＡ（例えば、コード又は非コードＲＮＡ）に対してＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を特徴とする。このｓｉＮＡ分子は、表Ｉ、その全部を参照により本明細書に組込むＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８、米国仮出願第６０／３６３，１２４号及び／又は米国特許出願第１０／９２３５３６号及び米国特許出願第１０／４４４，８５３号に示されたＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を有する配列などの任意のＲＮＡ配列に相補的である配列を含む。別の実施形態においては、本発明は、標的ＲＮＡに対してＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を特徴とする。このｓｉＮＡ分子は、変種コード配列を有するＲＮＡに相補的である配列を含み、例えば、本明細書に記載の、又は当分野で公知の疾患、形質、障害及び／又は症状の持続及び／又は発生に関連することが当分野で知られている他の変異遺伝子を有するＲＮＡに相補的である配列を含む。表ＩＩＩ及びＩＶに示す化学修飾、又は本明細書に記載の化学修飾を、本発明の任意のｓｉＮＡ構築体に適用することができる。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＨＣＶ標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用し、それによってＨＣＶ標的遺伝子発現のサイレンシングを媒介し得るヌクレオチド配列を含む。例えば、このｓｉＮＡは、クロマチン構造又はＨＣＶ標的遺伝子のメチル化パターンを調節して、ＨＣＶ標的遺伝子の転写を防止する細胞プロセスによって、ＨＣＶ標的遺伝子発現の調節を媒介する。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子を用いて、対象又は生物体において形質、疾患又は症状に関連するハプロタイプ多型から生じるタンパク質の発現を下方制御又は阻害する。遺伝子又はタンパク質若しくはＲＮＡレベルを分析することによって、かかる多型を有する対象、又は本明細書に記載の形質、症状若しくは疾患を発生するリスクのある対象を特定することができる。これらの対象は、治療、例えば、本発明のｓｉＮＡ分子を用いた治療、及び標的遺伝子発現に関係する疾患の治療に有用である任意の他の組成物を用いた治療に適している。したがって、タンパク質又はＲＮＡレベルを分析することによって、対象を治療する治療タイプ及び療法のコースを決定することができる。タンパク質又はＲＮＡレベルを監視することによって、治療の成果を予測し、また、形質、障害、症状又は疾患に関連したある種のタンパク質のレベル及び／又は活性を調節する化合物及び組成物の効力を求めることができる。

本発明の一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は、ＨＣＶ標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。ｓｉＮＡ分子は、センス鎖を更に含み、前記センス鎖は、ＨＣＶ標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部を含む。

別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は、ＨＣＶ標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を含む。ｓｉＮＡ分子は、センス領域を更に含み、前記センス領域は、ＨＣＶ標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部を含む。

別の実施形態においては、本発明は、ヌクレオチド配列を含むｓｉＮＡ分子、例えば、ＨＣＶ標的遺伝子のヌクレオチド配列又は配列の一部に相補的である、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域中のヌクレオチド配列を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の実施形態においては、本発明は、領域を含むｓｉＮＡ分子、例えば、ＨＣＶ標的遺伝子配列又はその一部を含む配列に相補的である、ｓｉＮＡ構築体のアンチセンス領域を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のセンス領域又はセンス鎖は、ＨＣＶ標的ポリヌクレオチド配列に相補的である、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域又はアンチセンス鎖の部分に相補的である。

更に別の実施形態においては、本発明は、配列を含むｓｉＮＡ分子、例えば、その全部を参照により本明細書に組込むＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８、米国仮出願第６０／３６３，１２４号及び／又は米国特許出願第１０／９２３，５３６号及び米国特許出願第１０／４４４，８５３号に示されたＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって表される配列を含む配列又は配列の一部に相補的である、ｓｉＮＡ構築体のアンチセンス配列を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。表ＩＩＩ及びＩＶ並びに本明細書に記載の化学修飾を、本発明の任意のｓｉＮＡ構築体に適用することができる。表ＶＩに記載のＬＮＰ調合物を、本明細書の任意のｓｉＮＡ分子又はｓｉＮＡ分子の組合せに適用することができる。

本発明の一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。このアンチセンス鎖は、ＨＣＶ標的ＲＮＡ配列又はその一部に相補的であり、前記ｓｉＮＡは、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを有するセンス鎖を更に含む。前記センス鎖と前記アンチセンス鎖は、異なるヌクレオチド配列であり、各鎖中の少なくとも約１５ヌクレオチドは、他方の鎖に相補的である。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子（例えば、二本鎖核酸分子）は、標的ＲＮＡ配列又はその一部に相補的である、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを有するアンチセンス（ガイド）鎖を含む。一実施形態においては、標的ＲＮＡ配列の少なくとも１５ヌクレオチド（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド）は、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス（ガイド）鎖に相補的である。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子（例えば、二本鎖核酸分子）は、標的ＲＮＡの配列又はその一部を含む、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを有するセンス（パッセンジャー）鎖を含む。一実施形態においては、標的ＲＮＡ配列の少なくとも１５ヌクレオチド（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドは、本発明のｓｉＮＡ分子のセンス（パッセンジャー）鎖を含む。

本発明の別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを有するアンチセンス領域を含む。このアンチセンス領域は、標的ＤＮＡ配列に相補的であり、前記ｓｉＮＡは、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを有するセンス領域を更に含む。前記センス領域と前記アンチセンス領域は線状分子に含まれ、センス領域は、アンチセンス領域に相補的である少なくとも約１５ヌクレオチドを含む。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＨＣＶ遺伝子によってコードされるＲＮＡの発現を調節するＲＮＡｉ活性を有する。ＨＣＶ遺伝子はある程度の配列相同性を相互に共有し得るので、ｓｉＮＡ分子は、異なるＨＣＶ標的間で共有される配列、又は特定のＨＣＶ標的に特有の配列を選択することによって、あるクラスのＨＣＶ遺伝子（例えば、異なるＨＣＶ系統のクラス）又は特定のＨＣＶ遺伝子（例えば、逸脱変異体、耐性系統、又は他の多型変種）を標的にするように設計することができる。したがって、一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は、１種類のｓｉＮＡ分子を用いてあるクラスのＨＣＶ遺伝子を標的にするために、幾つかのＨＣＶ遺伝子変種間で相同性を有するＨＣＶ ＲＮＡ配列の保存領域を標的にするように設計することができる。したがって、一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体における１つ以上のＨＣＶ系統の発現を調節する。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡｉ活性を媒介するのに必要な高度の特異性のために、特定のＨＣＶ ＲＮＡ配列（例えば、単一のＨＣＶ系統、又はＨＣＶ一塩基多型（ＳＮＰ））に特有の配列を標的にするように設計することができる。

一実施形態においては、ＲＮＡ干渉遺伝子サイレンシング応答の媒介物質として作用する本発明の核酸分子は、二本鎖核酸分子である。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド間の約１５から約３０塩基対を含む二本鎖核酸分子からなる。更に別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１から約３（例えば、約１、２又は３）ヌクレオチドのオーバーハング末端を有する二本鎖核酸分子、例えば、約１９塩基対と３’末端モノヌクレオチド、ジヌクレオチド又はトリヌクレオチドオーバーハングとを有する約２１ヌクレオチド二本鎖を含む。更に別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、両末端が平滑末端である、又は両末端の一方が平滑末端である、平滑末端を有する二本鎖核酸分子を含む。

一実施形態においては、二本鎖核酸（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドオーバーハングを含む。「オーバーハング」とは、二本鎖核酸分子の２本の鎖の間で塩基対を形成していないヌクレオチド配列の末端部分を意味する（例えば、図６参照）。一実施形態においては、本発明の二本鎖核酸分子は、二本鎖核酸分子の一方又は両方の鎖の３’末端にヌクレオチド又は非ヌクレオチドオーバーハングを含み得る。例えば、本発明の二本鎖核酸分子は、二本鎖核酸分子のガイド鎖若しくはアンチセンス鎖／領域の３’末端に、パッセンジャー鎖若しくはセンス鎖／領域の３’末端に、又はガイド鎖若しくはアンチセンス鎖／領域とパッセンジャー鎖若しくはセンス鎖／領域の両方に、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドオーバーハングを含み得る。別の実施形態においては、本発明の二本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子のヌクレオチドオーバーハング部分は、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ（ＦＡＮＡ）、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、汎用塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）、非環式、又は５−Ｃ−メチルヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、本発明の二本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子の非ヌクレオチドオーバーハング部分は、グリセリル、脱塩基又は反転（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）デオキシ脱塩基非ヌクレオチドを含む。

一実施形態においては、本発明の二本鎖核酸（例えば、ｓｉＮＡ）分子のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、ＨＣＶ標的ポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチドに対応する。したがって、かかる実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、ＨＣＶ標的ポリヌクレオチド配列に基づく配列を含む。ここで、本発明のｓｉＮＡ分子のガイド鎖又はアンチセンス鎖／領域のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、ＨＣＶ標的ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドに相補的であり得、又は本発明のｓｉＮＡ分子のパッセンジャー鎖又はセンス鎖／領域のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、ＨＣＶ標的ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドを含み得る。かかるヌクレオチドオーバーハングは、ｓｉＲＮＡへの未変性ｄｓＲＮＡのダイサープロセシングから生成する配列を含む。

一実施形態においては、本発明の二本鎖核酸（例えば、ｓｉＮＡ）分子のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、ＨＣＶ標的ポリヌクレオチド配列に相補的であり、本明細書に記載したとおりに化学修飾されていてもよい。したがって、一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のガイド鎖又はアンチセンス鎖／領域のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、ＨＣＶ標的ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチド、すなわち、ｓｉＮＡ分子のガイド鎖又はアンチセンス鎖／領域中のオーバーハングヌクレオチドのヌクレオチド位置に相補的である、ＨＣＶ標的ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチド位置に相補的であり得る。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のパッセンジャー鎖又はセンス鎖／領域のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、ＨＣＶ標的ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチド、すなわち、ｓｉＮＡ分子中のパッセンジャー鎖又はセンス鎖／領域中のオーバーハングヌクレオチドの同じヌクレオチド位置に対応するＨＣＶ標的ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチド位置を含み得る。一実施形態においては、オーバーハングは、ＨＣＶ標的ポリヌクレオチド配列の一部に相補的である２ヌクレオチド（例えば、３’−ＧＡ、３’−ＧＵ、３’−ＧＧ、３’ＧＣ、３’−ＣＡ、３’−ＣＵ、３’−ＣＧ、３’ＣＣ、３’−ＵＡ、３’−ＵＵ、３’−ＵＧ、３’ＵＣ、３’−ＡＡ、３’−ＡＵ、３’−ＡＧ、３’−ＡＣ、３’−ＴＡ、３’−ＴＵ、３’−ＴＧ、３’−ＴＣ、３’−ＡＴ、３’−ＵＴ、３’−ＧＴ、３’−ＣＴ）オーバーハングを含む。一実施形態においては、オーバーハングは、ＨＣＶ標的ポリヌクレオチド配列の一部に相補的でない２ヌクレオチド（例えば、３’−ＧＡ、３’−ＧＵ、３’−ＧＧ、３’ＧＣ、３’−ＣＡ、３’−ＣＵ、３’−ＣＧ、３’ＣＣ、３’−ＵＡ、３’−ＵＵ、３’−ＵＧ、３’ＵＣ、３’−ＡＡ、３’−ＡＵ、３’−ＡＧ、３’−ＡＣ、３’−ＴＡ、３’−ＴＵ、３’−ＴＧ、３’−ＴＣ、３’−ＡＴ、３’−ＵＴ、３’−ＧＴ、３’−ＣＴ）オーバーハングを含む。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハングヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハングヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドがプリンヌクレオチドである場合には、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、及び／又はオーバーハングヌクレオチドがピリミジンヌクレオチドである場合には、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド若しくは２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチドである。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハング中のプリンヌクレオチドは（存在するときには）２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハング中のピリミジンヌクレオチドは（存在するときには）２’−デオキシ−２’−フルオロ又は２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチドである。

一実施形態においては、本発明の二本鎖核酸（例えば、ｓｉＮＡ）分子のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、ＨＣＶ標的ポリヌクレオチド配列に相補的でなく、本明細書に記載したとおりに化学修飾されていてもよい。一実施形態においては、オーバーハングは、ＨＣＶ標的ポリヌクレオチド配列の一部に相補的でない３’−ＵＵオーバーハングを含む。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。

一実施形態においては、本発明の二本鎖核分子（例えば、ｓｉＮＡ）は、２又は３ヌクレオチドオーバーハングを含み、オーバーハング中のヌクレオチドは同じであり、又は異なる。一実施形態においては、本発明の二本鎖核分子（例えば、ｓｉＮＡ）は、２又は３ヌクレオチドオーバーハングを含み、オーバーハング中のヌクレオチドは、同じであり、又は異なり、オーバーハング中の１個以上のヌクレオチドは、塩基、糖及び／又はリン酸骨格において化学修飾されている。

一実施形態においては、本発明は、ＤＮＡ、タンパク質をコードするＲＮＡ、ＨＣＶ標的遺伝子の発現に関連する非コードＲＮＡなどのＨＣＶ標的核酸分子に特異的である１種類以上の化学修飾ｓｉＮＡ構築体を特徴とする。一実施形態においては、本発明は、本明細書に記載の１個以上の化学修飾を含む核酸分子に特異的である、ＲＮＡベースのｓｉＮＡ分子（例えば、２’−ＯＨヌクレオチドを含むｓｉＮＡ）を特徴とする。かかる化学修飾の非限定的例としては、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、４’−チオリボヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド（例えば、参照により本明細書に組込む、２００４年１１月５日に出願された米国特許出願第１０／９８１，９６６号参照）、「汎用塩基」ヌクレオチド、「非環式」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ（ＦＡＮＡ、例えば、Ｄｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３４， １６６９−１６７５参照）、並びに末端グリセリル及び／又は反転デオキシ脱塩基残基の組み入れが挙げられるが、これらだけに限定されない。これらの化学修飾は、種々のｓｉＮＡ構築体（例えば、ＲＮＡベースのｓｉＮＡ構築体）において使用すると、細胞におけるＲＮＡｉ活性を維持し、同時に、これらの化合物の血清安定性を劇的に増大させることが判明した。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載の化学修飾（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、４’−チオリボヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、ＬＮＡ）をｓｉＮＡ分子の内部位置に含む。「内部位置」とは、ｓｉＮＡ二本鎖の塩基対形成位置を意味する。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持しつつ、修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドを使用して、安定性、活性、毒性、免疫応答及び／又は生物学的利用能などのインビトロ又はインビボ特性を改善することができる。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子中に存在するヌクレオチドの総数の百分率として修飾ヌクレオチドを含み得る。したがって、本発明のｓｉＮＡ分子は、約５％から約１００％の修飾ヌクレオチド（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の修飾ヌクレオチド）を一般に含み得る。例えば、一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子中のヌクレオチド位置の約５％から約１００％（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の修飾ヌクレオチド）は、２’糖修飾、例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチドなどの核酸糖修飾を含む。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子中のヌクレオチド位置の約５％から約１００％（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の修飾ヌクレオチド）は、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）又は６−アザピリミジン又は６−アルキルピリミジン（例えば６−メチルウリジン）、プロピン修飾などの核酸塩基修飾を含む。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子中のヌクレオチド位置の約５％から約１００％（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の修飾ヌクレオチド）は、本明細書の式Ｉの骨格修飾などの核酸骨格修飾を含む。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子中のヌクレオチド位置の約５％から約１００％（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の修飾ヌクレオチド）は、核酸の糖、塩基若しくは骨格修飾又はその任意の組合せ（例えば、本明細書の核酸の糖、塩基、骨格又は非ヌクレオチド修飾の任意の組合せ）を含む。一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の修飾ヌクレオチドを含む。所与のｓｉＮＡ分子中に存在する修飾ヌクレオチドの実際の割合は、ｓｉＮＡ中に存在するヌクレオチドの総数に依存する。ｓｉＮＡ分子が一本鎖である場合には、修飾率は、一本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するヌクレオチドの総数に基づき得る。同様に、ｓｉＮＡ分子が二本鎖である場合には、修飾率は、センス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖とアンチセンス鎖の両方中に存在するヌクレオチドの総数に基づき得る。

本発明のｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子内の種々の場所に修飾ヌクレオチドを含み得る。一実施形態においては、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ二本鎖内部の塩基対形成位置に修飾ヌクレオチドを含む。例えば、内部位置は、１９塩基対と２ヌクレオチド３’オーバーハングとを有する２１ヌクレオチドｓｉＮＡ二本鎖のセンス鎖若しくは領域又はアンチセンス鎖若しくは領域のどちらかの５’末端から約３から約１９ヌクレオチドの位置を含み得る。別の実施形態においては、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子の非塩基対形成領域、すなわちオーバーハング領域に修飾ヌクレオチドを含む。「非塩基対形成」とは、センス鎖又はセンス領域とアンチセンス鎖又はアンチセンス領域又はｓｉＮＡ分子との間でヌクレオチドが塩基対を形成していないことを意味する。オーバーハングヌクレオチドは、対応するＨＣＶ標的ポリヌクレオチド配列に相補的であり得、又は対応するＨＣＶ標的ポリヌクレオチド配列と塩基対を形成し得る（例えば、図６Ｃ参照）。例えば、オーバーハング位置は、１９塩基対と２ヌクレオチド３’オーバーハングとを有する２１ヌクレオチドｓｉＮＡ二本鎖のセンス鎖若しくは領域又はアンチセンス鎖若しくは領域のどちらかの５’末端から約２０及び約２１ヌクレオチドの位置を含み得る。別の実施形態においては、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子の末端位置に修飾ヌクレオチドを含む。例えば、かかる末端領域としては、ｓｉＮＡ分子のセンス及び／又はアンチセンス鎖若しくは領域の３’と５’の両方の位置に対して、３’位、５’位が挙げられる。別の実施形態においては、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、塩基対形成位置若しくは内部位置、非塩基対形成領域若しくはオーバーハング領域、及び／又は末端領域、又はその任意の組合せにおいて、修飾ヌクレオチドを含む。

本発明の一態様は、ＨＣＶ標的遺伝子の発現を下方制御する、又はＨＣＶ標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。一実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子は、１個以上の化学修飾を含み、二本鎖ｓｉＮＡの各鎖は約２１ヌクレオチド長である。一実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子は、リボヌクレオチドを含まない。別の実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子は、１個以上のリボヌクレオチドを含む。一実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを独立に含む。ここで、各鎖は、他方の鎖のヌクレオチドに相補的である約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを含む。一実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は、ＨＣＶ標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、二本鎖ｓｉＮＡ分子の他方の鎖は、ＨＣＶ標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部にかなり類似したヌクレオチド配列を含む。

別の実施形態においては、本発明は、アンチセンス領域とセンス領域を含み、ＨＣＶ標的遺伝子の発現を下方制御する、又はＨＣＶ標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域は、ＨＣＶ標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部にかなり類似したヌクレオチド配列を含む。一実施形態においては、アンチセンス領域とセンス領域は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを独立に含む。ここで、アンチセンス領域は、センス領域のヌクレオチドに相補的である約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを含む。

別の実施形態においては、本発明は、センス領域とアンチセンス領域を含み、ＨＣＶ標的遺伝子の発現を下方制御する、又はＨＣＶ標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域は、ＨＣＶ標的遺伝子によってコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、アンチセンス領域に相補的であるヌクレオチド配列を含む。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、平滑末端、すなわち、オーバーハングヌクレオチドを含まない末端を含む。例えば、本明細書に記載の修飾を含み（例えば、式Ｉ−ＶＩＩのヌクレオチド、「Ｓｔａｂ ００」−「Ｓｔａｂ ３６」若しくは「Ｓｔａｂ ３Ｆ」−「Ｓｔａｂ ３６Ｆ」を含むｓｉＮＡ構築体（表ＩＶ）、又はその任意の組合せを含み）、及び／又は本明細書に記載の任意の長さを含むｓｉＮＡ分子は、平滑末端、すなわちオーバーハングヌクレオチドを含まない末端を含み得る。

一実施形態においては、本発明の任意のｓｉＮＡ分子は、１個以上の平滑末端を含み得る。すなわち、ここで、平滑末端は、オーバーハングヌクレオチドを含まない。一実施形態においては、平滑末端ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子の各鎖中に存在するヌクレオチドと同数の塩基対を有する。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は１個の平滑末端を含み、例えば、アンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端はオーバーハングヌクレオチドを含まない。別の例においては、ｓｉＮＡ分子は１個の平滑末端を含み、例えば、アンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端はオーバーハングヌクレオチドを含まない。別の例においては、ｓｉＮＡ分子は２個の平滑末端を含み、例えば、アンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端、及びアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端は、オーバーハングヌクレオチドを含まない。平滑末端ｓｉＮＡ分子は、例えば、約１５から約３０ヌクレオチド（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド）を含み得る。平滑末端ｓｉＮＡ分子中に存在する他のヌクレオチドは、例えば、ミスマッチ、バルジ、ループ又はゆらぎ塩基対を含み、ｓｉＮＡ分子の活性を調節して、ＲＮＡ干渉を媒介することができる。

「平滑末端」とは、対称な末端、又はオーバーハングヌクレオチドを含まない二本鎖ｓｉＮＡ分子の末端を意味する。二本鎖ｓｉＮＡ分子の２本の鎖は、末端にオーバーハングヌクレオチドを含まずに整合する。例えば、平滑末端ｓｉＮＡ構築体は、ｓｉＮＡ分子のセンス領域とアンチセンス領域の間で相補的である末端ヌクレオチドを含む。

一実施形態においては、本発明は、ＨＣＶ標的遺伝子の発現を下方制御する、又はＨＣＶ標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は、２個の別々のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられ、第１の断片はセンス領域を含み、第２の断片はｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。センス領域は、ポリヌクレオチドリンカー、非ヌクレオチドリンカーなどのリンカー分子を介してアンチセンス領域と連結し得る。

一実施形態においては、本発明の二本鎖核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、ＲＮＡｉ活性を維持又は増強する位置にリボヌクレオチドを含む。一実施形態においては、リボヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖又はセンス領域中に存在し、ＲＩＳＣ内での酵素によるセンス鎖又はセンス領域の切断を可能にすることによってＲＮＡｉ活性を付与し得る（例えば、ＲＩＳＣ中でＡＧＯ２酵素によって切断される、１９塩基対二本鎖のパッセンジャー鎖の９位など、パッセンジャー鎖、センス鎖又はセンス領域の切断位置に存在するリボヌクレオチド。例えば、Ｍａｔｒａｎｇａ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｃｅｌｌ， １２３：１−１１４及びＲａｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｃｅｌｌ， １２３：６２１−６２９を参照されたい。）。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の（アンチセンス鎖又はアンチセンス領域としても知られる）ガイド鎖又はガイド領域の５’末端にある１個以上（例えば、１、２、３、４又は５個）のヌクレオチドはリボヌクレオチドである。

一実施形態においては、本発明の二本鎖核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）分子は、ＲＩＳＣ中での酵素によるパッセンジャー鎖又はパッセンジャー領域の切断を可能にする（センス鎖又はセンス領域としても知られる）パッセンジャー鎖又はパッセンジャー領域内の位置に１個以上のリボヌクレオチドを含む。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、少なくとも２、３、４、５個又はそれを超える、同じでも、異なっていてもよい化学修飾を含む。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、少なくとも２、３、４、５個又はそれを超える異なる化学修飾を含む。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は二本鎖であって、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）個の塩基対を含み、ｓｉＮＡ分子の各鎖中のヌクレオチド位置の１つ以上（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個）は、化学修飾を含む。別の実施形態においては、ｓｉＮＡは、少なくとも２、３、４、５個又はそれを超える異なる化学修飾を含む。

一実施形態においては、本発明は、ＨＣＶ標的遺伝子の発現を下方制御する、又はＨＣＶ標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）個の塩基対を含み、ｓｉＮＡ分子の各鎖は１個以上の化学修飾を含む。一実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、少なくとも２個の（例えば、２、３、４、５個又はそれを超える）異なる化学修飾、例えば、ヌクレオチドの糖、塩基又は骨格の種々の修飾を含む。別の実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は、ＨＣＶ標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、二本鎖ｓｉＮＡ分子の他方の鎖は、ＨＣＶ標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部にかなり類似したヌクレオチド配列を含む。別の実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は、ＨＣＶ標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、二本鎖ｓｉＮＡ分子の他方の鎖は、ＨＣＶ標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部にかなり類似したヌクレオチド配列を含む。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを含み、各鎖は、他方の鎖のヌクレオチドに相補的である少なくとも約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを含む。ＨＣＶ標的遺伝子は、例えば、本明細書で言及する配列、又は参照により本明細書に組込む配列を含み得る。ＨＣＶ遺伝子は、例えば、本明細書のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって参照される配列を含み得る。

一実施形態においては、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、本明細書の任意の「Ｓｔａｂ ００」−「Ｓｔａｂ ３６」又は「Ｓｔａｂ ３Ｆ」−「Ｓｔａｂ ３６Ｆ」（表ＩＶ）修飾パターン、その任意の組合せなどの異なる化学修飾パターンを含む。種々の修飾パターンを有するかかるｓｉＮＡ分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖の非限定的例を表ＩＩＩ並びに図４及び５に示す。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、リボヌクレオチドを含まない。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１個以上のリボヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるリボヌクレオチド）を含む。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＨＣＶ標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を含み、ＨＣＶ標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部にかなり類似したヌクレオチド配列を含むセンス領域を更に含む。別の実施形態においては、アンチセンス領域とセンス領域は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを各々含む。アンチセンス領域は、センス領域のヌクレオチドに相補的である少なくとも約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを含む。一実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、少なくとも２個の（例えば、２、３、４、５個又はそれを超える）異なる化学修飾、例えば、ヌクレオチドの糖、塩基又は骨格の種々の修飾を含む。ＨＣＶ標的遺伝子は、例えば、本明細書で言及する配列、又は参照により本明細書に組込む配列を含み得る。別の実施形態においては、ｓｉＮＡは二本鎖核酸分子であり、ｓｉＮＡ分子の２本の鎖の各々は、約１５から約４０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、２３、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０）ヌクレオチドを独立に含み、ｓｉＮＡ分子の鎖の１本は、ＨＣＶ標的遺伝子の核酸配列又はその一部に相補的である少なくとも約１５（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５又はそれを超える）ヌクレオチドを含む。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、センス領域及びアンチセンス領域を含み、アンチセンス領域は、ＨＣＶ標的遺伝子によってコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、アンチセンス領域に相補的であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は、２個の別々のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられ、第１の断片はセンス領域を含み、第２の断片はｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。別の実施形態においては、センス領域は、リンカー分子を介してアンチセンス領域と連結されている。別の実施形態においては、センス領域は、ヌクレオチド、非ヌクレオチドリンカーなどのリンカー分子を介してアンチセンス領域と連結されている。一実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、少なくとも２個の（例えば、２、３、４、５個又はそれを超える）異なる化学修飾、例えば、ヌクレオチドの糖、塩基又は骨格の種々の修飾を含む。ＨＣＶ標的遺伝子は、例えば、本明細書で言及する配列、又は参照により本明細書に組込む配列を含み得る。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１個以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個又はそれを超える）２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジン修飾を含む（例えば、ｓｉＮＡの１個以上又は全部のピリミジン（例えば、Ｕ又はＣ）位置が２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで修飾されている。）。一実施形態においては、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジン修飾は、センス鎖中に存在する。一実施形態においては、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジン修飾は、アンチセンス鎖中に存在する。一実施形態においては、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジン修飾は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖中とアンチセンス鎖中の両方に存在する。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１個以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個又はそれを超える）２’−Ｏ−メチルプリン修飾を含む（例えば、ｓｉＮＡの１個以上又は全部のプリン（例えば、Ａ又はＧ）位置が２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで修飾されている。）。一実施形態においては、２’−Ｏ−メチルプリン修飾は、センス鎖中に存在する。一実施形態においては、２’−Ｏ−メチルプリン修飾は、アンチセンス鎖中に存在する。一実施形態においては、２’−Ｏ−メチルプリン修飾は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖中とアンチセンス鎖中の両方に存在する。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１個以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個又はそれを超える）２’−デオキシプリン修飾を含む（例えば、ｓｉＮＡの１個以上又は全部のプリン（例えば、Ａ又はＧ）位置が２’−デオキシヌクレオチドで修飾されている。）。一実施形態においては、２’−デオキシプリン修飾は、センス鎖中に存在する。一実施形態においては、２’−デオキシプリン修飾は、アンチセンス鎖中に存在する。一実施形態においては、２’−デオキシプリン修飾は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖中とアンチセンス鎖中の両方に存在する。

一実施形態においては、本発明は、センス領域とアンチセンス領域を含み、ＨＣＶ標的遺伝子の発現を下方制御する、又はＨＣＶ標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域は、ＨＣＶ標的遺伝子によってコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、アンチセンス領域に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ｓｉＮＡ分子は、１個以上の修飾ピリミジン及び／又はプリンヌクレオチドを有する。一実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、少なくとも２個の（例えば、２、３、４、５個又はそれを超える）異なる化学修飾、例えば、ヌクレオチドの糖、塩基又は骨格の種々の修飾を含む。一実施形態においては、センス領域中のピリミジンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチド又は２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域中に存在するプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の実施形態においては、センス領域中のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域中に存在するプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。別の実施形態においては、センス領域中のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域中に存在するプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。一実施形態においては、アンチセンス領域中のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス領域中に存在するプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル又は２’−デオキシプリンヌクレオチドである。上記ｓｉＮＡ分子のいずれかの別の実施形態においては、センス鎖の非相補領域（例えば、オーバーハング領域）中に存在する任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。

一実施形態においては、本発明は、ＨＣＶ標的遺伝子の発現を下方制御する、又はＨＣＶ標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は、２個の別々のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられ、第１の断片はセンス領域を含み、第２の断片はｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。センス領域を含む断片は、断片の５’末端に、３’末端に、又は５’末端と３’末端の両方に、末端キャップ部分を含む。一実施形態においては、末端キャップ部分は、反転デオキシ脱塩基部分又はグリセリル部分である。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の２個の断片の各々は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを独立に含む。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の２個の断片の各々は、約１５から約４０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、２３、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０）ヌクレオチドを独立に含む。非限定的例においては、ｓｉＮＡ分子の２個の断片の各々は、約２１ヌクレオチドを含む。

一実施形態においては、本発明は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、又は本明細書及び参照により本明細書に組込む２００４年１１月５日に出願された米国特許出願第１０／９８１，９６６号に記載の任意の他の修飾ヌクレオシド／ヌクレオチドである。一実施形態においては、本発明は、少なくとも２個の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、又は本明細書及び参照により本明細書に組込む２００４年１１月５日に出願された米国特許出願第１０／９８１，９６６号に記載の任意の他の修飾ヌクレオシド／ヌクレオチドからなる群から選択される。修飾ヌクレオチド／ヌクレオシドは、同じでも、異なっていてもよい。ｓｉＮＡは、例えば、約１５から約４０ヌクレオチド長であり得る。一実施形態においては、ｓｉＮＡ中に存在する全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオピリミジンヌクレオチドである。

一実施形態においては、本発明は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドをｓｉＮＡ分子中に導入することを含む、リボヌクレアーゼによる切断に対するｓｉＮＡ分子の安定性を増大させる方法を特徴とする。ここで、修飾ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。一実施形態においては、ｓｉＮＡ中に存在する全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。

一実施形態においては、ｓｉＮＡ中の修飾ヌクレオチドは、少なくとも１個の２’−デオキシ−２’−フルオロシチジン又は２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ中の修飾ヌクレオチドは、少なくとも１個の２’−フルオロシチジン及び少なくとも１個の２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。一実施形態においては、ｓｉＮＡ中に存在する全ウリジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドである。一実施形態においては、ｓｉＮＡ中に存在する全シチジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンヌクレオチドである。一実施形態においては、ｓｉＮＡ中に存在する全アデノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンヌクレオチドである。一実施形態においては、ｓｉＮＡ中に存在する全グアノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンヌクレオチドである。ＳｉＮＡは、ホスホロチオアート結合などの少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合を更に含み得る。一実施形態においては、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチドを有する場所など、リボヌクレアーゼによる切断に敏感である、ｓｉＮＡ中の特に選択された場所に存在する。

一実施形態においては、本発明は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドをｓｉＮＡ分子中に導入することを含む、リボヌクレアーゼによる切断に対するｓｉＮＡ分子の安定性を増大させる方法を特徴とする。ここで、修飾ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチドである。一実施形態においては、ｓｉＮＡ中に存在する全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノピリミジンヌクレオチドである。一実施形態においては、ｓｉＮＡ中の修飾ヌクレオチドは、少なくとも１個の２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノシチジン又は２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノウリジンヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ中の修飾ヌクレオチドは、少なくとも１個の２’−フルオロシチジン及び少なくとも１個の２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノウリジンヌクレオチドを含む。一実施形態においては、ｓｉＮＡ中に存在する全ウリジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノウリジンヌクレオチドである。一実施形態においては、ｓｉＮＡ中に存在する全シチジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノシチジンヌクレオチドである。一実施形態においては、ｓｉＮＡ中に存在する全アデノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノアデノシンヌクレオチドである。一実施形態においては、ｓｉＮＡ中に存在する全グアノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノグアノシンヌクレオチドである。ＳｉＮＡは、ホスホロチオアート結合などの少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合を更に含み得る。一実施形態においては、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチドを有する場所など、リボヌクレアーゼによる切断に敏感である、ｓｉＮＡ中の特に選択された場所に存在する。

一実施形態においては、本発明は、センス領域とアンチセンス領域を含み、ＨＣＶ標的遺伝子の発現を下方制御する、又はＨＣＶ標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域は、ＨＣＶ標的遺伝子によってコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、アンチセンス領域に相補的であるヌクレオチド配列を含む。アンチセンス領域中に存在するプリンヌクレオチドは、２’−デオキシ−プリンヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、アンチセンス領域中に存在するプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドを含む。上記実施形態のいずれにおいても、アンチセンス領域は、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合をアンチセンス領域の３’末端に含み得る。或いは、上記実施形態のいずれにおいても、アンチセンス領域は、グリセリル修飾をアンチセンス領域の３’末端に含み得る。上記ｓｉＮＡ分子のいずれかの別の実施形態においては、アンチセンス鎖の非相補領域（例えば、オーバーハング領域）中に存在する任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、疾患又は形質特異的対立遺伝子に関連した一塩基多型（ＳＮＰ）を含む配列など、対象又は生物体における特定の疾患又は形質に関係する対立遺伝子に特有の配列を有する内因性転写物の一部に相補的である配列を含む。したがって、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、特定の対立遺伝子に特有な配列であって、疾患、症状又は形質に関係する対立遺伝子に対して選択的なＲＮＡｉを媒介する特異性をもたらす配列に相補的である配列を含み得る。

一実施形態においては、本発明は、ＨＣＶ標的遺伝子の発現を下方制御する、又はＨＣＶ標的ＲＮＡの切断を誘導する、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は、２個の別々のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられ、第１の断片はセンス領域を含み、第２の断片はｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。一実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約２１ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の各断片の約１９ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補ヌクレオチドと塩基対を形成し、ｓｉＮＡ分子の各断片の少なくとも２個の３’末端ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の断片のヌクレオチドと塩基対を形成しない。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は二本鎖核酸分子であり、各鎖は約１９ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の各断片のヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補ヌクレオチドと塩基対を形成して、少なくとも約１５（例えば、１５、１６、１７、１８又は１９）塩基対を形成し、ｓｉＮＡ分子の一方又は両方の末端は平滑末端である。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の各断片の２個の３’末端ヌクレオチドの各々は、２’−デオキシ−チミジンなどの２’−デオキシ−ピリミジンヌクレオチドである。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の各断片の２個の３’末端ヌクレオチドの各々は、２’−Ｏ−メチルウリジン、シチジン、チミジンなどの２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の各断片の全ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補ヌクレオチドと塩基対を形成する。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は、センス領域及びアンチセンス領域を有する、約１９から約２５塩基対の二本鎖核酸分子であり、アンチセンス領域の約１９ヌクレオチドは、ＨＣＶ標的遺伝子によってコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対を形成する。別の実施形態においては、アンチセンス領域の約２１ヌクレオチドは、ＨＣＶ標的遺伝子によってコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対を形成する。上記実施形態のいずれにおいても、前記アンチセンス領域を含む断片の５’末端は、リン酸基を含んでいてもよい。

一実施形態においては、本発明は、ＨＣＶ標的ＲＮＡ配列の発現を阻害する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まず、二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１５から約３０ヌクレオチドである。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は２１ヌクレオチド長である。非リボヌクレオチド含有ｓｉＮＡ構築体の例は、Ｓｔａｂ ７／８、Ｓｔａｂ ７／１１、Ｓｔａｂ ８／８、Ｓｔａｂ １８／８、Ｓｔａｂ １８／１１、Ｓｔａｂ １２／１３、Ｓｔａｂ ７／１３、Ｓｔａｂ １８／１３、Ｓｔａｂ ７／１９、Ｓｔａｂ ８／１９、Ｓｔａｂ １８／１９、Ｓｔａｂ ７／２０、Ｓｔａｂ ８／２０、Ｓｔａｂ １８／２０、Ｓｔａｂ ７／３２、Ｓｔａｂ ８／３２、Ｓｔａｂ １８／３２など、センス／アンチセンスケミストリーの任意の組合せの表ＩＶに示す安定化ケミストリーの組合せである（例えば、Ｓｔａｂ ７、８、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０又は３２のセンス若しくはアンチセンス鎖又はその任意の組合せを有する任意のｓｉＮＡ）。本明細書では、数字で表したＳｔａｂケミストリーは、表ＩＶに示すケミストリーの２’−フルオロと２’−ＯＣＦ３の両方のバージョンを含み得る。例えば、「Ｓｔａｂ ７／８」は、Ｓｔａｂ ７／８とＳｔａｂ ７Ｆ／８Ｆの両方を指す。一実施形態においては、本発明は、ＲＮＡ干渉によるＨＣＶ標的ＲＮＡの切断を誘導する、化学合成された二本鎖ＲＮＡ分子を特徴とする。ここで、前記ＲＮＡ分子の各鎖は約１５から約３０ヌクレオチド長である。ＲＮＡ分子の一方の鎖は、ＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉によってＨＣＶ標的ＲＮＡの切断を誘導するのに十分な相補性を、ＨＣＶ標的ＲＮＡに対して有するヌクレオチド配列を含む。ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、デオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチドなど、又はその任意の組合せなど、ただしこれらだけに限定されない、本明細書に記載の１個以上の化学修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。

一実施形態においては、本発明のＨＣＶ標的ＲＮＡは、ＨＣＶタンパク質又はＨＣＶ経路／宿主タンパク質をコードする、ＨＣＶ ＲＮＡ又はＨＣＶ経路／宿主ＲＮＡなど、タンパク質をコードする配列を含む。

一実施形態においては、本発明の標的ＲＮＡは、非コードＲＮＡ配列（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなど）を含む。例えば、Ｍａｔｔｉｃｋ， ２００５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０９， １５２７−１５２８；Ｃｌａｖｅｒｉｅ， ２００５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０９， １５２９−１５３０；Ｓｅｔｈｕｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．， ２００６， ＲＮＡ， １２， １９２−１９７及びＣｚｅｃｈ， ２００６ ＮＥＪＭ， ３５４， １１：１１９４−１１９５を参照されたい。

一実施形態においては、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子を含む医薬品を特徴とする。

一実施形態においては、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子を含む活性成分を特徴とする。

一実施形態においては、本発明は、ＨＣＶ標的遺伝子の発現を阻害する、下方制御する、又は減少させるための二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子の使用を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は１個以上の化学修飾を含み、二本鎖ｓｉＮＡの各鎖は独立に約１５から約３０又はそれを超える（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０又はそれを超える）ヌクレオチド長である。一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１個以上の化学修飾を含む二本鎖核酸分子であり、ｓｉＮＡ分子の２個の断片の各々は、約１５から約４０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、２３、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０）ヌクレオチドを独立に含み、鎖の１本は、ＨＣＶ標的コードＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的である少なくとも１５ヌクレオチドを含む。非限定的例においては、ｓｉＮＡ分子の２個の断片の各々は、約２１ヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は、１個以上の化学修飾を含む二本鎖核酸分子であり、各鎖は約２１ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の各断片の約１９ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補ヌクレオチドと塩基対を形成し、ｓｉＮＡ分子の各断片の少なくとも２個の３’末端ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の断片のヌクレオチドと塩基対を形成しない。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は、１個以上の化学修飾を含む二本鎖核酸分子であり、各鎖は約１９ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の各断片のヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補ヌクレオチドと塩基対を形成して、少なくとも約１５（例えば、１５、１６、１７、１８又は１９）塩基対を形成し、ｓｉＮＡ分子の一方又は両方の末端は平滑末端である。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の各断片の２個の３’末端ヌクレオチドの各々は、２’−デオキシ−チミジンなどの２’−デオキシ−ピリミジンヌクレオチドである。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の各断片の２個の３’末端ヌクレオチドの各々は、２’−Ｏ−メチルウリジン、シチジン、チミジンなどの２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の各断片の全ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補ヌクレオチドと塩基対を形成する。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は、センス領域及びアンチセンス領域を有し、かつ、１個以上の化学修飾を含む、約１９から約２５塩基対の二本鎖核酸分子であり、アンチセンス領域の約１９ヌクレオチドは、ＨＣＶ標的遺伝子によってコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対を形成する。別の実施形態においては、アンチセンス領域の約２１ヌクレオチドは、ＨＣＶ標的遺伝子によってコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対を形成する。上記実施形態のいずれにおいても、前記アンチセンス領域を含む断片の５’末端は、リン酸基を含んでいてもよい。

一実施形態においては、本発明は、ＨＣＶ標的遺伝子の発現を阻害する、下方制御する、又は減少させる、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は、ＨＣＶ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、他方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖である。一実施形態においては、各鎖は、ヌクレオチド、糖、塩基、骨格修飾などの同じでも、異なっていてもよい、少なくとも２個の（例えば、２、３、４、５個又はそれを超える）化学修飾を有する。一実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するピリミジンヌクレオチドの大多数は、糖修飾を含む。一実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するプリンヌクレオチドの大多数は、糖修飾を含む。

一実施形態においては、本発明は、ＨＣＶ標的遺伝子の発現を阻害する、下方制御する、又は減少させる、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は、タンパク質をコードするＨＣＶ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、他方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり、二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するピリミジンヌクレオチドの大多数は、糖修飾を含む。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１５から約３０個又はそれを超える（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０個又はそれを超える）ヌクレオチドを含み、他方の鎖のヌクレオチドに相補的である少なくとも約１５ヌクレオチドを含む。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は、２個のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられ、第１の断片はｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、第２の断片はｓｉＮＡ分子のセンス領域のヌクレオチド配列を含む。一実施形態においては、センス鎖は、ポリヌクレオチドリンカー、非ヌクレオチドリンカーなどのリンカー分子を介して、アンチセンス鎖と連結されている。更なる実施形態においては、センス鎖中に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域中に存在するプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の実施形態においては、センス鎖中に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域中に存在するプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。更に別の実施形態においては、アンチセンス鎖中に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の実施形態においては、アンチセンス鎖は、１個以上の２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド及び１個以上の２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、アンチセンス鎖中に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。更なる実施形態においては、センス鎖は、３’末端及び５’末端を含み、末端キャップ部分（例えば、反転チミジンなどの反転デオキシ脱塩基部分又は反転デオキシヌクレオチド部分）は、センス鎖の５’末端、３’末端、又は５’末端と３’末端の両方に存在する。別の実施形態においては、アンチセンス鎖は、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合をアンチセンス鎖の３’末端に含む。別の実施形態においては、アンチセンス鎖は、グリセリル修飾を３’末端に含む。別の実施形態においては、アンチセンス鎖の５’末端は、リン酸基を含んでいてもよい。

二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するピリミジンヌクレオチドの大多数が糖修飾を含む、ＨＣＶ標的遺伝子の発現を阻害する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子の上記実施形態のいずれにおいても、ｓｉＮＡ分子の２本の鎖の各々は、約１５から約３０個又はそれを超える（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０個又はそれを超える）ヌクレオチドを含み得る。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の各鎖の約１５から約３０個又はそれを超える（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０個又はそれを超える）ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の鎖の相補ヌクレオチドと塩基対を形成する。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の各鎖の約１５から約３０個又はそれを超える（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０個又はそれを超える）ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の鎖の相補ヌクレオチドと塩基対を形成する。ここで、ｓｉＮＡ分子の各鎖の少なくとも２個の３’末端ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成しない。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の各断片の２個の３’末端ヌクレオチドの各々は、２’−デオキシ−チミジンなどの２’−デオキシ−ピリミジンである。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の各鎖は、ｓｉＮＡ分子の他方の鎖の相補ヌクレオチドと塩基対を形成する。一実施形態においては、アンチセンス鎖の約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドは、ＨＣＶ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対を形成する。一実施形態においては、アンチセンス鎖の約１８から約２５（例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）ヌクレオチドは、ＨＣＶ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対を形成する。

一実施形態においては、本発明は、ＨＣＶ標的遺伝子の発現を阻害する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は、ＨＣＶ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、他方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖である。一実施形態においては、各鎖は、ヌクレオチドの糖、塩基、骨格修飾などの少なくとも２個の（例えば、２、３、４、５個又はそれを超える）異なる化学修飾を有する。一実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するピリミジンヌクレオチドの大多数は、糖修飾を含む。一実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するプリンヌクレオチドの大多数は、糖修飾を含む。一実施形態においては、アンチセンス鎖の５’末端は、リン酸基を含んでいてもよい。

一実施形態においては、本発明は、ＨＣＶ標的遺伝子の発現を阻害する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は、ＨＣＶ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、他方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖である。二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するピリミジンヌクレオチドの大多数は、糖修飾を含む。アンチセンス鎖のヌクレオチド配列又はその一部は、ＨＣＶ標的ＲＮＡの非翻訳領域のヌクレオチド配列又はその一部に相補的である。

一実施形態においては、本発明は、ＨＣＶ標的遺伝子の発現を阻害する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は、ＨＣＶ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、他方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖である。二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するピリミジンヌクレオチドの大多数は、糖修飾を含む。アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ＨＣＶ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列、又はＨＣＶ標的ＲＮＡ中に存在するその一部に相補的である。

一実施形態においては、本発明は、薬剤として許容される担体又は希釈剤中に本発明のｓｉＮＡ分子を含む組成物を特徴とする。別の実施形態においては、本発明は、薬剤として許容される担体又は希釈剤中の、本発明の２種類以上のｓｉＮＡ分子（例えば、ＨＣＶ標的ＲＮＡの異なる領域を標的にするｓｉＮＡ分子、又はＨＣＶ ＲＮＡ及び細胞標的を標的にするｓｉＮＡ分子）を特徴とする。

非限定的例においては、化学修飾ヌクレオチドを核酸分子に導入することは、外来的に送達される未変性ＲＮＡ分子に固有のインビボでの安定性及び生物学的利用能の潜在的限界を克服する強力なツールとなる。例えば、化学修飾核酸分子を使用すると、化学修飾核酸分子は、血清中でより長い半減期を有する傾向にあるので、所与の治療効果に対する特定の核酸分子の用量を削減することができる。また、ある種の化学修飾は、特定の細胞又は組織をＨＣＶ標的にすることによって、及び／又は核酸分子の細胞内取り込みを改善することによって、核酸分子の生物学的利用能を改善することができる。したがって、化学修飾核酸分子の活性が、未変性核酸分子と比較して、例えば、全ＲＮＡ（ａｌｌ−ＲＮＡ）核酸分子と比較して、低い場合でも、分子の安定性及び／又は送達が改善されたために、修飾核酸分子の全活性は、未変性分子の全活性よりも高くなり得る。未変性無修飾ｓｉＮＡとは異なり、化学修飾ｓｉＮＡは、ヒトにおけるインターフェロン活性又は免疫賦活を活性化する可能性も最小化し得る。したがって、これらの諸性質は、研究と治療の両方の適用分野における使用を含めて、種々のインビトロ及びインビボの環境において、未変性ｓｉＲＮＡ又は最小限に修飾されたｓｉＲＮＡがＲＮＡｉを媒介する能力を更に改善する。本出願人は、対応する無修飾ｓｉＲＮＡ分子又は最小限に修飾されたｓｉＲＮＡ分子よりもＲＮＡｉ活性が改善された化学修飾ｓｉＮＡ分子を本明細書に記述する。本明細書に開示する化学修飾ｓｉＮＡモチーフは、無修飾活性ｓｉＲＮＡ又は最小限に修飾された活性ｓｉＲＮＡにかなり類似したＲＮＡｉ活性を維持する能力を提供し（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１， ＥＭＢＯ Ｊ．， ２０：６８７７−６８８８参照）、同時に治療への応用に適切なヌクレアーゼ耐性及び薬物動態学的（ｐｈａｒｍａｃｏｋｅｔｉｃ）諸性質を提供する。

本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合を前記アンチセンス領域の３’末端に含み得る。本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、アンチセンス領域は、約１から約５個のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を前記アンチセンス領域の５’末端に含み得る。本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、本発明のｓｉＮＡ分子の３’末端ヌクレオチドオーバーハングは、核酸の糖、塩基又は骨格において化学修飾されたリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含み得る。本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、３’末端ヌクレオチドオーバーハングは、１個以上の汎用塩基リボヌクレオチドを含み得る。本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、３’末端ヌクレオチドオーバーハングは、１個以上の非環式ヌクレオチドを含み得る。

本発明の一実施形態は、核酸分子の発現が可能であるように、本発明の少なくとも１種類のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含む、発現ベクターを提供する。本発明の別の実施形態は、かかる発現ベクターを含むほ乳動物細胞を提供する。ほ乳動物細胞は、ヒト細胞であり得る。発現ベクターのｓｉＮＡ分子は、センス領域及びアンチセンス領域を含み得る。アンチセンス領域は、ＨＣＶ標的をコードするＲＮＡ又はＤＮＡ配列に相補的である配列を含み得る。センス領域は、アンチセンス領域に相補的である配列を含み得る。ｓｉＮＡ分子は、相補センス領域とアンチセンス領域を有する２本の異なる鎖を含み得る。ｓｉＮＡ分子は、相補センス領域とアンチセンス領域を有する一本鎖を含み得る。

一実施形態においては、本発明は、細胞内で、又は再構成されたインビトロ系内で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、化学修飾は、骨格が修飾された式Ｉのヌクレオチド間結合を含む１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）ヌクレオチドを含む。

式中、各Ｒ１及びＲ２は独立に、天然でも、化学修飾されていてもよい、ｓｉＮＡ分子構造に含まれ得る、又はｓｉＮＡ分子との結合点として役立ち得る、任意のヌクレオチド、非ヌクレオチド又はポリヌクレオチドであり、各Ｘ及びＹは独立にＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル又は置換アルキルであり、各Ｚ及びＷは独立にＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アルカリール、アラルキル又はアセチルであり、Ｗ、Ｘ、Ｙ及びＺは全部がＯとは限らない。別の実施形態においては、本発明の骨格修飾は、ホスホノアセタート及び／又はチオホスホノアセタートヌクレオチド間結合を含む（例えば、Ｓｈｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３１， ４１０９−４１１８参照）。

例えば任意のＺ、Ｗ、Ｘ及び／又はＹが硫黄原子を独立に含む、式Ｉの化学修飾ヌクレオチド間結合は、ｓｉＮＡ二本鎖の一方又は両方のオリゴヌクレオチド鎖中に、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖中に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、式Ｉの１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）化学修飾ヌクレオチド間結合を、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含み得る。例えば、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、式Ｉの約１から約５個又はそれを超える（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超える）化学修飾ヌクレオチド間結合を、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の５’末端に含み得る。別の非限定的例においては、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、式Ｉの化学修飾ヌクレオチド間結合を有する１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）ピリミジンヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖に含み得る。更に別の非限定的例においては、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、式Ｉの化学修飾ヌクレオチド間結合を有する１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）プリンヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖に含み得る。別の実施形態においては、式Ｉのヌクレオチド間結合を有する本発明のｓｉＮＡ分子は、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドも含む。

一実施形態においては、本発明は、細胞内で、又は再構成されたインビトロ系内で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、化学修飾は、式ＩＩの１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含む。

式中、各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は独立に、いずれもｓｉＮＡ分子の構造に含まれ得る、又はｓｉＮＡ分子との結合点として役立ち得る、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリール若しくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキル（ａｌｋｌｙｌ）アミノ、置換シリル、又は式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及び／又はＶＩＩのいずれかの基であり、Ｒ９は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ又はＣＦ２であり、Ｂは、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、２−アミノアデノシン、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリンなどのヌクレオシド塩基、又は標的ＲＮＡに相補的でも、非相補的でもよい任意の他の非天然塩基、又はフェニル、ナフチル、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ネブラリン、ピリドン、ピリジノンなどの非ヌクレオシド塩基、又は標的ＲＮＡに相補的でも、非相補的でもよい任意の他の非天然汎用塩基である。一実施形態においては、Ｒ３及び／又はＲ７は、抱合部分及びリンカー（例えば、本明細書に記載の、又は当分野で公知の、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）を含む。抱合部分の非限定的例としては、天然タンパク質リガンド由来のペプチドなどの細胞受容体のリガンド；細胞のＺＩＰコード配列を含めたタンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；葉酸塩、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどのビタミン及び他の補因子；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー；リン脂質；コレステロール；ステロイド及びＰＥＩ、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミンが挙げられる。一実施形態においては、本発明の式ＩＩのヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。一実施形態においては、本発明の式ＩＩのヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。一実施形態においては、本発明の式ＩＩのヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。

式ＩＩの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ二本鎖の一方又は両方のオリゴヌクレオチド鎖中に、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖中に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、式ＩＩの１個以上の化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含み得る。例えば、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、式ＩＩの約１から約５個又はそれを超える（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超える）化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の５’末端に含み得る。別の非限定的例においては、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、約１から約５個又はそれを超える（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超える）式ＩＩの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端に含み得る。

一実施形態においては、本発明は、細胞内で、又は再構成されたインビトロ系内で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、化学修飾は、式ＩＩＩの１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含む。

式中、各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は独立に、いずれもｓｉＮＡ分子の構造に含まれ得る、又はｓｉＮＡ分子との結合点として役立ち得る、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリール若しくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキル（ａｌｋｌｙｌ）アミノ、置換シリル、又は式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及び／又はＶＩＩのいずれかの基であり、Ｒ９は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ又はＣＦ２であり、Ｂは、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、２−アミノアデノシン、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリンなどのヌクレオシド塩基、又は標的ＲＮＡに相補的又は非相補的であるように使用することができる任意の他の非天然塩基、又はフェニル、ナフチル、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ネブラリン、ピリドン、ピリジノンなどの非ヌクレオシド塩基、又は標的ＲＮＡに相補的でも、非相補的でもよい任意の他の非天然汎用塩基である。一実施形態においては、Ｒ３及び／又はＲ７は、抱合部分及びリンカー（例えば、本明細書に記載の、又は当分野で公知の、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）を含む。抱合部分の非限定的例としては、天然タンパク質リガンド由来のペプチドなどの細胞受容体のリガンド；細胞のＺＩＰコード配列を含めたタンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；葉酸塩、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどのビタミン及び他の補因子；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー；リン脂質；コレステロール；ステロイド及びＰＥＩ、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミンが挙げられる。

式ＩＩＩの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ二本鎖の一方又は両方のオリゴヌクレオチド鎖中に、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖中に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、式ＩＩＩの１個以上の化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含み得る。例えば、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、式ＩＩＩの約１から約５個又はそれを超える（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超える）化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の５’末端に含み得る。別の非限定的例においては、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、約１から約５個又はそれを超える（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超える）式ＩＩＩの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端に含み得る。

別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、式ＩＩ又はＩＩＩのヌクレオチドを含む。ここで、式ＩＩ又はＩＩＩのヌクレオチドは、反転した配置である。例えば、式ＩＩ又はＩＩＩのヌクレオチドは、一方又は両方のｓｉＮＡ鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端と５’末端の両方においてなど、３’−３’、３’−２’、２’−３’又は５’−５’配置でｓｉＮＡ構築体に連結されている。

一実施形態においては、本発明は、細胞内で、又は再構成されたインビトロ系内で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、化学修飾は、式ＩＶの５’末端リン酸基を含む。

式中、各Ｘ及びＹは独立にＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル又はアルキルハロであり、各Ｚ及びＷは独立にＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アルカリール、アラルキル、アルキルハロ又はアセチルであり、Ｗ、Ｘ、Ｙ及びＺは全部がＯとは限らず、ＹはｓｉＮＡ分子との結合点として役立つ。

一実施形態においては、本発明は、ＨＣＶ標的に相補的である鎖上に、例えば、ＨＣＶ標的ＲＮＡに相補的である鎖上に、式ＩＶの５’末端リン酸基を有するｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は、全ＲＮＡ ｓｉＮＡ分子を含む。別の実施形態においては、本発明は、ＨＣＶ標的に相補的である鎖上に式ＩＶの５’末端リン酸基を有するｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は、一方又は両方の鎖の３’末端上に、約１から約４（例えば、約１、２、３又は４）個のデオキシリボヌクレオチドを有する、約１から約３（例えば、約１、２又は３）ヌクレオチド３’末端ヌクレオチドオーバーハングも含む。別の実施形態においては、式ＩＶの５’末端リン酸基は、本発明のｓｉＮＡ分子の、例えば、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの化学修飾を有するｓｉＮＡ分子の、ＨＣＶ標的に相補的である鎖上に存在する。

一実施形態においては、本発明は、細胞内で、又は再構成されたインビトロ系内で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、化学修飾は、１個以上のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含む。例えば、非限定的例においては、本発明は、１本のｓｉＮＡ鎖中に約１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合を有する化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。更に別の実施形態においては、本発明は、両方のｓｉＮＡ鎖中に約１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合を個々に有する化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。ホスホロチオアートヌクレオチド間結合は、ｓｉＮＡ二本鎖の一方又は両方のオリゴヌクレオチド鎖中に、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖中に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、１個以上のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含み得る。例えば、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、約１から約５個又はそれを超える（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超える）連続したホスホロチオアートヌクレオチド間結合を、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の５’末端に含み得る。別の非限定的例においては、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）ピリミジンホスホロチオアートヌクレオチド間結合を、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖中に含み得る。更に別の非限定的例においては、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）プリンホスホロチオアートヌクレオチド間結合を、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖中に含み得る。

二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、異なる化学修飾パターンを含むように、１個以上の化学修飾を有し得る。異なる修飾パターンを生じ得る修飾スキームの幾つかの非限定的例を本明細書に示す。

一実施形態においては、本発明は、センス鎖が、１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、及び／又は約１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）汎用塩基修飾ヌクレオチドを含み、末端キャップ分子をセンス鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含んでいてもよく、アンチセンス鎖が、約１から約１０又はそれを超える、具体的には約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）汎用塩基修飾ヌクレオチドを含み、末端キャップ分子をアンチセンス鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含んでいてもよい、ｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の実施形態においては、センス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾されている。１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は３’末端、５’末端、又は３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子は、同じ鎖又は異なる鎖中に、存在しても、しなくてもよい。

別の実施形態においては、本発明は、センス鎖が、約１から約５個、具体的には約１、２、３、４又は５個のホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超える）２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超える）汎用塩基修飾ヌクレオチドを含み、末端キャップ分子をセンス鎖の３末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含んでいてもよく、アンチセンス鎖が、約１から約５又はそれを超える、具体的には約１、２、３、４、５個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）汎用塩基修飾ヌクレオチドを含み、末端キャップ分子をアンチセンス鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含んでいてもよい、ｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の実施形態においては、センス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾されている。約１から約５個又はそれを超える、例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は３’末端、５’末端、又は３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子は、同じ鎖又は異なる鎖中に、存在しても、しなくてもよい。

一実施形態においては、本発明は、センス鎖が、１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は約１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）汎用塩基修飾ヌクレオチドを含み、末端キャップ分子をセンス鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含んでいてもよく、アンチセンス鎖が、約１から約１０個又はそれを超える、具体的には約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）汎用塩基修飾ヌクレオチドを含み、末端キャップ分子をアンチセンス鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含んでいてもよい、ｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の実施形態においては、センス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾されている。１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は３’末端、５’末端、又は３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子は、同じ鎖又は異なる鎖中に、存在しても、しなくてもよい。

別の実施形態においては、本発明は、ここで、センス鎖が、約１から約５又はそれを超える、具体的には約１、２、３、４、５個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）汎用塩基修飾ヌクレオチドを含み、末端キャップ分子をセンス鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含んでいてもよく、アンチセンス鎖が、約１から約５個又はそれを超える、具体的には約１、２、３、４、５個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）汎用塩基修飾ヌクレオチドを含み、末端キャップ分子をアンチセンス鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含んでいてもよい、ｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の実施形態においては、センス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾されている。約１から約５個、例えば、約１、２、３、４、５個又はそれを超えるホスホロチオアートヌクレオチド間結合、及び／又は３’末端、５’末端、又は３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子は、同じ鎖又は異なる鎖中に、存在しても、しなくてもよい。

一実施形態においては、本発明は、約１から約５個又はそれを超える（具体的には約１、２、３、４、５個又はそれを超える）ホスホロチオアートヌクレオチド間結合をｓｉＮＡ分子の各鎖中に有する化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。

別の実施形態においては、本発明は、２’−５’ヌクレオチド間結合を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。２’−５’ヌクレオチド間結合は、一方又は両方のｓｉＮＡ配列鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に存在し得る。また、２’−５’ヌクレオチド間結合は、一方又は両方のｓｉＮＡ配列鎖内の種々の他の位置に存在し得る。例えば、ｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖中のピリミジンヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間結合を含めて、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるヌクレオチド間結合は、２’−５’ヌクレオチド間結合を含み得る。又はｓｉＮＡ分子の一方若しくは両方の鎖中のプリンヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間結合を含めて、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個若しくはそれを超えるヌクレオチド間結合は、２’−５’ヌクレオチド間結合を含み得る。

別の実施形態においては、本発明の化学修飾ｓｉＮＡ分子は、その一方又は両方が化学修飾され得る２本の鎖を有する二本鎖を含む。ここで、各鎖は独立に約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチド長であり、二本鎖は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）個の塩基対を有し、化学修飾は式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を含む。例えば、本発明の例示的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、その一方又は両方が式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの化学修飾又はその任意の組合せで化学修飾され得る２本の鎖を有する二本鎖を含む。ここで、各鎖は、２ヌクレオチド３’末端ヌクレオチドオーバーハングを各々有する、約２１ヌクレオチドからなり、二本鎖は約１９塩基対を有する。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、一本鎖ヘアピン構造を含み、該ｓｉＮＡは、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）個の塩基対を有する約３６から約７０（例えば、約３６、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７０）ヌクレオチド長であり、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を含む化学修飾又はその任意の組合せを含み得る。例えば、本発明の例示的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの化学修飾又はその任意の組合せで化学修飾された、約４２から約５０（例えば、約４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０）個のヌクレオチドを有する線状オリゴヌクレオチドを含む。ここで、線状オリゴヌクレオチドは、約１９から約２１（例えば、１９、２０又は２１）個の塩基対と２ヌクレオチド３’末端ヌクレオチドオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成する。別の実施形態においては、本発明の線状ヘアピンｓｉＮＡ分子は、ステムループモチーフを含み、ｓｉＮＡ分子のループ部分は生分解性である。例えば、本発明の線状ヘアピンｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のループ部分のインビボでの分解によって、約２個のヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチドオーバーハングなどの３’末端オーバーハングを有する二本鎖ｓｉＮＡ分子が生成し得るように設計される。

別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ヘアピン構造を含み、該ｓｉＮＡは、約３から約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）個の塩基対を有する、約２５から約５０（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０）ヌクレオチド長であり、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を含む１個以上の化学修飾又はその任意の組合せを含み得る。例えば、本発明の例示的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの１個以上の化学修飾又はその任意の組合せで化学修飾された、約２５から約３５（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５）個のヌクレオチドを有する、線状オリゴヌクレオチドを含む。ここで、線状オリゴヌクレオチドは、約３から約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）個の塩基対、及び本明細書に記載したとおりに化学修飾され得る５’末端リン酸基（例えば、式ＩＶの５’末端リン酸基）を有する、ヘアピン構造を形成する。別の実施形態においては、本発明の線状ヘアピンｓｉＮＡ分子は、ステムループモチーフを含み、ｓｉＮＡ分子のループ部分は生分解性である。一実施形態においては、本発明の線状ヘアピンｓｉＮＡ分子は、非ヌクレオチドリンカーを含むループ部分を含む。

別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、非対称ヘアピン構造を含み、該ｓｉＮＡは、約３から約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）個の塩基対を有する、約２５から約５０（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０）ヌクレオチド長であり、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を含む１個以上の化学修飾又はその任意の組合せを含み得る。例えば、本発明の例示的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの１個以上の化学修飾又はその任意の組合せで化学修飾された、約２５から約３５（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５）個のヌクレオチドを有する、線状オリゴヌクレオチドを含む。ここで、線状オリゴヌクレオチドは、約３から約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）個の塩基対、及び本明細書に記載したとおりに化学修飾され得る５’末端リン酸基（例えば、式ＩＶの５’末端リン酸基）を有する、非対称ヘアピン構造を形成する。一実施形態においては、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、ステムループモチーフを含み、ｓｉＮＡ分子のループ部分は生分解性である。別の実施形態においては、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、非ヌクレオチドリンカーを含むループ部分を含む。

別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、センス及びアンチセンス領域を含む別々のポリヌクレオチド鎖を有する非対称二本鎖構造を含み、アンチセンス領域は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチド長であり、センス領域は、約３から約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）ヌクレオチド長であり、センス領域及びアンチセンス領域は、少なくとも３個の相補ヌクレオチドを有し、ｓｉＮＡは、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を含む１個以上の化学修飾又はその任意の組合せを含み得る。例えば、本発明の例示的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、センス及びアンチセンス領域を含む別々のポリヌクレオチド鎖を有する非対称二本鎖構造を含み、アンチセンス領域は、約１８から約２３（例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、又は２３）ヌクレオチド長であり、センス領域は、約３から約１５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）ヌクレオチド長であり、センス領域アンチセンス領域は、少なくとも３個の相補ヌクレオチドを有し、ｓｉＮＡは、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を含む１個以上の化学修飾又はその任意の組合せを含み得る。別の実施形態においては、非対称二本鎖ｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載したとおりに化学修飾され得る５’末端リン酸基（例えば、式ＩＶの５’末端リン酸基）も有し得る。

別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、環状核酸分子を含み、該ｓｉＮＡは、約１５から約３０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個）の塩基対を有する約３８から約７０（例えば、約３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７０）ヌクレオチド長であり、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を含む化学修飾又はその任意の組合せを含み得る。例えば、本発明の例示的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの化学修飾又はその任意の組合せで化学修飾された、約４２から約５０（例えば、約４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０）個のヌクレオチドを有する環状オリゴヌクレオチドを含む。ここで、環状オリゴヌクレオチドは、約１９個の塩基対及び２個のループを有するダンベル状構造を形成する。

別の実施形態においては、本発明の環状ｓｉＮＡ分子は、２個のループモチーフを含み、ｓｉＮＡ分子の一方又は両方のループ部分は生分解性である。例えば、本発明の環状ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のループ部分のインビボでの分解によって、約２個のヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチドオーバーハングなどの３’末端オーバーハングを有する二本鎖ｓｉＮＡ分子が生成し得るように設計される。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、少なくとも１個の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）脱塩基部分、例えば、式Ｖの化合物を含む。

式中、各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は独立に、いずれもｓｉＮＡ分子の構造に含まれ得る、又はｓｉＮＡ分子との結合点として役立ち得る、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリール若しくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキル（ａｌｋｌｙｌ）アミノ、置換シリル、又は式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及び／又はＶＩＩのいずれかの基であり、Ｒ９は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ又はＣＦ２である。一実施形態においては、Ｒ３及び／又はＲ７は、抱合部分及びリンカー（例えば、本明細書に記載の、又は当分野で公知の、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）を含む。抱合部分の非限定的例としては、天然タンパク質リガンド由来のペプチドなどの細胞受容体のリガンド；細胞のＺＩＰコード配列を含めたタンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；葉酸塩、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどのビタミン及び他の補因子；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー；リン脂質；コレステロール；ステロイド及びＰＥＩ、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミンが挙げられる。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、少なくとも１個の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）反転脱塩基部分、例えば、式ＶＩの化合物を含む。

式中、各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は独立に、いずれもｓｉＮＡ分子の構造に含まれ得る、又はｓｉＮＡ分子との結合点として役立ち得る、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリール若しくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキル（ａｌｋｌｙｌ）アミノ、置換シリル、又は式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及び／又はＶＩＩのいずれかの基であり、Ｒ９は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ又はＣＦ２であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ８又はＲ１３は、本発明のｓｉＮＡ分子との結合点として役立つ。一実施形態においては、Ｒ３及び／又はＲ７は、抱合部分及びリンカー（例えば、本明細書に記載の、又は当分野で公知の、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）を含む。抱合部分の非限定的例としては、天然タンパク質リガンド由来のペプチドなどの細胞受容体のリガンド；細胞のＺＩＰコード配列を含めたタンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；葉酸塩、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどのビタミン及び他の補因子；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー；リン脂質；コレステロール；ステロイド及びＰＥＩ、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミンが挙げられる。

別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、少なくとも１個の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）置換ポリアルキル部分、例えば、式ＶＩＩの化合物を含む。

式中、各ｎは独立に整数１から１２であり、各Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は独立に、いずれもｓｉＮＡ分子の構造に含まれ得る、又はｓｉＮＡ分子との結合点として役立ち得る、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリール若しくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキル（ａｌｋｌｙｌ）アミノ、置換シリル、又は式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及び／又はＶＩＩのいずれかの基である。一実施形態においては、Ｒ３及び／又はＲ１は、抱合部分及びリンカー（例えば、本明細書に記載の、又は当分野で公知の、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）を含む。抱合部分の非限定的例としては、天然タンパク質リガンド由来のペプチドなどの細胞受容体のリガンド；細胞のＺＩＰコード配列を含めたタンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；葉酸塩、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどのビタミン及び他の補因子；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー；リン脂質；コレステロール；ステロイド及びＰＥＩ、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミンが挙げられる。

「ＺＩＰコード」配列とは、細胞のトポロジー形成シグナル伝達（ｔｏｐｏｇｅｎｉｃ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）によって媒介される輸送に関与する任意のペプチド又はタンパク質配列を意味する（例えば、Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０６（１５０１）：１５０５参照）。

二本鎖ｓｉＮＡ分子内の各ヌクレオチドは、式Ｉ−ＶＩＩＩのいずれかの構造を含む化学修飾を独立に有し得る。したがって、一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子の１個以上のヌクレオチド位置は、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を有する化学修飾、又は本明細書の任意の他の修飾を含む。一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子の各ヌクレオチド位置は、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を有する化学修飾、又は本明細書の任意の他の修飾を含む。

一実施形態においては、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖の１個以上のヌクレオチド位置は、式１−ＶＩＩのいずれかの構造を有する化学修飾、又は本明細書の任意の他の修飾を含む。一実施形態においては、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖の各ヌクレオチド位置は、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの構造を有する化学修飾、又は本明細書の任意の他の修飾を含む。

別の実施形態においては、本発明は、式ＶＩＩの化合物を特徴とする。ここで、Ｒ１及びＲ２はヒドロキシル（ＯＨ）基であり、ｎ＝１であり、Ｒ３は、Ｏを含み、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖の３’末端、５’末端、若しくは３’末端と５’末端の両方との、又は本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子との、結合点である。この修飾を本明細書では「グリセリル」と称する（例えば、図１０の修飾６）。

別の実施形態においては、本発明の化学修飾ヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩのいずれかの部分）は、本発明のｓｉＮＡ分子の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方にある。例えば、化学修飾ヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩの部分）は、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖とセンス鎖の両方の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に存在し得る。一実施形態においては、化学修飾ヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩの部分）は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端及び３’末端並びにアンチセンス鎖の３’末端に存在する。一実施形態においては、化学修飾ヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩの部分）は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端及び３’末端並びにアンチセンス鎖の３’末端の末端位置に存在する。一実施形態においては、化学修飾ヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩの部分）は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端及び３’末端並びにアンチセンス鎖の３’末端の２つの末端位置に存在する。一実施形態においては、化学修飾ヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩの部分）は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端及び３’末端並びにアンチセンス鎖の３’末端の最後から２番目の位置に存在する。また、式ＶＩＩの部分は、本明細書に記載のヘアピンｓｉＮＡ分子の３’末端又は５’末端に存在し得る。

別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、式Ｖ又はＶＩの脱塩基残基を含む。ここで、式ＶＩ又はＶＩの脱塩基残基は、一方又は両方のｓｉＮＡ鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端と５’末端の両方におけるなどの３’−３’、３’−２’、２’−３’又は５’−５’配置でｓｉＮＡ構築体と連結されている。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）ロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）ヌクレオチドを、例えば、ｓｉＮＡ分子の５’末端に、３’末端に、５’末端と３’末端の両方に、又はその任意の組合せに含む。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）４’−チオヌクレオチドを、例えば、ｓｉＮＡ分子の５’末端に、３’末端に、５’末端と３’末端の両方に、又はその任意の組合せに含む。

別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）非環式ヌクレオチドを、例えば、ｓｉＮＡ分子の５’末端に、３’末端に、５’末端と３’末端の両方に、又はその任意の組合せに含む。

一実施形態においては、本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は、１個以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４ １５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれを超える）２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ、ＦＡＮＡ若しくは脱塩基化学修飾又はその任意の組合せを有するセンス鎖又はセンス領域を含む。

一実施形態においては、本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は、１個以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４ １５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれを超える）２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ、ＦＡＮＡ若しくは脱塩基化学修飾又はその任意の組合せを有するアンチセンス鎖又はアンチセンス領域を含む。

一実施形態においては、本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は、１個以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４ １５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれを超える）２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ、ＦＡＮＡ若しくは脱塩基化学修飾又はその任意の組合せを各々有する、センス鎖又はセンス領域及びアンチセンス鎖又はアンチセンス領域を含む。

一実施形態においては、本発明は、センス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。）。

一実施形態においては、本発明は、センス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、ＦＡＮＡピリミジンヌクレオチドである（例えば、全ピリミジンヌクレオチドはＦＡＮＡピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドはＦＡＮＡピリミジンヌクレオチドである。）。

一実施形態においては、本発明は、アンチセンス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。）。

一実施形態においては、本発明は、センス領域及びアンチセンス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域及びアンチセンス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。）。

一実施形態においては、本発明は、センス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。）。

一実施形態においては、本発明は、アンチセンス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。）。

一実施形態においては、本発明は、センス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。）、センス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。）。

一実施形態においては、本発明は、センス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、センス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり（例えば、全プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。）、前記センス領域中に存在する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。

一実施形態においては、本発明は、センス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、センス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）。

一実施形態においては、本発明は、センス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、センス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである。）、前記センス領域中に存在する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。

一実施形態においては、本発明は、アンチセンス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、アンチセンス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである。）。

一実施形態においては、本発明は、アンチセンス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、アンチセンス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである。）、前記アンチセンス領域中に存在する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。

一実施形態においては、本発明は、アンチセンス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、アンチセンス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。）。

一実施形態においては、本発明は、アンチセンス領域を含む本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、アンチセンス領域中に存在する任意（例えば、１個以上又は全部）のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである。）。

一実施形態においては、本発明は、センス領域及びアンチセンス領域を含む、細胞内で、又は再構成されたインビトロ系内で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る、本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する１個以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、センス領域中に存在する１個以上のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり（例えば、全プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。）、アンチセンス領域中に存在する１個以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、アンチセンス領域中に存在する１個以上のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）。センス領域及び／又はアンチセンス領域は、センス及び／又はアンチセンス配列の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に存在してもよい、本明細書に記載の、又は図１０に示す、任意の修飾などの末端キャップ修飾を有し得る。センス及び／又はアンチセンス領域は、約１から約４（例えば、約１、２、３又は４）個の２’−デオキシヌクレオチドを有する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを更に含んでいてもよい。オーバーハングヌクレオチドは、１個以上の（例えば、約１、２、３、４又はそれを超える）ホスホロチオアート、ホスホノアセタート及び／又はチオホスホノアセタートヌクレオチド間結合を更に含み得る。これらの化学修飾ｓｉＮＡの非限定的例を本明細書の図４及び５並びに表ＩＩＩに示す。上記実施形態のいずれにおいても、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは、或いは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである。）、アンチセンス領域中に存在する１個以上のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）。また、これらの実施形態のいずれにおいても、センス領域中に存在する１個以上のプリンヌクレオチドは、或いは、プリンリボヌクレオチドであり（例えば、全プリンヌクレオチドはプリンリボヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドはプリンリボヌクレオチドである。）、アンチセンス領域中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである。）。さらに、これらの実施形態のいずれにおいても、センス領域中に存在する、及び／又はアンチセンス領域中に存在する、１個以上のプリンヌクレオチドは、或いは、２’−デオキシヌクレオチド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群から選択される（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群から選択され、又は複数の（すなわち１を超える）プリンヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群から選択される。）。

別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子中に、好ましくは本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖中に、ただし場合によってはセンス鎖中及び／又はアンチセンスとセンスの両方の鎖中に、存在する任意の修飾ヌクレオチドは、天然リボヌクレオチドと類似した諸性質又は諸特性を有する修飾ヌクレオチドを含む。例えば、本発明は、「リボ様」又は「Ａ型ヘリックス」配置としても知られる、ノーザンコンホメーション（例えば、ノーザン擬回転サイクル。例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ｅｄ．， １９８４参照）を有する修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。したがって、本発明のｓｉＮＡ分子中に、好ましくは本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖中に、ただし場合によってはセンス鎖中及び／又はアンチセンスとセンスの両方の鎖中に、存在する化学修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡｉ媒介能力を同時に維持しながら、ヌクレアーゼ分解に耐性がある。ノーザン配置を有するヌクレオチドの非限定的例としては、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）；２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド；２’−メチル−チオ−エチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが挙げられる。

一実施形態においては、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖は、反転デオキシ脱塩基（ａｂａｉｓｃ）部分などの末端キャップ部分を、センス鎖の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に含む（例えば、図１０参照）。

一実施形態においては、本発明は、細胞内で、又は再構成されたインビトロ系内でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る化学修飾低分子干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）を特徴とする。ここで、化学修飾は、化学修飾ｓｉＮＡ分子と共有結合した抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を含む。本発明で企図する抱合体の非限定的例としては、図面を含めて、参照によりその全体を本明細書に組込む、２００３年４月３０日に出願された、Ｖａｒｇｅｅｓｅ他、米国特許出願第１０／４２７，１６０号に記載の抱合体及びリガンドが挙げられる。別の実施形態においては、抱合体は、生分解性リンカーを介して、化学修飾ｓｉＮＡ分子と共有結合している。一実施形態においては、抱合分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’末端で結合している。別の実施形態においては、抱合分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の５’末端で結合している。更に別の実施形態においては、抱合分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖若しくは両方の鎖又はその任意の組合せの３’末端と５’末端の両方で結合している。一実施形態においては、本発明の抱合分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子を細胞などの生物系に送達するのを促進する分子を含む。別の実施形態においては、化学修飾ｓｉＮＡ分子と結合した抱合分子は、天然タンパク質リガンド由来のペプチドなどの細胞受容体のリガンド；細胞のＺＩＰコード配列を含めたタンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；葉酸塩、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどのビタミン及び他の補因子；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー；リン脂質；コレステロール；ステロイド及びＰＥＩ、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミンである。本発明で企図する、化学修飾ｓｉＮＡ分子と結合し得る具体的抱合分子の例は、参照により本明細書に組込む、２００２年７月２２日に出願された、Ｖａｒｇｅｅｓｅ他、米国特許出願第１０／２０１，３９４号に記載されている。使用される抱合体のタイプ、及び本発明のｓｉＮＡ分子の抱合の程度は、ＲＮＡｉ活性を媒介するｓｉＮＡの能力を同時に維持しながら、ｓｉＮＡ構築体の改善された薬物動態学的プロファイル、生物学的利用能、及び／又は安定性について評価することができる。したがって、当業者は、例えば当分野で一般に公知である動物モデルにおいて、種々の抱合体で修飾されたｓｉＮＡ構築体をスクリーニングして、ｓｉＮＡ抱合複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）が、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持しながら、改善された諸性質を有するかどうかを判定することができる。

一実施形態においては、本発明は、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）のセンス領域をｓｉＮＡのアンチセンス領域と連結する、ヌクレオチド、非ヌクレオチド又は混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーを更に含む、本発明のｓｉＮＡ分子を特徴とする。一実施形態においては、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、又は混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーを使用して、例えば、抱合部分をｓｉＮＡと結合させる。一実施形態においては、本発明のヌクレオチドリンカーは、≧２ヌクレオチド長、例えば、約３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド長のリンカーであり得る。別の実施形態においては、ヌクレオチドリンカーは核酸アプタマーであり得る。本明細書では「アプタマー」又は「核酸アプタマー」とは、ＨＣＶ標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味し、該核酸分子は、その自然な状況においてＨＣＶ標的分子によって認識される配列を含む配列を有する。或いは、アプタマーは、核酸と自然には結合しないＨＣＶ標的分子と結合する核酸分子であり得る。ＨＣＶ標的分子は、対象となる任意の分子であり得る。例えば、アプタマーを使用して、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合させることができ、それによって天然のリガンドとタンパク質の相互作用を防止することができる。これは非限定的例であり、当業者は、他の実施形態を当分野で一般に公知である技術によって容易に作製できることを認識されたい。（例えば、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４， ７６３；Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ， ２０００， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ７４， ５；Ｓｕｎ， ２０００， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ２， １００；Ｋｕｓｓｅｒ， ２０００， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ７４， ２７；Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ， ２０００， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８７， ８２０及びＪａｙａｓｅｎａ， １９９９， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４５， １６２８を参照されたい。）

更に別の実施形態においては、本発明の非ヌクレオチドリンカーは、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）又は他の重合体化合物（例えば、２から１００個のエチレングリコール単位を含むポリエチレングリコールなどのポリエチレングリコール）を含む。具体例としては、参照により本明細書に組込む、Ｓｅｅｌａ ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９０， １８：６３５３及びＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９８７， １５：３１１３；Ｃｌｏａｄ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９１， １１３：６３２４；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９１， １１３：５１０９；Ｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９３， ２１：２５８５及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９３， ３２：１７５１；Ｄｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９０， １８：６３５３；ＭｃＣｕｒｄｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９１， ７０：２８７；Ｊｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９９３， ３４：３０１；Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９１， ３０：９９１４；Ａｒｎｏｌｄ他、国際公開第８９／０２４３９号；Ｕｓｍａｎ他、国際公開第９５／０６７３１号；Ｄｕｄｙｃｚ他、国際公開第９５／１１９１０号並びにＦｅｒｅｎｔｚ ａｎｄ Ｖｅｒｄｉｎｅ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９１， １１３：４０００に記載のものが挙げられる。「非ヌクレオチド」とは、糖置換及び／又はリン酸置換を含めて、１個以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖に組み入れることができ、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡｉ活性を保持するのを、又はＲＮＡｉ抑制性がその阻害活性を保持するのを可能にする、任意の基又は化合物を更に意味する。この基又は化合物は、例えば糖のＣ１位に、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミンなどの一般に認識されているヌクレオチド塩基を含まない点で、脱塩基であり得る。

一実施形態においては、本発明は、細胞内で、又は再構成されたインビトロ系内でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、２個の別々のオリゴヌクレオチドから組み立てられるｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖は、リボヌクレオチドを含まない（例えば、ｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖は、１００％化学修飾されている）。例えば、ｓｉＮＡ分子は、単一のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、ｓｉＮＡのセンス領域とアンチセンス領域は、オリゴヌクレオチド中に存在するリボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まない、別々のオリゴヌクレオチドを含む。別の例においては、ｓｉＮＡ分子は、単一のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、ｓｉＮＡのセンス領域とアンチセンス領域は、本明細書に記載のヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーによって連結又は環化され、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中に存在するリボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まない。本出願人は、驚くべきことに、ｓｉＮＡ分子内のリボヌクレオチド（例えば、２’ヒドロキシル基を有するヌクレオチド）の存在がＲＮＡｉ活性の維持に不要である、又は必須でないことを見いだした。したがって、一実施形態においては、ｓｉＮＡ内の全位置は、細胞中でＲＮＡｉ活性を維持するｓｉＮＡ分子の能力が持続する程度に、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ若しくはＶＩＩ又はその任意の組合せのヌクレオチド及び又は非ヌクレオチドなどの化学修飾ヌクレオチド及び／又は非ヌクレオチドを含むことができる。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＨＣＶ標的核酸配列に対して相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含み、細胞又は再構成されたインビトロ系においてＲＮＡｉ活性を媒介する、一本鎖ｓｉＮＡ分子である。別の実施形態においては、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は、５’末端リン酸基を含む。別の実施形態においては、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は、５’末端リン酸基及び３’末端リン酸基を含む（例えば、２’，３’−環式リン酸）。別の実施形態においては、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は、約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドを含む。更に別の実施形態においては、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載の１個以上の化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含む。例えば、ｓｉＮＡ分子内の全位置は、細胞中でＲＮＡｉ活性を維持するｓｉＮＡ分子の能力が持続する程度に、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せなどの化学修飾ヌクレオチドを含み得る。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＨＣＶ標的核酸配列に対して相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含み、細胞又は再構成されたインビトロ系において、ＲＮＡｉ活性を媒介する、又はＲＮＡｉ活性を交互に調節する、一本鎖ｓｉＮＡ分子である。ここで、ｓｉＮＡ中に存在する１個以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり、又は複数のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである。）、アンチセンス領域中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり（例えば、全プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり、又は複数のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ若しくは２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである。）、アンチセンス配列の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に存在してもよい、本明細書に記載の、又は図１０に示す、任意の修飾などの末端キャップ修飾。ＳｉＮＡは、約１から約４又はそれを超える（例えば、約１、２、３、４又はそれを超える）末端２’−デオキシヌクレオチドをｓｉＮＡ分子の３’末端に更に含んでいてもよい。ここで、末端ヌクレオチドは、１個以上の（例えば、１、２、３、４又はそれを超える）ホスホロチオアート、ホスホノアセタート及び／又はチオホスホノアセタートヌクレオチド間結合を更に含み得、ｓｉＮＡは、５’末端リン酸基などの末端リン酸基を更に含んでいてもよい。これらの実施形態のいずれにおいても、アンチセンス領域中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、或いは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり、又は複数のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。）。また、これらの実施形態のいずれにおいても、ｓｉＮＡ中に存在する任意のプリンヌクレオチド（すなわち、センス及び／又はアンチセンス領域中に存在するプリンヌクレオチド）は、或いは、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドはＬＮＡヌクレオチドであり、又は複数のプリンヌクレオチドはＬＮＡヌクレオチドである。）。また、これらの実施形態のいずれにおいても、ｓｉＮＡ中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、或いは、２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドである（例えば、全プリンヌクレオチドは２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドであり、又は複数のプリンヌクレオチドは２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドである。）。別の実施形態においては、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在する任意の修飾ヌクレオチドは、天然リボヌクレオチドと類似した諸性質又は諸特性を有する修飾ヌクレオチドを含む。例えば、本発明は、ノーザンコンホメーション（例えば、ノーザン擬回転サイクル。例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ｅｄ．， １９８４参照）を有する修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。したがって、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在する化学修飾ヌクレオチドは、好ましくは、ＲＮＡｉ媒介能力を同時に維持しながら、ヌクレアーゼ分解に耐性がある。

一実施形態においては、本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は、２個以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４ １５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれを超える）２’−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル）修飾又はその任意の組合せを有するセンス鎖又はセンス領域を含む。別の実施形態においては、２’−Ｏ−アルキル修飾は、ｓｉＮＡのセンス鎖又はセンス領域中の、位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１など、又は位置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０などの交互の位置にある。

一実施形態においては、本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は、２個以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４ １５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれを超える）２’−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル）修飾又はその任意の組合せを有するアンチセンス鎖又はアンチセンス領域を含む。別の実施形態においては、２’−Ｏ−アルキル修飾は、ｓｉＮＡのアンチセンス鎖又はアンチセンス領域中の、位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１など、又は位置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０などの交互の位置にある。

一実施形態においては、本発明の化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は、２個以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４ １５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれを超える）２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ若しくは脱塩基化学修飾又はその任意の組合せを各々有する、センス鎖又はセンス領域及びアンチセンス鎖又はアンチセンス領域を含む。別の実施形態においては、２’−Ｏ−アルキル修飾は、ｓｉＮＡのセンス鎖又はセンス領域中の、位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１など、又は位置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０などの交互の位置にある。別の実施形態においては、２’−Ｏ−アルキル修飾は、ｓｉＮＡのアンチセンス鎖又はアンチセンス領域中の、位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１など、又は位置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０などの交互の位置にある。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、（例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドなどの式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの）化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、ｓｉＮＡ分子の１個以上の鎖又は領域内の交互の位置に含む。例えば、かかる化学修飾は、ｓｉＮＡの３’末端又は５’末端から第１又は第２のヌクレオチドで始まる、ＲＮＡベースのｓｉＮＡ分子の１つ置きの位置に導入することができる。非限定的例においては、ｓｉＮＡの各鎖が２１ヌクレオチド長である、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、各鎖の位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１は、（例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドなどの式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの化合物で）化学修飾されている。別の非限定的例においては、ｓｉＮＡの各鎖が２１ヌクレオチド長である、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、各鎖の位置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０は、（例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドなどの式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの化合物で）化学修飾されている。一実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、位置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０の化学修飾、並びに位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１の化学修飾を含む。かかるｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載の末端キャップ部分及び／又は骨格修飾を更に含み得る。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は以下の特徴を含む。すなわち、プリンヌクレオチドが、ｓｉＮＡ分子の（ガイド配列又はガイド鎖とも称する）アンチセンス鎖又はアンチセンス領域の５’末端に（例えば、５’末端から１、２、３、４、５又は６位の末端ヌクレオチド位置のいずれかに）存在する場合には、かかるプリンヌクレオシドはリボヌクレオチドである。別の実施形態においては、プリンリボヌクレオチドは、存在するときには、ｓｉＮＡ分子の（パッセンジャー鎖とも称する）センス鎖又はセンス領域のヌクレオチドと塩基対を形成する。かかるプリンリボヌクレオチドは、それ以外は修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ安定化モチーフ中に存在し得る。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は以下の特徴を含む。すなわち、ピリミジンヌクレオチドが、ｓｉＮＡ分子の（ガイド配列又はガイド鎖とも称する）アンチセンス鎖又はアンチセンス領域の５’末端に（例えば、５’末端から１、２、３、４、５又は６位の末端ヌクレオチド位置のいずれかに）存在する場合には、かかるピリミジンヌクレオシドはリボヌクレオチドである。別の実施形態においては、ピリミジンリボヌクレオチドは、存在するときには、ｓｉＮＡ分子の（パッセンジャー鎖とも称する）センス鎖又はセンス領域のヌクレオチドと塩基対を形成する。かかるピリミジンリボヌクレオチドは、それ以外は修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ安定化モチーフ中に存在し得る。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は以下の特徴を含む。すなわち、ピリミジンヌクレオチドが、ｓｉＮＡ分子の（ガイド配列又はガイド鎖とも称する）アンチセンス鎖又はアンチセンス領域の５’末端に（例えば、５’末端から１、２、３、４、５又は６位の末端ヌクレオチド位置のいずれかに）存在する場合には、かかるピリミジンヌクレオシドは修飾ヌクレオチドである。別の実施形態においては、修飾ピリミジンヌクレオチドは、存在するときには、ｓｉＮＡ分子の（パッセンジャー鎖とも称する）センス鎖又はセンス領域のヌクレオチドと塩基対を形成する。修飾ピリミジンヌクレオチドの非限定的例としては、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドなどの式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの修飾ピリミジンヌクレオチドが挙げられる。

一実施形態においては、本発明は、構造ＳＩを有する二本鎖核酸分子を特徴とする。

式中、各Ｎは独立に、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、ヌクレオチドであり、各Ｂは、存在しても、しなくてもよい、末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成ヌクレオチド又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］は、任意のプリンヌクレオチドが、存在するときには、リボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは独立に、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは独立に、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。

一実施形態においては、本発明は、構造ＳＩＩを有する二本鎖核酸分子を特徴とする。

式中、各Ｎは独立に、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、ヌクレオチドであり、各Ｂは、存在しても、しなくてもよい、末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成ヌクレオチド又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］は、任意のプリンヌクレオチドが、存在するときには、リボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドはリボヌクレオチドであり、センス鎖中に存在する任意のプリンヌクレオチド（上側の鎖）はリボヌクレオチドであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。

一実施形態においては、本発明は、構造ＳＩＩＩを有する二本鎖核酸分子を特徴とする。

式中、各Ｎは独立に、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、ヌクレオチドであり、各Ｂは、存在しても、しなくてもよい、末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成ヌクレオチド又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］は、任意のプリンヌクレオチドが、存在するときには、リボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、リボヌクレオチドであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。

一実施形態においては、本発明は、構造ＳＩＶを有する二本鎖核酸分子を特徴とする。

式中、各Ｎは独立に、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、ヌクレオチドであり、各Ｂは、存在しても、しなくてもよい、末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成ヌクレオチド又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］は、任意のプリンヌクレオチドが、存在するときには、リボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。

一実施形態においては、本発明は、構造ＳＶを有する二本鎖核酸分子を特徴とする。

式中、各Ｎは独立に、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、ヌクレオチドであり、各Ｂは、存在しても、しなくてもよい、末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成ヌクレオチド又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］は、任意のプリンヌクレオチドが、存在するときには、リボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは、リボ様配置（例えば、ノーザン又はＡ型ヘリックス配置）のヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは、リボ様配置（例えば、ノーザン又はＡ型ヘリックス配置）のヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。

一実施形態においては、本発明は、構造ＳＶＩを有する二本鎖核酸分子を特徴とする。

式中、各Ｎは独立に、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、ヌクレオチドであり、各Ｂは、存在しても、しなくてもよい、末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成ヌクレオチド又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］は、アンチセンス鎖（下側の鎖）の５’末端をセンス鎖（上側の鎖）の５’末端よりも熱的に不安定にする配列を含むヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは独立に、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは独立に、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。

一実施形態においては、本発明は、構造ＳＶＩＩを有する二本鎖核酸分子を特徴とする。

式中、各Ｎは独立に、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、ヌクレオチドであり、各Ｂは、存在しても、しなくてもよい、末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、非塩基対形成ヌクレオチド又はオーバーハングヌクレオチドであり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４に相補的であり、どの（Ｎ）ヌクレオチドも２’−Ｏ−メチル及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。

一実施形態においては、本発明は、構造ＳＶＩＩＩを有する二本鎖核酸分子を特徴とする。

式中、各Ｎは独立に、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、ヌクレオチドであり、各Ｂは、存在しても、しなくてもよい、末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成ヌクレオチド又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］はアンチセンス鎖（下側の鎖）の５’末端をセンス鎖（上側の鎖）の５’末端よりも熱的に不安定にする配列を含むヌクレオチド位置であり、［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約１５の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、Ｘ６は約１から約４の整数であり、Ｘ７は約９から約１５の整数であり、ＮＸ７、ＮＸ６及びＮＸ３は、ＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは独立に、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは、［Ｎ］ヌクレオチド以外の２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは独立に、［Ｎ］ヌクレオチド以外の、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。

一実施形態においては、本発明は、構造ＳＩＸを有する二本鎖核酸分子を特徴とする。

式中、各Ｎは独立に、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、ヌクレオチドであり、各Ｂは、存在しても、しなくてもよい、末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成ヌクレオチド又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］は、リボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは独立に、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは独立に、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。

一実施形態においては、本発明は、構造ＳＸを有する二本鎖核酸分子を特徴とする。

式中、各Ｎは独立に、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、ヌクレオチドであり、各Ｂは、存在しても、しなくてもよい、末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成ヌクレオチド又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］は、リボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドはリボヌクレオチドであり、センス鎖中に存在する任意のプリンヌクレオチド（上側の鎖）はリボヌクレオチドであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。

一実施形態においては、本発明は、構造ＳＸＩを有する二本鎖核酸分子を特徴とする。

式中、各Ｎは独立に、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、ヌクレオチドであり、各Ｂは、存在しても、しなくてもよい、末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成ヌクレオチド又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］は、リボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、リボヌクレオチドであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。

一実施形態においては、本発明は、構造ＳＸＩＩを有する二本鎖核酸分子を特徴とする。

式中、各Ｎは独立に、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、ヌクレオチドであり、各Ｂは、存在しても、しなくてもよい、末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成ヌクレオチド又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］は、リボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。

一実施形態においては、本発明は、構造ＳＸＩＩＩを有する二本鎖核酸分子を特徴とする。

式中、各Ｎは独立に、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、ヌクレオチドであり、各Ｂは、存在しても、しなくてもよい、末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成ヌクレオチド又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］は、リボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約３０の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、ＮＸ３はＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは、リボ様配置（例えば、ノーザン又はＡ型ヘリックス配置）のヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは、リボ様配置（例えば、ノーザン又はＡ型ヘリックス配置）のヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。

一実施形態においては、本発明は、構造ＳＸＩＶを有する二本鎖核酸分子を特徴とする。

式中、各Ｎは独立に、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、ヌクレオチドであり、各Ｂは、存在しても、しなくてもよい、末端キャップ部分であり、（Ｎ）は、無修飾でも、化学修飾されていてもよい、非塩基対形成ヌクレオチド又はオーバーハングヌクレオチドであり、［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置であり、Ｘ１及びＸ２は独立に約０から約４の整数であり、Ｘ３は約９から約１５の整数であり、Ｘ４は約１１から約３０の整数であって、ただしＸ４とＸ５の合計は１７−３６であり、Ｘ５は約１から約６の整数であり、Ｘ６は約１から約４の整数であり、Ｘ７は約９から約１５の整数であり、ＮＸ７、ＮＸ６及びＮＸ３は、ＮＸ４及びＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する任意のピリミジン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、アンチセンス鎖（下側の鎖）中に存在する、［Ｎ］ヌクレオチド位置のプリンヌクレオチド以外の任意のプリンヌクレオチドは独立に、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｂ）センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドは、［Ｎ］ヌクレオチド以外の２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり、センス鎖（上側の鎖）中に存在する任意のプリンヌクレオチドは独立に、［Ｎ］ヌクレオチド以外の、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、又は２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組合せであり、
（ｃ）任意の（Ｎ）ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。

一実施形態においては、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、核酸分子のアンチセンス鎖又はアンチセンス領域の５’末端に末端リン酸基を含む。

一実施形態においては、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、Ｘ５＝１、２又は３；各Ｘ１及びＸ２＝１又は２；Ｘ３＝１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０並びにＸ４＝１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０を含む。

一実施形態においては、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、Ｘ５＝１；各Ｘ１及びＸ２＝２；Ｘ３＝１９並びにＸ４＝１８を含む。

一実施形態においては、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、Ｘ５＝２；各Ｘ１及びＸ２＝２；Ｘ３＝１９並びにＸ４＝１７を含む。

一実施形態においては、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、Ｘ５＝３；各Ｘ１及びＸ２＝２；Ｘ３＝１９並びにＸ４＝１６を含む。

一実施形態においては、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、センス鎖又はセンス領域の３’及び５’末端にＢを含む。

一実施形態においては、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、アンチセンス鎖又はアンチセンス領域の３’末端にＢを含む。

一実施形態においては、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、センス鎖又はセンス領域の３’及び５’末端、並びにアンチセンス鎖又はアンチセンス領域の３’末端にＢを含む。

一実施形態においては、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、核酸分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の３’末端上の第１の末端（Ｎ）に、１個以上のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を更に含む。例えば、二本鎖核酸分子は、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合（例えば、（ＮｓＮ））を含むオーバーハングヌクレオチド位置を有する、Ｘ１及び／又はＸ２＝２を含み得る。ここで、「ｓ」はホスホロチオアートを示す。

一実施形態においては、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである（Ｎ）ヌクレオチドを含む。

一実施形態においては、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、２’−デオキシヌクレオチドである（Ｎ）ヌクレオチドを含む。

一実施形態においては、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、アンチセンス（下側の）鎖のＮ及び［Ｎ］ヌクレオチドに相補的である標的ポリヌクレオチド配列（例えば、ＨＣＶ標的及び／又はＨＣＶ経路／宿主標的配列）中のヌクレオチドに相補的である（Ｎ）ヌクレオチドをアンチセンス鎖（下側の鎖）中に含む。

一実施形態においては、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、ＨＣＶ標的及び／又はＨＣＶ経路／宿主標的配列）の約１５から約３０ヌクレオチドの隣接ヌクレオチド配列を含む（Ｎ）ヌクレオチドをセンス鎖（上側の鎖）中に含む。

一実施形態においては、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、センス鎖の隣接（Ｎ）及びＮヌクレオチド配列が標的核酸配列（例えば、ＨＣＶ標的及び／又はＨＣＶ経路／宿主標的配列）のヌクレオチド配列を含むように、アンチセンス（下側の）鎖に相補的である標的ポリヌクレオチド配列（例えば、ＨＣＶ標的及び／又はＨＣＶ経路／宿主標的配列）に対応するヌクレオチド配列を含む（Ｎ）ヌクレオチドをセンス鎖（上側の鎖）中に含む。

一実施形態においては、構造ＳＶＩＩＩ又はＳＸＩＶのどちらかを有する二本鎖核酸分子は、二本鎖核酸分子のセンス（上側の）鎖の５’末端のみにＢを含む。

一実施形態においては、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、不対末端ヌクレオチドをアンチセンス（下側の）鎖の５’末端に更に含む。不対ヌクレオチドは、センス鎖と相補的でない。一実施形態においては、不対の末端ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のＮ及び／又は［Ｎ］ヌクレオチドに相補的である標的ポリヌクレオチド配列に相補的である。別の実施形態においては、不対の末端ヌクレオチドは、アンチセンス（下側の）鎖のＮ及び／又は［Ｎ］ヌクレオチドに相補的である標的ポリヌクレオチド配列に相補的でない。

一実施形態においては、構造ＳＶＩＩＩ又はＳＸＩＶのいずれかを有する二本鎖核酸分子は、Ｘ６＝１及びＸ３＝１０を含む。

一実施形態においては、構造ＳＶＩＩＩ又はＳＸＩＶのどちらかを有する二本鎖核酸分子は、Ｘ６＝２及びＸ３＝９を含む。

一実施形態においては、本発明は、表ＶＩに示す調合物、例えば、ＬＮＰ−０５１、ＬＮＰ−０５３、ＬＮＰ−０５４、ＬＮＰ−０６９、ＬＮＰ−０７３、ＬＮＰ−０７７、ＬＮＰ−０８０、ＬＮＰ−０８２、ＬＮＰ−０８３、ＬＮＰ−０６０、ＬＮＰ−０６１、ＬＮＰ−０８６、ＬＮＰ−０９７、ＬＮＰ−０９８、ＬＮＰ−０９９、ＬＮＰ−１００、ＬＮＰ−１０１、ＬＮＰ−１０２、ＬＮＰ−１０３又はＬＮＰ−１０４（表ＶＩ参照）のいずれかとして調合されたｓｉＮＡ分子又は二本鎖核酸分子又はＲＮＡｉ阻害剤を含む組成物を特徴とする。

一実施形態においては、本発明は、互いに相補的である第１の鎖と第２の鎖を各々有する、第１の二本鎖核酸分子と第２の二本鎖核酸分子とを含む組成物を特徴とする。ここで、第１の二本鎖核酸分子の第２の鎖は、配列番号１４４４である第１のＨＣＶ配列に相補的である配列を含み、第２の二本鎖核酸分子の第２の鎖は、配列番号１４１７である第２のＨＣＶ配列に相補的である配列を含む。一実施形態においては、組成物は、陽イオン性脂質、中性脂質及びポリエチレングリコール抱合体を更に含む。一実施形態においては、組成物は、陽イオン性脂質、中性脂質、ポリエチレングリコール抱合体及びコレステロールを更に含む。一実施形態においては、組成物は、ポリエチレングリコール抱合体、コレステロール及び界面活性剤を更に含む。一実施形態においては、陽イオン性脂質は、ＣＬｉｎＤＭＡ、ｐＣＬｉｎＤＭＡ、ｅＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ及びＤＭＬＢＡからなる群から選択される。一実施形態においては、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＯＢＡ及びコレステロールからなる群から選択される。一実施形態においては、ポリエチレングリコール抱合体は、ＰＥＧ−ジミリストイルグリセリン及びＰＥＧ−コレステロールからなる群から選択される。一実施形態においては、ＰＥＧは２ＫＰＥＧである。一実施形態においては、界面活性剤は、パルミチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール及びリノレイルアルコールからなる群から選択される。一実施形態においては、陽イオン性脂質はＣＬｉｎＤＭＡであり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ポリエチレングリコール抱合体は２ＫＰＥＧ−ＤＭＧであり、コレステロールはコレステロールであり、界面活性剤はリノレイルアルコールである。一実施形態においては、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＳＰＣ、２ＫＰＥＧ−ＤＭＧ、コレステロール及びリノレイルアルコールは、それぞれ４３：３８：１０：２：７のモル比で存在する。

一実施形態においては、本発明は、互いに相補的である第１の鎖と第２の鎖を各々有する、第１の二本鎖核酸分子と第２の二本鎖核酸分子とを含む組成物を特徴とする。ここで、第１の二本鎖核酸分子の第２の鎖は、配列番号１４４４のＨＣＶ配列に相補的である配列を含み、第２の二本鎖核酸分子の第２の鎖は、配列番号１４１７のＨＣＶ配列に相補的である配列を含む。一実施形態においては、組成物は、陽イオン性脂質、中性脂質及びポリエチレングリコール抱合体を更に含む。一実施形態においては、組成物は、陽イオン性脂質、中性脂質、ポリエチレングリコール抱合体及びコレステロールを更に含む。一実施形態においては、組成物は、ポリエチレングリコール抱合体、コレステロール及び界面活性剤を更に含む。一実施形態においては、陽イオン性脂質は、ＣＬｉｎＤＭＡ、ｐＣＬｉｎＤＭＡ、ｅＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ及びＤＭＬＢＡからなる群から選択される。一実施形態においては、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＯＢＡ及びコレステロールからなる群から選択される。一実施形態においては、ポリエチレングリコール抱合体は、ＰＥＧ−ジミリストイルグリセリン及びＰＥＧ−コレステロールからなる群から選択される。一実施形態においては、ＰＥＧは２ＫＰＥＧである。一実施形態においては、界面活性剤は、パルミチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール及びリノレイルアルコールからなる群から選択される。一実施形態においては、陽イオン性脂質はＣＬｉｎＤＭＡであり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ポリエチレングリコール抱合体は２ＫＰＥＧ−ＤＭＧであり、コレステロールはコレステロールであり、界面活性剤はリノレイルアルコールである。一実施形態においては、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＳＰＣ、２ＫＰＥＧ−ＤＭＧ、コレステロール及びリノレイルアルコールは、それぞれ４３：３８：１０：２：７のモル比で存在する。一実施形態においては、第１の二本鎖核酸分子の第１の鎖及び第２の鎖は、それぞれ配列番号１７９６及び２０１０を含み、第２の二本鎖核酸分子の第１の鎖及び第２の鎖は、それぞれ配列番号１６７７及び２０１１を含む。一実施形態においては、第１の二本鎖核酸分子の第１の鎖及び第２の鎖は、それぞれ配列番号１７９６及び２０１２を含み、第２の二本鎖核酸分子の第１の鎖及び第２の鎖は、それぞれ配列番号１６７７及び２０１３を含む。一実施形態においては、第１の二本鎖核酸分子の第１の鎖及び第２の鎖は、それぞれ配列番号１７９６及び２１０２を含み、第２の二本鎖核酸分子の第１の鎖及び第２の鎖は、それぞれ配列番号１６７７及び２１０３を含む。

本明細書の実施形態のいずれにおいても、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡ干渉の阻害によって、１個以上の標的の発現を調節する。一実施形態においては、ＲＮＡ干渉は、ＲＩＳＣによって媒介される標的の切断（例えば、ｓｉＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ干渉）である。一実施形態においては、ＲＮＡ干渉は、標的の翻訳阻害（例えば、ｍｉＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ干渉）である。一実施形態においては、ＲＮＡ干渉は、標的の転写阻害（例えば、ｓｉＲＮＡによって媒介される転写サイレンシング）である。一実施形態においては、ＲＮＡ干渉は細胞質中で起こる。一実施形態においては、ＲＮＡ干渉は核中で起こる。

本明細書の実施形態のいずれにおいても、本発明のｓｉＮＡ分子は、内因性ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどの内因性標的ＲＮＡを阻害することによって、又はＲＩＳＣを阻害することによって、１個以上の標的の発現を調節する。

一実施形態においては、本発明は、ｍｉＲＮＡ阻害、ｓｉＲＮＡ阻害又はＲＩＳＣ阻害によって１個以上の遺伝子標的の発現を調節する、１種類以上のＲＮＡｉ阻害剤を特徴とする。

一実施形態においては、本発明のＲＮＡｉ阻害剤は、１個以上の標的ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子に相補的である１本以上の鎖を有する、本明細書に記載のｓｉＮＡ分子である。

一実施形態においては、本発明のＲＮＡｉ阻害剤は、標的ｍｉＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡ分子又はその一部に相補的であるアンチセンス分子である。本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤は、約１０から約４０ヌクレオチド長（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０ヌクレオチド長）の長さであり得る。本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤は、本明細書に記載の１個以上の修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含み得る（例えば、本明細書の式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの分子、又はその任意の組合せを参照されたい。）。一実施形態においては、本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤は、１個以上又は全部の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含み得る。一実施形態においては、本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤は、１個以上又は全部の２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含み得る。一実施形態においては、本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤は、１個以上又は全部の（２’−メトキシエトキシ又はＭＯＥとしても知られる）２’−Ｏ−メトキシ−エチルヌクレオチドを含み得る。一実施形態においては、本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤は、１個以上又は全部のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含み得る。一実施形態においては、アンチセンスＲＮＡ阻害剤又は本発明は、アンチセンスＲＮＡ阻害剤の３’末端に、５’末端に、又は５’末端と３’末端の両方に末端キャップ部分を含み得る。

一実施形態においては、本発明のＲＮＡｉ阻害剤は、調節可能なアプタマーなど、ＲＩＳＣに対する結合親和性を有する核酸アプタマーである（例えば、Ａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６， ＲＮＡ， １２：７１０−７１６参照）。本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤は、約１０から約５０ヌクレオチド長（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０ヌクレオチド長）の長さであり得る。本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤は、本明細書に記載の１個以上の修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含み得る（例えば、本明細書の式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの分子、又はその任意の組合せを参照されたい。）。一実施形態においては、本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤は、１個以上又は全部の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含み得る。一実施形態においては、本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤は、１個以上又は全部の２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含み得る。一実施形態においては、本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤は、１個以上又は全部の（２’−メトキシエトキシ又はＭＯＥとしても知られる）２’−Ｏ−メトキシ−エチルヌクレオチドを含み得る。一実施形態においては、本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤は、１個以上又は全部のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含み得る。一実施形態においては、アプタマーＲＮＡ阻害剤又は本発明は、アプタマーＲＮＡ阻害剤の３’末端に、５’末端に、又は５’末端と３’末端の両方に末端キャップ部分を含み得る。

一実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾されていても、無修飾でもよい、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、ＨＣＶ標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含む。）、及び（ｂ）細胞におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞内のＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。

一実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾されていても、無修飾でもよい、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、ＨＣＶ標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列は、ＨＣＶ標的ＲＮＡの配列と同一である、又はかなり類似した配列を含む。）、及び（ｂ）細胞におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞内のＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾されていても、無修飾でもよい、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、ＨＣＶ標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含む。）、及び（ｂ）細胞におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞内の１個を超えるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾されていても、無修飾でもよい、本発明の１種類以上のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖は、ＨＣＶ標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列は、ＨＣＶ標的ＲＮＡの配列と同一である、又はかなり類似した配列を含む。）、及び（ｂ）細胞におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞内の２個以上のＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾されていても、無修飾でもよい、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、ＨＣＶ標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列は、ＨＣＶ標的ＲＮＡの配列と同一である、又はかなり類似した配列を含む。）、及び（ｂ）細胞におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞内の１個を超えるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、生体外用途における試薬として使用される。例えば、ｓｉＮＡ試薬は、治療効果のために、対象に移植された組織又は細胞中に導入される。細胞及び／又は組織は、外植片をその後に移植される生物体又は対象から得ることができ、又は別の生物体又は対象から移植前に得ることができる。ｓｉＮＡ分子を使用して、細胞又は組織中の１個以上の遺伝子の発現を調節することができ、細胞又は組織は、所望の表現型を獲得し、又はインビボで移植したときに機能することができる。一実施形態においては、患者由来のある標的細胞（例えば、肝細胞）を採取する。採取した細胞を、この細胞によるｓｉＮＡの取り込みに適切な条件下で（例えば、細胞中へのｓｉＮＡの送達を促進するために、陽イオン性脂質、リポソームなどの送達試薬を用いて、又は電気穿孔法などの技術を用いて）、細胞内の特定のヌクレオチド配列を標的にしたｓｉＮＡと接触させる。次いで、同じ患者又は他の患者に細胞を再導入する。

一実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の一方は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含む。）、及び（ｂ）組織外植片における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、特定の生物体から得られた組織外植片の細胞にｓｉＮＡ分子を導入することを含む、組織外植片（例えば、一生物体から別の生物体に移植することができる、又は器官、組織若しくは細胞が得られた同じ生物体に戻すことができる、肝臓又は任意の他の器官、組織若しくは細胞）における標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。別の実施形態においては、この方法は、組織が得られた生物体に、又は別の生物体に、生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、組織外植片を戻すことを更に含む。

一実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の一方は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列は、標的ＲＮＡの配列と同一である、又は実質的に類似した、配列を含む。）、及び（ｂ）組織外植片における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、特定の生物体から得られた組織外植片の細胞にｓｉＮＡ分子を導入することを含む、組織外植片（例えば、一生物体から別の生物体に移植することができる、又は器官、組織若しくは細胞が得られた同じ生物体に戻すことができる、肝臓又は任意の他の器官、組織若しくは細胞）における標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。別の実施形態においては、この方法は、組織が得られた生物体に、又は別の生物体に、生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、組織外植片を戻すことを更に含む。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の一方は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含む。）、及び（ｂ）組織外植片における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、特定の生物体から得られた組織外植片の細胞にｓｉＮＡ分子を導入することを含む、組織外植片（例えば、一生物体から別の生物体に移植することができる、又は器官、組織若しくは細胞が得られた同じ生物体に戻すことができる、肝臓又は任意の他の器官、組織若しくは細胞）における１種類を超える標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。別の実施形態においては、この方法は、組織が得られた生物体に、又は別の生物体に、生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、組織外植片を戻すことを更に含む。

一実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含む。）、及び（ｂ）対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、ｓｉＮＡ分子を対象又は生物体に導入することを含む、対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。標的タンパク質又はＲＮＡのレベルは、当分野で周知の種々の方法によって求めることができる。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含む。）、及び（ｂ）対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、ｓｉＮＡ分子を対象又は生物体に導入することを含む、対象又は生物体における１個を超える標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。標的タンパク質又はＲＮＡのレベルは、当分野で公知のとおりに求めることができる。

一実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡは、標的遺伝子のＲＮＡに対して相補性を有する一本鎖配列を含む。）、及び（ｂ）細胞における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞（例えば、肝細胞）内の標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡは、ＨＣＶ標的遺伝子のＲＮＡに対して相補性を有する一本鎖配列を含む。）、及び（ｂ）細胞におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、細胞をインビトロ又はインビボでｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、細胞（例えば、肝細胞）内の１個を超えるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。

一実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡは、ＨＣＶ標的遺伝子のＲＮＡに対して相補性を有する一本鎖配列を含む。）、及び（ｂ）組織外植片におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、特定の対象又は生物体から得られた組織外植片の細胞をｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、組織外植片（（例えば、一生物体から別の生物体に移植することができる、又は器官、組織若しくは細胞が得られた同じ生物体に戻すことができる、肝臓又は任意の他の器官、組織若しくは細胞）におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。別の実施形態においては、この方法は、組織が得られた対象若しくは生物体に、又は別の対象若しくは生物体に、対象又は生物体におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、組織外植片を戻すことを更に含む。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡは、ＨＣＶ標的遺伝子のＲＮＡに対して相補性を有する一本鎖配列を含む。）、及び（ｂ）組織外植片におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、特定の対象又は生物体から得られた組織外植片の細胞にｓｉＮＡ分子を導入することを含む、組織外植片（例えば、一生物体から別の生物体に移植することができる、又は器官、組織若しくは細胞が得られた同じ生物体に戻すことができる、肝臓又は任意の他の器官、組織若しくは細胞）における１個を超えるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。別の実施形態においては、この方法は、組織が得られた対象若しくは生物体に、又は別の対象若しくは生物体に、対象又は生物体におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、組織外植片を戻すことを更に含む。

一実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡは、ＨＣＶ標的遺伝子のＲＮＡに対して相補性を有する一本鎖配列を含む。）、及び（ｂ）対象又は生物体におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、ｓｉＮＡ分子を対象又は生物体に導入することを含む、対象又は生物体におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡは、ＨＣＶ標的遺伝子のＲＮＡに対して相補性を有する一本鎖配列を含む。）、及び（ｂ）対象又は生物体におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、ｓｉＮＡ分子を対象又は生物体に導入することを含む、対象又は生物体における１個を超えるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。

一実施形態においては、本発明は、対象又は生物体におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象又は生物体におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。

一実施形態においては、本発明は、対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節するのに適切な条件下で、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象又は生物体における遺伝子発現又は活性に関係する疾患、障害、形質又は症状を治療又は予防する方法を特徴とする。遺伝子発現の減少、したがってそれぞれのタンパク質／ＲＮＡのレベルの減少によって、疾患、障害、形質又は症状の症候がある程度緩和される。

一実施形態においては、本発明は、対象又は生物体におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節するのに適切な条件下で、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含み、それによってＨＣＶ感染症を治療又は予防することができる、対象又は生物体におけるＨＣＶ感染症を治療又は予防する方法を特徴とする。一実施形態においては、本発明は、肝細胞、肝組織など、関連する組織又は細胞に局所投与することによって、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。一実施形態においては、本発明は、対象又は生物体におけるＨＣＶ感染症の持続又は発生に関与する組織又は細胞など、関連する組織又は細胞に（ｓｉＮＡの静脈内又は皮下投与などによって）全身投与することによって、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。本発明のｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体における適切な組織又は細胞を標的にするために、本明細書に記載するとおりに、又は当分野で公知のとおりに、処方又は抱合することができる。ｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体におけるＨＣＶ感染症の治療又は予防のための当分野で公知の他の治療処置及び様式と組み合わせることができる。

一実施形態においては、本発明は、対象又は生物体におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節するのに適切な条件下で、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含み、それによって肝不全又は症状を治療又は予防することができる、対象又は生物体における肝不全又は症状を治療又は予防する方法を特徴とする。一実施形態においては、本発明は、肝不全に関与する肝細胞及び組織など、関連する組織又は細胞に局所投与することによって、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。一実施形態においては、本発明は、対象又は生物体における肝不全又は症状の持続又は発生に関与する組織又は細胞など、関連する組織又は細胞に（ｓｉＮＡの静脈内又は皮下投与などによって）全身投与することによって、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。本発明のｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体における適切な組織又は細胞を標的にするために、本明細書に記載するとおりに、又は当分野で公知のとおりに、処方又は抱合することができる。ｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体における肝臓の不全、形質、障害又は症状の治療又は予防のための当分野で公知の他の治療処置及び様式と組み合わせることができる。

一実施形態においては、本発明は、対象又は生物体におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節するのに適切な条件下で、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含み、それによって肝細胞癌を治療又は予防することができる、対象又は生物体における肝細胞癌を治療又は予防する方法を特徴とする。一実施形態においては、本発明は、肝細胞癌に関与する肝細胞及び組織など、関連する組織又は細胞に局所投与することによって、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。一実施形態においては、本発明は、対象又は生物体における肝細胞癌の持続又は発生に関与する組織又は細胞など、関連する組織又は細胞に（ｓｉＮＡの静脈内又は皮下投与などによって）全身投与することによって、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。本発明のｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体における適切な組織又は細胞を標的にするために、本明細書に記載するとおりに、又は当分野で公知のとおりに、処方又は抱合することができる。ｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体における肝細胞癌の治療又は予防のための当分野で公知の他の治療処置及び様式と組み合わせることができる。

一実施形態においては、本発明は、対象又は生物体におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節するのに適切な条件下で、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含み、それによって肝硬変、障害、形質又は症状を治療又は予防することができる、対象又は生物体における肝硬変、障害、形質又は症状を治療又は予防する方法を特徴とする。一実施形態においては、本発明は、肝硬変、障害、形質又は症状に関与する細胞及び組織など、関連する組織又は細胞に局所投与することによって、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。一実施形態においては、本発明は、対象又は生物体における肝硬変、障害、形質又は症状の持続又は発生に関与する組織又は細胞など、関連する組織又は細胞に（ｓｉＮＡの静脈内又は皮下投与などによって）全身投与することによって、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。本発明のｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体における適切な組織又は細胞を標的にするために、本明細書に記載するとおりに、又は当分野で公知のとおりに、処方又は抱合することができる。ｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体における肝硬変、形質、障害又は症状の治療又は予防のための当分野で公知の他の治療処置及び様式と組み合わせることができる。

一実施形態においては、本発明は、対象又は生物体におけるＨＣＶ遺伝子発現の阻害剤の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象又は生物体におけるＨＣＶ感染症を治療又は予防する方法を特徴とする。

一実施形態においては、本発明は、対象又は生物体におけるＨＣＶ遺伝子発現の阻害剤の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象又は生物体における肝不全を治療又は予防する方法を特徴とする。

一実施形態においては、本発明は、対象又は生物体におけるＨＣＶ遺伝子発現の阻害剤の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象又は生物体における肝細胞癌を治療又は予防する方法を特徴とする。

一実施形態においては、本発明は、対象又は生物体におけるＨＣＶ遺伝子発現の阻害剤の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、対象又は生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象又は生物体における肝硬変を治療又は予防する方法を特徴とする。

一実施形態においては、本発明は、ＰＥＧインターフェロンを本発明のｓｉＮＡ分子と組み合わせて対象に投与することを含む、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を治療又は予防する方法を特徴とする。ここで、ＰＥＧインターフェロン及びｓｉＮＡ分子は、ＰＥＧインターフェロン及びｓｉＮＡ分子による治療を受けていない対象に比較して、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）レベルを低下させるのに、又は抑制するのに適切な条件下で投与される。一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、米国仮出願第６０／６７８，５３１号、並びに関係する２００５年７月２９日に出願された米国仮出願第６０／７０３，９４６号、２００５年１１月１５日に出願された米国仮出願第６０／７３７，０２４号、及び２００６年２月１４日に出願された米国特許出願第１１／３５３，６３０号（Ｖａｒｇｅｅｓｅ他）に記載された組成物として処方される。

一実施形態においては、本発明は、リバビリンを本発明のｓｉＮＡ分子と組み合わせて対象に投与することを含む、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を治療又は予防する方法を特徴とする。ここで、リバビリン及びｓｉＮＡ分子は、リバビリン及びｓｉＮＡ分子による治療を受けていない対象に比較して、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）レベルを低下させるのに、又は抑制するのに適切な条件下で投与される。

一実施形態においては、本発明は、ＰＥＧインターフェロン及びリバビリンを本発明のｓｉＮＡ分子と組み合わせて対象に投与することを含む、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を治療又は予防する方法を特徴とする。ここで、ＰＥＧインターフェロン、リバビリン及びｓｉＮＡ分子は、ＰＥＧインターフェロン、リバビリン及びｓｉＮＡ分子による治療を受けていない対象に比較して、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）レベルを低下させるのに、又は抑制するのに適切な条件下で投与される。

一実施形態においては、本発明は、化学合成された二本鎖核酸分子と組み合わせてＰＥＧインターフェロンを対象に投与することを含む、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を治療又は予防する方法を特徴とする。ここで、（ａ）二本鎖核酸分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、（ｂ）二本鎖核酸分子の各鎖は１５から２８ヌクレオチド長であり、（ｃ）センス鎖の少なくとも１５ヌクレオチドは、アンチセンス鎖に相補的であり、（ｄ）二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）標的ＲＮＡに対して相補性を有する。ＰＥＧインターフェロン及び二本鎖核酸分子は、ＰＥＧインターフェロン及び二本鎖核酸分子による治療を受けていない対象に比較して、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）レベルを低下させるのに、又は抑制するのに適切な条件下で投与される。

一実施形態においては、本発明は、化学合成された二本鎖核酸分子と組み合わせてリバビリンを対象に投与することを含む、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を治療又は予防する方法を特徴とする。ここで、（ａ）二本鎖核酸分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、（ｂ）二本鎖核酸分子の各鎖は１５から２８ヌクレオチド長であり、（ｃ）センス鎖の少なくとも１５ヌクレオチドは、アンチセンス鎖に相補的であり、（ｄ）二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）標的ＲＮＡに対して相補性を有する。リバビリン及び二本鎖核酸分子は、リバビリン及び二本鎖核酸分子による治療を受けていない対象に比較して、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）レベルを低下させるのに、又は抑制するのに適切な条件下で投与される。

一実施形態においては、本発明は、化学合成された二本鎖核酸分子と組み合わせてＰＥＧインターフェロン及びリバビリンを対象に投与することを含む、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を治療又は予防する方法を特徴とする。ここで、（ａ）二本鎖核酸分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、（ｂ）二本鎖核酸分子の各鎖は１５から２８ヌクレオチド長であり、（ｃ）センス鎖の少なくとも１５ヌクレオチドは、アンチセンス鎖に相補的であり、（ｄ）二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）標的ＲＮＡに対して相補性を有する。ＰＥＧインターフェロン、リバビリン及び二本鎖核酸分子は、ＰＥＧインターフェロン、リバビリン及び二本鎖核酸分子による治療を受けていない対象に比較して、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）レベルを低下させるのに、又は抑制するのに適切な条件下で投与される。

一実施形態においては、本発明は、化学合成された二本鎖核酸分子と組み合わせてＰＥＧインターフェロンを対象に投与することを含む、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を治療又は予防する方法を特徴とする。ここで、（ａ）二本鎖核酸分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、（ｂ）二本鎖核酸分子の各鎖は１５から２８ヌクレオチド長であり、（ｃ）センス鎖の少なくとも１５ヌクレオチドは、アンチセンス鎖に相補的であり、（ｄ）二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）標的ＲＮＡに対して相補性を有し、（ｅ）二本鎖核酸分子の各鎖の内部ヌクレオチドの少なくとも２０％は、化学修飾を有する修飾ヌクレオシドであり、（ｆ）化学修飾の少なくとも２個は互いに異なる。ＰＥＧインターフェロン及び二本鎖核酸分子は、ＰＥＧインターフェロン及び二本鎖核酸分子による治療を受けていない対象に比較して、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）レベルを低下させるのに、又は抑制するのに適切な条件下で投与される。

一実施形態においては、本発明は、化学合成された二本鎖核酸分子と組み合わせてリバビリンを対象に投与することを含む、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を治療又は予防する方法を特徴とする。ここで、（ａ）二本鎖核酸分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、（ｂ）二本鎖核酸分子の各鎖は１５から２８ヌクレオチド長であり、（ｃ）センス鎖の少なくとも１５ヌクレオチドは、アンチセンス鎖に相補的であり、（ｄ）二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）標的ＲＮＡに対して相補性を有し、（ｅ）二本鎖核酸分子の各鎖の内部ヌクレオチドの少なくとも２０％は、化学修飾を有する修飾ヌクレオシドであり、（ｆ）化学修飾の少なくとも２個は互いに異なる。リバビリン及び二本鎖核酸分子は、リバビリン及び二本鎖核酸分子による治療を受けていない対象に比較して、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）レベルを低下させるのに、又は抑制するのに適切な条件下で投与される。

一実施形態においては、本発明は、化学合成された二本鎖核酸分子と組み合わせてＰＥＧインターフェロン及びリバビリンを対象に投与することを含む、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を治療又は予防する方法を特徴とする。ここで、（ａ）二本鎖核酸分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、（ｂ）二本鎖核酸分子の各鎖は１５から２８ヌクレオチド長であり、（ｃ）センス鎖の少なくとも１５ヌクレオチドは、アンチセンス鎖に相補的であり、（ｄ）二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）標的ＲＮＡに対して相補性を有し、（ｅ）二本鎖核酸分子の各鎖の内部ヌクレオチドの少なくとも２０％は、化学修飾を有する修飾ヌクレオシドであり、（ｆ）化学修飾の少なくとも２個は互いに異なる。ＰＥＧインターフェロン、リバビリン及び二本鎖核酸分子は、ＰＥＧインターフェロン、リバビリン及び二本鎖核酸分子による治療を受けていない対象に比較して、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）レベルを低下させるのに、又は抑制するのに適切な条件下で投与される。

一実施形態においては、本発明は、化学合成された二本鎖核酸分子と組み合わせてＰＥＧインターフェロンを対象に投与することを含む、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を治療又は予防する方法を特徴とする。ここで、（ａ）二本鎖核酸分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、（ｂ）二本鎖核酸分子の各鎖は１５から２８ヌクレオチド長であり、（ｃ）センス鎖の少なくとも１５ヌクレオチドは、アンチセンス鎖に相補的であり、（ｄ）二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）標的ＲＮＡに対して相補性を有し、（ｅ）二本鎖核酸分子の各鎖の内部ヌクレオチドの少なくとも２０％は、糖修飾を有する修飾ヌクレオシドであり、（ｆ）糖修飾の少なくとも２個は互いに異なる。ＰＥＧインターフェロン及び二本鎖核酸分子は、ＰＥＧインターフェロン及び二本鎖核酸分子による治療を受けていない対象に比較して、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）レベルを低下させるのに、又は抑制するのに適切な条件下で投与される。

一実施形態においては、本発明は、化学合成された二本鎖核酸分子と組み合わせてリバビリンを対象に投与することを含む、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を治療又は予防する方法を特徴とする。ここで、（ａ）二本鎖核酸分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、（ｂ）二本鎖核酸分子の各鎖は１５から２８ヌクレオチド長であり、（ｃ）センス鎖の少なくとも１５ヌクレオチドは、アンチセンス鎖に相補的であり、（ｄ）二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）標的ＲＮＡに対して相補性を有し、（ｅ）二本鎖核酸分子の各鎖の内部ヌクレオチドの少なくとも２０％は、糖修飾を有する修飾ヌクレオシドであり、（ｆ）糖修飾の少なくとも２個は互いに異なる。リバビリン及び二本鎖核酸分子は、リバビリン及び二本鎖核酸分子による治療を受けていない対象に比較して、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）レベルを低下させるのに、又は抑制するのに適切な条件下で投与される。

一実施形態においては、本発明は、化学合成された二本鎖核酸分子と組み合わせてＰＥＧインターフェロン及びリバビリンを対象に投与することを含む、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を治療又は予防する方法を特徴とする。ここで、（ａ）二本鎖核酸分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、（ｂ）二本鎖核酸分子の各鎖は１５から２８ヌクレオチド長であり、（ｃ）センス鎖の少なくとも１５ヌクレオチドは、アンチセンス鎖に相補的であり、（ｄ）二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）標的ＲＮＡに対して相補性を有し、（ｅ）二本鎖核酸分子の各鎖の内部ヌクレオチドの少なくとも２０％は、糖修飾を有する修飾ヌクレオシドであり、（ｆ）糖修飾の少なくとも２個は互いに異なる。ＰＥＧインターフェロン、リバビリン及び二本鎖核酸分子は、ＰＥＧインターフェロン、リバビリン及び二本鎖核酸分子による治療を受けていない対象に比較して、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）レベルを低下させるのに、又は抑制するのに適切な条件下で投与される。

一実施形態においては、本発明は、ＰＥＧインターフェロン及び本発明の１種類以上の二本鎖核酸分子又はｓｉＮＡ分子を薬剤として許容される担体又は希釈剤中に含む、組成物を特徴とする。別の実施形態においては、本発明は、ＰＥＧインターフェロン、リバビリン、Ｖｅｒｔｅｘ ＶＸ−９５０、Ａｃｔｉｌｏｎ（ＣＰＧ １０１０１）及び／又はＩｓａｔｏｒｉｂｉｎｅ（ＴＬＲ−７作動物質）並びに本発明の１個以上の二本鎖核酸分子又はｓｉＮＡ分子を薬剤として許容される担体又は希釈剤中に含む、組成物を特徴とする。

一実施形態においては、本発明の治療方法は、インターフェロン（例えば、インターフェロン−アルファ、又はＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ、Ｒｅｂｅｔｏｌ、Ｒｅｂｅｔｒｏｎ、ＰｅｇａｓｙｓなどのＰＥＧインターフェロン）、リバビリン、Ｖｅｒｔｅｘ ＶＸ−９５０、Ａｃｔｉｌｏｎ（ＣＰＧ １０１０１）又はＩｓａｔｏｒｉｂｉｎｅ（ＴＬＲ−７作動物質）を含めて、１つ以上の他の治療様式と組み合わせた本発明の二本鎖核酸分子の投与を特徴とする。別の実施形態においては、かかる併用療法を、本明細書に記載の実施形態のいずれにも利用することができる。

本発明の治療方法のいずれにおいても、ｓｉＮＡを対象に治療コースとして投与することができ、例えば、治療コースを通して１日１回、治療コースを通して２日ごとに１回、治療コースを通して３日ごとに１回、治療コースを通して４日ごとに１回、治療コースを通して５日ごとに１回、治療コースを通して６日ごとに１回、治療コースを通して１週間に１回、治療コースを通して隔週で１回、治療コースを通して１か月に１回などの種々の時間間隔で投与することができる。一実施形態においては、治療コースは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０週ごとに１回である。一実施形態においては、治療コースは、約１から約５２週間又はそれ以上（例えば、無期限）である。一実施形態においては、治療コースは、約１から約４８か月間又はそれ以上（例えば、無期限）である。

一実施形態においては、治療コースは、固定間隔（例えば、１×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×又はそれ以上）で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超える週ごとに１回などの初期治療コースと、それに続く追加の固定間隔（例えば、１×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×又はそれを超える）で４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０又はそれを超える週ごとに１回などの治療維持コースとを含む。

本発明の治療方法のいずれにおいても、ｓｉＮＡは、本明細書に記載の、又は当分野で公知のとおりに、単独療法として単体で、又は追加の療法と組み合わせて、本明細書に記載するとおりに、又は当分野で公知のとおりに、対象に全身投与することができる。全身投与としては、例えば、当分野で一般に公知である、肺（吸入、噴霧など） 静脈内、皮下、筋肉内、カテーテル法、鼻咽頭（ｎａｓｏｐｈａｒａｎｇｅａｌ）、経皮又は経口／胃腸投与が挙げられる。

一実施形態においては、本発明の治療又は予防の方法のいずれにおいても、ｓｉＮＡは、当分野で公知のとおりに、単独療法として単体で、又は追加の療法と組み合わせて、本明細書に記載するとおりに、又は当分野で公知のとおりに、対象に局所的に、又は局所組織に、投与することができる。局所投与としては、例えば、当分野で一般に公知である、関連組織への吸入、噴霧、カテーテル法、移植、直接注射、皮膚／経皮投与、ステント術、点耳／点眼若しくは門脈投与、又は任意の他の局所投与技術、方法若しくは手順が挙げられる。

別の実施形態においては、本発明は、対象又は生物体におけるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害する）のに適切な条件下で、対象又は生物体を本発明の１種類以上のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象又は生物体における１個を超えるＨＣＶ標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。

本発明のｓｉＮＡ分子は、種々の核酸分子のＲＮＡｉターゲティングによって、標的遺伝子発現を下方制御又は阻害するように設計することができる。一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子を用いて、例えば異質染色質サイレンシング又は転写阻害によって、標的遺伝子に対応する種々のＤＮＡを標的にする。一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子を用いて、例えばＲＮＡ標的切断又は翻訳阻害によって、標的遺伝子に対応する種々のＲＮＡを標的にする。かかるＲＮＡの非限定的例としては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、又はｍｉＲＮＡ及び他の低分子ＲＮＡを含む調節エレメント（例えば、Ｍａｔｔｉｃｋ， ２００５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０９， １５２７−１５２８及びＣｌａｖｅｒｉｅ， ２００５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０９， １５２９−１５３０参照）、標的遺伝子の代替（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）ＲＮＡスプライスバリアント、標的遺伝子の転写後修飾ＲＮＡ、標的遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡ、及び／又はＲＮＡテンプレートが挙げられる。代替（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）スプライシングによって、適切なエキソンを用いて区別される転写物ファミリーが生成する場合には、本発明によって適切なエキソンを介して遺伝子発現を阻害して、遺伝子ファミリーメンバーの機能を特異的に阻害する、又は区別することができる。例えば、選択的にスプライスされた膜貫通領域を含むタンパク質は、膜結合型と分泌型の両方で発現され得る。膜貫通領域を含むエキソンを標的にするために本発明を使用して、タンパク質の分泌型に対立するものとして、膜結合型の薬剤ターゲティングの機能的結果を判定することができる。これらのＲＮＡ分子のターゲティングに関係した本発明の非限定的適用例としては、治療薬剤用途、化粧品用途、獣医学用途、創薬用途、分子診断及び遺伝子機能用途、並びに、例えば本発明のｓｉＮＡ分子を用いた一塩基多型マッピングによる、遺伝子地図が挙げられる。かかる適用例は、公知の遺伝子配列を用いて、又は発現配列タグ（ＥＳＴ）から利用可能な部分配列から、実施することができる。

別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子を用いて、ＨＣＶファミリー遺伝子（例えば、公知の全ＨＣＶ系統、関係するＨＣＶ系統の群、又は異なるＨＣＶ系統の群）などの遺伝子ファミリーに対応する保存配列を標的にする。したがって、複数のＨＣＶ標的を標的にするｓｉＮＡ分子によって、治療効果を増大させることができる。また、ｓｉＮＡを用いて、多様な用途において遺伝子機能経路を特徴づけることができる。例えば、本発明によって、経路中の標的遺伝子の活性を阻害して、遺伝子機能分析、ｍＲＮＡ機能分析又は翻訳分析において、特徴づけられていない遺伝子の機能を明らかにすることができる。本発明によって、薬剤開発に向けて、種々の疾患及び症状に関与する標的遺伝子経路候補を決定することができる。

また、ｓｉＮＡを用いて、多様な用途において遺伝子機能経路を特徴づけることができる。例えば、本発明によって、経路中の標的遺伝子の活性を阻害して、遺伝子機能分析、ｍＲＮＡ機能分析又は翻訳分析において、特徴づけられていない遺伝子の機能を明らかにすることができる。本発明によって、薬剤開発に向けて、種々の疾患及び症状に関与する標的遺伝子経路候補を決定することができる。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子及び／又は方法を用いて、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッションによって参照されるＲＮＡをコードする遺伝子、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号、例えば、表Ｉに示すＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、又はそのすべてを参照により本明細書に組込む、ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８、米国仮出願第６０／３６３，１２４号及び米国特許出願第１０／９２３，５３６号及び米国特許出願第１０／４４４，８５３号に記載のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号によって本明細書で参照されるＲＮＡ配列をコードする標的遺伝子の発現を下方制御する。

一実施形態においては、本発明は、（ａ）所定の複雑性を有するｓｉＮＡ構築体のライブラリーを作製すること、及び（ｂ）標的ＲＮＡ配列内のＲＮＡｉ標的部位を決定するのに適切な条件下で、上記（ａ）のｓｉＮＡ構築体を分析することを含む、方法を特徴とする。一実施形態においては、（ａ）のｓｉＮＡ分子は、一定の長さ、例えば、約２３ヌクレオチド長の鎖を有する。別の実施形態においては、（ａ）のｓｉＮＡ分子は異なる長さ、例えば約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチド長の鎖を有する。一実施形態においては、アッセイは、本明細書に記載の、再構成されたインビトロｓｉＮＡアッセイを含み得る。別の実施形態においては、アッセイは、標的ＲＮＡが発現される細胞培養系を含み得る。別の実施形態においては、標的ＲＮＡ断片の検出可能な切断レベルを、例えば、ゲル電気泳動、ノーザンブロット分析又はＲＮＡｓｅ保護アッセイによって分析して、標的ＲＮＡ配列内の最も適切な標的部位を決定する。標的ＲＮＡ配列は、例えば、インビトロ系のクローニング及び／又は転写によって、また、インビボ系における細胞発現によって、当分野で公知のとおりに得ることができる。

一実施形態においては、本発明は、（ａ）４^Ｎなどの所定の複雑性を有するｓｉＮＡ構築体の無作為化ライブラリーを作製すること（ここで、Ｎは、ｓｉＮＡ構築体鎖の各々における塩基対形成ヌクレオチド数である（例えば、１９塩基対を含む、２１ヌクレオチドセンス鎖及びアンチセンス鎖を有するｓｉＮＡ構築体の場合、複雑性は４^１９となる。）。）、及び（ｂ）標的ＲＮＡ配列内のＲＮＡｉ標的部位を決定するのに適切な条件下で、上記（ａ）のｓｉＮＡ構築体を分析することを含む、方法を特徴とする。別の実施形態においては、（ａ）のｓｉＮＡ分子は、一定の長さ、例えば、約２３ヌクレオチド長の鎖を有する。更に別の実施形態においては、（ａ）のｓｉＮＡ分子は異なる長さ、例えば約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチド長の鎖を有する。一実施形態においては、アッセイは、本明細書の実施例６に記載の、再構成されたインビトロｓｉＮＡアッセイを含み得る。別の実施形態においては、アッセイは、標的ＲＮＡが発現される細胞培養系を含み得る。別の実施形態においては、標的ＲＮＡ断片の検出可能な切断レベルを、例えば、ゲル電気泳動、ノーザンブロット分析又はＲＮＡｓｅ保護アッセイによって分析して、標的ＲＮＡ配列内の最も適切な標的部位を決定する。標的ＲＮＡ配列は、例えば、インビトロ系のクローニング及び／又は転写によって、また、インビボ系における細胞発現によって、当分野で公知のとおりに得ることができる。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）標的遺伝子によってコードされるＲＮＡ標的の配列を解析すること、（ｂ）（ａ）のＲＮＡの１個以上の領域に相補的である配列を有するｓｉＮＡ分子の１組以上を合成すること、及び（ｃ）標的ＲＮＡ配列内のＲＮＡｉ標的を決定するのに適切な条件下で（ｂ）のｓｉＮＡ分子を分析することを含む、方法を特徴とする。一実施形態においては、（ｂ）のｓｉＮＡ分子は、一定の長さ、例えば、約２３ヌクレオチド長の鎖を有する。別の実施形態においては、（ｂ）のｓｉＮＡ分子は異なる長さ、例えば約１５から約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチド長の鎖を有する。一実施形態においては、アッセイは、本明細書に記載の、再構成されたインビトロｓｉＮＡアッセイを含み得る。別の実施形態においては、アッセイは、標的ＲＮＡが発現される細胞培養系を含み得る。標的ＲＮＡ断片の検出可能な切断レベルを、例えば、ゲル電気泳動、ノーザンブロット分析又はＲＮＡｓｅ保護アッセイによって分析して、標的ＲＮＡ配列内の最も適切な標的部位を決定する。標的ＲＮＡ配列は、例えば、インビトロ系のクローニング及び／又は転写によって、また、インビボ系における発現によって、当分野で公知のとおりに得ることができる。

「標的部位」とは、標的配列に相補的である配列をそのアンチセンス領域内に含むｓｉＮＡ構築体によって媒介される切断のために「標的にされ」る標的ＲＮＡ内の配列を意味する。

「検出可能な切断レベル」とは、標的ＲＮＡの無作為分解によって生成されるＲＮＡのバックグラウンドを超えて、切断産物を識別するのに十分な程度の標的ＲＮＡの切断（及び切断された生成物ＲＮＡの形成）を意味する。標的ＲＮＡの１−５％からの切断産物の生成は、大部分の検出方法のバックグラウンドを超えて検出するのに十分である。

一実施形態においては、本発明は、薬剤として許容される担体又は希釈剤中に、本発明の化学修飾され得るｓｉＮＡ分子を含む、組成物を特徴とする。別の実施形態においては、本発明は、薬剤として許容される担体又は希釈剤中に、化学修飾され得る、１個以上の遺伝子を標的にした、本発明のｓｉＮＡ分子を含む、薬剤組成物を特徴とする。別の実施形態においては、本発明は、対象における疾患、形質又は症状の診断に適切な条件下で、本発明の組成物を対象に投与することを含む、対象における疾患、形質又は症状を診断する方法を特徴とする。別の実施形態においては、本発明は、対象における疾患、形質又は症状の治療又は予防に適切な条件下で、単独で、又は１種類以上の他の治療化合物と併せて、本発明の組成物を対象に投与することを含む、疾患、形質又は症状を治療又は予防する方法を特徴とする。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含む。）、（ｂ）細胞、組織、対象又は生物体における標的遺伝子の発現を調節するのに適切な条件下で、細胞、組織、対象又は生物体にｓｉＮＡ分子を導入すること、及び（ｃ）細胞、組織、対象又は生物体における任意の表現型の変化を評価することによって、遺伝子の機能を明らかにすることを含む、標的遺伝子標的を確認する方法を特徴とする。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾され得る、本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１本は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的である配列を含む。）、（ｂ）生物系における標的遺伝子の発現を調節するのに適切な条件下で、生物系にｓｉＮＡ分子を導入すること、及び（ｃ）生物系における任意の表現型の変化を評価することによって、遺伝子の機能を明らかにすることを含む、標的を確認する方法を特徴とする。

「生物系」とは、ヒト又は動物を含めて、ただしこれらだけに限定されない生物源から得られる精製又は未精製の材料を意味し、この系は、ＲＮＡｉ活性に必要な成分を含む。「生物系」という用語は、例えば、細胞、組織、対象若しくは生物体又はその抽出物を含む。生物系という用語は、インビトロでの状況において使用することができる、再構成されたＲＮＡｉ系も含む。

「表現型の変化」とは、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）による接触又は処理に応じて起こる、細胞の任意の検出可能な変化を意味する。かかる検出可能な変化としては、当分野で公知の方法によって評価することができる、形状、サイズ、増殖、運動性、タンパク質発現若しくはＲＮＡ発現、又は他の物理的若しくは化学的変化が挙げられるが、これらだけに限定されない。検出可能な変化としては、発現タンパク質、又は分析可能な任意の他の細胞成分を特定するのに用いられる、Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）などのレポーター遺伝子／分子又は種々のタグの発現も挙げられる。

一実施形態においては、本発明は、例えば、細胞、組織、対象又は生物体を含めて、生物系における標的遺伝子の発現の調節に使用することができる、本発明の化学修飾され得るｓｉＮＡ分子を含む、キットを特徴とする。別の実施形態においては、本発明は、例えば、細胞、組織、対象又は生物体を含めて、生物系における１個を超える標的遺伝子の発現の調節に使用することができる、本発明の化学修飾され得る１種類を超えるｓｉＮＡ分子を含む、キットを特徴とする。

一実施形態においては、本発明は、本発明の化学修飾され得る１種類以上のｓｉＮＡ分子を含む細胞を特徴とする。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子を含む細胞は、ほ乳動物細胞である。更に別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子を含む細胞は、ヒト細胞である。

一実施形態においては、本発明の化学修飾され得るｓｉＮＡ分子の合成は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の２本の相補鎖の合成と、（ｂ）二本鎖ｓｉＮＡ分子を得るのに適切な条件下で２本の相補鎖を一緒にアニーリングすることを含む。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の２本の相補鎖の合成は、固相オリゴヌクレオチド合成による。更に別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の２本の相補鎖の合成は、固相直列オリゴヌクレオチド合成による。

一実施形態においては、本発明は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の第１のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成すること（ここで、第１のオリゴヌクレオチド配列鎖は、ｓｉＮＡの第２のオリゴヌクレオチド配列鎖の合成の足場として使用することができる切断可能なリンカー分子を含む。）、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチド配列鎖の足場の上にｓｉＮＡの第２のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成すること（ここで、第２のオリゴヌクレオチド配列鎖は、ｓｉＮＡ二本鎖の精製に使用することができる化学部分を更に含む。）、（ｃ）２本のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖がハイブリッド形成して、安定な二本鎖を形成するのに適切な条件下で、（ａ）のリンカー分子を切断すること、及び（ｄ）第２のオリゴヌクレオチド配列鎖の化学部分を利用してｓｉＮＡ二本鎖を精製することを含む、ｓｉＮＡ二本鎖分子を合成する方法を特徴とする。一実施形態においては、上記（ｃ）のリンカー分子の切断は、例えばメチルアミンなどのアルキルアミン塩基を用いた加水分解条件下で、オリゴヌクレオチドの脱保護中に起こる。一実施形態においては、この合成方法は、ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）、ポリスチレンなどの固体支持体上での固相合成を含む。ここで、（ａ）の第１の配列は、固体支持体を足場として用いて、スクシニルリンカーなどの切断可能なリンカー上で合成される。第２の鎖の合成用足場として用いた（ａ）の切断可能なリンカーは、固体支持体によって誘導体化されたリンカーと類似の反応性を含み得る。したがって、固体支持体によって誘導体化されたリンカーと（ａ）の切断可能なリンカーの切断は、同時に起こる。別の実施形態においては、結合したオリゴヌクレオチド配列を単離するのに使用することができる（ｂ）の化学部分は、本明細書に記載のトリチルオン（ｔｒｉｔｙｌ−ｏｎ）合成戦略に使用することができるトリチル基、例えば、ジメトキシトリチル基を含む。更に別の実施形態においては、ジメトキシトリチル基などの化学部分を、例えば酸性条件を用いて、精製中に除去する。

更なる実施形態においては、ｓｉＮＡ合成方法は、溶液相合成又は混成相合成であり、ｓｉＮＡ二本鎖の両方の鎖は、第２の配列の合成用足場として作用する第１の配列に結合した切断可能なリンカーを用いて、タンデム合成される。別々のｓｉＮＡ配列鎖のハイブリダイゼーションに適切な条件下でリンカーを切断すると、二本鎖ｓｉＮＡ分子が形成される。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の１本のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成すること（ここで、この配列は、別のオリゴヌクレオチド配列の合成用足場として使用することができる切断可能なリンカー分子を含む。）、（ｂ）第１の配列鎖に対して相補性を有する第２のオリゴヌクレオチド配列を（ａ）の足場上に合成すること（ここで、第２の配列は、二本鎖ｓｉＮＡ分子の他方の鎖を含み、結合したオリゴヌクレオチド配列の単離に使用することができる化学部分を更に含む。）、（ｃ）切断可能なリンカーによって連結された両方のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖を含む完全長配列を単離するのに適切な条件下で、また、２本のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖がハイブリッド形成して、安定な二本鎖を形成するのに適切な条件下で、第２のオリゴヌクレオチド配列鎖の化学部分を利用して（ｂ）の生成物を精製することを含む、ｓｉＮＡ二本鎖分子を合成する方法を特徴とする。一実施形態においては、上記（ｃ）におけるリンカー分子の切断は、例えば加水分解条件下で、オリゴヌクレオチドの脱保護中に起こる。別の実施形態においては、上記（ｃ）におけるリンカー分子の切断は、オリゴヌクレオチドの脱保護後に起こる。別の実施形態においては、この合成方法は、ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）、ポリスチレンなどの固体支持体上での固相合成を含む。ここで、（ａ）の第１の配列は、固体支持体を足場として用いて、スクシニルリンカーなどの切断可能なリンカー上で合成される。第２の鎖の合成用足場として用いた（ａ）の切断可能なリンカーは、固体支持体によって誘導体化されたリンカーと類似の反応性又は異なる反応性を含み得る。したがって、固体支持体によって誘導体化されたリンカーと（ａ）の切断可能なリンカーの切断は、同時又は逐次的に起こる。一実施形態においては、結合したオリゴヌクレオチド配列の単離に使用することができる（ｂ）の化学部分は、トリチル基、例えば、ジメトキシトリチル基を含む。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）第１と第２の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成すること（ここで、第１の配列は第２の配列に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチド配列は、切断可能なリンカーによって第２の配列に連結されており、末端５’保護基、例えば、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基（５’−Ｏ−ＤＭＴ）は、第２の配列を有するオリゴヌクレオチド上に残る。）、（ｂ）オリゴヌクレオチドを脱保護し、それによって２個のオリゴヌクレオチド配列を連結しているリンカーが切断されること、及び（ｃ）二本鎖ｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、例えば本明細書に記載のトリチルオン合成戦略によって、（ｂ）の生成物を精製することを含む、二本鎖ｓｉＮＡ分子を単一の合成プロセスで作製する方法を特徴とする。

別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子の合成方法は、参照によりその全体を本明細書に組込む、Ｓｃａｒｉｎｇｅ他、米国特許第５，８８９，１３６号、同６，００８，４００号及び同６，１１１，０８６号の教示を含む。

一実施形態においては、本発明は、標的ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ標的）に対してＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構築体を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ構築体は、ｓｉＮＡ構築体のヌクレアーゼ耐性を増大させる、１個以上の化学修飾、例えば、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの１個以上の化学修飾又はその任意の組合せを含む。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）ヌクレアーゼ耐性の増大したｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、ヌクレアーゼ耐性の増大したｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド（例えば、表ＩＶに示すｓｉＮＡモチーフ）又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）毒物学的プロファイルが改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、毒物学的プロファイルが改善された（例えば、免疫賦活性が減弱された、又は免疫賦活性がない）ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子と、本明細書に記載の、又は当分野で公知の、送達ビヒクル又は送達粒子とを含むｓｉＮＡ調合物を生成すること、及び（ｂ）毒物学的プロファイルが改善されたｓｉＮＡ調合物の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ調合物を評価することを含む、毒物学的プロファイルが改善された（例えば、免疫賦活性が減弱された、又は免疫賦活性がない）ｓｉＮＡ調合物を生成する方法を特徴とする。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド（例えば、表ＩＶに示すｓｉＮＡモチーフ）又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）インターフェロン応答を刺激しないｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、細胞、対象又は生物体においてインターフェロン応答を刺激しない（例えば、インターフェロン応答がない、又はインターフェロン応答が減弱された）ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子と、本明細書に記載の、又は当分野で公知の、送達ビヒクル又は送達粒子とを含むｓｉＮＡ調合物を生成すること、及び（ｂ）インターフェロン応答を刺激しないｓｉＮＡ調合物の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ調合物を評価することを含む、細胞、対象又は生物体においてインターフェロン応答を刺激しない（例えば、インターフェロン応答がない、又はインターフェロン応答が減弱された）ｓｉＮＡ調合物を生成する方法を特徴とする。一実施形態においては、インターフェロンは、インターフェロンアルファを含む。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド（例えば、表ＩＶに示すｓｉＮＡモチーフ）又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）サイトカイン応答を刺激しないｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、細胞、対象又は生物体において炎症性又は炎症誘発性サイトカインを刺激しない（例えば、サイトカイン応答がない、又はサイトカイン応答が減弱された）ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。一実施形態においては、サイトカインは、インターロイキン６（ＩＬ−６）などのインターロイキン及び／又は腫よう壊死アルファ（ＴＮＦ−α）を含む。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子と、本明細書に記載の、又は当分野で公知の、送達ビヒクル又は送達粒子とを含むｓｉＮＡ調合物を生成すること、及び（ｂ）サイトカイン応答を刺激しないｓｉＮＡ調合物の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ調合物を評価することを含む、細胞、対象又は生物体において炎症性又は炎症誘発性サイトカインを刺激しない（例えば、サイトカイン応答がない、又はサイトカイン応答が減弱された）ｓｉＮＡ調合物を生成する方法を特徴とする。一実施形態においては、サイトカインは、インターロイキン６（ＩＬ−６）などのインターロイキン及び／又は腫よう壊死アルファ（ＴＮＦ−α）を含む。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド（例えば、表ＩＶに示すｓｉＮＡモチーフ）又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）ＴＬＲ応答を刺激しないｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、細胞、対象又は生物体においてトール様受容体（ＴＬＲ）応答を刺激しない（例えば、ＴＬＲ応答がない、又はＴＬＲ応答が減弱された）ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。一実施形態においては、ＴＬＲは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及び／又はＴＬＲ９を含む。

一実施形態においては、本発明の化学修飾ｓｉＮＡ分子は、全く又はほとんど化学修飾されていない対応するｓｉＲＮＡ分子よりも毒物学的プロファイルが改善されている。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子と、本明細書に記載の、又は当分野で公知の、送達ビヒクル又は送達粒子とを含むｓｉＮＡ調合物を生成すること、及び（ｂ）ＴＬＲ応答を刺激しないｓｉＮＡ調合物の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ調合物を評価することを含む、細胞、対象又は生物体においてトール様受容体（ＴＬＲ）応答を刺激しない（例えば、ＴＬＲ応答がない、又はＴＬＲ応答が減弱された）ｓｉＮＡ調合物を生成する方法を特徴とする。一実施形態においては、ＴＬＲは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及び／又はＴＬＲ９を含む。

一実施形態においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による標的ＲＮＡの切断を誘導する、化学合成された二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、（ａ）前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８から約３８ヌクレオチド長であり、（ｂ）前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって標的ＲＮＡの切断を誘導するのに十分な相補性を、前記標的ＲＮＡに対して有するヌクレオチド配列を含み、（ｃ）前記ｓｉＮＡ分子内のヌクレオチド位置は、対応する無修飾ｓｉＲＮＡ分子のレベルよりも低いレベルにｓｉＮＡ分子の免疫賦活性を低下させるように化学修飾されている。かかるｓｉＮＡ分子は、無修飾又は最小限に修飾されたｓｉＮＡよりも改善された毒物学的プロファイルを有すると言われる。

「改善された毒物学的プロファイル」とは、化学修飾又は調合されたｓｉＮＡ構築体が、細胞、対象又は生物体において、無修飾ｓｉＮＡ、調合されていないｓｉＮＡ、より少数の修飾を有するｓｉＮＡ分子、又は改善された毒物学（ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）を付与するにはさほど有効でない修飾を有するｓｉＮＡ分子よりも毒性が減少していることを意味する。かかるｓｉＮＡ分子は、「改善されたＲＮＡｉ活性」を有するとも考えられる。非限定的例においては、毒物学的プロファイルが改善されたｓｉＮＡ分子及び調合物は、細胞、対象又は生物体において、無修飾ｓｉＮＡ、調合されていないｓｉＮＡ、より少数の修飾を有するｓｉＮＡ分子、又は改善された毒物学を付与するにはさほど有効でない修飾を有するｓｉＮＡ分子よりも低下した、減少した、又は減弱された免疫賦活性応答など、低下した免疫賦活性を伴う。かかる改善された毒物学的プロファイルは、インターフェロン（例えば、インターフェロンアルファ）、炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６などのインターロイキン及び／又はＴＮＦ−アルファ）及び／又はトール様受容体（例えば、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８及び／又はＴＬＲ−９）の誘導の減少又は抑止など、抑止された、又は減少した免疫賦活を特徴とする。一実施形態においては、毒物学的プロファイルが改善されたｓｉＮＡ分子又は調合物は、リボヌクレオチドを含まない。一実施形態においては、毒物学的プロファイルが改善されたｓｉＮＡ分子又は調合物は、５個未満のリボヌクレオチド（例えば、１、２、３又は４個のリボヌクレオチド）を含む。一実施形態においては、毒物学的プロファイルが改善されたｓｉＮＡ分子又は調合物は、Ｓｔａｂ ７、Ｓｔａｂ ８、Ｓｔａｂ １１、Ｓｔａｂ １２、Ｓｔａｂ １３、Ｓｔａｂ １６、Ｓｔａｂ １７、Ｓｔａｂ １８、Ｓｔａｂ １９、Ｓｔａｂ ２０、Ｓｔａｂ ２３、Ｓｔａｂ ２４、Ｓｔａｂ ２５、Ｓｔａｂ ２６、Ｓｔａｂ ２７、Ｓｔａｂ ２８、Ｓｔａｂ ２９、Ｓｔａｂ ３０、Ｓｔａｂ ３１、Ｓｔａｂ ３２、Ｓｔａｂ ３３、Ｓｔａｂ ３４、Ｓｔａｂ ３５、Ｓｔａｂ ３６又はその任意の組合せを含む（表ＩＶ参照）。本明細書では、数字で表したＳｔａｂケミストリーは、表ＩＶに示すケミストリーの２’−フルオロと２’−ＯＣＦ３の両方のバージョンを含む。例えば、「Ｓｔａｂ ７／８」は、Ｓｔａｂ ７／８とＳｔａｂ ７Ｆ／８Ｆの両方を指す。一実施形態においては、毒物学的プロファイルが改善されたｓｉＮＡ分子又は調合物は、本発明のｓｉＮＡ分子、及び図面を含めて、参照によりその全体を本明細書に組込む米国特許出願公開第２００３００７７８２９号に記載された調合物を含む。

一実施形態においては、所与のｓｉＮＡ分子に付随する免疫賦活性応答レベルは、本明細書に記載のとおりに測定することができ、又は例えば、特定のｓｉＮＡ分子の免疫賦活性応答を定量するアッセイにおいて、ＰＫＲ／インターフェロン応答、増殖、Ｂ細胞活性化及び／又はサイトカイン産生のレベルを求めることによって、当分野で公知のとおりに測定することができる（例えば、その全体を参照により組込む、Ｌｅｉｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２６， ３１３−９及び米国特許第５，９６８，９０９号を参照されたい。）。一実施形態においては、低下した免疫賦活性応答は、無修飾又は最小限に修飾されたｓｉＲＮＡ分子と比較して約１０％及び約１００％、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％低下した免疫賦活性応答である。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子に関連した免疫賦活性応答は、化学修飾の程度によって調節することができる。例えば、修飾ｓｉＮＡ分子中のヌクレオチド位置の約１０％から約１００％（例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％、又は少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％）を有するｓｉＮＡ分子を、本明細書に記載の対応する免疫賦活性度を有するように選択することができる。

一実施形態においては、低下した免疫賦活性応答の程度を、ＲＮＡｉ活性を最適化するために選択する。例えば、ある程度の免疫賦活を保持することは、ウイルス感染症を治療するために好ましい場合がある。この場合、免疫賦活の１００％未満の減少が、最大の抗ウイルス活性に好ましい場合があるのに対して（例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の免疫賦活の減少）、非特異的毒性又はオフターゲット（ｏｆｆ ｔａｒｇｅｔ）効果を防止するのに最小の免疫賦活性を有するｓｉＮＡ分子を用いて、内在性遺伝子標的の発現を阻止することが好ましい場合もある（例えば、約９０％から約１００％の免疫賦活の減少）。

一実施形態においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による標的ＲＮＡの切断を誘導する、化学合成された二本鎖ｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、（ａ）前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８から約３８ヌクレオチド長であり、（ｂ）前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって標的ＲＮＡの切断を誘導するのに十分な相補性を、前記標的ＲＮＡに対して有するヌクレオチド配列を含み、（ｃ）前記ｓｉＮＡ分子の１個以上のヌクレオチドは、対応する無修飾ｓｉＲＮＡ分子のレベルよりも低いレベルにｓｉＮＡ分子の免疫賦活性を低下させるように化学修飾されている。一実施形態においては、各鎖は、他方の鎖のヌクレオチドに相補的である少なくとも約１８個のヌクレオチドを含む。

別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の免疫賦活性を低下させる修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を有するアンチセンス領域を含み、センス領域を更に含む。ここで、前記センス領域は、前記標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部にかなり類似したヌクレオチド配列を含む。その一実施形態においては、アンチセンス領域及びセンス領域は、約１８から約３８ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス領域は、センス領域のヌクレオチドに相補的である少なくとも約１８ヌクレオチドを含む。その一実施形態においては、センス領域中のピリミジンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである。その別の実施形態においては、センス領域中のプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。その更に別の実施形態においては、センス領域に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。その別の実施形態においては、前記アンチセンス領域のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。その更に別の実施形態においては、前記アンチセンス領域のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。その更に別の実施形態においては、前記アンチセンス領域中に存在するプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、アンチセンス領域は、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合を前記アンチセンス領域の３’末端に含む。別の実施形態においては、アンチセンス領域は、グリセリル修飾を前記アンチセンス領域の３’末端に含む。

別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の免疫賦活性を低下させる修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の構造上の特徴のいずれかを含み得る。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の免疫賦活性を低下させる修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の化学修飾のいずれかを含み得る。

一実施形態においては、本発明は、（ａ）１個以上の修飾ヌクレオチド分子をｓｉＮＡに導入すること、及び（ｂ）無修飾ヌクレオチドを有する対応するｓｉＮＡ分子よりも免疫賦活性が低下したｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、ｓｉＮＡ分子の免疫賦活性を低下させる化学修飾ヌクレオチドを有する、化学合成された二本鎖ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８から約３８ヌクレオチド長である。ＳｉＮＡ分子の１本の鎖は、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって標的ＲＮＡの切断を誘導するのに十分な相補性を、標的ＲＮＡに対して有する、ヌクレオチド配列を含む。一実施形態においては、低下した免疫賦活性は、ｓｉＮＡが細胞、組織又は生物体に導入されるのに応答した、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫よう壊死アルファ（ＴＮＦ−α）などの炎症性又は炎症誘発性サイトカインの抑止された、又は低下した誘導を含む。別の実施形態においては、低下した免疫賦活性は、ｓｉＮＡが細胞、組織又は生物体に導入されるのに応答した、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９などのトール様受容体（ＴＬＲ）の抑止された、又は低下した誘導を含む。別の実施形態においては、低下した免疫賦活性は、ｓｉＮＡが細胞、組織又は生物体に導入されるのに応答した、インターフェロンアルファなどのインターフェロンの抑止された、又は低下した誘導を含む。

一実施形態においては、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構築体を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ構築体は、ｓｉＮＡ構築体のセンス鎖とアンチセンス鎖の結合親和性を調節する本明細書に記載の１個以上の化学修飾を含む。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）ｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖の結合親和性が増加したｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖の結合親和性が増加したｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。

一実施形態においては、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構築体を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ構築体は、ｓｉＮＡ構築体のアンチセンス鎖と細胞内の相補的標的ＲＮＡ配列との結合親和性を調節する本明細書に記載の１個以上の化学修飾を含む。

一実施形態においては、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構築体を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ構築体は、ｓｉＮＡ構築体のアンチセンス鎖と細胞内の相補的標的ＤＮＡ配列との結合親和性を調節する本明細書に記載の１個以上の化学修飾を含む。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補的標的ＲＮＡ配列との結合親和性が増加したｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補的標的ＲＮＡ配列との結合親和性が増加したｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補的標的ＤＮＡ配列との結合親和性が増加したｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補的標的ＤＮＡ配列との結合親和性が増加したｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。

一実施形態においては、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構築体を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ構築体は、化学修飾ｓｉＮＡ構築体に対して配列相同性を有する追加の内因性ｓｉＮＡ分子を生成し得る細胞ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を調節する、本明細書に記載の１個以上の化学修飾を含む。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）化学修飾ｓｉＮＡ分子に対して配列相同性を有する追加の内因性ｓｉＮＡ分子を生成し得る細胞ポリメラーゼの高いポリメラーゼ活性を媒介し得るｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、化学修飾ｓｉＮＡ分子に対して配列相同性を有する追加の内因性ｓｉＮＡ分子を生成し得る細胞ポリメラーゼの高いポリメラーゼ活性を媒介し得るｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。

一実施形態においては、本発明は、細胞中の標的ポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉを媒介する化学修飾ｓｉＮＡ構築体を特徴とする。ここで、化学修飾は、かかるｓｉＮＡ構築体によって媒介されるＲＮＡｉの効力を減少させるように、ｓｉＮＡと、標的ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子及び／又はタンパク質、又はＲＮＡｉに必須である他の因子との相互作用をさほど引き起こさない。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）ＲＮＡｉ特異性が改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、ポリヌクレオチド標的に対するＲＮＡｉ特異性が改善されたｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。一実施形態においては、改善された特異性は、無修飾ｓｉＮＡ分子に比較して低いオフターゲット効果を有することを含む。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖又は領域の３’末端に、５’末端に、又は３’末端と５’末端の両方に末端キャップ部分を導入すると、センス鎖又はセンス領域に対して相補性を有する対応する標的に対して、センス鎖又はセンス領域がＲＮＡｉ活性のテンプレートとして作用するのを阻止することによって、ｓｉＮＡが、改善された特異性を有するようにすることができる。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）ＲＮＡｉ活性が改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、標的ポリヌクレオチドに対するＲＮＡｉ活性が改善されたｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。

更に別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）標的ＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性が改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、標的ＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性が改善されたｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。

更に別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）標的ＤＮＡに対するＲＮＡｉ活性が改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、標的ＤＮＡに対するＲＮＡｉ活性が改善されたｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。

一実施形態においては、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構築体を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ構築体は、ｓｉＮＡのコレステロール抱合などのｓｉＮＡ構築体の細胞内取り込みを調節する本明細書に記載の１個以上の化学修飾を含む。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）細胞内取り込みが改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、細胞内取り込みが改善された、標的ポリヌクレオチドに対するｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。

一実施形態においては、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構築体を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ構築体は、例えば、ｓｉＮＡ構築体の薬物動態学を改善する、ポリエチレングリコールなどの高分子抱合体、若しくは等価な抱合体を結合させることによって、又は特定の組織タイプ若しくは細胞タイプをインビボで標的にする抱合体を結合させることによって、ｓｉＮＡ構築体の生物学的利用能を増大させる、本明細書に記載の１個以上の化学修飾を含む。かかる抱合体の非限定的例は、参照により本明細書に組込む、Ｖａｒｇｅｅｓｅ他、米国特許出願第１０／２０１，３９４号に記述されている。

一実施形態においては、本発明は、（ａ）抱合体をｓｉＮＡ分子構造に導入すること、及び（ｂ）生物学的利用能が改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、生物学的利用能が改善された、本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。かかる抱合体としては、天然タンパク質リガンド由来のペプチドなどの細胞受容体のリガンド；細胞のＺＩＰコード配列を含めたタンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；葉酸塩、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどのビタミン及び他の補因子；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー；リン脂質；コレステロール；コレステロール誘導体、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミンなどが挙げられる。

一実施形態においては、本発明は、標的ＲＮＡ配列又はその一部に相補的である第１のヌクレオチド配列と、前記第１の配列に対して相補性を有する第２の配列とを含む、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記第２の配列は、ＲＮＡ干渉を効率的に媒介するガイド配列としてもはや作用しないように、及び／又はＲＮＡｉを促進する細胞タンパク質によって認識されるように、化学修飾されている。一実施形態においては、ｓｉＮＡの第１のヌクレオチド配列は、本明細書に記載のとおりに化学修飾されている。一実施形態においては、ｓｉＮＡの第１のヌクレオチド配列は修飾されていない（例えば、全ＲＮＡである。）。

一実施形態においては、本発明は、標的ＲＮＡ配列又はその一部に相補的である第１のヌクレオチド配列と、前記第１の配列に対して相補性を有する第２の配列とを含む、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、第２の配列は、ガイド配列として、又は標的核酸（例えば、ＲＮＡ）配列に相補的である配列として、ＲＮＡｉ経路に入るのを阻止するように、設計又は修飾されている。一実施形態においては、ｓｉＮＡの第１のヌクレオチド配列は、本明細書に記載のとおりに化学修飾されている。一実施形態においては、ｓｉＮＡの第１のヌクレオチド配列は修飾されていない（例えば、全ＲＮＡである。）。かかる設計又は修飾は、ｓｉＮＡの活性を高め、及び／又は本発明のｓｉＮＡ分子の特異性を改善すると予想される。これらの修飾は、オフターゲット効果及び／又は付随する毒性を最小化することも予想される。

一実施形態においては、本発明は、標的ＲＮＡ配列又はその一部に相補的である第１のヌクレオチド配列と、前記第１の配列に対して相補性を有する第２の配列とを含む、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記第２の配列は、ＲＮＡ干渉を媒介するガイド配列として作用することができない。一実施形態においては、ｓｉＮＡの第１のヌクレオチド配列は、本明細書に記載のとおりに化学修飾されている。一実施形態においては、ｓｉＮＡの第１のヌクレオチド配列は修飾されていない（例えば、全ＲＮＡである。）。

一実施形態においては、本発明は、標的ＲＮＡ配列又はその一部に相補的である第１のヌクレオチド配列と、前記第１の配列に対して相補性を有する第２の配列とを含む、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記第２の配列は、末端５’ヒドロキシル（５’−ＯＨ）又は５’リン酸基を持たない。

一実施形態においては、本発明は、標的ＲＮＡ配列又はその一部に相補的である第１のヌクレオチド配列と、前記第１の配列に対して相補性を有する第２の配列とを含む、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記第２の配列は、末端キャップ部分を前記第２の配列の５’末端に含む。一実施形態においては、末端キャップ部分は、反転脱塩基、反転デオキシ脱塩基、反転ヌクレオチド部分、図１０に示す基、アルキル若しくはシクロアルキル基、複素環、又は第２の配列がＲＮＡｉのガイド配列若しくはテンプレートとして役立つＲＮＡｉ活性を阻止する任意の他の基を含む。

一実施形態においては、本発明は、標的ＲＮＡ配列又はその一部に相補的である第１のヌクレオチド配列と、前記第１の配列に対して相補性を有する第２の配列とを含む、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記第２の配列は、末端キャップ部分を前記第２の配列の５’末端及び３’末端に含む。一実施形態においては、各末端キャップ部分は、反転脱塩基、反転デオキシ脱塩基、反転ヌクレオチド部分、図１０に示す基、アルキル若しくはシクロアルキル基、複素環、又は第２の配列がＲＮＡｉのガイド配列若しくはテンプレートとして役立つＲＮＡｉ活性を阻止する任意の他の基を個々に含む。

一実施形態においては、本発明は、（ａ）１個以上の化学修飾をｓｉＮＡ分子構造に導入すること、及び（ｂ）特異性が改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、標的核酸（例えば、遺伝子、その対応するＲＮＡなどのＤＮＡ又はＲＮＡ）の発現を下方制御又は阻害する、特異性が改善された本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。別の実施形態においては、特異性の改善に使用される化学修飾は、ｓｉＮＡ分子の５’末端、３’末端、又は５’末端と３’末端の両方の末端キャップ修飾を含む。末端キャップ修飾は、例えば、図１０に示す構造（例えば、反転デオキシ脱塩基部分）、又はｓｉＮＡ分子の一部（例えば、センス鎖）がオフターゲット核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介できないようにする任意の他の化学修飾を含み得る。非限定的例においては、ｓｉＮＡ分子は、ＲＩＳＣによって媒介される、対応する標的ＲＮＡ配列の分解のガイド配列としてｓｉＮＡ分子のアンチセンス配列のみが役立ち得るように設計される。これは、ＲＮＡｉ機構によってセンス鎖がガイド配列として認識されないようにする化学修飾をセンス鎖に導入して、ｓｉＮＡのセンス配列を不活性化することによって実施することができる。一実施形態においては、かかる化学修飾は、ｓｉＮＡのセンス鎖の５’末端における任意の化学基、又はＲＮＡ干渉を媒介するガイド配列としてのセンス鎖を不活性にするのに役立つ任意の他の基を含む。これらの修飾は、例えば、センス鎖の５’末端が、遊離５’ヒドロキシル（５’−ＯＨ）も、遊離５’リン酸基（例えば、リン酸、二リン酸、三リン酸、環式リン酸など）ももはや持たない分子をもたらし得る。かかるｓｉＮＡ構築体の非限定的例は、「Ｓｔａｂ ９／１０」、「Ｓｔａｂ ７／８」、「Ｓｔａｂ ７／１９」、「Ｓｔａｂ １７／２２」、「Ｓｔａｂ ２３／２４」、「Ｓｔａｂ ２４／２５」及び「Ｓｔａｂ ２４／２６」（例えば、Ｓｔａｂ ７、９、１７、２３又は２４センス鎖を有する任意のｓｉＮＡ）ケミストリー及びその変種など、本明細書に記載されている（表ＩＶ参照）。ここで、ｓｉＮＡのセンス鎖の５’末端及び３’末端は、ヒドロキシル基もリン酸基も含まない。本明細書では、数字で表したＳｔａｂケミストリーは、表ＩＶに示すケミストリーの２’−フルオロと２’−ＯＣＦ３の両方のバージョンを含む。例えば、「Ｓｔａｂ ７／８」は、Ｓｔａｂ ７／８とＳｔａｂ ７Ｆ／８Ｆの両方を指す。

一実施形態においては、本発明は、ｓｉＮＡ分子の鎖又は一部がＲＮＡｉ活性に対するテンプレート又はガイド配列として作用しないようにする１個以上の化学修飾をｓｉＮＡ分子構造に導入することを含む、標的核酸（例えば、遺伝子、その対応するＲＮＡなどのＤＮＡ又はＲＮＡ）の発現を下方制御又は阻害する、特異性が改善された本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の不活性鎖又はセンス領域は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖又はセンス領域、すなわち標的核酸配列に対して相補性を持たない、ｓｉＮＡの鎖又は領域である。一実施形態においては、かかる化学修飾は、５’ヒドロキシル（５’−ＯＨ）も５’リン酸基も含まないｓｉＮＡのセンス鎖又は領域の５’末端における任意の化学基、又はＲＮＡ干渉を媒介するガイド配列としてのセンス鎖若しくはセンス領域を不活性にするのに役立つ任意の他の基を含む。かかるｓｉＮＡ構築体の非限定的例は、「Ｓｔａｂ ９／１０」、「Ｓｔａｂ ７／８」、「Ｓｔａｂ ７／１９」、「Ｓｔａｂ １７／２２」、「Ｓｔａｂ ２３／２４」、「Ｓｔａｂ ２４／２５」及び「Ｓｔａｂ ２４／２６」（例えば、Ｓｔａｂ ７、９、１７、２３又は２４センス鎖を有する任意のｓｉＮＡ）ケミストリー及びその変種など、本明細書に記載されている（表ＩＶ参照）。ここで、ｓｉＮＡのセンス鎖の５’末端及び３’末端は、ヒドロキシル基もリン酸基も含まない。本明細書では、数字で表したＳｔａｂケミストリーは、表ＩＶに示すケミストリーの２’−フルオロと２’−ＯＣＦ３の両方のバージョンを含む。例えば、「Ｓｔａｂ ７／８」は、Ｓｔａｂ ７／８とＳｔａｂ ７Ｆ／８Ｆの両方を指す。

一実施形態においては、本発明は、（ａ）複数の無修飾ｓｉＮＡ分子を生成すること、（ｂ）標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介するのに活性であるｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子をスクリーニングすること、及び（ｃ）化学修飾（例えば、本明細書に記載の、又は当分野で公知の化学修飾）を（ｂ）の活性ｓｉＮＡ分子に導入することを含む、標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介するのに活性であるｓｉＮＡ分子をスクリーニングする方法を特徴とする。一実施形態においては、この方法は、標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介するのに活性である化学修飾ｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ｃ）の化学修飾ｓｉＮＡ分子を再スクリーニングすることを更に含む。

一実施形態においては、本発明は、（ａ）複数の化学修飾ｓｉＮＡ分子（例えば、本明細書に記載の、又は当分野で公知のｓｉＮＡ分子）を生成すること、及び（ｂ）標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介するのに活性である化学修飾ｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子をスクリーニングすることを含む、標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介するのに活性である化学修飾ｓｉＮＡ分子をスクリーニングする方法を特徴とする。

「リガンド」という用語は、受容体などの別の化合物と直接的又は間接的に相互作用し得る、薬物、ペプチド、ホルモン、神経伝達物質などの任意の化合物又は分子を指す。リガンドと相互作用する受容体は、細胞表面に存在し得、又は細胞間受容体であり得る。リガンドと受容体の相互作用は、生化学反応をもたらし得、又は単なる物理的相互作用若しくは会合であり得る。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）賦形剤調合物をｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）生物学的利用能が改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、生物学的利用能が改善された、本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。かかる賦形剤としては、シクロデキストリンなどのポリマー、脂質、陽イオン性脂質、ポリアミン、リン脂質、ナノ粒子、受容体、リガンドなどが挙げられる。

別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド又はその任意の組合せをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）生物学的利用能が改善されたｓｉＮＡ分子の単離に適切な条件下で、段階（ａ）のｓｉＮＡ分子を評価することを含む、生物学的利用能が改善された本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。

別の実施形態においては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が発明のｓｉＮＡ化合物と共有結合し得る。結合するＰＥＧは、任意の分子量とすることができ、好ましくは約１００から約５０，０００ダルトン（Ｄａ）とすることができる。

本発明は、単独で使用することができ、又は試験試料及び／又は対象にインビトロ若しくはインビボでＲＮＡを導入するのに必要な試薬の少なくとも１種類を含むキットの１構成要素として使用することができる。例えば、キットの好ましい成分としては、本発明のｓｉＮＡ分子、及び（例えば、脂質、及び当分野で公知の他の移入方法を用いて）本明細書に記載したように目的細胞へのｓｉＮＡの導入を促進するビヒクルが挙げられる（例えば、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ他、米国特許第６，３９５，７１３号参照）。キットは、遺伝子機能及び／又は活性の測定、薬物の最適化、創薬などにおける標的確認に使用することができる（例えば、Ｕｓｍａｎ他、米国特許出願第６０／４０２，９９６号参照）。かかるキットは、キットの使用者が本発明を実施できるようにする説明書も含むことができる。

本明細書では「低分子干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉核酸分子」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」又は「化学修飾低分子干渉核酸分子」という用語は、ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」又は遺伝子サイレンシングを配列特異的に媒介することによって、遺伝子発現又はウイルス複製を阻害又は下方制御することができる任意の核酸分子を指す。これらの用語は、個々の核酸分子、複数のかかる核酸分子、又はかかる核酸分子のプールも表し得る。ＳｉＮＡは、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む二本鎖核酸分子であり得る。ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列、及び標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列又はその一部を有するセンス領域を含む。ＳｉＮＡは、一方の鎖がセンス鎖であり、他方がアンチセンス鎖である、２個の別々のオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。ここで、アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補的である（すなわち、アンチセンス鎖とセンス鎖が二本鎖又は二本鎖構造を形成するなど、各鎖は、他方の鎖中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ここで、例えば、二本鎖領域は、約１５から約３０、例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０塩基対である。アンチセンス鎖は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を含む（例えば、ｓｉＮＡ分子の約１５から約２５個又はそれを超えるヌクレオチドは、標的核酸又はその一部に相補的である）。或いは、ｓｉＮＡは、単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、ｓｉＮＡの自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域は、核酸リンカー又は非核酸リンカーによって連結されている。ＳｉＮＡは、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む、二本鎖、非対称二本鎖、ヘアピン又は非対称ヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであり得る。ここで、アンチセンス領域は、別個の標的核酸分子中のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列、及び標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列又はその一部を有するセンス領域を含む。ＳｉＮＡは、２個以上のループ構造と、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む軸（ｓｔｅｍ）とを有する、環状一本鎖ポリヌクレオチドであり得る。ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列、及び標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を有するセンス領域を含み、環状ポリヌクレオチドは、インビボ又はインビトロでプロセシングを受けて、ＲＮＡｉを媒介し得る活性なｓｉＮＡ分子を生成し得る。ＳｉＮＡは、標的核酸分子中のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドも含み得る（例えば、かかるｓｉＮＡ分子は、標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列がｓｉＮＡ分子内に存在する必要がない。）。一本鎖ポリヌクレオチドは、５’リン酸（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｃｅｌｌ．， １１０， ５６３−５７４及びＳｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ， １０， ５３７−５６８参照）、５’，３’−二リン酸などの末端リン酸基を更に含み得る。ある実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、別々のセンス及びアンチセンス配列又は領域を含む。ここで、センス領域とアンチセンス領域は、当分野で公知のヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合しており、又はイオン相互作用、水素結合、ファン デル ワールス相互作用、疎水性相互作用及び／又はスタッキング相互作用によって交互に非共有結合している。ある実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子の発現を阻害するように、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書では、ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含む分子に必ずしも限定されず、化学修飾ヌクレオチド及び非ヌクレオチドも包含する。ある実施形態においては、本発明の低分子干渉核酸分子は、２’ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠く。本出願人は、ある実施形態において、ＲＮＡｉを媒介するのに２’ヒドロキシル基を有するヌクレオチドの存在が不要である低分子干渉核酸を記述する。したがって、本発明の低分子干渉核酸分子は、リボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まなくてもよい。しかし、ＲＮＡｉを維持するのにｓｉＮＡ分子内のリボヌクレオチドの存在が不要であるかかるｓｉＮＡ分子は、２’−ＯＨ基を有する１個以上のヌクレオチドを含む、結合したリンカー、又は他の結合若しくは会合した基、部分若しくは鎖を有し得る。場合によっては、ｓｉＮＡ分子は、ヌクレオチド位置の約５、１０、２０、３０、４０又は５０％においてリボヌクレオチドを含み得る。本発明の修飾低分子干渉核酸分子は、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド「ｓｉＭＯＮ」とも称し得る。本明細書ではｓｉＮＡという用語は、配列特異的ＲＮＡｉを媒介し得る核酸分子の記述に用いられる他の用語、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）などと同義であるものとする。本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的例を本明細書の図４−６並びに表ＩＩ及びＩＩＩに示す。かかるｓｉＮＡ分子は、リボザイム、アンチセンス、三重鎖形成、アプタマー、２，５−Ａキメラ、デコイオリゴヌクレオチドなど、遺伝子発現の阻害を媒介する、当分野で公知の他の核酸技術とは異なる。

「ＲＮＡ干渉」又は「ＲＮＡｉ」とは、当分野で一般に公知であり、低分子干渉核酸分子によって媒介される、細胞における遺伝子発現を阻害又は下方制御する生物学的プロセスである。例えば、Ｚａｍｏｒｅ ａｎｄ Ｈａｌｅｙ， ２００５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０９， １５１９−１５２４；Ｖａｕｇｈｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ， ２００５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０９， １５２５−１５２６；Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｃｅｌｌ， １０１， ２５−３３；Ｂａｓｓ， ２００１， Ｎａｔｕｒｅ， ４１１， ４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｎａｔｕｒｅ， ４１１， ４９４−４９８；及びＫｒｅｕｔｚｅｒ他、国際公開第００／４４８９５号；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ他、国際公開第０１／３６６４６号；Ｆｉｒｅ、国際公開第９９／３２６１９号；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ他、国際公開第００／０１８４６号；Ｍｅｌｌｏ及びＦｉｒｅ、国際公開第０１／２９０５８号；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ、国際公開第９９／０７４０９号及びＬｉ他、国際公開第００／４４９１４号；Ａｌｌｓｈｉｒｅ， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９７， １８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９７， １８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９７， ２２１５−２２１８；及びＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９７， ２２３２−２２３７；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９７， ２０５６−６０；ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．， ２００２， ＲＮＡ， ８， ８４２−８５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖ．， １６， １６１６−１６２６；及びＲｅｉｎｈａｒｔ ＆ Ｂａｒｔｅｌ， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９７， １８３１を参照されたい。）。また、本明細書では、ＲＮＡｉという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、エピジェネティクスなどの配列特異的ＲＮＡ干渉の記述に用いられる他の用語と同義であるものとする。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子を用いて、転写後レベル又は転写前レベルで遺伝子をエピジェネティックにサイレンシングすることができる。非限定的例においては、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現のエピジェネティックな調節は、遺伝子発現を変える、クロマチン構造又はメチル化パターンの、ｓｉＮＡによって媒介される改変に起因し得る（例えば、Ｖｅｒｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０３， ６７２−６７６；Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０３， ６６９−６７２；Ａｌｌｓｈｉｒｅ， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９７， １８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９７， １８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９７， ２２１５−２２１８及びＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９７， ２２３２−２２３７参照）。別の非限定的例においては、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の調節は、ＲＩＳＣを介した、ｓｉＮＡによって媒介されるＲＮＡ（コード又は非コードＲＮＡ）の切断、又は当分野で公知の翻訳阻害に起因し得る。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の調節は、転写阻害に起因し得る（例えば、Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １， ２１６−２２２参照）。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、二本鎖形成性オリゴヌクレオチド「ＤＦＯ」である（例えば、図１４−１５、並びに２００３年１２月３日に出願されたＶａｉｓｈ他、米国特許出願第１０／７２７，７８０号、及び２００４年５月２４日出願された国際ＰＣＴ出願第ＵＳ０４／１６３９０号参照）。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は多官能ｓｉＮＡである（例えば、図１６−２１、並びにＪａｄｈａｖ他、２００４年２月１０日に出願された米国特許出願第６０／５４３，４８０号、及び２００４年５月２４日に出願された国際ＰＣＴ出願第ＵＳ０４／１６３９０号参照）。一実施形態においては、本発明の多官能ｓｉＮＡは、例えば、標的ＲＮＡの２個以上の領域を標的にした配列を含み得る（例えば、表ＩＩ及びＩＩＩの標的配列参照）。一実施形態においては、本発明の多官能ｓｉＮＡは、ＨＣＶ ＲＮＡを標的にした配列を含み得、細胞受容体、細胞表面分子、細胞酵素、細胞転写因子、及び／又はサイトカイン、二次メッセンジャー、並びにＬａ抗原（例えば、Ｃｏｓｔａ−Ｍａｔｔｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ２４， ６８６１−７０参照。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３１４２）（例えば、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８２５０３．１）、細胞ＰＫＲプロテインキナーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００２６６１．７）、ヒト真核生物開始因子２Ｂ（ｅｌＦ２Ｂガンマ；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２５６２２３、及び／又はｅｌＦ２ガンマ；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６８７４．１）、ヒトＤＥＡＤ Ｂｏｘタンパク質（ＤＤＸ３；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０１８０２１．２）、及びポリピリミジントラクト結合タンパク質などのＨＣＶ ３’−ＵＴＲのポリ（Ｕ）トラクトに結合する細胞タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３１９９１．１及びＸＭ＿０４２９７２．３）を含めて、ただしこれらだけに限定されない細胞アクセサリー分子など、ＨＣＶ生活環に関与する１個以上の細胞標的を含み得る。

本明細書では「非対称ヘアピン」とは、アンチセンス領域と、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含み得るループ部分と、センス領域がアンチセンス領域と塩基対を形成して、ループを有する二本鎖を形成するのに十分な相補ヌクレオチドを有する程度にアンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含むセンス領域とを含む、線状ｓｉＮＡ分子を意味する。例えば、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、細胞又はインビトロ系においてＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例えば、約１５から約３０、又は約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチド）を有するアンチセンス領域と、約４から約１２（例えば、約４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２）個のヌクレオチドを含むループ領域と、アンチセンス領域に相補的である約３から約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）個のヌクレオチドを有するセンス領域とを含み得る。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、化学修飾され得る５’末端リン酸基も含み得る。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部分は、本明細書に記載のヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子又は抱合分子を含み得る。

本明細書では「非対称二本鎖」とは、センス領域及びアンチセンス領域を含む２本の別々の鎖を有するｓｉＮＡ分子を意味する。ここで、センス領域は、センス領域がアンチセンス領域と塩基対を形成して、二本鎖を形成するのに十分な相補ヌクレオチドを有する程度にアンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む。例えば、本発明の非対称二本鎖ｓｉＮＡ分子は、細胞又はインビトロ系においてＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例えば、約１５から約３０、又は約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチド）を有するアンチセンス領域と、アンチセンス領域に相補的である約３から約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）個のヌクレオチドを有するセンス領域とを含み得る。

「ＲＮＡｉ阻害剤」とは、細胞又は生物体におけるＲＮＡ干渉機能又は活性を下方制御、減少又は阻害し得る任意の分子を意味する。ＲＮＡｉ阻害剤は、ＲＩＳＣなどのタンパク質成分、又はｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどの核酸成分を含めて、ＲＮＡｉ経路の任意の成分と相互作用することによって、又は該成分の機能を妨害することによって、ＲＮＡｉを下方制御、減少又は阻害し得る（例えば、ＲＮＡｉによって媒介される標的ポリヌクレオチドの切断、翻訳阻害、又は転写サイレンシング）。ＲＮＡｉ阻害剤は、ＲＩＳＣ、ｍｉＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡ、又は細胞若しくは生物体におけるＲＮＡｉ経路の任意の他の成分と相互作用する、又はその機能を妨害する、ｓｉＮＡ分子、アンチセンス分子、アプタマー又は小分子であり得る。ＲＮＡｉを阻害することによって（例えば、ＲＮＡｉによって媒介される標的ポリヌクレオチドの切断、翻訳阻害、又は転写サイレンシング）、本発明のＲＮＡｉ阻害剤を用いて、標的遺伝子の発現を調節（例えば、上方制御又は下方制御）することができる。一実施形態においては、本発明のＲＮＡ阻害剤を用いて、翻訳阻害により、転写サイレンシングにより、又はＲＩＳＣによって媒介されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の切断により、遺伝子発現の内因的下方制御又は阻害を妨害（例えば、減少又は阻止）することによって、遺伝子発現を上方制御する。したがって、遺伝子発現の内因的抑制、サイレンシング又は阻害の機序を妨害することによって、本発明のＲＮＡｉ阻害剤を用いて、機能喪失に起因する疾患、形質又は症状の治療のために、遺伝子発現を上方制御することができる。一実施形態においては、「ＲＮＡｉ阻害剤」という用語は、例えば、機能喪失の疾患、形質及び／又は症状の治療のために遺伝子発現を増大させる効果を有する、本明細書の種々の実施形態における「ｓｉＮＡ」という用語の代わりに使用される。

本明細書では「アプタマー」又は「核酸アプタマー」とは、標的分子に特異的に結合するポリヌクレオチドを意味し、核酸分子は、その自然な状況において標的分子によって認識される配列とは異なる配列を有する。或いは、アプタマーは、核酸と自然には結合しない標的分子と結合する核酸分子であり得る。標的分子は、対象となる任意の分子であり得る。例えば、アプタマーを使用して、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合させることができ、それによって天然のリガンドとタンパク質の相互作用を防止することができる。これは非限定的例であり、当業者は、当分野で一般に公知である技術を用いて、他の実施形態を容易に作成できることを認識されたい。例えば、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４， ７６３；Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ， ２０００， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ７４， ５；Ｓｕｎ， ２０００， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ２， １００；Ｋｕｓｓｅｒ， ２０００， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ７４， ２７；Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ， ２０００， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８７， ８２０及びＪａｙａｓｅｎａ， １９９９， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４５， １６２８を参照されたい。本発明のアプタマー分子は、当分野で一般に公知のとおりに、又は本明細書に記載のとおりに、化学修飾することができる。

本明細書では「アンチセンス核酸」という用語は、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸；Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６５， ５６６）相互作用によって標的ＲＮＡと結合し、立体的相互作用によって、又はＲＮａｓｅ Ｈによって媒介される標的認識によって、標的ＲＮＡの活性を変える核酸分子を指す（総説として、Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ， １９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１， １００４及びＷｏｏｌｆ他、米国特許第５，８４９，９０２号を参照されたい。）。典型的には、アンチセンス分子は、アンチセンス分子の単一の隣接配列に沿った標的配列に相補的である。しかし、ある実施形態においては、アンチセンス分子は、基質分子がループを形成するように基質と結合し得、及び／又はアンチセンス分子がループを形成するように結合し得る。したがって、アンチセンス分子は、２個の（さらには、それを超える）非隣接基質配列に相補的であり得、又はアンチセンス分子の２個の（さらには、それを超える）非隣接配列部分は、標的配列に相補的であり得、又は両方である。現在のアンチセンス戦略の総説については、Ｓｃｈｍａｊｕｋ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４， ２１７８３−２１７８９、Ｄｅｌｉｈａｓ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ， １５， ７５１−７５３、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎ． Ａ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．， ７， １５１、Ｃｒｏｏｋｅ， ２０００， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ３１３， ３−４５、Ｃｒｏｏｋｅ， １９９８， Ｂｉｏｔｅｃｈ． ｇｅｎｅｔ． Ｅｎｇ． Ｒｅｖ．， １５， １２１−１５７、Ｃｒｏｏｋｅ， １９９７， Ａｄ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ４０， １−４９を参照されたい。また、２’−ＭＯＥによって修飾された、また、当分野で公知の他の修飾によって修飾された、アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスを用いて、ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用によってＲＮＡを標的にすることができ、それによって二本鎖中の標的ＲＮＡを消化するＲＮａｓｅ Ｈを活性化することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅ Ｈ切断を活性化し得る１個以上のＲＮＡｓｅ Ｈ活性化領域を含み得る。アンチセンスＤＮＡは、化学的に合成することができ、又は一本鎖ＤＮＡ発現ベクター若しくはその等価物を用いて発現させることができる。本発明のアンチセンス分子は、当分野で一般に公知のとおりに、又は本明細書に記載のとおりに、化学修飾することができる。

「調節する」とは、遺伝子の発現を、又は１個以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子若しくは等価なＲＮＡ分子のレベルを、又は１個以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性を、発現、レベル又は活性が、調節物質の非存在下で認められるものよりも増大又は低下するように、上方制御又は下方制御することを意味する。例えば、「調節する」という用語は「阻害する」を意味し得るが、「調節する」という言葉の用法はこの定義に限定されない。

「阻害する」、「下方制御する」又は「減少する」とは、遺伝子の発現、又は１個以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子若しくは等価なＲＮＡ分子のレベル、又は１個以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）の非存在下で認められるものよりも低下することを意味する。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子による阻害、下方制御又は減少は、不活性分子又は減弱された分子の存在下で認められるレベルよりも低い。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子による阻害、下方制御又は減少は、例えば、スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）配列又はミスマッチを有するｓｉＮＡ分子の存在下で認められるレベルよりも低い。別の実施形態においては、本発明の核酸分子による遺伝子発現の阻害、下方制御又は減少は、核酸分子の存在下の方が、核酸分子の非存在下よりも大きい。一実施形態においては、遺伝子発現の阻害、下方制御又は減少は、ＲＮＡｉによって媒介される標的核酸分子（例えばＲＮＡ）の切断、翻訳阻害などの転写後サイレンシングと関連がある。一実施形態においては、遺伝子発現の阻害、下方制御又は減少は、ＤＮＡメチル化パターン及びＤＮＡクロマチン構造の変化などによる転写前サイレンシングと関連がある。

「上方制御する」又は「促進する」とは、遺伝子の発現、又は１個以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子若しくは等価なＲＮＡ分子のレベル、又は１個以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）の非存在下で認められるものよりも増加することを意味する。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の上方制御又は促進は、不活性分子又は減弱された分子の存在下で認められるレベルよりも高い。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の上方制御又は促進は、例えば、スクランブル配列又はミスマッチを有するｓｉＮＡ分子の存在下で認められるレベルよりも高い。別の実施形態においては、本発明の核酸分子による遺伝子発現の上方制御又は促進は、核酸分子の存在下の方が、核酸分子の非存在下よりも大きい。一実施形態においては、遺伝子発現の上方制御又は促進は、上方制御される目的遺伝子の発現を下方制御、阻害又はサイレンシングする、ＲＮＡｉによって媒介されるコード又は非コードＲＮＡ標的の切断又はサイレンシングなど、ＲＮＡによって媒介される遺伝子サイレンシングの阻害と関連がある。遺伝子発現の下方制御は、例えば、負のフィードバック、拮抗作用などを介して、コードＲＮＡ又はそのコードされたタンパク質によって誘導され得る。遺伝子発現の下方制御は、例えば、翻訳阻害、クロマチン構造、メチル化、ＲＩＳＣによって媒介されるＲＮＡ切断、又は翻訳阻害により、遺伝子の発現を停止させることによって、目的遺伝子を調節制御する非コードＲＮＡによって誘導され得る。したがって、目的遺伝子を下方制御、抑制又はサイレンシングする標的を阻害又は下方制御することによって、治療のために目的遺伝子の発現を上方制御又は促進することができる。

一実施形態においては、本発明のＲＮＡｉ阻害剤を用いて、ＲＮＡｉ又は遺伝子サイレンシングを阻害することによって、遺伝子発現を上方制御する。例えば、特定の遺伝子の１個の対立遺伝子が変異（例えば、フレームシフト、ミスセンス又はナンセンス変異）を保有して、変異遺伝子によってコードされるタンパク質の機能喪失をもたらすハプロ不全の場合などにおいて、本発明のＲＮＡｉ阻害剤を用いて、遺伝子発現を上方制御することによって、機能喪失の疾患及び症状を治療することができる。かかる場合においては、ＲＮＡｉ阻害剤を用いて、野生型又は機能的対立遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を上方制御することができ、したがって変異遺伝子又はヌル対立遺伝子を補うことによって、ハプロ不全を矯正することができる。別の実施形態においては、本明細書に記載の、又は当分野で公知の疾患、形質又は症状の治療などにおいて、本発明のｓｉＮＡ分子を用いて、有毒な機能獲得型（ｔｏｘｉｃ ｇａｉｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）対立遺伝子の発現を下方制御しつつ、本発明のＲＮＡｉ阻害剤を同時に用いて、野生型又は機能的対立遺伝子の発現を上方制御する（例えば、Ｒｈｏｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００４， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， １０１：１１１４７−１１１５２及びＭｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００５， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， １１５：２０１０−２０１７参照）。

「遺伝子」又は「標的遺伝子」若しくは「標的ＤＮＡ」とは、ＲＮＡをコードする核酸、例えば、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含めて、ただしこれだけに限定されない核酸配列を意味する。遺伝子又は標的遺伝子は、ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、その前駆体ＲＮＡなどの機能性ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）又は非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）もコードし得る。かかる非コードＲＮＡは、機能的又は調節性細胞プロセスに関与するｆＲＮＡ又はｎｃＲＮＡの活性の調節において、ｓｉＮＡによって媒介されるＲＮＡ干渉の標的核酸分子として役立ち得る。したがって、疾患をもたらす異常なｆＲＮＡ又はｎｃＲＮＡ活性を本発明のｓｉＮＡ分子によって調節することができる。ｆＲＮＡ及びｎｃＲＮＡを標的にしたｓｉＮＡ分子を用いて、遺伝子刷り込み、転写、翻訳、核酸プロセシング（例えば、アミノ基転移、メチル化など）などの細胞プロセスに介入することによって、対象、生物体又は細胞の遺伝子型又は表現型を操作又は変化させることもできる。標的遺伝子は、細胞に由来する遺伝子、内在性遺伝子、導入遺伝子、又は感染後に細胞中に存在する病原体、例えば、ウイルスの遺伝子などの外来遺伝子であり得る。標的遺伝子を含む細胞は、任意の生物体、例えば、植物、動物、原生動物、ウイルス、細菌若しくは真菌に由来し得、又はこれらに含まれ得る。植物の非限定的例としては、単子葉植物、双子葉植物又は裸子植物が挙げられる。動物の非限定的例としては、脊椎動物又は無脊椎動物が挙げられる。真菌の非限定的例としては、カビ又は酵母が挙げられる。総説については、例えば、Ｓｎｙｄｅｒ ａｎｄ Ｇｅｒｓｔｅｉｎ， ２００３， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３００， ２５８−２６０を参照されたい。

「非標準塩基対」とは、反転（ｆｌｉｐｐｅｄ）ミスマッチ、単一の水素結合ミスマッチ、トランス型ミスマッチ、３塩基（ｔｒｉｐｌｅ ｂａｓｅ）相互作用及び４塩基（ｑｕａｄｒｕｐｌｅ ｂａｓｅ）相互作用を含めた、ミスマッチ及び／又はゆらぎ塩基対などの任意の非ワトソン クリック塩基対を意味する。かかる非標準塩基対の非限定的例としては、ＡＣ逆フーグスティーン、ＡＣゆらぎ、ＡＵ逆フーグスティーン、ＧＵゆらぎ、ＡＡ Ｎ７アミノ、ＣＣ ２−カルボニル−アミノ（Ｈ１）−Ｎ３−アミノ（Ｈ２）、ＧＡ ｓｈｅａｒｅｄ型、ＵＣ ４−カルボニル−アミノ、ＵＵイミノ−カルボニル、ＡＣ逆ゆらぎ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｗｏｂｂｌｅ）、ＡＵフーグスティーン、ＡＵ逆ワトソン クリック、ＣＧ逆ワトソン クリック、ＧＣ Ｎ３−アミノ−アミノＮ３、ＡＡ Ｎ１−アミノ対称、ＡＡ Ｎ７−アミノ対称、ＧＡ Ｎ７−Ｎ１アミノ−カルボニル、ＧＡ＋カルボニル−アミノＮ７−Ｎ１、ＧＧ Ｎ１−カルボニル対称、ＧＧ Ｎ３−アミノ対称、ＣＣカルボニル−アミノ対称、ＣＣ Ｎ３−アミノ対称、ＵＵ ２−カルボニル−イミノ対称、ＵＵ ４−カルボニル−イミノ対称、ＡＡアミノ−Ｎ３、ＡＡ Ｎ１−アミノ、ＡＣアミノ２−カルボニル、ＡＣ Ｎ３−アミノ、ＡＣ Ｎ７−アミノ、ＡＵアミノ−４−カルボニル、ＡＵ Ｎ１−イミノ、ＡＵ Ｎ３−イミノ、ＡＵ Ｎ７−イミノ、ＣＣカルボニル−アミノ、ＧＡアミノ−Ｎ１、ＧＡアミノ−Ｎ７、ＧＡカルボニル−アミノ、ＧＡ Ｎ３−アミノ、ＧＣアミノ−Ｎ３、ＧＣカルボニル−アミノ、ＧＣ Ｎ３−アミノ、ＧＣ Ｎ７−アミノ、ＧＧアミノ−Ｎ７、ＧＧカルボニル−イミノ、ＧＧ Ｎ７−アミノ、ＧＵアミノ−２−カルボニル、ＧＵカルボニル−イミノ、ＧＵイミノ−２−カルボニル、ＧＵ Ｎ７−イミノ、ｐｓｉＵイミノ−２−カルボニル、ＵＣ ４−カルボニル−アミノ、ＵＣイミノ−カルボニル、ＵＵイミノ−４−カルボニル、ＡＣ Ｃ２−Ｈ−Ｎ３、ＧＡカルボニル−Ｃ２−Ｈ、ＵＵイミノ−４−カルボニル２カルボニル−Ｃ５−Ｈ、ＡＣアミノ（Ａ）Ｎ３（Ｃ）−カルボニル、ＧＣイミノアミノ−カルボニル、Ｇｐｓｉイミノ−２−カルボニルアミノ−２−カルボニル及びＧＵイミノアミノ−２−カルボニル塩基対が挙げられるが、これらだけに限定されない。

本明細書では「ＨＣＶ」とは、任意のＣ型肝炎ウイルス、又は表ＩのＨＣＶ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号などによってコードされる、ＨＣＶ活性を有するＨＣＶタンパク質、ペプチド若しくはポリペプチドを意味する。ＨＣＶという用語は、ＨＣＶ活性を有する任意のＨＣＶタンパク質、ペプチド又はポリペプチドをコードする核酸配列も指す。「ＨＣＶ」という用語は、他のＨＣＶアイソフォーム、変異ＨＣＶ遺伝子、ＨＣＶ遺伝子のスプライスバリアント、ＨＣＶ遺伝子多型などの他のＨＣＶコード配列も含むものとする。一実施形態においては、本明細書のＨＣＶという用語は、細胞若しくは宿主のタンパク質、又はかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はＨＣＶ感染及び／又は複製に関与するポリヌクレオチドを指す。

本明細書では「標的」とは、本明細書に記載の、また、参照により本明細書に組込む、米国特許出願第１０／９２３，５３６号及び米国特許出願第１０／４４４，８５３号に記載のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号などによってコードされる任意の標的タンパク質、ペプチド又はポリペプチドを意味する。「標的」という用語は、本明細書及び／又は米国仮出願第６０／３６３，１２４号、米国特許出願第１０／９２３，５３６号、米国特許出願第１０／４４４，８５３号及び／又はＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８号に記載のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号を有する配列によってコードされるタンパク質、ペプチド、ポリペプチドなどの任意の標的タンパク質、ペプチド又はポリペプチドをコードする核酸配列又は標的ポリヌクレオチド配列も指す。対象となる標的としては、標的ＤＮＡ、標的ＲＮＡなどの標的ポリヌクレオチド配列が挙げられる。「標的」という用語は、種々のアイソフォーム、変異標的遺伝子、標的ポリヌクレオチドのスプライスバリアント、標的多型、非コードポリヌクレオチド配列（例えば、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ）、本明細書に記載の他の調節ポリヌクレオチド配列などの他の配列も含むものとする。したがって、本発明の多様な実施形態においては、標的ＲＮＡに対して相補性を有する本発明の二本鎖核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）を用いて、ｍｉＲＮＡ又は他のｎｃＲＮＡ活性を阻害又は下方制御することができる。一実施形態においては、ｍｉＲＮＡ又はｎｃＲＮＡ活性を阻害することによって、ｍｉＲＮＡ又はｎｃＲＮＡ活性に依存する遺伝子発現（例えば、本明細書に記載の遺伝子標的、又は当分野で公知の遺伝子標的）又はウイルス複製（例えば、本明細書に記載のウイルス標的、又は当分野で公知のウイルス標的）を下方制御又は阻害することができる。別の実施形態においては、ｍｉＲＮＡ又はｎｃＲＮＡに対して相補性を有する本発明の二本鎖核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）によってｍｉＲＮＡ又はｎｃＲＮＡ活性を阻害することによって、ｍｉＲＮＡ又はｎｃＲＮＡによって下方制御、抑制又はサイレンシングされる標的遺伝子発現（例えば、本明細書に記載の遺伝子標的、又は当分野で公知の遺伝子標的）を上方制御又は促進することができる。遺伝子発現のかかる上方制御によって、当分野で一般に公知である機能喪失又はハプロ不全に関連する疾患及び症状を治療することができる。

「経路標的」又は「宿主標的」とは、遺伝子発現若しくは活性の経路に関与する任意の標的、又は細胞若しくは宿主タンパク質、又はかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はＨＣＶ感染及び／又は複製に関与するポリヌクレオチドを意味する。例えば、任意の所与の標的は、生物学的経路における上流、下流又は変更遺伝子を含み得る、関係する経路標的又は宿主標的を有し得る。これらの経路標的遺伝子及び宿主標的遺伝子は、本明細書に記載の疾患、症状及び形質の治療において相加又は相乗効果をもたらし得る。

一実施形態においては、標的は、任意の標的ＲＮＡ又はその一部である。

一実施形態においては、標的は、任意の標的ＤＮＡ又はその一部である。

一実施形態においては、標的は、任意の標的ｍＲＮＡ又はその一部である。

一実施形態においては、標的は、任意の標的ｍｉＲＮＡ又はその一部である。

一実施形態においては、標的は、任意の標的ｓｉＲＮＡ又はその一部である。

一実施形態においては、標的は、任意の標的ｓｔＲＮＡ又はその一部である。

一実施形態においては、標的は、標的及び又は経路標的又はその一部である。

一実施形態においては、標的は、本明細書、及び／又は米国仮出願第６０／３６３，１２４号、米国特許出願第１０／９２３，５３６号及び米国特許出願第１０／４４４，８５３号及び／又はＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８号に記載の標的配列のいずれか（例えば、１個以上）又はその一部である。一実施形態においては、標的は、表Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩに示す標的配列のいずれか（例えば、１個以上）又はその一部である。別の実施形態においては、標的は、表ＩＩ又はＩＩＩに示す任意の（例えば、１個以上の）上側の鎖、又は下側の鎖の標的配列に対応するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ若しくはｔＲＮＡ又はその一部である。別の実施形態においては、標的は、本明細書又は米国仮出願第６０／３６３，１２４号、米国特許出願第１０／９２３，５３６号及び米国特許出願第１０／４４４，８５３号及び／又はＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８に記載の配列に対応する任意の（例えば、１個以上）配列に対応する任意のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｔＲＮＡである。

「相同配列」とは、遺伝子、遺伝子転写物及び／又は非コードポリヌクレオチドなどの１個以上のポリヌクレオチド配列によって共有されるヌクレオチド配列を意味する。例えば、相同配列は、サイトカインとその対応する受容体など、遺伝子ファミリーの異なるメンバー、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質アイソフォーム、完全に異なる遺伝子などの関係するが異なるタンパク質をコードする２個以上の遺伝子によって共有されるヌクレオチド配列であり得る。相同配列は、非コードＤＮＡ又はＲＮＡ、制御配列、イントロン、転写制御部位、転写調節部位など、２個以上の非コードポリヌクレオチドによって共有されるヌクレオチド配列であり得る。相同配列は、１個を超えるポリヌクレオチド配列によって共有される保存配列領域も含み得る。相同性は、完全な相同性（例えば、１００％）である必要はなく、部分的相同配列も本発明によって企図される（例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％など）。

「保存配列領域」とは、ポリヌクレオチド中の１個以上の領域のヌクレオチド配列が、世代間で、又は生物系、対象若しくは生物体間でさほど変化しないことを意味する。ポリヌクレオチドは、コード及び非コードのＤＮＡ及びＲＮＡを含み得る。

「センス領域」とは、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に対して相補性を有する、ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。また、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含み得る。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子のセンス領域をセンス鎖又はパッセンジャー鎖と称する。

「アンチセンス領域」とは、標的核酸配列に対して相補性を有する、ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。また、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、ｓｉＮＡ分子のセンス領域に対して相補性を有する核酸配列を含んでいてもよい。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域をアンチセンス鎖又はガイド鎖と称する。

「標的核酸」又は「標的ポリヌクレオチド」とは、発現又は活性を調節すべき任意の核酸配列（例えば、任意の標的及び／又は経路標的配列）を意味する。標的核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。一実施形態においては、本発明の標的核酸は標的ＲＮＡ又はＤＮＡである。

「相補性」とは、核酸が、伝統的なワトソン−クリック、又は本明細書に記載の他の非伝統的なタイプによって別の核酸配列と水素結合を形成し得ることを意味する。一実施形態においては、各鎖が１５から３０ヌクレオチド長である、ｓｉＮＡ分子などの本発明の二本鎖核酸分子は、二本鎖核酸分子の２本の鎖間の約１０％から約１００％（例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％）の相補性を含む。別の実施形態においては、一方の鎖がセンス鎖であり、他方の鎖がアンチセンス鎖であり、各鎖が１５から３０ヌクレオチド長である、ｓｉＮＡ分子などの本発明の二本鎖核酸分子は、二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖中のヌクレオチド配列と、標的ＲＮＡ、標的ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡなどのその対応する標的核酸分子のヌクレオチド配列との間で、少なくとも約１０％から約１００％（例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％）の相補性を含む。一実施形態においては、一方の鎖がセンス領域と称するヌクレオチド配列を含み、他方の鎖がアンチセンス領域と称するヌクレオチド配列を含み、各鎖が１５から３０ヌクレオチド長である、ｓｉＮＡ分子などの本発明の二本鎖核酸分子は、二本鎖核酸分子のセンス領域とアンチセンス領域の間で、約１０％から約１００％（例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％）の相補性を含む。本発明の核分子に関連して、その相補配列との核酸分子の結合自由エネルギーは、核酸の関連機能、例えば、ＲＮＡｉ活性が進行するのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの測定は当分野で周知である（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， ＣＳＨ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ＬＩＩ ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０９：３７８３−３７８５参照）。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合を形成（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）し得る、核酸分子中の隣接残基の百分率を示す（例えば、１０ヌクレオチドの第２の核酸配列と塩基対を形成した、第１のオリゴヌクレオチド中の合計１０ヌクレオチドのうちの５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチドは、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％相補的である。）。一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖又はセンス領域とアンチセンス鎖又はアンチセンス領域との間で完全な相補性を有する。一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、対応する標的核酸分子と完全に相補的である。「完全に相補的」とは、核酸配列の全隣接残基が第２の核酸配列中の同数の隣接残基と水素結合することを意味する。一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１個以上の標的核酸分子又はその一部に相補的である、約１５から約３０個又はそれを超える（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０個又はそれを超える）ヌクレオチドを含む。一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖若しくはセンス領域とアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域との間で、又はｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間で、部分的相補性（すなわち、１００％未満の相補性）を有する。例えば、部分的相補性は、ｓｉＮＡ構造内の種々のミスマッチ又は非塩基対形成ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５個又はそれを超えるミスマッチ又は非塩基対形成ヌクレオチド）を含み得る。これは、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖若しくはセンス領域とアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域との間で、又はｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間で生じるバルジ、ループ又はオーバーハングをもたらし得る。

一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子などの本発明の二本鎖核酸分子は、核酸分子のセンス鎖又はセンス領域とアンチセンス鎖又はアンチセンス領域との間で完全な相補性を有する。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子などの本発明の二本鎖核酸分子は、対応する標的核酸分子に完全に相補的である。

一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子などの本発明の二本鎖核酸分子は、二本鎖核酸分子のセンス鎖若しくはセンス領域とアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域との間で、又は核酸分子のアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間で、部分的相補性（すなわち、１００％未満の相補性）を有する。例えば、部分的相補性は、二本鎖核酸分子構造内の種々のミスマッチ又は非塩基対形成ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５個又はそれを超えるミスマッチ又はヌクレオチドバルジなどの非塩基対形成ヌクレオチド）を含み得る。これは、二本鎖核酸分子のセンス鎖若しくはセンス領域とアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域との間で、又は二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間で生じるバルジ、ループ又はオーバーハングをもたらし得る。

一実施形態においては、本発明の二本鎖核酸分子は、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。「ミクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡ切断、翻訳抑制／阻害又は異質染色質サイレンシングによって、標的メッセンジャーＲＮＡの発現を調節する低分子二本鎖ＲＮＡを意味する（例えば、Ａｍｂｒｏｓ， ２００４， Ｎａｔｕｒｅ， ４３１， ３５０−３５５；Ｂａｒｔｅｌ， ２００４， Ｃｅｌｌ， １１６， ２８１−２９７；Ｃｕｌｌｅｎ， ２００４， Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．， １０２， ３−９；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． ｇｅｎｅｔ．， ５， ５２２−５３１；Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００４， ｇｅｎｅ， ３４２， ２５−２８及びＳｅｔｈｕｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．， ２００６， ＲＮＡ， １２：１９２−１９７参照）。一実施形態においては、本発明のミクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ分子のセンス鎖若しくはセンス領域とアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域との間で、又はｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間で、部分的相補性（すなわち、１００％未満の相補性）を有する。例えば、部分的相補性は、二本鎖核酸分子構造内の種々のミスマッチ又は非塩基対形成ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５個又はそれを超えるミスマッチ又はヌクレオチドバルジなどの非塩基対形成ヌクレオチド）を含み得る。これは、ｍｉＲＮＡのセンス鎖若しくはセンス領域とアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域との間で、又はｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖若しくはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間で生じるバルジ、ループ又はオーバーハングをもたらし得る。

一実施形態においては、標的遺伝子発現を下方制御する、又は減少させる、本発明のｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載するとおりに、又は当分野で公知のとおりに、対象又は生物体におけるＨＣＶ感染症、肝不全、肝細胞癌又は肝硬変の治療、予防又は軽減に使用される。

本発明の一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子の各配列は独立に約１５から約３０ヌクレオチド長であり、特定の実施形態においては、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド長である。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ二本鎖は、約１５から約３０塩基対（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）を独立に含む。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子の１本以上の鎖は、標的核酸分子に相補的である約１５から約３０ヌクレオチド（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）を独立に含む。更に別の実施形態においては、ヘアピン又は環状構造を含む本発明のｓｉＮＡ分子は、約３５から約５５（例えば、約３５、４０、４５、５０又は５５）ヌクレオチド長、又は約３８から約４４（例えば、約３８、３９、４０、４１、４２、４３又は４４）ヌクレオチド長であり、約１５から約２５（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）個の塩基対を含む。本発明の例示的なｓｉＮＡ分子を表ＩＩ及びＩＩＩ及び／又は図４−５に示す。

本明細書では「細胞」は、その通常の生物学的意味で使用され、多細胞生物全体を指すのではなく、例えば、具体的にヒトを指すのではない。細胞は、生物体、例えば、トリ、植物、及びヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、ネコなどのほ乳動物中に存在し得る。細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞）でも真核細胞（例えば、ほ乳動物細胞又は植物細胞）でもよい。細胞は、体細胞又は生殖系列起源、全能性又は多能性、分裂又は非分裂であり得る。細胞は、配偶子若しくは胚、幹細胞、又は完全に分化した細胞に由来することもでき、又はこれらを含み得る。細胞は、当分野で一般に認識されている、単離細胞、精製細胞、又は実質的な精製細胞であり得る。

本発明のｓｉＮＡ分子は、直接添加され、又は陽イオン性脂質と複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成することができ、リポソームに入れることができ、又は標的細胞若しくは組織に送達することができる。核酸又は核酸複合体は、関連組織に生体外で、又は肺に局所送達することによってインビボで、生体高分子に組み入れて、若しくは組み入れずに、局所投与することができる。特定の実施形態においては、本発明の核酸分子は、表ＩＩ−ＩＩＩ及び／又は図４−５に示す配列を含む。かかる核酸分子の例は、これらの表及び図に規定された配列から本質的になる。また、表ＩＶに記載の化学修飾構築体、及び表ＶＩに示す脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調合物を、本発明の任意のｓｉＮＡ配列又はｓｉＮＡ配列群に適用することができる。

別の態様においては、本発明は、本発明の１種類以上のｓｉＮＡ分子を含むほ乳動物細胞を提供する。１種類以上のｓｉＮＡ分子は、本発明の標的ポリヌクレオチド内の同じ、又は異なる部位を独立に標的にすることができる。

「ＲＮＡ」とは、少なくとも１個のリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分精製ＲＮＡなどの単離ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え産生されたＲＮＡ、並びに１個以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は変化によって天然ＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含む。かかる変化は、例えばＲＮＡの１個以上のヌクレオチドにおける、ｓｉＮＡの末端、内部などへの、非ヌクレオチド材料の付加を含み得る。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド、化学合成ヌクレオチド、デオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドも含み得る。これらの改変ＲＮＡは、類似体、又は天然ＲＮＡの類似体と称することができる。

「対象」とは、外植された細胞のドナー若しくはレシピエント、又は細胞自体である、生物体を意味する。「対象」とは、本発明の核酸分子を投与することができる生物体も指す。対象は、ヒト又はヒト細胞を含めて、ほ乳動物又はほ乳動物細胞であり得る。一実施形態においては、対象は乳児（例えば、１月齢未満、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２月齢の対象）である。一実施形態においては、対象は幼児（例えば、１、２、３、４、５又は６歳）である。一実施形態においては、対象は（例えば、約６５歳を超える）高齢者である。

本明細書では「化学修飾」とは、未変性のｓｉＲＮＡ又はＲＮＡのヌクレオチドとは異なる、ヌクレオチドの化学構造の任意の修飾を意味する。「化学修飾」という用語は、本明細書に記載の、又は当分野で公知の、修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドを用いた、未変性のｓｉＲＮＡ又はＲＮＡのヌクレオシド及びヌクレオチドの付加、置換又は修飾を包含する。かかる化学修飾の非限定的例としては、本明細書の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ若しくはＶＩＩのいずれかの組成物、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、４’−チオリボヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド（例えば、参照により本明細書に組込む、２００４年１１月５日に出願された米国特許出願第１０／９８１，９６６号参照）、ＦＡＮＡ、「汎用塩基」ヌクレオチド、「非環式」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、末端グリセリル及び／又は反転デオキシ脱塩基残基の組み入れ、又は本明細書の式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの修飾が挙げられるが、これらだけに限定されない。一実施形態においては、本発明の核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡなど）は、化学修飾によって部分的に修飾されている（例えば、約５％、１０，％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％修飾）。別の実施形態においては、本発明の核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡなど）は、化学修飾によって完全に修飾されている（例えば、約１００％修飾）。

本明細書では「ホスホロチオアート」という用語は、式Ｉのヌクレオチド間結合を指す。式中、Ｚ及び／又はＷは硫黄原子を含む。したがって、ホスホロチオアートという用語は、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合とホスホロジチオアートヌクレオチド間結合の両方を指す。

本明細書では「ホスホノアセタート」という用語は、式Ｉのヌクレオチド間結合を指す。式中、Ｚ及び／又はＷは、アセチル基、又は保護されたアセチル基を含む。

本明細書では「チオホスホノアセタート」という用語は、式Ｉのヌクレオチド間結合を指す。式中、Ｚは、アセチル基、又は保護されたアセチル基を含み、Ｗは、硫黄原子、又はアセチル基、若しくは保護されたアセチル基を含み、Ｚは硫黄原子を含む。

本明細書では「汎用塩基」という用語は、天然ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基の各々とほとんど差別なく塩基対を形成するヌクレオチド塩基類似体を指す。汎用塩基の非限定的例としては、当分野で公知である、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル及び他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、並びに３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、６−ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体が挙げられる（例えば、Ｌｏａｋｅｓ， ２００１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２９， ２４３７−２４４７参照）。

本明細書では「非環式ヌクレオチド」という用語は、例えば、リボース炭素（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４又はＣ５）のいずれかが、独立に、又は組み合わせて、ヌクレオチドから欠けている、非環式リボース糖を有する任意のヌクレオチドを指す。

本発明の核酸分子は、個々に、又は他の薬物と組み合わせて若しくは併用して、対象又は生物体における、本明細書に記載の、又は当分野で公知の、疾患、障害、症状及び形質の予防又は治療に使用することができる。例えば、ｓｉＮＡ分子は、個々に、又は１種類以上の薬物と組み合わせて、治療に適切な条件下で、対象に投与することができ、又は当業者に明らかである他の適切な細胞に投与することができる。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、個々に、又は１種類以上の薬物と組み合わせて、治療に適切な条件下で、対象に投与することができ、又は当業者に明らかである他の適切な細胞に投与することができる。

更なる実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は、対象又は生物体において、他の公知の予防処置又は治療処置と併用することができる。例えば、上記分子を１つ以上の公知の化合物、治療又は手順と併用して、当分野で公知である対象又は生物体における本明細書に記載の疾患、障害、症状及び形質を予防又は治療することができる。

一実施形態においては、本発明は、ｓｉＮＡ分子の発現が可能であるように、本発明の少なくとも１種類のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。例えば、ベクターは、二本鎖を含むｓｉＮＡ分子の両方の鎖をコードする配列を含み得る。自己相補的であり、したがってｓｉＮＡ分子を形成する単一の核酸分子をコードする配列もベクターは含み得る。かかる発現ベクターの非限定的例は、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９， ５０５；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ， ２００２， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９， ４９７；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９， ５００及びＮｏｖｉｎａ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５に記載されている。

別の実施形態においては、本発明は、本発明の発現ベクターを含むほ乳動物細胞、例えば、ヒト細胞を特徴とする。

更に別の実施形態においては、本発明の発現ベクターは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号によって、例えば、本明細書に記載の、又は米国仮出願第６０／３６３，１２４号、米国特許出願第１０／９２３，５３６号及び米国特許出願第１０／４４４，８５３号及び／又はＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８に記載のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号によって、参照されるＲＮＡ分子に対して相補性を有するｓｉＮＡ分子の配列を含む。

一実施形態においては、本発明の発現ベクターは、同じでも、異なっていてもよい、２個以上のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。

本発明の別の態様においては、標的ＲＮＡ分子と相互作用し、標的ＲＮＡ分子（例えば、本明細書のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号によって参照される標的ＲＮＡ分子）をコードする遺伝子を下方制御するｓｉＮＡ分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターに挿入される転写単位から発現される。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターであり得る。ｓｉＮＡを発現するウイルスベクターは、これらだけに限定されないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス又はアルファウイルスに基づいて構築することができる。ｓｉＮＡ分子を発現可能である組換えベクターを、本明細書に記載のとおりに送達し、標的細胞中に存続させることができる。或いは、ｓｉＮＡ分子の一過性発現を与えるウイルスベクターを使用することができる。かかるベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。発現後、ｓｉＮＡ分子は、結合し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって遺伝子の機能又は発現を下方制御する。ｓｉＮＡを発現するベクターの送達は、静脈内又は筋肉内投与によって、対象から外植された標的細胞に投与し、続いて対象に再導入することによって、所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段によってなど、全身的であり得る。

「ベクター」とは、所望の核酸の送達に使用される任意の核酸技術及び／又はウイルス技術を意味する。

本発明の他の特徴及び効果は、以下の好ましい実施形態の説明、及び特許請求の範囲から明らかになるはずである。

（発明の詳細）
本発明の核酸分子の作用機序
以下の考察は、現在公知である低分子干渉ＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ干渉の提案されている機序を考察するものであり、限定的なものではなく、従来技術と認めるものでもない。本出願人は、本明細書において、化学修飾低分子干渉核酸が、ｓｉＲＮＡ分子と類似したＲＮＡｉ媒介能力、又は改善されたＲＮＡｉ媒介能力を有し、改善された安定性及び活性をインビボで有すると予想されることを示す。したがって、この考察は、ｓｉＲＮＡのみに限定されず、ｓｉＮＡ全体にあてはまる。「改善されたＲＮＡｉ媒介能力」又は「改善されたＲＮＡｉ活性」とは、インビトロ及び／又はインビボで測定されたＲＮＡｉ活性を含むものとする。ここで、ＲＮＡｉ活性は、本発明のｓｉＮＡのＲＮＡｉ媒介能力とｓｉＮＡの安定性の両方を反映している。本発明では、これらの活性の成果は、全ＲＮＡ ｓｉＲＮＡ、又は複数のリボヌクレオチドを含むｓｉＮＡよりも、インビトロ及び／又はインビボで増加し得る。ｓｉＮＡ分子の活性又は安定性は減少し得る場合もあるが（すなわち、１／１０未満）、ｓｉＮＡ分子の全体的活性は、インビトロ及び／又はインビボで増強される。

ＲＮＡ干渉とは、動物において、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１， ８０６）。植物における対応するプロセスは、転写後遺伝子サイレンシング又はＲＮＡサイレンシングと一般に称し、真菌においてはクエリングとも称される。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を防止するのに使用される、進化的に保存された細胞防御機構であると考えられ、多様な叢及び門によって一般に共有されている（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．， １５， ３５８）。外来遺伝子発現からのかかる防御は、相同な一本鎖ＲＮＡ又はウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介して、ウイルス感染に由来する、又は宿主ゲノム中へのトランスポゾンエレメントの無作為な組み込みに由来する、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に応じて進化してきたと考えられる。細胞中にｄｓＲＮＡが存在すると、特徴がまだ十分に明らかになっていない機序によってＲＮＡｉ応答が誘発される。この機序は、リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断をもたらす、ｄｓＲＮＡによって媒介されるプロテインキナーゼＰＫＲ及び２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素の活性化に起因するインターフェロン応答とは異なると考えられる。

細胞中に長鎖ｄｓＲＮＡが存在すると、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡ小片へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与する（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｎａｔｕｒｅ， ４０９， ３６３）。ダイサー活性に由来する低分子干渉ＲＮＡは、典型的には約２１から約２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対の二本鎖を含む。ダイサーは、構造の保存された前駆体ＲＮＡからの、翻訳調節に関係する２１及び２２ヌクレオチドのｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切り出しにも関係する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９３， ８３４）。ＲＮＡｉ応答は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般に称する、ｓｉＲＮＡを含むエンドヌクレアーゼ複合体も特徴とする。ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡと相同である配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のガイド配列に相補的である領域の中央で起こる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１， ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １５， １８８）。また、恐らくはクロマチン構造を調節し、それによって標的遺伝子配列の転写を防止する細胞機序によって、ＲＮＡ干渉は、低分子ＲＮＡ（例えば、ミクロＲＮＡ、すなわちｍｉＲＮＡ）によって媒介される遺伝子サイレンシングも含み得る（例えば、Ａｌｌｓｈｉｒｅ， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９７， １８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９７， １８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９７， ２２１５−２２１８及びＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９７， ２２３２−２２３７）。したがって、本発明のｓｉＮＡ分子を用いて、ＲＮＡ転写物との相互作用によって、又は特定の遺伝子配列との相互作用によって、遺伝子サイレンシングを媒介することができる。かかる相互作用は、転写レベル又は転写後レベルで遺伝子サイレンシングを生じる。

ＲＮＡｉは種々の系で研究されている。Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１， ８０６は、線虫においてＲＮＡｉを観察した最初であった。Ｗｉａｎｎｙ ａｎｄ Ｇｏｅｔｚ， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ２， ７０は、マウス胚においてｄｓＲＮＡによって媒介されるＲＮＡｉを記載している。Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ， ４０４， ２９３は、ｄｓＲＮＡが移入されたショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡｉを記述している。Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｎａｔｕｒｅ， ４１１， ４９４は、ヒト胚性腎臓細胞及びＨｅＬａ細胞を含めた培養ほ乳動物細胞において、合成２１ヌクレオチドＲＮＡ二本鎖の導入によって誘導されるＲＮＡｉを記述している。ショウジョウバエ胚溶解物における最近の研究によって、効率的ＲＮＡｉ活性を媒介するのに必要である、ｓｉＲＮＡの長さ、構造、化学組成及び配列に対する一定の要件が明らかになった。これらの研究によれば、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二本鎖は、２個の２ヌクレオチド３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含むときに最も活性である。また、一方又は両方のｓｉＲＮＡ鎖を２’−デオキシ又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換するとＲＮＡｉ活性が消失するのに対して、デオキシヌクレオチドによる３’末端ｓｉＲＮＡヌクレオチドの置換は許容されることが判明した。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中央におけるミスマッチ配列も、ＲＮＡｉ活性を消失させることが判明した。また、これらの研究は、標的ＲＮＡ中の切断部位の位置が、ｓｉＲＮＡガイド配列の３’末端ではなく５’末端によって規定されることも示している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１， ＥＭＢＯ Ｊ．， ２０， ６８７７）。他の研究によれば、ｓｉＲＮＡ二本鎖の標的相補鎖上の５’リン酸がｓｉＲＮＡ活性に必要であり、ＡＴＰを利用してｓｉＲＮＡ上の５’リン酸部分が維持される（Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｃｅｌｌ， １０７， ３０９）。しかし、５’リン酸を欠くｓｉＲＮＡ分子は、外来的に導入したときに活性であり、ｓｉＲＮＡ構築体の５’リン酸化がインビボで起こり得ることを示唆している。

本発明の二本鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）
一実施形態においては、本発明は、二本鎖オリゴヌクレオチドを自己組織化し得る二本鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。本発明の二本鎖形成性オリゴヌクレオチドは、化学合成することができ、又は転写単位及び／又はベクターから発現させることができる。本発明のＤＦＯ分子は、多様な治療、診断、農業、獣医学、標的確認、ゲノム発見、遺伝子工学及び薬理ゲノミクスの各適用分野に有用である試薬及び方法を提供する。

本出願人は、二本鎖形成性オリゴヌクレオチド、すなわちＤＦＯ分子に限定されないが、本明細書では便宜上そのように称される、ある種のオリゴヌクレオチドが、遺伝子発現の配列特異的調節の強力な媒介物質であることを本明細書で示す。本発明のオリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチドを自己組織化するように設計されている線状ポリヌクレオチド配列のクラスである点で、当分野で公知である他の核酸配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）とは異なる。二本鎖オリゴヌクレオチドの各鎖は、標的核酸分子に相補的であるヌクレオチド配列を含む。したがって、本発明の核酸分子は、機能的二本鎖を自己組織化することができ、該二本鎖の各鎖は、同じポリヌクレオチド配列を含み、標的核酸分子に相補的であるヌクレオチド配列を含む。

一般に、二本鎖オリゴヌクレオチドは、２個の異なるオリゴヌクレオチド配列を組み立てることによって形成される。ここで、一方の鎖のオリゴヌクレオチド配列は、他方の鎖のオリゴヌクレオチド配列に相補的である。かかる二本鎖オリゴヌクレオチドは、２個の別々のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、又はそれ自体の上で折り重なって二本鎖構造を形成する単一の分子から組み立てられ、当分野ではヘアピンステムループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ、すなわち短鎖ヘアピンＲＮＡ）と称されることが多い。当分野で公知であるこれらの二本鎖オリゴヌクレオチドはすべて、二本鎖の各鎖が異なるヌクレオチド配列を有する点で共通の特徴を有する。

当分野で公知の二本鎖核酸分子とは別に、本出願人は、一本鎖又は線状オリゴヌクレオチドから出発して、二本鎖核酸分子を形成する、潜在的に費用効果の高い、簡単な新規方法を開発した。本発明によって形成される二本鎖オリゴヌクレオチドの２本の鎖は、同じヌクレオチド配列を有し、互いに共有結合していない。かかる二本鎖オリゴヌクレオチド分子は、当分野で公知である方法及び試薬によって、合成後に容易に連結することができ、本発明の範囲内である。一実施形態においては、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチド（二本鎖形成性オリゴヌクレオチド）は、第１の領域と第２の領域を含む。ここで、一本鎖オリゴヌクレオチドが自己組織化して、二本鎖の一方の鎖のヌクレオチド配列が他方の鎖のヌクレオチド配列と同じである二本鎖オリゴヌクレオチドを形成するように、第２の領域は、第１の領域中のヌクレオチド配列又はその一部の逆方向反復であるヌクレオチド配列を含む。かかる二本鎖形成性オリゴヌクレオチドの非限定的例を図１４及び１５に示す。これらの二本鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）は、ある種の回文構造又は反復配列を含んでいてもよい。かかる回文構造又は反復配列は、ＤＦＯの第１の領域と第２の領域の間に存在する。

一実施形態においては、本発明は、標的核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する二本鎖形成性自己相補的核酸配列を含む二本鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）分子を特徴とする。ＤＦＯ分子は、かかる自己相補配列の組立てによって生じる、単一の自己相補配列又は二本鎖を含み得る。

一実施形態においては、本発明の二本鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）は、第１の領域と第２の領域を含み、第２の領域は、ＤＦＯ分子から二本鎖オリゴヌクレオチドを組み立てることができるように、第１の領域のヌクレオチド配列の逆方向反復を含むヌクレオチド配列を含む。かかる二本鎖オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を調節する低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）として作用し得る。本発明のＤＦＯ分子によって形成される二本鎖オリゴヌクレオチド二本鎖の各鎖は、標的核酸分子（例えば、ＨＣＶ標的ＲＮＡ）中の同じヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列領域を含み得る。

一実施形態においては、本発明は、二本鎖オリゴヌクレオチドに組み立て得る一本鎖ＤＦＯを特徴とする。驚くべきことに、本出願人は、自己相補性のヌクレオチド領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを二本鎖オリゴヌクレオチド構築体に容易に組み立て得ることを見いだした。かかるＤＦＯは、遺伝子発現を配列特異的に阻害し得る二本鎖に組み立て得る。本発明のＤＦＯ分子は、第２の領域のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する第１の領域を含み、第１の領域の配列は、標的核酸に相補的である。ＤＦＯは、二本鎖オリゴヌクレオチドの各鎖の一部が、標的核酸配列に相補的である配列を含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成し得る。

一実施形態においては、本発明は、二本鎖オリゴヌクレオチドの２本の鎖が互いに共有結合せず、二本鎖オリゴヌクレオチドの各鎖が、標的核酸分子又はその一部（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）中の同じヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを特徴とする。別の実施形態においては、二本鎖オリゴヌクレオチドの２本の鎖は、少なくとも約１５、好ましくは少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチドの同一ヌクレオチド配列を共有する。

一実施形態においては、本発明のＤＦＯ分子は、式ＤＦＯ−Ｉの構造を含む。

式中、Ｚは、１個以上の修飾ヌクレオチド（例えば、２−アミノプリン、２−アミノ−１，６−ジヒドロプリン、汎用塩基などの修飾塩基を有するヌクレオチド）を含んでいてもよい、例えば偶数の約２から約２４ヌクレオチド（例えば、約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４ヌクレオチド）長の、回文構造の核酸配列、又は反復核酸配列を含み、Ｘは、例えば約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長の、核酸配列であり、Ｘ’は、例えば配列Ｘ又はその一部に対するヌクレオチド配列相補性を有する約１及び約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長の、核酸配列を含み、ｐは、存在しても、しなくてもよい末端リン酸基を含み、配列ＸとＺは、独立に、又は一緒に、標的核酸配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列又はその一部（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）と相互作用する（例えば、塩基対形成する）のに十分な長さである。例えば、Ｘは、標的ＲＮＡ中のヌクレオチド配列又はその一部に相補的である、約１２から約２１又はそれを超える（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれを超える）ヌクレオチド長の配列を独立に含み得る。別の非限定的例においては、Ｘが存在するときに、標的ＲＮＡ又はその一部（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）に相補的である、ＸとＺの一緒のヌクレオチド配列の長さは、約１２から約２１又はそれを超える（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれを超える）ヌクレオチドである。更に別の非限定的例においては、Ｘが存在しないときには、標的ＲＮＡ又はその一部に相補的であるＺのヌクレオチド配列の長さは、約１２から約２４又はそれを超える（例えば、約１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又はそれを超える）ヌクレオチドである。一実施形態においては、Ｘ、Ｚ及びＸ’は独立に、Ｘ及び／又はＺが、標的ＲＮＡ又はその一部（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）中のヌクレオチド配列と相互作用する（例えば、塩基対形成する）のに十分な長さのヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドである。一実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは同一である。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは異なる。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸとＺ、又はＺとＸ’、又はＸ、Ｚ及びＸ’の長さは、同一であり、又は異なる。

配列が、別の配列と相互作用する（すなわち、塩基対形成する）のに「十分な」長さであると本明細書で記述するときには、２個の配列間で形成される結合（例えば、水素結合）の数が、対象となる条件下で２個の配列が二本鎖を形成し得るのに十分であるような長さであることを意味する。かかる条件は、インビトロ（例えば、診断又はアッセイ目的）又はインビボ（例えば、治療目的）であり得る。かかる長さを決定することは簡単であり、定常的なことである。

一実施形態においては、本発明は、式ＤＦＯ−Ｉ（ａ）の二本鎖オリゴヌクレオチド構築体を特徴とする。

式中、Ｚは、１個以上の修飾ヌクレオチド（例えば、２−アミノプリン、２−アミノ−１，６−ジヒドロプリン、汎用塩基などの修飾塩基を有するヌクレオチド）を有する、例えば偶数の約２から約２４ヌクレオチド（例えば、約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４ヌクレオチド）長の、回文構造の核酸配列、若しくは反復核酸配列、又は回文構造様（ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ−ｌｉｋｅ）核酸配列、若しくは反復様（ｒｅｐｅａｔ−ｌｉｋｅ）核酸配列を含み、Ｘは、例えば約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長の、核酸配列であり、Ｘ’は、例えば配列Ｘ又はその一部に対するヌクレオチド配列相補性を有する約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長の、核酸配列を含み、ｐは、存在しても、しなくてもよい末端リン酸基を含み、各Ｘ及びＺは、標的核酸配列又はその一部（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）に相補的であるヌクレオチド配列を独立に含み、その一部の標的核酸配列（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）と相互作用するのに十分な長さである。例えば、配列Ｘは、標的ＲＮＡ又はその一部（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）中のヌクレオチド配列に相補的である、約１２から約２１又はそれを超える（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれを超える）ヌクレオチド長の配列を独立に含み得る。別の非限定的例においては、標的ＲＮＡ又はその一部に相補的である、（Ｘが存在するときの）ＸとＺの一緒のヌクレオチド配列の長さは、約１２から約２１又はそれを超える（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれを超える）ヌクレオチドである。更に別の非限定的例においては、Ｘが存在しないときには、標的ＲＮＡ又はその一部に相補的であるＺのヌクレオチド配列の長さは、約１２から約２４又はそれを超える（例えば、約１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又はそれを超える）ヌクレオチドである。一実施形態においては、Ｘ、Ｚ及びＸ’は独立に、Ｘ及び／又はＺが、標的ＲＮＡ又はその一部（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）中のヌクレオチド配列と相互作用する（例えば、塩基対形成する）のに十分な長さのヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドである。一実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは同一である。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは異なる。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸとＺ、又はＺとＸ’、又はＸ、Ｚ及びＸ’の長さは、同一であり、又は異なる。一実施形態においては、式Ｉ（ａ）の二本鎖オリゴヌクレオチド構築体は、ミスマッチが二本鎖オリゴヌクレオチドの標的遺伝子発現阻害能力をさほど低下させない程度に、１個以上、具体的には１、２、３又は４個のミスマッチを含む。

一実施形態においては、本発明のＤＦＯ分子は、式ＤＦＯ−ＩＩの構造を含む。

式中、各Ｘ及びＸ’は独立に約１２ヌクレオチドから約２１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、Ｘは、例えば約１２から約２１ヌクレオチド（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長の核酸配列を含み、Ｘ’は、例えば配列Ｘ又はその一部に対してヌクレオチド配列相補性を有する約１２から約２１ヌクレオチド（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長の、核酸配列を含み、ｐは、存在しても、しなくてもよい末端リン酸基を含み、Ｘは、ＨＣＶ標的核酸配列（例えば、ＨＣＶ標的ＲＮＡ）又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、その一部のＨＣＶ標的核酸配列と相互作用する（例えば、塩基対形成する）のに十分な長さである。一実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは同一である。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは異なる。一実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸ及びＸ’の長さは、比較的安定な二本鎖オリゴヌクレオチドを形成するのに十分である。

一実施形態においては、本発明は、式ＤＦＯ−ＩＩ（ａ）の二本鎖オリゴヌクレオチド構築体を特徴とする。

式中、各Ｘ及びＸ’は独立に約１２ヌクレオチドから約２１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、Ｘは、例えば約１２から約２１ヌクレオチド（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長の、核酸配列を含み、Ｘ’は、例えば配列Ｘ又はその一部に対してヌクレオチド配列相補性を有する約１２から約２１ヌクレオチド（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長の、核酸配列を含み、ｐは、存在しても、しなくてもよい末端リン酸基を含み、Ｘは、ＨＣＶ標的核酸配列又はその一部（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）に相補的であるヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列（例えば、標的ＲＮＡ）又はその一部と相互作用する（例えば、塩基対形成する）のに十分な長さである。一実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは同一である。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは異なる。一実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸ及びＸ’の長さは、比較的安定な二本鎖オリゴヌクレオチドを形成するのに十分である。一実施形態においては、式ＩＩ（ａ）の二本鎖オリゴヌクレオチド構築体は、ミスマッチが二本鎖オリゴヌクレオチドの標的遺伝子発現阻害能力をさほど低下させない程度に、１個以上、具体的には１、２、３又は４個のミスマッチを含む。

一実施形態においては、本発明は、式ＤＦＯ−Ｉ（ｂ）のＤＦＯ分子を特徴とする。

式中、Ｚは、他のヌクレオチドとの塩基対形成を促進し得る、１個以上の非標準又は修飾ヌクレオチド（例えば、２−アミノプリン、汎用塩基などの修飾塩基を有するヌクレオチド）を含んでいてもよい、回文構造の核酸配列、又は反復核酸配列を含む。Ｚは、例えば、標的核酸（例えば、標的ＲＮＡ）分子のヌクレオチド配列と相互作用する（例えば、塩基対形成する）のに十分な長さであり得、好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド長、具体的には約１２から約２４ヌクレオチド（例えば、約１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４ヌクレオチド）長であり得る。ｐは、存在しても、しなくてもよい末端リン酸基である。

一実施形態においては、式ＤＦＯ−Ｉ、ＤＦＯ−Ｉ（ａ）、ＤＦＯ−Ｉ（ｂ）、ＤＦＯ−ＩＩ（ａ）又はＤＦＯ−ＩＩのいずれかのＤＦＯ分子は、例えば、式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド、表ＩＶに記載の安定化ケミストリー、本明細書の多様な実施形態に記載の修飾ヌクレオチドと非ヌクレオチドの任意の他の組合せなど、本明細書に記載の化学修飾を、これらだけに限定されずに含み得る。

一実施形態においては、式ＤＦＯ−Ｉ、ＤＦＯ−Ｉ（ａ）及びＤＦＯ−Ｉ（ｂ）のＤＦＯ構築体のＺ中の回文構造若しくは反復配列又は修飾ヌクレオチド（例えば、２−アミノプリン、汎用塩基などの修飾塩基を有するヌクレオチド）は、ＨＣＶ標的核酸配列（例えば、ワトソン クリック塩基対、又は非ワトソン クリック塩基対を形成し得る修飾塩基類似体）の一部と相互作用し得る化学修飾ヌクレオチドを含む。

一実施形態においては、本発明のＤＦＯ分子、例えば、式ＤＦＯ−Ｉ又はＤＦＯ−ＩＩのＤＦＯは、約１５から約４０個のヌクレオチド（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個のヌクレオチド）を含む。一実施形態においては、本発明のＤＦＯ分子は、１個以上の化学修飾を含む。非限定的例においては、化学修飾ヌクレオチド及び／又は非ヌクレオチドを本発明の核酸分子に導入することは、外来的に送達される無修飾ＲＮＡ分子に固有のインビボでの安定性及び生物学的利用能の潜在的限界を克服する強力なツールとなる。例えば、化学修飾核酸分子を使用すると、化学修飾核酸分子は、血清中又は細胞若しくは組織中でより長い半減期を有する傾向にあるので、所与の治療効果に対する特定の核酸分子の用量を減少させることができる。また、ある種の化学修飾は、半減期を延長するだけでなく、特定の器官、細胞又は組織への核酸分子のターゲティングを容易にし、及び／又は核酸分子の細胞内取り込みを改善することによって、核酸分子の生物学的利用能及び／又は効力を改善することができる。したがって、化学修飾核酸分子の活性がインビトロで未変性／無修飾核酸分子よりも低い場合でも、例えば、無修飾ＲＮＡ分子と比較したときに、分子の安定性、効力、有効期間、生物学的利用能及び／又は送達が改善されたために、修飾核酸分子の全活性が、未変性又は無修飾核酸分子よりも大きくなり得る。

本発明の多官能又は多標的ｓｉＮＡ分子
一実施形態においては、本発明は、細胞、組織、生物体などの生体系において１個以上の遺伝子の発現を調節する多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）分子を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。本発明の多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）分子は、ＨＣＶ又は細胞／宿主標的核酸配列の１個を超える領域を標的にすることができ、又は１個を超える異なる標的核酸分子の配列（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ又は細胞／宿主ＲＮＡ標的）を標的にすることができる。本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、化学合成することができ、又は転写単位及び／又はベクターから発現させることができる。本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、種々のヒト用途、治療、診断、農業、獣医学、標的確認、ゲノム発見、遺伝子工学及び薬理ゲノミクスの各適用分野に有用である試薬及び方法を提供する。

本出願人は、多官能低分子干渉核酸、すなわち多官能ｓｉＮＡ分子に限定されないが、本明細書では便宜上そのように称されるある種のオリゴヌクレオチドが、遺伝子発現の配列特異的調節の強力な媒介物質であることを本明細書で示す。本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、１個以上の標的核酸分子中の異なる核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を多官能ｓｉＮＡ構築体の各鎖が含むように設計されたポリヌクレオチド分子の一クラスである点で、当分野で公知である他の核酸配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）とは異なる。したがって、本発明の単一の多官能ｓｉＮＡ分子（一般に二本鎖分子）は、１個を超える（例えば、２、３、４、５個又はそれを超える）異なる標的核酸標的分子を標的にすることができる。本発明の核酸分子は、同じ標的核酸配列の１個を超える（例えば、２、３、４、５個又はそれを超える）領域を標的にすることもできる。したがって、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、１個以上の標的核酸分子の発現を下方制御又は阻害するのに有用である。例えば、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、ウイルス感染及び／又は複製に必要であるウイルス若しくはウイルスタンパク質及び対応する細胞タンパク質をコードする核酸分子、又は特定のウイルス（例えば、ＨＣＶ）の異なる系統をコードする核酸分子を標的にすることができる。１個の多官能ｓｉＮＡ構築体を用いて１個を超える標的核酸分子の発現を低下させる、又は阻害することによって、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、疾患又は病原体に関係する経路内の複数の標的を同時に阻害することができる強力な治療薬の一クラスである。かかる同時阻害は、別々の前臨床及び臨床開発労力や複雑な規制認可プロセスが不要である相乗的治療処置戦略をもたらし得る。

標的核酸分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ又はＨＣＶ ＲＮＡ）の１個を超える領域を標的にする多官能ｓｉＮＡ分子を使用すると、遺伝子発現を強力に阻害すると予想される。例えば、本発明の単一の多官能ｓｉＮＡ構築体は、標的核酸分子（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ）の保存領域と可変領域の両方を標的にすることができ、それによって異なる系統変種（ｓｔｒａｉｎ ｖａｒｉａｎｔ）若しくはウイルス、又は単一の宿主遺伝子によってコードされるスプライスバリアントを下方制御若しくは阻害することができ、又は宿主標的核酸分子のコード領域と非コード領域の両方のターゲティングを可能にする。

一般に、二本鎖オリゴヌクレオチドは、２個の異なるオリゴヌクレオチドを組み立てることによって形成され、一方の鎖のオリゴヌクレオチド配列は、他方の鎖のオリゴヌクレオチド配列に相補的である。かかる二本鎖オリゴヌクレオチドは、２個の別々のオリゴヌクレオチドから一般に組み立てられる（例えば、ｓｉＲＮＡ）。或いは、二本鎖は、それ自体の上で折り重なる単一の分子から形成され得る（例えば、ｓｈＲＮＡ、すなわち短鎖ヘアピンＲＮＡ）。これらの二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉を媒介することが当分野で知られている。これらの二本鎖オリゴヌクレオチドはすべて、一方のヌクレオチド配列領域（ガイド配列又はアンチセンス配列）のみが標的核酸配列と相補性を有し、他方の鎖（センス配列）が、標的核酸配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、共通の特徴を有する。一般に、アンチセンス配列は、活性なＲＩＳＣ複合体中に保持され、アンチセンス配列と標的配列の相補的塩基対形成によってＲＩＳＣを標的ヌクレオチド配列に誘導して、配列特異的ＲＮＡ干渉を媒介する。一部の細胞培養系においては、あるタイプの無修飾ｓｉＲＮＡが「オフターゲット」効果を示し得ることが当分野で知られている。このオフターゲット効果は、ＲＩＳＣ複合体中のｓｉＲＮＡのアンチセンス配列の代わりにセンス配列の関与が必要であると仮定されている（例えば、Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｃｅｌｌ， １１５， １９９−２０８参照）。この場合、センス配列は、ＲＩＳＣ複合体を目的標的配列とは異なる配列（オフターゲット配列）に誘導し、オフターゲット配列を阻害すると考えられる。これらの二本鎖核酸分子においては、各鎖は、異なる標的核酸配列に相補的である。しかし、これらのｄｓＲＮＡによって影響を受けるオフターゲットは、完全に予測可能であるわけではなく、非特異的である。

当分野で公知の二本鎖核酸分子とは別に、本出願人は、単一の多官能ｓｉＮＡ構築体を用いて、１個を超える標的核酸配列の発現を下方制御又は阻害する、潜在的に費用効果の高い簡単な新規方法を開発した。本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、多官能ｓｉＮＡの各鎖又は各領域の一部が、最適な標的核酸配列に相補的であるように、二本鎖又は部分的に二本鎖であるように設計される。したがって、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、互いに相補的であるターゲティング配列に限定されず、任意の２個の異なる標的核酸配列である。本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、所与の標的核酸配列に相補的である、多官能ｓｉＮＡ分子の各鎖又は各領域が、標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介するのに適切な長さ（例えば、約１６から約２８ヌクレオチド長、好ましくは約１８から約２８ヌクレオチド長）であるように設計される。標的核酸配列と多官能ｓｉＮＡの鎖又は領域との相補性は、ＲＮＡ干渉による標的核酸配列の切断に十分でなければならない（少なくとも約８塩基対）。本発明の多官能ｓｉＮＡは、（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．（前掲））に記載のものなどのある種のｓｉＲＮＡ配列で見られるオフターゲット効果を最小化すると予想される。

２９塩基対から３６塩基対の長さのｄｓＲＮＡ（Ｔｕｓｃｈｌ他、国際公開第０２／４４３２１号）は、ＲＮＡｉを媒介しないことが報告されている。これらのｄｓＲＮＡが不活性である１つの理由は、恐らく、標的ＲＮＡ配列と相互作用する鎖の代謝回転又は解離の欠如である。ＲＩＳＣ複合体は、標的ＲＮＡの複数のコピーと効率的に相互作用することができず、ＲＮＡｉプロセスの効力及び効率がかなり減少する。驚くべきことに、本出願人は、本発明の多官能ｓｉＮＡが、この障害を克服することができ、ＲＮＡｉプロセスの効率及び効力を増大できることを見いだした。すなわち、本発明のある実施形態においては、多官能ｓｉＮＡ分子の各鎖の一部が、ＲＮＡｉを効率的に媒介するのに十分な長さ（例えば、約１５から約２３塩基対）の標的核酸に相補的であるヌクレオチド配列領域と、標的核酸に相補的でないヌクレオチド配列領域とを含むように、約２９から約３６塩基対の長さの多官能ｓｉＮＡを設計することができる。多官能ｓｉＮＡの各鎖中に相補部分と非相補部分の両方を有することによって、多官能ｓｉＮＡは、代謝回転又は解離を妨げること（例えば、各鎖の長さが長すぎて、それぞれの標的核酸配列に対してＲＮＡｉを媒介することができない場合）なしに、標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介することができる。また、内部重複領域を有する、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子を設計すると、多官能ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉を媒介するのに好都合な（小さい）サイズ、及び治療薬としての使用に適切なサイズになる（例えば、各鎖は独立に約１８から約２８ヌクレオチド長である。）。非限定的例を図１６−２８に示す。

一実施形態においては、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、第１の領域と第２の領域を含み、多官能ｓｉＮＡの第１の領域は、第１の標的核酸分子の核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、多官能ｓｉＮＡの第２の領域は、第２の標的核酸分子の核酸配列に相補的である核酸配列を含む。一実施形態においては、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、第１の領域と第２の領域を含み、多官能ｓｉＮＡの第１の領域は、標的核酸分子の第１の領域の核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、多官能ｓｉＮＡの第２の領域は、標的核酸分子の第２の領域の核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態においては、多官能ｓｉＮＡの第１の領域と第２の領域は、ある程度の相補性（例えば、約１から約１０個の相補ヌクレオチド）を共有する別々の核酸配列を含み得る。ある実施形態においては、別々の核酸配列を含む複数の多官能ｓｉＮＡ構築体は、合成後に、当分野で公知である方法及び試薬によって容易に連結することができ、かかる連結された構築体は本発明の範囲内である。或いは、多官能ｓｉＮＡの第１の領域と第２の領域は、ヘアピン又はステムループ構造などのある程度の自己相補性を有する単一の核酸配列を含み得る。かかる二本鎖及びヘアピン多官能低分子干渉核酸の非限定的例をそれぞれ図１６及び１７に示す。これらの多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）は、ある種の重複ヌクレオチド配列を含んでいてもよく、かかる重複ヌクレオチド配列は、多官能ｓｉＮＡの第１の領域と第２の領域の間に存在する（例えば、図１８及び１９参照）。

一実施形態においては、本発明は、多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）の各鎖が、異なる標的核酸配列に相補的である核酸配列の第１の領域と、標的配列に相補的でないヌクレオチド配列の第２の領域とを独立に含む、多官能ｓｉＮＡ分子を特徴とする。各鎖の標的核酸配列は、同じ標的核酸分子、又は異なる標的核酸分子中に存在する。

別の実施形態においては、多官能ｓｉＮＡは２本の鎖を含み、（ａ）第１の鎖は、標的核酸配列に対して配列相補性を有する領域（相補領域１）と、標的ヌクレオチド配列に対して配列相補性を持たない領域（非相補領域１）とを含み、（ｂ）多官能ｓｉＮＡの第２の鎖は、第１の鎖のヌクレオチド配列に相補的である標的ヌクレオチド配列とは異なる標的核酸配列に対して配列相補性を有する領域（相補領域２）と、相補領域２の標的ヌクレオチド配列に対して配列相補性を持たない領域（非相補領域２）とを含み、（ｃ）第１の鎖の相補領域１は、第２の鎖の非相補領域２中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、第２の鎖の相補領域２は、第１の鎖の非相補領域１中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。相補領域１と相補領域２の標的核酸配列は、同じ標的核酸分子、又は異なる標的核酸分子中に存在する。

別の実施形態においては、多官能ｓｉＮＡは２本の鎖を含み、（ａ）第１の鎖は、遺伝子（例えば、ＨＣＶ又は宿主遺伝子）に由来する標的核酸配列に対して配列相補性を有する領域（相補領域１）と、相補領域１の標的ヌクレオチド配列に対して配列相補性を持たない領域（非相補領域１）とを含み、（ｂ）多官能ｓｉＮＡの第２の鎖は、相補領域１の遺伝子とは異なる遺伝子に由来する標的核酸配列に対して配列相補性を有する領域（相補領域２）と、相補領域２の標的ヌクレオチド配列に対して配列相補性を持たない領域（非相補領域２）とを含み、（ｃ）第１の鎖の相補領域１は、第２の鎖の非相補領域２中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、第２の鎖の相補領域２は、第１の鎖の非相補領域１中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。

別の実施形態においては、多官能ｓｉＮＡは２本の鎖を含み、（ａ）第１の鎖は、遺伝子（例えば、ＨＣＶ又は宿主遺伝子）に由来する標的核酸配列に対して配列相補性を有する領域（相補領域１）と、相補領域１の標的ヌクレオチド配列に対して配列相補性を持たない領域（非相補領域１）とを含み、（ｂ）多官能ｓｉＮＡの第２の鎖は、相補領域１の標的核酸配列とは異なる標的核酸配列に対して配列相補性を有する領域（相補領域２）（ただし、相補領域１の標的核酸配列と相補領域２の標的核酸配列はどちらも同じ遺伝子に由来する。）と、相補領域２の標的ヌクレオチド配列に対して配列相補性を持たない領域（非相補領域２）とを含み、（ｃ）第１の鎖の相補領域１は、第２の鎖の非相補領域２中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、第２の鎖の相補領域２は、第１の鎖の非相補領域１中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。

一実施形態においては、本発明は、２個の相補核酸配列を含む、多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、第１の配列は、標的核酸分子内のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する第１の領域を含み、第２の配列は、同じ標的核酸分子内の異なるヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する第１の領域を含む。好ましくは、第１の配列の第１の領域は、第２の配列の第２の領域のヌクレオチド配列にも相補的であり、第２の配列の第１の領域は、第１の配列の第２の領域のヌクレオチド配列に相補的である。

一実施形態においては、本発明は、２個の相補核酸配列を含む、多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、第１の配列は、第１の標的核酸分子内のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する第１の領域を含み、第２の配列は、第２の標的核酸分子内の異なるヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する第１の領域を含む。好ましくは、第１の配列の第１の領域は、第２の配列の第２の領域のヌクレオチド配列にも相補的であり、第２の配列の第１の領域は、第１の配列の第２の領域のヌクレオチド配列に相補的である。

一実施形態においては、本発明は、第１の領域と第２の領域を含む多官能ｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、第１の領域は、第１の標的核酸分子内の核酸配列に相補的である約１８から約２８ヌクレオチドを有する核酸配列を含み、第２の領域は、第２の標的核酸分子内の異なる核酸配列に相補的である約１８から約２８ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む。

一実施形態においては、本発明は、第１の領域と第２の領域を含む多官能ｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、第１の領域は、標的核酸分子内の核酸配列に相補的である約１８から約２８ヌクレオチドを有する核酸配列を含み、第２の領域は、同じ標的核酸分子内の異なる核酸配列に相補的である約１８から約２８ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む。

一実施形態においては、本発明は、一方の鎖が、第１の標的核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する第１の領域を含み、他方の鎖が、第２の標的核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する第１の領域を含む、二本鎖多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。第１と第２の標的核酸配列は、別々の標的核酸分子中に存在し得、又は同じ標的核酸分子内の異なる領域であり得る。したがって、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子を用いて、異なる遺伝子、同じ遺伝子のスプライスバリアント、１個以上の遺伝子転写物の変異領域と保存領域の両方、又は同じ若しくは異なる遺伝子若しくは遺伝子転写物のコード配列と非コード配列の両方の発現を標的にすることができる。

一実施形態においては、本発明の標的核酸分子は、単一のタンパク質をコードする。別の実施形態においては、標的核酸分子は、１個を超えるタンパク質（例えば、１、２、３、４、５個又はそれを超えるタンパク質）をコードする。したがって、本発明の多官能ｓｉＮＡ構築体を用いて、幾つかのタンパク質の発現を下方制御又は阻害することができる。例えば、ウイルスゲノム（例えば、ＨＣＶ）に由来する第１の標的核酸配列に対してヌクレオチド配列相補性を有する１本の鎖中の領域と、２種類のタンパク質（例えば、ＨＣＶ生活環に関与する２種類の宿主タンパク質）をコードする遺伝子に由来する標的核酸分子中に存在する第２の標的核酸配列に対してヌクレオチド配列相補性を有する領域を含む第２の鎖とを含む多官能ｓｉＮＡ分子を使用して、例えば、ウイルスＲＮＡ（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ）と、ウイルス感染又はウイルス生活環に関与する１個以上の宿主ＲＮＡ（例えば、Ｌａ抗原又はインターフェロン制御因子）とを標的にすることによって、特定の生物学的経路を下方制御、阻害、又は遮断することができる。

一実施形態においては、本発明は、サイトカイン又はリガンド及びサイトカイン又はリガンドの受容体の異なるアイソフォーム中に存在する保存ヌクレオチド配列を利用する。一方の鎖が、サイトカインの種々のアイソフォーム間で保存された標的核酸配列に相補的である配列を含み、他方の鎖が、サイトカイン受容体間で保存された標的核酸配列に相補的である配列を含むように、多官能ｓｉＮＡを設計することによって、単一の多官能ｓｉＮＡを用いて、生物学的経路又は生物学的経路中の複数の遺伝子（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｅｎｅ）を選択的かつ効果的に調節又は阻害することができる。

一実施形態においては、本発明の多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）は、第１の領域と第２の領域を含み、第１の領域は、第１の標的の第１の標的ＲＮＡに相補的であるヌクレオチド配列を含み、第２の領域は、第２の標的の第２の標的ＲＮＡに相補的であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態においては、第１と第２の領域は、同じ標的配列内の異なる標的部位の共有若しくは保存ＲＮＡ配列、又は異なる標的配列間の共有ＲＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み得る。

別の非限定的例においては、ウイルス又はウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶ）をコードする標的核酸分子に由来する第１の標的核酸配列に対してヌクレオチド配列相補性を有する１本の鎖中の領域と、細胞タンパク質（例えば、ＨＩＶのＣＣＲ５受容体などのウイルスの受容体）をコードする標的核酸分子中に存在する第２の標的核酸配列に対してヌクレオチド配列相補性を有する領域を含む第２の鎖とを含む多官能ｓｉＮＡ分子を用いて、ウイルスとウイルス感染又は複製に必要な細胞タンパク質とを標的にすることによって、ウイルス複製及び感染を下方制御、阻害又は遮断することができる。

別の非限定的例においては、ウイルスゲノムと、ウイルス感染又は複製に必要なウイルスによってコードされたタンパク質とを標的にすることによって、ウイルス複製及び感染を下方制御、阻害、又は遮断するための、ウイルスゲノム（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ）などの標的核酸分子中に存在する第１の標的核酸配列（例えば、保存配列）に対してヌクレオチド配列相補性を有する１本の鎖中の領域と、ウイルスタンパク質（例えば、ＨＣＶタンパク質）をコードする遺伝子に由来する標的核酸分子中に存在する第２の標的核酸配列（例えば、保存配列）に対してヌクレオチド配列相補性を有する領域を含む第２の鎖とを含む多官能ｓｉＮＡ分子。

一実施形態においては、本発明は、異なる系統、アイソタイプ又は形態のウイルス中に存在する保存ヌクレオチド配列と、これらの異なる系統、アイソタイプ及び形態のウイルス（例えば、ＨＣＶ）によってコードされる遺伝子とを利用する。一方の鎖が、種々の系統、アイソタイプ又は形態のウイルス間で保存された標的核酸配列に相補的である配列を含み、他方の鎖が、ウイルスによってコードされるタンパク質中に保存された標的核酸配列に相補的である配列を含むように、多官能ｓｉＮＡを設計することによって、単一の多官能ｓｉＮＡを用いてウイルス複製又は感染を選択的かつ効果的に阻害することができる。

一実施形態においては、本発明の多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）は、第１の領域と第２の領域を含み、第１の領域は、第１のウイルス系統のＨＣＶウイルスＲＮＡに相補的であるヌクレオチド配列を含み、第２の領域は、第２のウイルス系統のＨＣＶウイルスＲＮＡに相補的であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態においては、第１の領域と第２の領域は、異なるウイルス系統又はクラス又はウイルス系統の共有又は保存ＲＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み得る。

一実施形態においては、本発明の多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）は、各鎖中に領域を含み、一方の鎖中の領域は、１種類以上のＨＣＶウイルス（例えば、１種類以上のＨＣＶ系統）をコードするＨＣＶウイルスＲＮＡに相補的であるヌクレオチド配列を含み、他方の鎖中の領域は、１種類以上のインターフェロン作動タンパク質をコードするウイルスＲＮＡに相補的であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態においては、第１の領域は、異なるＨＣＶウイルス系統、又は異なるクラスのＨＣＶウイルス系統の共有又は保存ＲＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み得る。インターフェロン作動タンパク質の非限定的例としては、ＲＮＡサイレンシングを阻害又は抑制し得る任意のタンパク質が挙げられる（例えば、Ｅ３Ｌ、ＮＳ１などのＲＮＡ結合タンパク質又はその等価物。例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４， ＰＮＡＳ， １０１， １３５０−１３５５参照）。

一実施形態においては、本発明の多官能低分子干渉核酸（多官能ｓｉＮＡ）は、第１の領域と第２の領域を含み、第１の領域は、ＨＣＶウイルスＲＮＡに相補的であるヌクレオチド配列を含み、第２の領域は、ＨＣＶウイルス感染及び／又は複製に関与する細胞ＲＮＡに相補的であるヌクレオチド配列を含む。ウイルス感染及び／又は複製に関与する細胞ＲＮＡの非限定的例としては、細胞受容体、細胞表面分子、細胞酵素、細胞転写因子、及び／又はサイトカイン、二次メッセンジャー、並びにＬａ抗原、ＦＡＳ、インターフェロン作動タンパク質（例えば、Ｅ３Ｌ若しくはＮＳ１又はその等価物。例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４， ＰＮＡＳ， １０１， １３５０−１３５５参照）、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ）；細胞ＰＫＲプロテインキナーゼ（ＰＫＲ）；ヒト真核生物開始因子２Ｂ（ｅｌＦ２Ｂガンマ及び／又はｅｌＦ２ガンマ）；ヒトＤＥＡＤ Ｂｏｘタンパク質（ＤＤＸ３）、及びポリピリミジントラクト結合タンパク質などのＨＣＶ ３’−ＵＴＲのポリ（Ｕ）トラクトに結合する細胞タンパク質を含めて、ただしこれらだけに限定されない細胞アクセサリー分子が挙げられる。

一実施形態においては、本発明の二本鎖多官能ｓｉＮＡ分子は、式ＭＦ−Ｉの構造を含む。

式中、各５’−ｐ−ＸＺＸ’−３’及び５’−ｐ−ＹＺＹ’−３’は独立に、約２０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド長、好ましくは約２０から約２００ヌクレオチド長、約２０から約１００ヌクレオチド長、約２０から約４０ヌクレオチド長、約２０から約４０ヌクレオチド長、約２４から約３８ヌクレオチド長、又は約２６から約３８ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ＸＺは、第１の標的核酸配列に相補的である核酸配列を含み、ＹＺは、第２の標的核酸配列に相補的である核酸配列を含むオリゴヌクレオチドであり、Ｚは、自己相補的である約１から約２４ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチド）長のヌクレオチド配列を含み、Ｘは、領域Ｙ’中に存在するヌクレオチド配列に相補的である、約１から約１００ヌクレオチド長、好ましくは約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長のヌクレオチド配列を含み、Ｙは、領域Ｘ’中に存在するヌクレオチド配列に相補的である、約１から約１００ヌクレオチド長、好ましくは約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長のヌクレオチド配列を含み、各ｐは、独立に存在する、又は存在しない末端リン酸基を含み、各ＸＺ及びＹＺは独立に、それぞれ第１及び第２の標的核酸配列又はその一部と安定に相互作用する（すなわち、塩基対形成する）のに十分な長さである。例えば、各配列Ｘ及びＹは、標的ＲＮＡ又はその一部など、異なる標的核酸分子中の標的ヌクレオチド配列に相補的である、約１２から約２１又はそれを超える（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれを超える）ヌクレオチド長の配列を独立に含み得る。別の非限定的例においては、第１の標的核酸配列又はその一部に相補的である、ＸとＺの一緒のヌクレオチド配列の長さは、約１２から約２１又はそれを超える（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれを超える）ヌクレオチドである。別の非限定的例においては、第２の標的核酸配列又はその一部に相補的である、ＹとＺの一緒のヌクレオチド配列の長さは、約１２から約２１又はそれを超える（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれを超える）ヌクレオチドである。一実施形態においては、第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列は、同じ標的核酸分子（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ又は宿主ＲＮＡ）中に存在する。別の実施形態においては、第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列は、異なる標的核酸分子（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡと宿主ＲＮＡ）中に存在する。一実施形態においては、Ｚは回文構造又は反復配列を含む。一実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは同一である。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは異なる。一実施形態においては、オリゴヌクレオチドＹとＹ’の長さは同一である。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＹとＹ’の長さは異なる。一実施形態においては、式Ｉ（ａ）の二本鎖オリゴヌクレオチド構築体は、ミスマッチが二本鎖オリゴヌクレオチドの標的遺伝子発現阻害能力をさほど低下させない程度に、１個以上、具体的には１、２、３又は４個のミスマッチを含む。

一実施形態においては、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、式ＭＦ−ＩＩの構造を含む。

式中、５’−ｐ−ＸＸ’−３’及び５’−ｐ−ＹＹ’−３’は独立に、約２０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド長、好ましくは約２０から約２００ヌクレオチド長、約２０から約１００ヌクレオチド長、約２０から約４０ヌクレオチド長、約２０から約４０ヌクレオチド長、約２４から約３８ヌクレオチド長、又は約２６から約３８ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、Ｘは、第１の標的核酸配列に相補的である核酸配列を含み、Ｙは、第２の標的核酸配列に相補的である核酸配列を含むオリゴヌクレオチドであり、Ｘは、領域Ｙ’中に存在するヌクレオチド配列に相補的である、約１から約１００ヌクレオチド長、好ましくは約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長のヌクレオチド配列を含み、Ｙは、領域Ｘ’中に存在するヌクレオチド配列に相補的である、約１から約１００ヌクレオチド長、好ましくは約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド）長のヌクレオチド配列を含み、各ｐは、独立に存在する、又は存在しない末端リン酸基を含み、各Ｘ及びＹは独立に、それぞれ第１及び第２の標的核酸配列又はその一部と安定に相互作用する（すなわち、塩基対形成する）のに十分な長さである。例えば、各配列Ｘ及びＹは、標的ＲＮＡ又はその一部など、異なる標的核酸分子中の標的ヌクレオチド配列に相補的である、約１２から約２１又はそれを超える（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又はそれを超える）ヌクレオチド長の配列を独立に含み得る。一実施形態においては、第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列は、同じ標的核酸分子（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ又は宿主ＲＮＡ）中に存在する。別の実施形態においては、第１の標的核酸配列と第２のＨＣＶ標的核酸配列は、異なる標的核酸分子（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡと宿主ＲＮＡ）中に存在する。一実施形態においては、Ｚは回文構造又は反復配列を含む。一実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは同一である。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸとＸ’の長さは異なる。一実施形態においては、オリゴヌクレオチドＹとＹ’の長さは同一である。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＹとＹ’の長さは異なる。一実施形態においては、式Ｉ（ａ）の二本鎖オリゴヌクレオチド構築体は、ミスマッチが二本鎖オリゴヌクレオチドの標的遺伝子発現阻害能力をさほど低下させない程度に、１個以上、具体的には１、２、３又は４個のミスマッチを含む。

一実施形態においては、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、式ＭＦ−ＩＩＩの構造を含む。

式中、各Ｘ、Ｘ’、Ｙ及びＹ’は独立に、約１５ヌクレオチドから約５０ヌクレオチド長、好ましくは約１８から約４０ヌクレオチド長、又は約１９から約２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、Ｘは、領域Ｙ’中に存在するヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、Ｘ’は、領域Ｙ中に存在するヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、各Ｘ及びＸ’は一実施形態において独立に、それぞれ第１及び第２の標的核酸配列又はその一部と安定に相互作用する（すなわち、塩基対形成する）のに十分な長さであり、Ｗは、配列Ｙ’とＹを連結するヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーであり、多官能ｓｉＮＡは、ＲＮＡ干渉によって第１の標的配列と第２の標的配列の切断を誘導する。
ｎｔ、第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列は、同じ標的核酸分子（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ又は宿主ＲＮＡ）中に存在する。別の実施形態においては、第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列は、異なる標的核酸分子（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡと宿主ＲＮＡ）中に存在する。一実施形態においては、領域Ｗは、配列Ｙ’の３’末端を配列Ｙの３’末端と連結する。一実施形態においては、領域Ｗは、配列Ｙ’の３’末端を配列Ｙの５’末端と連結する。一実施形態においては、領域Ｗは、配列Ｙ’の５’末端を配列Ｙの５’末端と連結する。一実施形態においては、領域Ｗは、配列Ｙ’の５’末端を配列Ｙの３’末端と連結する。一実施形態においては、末端リン酸基は、配列Ｘの５’末端に存在する。一実施形態においては、末端リン酸基は、配列Ｘ’の５’末端に存在する。一実施形態においては、末端リン酸基は、配列Ｙの５’末端に存在する。一実施形態においては、末端リン酸基は、配列Ｙ’の５’末端に存在する。一実施形態においては、Ｗは、生分解性リンカーを介して配列ＹとＹ’を連結する。一実施形態においては、Ｗは、抱合体、標識、アプタマー、リガンド、脂質又はポリマーを更に含む。

一実施形態においては、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、式ＭＦ−ＩＶの構造を含む。

式中、各Ｘ、Ｘ’、Ｙ及びＹ’は独立に、約１５ヌクレオチドから約５０ヌクレオチド長、好ましくは約１８から約４０ヌクレオチド長、又は約１９から約２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、Ｘは、領域Ｙ’中に存在するヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、Ｘ’は、領域Ｙ中に存在するヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、各Ｙ及びＹ’は独立に、それぞれ第１及び第２の標的核酸配列又はその一部と安定に相互作用する（すなわち、塩基対形成する）のに十分な長さであり、Ｗは、配列Ｙ’とＹを連結するヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーであり、多官能ｓｉＮＡは、ＲＮＡ干渉によって第１の標的配列と第２の標的配列の切断を誘導する。一実施形態においては、第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列は、同じ標的核酸分子（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ又は宿主ＲＮＡ）中に存在する。別の実施形態においては、第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列は、異なる標的核酸分子（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡと宿主ＲＮＡ）中に存在する。一実施形態においては、領域Ｗは、配列Ｙ’の３’末端を配列Ｙの３’末端と連結する。一実施形態においては、領域Ｗは、配列Ｙ’の３’末端を配列Ｙの５’末端と連結する。一実施形態においては、領域Ｗは、配列Ｙ’の５’末端を配列Ｙの５’末端と連結する。一実施形態においては、領域Ｗは、配列Ｙ’の５’末端を配列Ｙの３’末端と連結する。一実施形態においては、末端リン酸基は、配列Ｘの５’末端に存在する。一実施形態においては、末端リン酸基は、配列Ｘ’の５’末端に存在する。一実施形態においては、末端リン酸基は、配列Ｙの５’末端に存在する。一実施形態においては、末端リン酸基は、配列Ｙ’の５’末端に存在する。一実施形態においては、Ｗは、生分解性リンカーを介して配列ＹとＹ’を連結する。一実施形態においては、Ｗは、抱合体、標識、アプタマー、リガンド、脂質又はポリマーを更に含む。

一実施形態においては、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、式ＭＦ−Ｖの構造を含む。

式中、各Ｘ、Ｘ’、Ｙ及びＹ’は独立に、約１５ヌクレオチドから約５０ヌクレオチド長、好ましくは約１８から約４０ヌクレオチド長、又は約１９から約２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、Ｘは、領域Ｙ’中に存在するヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、Ｘ’は、領域Ｙ中に存在するヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、各Ｘ、Ｘ’、Ｙ又はＹ’は独立に、それぞれ第１、第２、第３又は第４の標的核酸配列又はその一部と安定に相互作用する（すなわち、塩基対形成する）のに十分な長さであり、Ｗは、配列Ｙ’とＹを連結するヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーであり、多官能ｓｉＮＡは、ＲＮＡ干渉によって第１、第２、第３及び／又は第４の標的配列の切断を誘導する。一実施形態においては、第１、第２、第３及び第４の標的核酸配列はすべて同じ標的核酸分子（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ又は宿主ＲＮＡ）中に存在する。別の実施形態においては、第１、第２、第３及び第４の標的核酸配列は、異なる標的核酸分子（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ及び宿主ＲＮＡ）中に独立に存在する。一実施形態においては、領域Ｗは、配列Ｙ’の３’末端を配列Ｙの３’末端と連結する。一実施形態においては、領域Ｗは、配列Ｙ’の３’末端を配列Ｙの５’末端と連結する。一実施形態においては、領域Ｗは、配列Ｙ’の５’末端を配列Ｙの５’末端と連結する。一実施形態においては、領域Ｗは、配列Ｙ’の５’末端を配列Ｙの３’末端と連結する。一実施形態においては、末端リン酸基は、配列Ｘの５’末端に存在する。一実施形態においては、末端リン酸基は、配列Ｘ’の５’末端に存在する。一実施形態においては、末端リン酸基は、配列Ｙの５’末端に存在する。一実施形態においては、末端リン酸基は、配列Ｙ’の５’末端に存在する。一実施形態においては、Ｗは、生分解性リンカーを介して配列ＹとＹ’を連結する。一実施形態においては、Ｗは、抱合体、標識、アプタマー、リガンド、脂質又はポリマーを更に含む。

一実施形態においては、（例えば、式ＭＦ−ＩからＭＦ−Ｖのいずれかの）本発明の多官能ｓｉＮＡ分子の領域ＸとＹは、同じ標的核酸分子の一部である異なる標的核酸配列に相補的である。一実施形態においては、かかる各標的核酸配列は、ＲＮＡ転写物のコード領域内の異なる場所に存在する。一実施形態においては、かかる各標的核酸配列は、同じＲＮＡ転写物のコード及び非コード領域を含む。一実施形態においては、かかる各標的核酸配列は、交互にスプライスされた転写物の領域、又はかかる交互にスプライスされた転写物の前駆体の領域を含む。

一実施形態においては、式ＭＦ−ＩからＭＦ−Ｖのいずれかの多官能ｓｉＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載の式Ｉ−ＶＩＩのいずれかのヌクレオチド、表ＩＶに記載の安定化ケミストリー、本明細書の種々の実施形態に記載の修飾ヌクレオチドと非ヌクレオチドの任意の他の組合せなど、本明細書に記載の化学修飾を、これらだけに限定されずに含み得る。

一実施形態においては、式ＭＦ−Ｉ又はＭＦ−ＩＩの多官能ｓｉＮＡ構築体のＺ中の回文構造若しくは反復配列又は修飾ヌクレオチド（例えば、２−アミノプリン、汎用塩基などの修飾塩基を有するヌクレオチド）は、標的核酸配列（例えば、ワトソン クリック塩基対又は非ワトソン クリック塩基対を形成し得る修飾塩基類似体）の一部と相互作用し得る化学修飾ヌクレオチドを含む。

一実施形態においては、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子、例えばＭＦ−ＩからＭＦ−Ｖの多官能ｓｉＮＡの各鎖は、約１５から約４０個のヌクレオチド（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個のヌクレオチド）を独立に含む。一実施形態においては、本発明の多官能ｓｉＮＡ分子は、１個以上の化学修飾を含む。非限定的例においては、化学修飾ヌクレオチド及び／又は非ヌクレオチドを本発明の核酸分子に導入することは、外来的に送達される無修飾ＲＮＡ分子に固有のインビボでの安定性及び生物学的利用能の潜在的限界を克服する強力なツールとなる。例えば、化学修飾核酸分子を使用すると、化学修飾核酸分子は、血清中又は細胞若しくは組織中でより長い半減期を有する傾向にあるので、所与の治療効果に対する特定の核酸分子の用量を減少させることができる。また、ある種の化学修飾は、半減期を延長するだけでなく、特定の器官、細胞又は組織への核酸分子のターゲティングを容易にし、及び／又は核酸分子の細胞内取り込みを改善することによって、核酸分子の生物学的利用能及び／又は効力を改善することができる。したがって、化学修飾核酸分子の活性がインビトロで未変性／無修飾核酸分子よりも低い場合でも、例えば、無修飾ＲＮＡ分子と比較したときに、分子の安定性、効力、有効期間、生物学的利用能及び／又は送達が改善されたために、修飾核酸分子の全活性が、未変性又は無修飾核酸分子よりも大きくなり得る。

別の実施形態においては、本発明は、２個の別々の二本鎖ｓｉＮＡから組み立てられ、２本のアンチセンスｓｉＮＡ鎖が、一端で互いに繋留されたその対応するセンス鎖とアニールされるように、各センス鎖の末端の一方が、他方のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の末端に繋留された、多官能ｓｉＮＡを特徴とする（図２２参照）。繋留鎖又はリンカーは、当分野で一般に公知であり、本明細書に記載された、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。

一実施形態においては、本発明は、２個の別々の二本鎖ｓｉＮＡから組み立てられ、２本のアンチセンスｓｉＮＡ鎖の５’末端が、互いに（反対方向に）離れた位置で、一端で互いに繋留されたその対応するセンス鎖とアニールされるように、ｓｉＮＡの１本のセンス鎖の５’末端が、他方のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端に繋留された、多官能ｓｉＮＡを特徴とする（図２２（Ａ）参照）。繋留鎖又はリンカーは、当分野で一般に公知であり、本明細書に記載された、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。

一実施形態においては、本発明は、２個の別々の二本鎖ｓｉＮＡから組み立てられ、２本のアンチセンスｓｉＮＡ鎖の５’末端が、向かい合って、一端で互いに繋留されたその対応するセンス鎖とアニールされるように、ｓｉＮＡの１本のセンス鎖の３’末端が、他方のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の３’末端に繋留された、多官能ｓｉＮＡを特徴とする（図２２（Ｂ）参照）。繋留鎖又はリンカーは、当分野で一般に公知であり、本明細書に記載された、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。

一実施形態においては、本発明は、２個の別々の二本鎖ｓｉＮＡから組み立てられ、アンチセンスｓｉＮＡ鎖の一方の５’末端が、他方のアンチセンス鎖の３’末端と向かい合って、一端で互いに繋留されたその対応するセンス鎖とアニールされるように、ｓｉＮＡの１本のセンス鎖の５’末端が、他方のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の３’末端に繋留された、多官能ｓｉＮＡを特徴とする（図２２（Ｃ−Ｄ）参照）。繋留鎖又はリンカーは、当分野で一般に公知であり、本明細書に記載された、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。

一実施形態においては、本発明は、２個の別々の二本鎖ｓｉＮＡから組み立てられ、センスｓｉＮＡ鎖の一方の５’末端が、他方のセンス鎖の３’末端と向かい合って、一端で互いに繋留されたその対応するアンチセンス鎖とアニールされるように、ｓｉＮＡの１本のアンチセンス鎖の５’末端が、他方のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の３’末端に繋留された、多官能ｓｉＮＡを特徴とする（図２２（Ｇ−Ｈ）参照）。一実施形態においては、第１のアンチセンス鎖の５’末端と第２のアンチセンス鎖の３’末端との結合は、容易に切断されて（例えば、生分解性リンカー）、多官能ｓｉＮＡの各アンチセンス鎖の５’末端が、ＲＮＡ干渉（ｉｎｔｅｒｅｆｅｎｃｅ）による標的ＲＮＡの切断を媒介するのに適切な遊離５’末端を有するように設計される。繋留鎖又はリンカーは、当分野で一般に公知であり、本明細書に記載された、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。

一実施形態においては、本発明は、２個の別々の二本鎖ｓｉＮＡから組み立てられ、センスｓｉＮＡ鎖の一方の３’末端が、他方のセンス鎖の３’末端と向かい合って、一端で互いに繋留されたその対応するアンチセンス鎖とアニールされるように、ｓｉＮＡの１本のアンチセンス鎖の５’末端が、他方のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の５’末端に繋留された、多官能ｓｉＮＡを特徴とする（図２２（Ｅ）参照）。一実施形態においては、第１のアンチセンス鎖の５’末端と第２のアンチセンス鎖の５’末端との結合は、容易に切断されて（例えば、生分解性リンカー）、多官能ｓｉＮＡの各アンチセンス鎖の５’末端が、ＲＮＡ干渉による標的ＲＮＡの切断を媒介するのに適切な遊離５’末端を有するように設計される。繋留鎖又はリンカーは、当分野で一般に公知であり、本明細書に記載された、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。

一実施形態においては、本発明は、２個の別々の二本鎖ｓｉＮＡから組み立てられ、センスｓｉＮＡ鎖の一方の５’末端が、他方のセンス鎖の３’末端と向かい合って、一端で互いに繋留されたその対応するアンチセンス鎖とアニールされるように、ｓｉＮＡの１本のアンチセンス鎖の３’末端が、他方のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の３’末端に繋留された、多官能ｓｉＮＡを特徴とする（図２２（Ｆ）参照）。一実施形態においては、第１のアンチセンス鎖の５’末端と第２のアンチセンス鎖の５’末端との結合は、容易に切断されて（例えば、生分解性リンカー）、多官能ｓｉＮＡの各アンチセンス鎖の５’末端が、ＲＮＡ干渉による標的ＲＮＡの切断を媒介するのに適切な遊離５’末端を有するように設計される。繋留鎖又はリンカーは、当分野で一般に公知であり、本明細書に記載された、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。

上記実施形態のいずれにおいても、第１の標的核酸配列又は第２の標的核酸配列は、細胞受容体、細胞表面分子、細胞酵素、細胞転写因子、及び／又はサイトカイン、二次メッセンジャー、並びにＬａ抗原（例えば、Ｃｏｓｔａ−Ｍａｔｔｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ２４， ６８６１−７０参照。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３１４２）、ＦＡＳ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００４３）又はＦＡＳリガンド（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００６３９）、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８２５０３．１）、細胞ＰＫＲプロテインキナーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００２６６１．７）、ヒト真核生物開始因子２Ｂ（ｅｌＦ２Ｂガンマ；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２５６２２３、及び／又はｅｌＦ２ガンマ；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６８７４．１）、ヒトＤＥＡＤ Ｂｏｘタンパク質（ＤＤＸ３；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０１８０２１．２）、及びポリピリミジントラクト結合タンパク質などのＨＣＶ ３’−ＵＴＲのポリ（Ｕ）トラクトに結合する細胞タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３１９９１．１及びＸＭ＿０４２９７２．３）を含めて、ただしこれらだけに限定されない細胞アクセサリー分子など、ＨＣＶ感染若しくは複製、又はＨＣＶ感染に関連した疾患過程に関与する、細胞又は宿主標的のＨＣＶ ＲＮＡ若しくはその一部又はポリヌクレオチドコード配列若しくは非コード配列を独立に含み得る。一実施形態においては、第１のＨＣＶ標的核酸配列は、ＨＣＶ ＲＮＡ又はその一部であり、第２のＨＣＶ標的核酸配列はその一部のＨＣＶ ＲＮＡである。一実施形態においては、第１のＨＣＶ標的核酸配列は、ＨＣＶ ＲＮＡ又はその一部であり、第２のＨＣＶ標的核酸配列は宿主ＲＮＡ又はその一部である。一実施形態においては、第１のＨＣＶ標的核酸配列は、宿主ＲＮＡ又はその一部であり、第２のＨＣＶ標的核酸配列は宿主ＲＮＡ又はその一部である。一実施形態においては、第１のＨＣＶ標的核酸配列は、宿主ＲＮＡ又はその一部であり、第２のＨＣＶ標的核酸配列はＨＣＶ ＲＮＡ又はその一部である。

核酸分子の合成
１００ヌクレオチド長を超える核酸の合成は、自動化された方法では困難であり、かかる分子の治療コストは法外である。本発明では、低分子核酸モチーフ（「低分子」とは、１００ヌクレオチド長以下、好ましくは８０ヌクレオチド長以下、最も好ましくは５０ヌクレオチド長以下の核酸モチーフ、例えば、個々のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド配列、又はタンデム合成されたｓｉＮＡ配列を指す。）は、外来性の送達に好ましく使用される。これらの分子の構造が簡単であると、タンパク質及び／又はＲＮＡ構造の標的領域に侵入する核酸の能力が増大する。本発明の例示的な分子は化学合成され、他の分子も同様に合成することができる。

オリゴヌクレオチド（例えば、ある種の修飾オリゴヌクレオチド、又はリボヌクレオチドを欠くオリゴヌクレオチドの一部）は、当分野で公知のプロトコルによって、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１， ３−１９、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他、国際公開第９９／５４４５９号、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３， ２６７７−２６８４、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ．， ７４， ５９， Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．， ６１， ３３−４５及びＢｒｅｎｎａｎ、米国特許第６，００１，３１１号に記載したとおりに、合成される。これらの参考文献のすべてを参照により本明細書に組込む。オリゴヌクレオチドの合成は、５’末端におけるジメトキシトリチル、３’末端におけるホスホルアミダイトなどの一般的な核酸保護基及びカップリング基を利用する。非限定的例においては、３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．合成装置を用いて、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドに対する２．５分間のカップリング段階、及び２’−デオキシヌクレオチド又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドに対する４５秒間のカップリング段階を含む、０．２μｍｏｌ規模のプロトコルによって、小規模合成を実施する。表Ｖは、合成サイクルに使用する試薬の量及び接触時間の概略である。或いは、０．２μｍｏｌ規模の合成を、Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）製装置などの９６ウェルプレート合成装置を用いて、サイクルを最小限度に変更して、実施することができる。ポリマーに結合した５’ヒドロキシルを基準として、３３倍過剰（０．１１Ｍ ６０μＬ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイト及び１０５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍ ６０μＬ＝１５μｍｏｌ）を、２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルに使用することができる。ポリマーに結合した５’ヒドロキシルを基準として、２２倍過剰（０．１１Ｍ ４０μＬ＝４．４μｍｏｌ）のデオキシホスホルアミダイト及び７０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍ ４０μＬ＝１０μｍｏｌ）を、デオキシ残基の各カップリングサイクルに使用することができる。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．合成装置による平均カップリング収率は、トリチル画分の比色定量によって測定して、典型的には９７．５−９９％である。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．合成装置用の他のオリゴヌクレオチド合成試薬としては、以下のものが挙げられる。脱トリチル化溶液は、３％ＴＣＡの塩化メチレン溶液（ＡＢＩ）である。キャッピングは、１６％Ｎ−メチルイミダゾールのＴＨＦ溶液（ＡＢＩ）及び１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジンのＴＨＦ溶液（ＡＢＩ）を用いて行われる。酸化溶液は、１６．９ｍＭ Ｉ_２、４９ｍＭピリジン、９％水のＴＨＦ溶液（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）である。Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｇｒａｄｅアセトニトリルを試薬瓶から直接使用する。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（０．２５Ｍアセトニトリル溶液）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｉｎｃ．から入手した固体から調製する。或いは、ホスホロチオアート結合を導入するために、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド、０．０５Ｍアセトニトリル溶液）を使用する。

ＤＮＡを主体にしたオリゴヌクレオチドの脱保護を以下のように実施する。ポリマーに結合したトリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬガラスねじぶた付きバイアルに移し、４０％メチルアミン水溶液（１ｍＬ）の溶液に６５℃で１０分間懸濁させる。−２０℃に冷却後、上清をポリマー支持体から除去する。支持体をＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ／３：１：１ １．０ｍＬで３回洗浄し、ボルテックス撹拌し、次いで上清を第１の上清に添加する。オリゴリボヌクレオチドを含む混合上清を乾燥させて白色粉末にする。一実施形態においては、参照によりその全体を本明細書に組込む、米国特許第６，９９５，２５９号、同６，６８６，４６３号、同６，６７３，９１８号、同６，６４９，７５１号、同６，９８９，４４２号及び米国特許出願第１０／１９０，３５９号に記載の方法によって、本発明の核酸分子を合成し、脱保護し、分析する。

本発明のある種のｓｉＮＡ分子を含めたＲＮＡに対して用いられる合成方法は、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １０９， ７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８， ５４３３及びＷｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３， ２６７７−２６８４ Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ．， ７４， ５９に記載の手順に従い、５’末端におけるジメトキシトリチル、３’末端におけるホスホルアミダイトなどの一般的な核酸保護基及びカップリング基を利用する。非限定的例においては、３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．合成装置を用いて、アルキルシリルで保護されたヌクレオチドに対する７．５分間のカップリング段階、及び２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドに対する２．５分間のカップリング段階を含む、０．２μｍｏｌ規模のプロトコルによって、小規模合成を実施する。表Ｖは、合成サイクルに使用する試薬の量及び接触時間の概略である。或いは、０．２μｍｏｌ規模の合成を、Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）製装置などの９６ウェルプレート合成装置を用いて、サイクルを最小限度に変更して、実施することができる。ポリマーに結合した５’ヒドロキシルを基準として、３３倍過剰（０．１１Ｍ ６０μＬ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイト及び７５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍ ６０μＬ＝１５μｍｏｌ）を、２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルに使用することができる。ポリマーに結合した５’ヒドロキシルを基準として、６６倍過剰（０．１１Ｍ １２０μＬ＝１３．２μｍｏｌ）の、アルキルシリル（リボ）で保護されたホスホルアミダイト、及び１５０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍ １２０μＬ＝３０μｍｏｌ）を、リボ残基の各カップリングサイクルに使用することができる。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．合成装置による平均カップリング収率は、トリチル画分の比色定量によって測定して、典型的には９７．５−９９％である。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．合成装置用の他のオリゴヌクレオチド合成試薬としては、以下のものが挙げられる。脱トリチル化溶液は、３％ＴＣＡの塩化メチレン溶液（ＡＢＩ）である。キャッピングは、１６％Ｎ−メチルイミダゾールのＴＨＦ溶液（ＡＢＩ）及び１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジンのＴＨＦ溶液（ＡＢＩ）を用いて行われる。酸化溶液は、１６．９ｍＭ Ｉ_２、４９ｍＭピリジン、９％水のＴＨＦ溶液（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）である。Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｇｒａｄｅアセトニトリルを試薬瓶から直接使用する。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（０．２５Ｍアセトニトリル溶液）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｉｎｃ．から入手した固体から調製する。或いは、ホスホロチオアート結合を導入するために、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド、０．０５Ｍアセトニトリル溶液）を使用する。

ＲＮＡの脱保護は、２ポット（ｔｗｏ−ｐｏｔ）又は１ポット（ｏｎｅ−ｐｏｔ）プロトコルによって実施される。２ポットプロトコルの場合、ポリマーに結合したトリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬガラスねじぶた付きバイアルに移し、４０％メチルアミン水溶液（１ｍＬ）の溶液に６５℃で１０分間懸濁させる。−２０℃に冷却後、上清をポリマー支持体から除去する。支持体をＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ／３：１：１ １．０ｍＬで３回洗浄し、ボルテックス撹拌し、次いで上清を第１の上清に添加する。オリゴリボヌクレオチドを含む混合上清を乾燥させて白色粉末にする。塩基で脱保護されたオリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ／ＨＦ／ＮＭＰ溶液（Ｎ−メチルピロリジノン１．５ｍＬ、ＴＥＡ ７５０μＬ及びＴＥＡ・３ＨＦ １ｍＬの溶液３００μＬで１．４Ｍ ＨＦ濃度にする。）に再懸濁させ、６５℃に加熱する。１．５時間後、オリゴマーを１．５Ｍ ＮＨ_４ＨＣＯ_３でクエンチする。一実施形態においては、参照によりその全体を本明細書に組込む、米国特許第６，９９５，２５９号、同６，６８６，４６３号、同６，６７３，９１８号、同６，６４９，７５１号、同６，９８９，４４２号及び米国特許出願第１０／１９０，３５９号に記載の方法によって、本発明の核酸分子を合成し、脱保護し、分析する。

或いは、１ポットプロトコルの場合、ポリマーに結合したトリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬガラスねじぶた付きバイアルに移し、３３％エタノール性メチルアミン／ＤＭＳＯ：１／１（０．８ｍＬ）の溶液に６５℃で１５分間懸濁させる。バイアルを室温にし、ＴＥＡ・３ＨＦ（０．１ｍＬ）を添加し、バイアルを６５℃で１５分間加熱する。試料を−２０℃に冷却し、次いで１．５Ｍ ＮＨ_４ＨＣＯ_３でクエンチする。

トリチルオンオリゴマーを精製する場合、クエンチしたＮＨ_４ＨＣＯ_３溶液を、アセトニトリル、続いて５０ｍＭ ＴＥＡＡで予洗したＣ−１８含有カートリッジに充填する。充填されたカートリッジを水洗後、ＲＮＡを０．５％ＴＦＡで１３分間脱トリチル化する。次いで、カートリッジを水で再洗浄し、１Ｍ ＮａＣｌで塩交換し、水で再洗浄する。次いで、オリゴヌクレオチドを３０％アセトニトリルで溶出させる。

平均段階的カップリング収率は、典型的には＞９８％である（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３， ２６７７−２６８４）。当業者は、９６ウェル形式を含めて、ただしこれだけに限定されない、上記例よりも大きい、又は小さい合成規模を適合させることができる。

或いは、本発明の核酸分子は、別々に合成し、合成後に、例えばライゲーション（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６， ９９２３；Ｄｒａｐｅｒ他、国際公開第９３／２３５６９号；Ｓｈａｂａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９， ４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １６， ９５１；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ８， ２０４）によって、又は合成及び／又は脱保護後のハイブリダイゼーションによって、連結することができる。

本発明のｓｉＮＡ分子は、本明細書の実施例１に記載のタンデム合成法によって合成することもできる。その場合、両方のｓｉＮＡ鎖は、切断可能なリンカーによって分離された単一の隣接オリゴヌクレオチド断片又は鎖として合成される。続いて、切断可能なリンカーを切断して、別々のｓｉＮＡ断片又は鎖を生成する。このｓｉＮＡ断片又は鎖をハイブリッド形成し、ｓｉＮＡ二本鎖の精製が可能になる。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーでも、非ヌクレオチドリンカーでもよい。本明細書に記載するｓｉＮＡのタンデム合成は、９６ウェルなどのマルチウェル／マルチプレート合成プラットフォーム、又は同様により大きいマルチウェルプラットフォームに容易に適合させることができる。本明細書に記載するｓｉＮＡのタンデム合成は、回分式反応装置、合成カラムなどを使用した大規模合成プラットフォームに容易に適合させることもできる。

ｓｉＮＡ分子は、一方の断片がＲＮＡ分子のセンス領域を含み、他方の断片がアンチセンス領域を含む、２個の異なる核酸鎖又は断片から組み立てることもできる。

本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼに耐性のある基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈで修飾することによって、徹底して修飾して、安定性を高めることができる（総説については、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ， １９９２， ＴＩＢＳ １７， ３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ３１， １６３を参照されたい。）。ｓｉＮＡ構築体は、一般的な方法を用いたゲル電気泳動によって精製することができ、又は高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；その全体を参照により本明細書に組込むＷｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（前掲）参照）によって精製することができ、水に再懸濁させることができる。

本発明の別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡベクター中に挿入された転写単位から発現される。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターであり得る。ｓｉＮＡを発現するウイルスベクターは、これらだけに限定されないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス又はアルファウイルスに基づいて構築することができる。ｓｉＮＡ分子を発現可能である組換えベクターを、本明細書に記載のとおりに送達し、標的細胞中に存続させることができる。或いは、ｓｉＮＡ分子の一過性発現を与えるウイルスベクターを使用することができる。

本発明の核酸分子の活性の最適化
修飾（塩基、糖及び／又はリン酸）を有する化学合成された核酸分子は、血清リボヌクレアーゼによる分解を防止することができ、それによってその抗力を高めることができる（例えば、その全部を参照により本明細書に組込む、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ他、国際公開第９２／０７０６５号；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．， １９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４４， ５６５；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３， ３１４；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ， １９９２， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １７， ３３４；Ｕｓｍａｎ他、国際公開第９３／１５１８７号；Ｒｏｓｓｉ他、国際公開第９１／０３１６２号；Ｓｐｒｏａｔ、米国特許第５，３３４，７１１号；Ｇｏｌｄ他、米国特許第６，３００，０７４号及びＢｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．（前掲）参照）。上記参考文献はすべて、本明細書に記載する核酸分子の塩基、リン酸及び／又は糖部分に対してなし得る種々の化学修飾を記載している。細胞におけるその抗力を増強するように修飾し、核酸分子から塩基を除去して、オリゴヌクレオチド合成時間を短縮し、化学物質の必要性を低下させることが望ましい。

核酸分子に導入して、ヌクレアーゼ安定性及び効力をかなり増強させることができる、糖、塩基及びリン酸の修飾を記述した例が当分野では幾つかある。例えば、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈ、ヌクレオチド塩基修飾でオリゴヌクレオチドを修飾することによって、安定性及び／又は生物活性を増強する（総説については、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ， １９９２， ＴＩＢＳ． １７， ３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ３１， １６３；Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３５， １４０９０を参照されたい。）。核酸分子の糖修飾は、当分野では広範に記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ他、国際公開第９２／０７０６５号；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， １９９０， ３４４， ５６５−５６８；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１， ２５３， ３１４−３１７；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．， １９９２， １７， ３３４−３３９；Ｕｓｍａｎ他、国際公開第９３／１５１８７号；Ｓｐｒｏａｔ、米国特許第５，３３４，７１１号及びＢｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ２５７０２；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ他、国際公開第９７／２６２７０号；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ他、米国特許第５，７１６，８２４号；Ｕｓｍａｎ他、米国特許第５，６２７，０５３号；Ｗｏｏｌｆ他、国際公開第９８／１３５２６号；１９９８年４月２０日に出願されたＴｈｏｍｐｓｏｎ他、米国特許出願第６０／０８２，４０４号；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ３９， １１３１；Ｅａｒｎｓｈａｗ ａｎｄ Ｇａｉｔ， １９９８， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）， ４８， ３９−５５；Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， １９９８， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６７， ９９−１３４並びにＢｕｒｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．， ５， １９９９−２０１０参照。これらの参考文献のすべてを参照によりその全体を本明細書に組込む。）。かかる刊行物は、触媒作用を調節せずに、糖、塩基及び／又はリン酸修飾などを核酸分子に組み入れる場所を決定する一般的方法及び戦略を記載しており、参照により本明細書に組込む。かかる教示を考慮して、細胞においてＲＮＡｉを促進するｓｉＮＡの能力がさほど阻害されない限り、類似の修飾を本明細書に記載のとおりに用いて、本発明のｓｉＮＡ核酸分子を修飾することができる。

一実施形態においては、本発明の核酸分子は、参照によりその全体を本明細書に組込む、米国特許出願公開第２００５００２０５２１号に記載したとおりに化学修飾される。

ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート及び／又は５’−メチルホスホナート結合によるオリゴヌクレオチドヌクレオチド間結合の化学修飾は安定性を改善するが、過剰な修飾は幾らかの毒性を生じ、又は活性を低下させ得る。したがって、核酸分子を設計するときには、これらのヌクレオチド間結合の量を最小限に抑えるべきである。これらの結合の濃度を減少させると、毒性が低下し、これらの分子の効力が増加し、特異性が高くなるはずである。

活性を維持又は増強する化学修飾を有する低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。また、かかる核酸は、ヌクレアーゼに対する耐性が無修飾核酸よりも一般に高い。したがって、インビトロ及び／又はインビボでの活性は、さほど低下しないはずである。調節を目的とする場合には、外来的に送達される治療用核酸分子は、最適には、標的ＲＮＡの翻訳が調節されて、望ましくないタンパク質のレベルが低下するまで、細胞内で安定であるべきである。この時間は、病態に応じて数時間から数日まで変動する。ＲＮＡ及びＤＮＡの化学合成が改善されたことによって（（参照により本明細書に組込む）Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３， ２６７７；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１， ３−１９）、上述したように、ヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を高めることによって核酸分子を修飾する能力が拡大した。

一実施形態においては、本発明の核酸分子は、１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）Ｇクランプヌクレオチドを含む。Ｇクランプヌクレオチドは、修飾シトシン類似体であり、この修飾は、二本鎖内の相補グアニンのワトソン クリック面とフーグスティーン面の両方の水素結合能力を与える。例えば、Ｌｉｎ ａｎｄ Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ， １９９８， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２０， ８５３１−８５３２を参照されたい。オリゴヌクレオチド内の単一のＧクランプ類似体を置換することによって、相補オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するときのらせんの熱安定性及びミスマッチ識別性を実質的に増強することができる。かかるヌクレオチドを本発明の核酸分子に含めることによって、核酸標的、相補配列又は鋳型鎖に対する親和性と特異性の両方が増強される。別の実施形態においては、本発明の核酸分子は、１個以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える）２’，４’−ＣメチレンビシクロヌクレオチドなどのＬＮＡ「ロックされた核酸」ヌクレオチドを含む（例えば、Ｗｅｎｇｅｌ他、国際公開第００／６６６０４号及び同９９／１４２２６号参照）。

別の実施形態においては、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子の抱合体及び／又は複合体を特徴とする。かかる抱合体及び／又は複合体を用いて、細胞などの生物系へのｓｉＮＡ分子の送達を容易にすることができる。本発明によって提供される抱合体及び複合体は、治療化合物を細胞膜を越えて輸送し、薬物動態学を変更し、及び／又は本発明の核酸分子の局在化を調節することによって、治療活性を与えることができる。本発明は、小分子、脂質、コレステロール、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、毒素、負に帯電したポリマー及び他のポリマー、例えば、タンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコール又はポリアミンを含めて、ただしこれらだけに限定されない分子を、細胞膜を越えて送達するための新規抱合体及び複合体の設計及び合成を包含する。一般に、記載するトランスポーターは、個々に、又は多成分系の一部として、分解性リンカーと一緒に、又は分解性リンカーなしで、使用するように設計される。これらの化合物は、血清の存在下又は非存在下で、異なる組織に由来する幾つかの細胞タイプへの本発明の核酸分子の送達及び／又は局在化を改善すると予測される（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ及びＣｅｃｈ、米国特許第５，８５４，０３８号参照）。本明細書に記載する分子の抱合体は、生分解性核酸リンカー分子などの生分解性リンカーを介して、生物活性分子に結合し得る。

本明細書では「生分解性リンカー」という用語は、１個の分子を別の分子に、例えば、生物活性分子を本発明のｓｉＮＡ分子に接続する、又は本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖を接続する、生分解性リンカーとして設計される核酸又は非核酸リンカー分子を指す。生分解性リンカーは、特定の組織又は細胞タイプへの送達などの特定の目的のためにその安定性を調節することができるように設計される。核酸を主体とした生分解性リンカー分子の安定性は、種々のケミストリー、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド及び（２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル、他の２’修飾又は塩基修飾ヌクレオチドなどの）化学修飾ヌクレオチドの組合せを用いることによって調節することができる。生分解性核酸リンカー分子は、２量体、３量体、４量体又はより長鎖の核酸分子、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり得、又はリン系結合、例えば、ホスホルアミダート若しくはリン酸ジエステル結合を有する単一のヌクレオチドを含み得る。生分解性核酸リンカー分子は、核酸骨格、核酸糖又は核酸塩基修飾も含み得る。

本明細書では「生分解性」という用語は、生物系における分解、例えば、酵素による分解、又は化学分解を指す。

本明細書では「生物活性分子」という用語は、系において生物学的反応を誘発又は改変し得る化合物又は分子を指す。生物活性ｓｉＮＡ分子単独の、又は本発明によって企図される他の分子と組み合わせた生物活性ｓｉＮＡ分子の、非限定的例としては、治療上活性な分子、例えば、抗体、コレステロール、ホルモン、抗ウイルス剤、ペプチド、タンパク質、化学療法剤、小分子、ビタミン、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素的核酸（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、２，５−Ａキメラ、ｓｉＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アロザイム、アプタマー、デコイ、その類似体など、治療に有効な分子が挙げられる。本発明の生物活性分子としては、他の生物活性分子の薬物動態学及び／又は薬力学を調節することができる分子、例えば、脂質、及びポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、他のポリエーテルなどのポリマーも含まれる。

本明細書では「リン脂質」という用語は、少なくとも１個のリン基（ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｇｒｏｕｐ）を含む疎水性分子を指す。例えば、リン脂質は、リン含有基と、ＯＨ、ＣＯＯＨ、オキソ、アミン又は置換若しくは非置換アリール基で置換されていてもよい飽和又は不飽和アルキル基とを含み得る。

外来的に送達される治療用核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）は、最適には、ＲＮＡの逆転写が調節されて、ＲＮＡ転写物レベルが低下するまで、細胞内で安定であるべきである。核酸分子は、有効な細胞内治療薬として機能するために、ヌクレアーゼに耐性がある。上述したように、本明細書及び当分野で記述される核酸分子の化学合成が改善されたことによって、ヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を高めることによって核酸分子を修飾する能力が拡大した。

更に別の実施形態においては、ＲＮＡｉに関与するタンパク質の酵素活性を維持又は増強する化学修飾を有するｓｉＮＡ分子を提供する。また、かかる核酸は、ヌクレアーゼに対する耐性が無修飾核酸よりも一般に高い。したがって、インビトロ及び／又はインビボでの活性は、さほど低下しないはずである。

本発明の核酸系分子を使用すると、併用療法（例えば、異なる遺伝子を標的とする複数のｓｉＮＡ分子；公知の小分子調節物質とカップリングされた核酸分子；又は異なるモチーフ及び／又は他の化学若しくは生体分子を含めた分子の組合せを用いた間欠的治療）が可能になることによって、治療がより良好なものになる。ｓｉＮＡ分子を用いた対象の治療は、酵素的核酸分子（リボザイム）、アロザイム、アンチセンス、２，５−Ａオリゴアデニラート、デコイ、アプタマーなどの異なるタイプの核酸分子の組合せも含み得る。

別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１個以上の５’及び／又は３’キャップ構造を、例えば、センスｓｉＮＡ鎖のみに、アンチセンスｓｉＮＡ鎖のみに、又は両方のｓｉＮＡ鎖に含む。

「キャップ構造」とは、オリゴヌクレオチドのどちらかの末端に組み入れられた化学修飾を意味する（例えば、参照により本明細書に組込む、Ａｄａｍｉｃ他、米国特許第５，９９８，２０３号を参照されたい。）。これらの末端修飾は、核酸分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、送達及び／又は細胞内の局在化を助け得る。キャップは５’末端（５’キャップ）若しくは３’末端（３’キャップ）に存在し得、又は両方の末端に存在し得る。非限定的例においては、５’キャップとしては、グリセリル、反転デオキシ脱塩基残基（部分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオアート結合；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−反転ヌクレオチド部分；３’−３’−反転脱塩基部分；３’−２’−反転ヌクレオチド部分；３’−２’−反転脱塩基部分；１，４−ブタンジオールリン酸；３’−ホスホルアミダート；ヘキシルリン酸；アミノヘキシルリン酸；３’−ホスファート；３’−ホスホロチオアート；ホスホロジチオアート；又は架橋若しくは非架橋メチルホスホナート部分が挙げられるが、これらだけに限定されない。キャップ部分の非限定的例を図１０に示す。

３’キャップの非限定的例としては、グリセリル、反転デオキシ脱塩基残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸；３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１，２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオアート；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−反転ヌクレオチド部分；５’−５’−反転脱塩基部分；５’−ホスホルアミダート；５’−ホスホロチオアート；１，４−ブタンジオールリン酸；５’−アミノ；架橋及び／又は非架橋５’−ホスホルアミダート、ホスホロチオアート及び／又はホスホロジチオアート、架橋又は非架橋メチルホスホナート及び５’−メルカプト部分が挙げられるが、これらだけに限定されない（より詳細には、参照により本明細書に組込む、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ， １９９３， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９， １９２５を参照されたい。）。

「非ヌクレオチド」という用語は、糖置換及び／又はリン酸置換を含めて、１個以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖に組み入れることができ、残りの塩基がその酵素活性を示すのを可能にする、任意の基又は化合物を意味する。この基又は化合物は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミンなどの一般に認識されているヌクレオチド塩基を含まず、したがって１’位の塩基を欠く点で、脱塩基である。

「アルキル」基とは、直鎖、分枝鎖及び環式アルキル基を含めて、飽和脂肪族炭化水素を指す。アルキル基は、１から１２個の炭素を有することが好ましい。より好ましくは、アルキル基は、１から７個の炭素、より好ましくは１から４個の炭素の低級アルキルである。アルキル基は、置換されていても、いなくてもよい。置換されているときには、置換基は、好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ_２若しくはＮ（ＣＨ_３）_２、アミノ又はＳＨである。この用語は、直鎖、分枝鎖及び環式基を含めて、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む不飽和炭化水素基であるアルケニル基も含む。アルケニル基は、１から１２個の炭素を有することが好ましい。より好ましくは、アルケニル基は、１から７個の炭素、より好ましくは１から４個の炭素の低級アルケニルである。アルケニル基は、置換されていても、いなくてもよい。置換されているときには、置換基は、好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ_２、ハロゲン、Ｎ（ＣＨ_３）_２、アミノ又はＳＨである。「アルキル」という用語は、直鎖、分枝鎖及び環式基を含めて、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含む不飽和炭化水素基を有するアルキニル基も含む。アルキニル基は、１から１２個の炭素を有することが好ましい。より好ましくは、アルキニル基は、１から７個の炭素、より好ましくは１から４個の炭素の低級アルキニルである。アルキニル基は、置換されていても、いなくてもよい。置換されているときには、置換基は、好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ_２若しくはＮ（ＣＨ_３）_２、アミノ又はＳＨである。

かかるアルキル基は、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環式アリール、アミド及びエステル基も含み得る。「アリール」基とは、共役したパイ電子系を有する少なくとも１個の環を有する芳香族基を指し、炭素環式アリール、複素環アリール及びビアリール基が含まれる。これらの基はすべて置換されていてもよい。アリール基の好ましい置換基は、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシル、ＳＨ、ＯＨ、シアノ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル及びアミノ基である。「アルキルアリール」基は、（上記）アリール基と共有結合した（上記）アルキル基を指す。炭素環式アリール基は、芳香環の環原子がすべて炭素原子である基である。炭素原子は、置換されていてもよい。複素環式アリール基は、芳香環の環原子として１から３個のヘテロ原子を有する基であり、環原子の残りは炭素原子である。適切なヘテロ原子としては、酸素、硫黄及び窒素が挙げられ、いずれも置換されていてもよい、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−低級アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリルなどが挙げられる。「アミド」とは−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒを指す。式中、Ｒは、アルキル、アリール、アルキルアリール又は水素である。「エステル」とは−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ’を指す。式中、Ｒはアルキル、アリール、アルキルアリール又は水素である。

本明細書では「ヌクレオチド」とは、（標準の）天然塩基、及び当分野で周知の修飾塩基を含むと当分野で認識されているとおりである。かかる塩基は、ヌクレオチド糖部分の１’位に一般に位置する。ヌクレオチドは、塩基、糖及びリン酸基を一般に含む。ヌクレオチドは、糖、リン酸及び／又は塩基成分において無修飾でも、修飾されていてもよい（ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドなどとも区別なく称される。例えば、参照により本明細書に組込む、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ（前掲）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ他、国際公開第９２／０７０６５号；Ｕｓｍａｎ他、国際公開第９３／１５１８７号；Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ（前掲）を参照されたい。）。Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２， ２１８３によって要約された、当分野で公知である修飾核酸塩基の幾つかの例がある。核酸分子中に導入することができる塩基修飾の非限定的例の一部としては、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）、６−アザピリミジン、６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン及び他の塩基修飾（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３５， １４０９０；Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ（前掲））が挙げられる。この態様において「修飾塩基」とは、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシン及びウラシル以外のヌクレオチド塩基又はその等価物を意味する。

一実施形態においては、本発明は、１個以上のホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、メチルホスホナート、リン酸トリエステル、モルホリノ、アミダート カルバマート、カルボキシメチル、アセトアミダート、ポリアミド、スルホナート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール及び／又はアルキルシリル置換を含むリン酸骨格修飾を有する修飾ｓｉＮＡ分子を特徴とする。オリゴヌクレオチド骨格修飾の総説については、Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ａｎｄ Ｌｅｕｍａｎｎ， １９９５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ＶＣＨ， ３３１−４１７及びＭｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ＡＣＳ， ２４−３９を参照されたい。

「脱塩基」とは、糖部分の１’位において、核酸塩基を欠く糖部分、又は核酸塩基の代わりに水素原子（Ｈ）若しくは他の非核酸塩基化学基を有する糖部分を意味する。例えば、Ａｄａｍｉｃ他、米国特許第５，９９８，２０３号を参照されたい。一実施形態においては、本発明の脱塩基部分は、リボース、デオキシリボース又はジデオキシリボース糖である。

「無修飾ヌクレオシド」とは、β−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素と結合したアデニン、シトシン、グアニン、チミン又はウラシル塩基の１つを意味する。

「修飾ヌクレオシド」とは、無修飾ヌクレオチドの塩基、糖及び／又はリン酸の化学構造中に修飾を含む任意のヌクレオチド塩基を意味する。修飾ヌクレオチドの非限定的例を、式Ｉ−ＶＩＩ及び／又は他の本明細書に記載の修飾によって示す。

本発明の２’修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」とは、修飾されていても、いなくてもよい、２’−ＮＨ_２又は２’−Ｏ−ＮＨ_２を意味する。かかる修飾基は、例えば、参照によりその全体を本明細書に組込む、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ他、米国特許第５，６７２，６９５号及びＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ他、米国特許第６，２４８，８７８号に記載されている。

核酸ｓｉＮＡ構造を種々修飾して、これらの分子の有用性を高めることができる。かかる修飾によって、有効期間、インビトロでの半減期、安定性が増大し、かかるオリゴヌクレオチドを標的部位に導入する容易さ、例えば、細胞膜の透過性が増大し、標的細胞を認識して、それに結合する能力が付与される。

核酸分子の投与
本発明のｓｉＮＡ分子は、単独で、又は他の療法と組み合わせて、ＨＣＶ感染、肝不全、肝細胞癌、肝硬変及び／又は細胞若しくは組織中のＨＣＶレベルに関係若しくは応答する任意の他の形質、疾患若しくは症状の治療、防止、阻害又は抑制に使用できるように適合させることができる。一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子及びその調合物又は組成物を、当分野で一般に公知であるとおりに、肝臓に投与する（例えば、Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．， １０， ２４４−９；Ｍｕｒａｏ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．， １９， １８０８−１４；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， ２００３， ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １０， １８０−７；Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ５４， ５１−８；Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．， １４９， １６１１−７及びＭａｔｓｕｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２００３， ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １０， １５５９−６６参照）。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ組成物は、対象に投与するためのリポソームを含めた送達ビヒクル、担体及び希釈剤並びにその塩を含むことができ、及び／又は薬剤として許容される剤形で存在し得る。核酸分子の送達方法は、その全部を参照により本明細書に組込む、Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．， ２， １３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ｅｄ． Ａｋｈｔａｒ， １９９５， Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｍｏｌ． Ｍｅｍｂｒ． Ｂｉｏｌ．， １６， １２９−１４０；Ｈｏｆｌａｎｄ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ， １９９９， Ｈａｎｄｂ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １３７， １６５−１９２及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， ＡＣＳ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．， ７５２， １８４−１９２に記載されている。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ他、米国特許第６，３９５，７１３号及びＳｕｌｌｉｖａｎ他、国際公開第９４／０２５９５号は、核酸分子の一般的送達方法を更に記載している。これらのプロトコルを実質的にあらゆる核酸分子の送達に利用することができる。核酸分子は、リポソーム封入、イオン泳動、又は生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， １０， １０６８−１０７４；Ｗａｎｇ他、国際公開第０３／４７５１８号及び同０３／４６１８５号参照）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）及びＰＬＣＡミクロスフェア（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号及び米国特許出願公開第２００２１３０４３０号参照）、生分解性ナノカプセル剤、生体接着性（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）ミクロスフェアなどの他のビヒクルへの組み入れ、又はタンパク質ベクター（Ｏ’Ｈａｒｅ及びＮｏｒｍａｎｄ、国際公開第００／５３７２２号）を含めて、ただしこれらだけに限定されない、当業者に公知である種々の方法によって細胞に投与することができる。別の実施形態においては、本発明の核酸分子は、ポリエチレンイミン、及びポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）、ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体などのその誘導体と一緒に処方又は複合化することもできる。一実施形態においては、本発明の核酸分子は、参照によりその全体を本明細書に組込む米国特許出願公開第２００３００７７８２９号に記載したとおりに処方される。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、参照によりその全体を本明細書に組込む、米国仮出願第６０／６７８，５３１号、並びに関係する２００５年７月２９日に出願された米国仮出願第６０／７０３，９４６号、２００５年１１月１５日に出願された米国仮出願第６０／７３７，０２４号、及び２００６年２月１４日に出願された米国特許出願第１１／３５３，６３０号（Ｖａｒｇｅｅｓｅ他）に記載された組成物として処方される。かかるｓｉＮＡ調合物を一般に「脂質核酸粒子」（ＬＮＰ）と称する。一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、本明細書の表ＶＩに記載の１種類以上のＬＮＰ組成物と一緒に調合される（参照により本明細書に組込む米国特許出願第１１／３５３，６３０号及び同１１／５８６，１０２号も参照されたい。）。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子及びその調合物又は組成物を、米国特許出願公開第２００６／００６２７５８号、同２００６／００１４２８９号及び同２００４／００７７５４０号に記載のとおりに、組織及び細胞に投与する。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子を、図面を含めて、参照によりその全体を本明細書に組込む米国特許出願公開第２００１０００７６６６号に記載のものなどの膜破壊剤（ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）と複合化する。別の実施形態においては、膜破壊剤とｓｉＮＡ分子も、図面を含めて、参照によりその全体を本明細書に組込む米国特許第６，２３５，３１０号に記載の脂質などの陽イオン性脂質又は補助（ｈｅｌｐｅｒ）脂質分子と複合化する。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子を、図面を含めて、参照によりその全体を本明細書に組込む、米国特許出願公開第２００３０７７８２９号、国際公開第００／０３６８３号及び同０２／０８７５４１号に記載の送達系と複合化する。

一実施形態においては、本発明の核酸分子を、アテロコラーゲン複合化又は抱合によって、骨格組織（例えば、骨、軟骨、腱、靭帯）又は骨転移性腫ように投与する（例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， ２００５， ＰＮＡＳ， １０２， １２１７７−１２１８２参照）。したがって、一実施形態においては、本発明は、アテロコラーゲンと複合化された組成物としての１個以上のｄｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の実施形態においては、本発明は、本明細書に記載する、又は当分野で公知である、リンカーによって、アテロコラーゲンと抱合された１個以上のｓｉＮＡ分子を特徴とする。

一実施形態においては、本発明の核酸分子及びその調合物（例えば、本発明の二本鎖核酸分子のＬＮＰ調合物）を、吸入装置又はネブライザーによって投与されるエアゾール剤又は噴霧乾燥製剤の吸入などによる肺送達によって投与して、関連する肺組織に核酸分子を迅速に局所的に取り込ませる。微粉化核酸組成物の呼吸用乾燥粒子を含む固体粒子組成物は、乾燥又は凍結乾燥させた核酸組成物を粉砕し、次いで微粉化組成物を、例えば、４００メッシュスクリーンに通して、大きい凝集物を分解又は分離することによって調製することができる。本発明の核酸組成物を含む固体粒子組成物は、エアゾール剤及び他の治療化合物の形成を容易にするのに役立つ分散剤を含んでいてもよい。適切な分散剤は、ラクトースであり、核酸化合物と１対１重量比などの任意の適切な比で混合することができる。

本発明の核酸組成物を含む液体粒子のエアゾール剤は、ネブライザーなどの任意の適切な手段によって生成され得る（例えば、米国特許第４，５０１，７２９号参照）。ネブライザーは、圧縮ガス、典型的には空気若しくは酸素を細いベンチュリーオリフィスに通して加速することによって、又は超音波振動によって、活性成分の溶液又は懸濁液を治療用エアゾールミストに転換する市販装置である。ネブライザー用に適切な製剤は、製剤の最高４０％ｗ／ｗ、好ましくは２０％ｗ／ｗ未満の活性成分を液体担体中に含む。担体は、典型的には水又は希薄アルコール水溶液であり、好ましくは、例えば塩化ナトリウム又は他の適切な塩を添加することによって、体液と等張にされる。必須でない添加剤としては、製剤が無菌調製されていない場合には防腐剤、例えば、ヒドロキシ安息香酸メチル、抗酸化剤、香味剤、揮発油、緩衝剤、乳化剤、他の処方界面活性剤などが挙げられる。活性組成物と界面活性剤を含む固体粒子のエアゾール剤は、任意の固体粒子エアゾール発生器を用いて同様に生成させることができる。固体粒子治療剤を対象に投与するエアゾール発生器は、上で説明したように、呼吸用粒子を生成し、所定用量の治療用組成物を含有する一定体積のエアゾール剤をヒト投与に適切な速度で生成する。

一実施形態においては、本発明の固体粒子エアゾール発生器は吸入器である。吸入器による投与に適切な製剤としては、吸入器によって送達することができる微粉砕散剤が挙げられる。吸入器では、散剤、例えば、本明細書に記載する治療の実施に有効なその一定用量を、典型的にはゼラチン又はプラスチック製のカプセル又はカートリッジに入れる。カプセル又はカートリッジは吸入器内で穿孔又は開封され、吸息又は手動ポンプによって装置を通して吸い込まれる空気によって散剤が送達される。吸入器に用いられる散剤は、活性成分のみからなり、又は活性成分と、ラクトースなどの適切な粉末希釈剤と、必要に応じて界面活性剤とを含む粉末混合物からなる。活性成分は、典型的には、製剤の０．１から１００ｗ／ｗである。説明のためのエアゾール発生器の第２のタイプは、定量吸入器を含む。定量吸入器は、液化噴霧剤中の活性成分の懸濁液剤又は溶液剤を典型的には含む加圧エアゾール分注器である。この装置は、使用中に、一定体積を送達するようになされた弁を通して製剤を吐出して、活性成分を含む微粒子噴霧を生成する。適切な噴霧剤としては、ある種のクロロフルオロ炭素化合物、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、これらの混合物などが挙げられる。製剤は、１種類以上の共溶媒、例えばエタノール、乳化剤、及びオレイン酸、トリオレイン酸ソルビタンなどの他の処方界面活性剤、抗酸化剤、並びに適切な香味剤を更に含むことができる。他の肺送達方法は、例えば、参照により本明細書に組込む、米国特許出願公開第２００４００３７７８０号及び米国特許第６，５９２，９０４号、同６，５８２，７２８号、同６，５６５，８８５号に記載されている。

一実施形態においては、肺送達に用いられる本明細書のｓｉＮＡ並びにＬＮＰ組成物及び調合物は、１種類以上の界面活性剤を更に含む。本発明の組成物の取り込みを増大させる適切な界面活性剤又は界面活性剤成分としては、合成及び天然並びに完全型及び切断型の界面活性剤タンパク質Ａ、界面活性剤タンパク質Ｂ、界面活性剤タンパク質Ｃ、界面活性剤タンパク質Ｄ及び界面活性剤タンパク質Ｅ、（ジパルミトイル以外の）二飽和（ｄｉ−ｓａｔｕｒａｔｅｄ）ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン；ホスファチジン酸、ユビキノン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、パルミトイル−リゾホスファチジルコリン、デヒドロエピアンドロステロン、ドリコール、スルファチド（ｓｕｌｆａｔｉｄｉｃ）酸、グリセリン−３−ホスファート、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセリン、グリセロ−３−ホスホコリン、ジヒドロキシアセトン、パルミタート、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）ジアシルグリセロール、ＣＤＰコリン、コリン、コリンリン酸、並びに界面活性剤成分の天然担体ビヒクルである天然及び人工の層状体、オメガ３脂肪酸、ポリエン（ｐｏｌｙｅｎｉｃ）酸、ポリエン（ｐｏｌｙｅｎｏｉｃ）酸、レシチン、パルミチン（ｐａｌｍｉｔｉｎｉｃ）酸、エチレン又はプロピレンオキシドの非イオンブロック共重合体、ポリオキシプロピレン、単量体及び重合体、ポリオキシエチレン、単量体及び重合体、デキストラン及び／又はアルカノイル側鎖を有するポリ（ビニルアミン）、Ｂｒｉｊ ３５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、並びに合成界面活性剤ＡＬＥＣ、Ｅｘｏｓｕｒｆ、Ｓｕｒｖａｎ及びＡｔｏｖａｑｕｏｎｅがとりわけ挙げられる。これらの界面活性剤は、調合物中で、単一で、若しくは複数成分の界面活性剤の一部として、又は本明細書の薬剤組成物の核酸成分の５’及び／又は３’末端に共有結合付加して、使用することができる。

本発明の組成物は、呼吸に適したサイズの粒子、例えば、吸入後、鼻、口及び喉頭を通過し、気管支及び肺胞を通過するのに十分に小さなサイズの粒子を含む製剤として、呼吸器系に投与することができる。一般に、呼吸用粒子は、約０．５から１０ミクロンのサイズである。エアゾール剤に含まれる呼吸に不適当なサイズの粒子は、咽頭に付着しやすく、えん下されやすい。したがって、エアゾール剤中の呼吸に不適当な粒子の量は、最小限に抑えられる。経鼻投与の場合、鼻腔内に確実に保持するために、１０−５００ｕｍの粒径が好ましい。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子及びその調合物又は組成物を、当分野で一般に公知であるとおりに、肝臓に投与する（例えば、Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．， １０， ２４４−９；Ｍｕｒａｏ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．， １９， １８０８−１４；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， ２００３， ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １０， １８０−７；Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ５４， ５１−８；Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．， １４９， １６１１−７及びＭａｔｓｕｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２００３， ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １０， １５５９−６６参照）。

一実施形態においては、本発明は、本発明の核酸分子を中枢神経系及び／又は末梢神経系に送達する方法の使用を特徴とする。実験によって、ニューロンによるインビボでの効率的な核酸の取り込みが実証された。神経細胞への核酸の局所投与の例として、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．， ８， ７５は、ｃ−ｆｏｓに対する１５量体ホスホロチオアートアンチセンス核酸分子を微量注入によってラットの脳に投与する研究を記載している。テトラメチルローダミン−イソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）又はフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）で標識されたアンチセンス分子は、注射後３０分で専らニューロンによって吸収された。これらの細胞では、拡散した細胞質染色及び核染色が観察された。神経細胞への核酸の全身投与の例として、Ｅｐａ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．， １０， ４６９は、ベータ−シクロデキストリン−アダマンタン−オリゴヌクレオチド抱合体を用いて、神経に分化したＰＣ１２細胞中のｐ７５ニューロトロフィン受容体を標的とした、インビボでのマウス試験を記載している。２週間のＩＰ投与後、後根神経節（ＤＲＧ）細胞において、ｐ７５ニューロトロフィン受容体アンチセンスの顕著な取り込みが認められた。また、ＤＲＧニューロンにおいて、ｐ７５の著しい一貫した下方制御が認められた。ニューロンへの核酸の別のターゲティング手法は、Ｂｒｏａｄｄｕｓ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．， ８８（４）， ７３４；Ｋａｒｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍｏｃｏｌ．， ３４０（２／３）， １５３；Ｂａｎｎａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ７８４（１，２）， ３０４；Ｒａｊａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｓｙｎａｐｓｅ， ２６（３）， １９９；Ｗｕ−ｐｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９， ＢｉｏＰｈａｒｍ， １２（１）， ３２；Ｂａｎｎａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｐｒｏｔｏｃ．， ３（１）， ８３；Ｓｉｍａｎｔｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， ７４（１）， ３９に記載されている。したがって、本発明の核酸分子は、ＲＥ遺伝子発現の調節に対して反復伸長（ｒｅｐｅａｔ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）対立遺伝子変種を発現する細胞に送達され、取り込まれやすい。ＲＥを標的にした本発明の核酸分子は、多種多様な戦略によって送達される。使用することができるＣＮＳ送達の伝統的手法としては、鞘内及び脳室内投与、カテーテル及びポンプの埋め込み、傷害若しくは病変の部位における直接注射若しくは潅流、脳動脈系への注射、又は化学的な、若しくは浸透圧による血液脳関門の開口が挙げられるが、これらだけに限定されない。他の手法としては、例えば抱合体及び生分解性ポリマーを用いた、種々の輸送及び担体系の使用も挙げられる。また、例えば、Ｋａｐｌｉｔｔ他、米国特許第６，１８０，６１３号及びＤａｖｉｄｓｏｎ、国際公開第０４／０１３２８０号に記載の遺伝子療法によって、ＣＮＳにおいて核酸分子を発現させることができる。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ化合物及び組成物を、全身的に、又は局所的に、約１−５０週ごと（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０週ごと）に、単独で、又は本明細書の他の化合物及び／又は療法と組み合わせて、投与する。一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ化合物及び組成物を（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、注入、ポンプ、移植片などによって）全身的に、約１−５０週ごと（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０週ごと）に、単独で、又は本明細書に記載の、及び／又は当分野で公知の他の化合物及び／又は療法と組み合わせて、投与する。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子を、例えば特定の器官又は区画（例えば、肝臓、腫よう、ＣＮＳなど）に、イオン泳動によって投与する。イオン泳動による送達の非限定的例は、例えば、参照によりその全体を本明細書に組込む、国際公開第０３／０４３６８９号及び同０３／０３０９８９号に記載されている。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子及びその調合物又は組成物を、当分野で一般に公知であるとおりに、肝臓に投与する（例えば、Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．， １０， ２４４−９；Ｍｕｒａｏ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．， １９， １８０８−１４；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， ２００３， ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １０， １８０−７；Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ５４， ５１−８；Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．， １４９， １６１１−７及びＭａｔｓｕｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２００３， ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １０， １５５９−６６参照）。

一実施形態においては、本発明は、本発明の核酸分子を、単球及びリンパ球を含めた造血細胞に送達する方法の使用を特徴とする。これらの方法は、Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｐｈａｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， ２８５（２）， ９２０−９２８；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｂｌｏｏｄ， ９１（３）， ８５２−８６２；Ｆｉｌｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， １９９７， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．， １３２９（２）， ３４５−３５６；Ｍａ ａｎｄ Ｗｅｉ， １９９６， Ｌｅｕｋ． Ｒｅｓ．， ２０（１１／１２）， ９２５−９３０及びＢｏｎｇａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２２（２２）， ４６８１−８に詳述されている。かかる方法は、上述したように、オリゴヌクレオチドを造血細胞に移入するために、遊離オリゴヌクレオチド、陽イオン性脂質調合物、ｐＨ感応性リポソーム及び免疫リポソームを含めたリポソーム調合物、及び膜融合ペプチドと抱合されたオリゴヌクレオチドを含めたバイオコンジュゲートの使用を含む。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子及びその調合物又は組成物を、当分野で一般に公知であるとおりに、真皮又はろ胞に直接的に、又は局部的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）（例えば、局所的に（ｌｏｃａｌｌｙ））投与する（例えば、Ｂｒａｎｄ， ２００１， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ３， ２４４−８；Ｒｅｇｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ， ５， ２７５−８９；Ｋａｎｉｋｋａｎｎａｎ， ２００２， ＢｉｏＤｒｕｇｓ， １６， ３３９−４７；Ｗｒａｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ９０， ８９−１０４及びＰｒｅａｔ ａｎｄ Ｄｕｊａｒｄｉｎ， ２００１， ＳＴＰ ＰｈａｒｍａＳｃｉｅｎｃｅｓ， １１， ５７−６８参照）。一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子及びその調合物又は組成物を、アルコール（例えば、エタノール又はイソプロパノール）、水を含み、ミリスチン酸イソプロピル、カーボマー９８０などの追加の薬剤を含んでいてもよい、ヒドロアルコールゲル調合物によって、直接的に、又は局部的に投与する。

一実施形態においては、本発明の送達系としては、例えば、水系及び非水系ゲル、クリーム、多相乳濁液（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水溶液及び非水溶液、ローション、エアゾール、炭化水素基剤及び粉末が挙げられ、可溶化剤、透過促進剤（ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ）（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール及びアミノ酸）、親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィル及びポリビニルピロリドン）などの賦形剤を含むことができる。一実施形態においては、薬剤として許容される担体は、リポソーム又は経皮促進剤（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｅｎｈａｎｃｅｒ）である。本発明に使用することができるリポソームの例としては、（１）ＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ、陽イオン性脂質Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラパルミト（ｔｅｔｒａｐａｌｍｉｔ）−ｙ−スペルミンとジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１．５（Ｍ／Ｍ）リポソーム調合物（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、（２）Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ ＧＳＶ、陽イオン性脂質とＤＯＰＥの２：１（Ｍ／Ｍ）リポソーム調合物（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、（３）ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ−メチル−アンモニウムメチルスルファート）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）、及び（４）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ポリカチオン脂質ＤＯＳＰＡと中性脂質ＤＯＰＥの３：１（Ｍ／Ｍ）リポソーム調合物（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）が挙げられる。

一実施形態においては、本発明の送達系としては、貼付剤、錠剤、座剤、ペッサリー、ゲル剤及びクリーム剤が挙げられる。本発明の送達系は、可溶化剤、エンハンサー（例えば、プロピレングリコール、胆汁酸塩及びアミノ酸）などの賦形剤、及び他のビヒクル（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステル及び誘導体、並びにヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒアルロン酸などの親水性ポリマー）も含み得る。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ポリエチレンイミン（例えば、線状又は分枝ＰＥＩ）及び／又は、例えば、ガラクトースＰＥＩ、コレステロールＰＥＩ、抗体によって誘導体化されたＰＥＩ、そのポリエチレングリコールＰＥＩ（ＰＥＧ−ＰＥＩ）誘導体などのグラフト（ｇｒａｆｔｅｄ）ＰＥＩを含めたポリエチレンイミン誘導体と一緒に処方され、又は複合化される（例えば、参照により本明細書に組込む、Ｏｇｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２００１， ＡＡＰＡ ＰｈａｒｍＳｃｉ， ３， １−１１；Ｆｕｒｇｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， １４， ８４０−８４７；Ｋｕｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｐｈｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９， ８１０−８１７；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｂｕｌｌ． Ｋｏｒｅａｎ Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ２２， ４６−５２；Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， １０， ５５８−５６１；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， １３， ８４５−８５４；Ｅｒｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｐｒｅｐｒｉｎｔ， １， １−１８；Ｇｏｄｂｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ９６， ５１７７−５１８１；Ｇｏｄｂｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， ６０， １４９−１６０；Ｄｉｅｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７４， １９０８７−１９０９４；Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｋｌｉｂａｎｏｖ， ２００２， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ９９， １４６４０−１４６４５及びＳａｇａｒａ、米国特許第６，５８６，５２４号参照）。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、バイオコンジュゲート、例えば、参照により本明細書に組込む、２００３年４月３０日に出願されたＶａｒｇｅｅｓｅ他、米国特許出願第１０／４２７，１６０号、米国特許第６，５２８，６３１号、同６，３３５，４３４号、同６，２３５，８８６号、同６，１５３，７３７号、同５，２１４，１３６号、同５，１３８，０４５号に記載の核酸抱合体を含む。

したがって、本発明は、本発明の１種類以上の核酸を安定剤、緩衝剤などの許容される担体中に含む薬剤組成物を特徴とする。本発明のポリヌクレオチドは、安定剤、緩衝剤などを用いて、又は用いないで、薬剤組成物を形成する任意の標準手段によって、対象に投与することができ（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質）、導入することができる。リポソーム送達機構を利用することが望ましいときには、リポソームの標準形成プロトコルに従うことができる。本発明の組成物は、クリーム剤、ゲル剤、噴霧剤、オイル剤、及び当分野で公知である、局所、皮膚又は経皮投与に適切な他の組成物として、処方し、使用することもできる。

本発明は、上記化合物の薬学的に許容される調合物も含む。これらの調合物としては、上記化合物の塩、例えば、酸付加塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩及びベンゼンスルホン酸塩が挙げられる。

薬理学的組成物又は調合物とは、例えばヒトを含めて、細胞又は対象に投与、例えば全身又は局所投与するのに適切な形態の組成物又は調合物を指す。適切な形態は、用途又は流入経路、例えば経口、経皮若しくは注射に応じて、ある程度決まる。かかる形態は、組成物又は調合物が標的細胞（すなわち、負に帯電した核酸の送達が望ましい細胞）に到達するのを妨害すべきではない。例えば、血流中に注射する薬理学的組成物は可溶であるべきである。他の因子は、当分野で公知であり、毒性、組成物又は調合物がその効果を発揮するのを防止する形態などの考慮事項を含む。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子を、薬学的に許容される組成物又は調合物として対象に全身投与する。「全身投与」とは、インビボでの全身吸収、又は血流中の薬物の蓄積と、それに後く全身への分布を意味する。全身吸収に至る投与経路としては、静脈内、皮下、門脈、腹腔内、吸入、経口、肺内及び筋肉内が挙げられるが、これらだけに限定されない。これらの投与経路の各々によって、到達可能な患部組織が本発明のｓｉＮＡ分子に暴露される。循環中への薬物の流入速度は、分子量又はサイズの関数であることが判明している。本発明の化合物を含むリポソーム又は他の薬物担体を使用すると、例えば、細網内皮系（ＲＥＳ）の組織などのある組織タイプに薬物を潜在的に局在化させることができる。リンパ球、マクロファージなどの細胞の表面と薬物との会合を容易にし得るリポソーム調合物も有用である。この手法は、マクロファージ及びリンパ球による異常細胞の免疫認識の特異性を利用することによって、標的細胞への薬物の送達を促進することができる。

「薬学的に許容される調合物」又は「薬学的に許容される組成物」とは、本発明の核酸分子を、その所望の活性に最も適切である身体部位に有効に分布させることができる組成物又は調合物を意味する。本発明の核酸分子と一緒に処方するのに適切である薬剤の非限定的例としては、（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ８５などの）Ｐ糖タンパク質阻害剤、徐放性送達用のポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）ミクロスフェアなどの生分解性ポリマー（Ｅｍｅｒｉｃｈ， ＤＦ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ， ８， ４７−５８）、及びポリブチルシアノアクリラート製ナノ粒子などの充填（ｌｏａｄｅｄ）ナノ粒子が挙げられる。本発明の核酸分子の送達戦略の他の非限定的例としては、Ｂｏａｄｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ， ８７， １３０８−１３１５；Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ４２１， ２８０−２８４；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５， ＰＮＡＳ ＵＳＡ．， ９２， ５５９２−５５９６；Ｂｏａｄｏ， １９９５， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．， １５， ７３−１０７；Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２６， ４９１０−４９１６及びＴｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９， ＰＮＡＳ ＵＳＡ．， ９６， ７０５３−７０５８に記載の材料が挙げられる。

本発明は、ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ修飾リポソーム又は長時間循環型リポソーム、すなわちステルスリポソーム）を含む表面修飾リポソームと本発明の核酸分子とを含む組成物の使用も特徴とする。これらの調合物は、標的組織における薬物（例えば、ｓｉＮＡ）の蓄積を増加させる方法を与える。このクラスの薬物担体は、単核食細胞系（ＭＰＳ又はＲＥＳ）によるオプソニン作用及び排除に抵抗性であり、それによって、封入された薬物の血液循環時間を延長し、組織暴露を増強することができる（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． １９９５， ９５， ２６０１−２６２７；Ｉｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． １９９５， ４３， １００５−１０１１）。かかるリポソームは、恐らくは新生血管標的組織における溢出及び捕獲によって、腫よう中に選択的に蓄積することが判明している（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５， ２６７， １２７５−１２７６；Ｏｋｕ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １２３８， ８６−９０）。長時間循環型リポソームは、特に、ＭＰＳの組織で蓄積することが知られている従来の陽イオン性リポソームに比較して、ＤＮＡ及びＲＮＡの薬物動態学及び薬力学を増強する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９５， ４２， ２４８６４−２４８７０；Ｃｈｏｉ他、国際公開第９６／１０３９１号；Ａｎｓｅｌｌ他、国際公開第９６／１０３９０号；Ｈｏｌｌａｎｄ他、国際公開第９６／１０３９２号）。長時間循環型リポソームは、肝臓、ひ臓などの代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織における蓄積を回避するその能力に基づいて、陽イオン性リポソームと比較して、薬物をヌクレアーゼ分解からより強く保護する可能性もある。

一実施形態においては、本発明のリポソーム調合物は、参照によりその全体を本明細書に組込む、米国特許第６，８５８，２２４号；同６，５３４，４８４号；同６，２８７，５９１号；同６，８３５，３９５号；同６，５８６，４１０号；同６，８５８，２２５号；同６，８１５，４３２号；同６，５８６，００１号；同６，１２０，７９８号；同６，９７７，２２３号；同６，９９８，１１５号；同５，９８１，５０１号；同５，９７６，５６７号；同５，７０５，３８５号；米国特許出願公開第２００６／００１９９１２号；同２００６／００１９２５８号；同２００６／０００８９０９号；同２００５／０２５５１５３号；同２００５／００７９２１２号；同２００５／０００８６８９号；同２００３／００７７８２９号、同２００５／００６４５９５号、同２００５／０１７５６８２号、同２００５／０１１８２５３号；同２００４／００７１６５４号；同２００５／０２４４５０４号；同２００５／０２６５９６１号及び同２００３／００７７８２９号に記載の化合物及び組成物と一緒に処方又は複合化された本発明の二本鎖核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）を含む。

本発明は、薬学的に許容される担体又は希釈剤中に薬学的有効量の所望の化合物を含む、保存又は投与用に調製された組成物も含む。治療用に許容される担体又は希釈剤は、薬剤分野ではよく知られており、例えば、参照により本明細書に組込むＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ． １９８５）に記載されている。例えば、防腐剤、安定剤、色素及び香味剤を用意することもできる。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルが含まれる。また、抗酸化剤及び懸濁剤を使用することもできる。

薬学的に有効な用量とは、病態の予防、発症の阻止、又は（症候をある程度軽減する、好ましくは症候のすべてを軽減する）治療に必要な用量である。薬学的に有効な用量は、疾患のタイプ、用いる組成物、投与経路、治療するほ乳動物のタイプ、検討する特定のほ乳動物の身体特性、併用する薬物療法、及び医薬分野の当業者が認識する他の因子に応じて決まる。一般に、負に帯電したポリマーの効力に応じて、活性成分０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ体重／日を投与する。

本発明の核酸分子及びその調合物は、薬学的に許容される従来の無毒の担体、アジュバント及び／又はビヒクルを含む単位用量剤形で、経口的に、局所的に、非経口的に、吸入若しくは噴霧によって、又は直腸に、投与することができる。本明細書では非経口という用語は、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、髄腔内注射又は注入技術などを含む。また、本発明の核酸分子と、薬学的に許容される担体とを含む薬剤を提供する。本発明の１種類以上の核酸分子は、薬学的に許容される１種類以上の無毒の担体及び／又は希釈剤及び／又はアジュバント、並びに必要に応じて他の活性成分と一緒に存在し得る。本発明の核酸分子を含有する薬剤組成物は、経口用に適した剤形、例えば、錠剤、トローチ剤、舐剤、水性若しくは油性懸濁液剤、分散性散剤若しくは顆粒剤、乳剤、硬若しくは軟カプセル剤、又はシロップ剤若しくはエリキシル剤とすることができる。

経口用組成物は、薬剤組成物製造分野で公知の任意の方法によって調製することができる。かかる組成物は、薬剤的に優れた口当たりの良い製剤を提供するために、１種類以上のかかる甘味剤、香味剤、着色剤又は防腐剤を含むことができる。錠剤は、錠剤の製造に適切である、薬学的に許容される無毒の賦形剤と混合された活性成分を含む。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤、顆粒化剤及び崩壊剤、例えば、コーンスターチ又はアルギン酸、結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン又はアラビアゴム、並びに潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクとすることができる。錠剤は、被覆しなくても、公知技術によって被覆してもよい。かかる被覆を公知技術によって調製して、胃腸管における崩壊及び吸収を遅延させ、それによって長時間の持続作用を得ることができる場合もある。例えば、モノステアリン酸グリセリン、ジステアリン酸グリセリンなどの遅延物質を使用することができる。

経口製剤は、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンと混合された硬ゼラチンカプセル剤とすることもでき、活性成分が水又は油媒体、例えば、落花生油、流動パラフィン又はオリーブ油と混合された軟ゼラチンカプセル剤とすることもできる。

水性懸濁液剤は、水性懸濁液剤の製造に適切な賦形剤と混合された活性材料を含む。かかる賦形剤は、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアラビアゴムであり、分散剤又は湿潤剤は、天然リン脂質、例えば、レシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合物、例えば、ポリオキシエチレンステアレート、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はポリオキシエチレンソルビトールモノオレアートなど脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、又は脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導される部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレアートとすることができる。水性懸濁液剤は、１種類以上の防腐剤、例えば、エチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸、１種類以上の着色剤、１種類以上の香味剤、及びスクロース、サッカリンなどの１種類以上の甘味剤を含むこともできる。

油性懸濁液剤は、植物油中、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油中、又は流動パラフィンなどの鉱物油中に活性成分を懸濁させることによって調剤することができる。油性懸濁液剤は、増粘剤、例えば、蜜ろう、固形パラフィン又はセチルアルコールを含むことができる。甘味剤及び香味剤を添加して、口当たりの良い経口製剤を提供することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤を添加することによって保存することができる。

水を添加することによって水性懸濁液剤を調製するのに適切な分散性散剤及び顆粒剤によって、分散剤又は湿潤剤、懸濁剤及び１種類以上の防腐剤と混合された活性成分が提供される。適切な分散剤若しくは湿潤剤又は懸濁剤は、上で例示したとおりである。追加の賦形剤、例えば、甘味剤、香味剤及び着色剤が存在してもよい。

本発明の薬剤組成物は、水中油型乳剤の形にすることもできる。油相は、植物油、鉱油又はこれらの混合物とすることができる。適切な乳化剤は、天然ゴム、例えば、アラビアゴム又はトラガカントゴム、天然リン脂質、例えば、ダイズ、レシチン、及び脂肪酸とヘキシトール、無水物から誘導されるエステル又は部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレアート、及び前記部分エステルとエチレンオキシドの縮合物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートであり得る。乳剤は甘味剤及び香味剤を含むこともできる。

シロップ剤及びエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコース又はスクロースを用いて処方することができる。かかる製剤は、粘滑剤、防腐剤、香味剤及び着色剤を含むこともできる。薬剤組成物は、無菌注射用水性又は油性懸濁液剤とすることができる。この懸濁液剤は、上述の適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて公知技術に従って処方することができる。無菌注射用製剤は、親らしく許容される無毒の希釈剤又は溶媒の無菌注射液又は懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール溶液とすることもできる。使用可能な許容されるビヒクル及び溶媒は、水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム溶液などである。さらに、無菌不揮発性油が溶媒又は懸濁媒体として従来使用されている。この目的で、合成モノ又はジグリセリドを含めて、任意の無刺激性不揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も注射剤の調製に使用することができる。

本発明の核酸分子は、例えば薬物を直腸投与するための、座剤の形で投与することもできる。常温では固体であるが直腸温度では液体であり、したがって直腸内で溶融して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と薬物を混合することによって、これらの組成物を調製することができる。かかる材料としては、カカオ脂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。

本発明の核酸分子は、滅菌媒体中で非経口的に投与することができる。薬物は、使用するビヒクル及び濃度に応じて、ビヒクル中に懸濁させても、溶解させてもよい。局所麻酔薬、防腐剤、緩衝剤などのアジュバントをビヒクルに溶解させることも有利である。

約０．１ｍｇから約１４０ｍｇ／キログラム体重／日の投与量レベルが上記症状の治療に有用である（約０．５ｍｇから約７ｇ／対象／日）。単回投与剤形（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ）を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療を受ける患者、及び特定の投与方法に応じて変わる。単位用量剤形（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ ｆｏｒｍ）は、一般に、活性成分約１ｍｇから約５００ｍｇを含む。

特定の対象に対する具体的用量レベルは、用いる具体的化合物の活性、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食餌、投与時間、投与経路、及び排出速度、薬物の組合せ、及び治療を受ける特定の疾患の重篤度を含めて種々の要因に応じて決まることを理解されたい。

ヒト以外の動物に投与する場合には、組成物を動物飼料又は飲料水に添加することもできる。動物が治療上適切な量の組成物をその飼料と一緒に摂取するように、動物飼料及び飲用水組成物を処方することが好都合であり得る。飼料又は飲料水に添加するプレミックスとして組成物を提供することも好都合であり得る。

本発明の核酸分子を他の治療化合物と組み合わせて対象に投与して、全体の治療効果を高めることもできる。ある適応症の治療に複数の化合物を用いると、副作用を減少させつつ、有益な効果を高めることができる。

一実施形態においては、本発明は、本発明の核酸分子を特定の細胞タイプに投与するのに適切である組成物を含む。例えば、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， １９８７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２， ４４２９−４４３２）は、肝細胞特有のものであり、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）などの分枝ガラクトース末端糖タンパク質と結合する。別の例においては、葉酸受容体は、多数の癌細胞において過剰発現される。かかる糖タンパク質、合成複合糖質又は葉酸塩と受容体の結合は、オリゴ糖鎖の分岐度に大きく依存した親和性によって生ずる。例えば、三分岐（ｔｒｉａｔｅｎｎａｒｙ）構造は、二分岐（ｂｉａｔｅｎａｒｒｙ）又は単分岐（ｍｏｎｏａｔｅｎｎａｒｙ）鎖よりも高い親和性で結合する（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｔｅ， １９８０， Ｃｅｌｌ， ２２， ６１１−６２０；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５７， ９３９−９４５）。Ｌｅｅ ａｎｄ Ｌｅｅ， １９８７， Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．， ４， ３１７−３２８は、受容体に対する親和性がガラクトースよりも高いＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを炭水化物部分として使用することによって、この高い特異性を得た。この「クラスター形成効果」は、マンノシル末端糖タンパク質又は複合糖質の結合及び取り込みについても記述されている（Ｐｏｎｐｉｐｏｍ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ２４， １３８８−１３９５）。ガラクトース、ガラクトサミン又は葉酸塩の抱合体を用いて、外来性化合物を細胞膜を越えて輸送することによって、目標とした送達手法を、例えば、肝疾患、肝臓癌、又は他の癌の治療に提供することができる。バイオコンジュゲートを使用すると、治療に必要な治療化合物の必要用量を削減することもできる。また、本発明の核酸バイオコンジュゲートを使用することによって、治療薬の生物学的利用能、薬力学及び薬物動態パラメータを調節することができる。かかるバイオコンジュゲートの非限定的例は、２００１年８月１３日に出願された、Ｖａｒｇｅｅｓｅ他、米国特許出願第１０／２０１，３９４号、及び２００２年３月６日に出願された、Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ他、米国特許出願第６０／３６２，０１６号に記載されている。

或いは、本発明のある種のｓｉＮＡ分子は、細胞内で真核生物プロモーターから発現させることができる（例えば、Ｉｚａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９， ３４５；ＭｃＧａｒｒｙ ａｎｄ Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８３， ３９９；Ｓｃａｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８， １０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．， ２， ３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６６， １４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６５， ５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９， １０８０２−６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２０， ４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４７， １２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２３， ２２５９；Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ４， ４５。当業者は、真核細胞中で任意の核酸を適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現させることができることを認識されたい。かかる核酸の活性は、核酸を酵素的核酸によって一次転写物から放出させることによって、増大させることができる（Ｄｒａｐｅｒ他、国際公開第９３／２３５６９号、及びＳｕｌｌｉｖａｎ他、国際公開第９４／０２５９５号；Ｏｈｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．， ２７， １５−６；Ｔａｉｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９， ５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２１， ３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６９， ２５８５６。

本発明の別の態様においては、本発明のＲＮＡ分子を、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現させることができる（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６， ＴＩＧ．， １２， ５１０）。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターであり得る。ｓｉＮＡを発現するウイルスベクターは、これらだけに限定されないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス又はアルファウイルスに基づいて構築することができる。別の実施形態においては、ｐｏｌ ＩＩＩに基づく構築体を用いて、本発明の核酸分子を発現させる（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、米国特許第５，９０２，８８０号及び６，１４６，８８６号参照）。ｓｉＮＡ分子を発現可能である組換えベクターを、上述のとおりに送達し、標的細胞中に存続させることができる。或いは、核酸分子の一過性発現を与えるウイルスベクターを使用することができる。かかるベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。ｓｉＮＡ分子は、発現後、標的ｍＲＮＡと相互作用して、ＲＮＡｉ応答を生ずる。ｓｉＮＡ分子を発現するベクターの送達は、静脈内又は筋肉内投与によって、対象から外植された標的細胞に投与し、続いて対象に再導入することによって、所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段によってなど、全身的であり得る（総説については、Ｃｏｕｔｕｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６， ＴＩＧ．， １２， ５１０を参照されたい。）。

一態様においては、本発明は、本発明の少なくとも１種類のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。発現ベクターは、ｓｉＮＡ二本鎖の一方若しくは両方の鎖をコードすることができ、又はｓｉＮＡ二本鎖を自己ハイブリッド形成する単一の自己相補鎖をコードすることができる。本発明のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列は、ｓｉＮＡ分子の発現を可能にするように作動可能に結合し得る（例えば、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９， ５０５；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ， ２００２， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９， ４９７；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９， ５００及びＮｏｖｉｎａ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５参照）。

別の態様においては、本発明は、ａ）転写開始領域（例えば、真核生物ｐｏｌ Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ開始領域）と、ｂ）転写終結領域（例えば、真核生物ｐｏｌ Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ終結領域）と、ｃ）本発明のｓｉＮＡ分子の少なくとも１種類をコードする核酸配列とを含む発現ベクターを特徴とする。ここで、前記配列は、ｓｉＮＡ分子の発現及び／又は送達を可能にするように、前記開始領域及び前記終結領域に作動可能に結合している。ベクターは、本発明のｓｉＮＡをコードする配列の５’側又は３’側に作動可能に結合した、タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、及び／又はイントロン（介在配列）を含んでいてもよい。

ｓｉＮＡ分子配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）のプロモーターから駆動され得る。ｐｏｌ ＩＩ又はｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからの転写物は、すべての細胞において高レベルで発現される。所与の細胞タイプにおける所与のｐｏｌ ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適切な細胞中で発現される限り、原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターも用いられる（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｏｓｓ， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７， ６７４３−７；Ｇａｏ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ １９９３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２１， ２８６７−７２；Ｌｉｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ２１７， ４７−６６；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １０， ４５２９−３７）。数名の研究者によれば、かかるプロモーターから発現された核酸分子は、ほ乳動物細胞中で機能し得る（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．， ２， ３−１５；Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９， １０８０２−６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２０， ４５８１−９；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ６３４０−４；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２， ＥＭＢＯ Ｊ．， １１， ４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ， ９０， ８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２３， ２２５９；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ ＆ Ｃｅｃｈ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６２， １５６６）。より具体的には、Ｕ６核内低分子（ｓｎＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びアデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードする遺伝子に由来する転写単位などの転写単位は、細胞において高濃度のｓｉＮＡなどの所望のＲＮＡ分子を生成するのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（前掲）；Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ， １９９６（前掲）；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， ２２， ２８３０；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ他、米国特許第５，６２４，８０３号；Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ４， ４５；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ他、国際公開第９６／１８７３６号。上記ｓｉＮＡ転写単位は、ほ乳動物細胞に導入するために、プラスミドＤＮＡベクター、（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクターなどの）ウイルスＤＮＡベクター又は（レトロウイルス、アルファウイルスベクターなどの）ウイルスＲＮＡベクターを含めて、ただしこれらだけに限定されない種々のベクターに組み入れることができる（総説については、Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ， １９９６（前掲）を参照されたい。）。

別の態様においては、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子の少なくとも１種類をコードする核酸配列を、そのｓｉＮＡ分子の発現が可能であるように含む、発現ベクターを特徴とする。一実施形態においては、発現ベクターは、ａ）転写開始領域と、ｂ）転写終結領域と、ｃ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列を含み、該配列は、ｓｉＮＡ分子の発現及び／又は送達を可能にするように、開始領域及び終結領域に作動可能に結合している。

別の実施形態においては、発現ベクターは、ａ）転写開始領域と、ｂ）転写終結領域と、ｃ）オープンリーディングフレームと、ｄ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列とを含み、該配列は、オープンリーディングフレームの３’末端に作動可能に結合し、ｓｉＮＡ分子の発現及び／又は送達を可能にするように、開始領域、オープンリーディングフレーム及び終結領域に作動可能に結合している。更に別の実施形態においては、発現ベクターは、ａ）転写開始領域と、ｂ）転写終結領域と、ｃ）イントロンと、ｄ）少なくとも１個のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列とを含み、該配列は、核酸分子の発現及び／又は送達を可能にするように、開始領域、イントロン及び終結領域に作動可能に結合している。

別の実施形態においては、発現ベクターは、ａ）転写開始領域と、ｂ）転写終結領域と、ｃ）イントロンと、ｄ）オープンリーディングフレームと、ｅ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列とを含み、該配列は、オープンリーディングフレームの３’末端に作動可能に結合し、ｓｉＮＡ分子の発現及び／又は送達を可能にするように、開始領域、イントロン、オープンリーディングフレーム及び終結領域に作動可能に結合している。

ＨＣＶの生物学及び生化学
１９８９年に、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、ＲＮＡウイルスであることが判明し、大部分の非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎の病原体であると特定された（Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４， ３５９−３６２）。ＨＩＶなどのレトロウイルスと異なり、ＨＣＶは、ＤＮＡ複製期を通過せず、ウイルスゲノムが宿主染色体中に組み込まれた形態は検出されていない（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， １４， ３８１−３８８）。むしろ、コード（プラス）鎖の複製は、複製（マイナス）鎖の生成によって媒介され、プラス鎖ＨＣＶ ＲＮＡの幾つかのコピーを生じる。ゲノムは、ポリタンパク質に翻訳される単一の大きいオープンリーディングフレームからなる（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９１， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２８０：３２５−３２８）。このポリタンパク質は、続いて翻訳後切断を受け、幾つかのウイルスタンパク質を生成する（Ｌｅｉｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２０４：１６３−１６９）。

ＨＣＶの９．５キロベースのゲノムを調べると、ウイルス核酸が高い割合で変異し得ることが実証された（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ４５， ２３８−２４６）。この変異率は、約７０％の配列同一性を共有するＨＣＶの幾つかの異なる遺伝子型を進化させた（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７５， １０５３−１０６１）。これらの配列が進化的にかなり離れていることは注目に値する。例えば、ヒトとチンパンジーなどの霊長目との遺伝的同一性は約９８％である。また、個々の患者におけるＨＣＶ感染は、ＲＮＡレベルで９８％の同一性を有する幾つかの遠い、進化しつつある準種で構成されることが実証された。したがって、ＨＣＶゲノムは、超可変性であり、連続的に変化している。ＨＣＶゲノムは超可変性ではあるが、高度に保存されている３つのゲノム領域がある。これらの保存配列は、５’及び３’非コード領域、並びにコアタンパク質コード領域の５’末端にあり、ＨＣＶ ＲＮＡ複製、及びＨＣＶポリタンパク質の翻訳に不可欠であると考えられる。したがって、これらの保存されたＨＣＶゲノム領域を標的にした治療薬は、広範囲のＨＣＶ遺伝子型にかなりの影響を及ぼし得る。さらに、薬剤耐性が、ＨＣＶゲノムの保存領域に特異的である酵素的核酸によって生じるおそれはない。これに対し、ウイルスのプロテアーゼやヘリカーゼなどの酵素の阻害を標的にした治療様式は、薬剤耐性系統の選択をもたらす可能性がある。というのは、これらのウイルスによってコードされた酵素のＲＮＡは、ＨＣＶゲノムの超可変部に位置するからである。

ＨＣＶに最初に暴露された後、患者は、肝酵素が過渡的に上昇する。これは、炎症過程が生じていることを示している（Ａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｅｆｆ ＬＢ， Ｌｅｗｉｓ ＪＨ， ｅｄｓ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏ；１９８９：８３−８９）。この肝酵素の上昇は、最初の暴露から少なくとも４週間後に生じ、最長で２か月持続し得る（Ｆａｒｃｉ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ３２５， ９８−１０４）。肝酵素が上昇する前に、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって、患者の血清中のＨＣＶ ＲＮＡを検出することができる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ． ８８， ２４０−２４３）。疾患のこの段階は、急性期と呼ばれ、通常は検出されない。というのは、ＨＣＶ感染による急性ウイルス性肝炎の患者の７５％は無症候性だからである。これらの患者の残りの２５％は、黄だん、又は肝炎の他の症候を生じる。

急性ＨＣＶ感染は良性疾患ではあるが、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの持続的な上昇、及び循環ＨＣＶ ＲＮＡの連続的な存在によって明らかなように、急性ＨＣＶ患者の８０％もが慢性肝疾患に進行する（Ｓｈｅｒｌｏｃｋ， １９９２， Ｌａｎｃｅｔ， ３３９， ８０２）。慢性ＨＣＶ感染症が１０から２０年間自然に進行すると、患者の２０％から５０％は肝硬変を発症する（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ， ２， １５０， １５４）。ＨＣＶ感染症から肝細胞癌への進行は詳細に記録されている（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ． １８， １３２６−１３３３；Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １６０， １３３−１３８）。肝硬変及び／又は肝細胞癌に進行する可能性が最も高い亜集団を判定する試験はなく、したがって全患者が同じ進行のリスクを有する。

肝細胞癌と診断された患者の生存時間は、最初の診断から０．９から１２．８か月にすぎないことは注目に値する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ． ８８， ２４０−２４３）。化学療法薬による肝細胞癌の治療が有効であることは証明されておらず、肝臓の広範な腫よう浸潤のために、患者のわずか１０％しか手術の恩恵を受けていない。（Ｔｒｉｎｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｅｓｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ２３， ８３１−８３３）。原発性肝細胞癌の悪性度が高いことを考慮すると、手術に代わる生存可能な治療は肝移植しかない（Ｐｉｃｈｌｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ． ２０， ３３Ｓ−４０Ｓ）。

肝硬変に進行後、慢性ＨＣＶ感染患者は、最初の原因にかかわらず、臨床的な肝硬変に共通した臨床的特徴を呈する（Ｄ’Ａｍｉｃｏ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． ３１， ４６８−４７５）。これらの臨床的特徴としては、出血性食道静脈りゅう、腹水、黄だん、脳症などが挙げられる（Ｚａｋｉｍ Ｄ， Ｂｏｙｅｒ ＴＤ． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ａ ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ １． １９９０ Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ． Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。肝硬変の初期には、患者は、肝組織損傷が起きてはいるが、患者の肝臓が血流中の代謝産物をまだ解毒することができる段階である、代償性に分類される。また、大部分の代償性肝疾患患者は無症候性であり、症候を呈する少数は、消化不良、脱力感などの軽い症候を示すにすぎない。肝硬変の後期では、患者は、血流中の代謝産物を解毒する肝臓の能力が低下した段階である、非代償性に分類される。上記臨床的特徴を呈するのは非代償期である。

１９８６年に、Ｄ’Ａｍｉｃｏ等は、アルコール依存症とウイルス関連の肝硬変との両方を有する１１５５名の患者における臨床症状及び生存率を記述した（Ｄ’Ａｍｉｃｏ（前掲））。１１５５名の患者のうち４３５名（３７％）は、代償性疾患を発症したが、７０％は試験開始時に無症候性であった。残りの７２０名の患者（６３％）は、非代償性肝疾患であり、７８％は腹水、３１％は黄だん、１７％は出血性、１６％は脳症の病歴を有した。肝細胞癌は、６名（．５％）の代償性疾患患者及び３０名（２．６％）の非代償性疾患患者において認められた。

６年間に、代償性肝硬変患者は、１０％／年の割合で非代償性疾患の臨床的特徴を示した。ほとんどの場合、腹水が代償不全の最初の症状であった。また、肝細胞癌は、６年間の試験の終わりまでに、初期に代償性疾患を呈した５９名の患者において発生した。

生存時間に関しては、Ｄ’Ａｍｉｃｏの試験によれば、試験の全患者の５年生存率は、わずか４０％であった。初期に代償性肝硬変を発症した患者の６年生存率は５４％であったのに対して、初期に非代償性疾患を発症した患者の６年生存率はわずか２１％であった。アルコール性肝硬変患者とウイルス関連の肝硬変患者との生存率に有意差はなかった。Ｄ’Ａｍｉｃｏの試験における患者の死の主原因は、肝不全が４９％、肝細胞癌が２２％、出血性が１３％であった（Ｄ’Ａｍｉｃｏ（前掲））。

慢性Ｃ型肝炎は、１０から２０年で肝硬変、肝不全及び／又は肝細胞癌をもたらし得る、ウイルス（ＨＣＶ）によって媒介される、進行の遅い肝臓の炎症性疾患である。米国では、ＨＣＶ感染は、米国における急性肝炎のうち年間５０，０００件の新規症例の原因であると推定される（ＮＩＨ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｍａｒｃｈ １９９７）。米国におけるＨＣＶの有病率は１．８％と推定され、ＣＤＣは、慢性感染米国人の数を約４５０万人としている。ＣＤＣは、毎年最高１０，０００人が慢性ＨＣＶ感染症によって死亡しているとも推定している。

慢性ＨＣＶ感染症の治療にインターフェロン（ＩＦＮアルファ）を用いた多数の十分に管理された臨床試験によれば、週３回の治療によって、６か月の療法の終わりまでに患者の約５０％（４０％−７０％）において血清ＡＬＴ値が低下する（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ３２１， １５０１−１５０６；Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， １３， ３９３−３９７；Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ２６， ７４７−７５４；Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ２６， １６４０−１６４５）。しかし、インターフェロン治療の休止後、反応のあった患者の約５０％が再発し、「耐久（ｄｕｒａｂｌｅ）」反応率は、血清ＡＬＴ濃度の正常化によって評価して、約２０−２５％であった。

ＨＣＶ ＲＮＡの直接測定は、分枝ＤＮＡ又は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析によって可能である。一般に、ＲＴ−ＰＣＲ法の方が感度が高く、臨床経過をより正確に評価することができる（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（前掲））。臨床的エンドポイントとしてＨＣＶ ＲＮＡ値の変化を用いた６か月間の１型インターフェロン療法を調べた試験によれば、療法の終わりまでに患者の最高３５％でＨＣＶ ＲＮＡが消失した（Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（前掲））。しかし、ＡＬＴエンドポイントの場合と同様に、患者の約５０％が療法休止後６か月以内に再発し、耐久ウイルス学的著効はわずか１２％にすぎない（Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（前掲））。４８週間の療法を調べた試験によれば、持続的ウイルス学的著効は、最高２５％である（ＮＩＨ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ： １９９７）。したがって、１型インターフェロンによる慢性ＨＣＶ感染治療の標準治療は、現在、効力の一次評価としてＨＣＶ ＲＮＡ濃度変化を用いた４８週間の療法である（Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ３３６， ３４７−３５６）。

１型インターフェロン治療に起因する副作用は、（１）インフルエンザ様症候、（２）神経精神医学的、（３）検査値異常、及び（４）その他の４つの一般的カテゴリーに分類することができる（Ｄｕｓｈｅｉｋｏ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ， １， ３−５）。インフルエンザ様症候の例としては、疲労、発熱、筋痛、倦怠感、食欲不振、頻脈、悪寒、頭痛及び関節痛が挙げられる。インフルエンザ様症候は、通常、短期間であり、投薬の最初の４週間後に軽減する傾向にある（Ｄｕｓｈｉｅｋｏ ｅｔ ａｌ．（前掲））。神経精神医学的副作用としては、被刺激性、感情鈍麻、感情変化、不眠、認知変化、抑うつなどが挙げられる。これらの神経精神医学的副作用のうち最も重要なのは抑うつであり、うつ病の病歴がある患者には１型インターフェロンを投与すべきではない。検査値異常としては、顆粒球を含めた骨髄細胞及び血小板の減少、並びにより少ない程度にではあるが赤血球の減少などが挙げられる。これらの血球数の変化は、重大な臨床的後遺症をめったにもたらさない（Ｄｕｓｈｉｅｋｏ ｅｔ ａｌ．（前掲））。また、トリグリセリド濃度の増加、血清アラニン及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ濃度の上昇も認められた。最後に、甲状腺異常が報告された。甲状腺異常は、通常、インターフェロン療法休止後に可逆性であり、療法中に適切な投薬によって調節することができる。その他の副作用としては、悪心、下痢、腹痛及び背痛、掻よう症、脱毛症、鼻漏などが挙げられる。一般に、ほとんどの副作用は、療法の４から８週間後に軽減する（Ｄｕｓｈｉｅｋｏ ｅｔ ａｌ．（前掲））。

したがって、ＨＣＶ遺伝子を標的にした低分子干渉核酸分子、及びＨＩＶ生涯過程に関連する細胞／宿主遺伝子標的を標的にした低分子干渉核酸分子の使用は、ＨＣＶ感染症、肝不全、肝細胞癌、肝硬変、又は対象若しくは生物体におけるＨＣＶ遺伝子の調節（例えば、阻害）に応答する任意の他の疾患若しくは症状の治療及び診断に使用することができる新規治療薬の１クラスをもたらす。

（実施例）
以下は、本発明の核酸の選択、単離、合成及び活性を示す非限定的例である。

ｓｉＮＡ構築体のタンデム合成
本発明の例示的なｓｉＮＡ分子を、切断可能なリンカー、例えば、スクシニル系リンカーを用いて、タンデム合成する。本明細書に記載のタンデム合成の後に、ＲＮＡｉ分子を高収率で与える１段階精製工程が続く。この手法は、ハイスループットＲＮＡｉスクリーニングを支持するｓｉＮＡ合成に極めて適しており、マルチカラム又はマルチウェルの合成プラットフォームに容易に適合させることができる。

５’末端ジメトキシトリチル（５’−Ｏ−ＤＭＴ）基がそのまま残る（トリチルオン合成）、ｓｉＮＡオリゴとその相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）のタンデム合成が完結した後、オリゴヌクレオチドを上述のとおりに脱保護する。脱保護後、ｓｉＮＡ配列鎖を自発的にハイブリッド形成させる。このハイブリダイゼーションによって、一方の鎖が５’−Ｏ−ＤＭＴ基を保持し、相補鎖が末端５’ヒドロキシルを含む、二本鎖が生成する。新規に形成された二本鎖は、一方の分子しかジメトキシトリチル基を持たないにもかかわらず、定常的な固相抽出精製（トリチルオン精製）の間、単一の分子として挙動する。鎖は安定な二本鎖を形成するので、例えばＣ１８カートリッジを用いて、オリゴの対を精製するのに必要であるのは、このジメトキシトリチル基（又は他のトリチル基、他の疎水性部分などの等価な基）のみである。

反転デオキシ脱塩基スクシナート、グリセリルスクシナートリンカーなどのタンデムリンカー（図１参照）、又は等価な切断可能なリンカーを導入するまでは、標準ホスホルアミダイト合成化学反応を用いる。使用可能なリンカー結合条件の非限定的例は、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢｒＯＰ）などの活性化試薬の存在下での、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＡ）及び／又はＤＭＡＰなどのヒンダード塩基を含む。リンカーが結合した後、標準合成化学反応を利用して、第２の配列の合成を完了し、末端５’−Ｏ−ＤＭＴをそのまま残す。合成後、生成したオリゴヌクレオチドを、本明細書に記載の手順に従って脱保護し、適切な緩衝剤、例えば、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ又は１．５Ｍ ＮＨ_４Ｈ_２ＣＯ_３でクエンチする。

ｓｉＮＡ二本鎖の精製は、例えば、アセトニトリル １カラム体積（ＣＶ）、Ｈ２Ｏ ２ＣＶ、及び５０ｍＭ ＮａＯＡｃ ２ＣＶで調整したＷａｔｅｒｓ Ｃ１８ ＳｅｐＰａｋ １ｇカートリッジを用いて、固相抽出によって容易に実施することができる。試料を充填し、次いでＨ２Ｏ又は５０ｍＭ ＮａＯＡｃ １ＣＶで洗浄する。失敗配列（ｆａｉｌｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を１４％ＡＣＮ（５０ｍＭ ＮａＯＡｃ及び５０ｍＭ ＮａＣｌを含む水溶液）１ＣＶで溶出させる。次いで、カラムを例えばＨ２Ｏ １ＣＶで洗浄後、例えば、１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液１ＣＶをカラムに通し、次いで１％ＴＦＡ水溶液１ＣＶをカラムに追加し、約１０分間放置することによって、カラム上で脱トリチル化する。残留ＴＦＡ溶液を除去し、カラムをＨ２Ｏ、続いて１Ｍ ＮａＣｌ １ＣＶ及び追加のＨ２Ｏで洗浄する。次いで、ＳｉＮＡ二本鎖生成物を、例えば２０％ＣＡＮ水溶液１ＣＶを用いて、溶出させる。

図２は、精製ｓｉＮＡ構築体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の例である。各ピークはｓｉＮＡ二本鎖の個々のｓｉＮＡ鎖の計算質量に対応する。同じ精製ｓｉＮＡは、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）によって分析すると、３本のピークを与える。１本のピークは二本鎖ｓｉＮＡに対応し、２本のピークは別々のｓｉＮＡ配列鎖に対応すると推定される。同じｓｉＮＡ構築体（ｃｏｎｔｒａｃｔ）のイオン交換ＨＰＬＣ分析では、単一のピークしか出現しない。以下のルシフェラーゼレポーターアッセイによる精製ｓｉＮＡ構築体の試験によれば、別々に合成したオリゴヌクレオチド配列鎖から生成したｓｉＮＡ構築体とＲＮＡｉ活性が同じであった。

任意のＲＮＡ配列におけるｓｉＮＡ標的部位候補の特定
ウイルス又はヒトｍＲＮＡ転写物（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって本明細書で参照する配列のいずれか）などの目的ＲＮＡ標的の配列を、例えばコンピュータ折りたたみアルゴリズムによって、標的部位についてスクリーニングする。非限定的例においては、Ｇｅｎｂａｎｋなどのデータベースから得られる遺伝子又はＲＮＡ遺伝子転写物の配列を用いて、標的に対して相補性を有するｓｉＮＡ標的を作製する。かかる配列は、データベースから得ることができ、又は当分野で公知のとおりに実験的に決定することができる。既知の標的部位、例えば他の核酸分子、例えばリボザイム若しくはアンチセンスを用いた研究に基づいて有効な標的部位であると決定された標的部位を用いて、又は変異若しくは欠失を含む部位などの疾患、形質若しくは症状と関連することが知られている標的を用いて、これらの部位を標的にするｓｉＮＡ分子を設計することができる。種々のパラメータを用いて、標的ＲＮＡ配列内の最も適切な標的部位である部位を決定することができる。このパラメータとしては、二次又は三次ＲＮＡ構造、標的配列のヌクレオチド塩基組成、標的配列の種々の領域間の相同性の程度、又はＲＮＡ転写物内の標的配列の相対位置が挙げられるが、これらだけに限定されない。この決定に基づいて、ＲＮＡ転写物内の任意の数の標的部位を選択して、例えば、インビトロＲＮＡ切断アッセイ、細胞培養又は動物モデルを用いることによって、ｓｉＮＡ分子を効力に関してスクリーニングすることができる。非限定的例においては、１から１０００個の標的部位のどこでも、使用するｓｉＮＡ構築体のサイズに基づいて、転写物内で選択される。標的遺伝子発現の効率的減少を求めるマルチウェル、マルチプレートアッセイなどの当分野で公知の方法を用いてｓｉＮＡ分子をスクリーニングするハイスループットスクリーニングアッセイを開発することができる。

ＲＮＡ中のｓｉＮＡ分子標的部位の選択
以下の非限定的段階によって、所与の遺伝子配列又は転写物を標的にしたｓｉＮＡを選択することができる。

１． 標的配列をコンピュータ解析して、標的配列内に含まれる特定の長さのすべての断片又は部分配列、例えば２３ヌクレオチド断片のリストを作成する。この段階は、特化されたＰｅｒｌスクリプトを用いて典型的には実施されるが、Ｏｌｉｇｏ、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅなどの市販配列解析プログラムも同様に使用することができる。

２． ｓｉＮＡは、１個を超える標的配列に対応する場合もある。例えば、同じ遺伝子の異なる転写物を標的にする場合、１個を超える遺伝子の異なる転写物を標的にする場合、又はヒト遺伝子と動物相同体の両方を標的にする場合である。この場合には、特定の長さの部分配列リストを標的の各々について作成し、次いでリストを比較して、各リストにおけるマッチング配列を見つける。次いで、部分配列を、所与の部分配列を含む標的配列の数に従ってランク付けする。標的配列の大部分又はすべてに存在する部分配列を見つけることが目的である。或いは、ランク付けによって、変異標的配列など、標的配列に独特な部分配列を特定することができる。かかる手法によって、変異配列を特異的に標的にし、正常配列を発現させない、ｓｉＮＡの使用が可能になる。

３． ｓｉＮＡ部分配列は、所望の標的配列には存在するが、１個以上の配列には存在しない場合もある。これは、非標的のままにすべきであるパラロガスなファミリーメンバーを有する遺伝子を、ｓｉＮＡが標的にする場合である。上記２の場合と同様に、特定の長さの部分配列リストを標的の各々について作成し、次いでリストを比較して、標的遺伝子中には存在するが、非標的パラログ中には存在しない配列を見つける。

４． ランク付けされたｓｉＮＡ部分配列を更に解析して、ＧＣ含量に従ってランク付けすることができる。３０−７０％ＧＣを含む部位が好ましく、４０−６０％ＧＣを含む部位が更に好ましい。

５． ランク付けされたｓｉＮＡ部分配列を更に解析して、自己折りたたみ及び内部ヘアピンに従ってランク付けすることができる。より弱い内部折りたたみが好ましく、強いヘアピン構造は回避されるべきである。

６． ランク付けされたｓｉＮＡ部分配列を更に解析して、一続きのＧＧＧ又はＣＣＣを配列中に有するか否かによってランク付けすることができる。どちらかの鎖のＧＧＧ（又は更に多いＧ）は、オリゴヌクレオチド合成に問題を生じるおそれがあり、ＲＮＡｉ活性を妨害するおそれがある。したがって、より良好な配列が利用可能であるときには常に回避される。標的鎖においてはＣＣＣを検索する。というのは、ＣＣＣは、アンチセンス鎖ではＧＧＧの位置にあるからである。

７． ランク付けされたｓｉＮＡ部分配列を更に解析して、ジヌクレオチドＵＵ（ウリジンジヌクレオチド）を配列の３’末端に有するか否か、及び／又は（アンチセンス配列に３’ＵＵを生ずる）ＡＡを配列の５’末端に有するか否かによって、ランク付けすることができる。これらの配列によって、末端ＴＴチミジンジヌクレオチドを有するｓｉＮＡ分子の設計が可能になる。

８． ランク付けされた上記部分配列リストから４又は５個の標的部位を選択する。次いで、例えば、２３ヌクレオチドを有する部分配列において、選択した各２３量体部分配列の右側の２１ヌクレオチドをｓｉＮＡ二本鎖の上側（センス）鎖用に設計して、合成し、次いで、選択した各２３量体部分配列の左側の２１ヌクレオチドの逆相補鎖（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）をｓｉＮＡ二本鎖の下側（アンチセンス）鎖用に設計して、合成する（表ＩＩ参照）。（パラグラフ７に記載したように）末端ＴＴ残基が配列にとって望ましい場合には、オリゴを合成する前に、センス鎖とアンチセンス鎖の両方の２個の３’末端ヌクレオチドをＴＴで置換する。

９． ｓｉＮＡ分子をインビトロの細胞培養又は動物モデル系においてスクリーニングして、標的ＲＮＡ配列内の最も活性なｓｉＮＡ分子、又は最も好ましい標的部位を特定する。

１０． 標的核酸配列を選択するときには、別の設計考慮事項を使用することができる。例えば、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ， １ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００４， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ９３６及びＵｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３２， ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｈ２４７を参照されたい。

代替手法においては、標的配列に特異的であるｓｉＮＡ構築体のプールを用いて、培養したジャーカット、ＨｅＬａ、Ａ５４９、２９３Ｔ細胞など、標的ＲＮＡを発現する細胞中の標的部位についてスクリーニングする。この手法に用いる一般戦略を図９に示す。標的ＲＮＡを発現する細胞にｓｉＮＡ構築体のプールを移入し、標的阻害に関連した表現型を示す細胞を選別する。ｓｉＮＡ構築体のプールは、適切なベクターに挿入された転写カセットから発現され得る（例えば、図７及び図８参照）。表現型のポジティブな変化（例えば、増殖の減少、標的ｍＲＮＡレベルの低下、又は標的タンパク質発現の減少）を示す細胞から得られたＳｉＮＡの配列を決定して、標的標的ＲＮＡ配列内の最も適切な標的部位を求める。

一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子を以下の方法によって選択する。以下の指針を編集して、本明細書に記載の化学修飾を含む異常に活性なｓｉＮＡを予測した。これらの規則は、幾つかの異なる標的に対して異常に活性な（標的ｍＲＮＡレベルの＞７５％ノックダウン）ｓｉＮＡと不活性な（標的ｍＲＮＡレベルの＜７５％ノックダウン）ｓｉＮＡとの比較解析から明らかになった。合計２４２個のｓｉＮＡ配列を解析した。２４２個のｓｉＮＡのうち３５個のｓｉＮＡは異常に活性なグループに分類され、残りのｓｉＮＡは不活性なグループに分類された。異常に活性なｓｉＮＡは、ｓｉＮＡ配列内の特定のヌクレオチド位置におけるある種の塩基に明らかに選択的であった。例えば、Ａ又はＵ核酸塩基は、異常に活性なｓｉＮＡ中のセンス鎖の１９位に圧倒的に存在し、不活性ｓｉＮＡでは逆であった。センス鎖の１５−１９位間のＡ／Ｕリッチ（５塩基のうち３塩基がＡ又はＵ）領域、及び１−５位間のＧ／Ｃリッチ領域（５塩基のうち３塩基がＧ又はＣ）のパターンも異常に活性なｓｉＮＡ中に存在した。表ＶＩＩに示すように、異常に活性なｓｉＮＡに特徴的であるかかる１２パターンを特定した。すべてのパターンが、異常に活性な各ｓｉＮＡ中に存在するとは限らないことに留意されたい。したがって、異常に活性なｓｉＮＡを予測するアルゴリズムを設計するために、各パターンに対して異なるスコアを割り当てた。異常に活性なｓｉＮＡと不活性ｓｉＮＡにおいてかかるパターンが出現する頻度に応じて、設計パラメータにスコアを割り当てた。１０が最高であった。ある種の核酸塩基がある位置において好ましくない場合には、負のスコアを割り当てた。例えば、センス鎖の９及び１３位において、Ｇヌクレオチドは、異常に活性なｓｉＮＡにおいて好ましくなく、したがって−３（マイナス３）のスコアを割り当てた。各パターンに対する示差的なスコアを表ＶＩＩに示す。パターン＃４は、最大スコアの−１００であった。これは、主に、一続きの４Ｇ又は４Ｃが合成に極めて不適合であり、配列を自己凝集させて、ｓｉＮＡを不活性にし得るので、一続きの４Ｇ又は４Ｃを含む配列を除去するためである。このアルゴリズムを用いて、任意のｓｉＮＡに可能な最高スコアは６６である。妥当なサイズ（約１０００ヌクレオチド）の任意の所与の標的に対して可能なｓｉＮＡ配列は多数あるので、このアルゴリズムは異常に活性なｓｉＮＡを作製するのに有用である。

一実施形態においては、表ＶＩＩに示す規則１−１１を用いて、本発明の活性なｓｉＮＡ分子を作製する。別の実施形態においては、表ＶＩＩに示す規則１−１２を用いて、本発明の活性なｓｉＮＡ分子を作製する。

ｓｉＮＡの設計
ｓｉＮＡ標的部位は、上記実施例３に記載した規則に基づいて、又は折りたたみ（標的へのｓｉＮＡの到達性を求めるために解析された任意の所与の配列の構造）に基づいて、標的配列を解析し、標的部位に優先順位を場合によっては付けることによって選択され、又は実施例３に記載したｓｉＮＡ分子のライブラリーを用いることによって選択され、又は本明細書の実施例６に記載するインビトロｓｉＮＡ系を用いることによって選択された。各標的に結合し得るｓｉＮＡ分子を設計した。ｓｉＮＡ分子を、上記アルゴリズムによって選択し、場合によっては、コンピュータ折りたたみによって個々に解析して、ｓｉＮＡ分子が標的配列と相互作用し得るか否かを判断する。ｓｉＮＡ分子の長さを変更して、活性を最適化するように選択することができる。一般に、標的ＲＮＡと結合又は相互作用するのに十分な数の相補ヌクレオチド塩基を選択するが、相補性の程度は、ｓｉＮＡ二本鎖又は種々の長さ又は塩基組成に適応するように調節することができる。かかる方法によって、任意の既知のＲＮＡ配列内、例えば、任意の遺伝子転写物に対応するＲＮＡ配列内の部位を標的にするようにｓｉＮＡ分子を設計することができる。

標的配列を解析して、二本鎖ｓｉＮＡを設計する元になる標的を作製する（表ＩＩ）。合成ｓｉＮＡ構築体を作製するために、実施例３に記載のアルゴリズムを利用して、活性な二本鎖構築体及びその化学修飾二本鎖構築体を選択する。例えば、表ＩＩにおいて、ｓｉＮＡ二本鎖の上側（センス鎖）及び下側（アンチセンス鎖）と一緒に標的配列を示す。異なる標的配列間の相同部位（例えば、相同性を共有した約５から約１５ヌクレオチド領域）を探索し、非標準塩基対（例えばＧ：Ｕゆらぎ塩基対形成）又は塩基対のミスマッチを考慮することによって、多官能ｓｉＮＡを設計する。

ＲＮＡｉ活性媒介能力を維持しながら、インビボでの全身投与のためのヌクレアーゼ安定性及び／又は改善された薬物動態学、局在化及び送達特性を備えるように、化学修飾ｓｉＮＡ構築体を本明細書に記載のとおりに設計した（例えば、表ＩＩＩ参照）。本明細書に記載の化学修飾を、本明細書に記載する合成方法、及び当分野で一般に公知である合成方法によって、合成的に導入する。次いで、合成ｓｉＮＡ構築体のヌクレアーゼ安定性を、血清及び／又は細胞／組織抽出物（例えば、肝臓抽出物）中で評価する。合成ｓｉＮＡ構築体のＲＮＡｉ活性も、本明細書に記載のルシフェラーゼレポーターアッセイ、ＲＮＡｉ活性を定量することができる別の適切なアッセイなどの適切なアッセイによって、並行して試験する。ヌクレアーゼ安定性とＲＮＡｉ活性の両方を有する合成ｓｉＮＡ構築体を更に修飾して、安定性及び活性のアッセイにおいて再評価することができる。次いで、安定化された活性ｓｉＮＡ構築体の化学修飾を、任意の選択ＲＮＡを標的にする任意のｓｉＮＡ配列に適用して、例えば標的スクリーニングアッセイに用いて、創薬のためのリードｓｉＮＡ化合物を選択することができる（例えば、図１１参照）。

ｓｉＮＡの化学合成、精製及び分析
ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡメッセージ中の種々の部位、例えば、本明細書に記載のＲＮＡ配列内の標的配列と相互作用するように設計することができる。ｓｉＮＡ分子の一方の鎖の配列は、上記標的部位配列に相補的である。ｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載の方法によって化学合成することができる。対照配列として用いられる不活性ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子の配列を標的配列に相補的でないようにスクランブルすることによって、合成することができる。一般に、ｓｉＮＡ構築体は、本明細書に記載の固相オリゴヌクレオチド合成方法によって合成することができる（例えば、参照によりその全体を本明細書に組込む、Ｕｓｍａｎ他、米国特許第５，８０４，６８３号、同５，８３１，０７１号、同５，９９８，２０３号、同６，１１７，６５７号、同６，３５３，０９８号、同６，３６２，３２３号、同６，４３７，１１７号、同６，４６９，１５８号、Ｓｃａｒｉｎｇｅ他、米国特許第６，１１１，０８６号、同６，００８，４００号、同６，１１１，０８６号参照）。

非限定的例においては、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、当分野で公知のホスホルアミダイト化学反応によって段階的に合成する。標準的なホスホルアミダイト化学反応は、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル、２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、３’−Ｏ−２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト基及び環外アミン保護基（例えば、Ｎ６−ベンゾイルアデノシン、Ｎ４ アセチルシチジン及びＮ２−イソブチリルグアノシン）のいずれかを含むヌクレオシドを使用する。或いは、Ｓｃａｒｉｎｇｅ（前掲）によって記述されたとおりに、２’−Ｏ−シリルエーテルを酸に不安定な２’−Ｏ−オルトエステル保護基と一緒に、ＲＮＡの合成に使用することができる。異なる２’化学反応は異なる保護基を必要とすることがあり、例えば、２’−デオキシ−２’−アミノヌクレオシドは、参照によりその全体を本明細書に組込む、Ｕｓｍａｎ他、米国特許第５，６３１，３６０号に記載のＮ−フタロイル保護を利用することができる。

固相合成中に、各ヌクレオチドを、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドに（３’から５’方向に）順次付加させる。鎖の３’末端の第１のヌクレオシドを、種々のリンカーによって固体支持体（例えば、ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ又はポリスチレン）に共有結合させる。ヌクレオチド前駆体、リボヌクレオシドホスホルアミダイト及び活性化物質を混合して、第１のヌクレオシドの５’末端に第２のヌクレオシドホスホルアミダイトを結合させる。次いで、支持体を洗浄し、未反応５’ヒドロキシル基を無水酢酸などのキャッピング試薬を用いてキャッピングして、不活性５’アセチル部分を得る。次いで、三価のリン結合を酸化して、より安定なリン酸結合にする。ヌクレオチド付加サイクルの最後に、５’−Ｏ−保護基を適切な条件下（例えば、トリチル系の基については酸性条件、シリル系の基についてはフッ化物）で切断する。後続の各ヌクレオチドについてこのサイクルを繰り返す。

合成条件を変更して、例えば、合成すべきｓｉＮＡの特定の化学組成に応じて、異なるカップリング時間、異なる試薬／ホスホルアミダイト濃度、異なる接触時間、異なる固体支持体及び固体支持体リンカー化学反応を用いることによって、カップリング効率を最適化することができる。ｓｉＮＡの脱保護及び精製は、一般に、参照によりその全体を本明細書に組込むＵｓｍａｎ他、米国特許第５，８３１，０７１号、同６，３５３，０９８号、同６，４３７，１１７号、及びＢｅｌｌｏｎ他、米国特許第６，０５４，５７６号、同６，１６２，９０９号、同６，３０３，７７３号、又はＳｃａｒｉｎｇｅ（前掲）に記載のとおりに実施することができる。さらに、脱保護条件を変更して、ｓｉＮＡ構築体の可能な最高の収率及び純度を得ることができる。例えば、出願人は、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが不適当な脱保護条件下で分解し得ることを認めた。かかるオリゴヌクレオチドは、メチルアミン水溶液を用いて、約３５℃で３０分間脱保護される。２’−デオキシ−２’−フルオロ含有オリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドも含む場合には、メチルアミン水溶液で約３５℃で３０分間脱保護した後、ＴＥＡ−ＨＦを添加して、反応物（ｒｅａｃｔｉｏｎ）を約６５℃で更に１５分間維持する。ｓｉＮＡの脱保護された一本鎖を、陰イオン交換によって精製して、高収率を維持しながら、高純度を得る。ｓｉＮＡ二本鎖分子を形成するために、一本鎖を食塩水中で等モル比で混合して、二本鎖を形成する。二本鎖ｓｉＮＡを濃縮し、クロスフロー（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）ろ過によって脱塩した後、凍結乾燥する。

ｓｉＮ組成物の製造
非限定的例においては、各ｓｉＮ組成物について、ｓｉＮＡの２本の個々の相補鎖を固相合成によって別々に合成し、次いでイオン交換クロマトグラフィーによって別々に精製する。相補鎖をアニールして、二重鎖（二本鎖）を形成する。次いで、二本鎖を限外ろ過し、凍結乾燥させて、固体ｓｉＮ組成物（例えば、薬剤組成物）を形成する。製造プロセスの非限定的例を表ＶＩＩＩの流れ図に示す。

固相合成
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ（例えば、Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ又はＯｌｉｇｏｐｉｌｏｔ １００ ｐｌｕｓ）などの自動固相合成装置を用いて一本鎖オリゴヌクレオチドをホスホルアミダイト化学反応によって合成する。調節可能な合成カラムに、第１のヌクレオシド残基を用いて誘導体化された固体担体を充填する。酸に不安定な５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基を脱トリチル化して、５’−ヒドロキシルを遊離させることによって合成を開始する。アセトニトリル中のホスホルアミダイト及び適切な活性化物質を合成カラムに同時に送達させて、アミダイトを５’−ヒドロキシルと結合させる。次いで、カラムをアセトニトリルで洗浄する。ヨウ素をカラムにポンプで注入して、亜リン酸トリエステル結合Ｐ（ＩＩＩ）をそのリン酸トリエステルＰ（Ｖ）類似体に酸化する。未反応５’−ヒドロキシル基を、無水酢酸などの試薬を用いて、２，６−ルチジン及びＮ−メチルイミダゾールの存在下でキャップする。次のホスホルアミダイトの組み入れのための脱トリチル化段階によって伸長サイクルを再開する。所望の配列が合成されるまで、このプロセスを繰り返す。合成の最後に末端ジメトキシトリチル基を除去する。

切断及び脱保護
合成終了後、固体支持体及び結合したオリゴヌクレオチドをフィルター漏斗に移し、減圧乾燥させ、反応器に移す。塩基水溶液を添加し、混合物を加熱して、スクシニル結合を切断し、シアノエチルリン酸保護基を除去し、環外アミン保護を脱保護する。

以下のプロセスを、リボヌクレオチドを含まない一本鎖上で実施する。すなわち、固体担体を塩基水溶液で処理した後、混合物を減圧ろ過して、脱保護された粗製合成材料から固体担体を分離する。次いで、固体担体を水でリンスし、その水をろ液と混合する。得られた塩基性溶液を酸で中和して、粗製一本鎖の溶液を得る。

以下のプロセスを、リボヌクレオチドを含む一本鎖上で実施する。すなわち、固体担体を塩基水溶液で処理した後、混合物を減圧ろ過して、脱保護された粗製合成材料から固体担体を分離する。次いで、固体担体をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）でリンスし、そのＤＭＳＯをろ液と混合する。混合物を冷却し、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩などのフッ化物試薬を添加し、溶液を加熱する。反応物を適切な緩衝剤でクエンチして、粗製一本鎖の溶液を得る。

陰イオン交換精製
各粗製一本鎖の溶液をクロマトグラフィー精製によって精製する。生成物を適切な緩衝剤勾配によって溶出させる。画分を密閉無菌容器に収集し、ＨＰＬＣによって分析し、適切な画分を混合して生成物のプールを得る。このプールの純度（ＨＰＬＣ）、アイデンティティ（ＨＰＬＣ）及び濃度（ＵＶ Ａ２６０）を分析する。

アニーリング
生成物のプールの分析に基づいて、（理論吸光係数を用いて計算した）等モル量のセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を反応器に移す。溶液を混合し、二本鎖の純度をクロマトグラフィー法によって分析する。分析によってどちらかの鎖が過剰であることが判明した場合、二本鎖形成（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）が完結するまで追加の非過剰の鎖を滴定する。分析によって標的生成物純度に達したことを確認し、濃縮・脱塩用のクロスフロー（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ）ろ過（ＴＦＦ）システムに材料を移送する。

限外ろ過
アニールした生成物溶液を、適切な分子量カットオフ膜を備えたＴＦＦシステムによって濃縮する。濃縮後、生成物溶液を、注射用水品質の水（ＷＦＩ ｑｕａｌｉｔｙ ｗａｔｅｒ）を用いた透析ろ過によって、ろ液の伝導率が水の伝導率になるまで脱塩する。

凍結乾燥
濃縮溶液を棚状凍結乾燥器中の無菌トレーに移す。次いで、生成物を凍結乾燥させて粉末にする。トレーを凍結乾燥器から取り出し、包装用のクラス１００ Ｌａｍｉｎａｒ Ａｉｒ Ｆｌｏｗ（ＬＡＦ）フードに移す。

薬物物質の包装
凍結乾燥生成物を含む凍結乾燥器トレーをクラス１００ ＬＡＦフード中で開ける。生成物を適切なサイズの無菌容器に移し、次いで密封し、標識する。

薬物物質容器密封システム
凍結乾燥薬物物質のバルクを無菌キャップの付いた無菌ナルゲン容器に詰める。使用する瓶のサイズは、その中に入れる材料の量によって決まる。充填後、各瓶をポリエチレンテープで更に密封する。

分析法及び仕様
原材料及び製造過程の方法
原材料を同定した後、薬物物質製造プロセスに導入する。薬物物質分子に組み入れる重要な原材料を、純度試験又はアッセイ試験によって、適宜、更に試験する。製造過程の試料を、製造プロセスの重要な制御ポイントにおいて試験して、最終薬物物質の品質をモニターし、保証する。

薬物物質分析法及び仕様
オリゴヌクレオチドの分析法及び受入れ基準を採用する規則（Ｃｏｎｔｒｏｌｓ）を確立した後に、バルクｓｉＮ組成物の臨床試験を実施する。以下の試験方法及び受入れ基準は、これらの規則の例を反映している。表ＩＸに、ｓｉＮＡ薬剤組成物の材料仕様例を要約する。

分析法の概要
同定（ＩＤ）試験
ＩＤオリゴヌクレオチド主ピーク：薬物物質をクロマトグラフィー法によって同定する。この測定に用いるデータをＨＰＬＣ試験方法の１つによって作成する（純度試験参照）。薬物物質試料と標準注射のピーク保持時間を比較する。薬物物質の同定は、主ピーク保持時間を好適に比較することによって裏づけられる。

分子量：薬物物質を分光学的方法によって同定する。酢酸アンモニウム水溶液を用いた沈殿によって、分析用の薬物物質試料を調製する。薬物物質の分子量を質量分析法によって測定する。試験を、理論分子量から得られる設定原子質量単位数内で制御する。

融解温度：この方法によって、二本鎖薬物の融解温度（Ｔｍ）を測定して薬物物質の同定を裏づける。溶液試料を加熱しながら、溶液の紫外（ＵＶ）吸光度をモニターする。吸光度は、二本鎖が一本鎖に解離することによって増加するので、Ｔｍは、吸光度曲線の変曲点によって示される。

アッセイ試験
オリゴヌクレオチド含量：このアッセイによって、薬物物質中の総オリゴヌクレオチド含量を測定する。オリゴヌクレオチドは、極大値２６０ｎｍのＵＶ光を吸収する。存在するオリゴヌクレオチド種は、残留一本鎖を含めて、二本鎖ｓｉＲＮＡ生成物、及び製造プロセスから得られる他の副次的な関連オリゴヌクレオチド物質からなる。薬物物質試料を正確に計量し、溶解させ、体積測定によって水で希釈する。吸光度を、ＵＶ分光光度計を用いて石英セル中で測定する。総オリゴヌクレオチドアッセイ値を、実験によって測定された実用標準（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｔａｎｄａｒｄ）のモル吸光係数を用いて計算し、固体薬物物質１ミリグラム当たりのナトリウムオリゴヌクレオチドのマイクログラム単位で記録する。

純度試験：１つ以上のクロマトグラフィー法によって純度を測定する。存在する薬物物質の核酸類似体の分離及び数に応じて、直交分離（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）法によってＡＰＩの純度をモニターすることができる。分離は、以下の手段によって実施することができる。

ＳＡＸ−ＨＰＬＣ：オリゴヌクレオチドリン酸ジエステルと分離用緩衝塩勾配を用いた強陰イオン交換ＨＰＬＣカラムとのイオン交換相互作用。

ＲＰ−ＨＰＬＣ：緩衝剤水溶液と有機溶媒との分離用勾配を用いた疎水性逆相ＨＰＬＣカラムと、オリゴヌクレオチドとの分配相互作用。

キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）：ゲル充填キャピラリー内の緩衝液中での分子ふるいによる電気泳動的分離。分離は、電場をかけると起こり、陰イオン性オリゴヌクレオチドは、ゲルマトリックスを通って移動する際に分子サイズによって分離される。すべての分離方法において、ピークは、オリゴヌクレオチド長の順で一般に溶出し、２６０ｎｍのＵＶによって検出される。

他の試験
物理的外観：薬物物質試料を目視検査する。この試験によって、材料が凍結乾燥固体の特性を有することを判定し、固体の色を確認し、可視汚染物質が存在するかどうかを判定する。

菌体内毒素試験：菌体内毒素試験は、９６ウェルプレートにおいて比濁時間分析法を用いたカブトガニの血球抽出成分（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ）（ＬＡＬ）アッセイによって実施される。賦形剤と混合したときに、投与した薬物製品中の内毒素の１日当たりの許容限界を超えないように、薬物物質に対する内毒素の限界を適切に設定する。

好気性生物汚染度（Ａｅｒｏｂｉｃ ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）：好気性生物汚染度は、ＵＳＰ＜６１＞章に基づく方法を用いて、契約した検査室によって実施される。

アセトニトリル含量：残留アセトニトリル分析は、契約した検査室によってガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて実施される。幾つかの他の有機試薬を合成に使用するものの、アセトニトリルは、上流の合成段階に用いられる主要な有機溶媒である。それに続く精製プロセス段階によって、薬物物質中の溶媒が典型的には除去される。他の溶媒は、プロセス開発作業（ｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｗｏｒｋ）の結果に応じてモニターすることができる。溶媒をＩＣＨ限界内に制限する。

含水量：固体エバポレーター装置（オーブン）を用いた体積測定カールフィッシャー（ＫＦ）滴定によって含水量を測定する。水は、典型的には、組成物の数重量パーセントとして核酸薬物物質中に存在し、したがって、モニターされる。

ｐＨ：水で戻した薬物物質のｐＨをモニターして、ヒトの注射に確実に適するようにする。

イオン含量：ナトリウム、塩化物及びホスファートの試験は、契約した検査室によって標準原子吸光及びイオンクロマトグラフィー法を用いて実施される。イオンの一般的モニタリングを実施して、薬物物質を組み入れた薬物製品の重量オスモル濃度が確実に生理学的許容範囲内にあるようにする。

金属含量：関係する金属の試験は、契約した検査室によって、標準の分析方法である誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）分光法を用いて実施される。

ｓｉＮＡ活性を評価するＲＮＡｉインビトロアッセイ
ＲＮＡｉを無細胞系において再現する（ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ）インビトロアッセイによって、標的ＲＮＡ標的を標的にするｓｉＮＡ構築体を評価する。このアッセイは、標的ＲＮＡを用いた使用に適合させた、Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １３， ３１９１−３１９７及びＺａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｃｅｌｌ， １０１， ２５−３３に記載の系を含む。シンシチウム胚盤葉に由来するショウジョウバエ抽出物を用いて、ＲＮＡｉ活性をインビトロで再構成する。標的ＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて適切な標的発現プラスミドからインビトロで転写することによって、又は本明細書に記載の化学合成によって、作製される。センスとアンチセンスの各ｓｉＮＡ鎖（例えば、各２０ｕＭ）を、（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウムなどの）緩衝剤中で９０℃で１分間、続いて３７℃で１時間インキュベートすることによってアニールし、次いで溶解緩衝剤（例えば、１００ｍＭ酢酸カリウム、ｐＨ７．４の３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、２ｍＭ酢酸マグネシウム）で希釈する。アガロースゲル上でＴＢＥ緩衝剤を用いてゲル電気泳動させ、臭化エチジウムで染色することによって、アニーリングをモニターすることができる。酵母菌を入れた（ｙｅａｓｔｅｄ）糖蜜寒天上に収集し、じゅう毛膜を除去し、溶解させた、Ｏｒｅｇｏｎ Ｒハエ由来の０から２時間齢の胚を用いて、ショウジョウバエ溶解物を調製する。この溶解物を遠心分離し、上清を単離する。アッセイは、５０％溶解物［ｖｏｌ／ｖｏｌ］と、ＲＮＡ（最終濃度１０−５０ｐＭ）と、ｓｉＮＡ（最終濃度１０ｎＭ）含有１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］溶解緩衝剤とを含有する反応混合物を含む。反応混合物は、１０ｍＭクレアチンリン酸、１０ｕｇ／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ、１００ｕｍ ＧＴＰ、１００ｕＭ ＵＴＰ、１００ｕＭ ＣＴＰ、５００ｕＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１Ｕ／ｕＬ ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び各アミノ酸１００ｕＭも含む。酢酸カリウムの最終濃度を１００ｍＭに調節する。反応物を氷上で前もって集め、２５℃で１０分間プレインキュベートした後、ＲＮＡを添加し、次いで２５℃で更に６０分間インキュベートする。反応物を１．２５×Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）４体積でクエンチする。標的ＲＮＡの切断をＲＴ−ＰＣＲ分析、又は当分野で公知の他の方法によって評価し、ｓｉＮＡが反応から省略されている対照反応と比較する。

或いは、アッセイ用に内部標識した標的ＲＮＡを、［アルファ−^３２Ｐ］ＣＴＰの存在下でのインビトロ転写によって調製し、スピンクロマトグラフィーによってＧ５０ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムに通し、更に精製せずに標的ＲＮＡとして用いる。場合によっては、標的ＲＮＡを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて５’−^３２Ｐ末端標識してもよい。アッセイを上述のとおりに実施し、標的ＲＮＡ、及びＲＮＡｉによって生成する特定のＲＮＡ切断産物をゲルのオートラジオグラフ上で可視化する。切断割合は、完全な対照ＲＮＡ、又はｓｉＮＡのない対照反応から得られたＲＮＡ、及びアッセイによって生成した切断産物の各バンドをＰＨＯＳＰＨＯＲ ＩＭＡＧＥＲ（登録商標）（オートラジオグラフィー）で定量することによって、求められる。

一実施形態においては、このアッセイによって、ｓｉＮＡによって媒介されるＲＮＡｉ切断のための標的ＲＮＡ標的中の標的部位を決定する。ここで、例えば、標識した標的ＲＮＡの電気泳動によりアッセイ反応を分析することによって、又はノーザンブロット法によって、また、当分野で周知である他の方法によって、ＲＮＡｉによって媒介される標的ＲＮＡ標的の切断について、複数のｓｉＮＡ構築体をスクリーニングする。

ＨＣＶ標的ＲＮＡのインビボでの核酸阻害
ヒトＨＣＶ ＲＮＡを標的にしたｓｉＮＡ分子を、上述したとおりに設計し、合成する。これらの核酸分子のインビボでの切断活性を、例えば、以下の手順によって試験することができる。ＨＣＶ ＲＮＡ内の標的配列及びヌクレオチドの位置を表ＩＩ及びＩＩＩに示す。

２つの形式によって、ＨＣＶを標的にするｓｉＮＡの効力を試験する。まず、試薬を、例えばヒト肝細胞癌（Ｈｕｈ７）細胞を用いて、細胞培養において試験して、ＲＮＡ及びタンパク質の阻害の程度を求める。ｓｉＮＡ試薬（例えば、表ＩＩ及びＩＩＩ参照）を、本明細書に記載のＨＣＶ標的に対して選択する。適切な移入剤を用いてこれらの試薬を、例えば、培養した表皮角化細胞に送達した後に、ＲＮＡ阻害を測定する。アクチンに対する標的ＲＮＡの相対量を、増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング（例えば、ＡＢＩ ７７００ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））によって測定する。無関係な標的に対して作製された各オリゴヌクレオチド配列の混合物を比較し、又は同じ全長及び化学的性質を有するが、各位置で無作為に置換された無作為化ｓｉＮＡ対照を比較する。一次及び二次リード試薬を標的に対して選択し、最適化を実施する。最適な移入剤濃度を選択後、ＲＮＡの経時阻害をリードｓｉＮＡ分子を用いて実施する。また、細胞プレーティング形式を用いて、ＲＮＡ阻害を求めることができる。

また、細胞プレーティング形式を用いて、ＲＮＡ阻害を求めることができる。このシステムは、参照により本明細書に組込む、Ｒｉｃｅ他、米国特許第５，８７４，５６５号及び同６，１２７，１１６号に記載されている。

細胞へのｓｉＮＡの送達
ＨＣＶサブゲノムレプリコンＣｌｏｎｅ Ａ又はＡｖａ．５を安定に移入したＨｕｈ７ｂ細胞を、例えば、９６ウェルプレートの１ウェル当たり８．５×１０^３細胞で、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に移入前日に播種する。ｓｉＮＡ（最終濃度、例えば２５ｎＭ）と陽イオン性脂質Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（例えば、最終濃度０．５ｕｌ／ウェル）を、ポリプロピレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｅｌｙｎｅ）ミクロチューブ中のＯｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ）中で３７℃で２０分間複合化する。ボルテックス撹拌後、複合化したｓｉＮＡを各ウェルに添加し、２４−７２時間インキュベートする。

ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング）及びＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒによるｍＲＮＡの定量
ｓｉＮＡ送達後、例えば、６ウェルアッセイ用Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡ精製キット又は９６ウェルアッセイ用Ｒｎｅａｓｙ抽出キットを用いて、細胞から全ＲＮＡを調製する。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分析（増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング）の場合、５’末端に共有結合したレポーター色素ＦＡＭ又はＪＯＥ、及び３’末端に結合したクエンチャー色素ＴＡＭＲＡを用いて、二重標識プローブを合成する。１段階ＲＴ−ＰＣＲ増幅は、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用い、全ＲＮＡ １０μｌ、１００ｎＭフォワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー、１００ｎＭプローブ、１×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応緩衝剤（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、５．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、１０Ｕ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１．２５Ｕ ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤ（登録商標）（ＤＮＡポリメラーゼ）（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０Ｕ Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）からなる反応物５０μｌを用いて実施される。温度サイクル条件は、４８℃３０分間、９５℃１０分間、続いて９５℃１５秒間と６０℃１分間を４０サイクルからなり得る。ｍＲＮＡレベルを、段階希釈した全細胞ＲＮＡ（３００、１００、３３、１１ｎｇ／反応）から作製した標準に対して定量し、並行したＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応（増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング）におけるβアクチン又はＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して標準化する。各目的遺伝子について、上側プライマーと下側プライマー及び蛍光標識プローブを設計する。特定のＰＣＲ産物へのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ色素の実時間取り込みは、ガラスキャピラリー管中でｌｉｇｈｔｃｙｌｅｒを用いて測定することができる。各プライマー対に対する検量線を、対照ｃＲＮＡを用いて作成する。値は、各試料におけるＧＡＰＤＨに対する相対発現として表される。

ウエスタンブロット法
ｓｉＮＡ送達後、例えば、大規模抽出用Ａｍｂｉｏｎ Ｒｎａｑｕｅｏｕｓ ４−ＰＣＲ精製キット、又は９６ウェルアッセイ用Ａｍｂｉｏｎ Ｒｎａｑｕｅｏｕｓ−９６精製キットを用いて、全ＲＮＡを細胞から調製する。Ｔａｑｍａｎ分析の場合、例えば、５’末端に共有結合したレポーター色素ＦＡＭ又はＶＩＣ、及び３’末端に抱合されたクエンチャー色素ＴＡＭＡＲＡを用いて、二重標識プローブを合成する。１段階ＲＴ−ＰＣＲ増幅は、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用い、全ＲＮＡ １０ｕｌ、１００ｎＭフォワードプライマー、１００ｎＭリバースプライマー、１００ｎＭプローブ、１×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応緩衝剤（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、５．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｕＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、０．２Ｕ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．０２５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び０．２Ｕ Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）からなる反応物５０ｕｌを用いて実施される。温度サイクル条件は、４８℃３０分間、９５℃１０分間、続いて９５℃１５秒間と６０℃１分間を４０サイクルからなり得る。標的ｍＲＮＡレベルを、段階希釈した全細胞ＲＮＡ（３００、１００、３０、１０ｎｇ／ｒｘｎ）から作製した標準に対して定量し、例えば、並行した、又は同じ管のＴａｑＭａｎ反応における３６Ｂ４ ｍＲＮＡに対して標準化する。ＨＣＶレプリコンｍＲＮＡの定量化の場合、ネオマイシン遺伝子に特異的であるＰＣＲプライマー及びプローブを使用した。

ネオフォワード（ｎｅｏ−ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー、５’−ＣＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣ−３’；（配列番号２１５０）
ネオリバース（ｎｅｏ−ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー、５’−ＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＡＡＧ−３’；（配列番号２１５１）
ネオプローブ（ｎｅｏ−ｐｒｏｂｅ）、５’ＦＡＭ−ＡＣＡＴＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＧＡＧＣＡＣＧＴＡＣ−ＴＡＭＡＲＡ３’；（配列番号２１５２）

標準化用に３６Ｂ４ ＰＣＲプライマー及びプローブを用いた。
３６Ｂ４−フォワードプライマー、５’−ＴＣＴＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧＧＧＴＡＣＡＡＡＣＧＡ−３’；（配列番号２１５３）
３６Ｂ４リバースプライマー、５’−ＣＴＴＴＴＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧ−３’；（配列番号２１５４）
３６Ｂ４プローブ、５’ＶＩＣ−ＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＡＴＴＡ−ＴＡＭＡＲＡ３’；（配列番号２１５５）

ＨＣＶ遺伝子発現の下方制御の評価に有用であるモデル
細胞培養
細胞培養によるＨＣＶの複製の報告はあるが（下記参照）、これらのシステムは再現が困難であり、信頼できないことが証明された。したがって、インターフェロン、リバビリンなどの他の抗ＨＣＶ治療法の開発の場合と同様に、動物試験における安全性が実証された後に、本出願人は臨床的な実行可能性調査に直接進むことができる。

幾つかの最近の報告は、ヒト細胞系におけるＨＣＶのインビトロでの成長を記述している（Ｍｉｚｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９６ ２２７（３）：８２２−８２６；Ｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９５ １０（５）：５２３−５２７；Ｃｒｉｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６（１０）：２４８５−２４９１；Ｓｅｉｐｐ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９７ ７８（１０）２４６７−２４７８；Ｉａｃｏｖａｃｃｉ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９７ １４８（２）：１４７−１５１；Ｉｏｃａｖａｃｃｉ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９７ ２６（５） １３２８−１３３７；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９６ ７７（５）：１０４３−１０５４；Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９６ ７０（５）：３３２５−３３２９；Ｍｉｚｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９６ ７０（１０）：７２１９−７２２３；Ｖａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓ Ｖｉｒｏｌ １９９５ １４６（４）：２８５−２８８；Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ １９９５ ２０６（３）：８６３−８６９）。ＨＣＶの複製は、Ｔ及びＢ細胞系、並びにヒト肝細胞に由来する細胞系において報告されている。ＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイ又はｂ−ＤＮＡアッセイを用いた低レベル複製の検出が記述されている。ＨＣＶ細胞培養に関する最も最近の刊行物が最高６か月間の複製を記述していることは注目に値する。しかし、これらの細胞系において観察されるＨＣＶ複製レベルは、抗ウイルス性化合物のスクリーニングに十分なほど堅牢ではない。

ＨＣＶに感染し得る細胞系に加えて、幾つかのグループは、完全長又は部分的なＨＣＶゲノムのｃＤＮＡクローンを用いて、細胞系の形質転換に成功したと報告している（Ｈａｒａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９９５， ７６（５）１２１５−１２２１；Ｈａｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ １９９７ ４Ｓ（１）：６１−６７；Ｄａｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９９７ １５１（２）：３６３−３７３；Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９９５ １０９（６）：１９３３−４０；Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９５ ６９（１）：３２−３８）。

ヒト肝細胞癌細胞系Ｈｕｈ７において首尾よく複製することができるサブゲノムＨＣＶ ＲＮＡレプリコンの最近の開発は、信頼できる細胞培養モデルに向けた意義深い進歩である。これらのレプリコンは、ＨＣＶ非構造遺伝子の上流のネオマイシン遺伝子を含み、Ｈｕｈ７細胞における複製ＲＮＡの選択が可能である。当初、ＲＮＡ複製の検出は低頻度であったが（Ｌｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９ ２８５：１１０−１１３）、細胞に適応性のある変異をＮＳ５Ａ領域に有するレプリコンが特定されて、複製効率が１０，０００倍向上した（Ｂｌｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００ ２９０：１９７２−１９７５）。翻訳、タンパク質プロセシング、ＲＮＡ複製などのＨＣＶ生活環における各段階は、サブゲノムレプリコン系において再現されるが、初期の現象（ウイルスの付着及び脱外被）及びウイルスの組立てが欠如している。レプリコン内にＨＣＶの構造遺伝子が含まれる結果、ＨＣＶコア及びエンベロープタンパク質が生成されるが、ウイルスの組立ては起こらない（Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００２ ７６：４００８−４０２１）。かかるレプリコン系は、ｓｉＲＮＡによって媒介されるＨＣＶ ＲＮＡの阻害を試験するのに使用される。例えば、Ｒａｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００３， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， １００， ２３５−２４０を参照されたい。

幾つかの細胞培養系においては、陽イオン性脂質は、培養細胞に対するオリゴヌクレオチドの生物学的利用能を高めることが示された（Ｂｅｎｎｅｔ， ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ４１， １０２３−１０３３）。一実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子を細胞培養実験用に陽イオン性脂質と複合化する。ｓｉＮＡと陽イオン性脂質の混合物を、細胞に添加する直前に、無血清ＤＭＥＭ中で調製する。ＤＭＥＭと添加剤を室温（約２０−２５℃）に加温し、陽イオン性脂質を所望の最終濃度まで添加し、溶液を短時間ボルテックス撹拌する。ｓｉＮＡ分子を所望の最終濃度まで添加し、溶液を再度、短時間ボルテックス撹拌し、室温で１０分間インキュベートする。１０分間のインキュベーション後、用量反応実験では、ＲＮＡ／脂質複合体をＤＭＥＭ中に段階希釈する。

動物モデル
抗ＨＣＶ剤の効力を動物モデルで評価することは、ヒト臨床試験に対する重要な必要条件である。ＨＣＶ感染に対して特性が最も明らかな動物系はチンパンジーである。さらに、ＨＣＶ感染に起因する慢性肝炎は、チンパンジーとヒトで極めて類似している。臨床的には関連しているが、チンパンジーモデルは、このモデルの使用を困難にする幾つかの実用上の障害がある。この障害としては、価格が高いこと、長時間のほ育が必要なこと、動物の数が不十分なことなどが挙げられる。これらの要因のために、幾つかのグループは、Ｃ型慢性肝炎感染症のげっ歯類モデルを開発しようとしている。直接感染はまだ可能ではないが、幾つかのグループは、ＨＣＶゲノム全体又は一部をげっ歯類に安定に移入したことを報告している（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９５ ２２（３）：８４７−８５５；Ｇａｌｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ １９９５ １７２（１）：２５−３０；Ｋｏｉｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９５ ７６（１２）３０３１−３０３８；Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９７ ２５（３）：７１９−７２７；Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｉｎｃｅｓｓ Ｔａｋａｍａｔｓｕ Ｓｙｍｐ １９９５ ２５：１４３０１４９；Ｍａｒｉｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９７ ７８（７） １５２７−１５３１；Ｔａｋｅｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９５ ２１（３）：７４６−７５１；Ｋａｗａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９７ ２５（４）：１０１４−１０２１）。また、ＨＣＶ感染したヒトの肝臓を免疫無防備状態のマウスに移植すると、動物の血液中にＨＣＶ ＲＮＡが長期間検出される。

Ｃ型肝炎ウイルスをインビボ動物モデルで発現させる方法が開発された（Ｖｉｅｒｌｉｎｇ、国際公開第９９／１６３０７号）。ＨＣＶに感染した生存可能なヒト肝細胞をｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス宿主の肝実質に移植する。次いで、ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス宿主を生存可能な状態で維持する。それによって、生存可能な形態学的に無傷のヒト肝細胞がドナー組織中で存続し、存続するヒト肝細胞中でＣ型肝炎ウイルスが複製される。このモデルは、酵素的核酸によるインビボでのＨＣＶ阻害の有効な試験手段である。

したがって、これらのモデルを用いて、本発明のｓｉＮＡ分子のＨＣＶ発現阻害効力を評価することができる。これらのモデル及び他のモデルを同様に用いて、本発明のｓｉＮＡ分子の安全性及び効力を前臨床環境で評価することができる。

ＲＮＡｉによって媒介される標的遺伝子発現の阻害
インビトロでｓｉＮＡによって媒介される標的ＲＮＡの阻害
ｓｉＮＡ構築体（表ＩＩＩ）のＨＣＶ ＲＮＡ発現抑制効力を、例えばＨｕｈ７細胞において試験する。移入の時点で細胞が７０−９０％コンフルエントであるように、移入の約２４時間前に、９６ウェルプレートに５，０００−７，５００細胞／ウェル、１００μｌ／ウェルで細胞を蒔く。移入のために、アニールしたｓｉＮＡを体積５０μｌ／ウェルの移入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、室温で２０分間インキュベートする。ｓｉＮＡ移入混合物を細胞に添加して、体積１５０μｌ中の最終ｓｉＮＡ濃度を２５ｎＭとする。各ｓｉＮＡ移入混合物を、３つ組のｓｉＮＡ処理用に３個のウェルに添加する。ｓｉＮＡ移入混合物が連続して存在する下で、細胞を３７°で２４時間インキュベートする。２４時間後、処理細胞の各ウェルからＲＮＡを調製する。移入混合物を含む上清をまず取り出して廃棄し、次いで細胞を溶解させ、各ウェルからＲＮＡを調製する。処理後の標的遺伝子発現を、標的遺伝子及び標準化用対照遺伝子（３６Ｂ４、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット）についてＲＴ−ＰＣＲによって評価する。３つ組データを平均し、標準偏差を各処理について求める。標準化したデータをグラフにし、活性ｓｉＮＡによる標的ｍＲＮＡの減少割合を、それぞれの逆対照（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ）ｓｉＮＡと比較して求める。

マモセットにおけるｓｉＮＡ分子の評価
ＧＢＶ−Ｂは、ヒトＣ型肝炎ウイルスに極めて密接に関係し、タマリン及びマモセットにおいて肝炎を起こす。したがって、ＧＢＶ−Ｂは、ＨＣＶ感染症に対する抗ウイルス性化合物及びワクチンを試験するための小動物モデルとなる。この試験によって、ＨＣＶ ＲＮＡ部位２９３及び３１６を標的にしたＬＮＰ調合二本鎖ｓｉＮＡ分子の効力を試験した。ＧＢＶ−Ｂモデルは、この療法が、ＨＣＶに慢性的に感染したヒトに対して作用する可能性があるかどうかを試験するための優れた系である。

試験では、２匹の動物にＧＢＶ−Ｂを接種し、３ｍｇ／ｋｇの活性調合ｓｉＮＡ（Ｓｉｒｎａ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｎｏｓ．３３１４９／４７６７７及び３１７０３／３８７５６、Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ＬＮＰ−０８６；表ＩＩＩ及びＶＩ参照）を用いたＩＶ治療を感染翌日に開始した。活性組成物を２００５年１１月１５日に出願された米国仮出願第６０／７３７，０２４号に記載のとおりに処方した。別の２匹の動物にＧＢＶ−Ｂを接種し、無処置の負の対照とした。動物をモニターして、ＧＢＶ−Ｂ感染療法の効果を判定した。試験の間に採血してウイルス力価を測定した。処置動物における調合ｓｉＮＡの投薬を、第０日の接種後１、３及び７日に繰り返した。これらの動物は、無処置の対照動物と比較して、著明なＧＢＶ−Ｂ阻害を３週間示す（図３０参照）。また、ＧＢＶ感染症の定着した動物を、感染後２８、３１及び３５日に活性調合ｓｉＮＡ（Ｓｉｒｎａ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｎｏｓ．３３１４９／４７６７７及び３１７０３／３８７５６、Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ＬＮＰ−０８６；表ＩＩＩ及びＶＩ参照）で処理した。この動物は、履歴的に（ｈｉｓｔｏｒｉｃ）無処置の対照と比較して、活性化合物の投薬後に、ウイルス力価が検出限界まで減少した（図３１参照）。

チンパンジーにおけるｓｉＮＡ分子の評価
この試験によって、ＨＣＶ感染チンパンジーにおける二本鎖核酸抗ウイルス性調合物のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）複製抑制能力を評価する。化合物調合物は、ＨＣＶウイルスゲノム向けのｓｉＮＡを含み、ＲＮＡ干渉によるウイルスＲＮＡの分解を媒介する。化合物をＩＶ投与する。使用するチンパンジーをＨＣＶ慢性動物群から選択する。試験を、薬物動態学と効力の二相で実施する。

試験の薬物動態学の部分を２匹の非ＨＣＶ感染動物で実施する。血液試料を０、１５分、３０分、２４時間、並びに第３、７及び１４日に得る。肝臓生検を２４時間及び第１４日に得る。効力は、２匹以上のＨＣＶ感染チンパンジーにおいて抗ウイルス性化合物を試験する必要がある。

動物に抗ウイルス性ｓｉＮＡ調合物のＩＶ注射を毎週４回行う。血液試料を第−４、−２及び０週、次いで６週間毎週、次いで更に４週間隔週で得る。肝臓生検を−４週及び＋４週に得る（最後の注射から１週間後）。血液及び組織試料採取スケジュールを下に示す。動物の血液化学及びＣＢＣを全採血時にモニターする。重大な有害作用の徴候があった場合には、処理を中止する。各動物に対して、血清中のウイルスＲＮＡレベルをモニターするのに合計１１個の血液試料が必要である。肝臓の針生検は、肝臓におけるウイルスＲＮＡ量、肝臓を標的にしたｓｉＮＡ化合物レベル、ｓｉＮＡによって誘導されるウイルスＲＮＡ分解生成物の存在、及び肝臓遺伝子発現の変化の分析のために２つの時点で必要である。ウイルスＲＮＡを実時間ＴａｑＭａｎ定量ＲＴ−ＰＣＲによってモニターする。血清試料を２つ組で抽出し、四つ組で操作する。肝臓ＲＮＡレベルを２つ組で操作する。

２匹の非感染チンパンジーにおけるＳＩＮＡ ＰＫ試験スケジュール

血液、Ｌａｎｆｏｒｄ Ｌａｂ．向け１×ＳＳＴ管。凍結１ｍｌ一定分量に加工。
凍結生検。

２匹のＨＣＶ慢性チンパンジーにおけるＳＩＮＡ効力試験スケジュール

血液、Ｌａｎｆｏｒｄ Ｌａｂ．向け２×ＳＳＴ管。凍結１ｍｌ一定分量に加工。
凍結生検。半分に分割。ウイルスＲＮＡ用にＲＮＡｚｏｌを用いてＲＮＡの半分を加工。

インターフェロン未処置及び処置の慢性ＨＣＶ感染患者における、ＳＩＲＮＡ−ＡＶ３４の単回及び複数回投与の安全性、耐容性、ＰＫ、ＰＤ及び抗ウイルス効果
この試験の主目的は、ＨＣＶ陽性患者におけるＳｉｒｎａ−０３４の単回及び複数回投与のＭＴＤを確立することである。二次的な目的は、Ｓｉｒｎａ−０３４の単回投与及び定常状態薬物動態学を評価すること、Ｓｉｒｎａ−０３４の単回及び複数回投与の薬力学を評価すること、並びにウイルス複製及び感染力の各指数に対するＳｉｒｎａ−０３４の単回及び複数回投与の効果を評価することである。

これは、慢性Ｃ型肝炎感染症及び代償性肝機能の患者における、Ｓｉｒｎａ−０３４の第Ｉ／ＩＩ相無作為二重盲検プラセボ対照、単回及び複数回投与漸増試験である。適格性判定基準を満足する患者は、試験のＳＡＤ部のための連続した４−６グループに登録される。各患者は、治療投与のために臨床研究ユニットに入院し、研究者によって更なる集中モニタリングが必要であると考えられない限り、投薬から３６時間後に退院する。患者は、更に５日間毎日来院し、投薬後３０日間、ＳＡＥについての経過観察の電話を受ける。用量漸増は、先行グループの安全性パラメータ（理学的検査所見、生命徴候、有害事象及び検査値）に依存する。

ＳＡＤフェーズについてのスクリーニング時には、患者は、血清化学、血液学、凝固パラメータ、血清ベータＨＣＧ（女性のみ）、ＨＩＶ抗体状態、ＨＢｓＡｇ、アルファフェトプロテイン、定量的ＨＣＶウイルスＲＮＡ及びＨＣＶ遺伝子型同定の評価のためにしゃ血し、尿検査用の尿を提供する。治療期中に、臨床検査室（化学的性質、血液学、凝固パラメータ及び尿検査）を投薬前（ｐｒｅ−ｄｏｓｅ）、並びに投薬から２４時間、３日及び６日後に評価する。ＥＣＧを投薬前、並びに投薬から４−６時間及び６日後に評価する。理学的検査を投薬前、及び投薬から６日後に実施する。ＰＫ分析用血清試料を投薬前、並びに投薬から３０分、１、２、３、４、６、８、１２、２４及び３６時間、２、３、４、５及び６日後に収集する。ウイルスＲＮＡ、及びウイルス感染価の潜在的な別のマーカーの評価を投薬前、並びに投薬から１、２、３、４、５及び６日後に実施する。

忍容性が良好であるＳｉｒｎａ−０３４の投与によって、ウイルス量が約９０％減少することを測定した後に、患者は試験のＭＡＤ部に登録される。ＭＡＤフェーズに参加するために選択された、試験のＳＡＤ部からの患者は、間欠期履歴（ｉｎｔｅｒｖａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ）、理学的検査、臨床検査室評価及び定量的ＨＣＶウイルスＲＮＡからなる一部の再スクリーニングを受ける。新しい登録者は、上記ＳＡＤフェーズで概説した全部の再スクリーニングを受ける。毎週１回の投与計画に登録された患者は、最後の投薬から７日後、試験場所を毎週４回訪れ、最後の投薬から３０日後、ＳＡＥについての電話を受ける。隔週投与計画に無作為化された患者は、試験場所を２回訪れ、類似の治療後経過観察を受ける。用量漸増は、先行グループの安全性パラメータ（理学的検査所見、生命徴候、有害事象及び検査値）に依存する。

ＭＡＤ治療期中に、臨床検査室（化学的性質、血液学、凝固パラメータ及び尿検査）を各投薬前、及び最後の投薬から７日後に評価する。ＥＣＧを最初の投薬前、及び最後の投薬から７日後に評価する。理学的検査を投薬前、最後の投薬後、及び最後の投薬から７日後に実施する。ＰＫ分析用血清試料を投薬前、最初の投薬から２、４、８、１２及び２４時間、それに続く各投薬前、並びに最後の投薬から２、４、８、１２、２４時間及び７日後に収集する。ウイルスＲＮＡ、及びウイルス感染価の潜在的な別のマーカーの評価を最初の投薬前、次いで最後の投薬から最高７日後まで毎週実施する。

診断、及び算入／除外の主な判定基準：
妊娠の可能性のない男性及び女性；１８から６０歳；ＨＣＶ陽性；スクリーニング時、及び過去６か月以内に更に１回、ＡＬＴが高いこと；ＨＩＶ陰性；ＨＢｓＡｇ陰性；正常なＰＴ、ＰＴＴ、ヘモグロビン、ビリルビン、アルブミン及びアルファフェトプロテイン；血小板数＞１００Ｋ；肝疾患の他の既知の原因がないこと；インターフェロン未処置、インターフェロン後再発又はインターフェロン非応答者。

投与量及び投与方法：
ＩＶ注射液、Ｓｉｒｎａ−０３４ ０．１から１０ｍｇ／ｍｌ。試験のＳＡＤ部の場合、開始用量はＴＢＤであるが、４週間のサル毒物学試験から得られたＮＯＡＥＬの１／５０と推定される。用量をＭＴＤまで増大。試験のＭＡＤ部の場合、ウイルス量の９０％減少をもたらす単回投与は、単回投与として忍容性が良好であれば、毎週又は隔週×４週投薬される連続コホートに投与される。

患者参加期間／試験期間／治療期間：
ＳＡＤ期間の場合、治療期間は、１−１４日のスクリーニング期間、１日の治療と３６時間の入院患者観察、更に５日の外来患者観察、及び（電話による）３０日のＳＡＥ経過観察からなる４２日（範囲、３８から４９）である。ＭＡＤフェーズ中、同じ患者、及び必要に応じて新規に補充した患者は、０−１４日のスクリーニング期間、４週間の治療期間、７日の経過観察期間、及び（電話による）３０日のＳＡＥ経過観察からなる７２日間（範囲、６５から７９）の治療を受ける。その結果、試験の両方のフェーズに登録された患者の参加期間は、試験のＳＡＤ部とＭＡＤ部の間の介在期間を除いて、最高１２８日になり得る。

基準療法、投与量及び投与方法：
プラセボは、ＩＶ注射液として処方され、Ｓｉｒｎａ−０３４と外観が同じである。

評価判定基準
効力及び薬力学については、ＨＣＶウイルスＲＮＡを、場合によってはＨＣＶキャプシドタンパク質プロセシング又はウイルス感染価の新規生物学的マーカーと一緒に、評価する。安全性については、生命徴候、有害事象、標準臨床検査及び理学的検査をモニターする。

統計学的方法
有害事象の発生率、徴候、症候、ＥＣＧパラメータ及び検査所見；ＥＣＧパラメータ及び検査値、ＰＫ及びＰＤパラメータの変化の記述統計；並びにウイルス量、複製及び感染力の測定値の探索的分析。

臨床計画（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｌａｎ）の主目的は、標的プロファイル（ＴＰ）を支援し、登録の要件を満たすように、慢性Ｃ型肝炎に対する可能な治療として、Ｓｉｒｎａ−０３４の安全性及び効力を評価することである。計画全体における試験対象の総数は、約１２００名である。

このＳｉｒｎａ−０３４用ＣＰは、ＴＰが正しいことを証明し、慢性Ｃ型肝炎治療としての登録の規制要件を満たすように設計される。最初の主張は、Ｓｉｒｎａ−０３４が、代償性（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅ）肝疾患を有し、ＰＥＧインターフェロン及びリバビリンに応答しない１８歳以上の患者において、ＰＥＧインターフェロン及びリバビリンと組み合わせて、慢性Ｃ型肝炎治療に必要であることである。

以前に治療を受けた、又は未治療の代償性の慢性Ｃ型肝炎患者における第Ｉ／ＩＩ相用量漸増試験によって、複数回投与（毎週増加する用量で４週間、又は２週間ごとに４週間）の安全性、化合物に対する全身暴露の程度を確立し、血清ＨＣＶ ＲＮＡ分析によって有効な単独療法としての「機序の証明」（１−２ ｌｏｇの減少）を確立する。

この後、ＰＥＧインターフェロン及びリバビリンに応答しない、臨床的に活性なＣ型肝炎患者における、ＰＥＧインターフェロン及びリバビリンと組み合わせた公式の第ＩＩ相用量設定試験が続く。４８週試験によって、毎週投与されるＳｉｒｎａ−０３４との３剤併用の安全性、有効性及びＰＫのデータが得られる。

第ＩＩＩ相試験は、効力の証拠を確認し、化合物の更なる安全性データを提供する無作為化プラセボ対照試験である。２つの枢要な無作為化プラセボ対照多国籍第ＩＩＩ相試験は、効力を確認し、登録を支持する安全性データを提供するように設計される。主要評価項目は、４８週の治療後の２４週におけるものであり、検出不可能なＨＣＶ ＲＮＡ、及びＡＬＴの正常化によって表される。登録時には、１２００名を超える患者がＳｉｒｎａ−０３４に暴露されたことになる。

Ｓｉｒｎａ−０３４は、ＨＣＶ複製を阻害する可能性を有する、２個のＳｉｒｎａ二本鎖からなる改変抗ＨＣＶ ｓｉＮＡである（ＬＮＰ−０８６として調合された、Ｓｉｒｎａ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｎｏｓ． ３３１４９／４７６７７及び３１７０３／３８７５６、（配列番号１７９６／２１０２及び１６７７／２１０３）。ＬＮＰ−０８６は、モル比４３／３８／１０／２／７のＣＬｉｎＤＭＡ／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／リノレイルアルコールからなる。表ＩＩＩ及びＶＩ参照）。Ｓｉｒｎａ−０３４は、ＨＣＶ ｍＲＮＡ部位２９３及び３１６を標的にする。Ｓｉｒｎａ−０３４は、従来の療法（ＰＥＧインターフェロンとリバビリン）に対する患者の全体的な症候性反応を改善すると予想され、ＨＣＶ感染によって引き起こされる能力障害、病的状態及び死亡のリスクに対する対象の感受性を安全に最小化する最良の機会を提供する。

適応症
ＨＣＶ研究における多数の知見によれば、研究、診断及び治療に使用するために、ＨＣＶ活性の評価方法、及びＨＣＶ発現を調節することができる化合物が必要である。本明細書に記載するとおり、本発明の核酸分子は、ＨＣＶレベルに関係した病態を診断するアッセイに使用することができる。また、本発明の核酸分子は、ＨＣＶレベルに関係した病態の治療に使用することができる。

ＨＣＶ発現の調節に関連し得る特定の変性状態及び病態としては、ＨＣＶ感染症、肝不全、肝細胞癌、肝硬変、及び／又はＨＣＶ感染に関連した他の病態が挙げられるが、これらだけに限定されない。

インターフェロン
インターフェロンは、本明細書に記載の疾患及び／又は症状を治療するために、本発明のｓｉＮＡ分子と併用することができる化合物の１クラスの非限定的例である。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）は、２５を超えるＩＦＮ−α（Ｐｅｓｔａ， １９８６， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １１９， ３−１４）並びにＩＦＮ−β及びＩＦＮ−ωのファミリーを含む天然サイトカインの１クラスである。同じ遺伝子に進化的に由来するが（Ｄｉａｚ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２２， ５４０−５５２）、これらの分子の一次配列には多数の相違があり、生物活性における進化的分岐を暗示している。すべてのＩ型ＩＦＮは、ＩＦＮが細胞表面受容体に結合することから始まる生物学的効果の共通のパターンを共有する（Ｐｆｅｆｆｅｒ ＆ Ｓｔｒｕｌｏｖｉｃｉ， １９９２， Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒｓ ｆｏｒ ＩＦＮ−α／β． Ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．， Ｓ． Ｂａｒｏｎ， Ｄ．Ｈ． Ｃｏｏｐｅｎｈａｖｅｒ， Ｆ． Ｄｉａｎｚａｎｉ， Ｗ．Ｒ． Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ Ｊｒ．， Ｔ．Ｋ． Ｈｕｇｈｅｓ Ｊｒ．， Ｇ．Ｒ． Ｋｉｍｐｅｌ， Ｄ．Ｗ． Ｎｉｅｓｅｌ， Ｇ．Ｊ． Ｓｔａｎｔｏｎ， ａｎｄ Ｓ．Ｋ． Ｔｙｒｉｎｇ， ｅｄｓ． １５１−１６０）。結合に続いて、ヤヌスチロシンキナーゼを含めたチロシンキナーゼ及びＳＴＡＴタンパク質が活性化され、ＩＦＮによって誘導される幾つかの遺伝子産物が産生される（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｓｃｉ． Ａｍ． ２７０， ６８−７５）。ＩＦＮによって誘導される遺伝子産物は、抗ウイルス性、抗増殖性及び免疫調節性効果、サイトカインの誘導、並びにＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩの調節を含めて、Ｉ型ＩＦＮの多面的な生物学的効果の原因である（Ｐｅｓｔｋａ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ５６， ７２７）。ＩＦＮによって誘導される遺伝子産物の例としては、２−５−オリゴアデニル酸合成酵素（２−５ ＯＡＳ）、β２−ミクログロブリン、ネオプトリン、ｐ６８キナーゼ及びＭｘタンパク質が挙げられる（Ｃｈｅｂａｔｈ ＆ Ｒｅｖｅｌ， １９９２， Ｔｈｅ ２−５ Ａ ｓｙｓｔｅｍ：２−５ Ａ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ， ｉｓｏｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ． Ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｓ． Ｂａｒｏｎ， Ｄ．Ｈ． Ｃｏｏｐｅｎｈａｖｅｒ， Ｆ． Ｄｉａｎｚａｎｉ， Ｗ．Ｒ． Ｊｒ． Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｔ．Ｋ． Ｊｒ Ｈｕｇｈｅｓ， Ｇ．Ｒ． Ｋｉｍｐｅｌ， Ｄ．Ｗ． Ｎｉｅｓｅｌ， Ｇ．Ｊ． Ｓｔａｎｔｏｎ， ａｎｄ Ｓ．Ｋ． Ｔｙｒｉｎｇ， ｅｄｓ．， ｐｐ．２２５−２３６；Ｓａｍｕｅｌ， １９９２， Ｔｈｅ ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐ１／ｅＩＦ−２ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ． Ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｓ． Ｂａｒｏｎ， Ｄ．Ｈ． Ｃｏｏｐｅｎｈａｖｅｒ， Ｆ． Ｄｉａｎｚａｎｉ， Ｗ．Ｒ． Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ Ｊｒ．， Ｔ．Ｋ． Ｈｕｇｈｅｓ Ｊｒ．， Ｇ．Ｒ． Ｋｉｍｐｅｌ， Ｄ．Ｗ． Ｎｉｅｓｅｌ， Ｇ．Ｈ． Ｓｔａｎｔｏｎ， ａｎｄ Ｓ．Ｋ． Ｔｙｒｉｎｇ， ｅｄｓ． ２３７−２５０；Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ， １９９２， ＭＸ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ． Ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｓ． Ｂａｒｏｎ， Ｄ．Ｈ． Ｃｏｏｐｅｎｈａｖｅｒ， Ｆ． Ｄｉａｎｚａｎｉ， Ｗ．Ｒ． Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ Ｊｒ．， Ｔ．Ｋ． Ｈｕｇｈｅｓ Ｊｒ．， Ｇ．Ｒ． Ｋｉｍｐｅｌ， Ｄ．Ｗ． Ｎｉｅｓｅｌ， Ｇ．Ｈ． Ｓｔａｎｔｏｎ， ａｎｄ Ｓ．Ｋ． Ｔｙｒｉｎｇ， ｅｄｓ． ２１５−２２４）。すべてのＩ型ＩＦＮは類似した生物学的効果を有するが、すべての活性が各Ｉ型ＩＦＮによって共有されるわけではなく、多くの場合において、活性度は、各ＩＦＮサブタイプでかなり実質的に変動する（Ｆｉｓｈ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ． ９， ９７−１１４；Ｏｚｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ． １２， ５５−５９）。より具体的には、ＩＦＮ−αの異なるサブタイプ、及びＩＦＮ−αの分子ハイブリッドの諸性質についての研究によれば、薬理的諸性質には違いがある（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ， １９８７， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ． ７， ５４５−５５１）。これらの薬理的相違は、わずか３個のアミノ酸残基の変化から生じ得る（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４２， １３１２−１３１６）。

公知のＩＦＮ−αサブタイプでは、８５から１６６個のアミノ酸が保存されている。ＩＦＮ−α偽遺伝子を除いて、約２５の公知の異なるＩＦＮ−αサブタイプがある。これらの非対立性サブタイプを対ごとに比較すると、一次配列の違いは、２％から２３％の範囲である。天然ＩＦＮに加えて、コンセンサスインターフェロン（ＣＩＦＮ）として知られる非天然組換えＩ型インターフェロンが治療化合物として合成された（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２６， ７４７−７５４）。

インターフェロンは、現在、感染症、自己免疫疾患及び癌を含めて少なくとも１２種類の適応症に使用されている（Ｂｏｒｄｅｎ， １９９２， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２６， １４９１−１４９２）。自己免疫疾患の場合、ＩＦＮは、リウマチ様関節炎、多発性硬化症及びクローン病の治療に利用されている。癌治療の場合、ＩＦＮは、単独で、又は幾つかの異なる化合物と組み合わせて使用されている。ＩＦＮが使用される特定の癌タイプとしては、へん平上皮癌、黒色腫、副腎腫、血管腫、有毛細胞白血病、カポジ肉腫などが挙げられる。感染症の治療においては、ＩＦＮは、マクロファージの食作用、及びリンパ球の細胞傷害性を増大させ、細胞病原体の増殖を阻害する。ＩＦＮが治療に使用される具体的適応症としては、Ｂ型肝炎、６及び１１型ヒトパピローマウイルス（すなわち、陰部ゆうぜい）（Ｌｅｖｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３２５， ６１３−６１７）、慢性肉芽腫症、Ｃ型肝炎ウイルスなどが挙げられる。

慢性ＨＣＶ感染症の治療にＩＦＮアルファを用いた多数の十分に管理された臨床試験によれば、週３回の治療によって、６か月の療法の終わりまでに患者の約５０％（４０％−７０％の範囲）において血清ＡＬＴ値が低下する（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２１， １５０１−１５０６；Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， １３， ３９３−３９７；Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ２６， ７４７−７５４；Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ２６， １６４０−１６４５）。しかし、インターフェロン治療の休止後、反応のあった患者の約５０％が再発し、「耐久（ｄｕｒａｂｌｅ）」反応率は、血清ＡＬＴ濃度の正常化によって評価して、約２０から２５％であった。また、臨床的エンドポイントとしてＨＣＶ ＲＮＡ値の変化を用いた１型インターフェロン療法の６か月間を調べた試験によれば、療法の終わりまでに患者の最高３５％でＨＣＶ ＲＮＡが消失した（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７（前掲））。しかし、ＡＬＴエンドポイントの場合と同様に、患者の約５０％が療法休止後６か月で再発し、耐久ウイルス学的著効はわずか１２％にすぎない（２３）。４８週間の療法を調べた試験によれば、持続的ウイルス学的著効は、最高２５％である。

ＰＥＧ化インターフェロン、すなわち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と抱合されたインターフェロンは、インターフェロンよりも諸特性が改善された。ＰＥＧ抱合によって受ける利点としては、ＰＥＧのないインターフェロンよりも薬物動態プロファイルが改善され、したがって投与計画がより好都合になり、耐性が改善され、抗ウイルス効力が向上することが挙げられる。かかる改善は、ポリエチレングリコールインターフェロンアルファ２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ、Ｒｏｃｈｅ）とポリエチレングリコールインターフェロンアルファ２ｂ（ＶＴＲＡＦＥＲＯＮ ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ、Ｅｎｚｏｎ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）の両方の臨床試験で実証された。

インターフェロン及びポリエチレングリコールインターフェロンと組み合わせたｓｉＮＡ分子は、ＨＣＶ、又は上で考察した他の適応症のいずれかの治療の有効性を改善し得る。ＨＣＶ感染に関連するＲＮＡを標的にしたｓｉＮＡ分子は、個々に、又はインターフェロン、ポリエチレングリコールインターフェロンなどの他の療法と組み合わせて、使用することができ、高い効力を得ることができる。

多官能ｓｉＮＡによる標的ＲＮＡ発現の阻害
多官能ｓｉＮＡの設計
多官能ｓｉＮＡ構築体に対する標的部位を特定した後、異なる標的核酸配列に相補的である、例えば約１８から約２８ヌクレオチド長の、相補領域を有するｓｉＮＡの各鎖を設計する。標的配列に相補的でないが、他方の配列の相補領域に対する相補性を含む、約４から約２２ヌクレオチドの隣接するフランキング領域を有する各相補領域を設計する（例えば、図１６参照）。ヘアピン構築体を同様に設計することができる（例えば、図１７参照）。異なる標的核酸配列間で共有される相補的な回文構造又は反復配列を特定することによって、多官能ｓｉＮＡ構築体の全長を短縮することができる（例えば、図１８及び１９参照）。

非限定的例においては、単一のｓｉＮＡ分子によって複数の標的をサイレンシングし得る別の多官能ｓｉＮＡ設計の３つの追加のカテゴリーが存在する。第１の方法は、リンカーを利用して、ｓｉＮＡ（又は多官能ｓｉＮＡ）を直接連結する。これによって、インターフェロン応答を誘発し得る一連の長鎖ＲＮＡを生成せずに、最も強力なｓｉＮＡを連結することができる。第２の方法は、重複した、又は連結された、多官能設計のデンドリマー的な伸長、或いは超分子形式のｓｉＮＡの組織化である。第３の方法は、３０塩基対を超えるヘリックス長を利用する。これらのｓｉＮＡのダイサーによるプロセシングによって、新しい活性５’アンチセンス末端が出現する。したがって、長鎖ｓｉＮＡは、元の５’末端によって規定される部位、及びダイサープロセシングによって作製される新しい末端によって規定される部位を標的にすることができる。（センス鎖とアンチセンス鎖が標的を各々規定する）伝統的な多官能ｓｉＮＡと併用すると、この手法を用いて、例えば４個以上の部位を標的にすることができる。

Ｉ． 繋留（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）二官能性ｓｉＮＡ
基本的な考え方は、２本のアンチセンスｓｉＮＡ鎖が単一のセンス鎖にアニールされる多官能ｓｉＮＡの設計に対する新規な取組である。センス鎖オリゴヌクレオチドは、リンカー（例えば、本明細書に記載の非ヌクレオチド（ｎｕｌｃｏｅｔｉｄｅ）リンカー）と、アンチセンスｓｉＮＡ鎖にアニールされる２個のセグメントを含む（図２２参照）。リンカーは、ヌクレオチド系リンカーを含んでいてもよい。この手法の幾つかの潜在的利点及び変形としては、これらだけに限定されないが、以下のものが挙げられる。

１． ２個のアンチセンスｓｉＮＡは独立している。したがって、標的部位の選択は、２個の部位間の配列保存の要件によって束縛されない。任意の２個の高活性ｓｉＮＡを組み合わせて、多官能ｓｉＮＡを形成することができる。

２． 相同性を有する標的部位と併用するときには、２個の遺伝子（例えば、異なるアイソフォーム）中に存在する配列を標的にするｓｉＮＡ、この設計を用いて、２個を超える部位を標的にすることができる。例えば、単一の多官能ｓｉＮＡを用いて、２個の異なる標的ＲＮＡのＲＮＡを標的にすることができる。

３． センス鎖とアンチセンス鎖の両方を使用して１個の遺伝子を標的にする多官能ｓｉＮＡも、繋留多官能設計に組み入れることができる。これによって、６個以上の部位を単一の複合体で標的にする可能性が残される。

４． ２個を超えるアンチセンス鎖ｓｉＮＡを単一の繋留センス鎖にアニールすることができる。

５． この設計は、一連の長鎖ｄｓＲＮＡの生成を防止する。したがって、インターフェロン応答を惹起する可能性は低い。

６． リンカー（又は本明細書に記載の抱合体など、リンカーに結合した修飾）は、複合体の薬物動態学的諸性質を改善し、又はリポソームへの複合体の取り込みを改善する。リンカーに導入された修飾は、ｓｉＮＡに直接結合した場合と同じ程度に、ｓｉＮＡ活性に影響を及ぼすべきではない（例えば、図２７及び２８参照）。

７． センス鎖は、アニールされたアンチセンス鎖を越えて伸長して、抱合体が結合するための追加の部位を与え得る。

８． 複合体の極性は、アンチセンス３’末端の両方がリンカーに隣接し、５’末端がリンカーの遠位にあるように、又はその組合せになるように、転換することができる。

デンドリマー及び超分子ｓｉＮＡ
デンドリマーｓｉＮＡ手法においては、ｓｉＮＡの合成は、デンドリマーテンプレートをまず合成することによって開始され、続いて種々の官能性ｓｉＮＡが結合する。種々の構築体を図２３に示す。結合し得る官能性ｓｉＮＡの数は、使用するデンドリマーの寸法によってのみ限定される。

多官能ｓｉＮＡに対する超分子手法
超分子形式は、デンドリマー合成の難題を簡単にする。この形式では、ｓｉＮＡ鎖は、標準のＲＮＡ化学反応と、それに続く種々の相補鎖のアニーリングによって合成される。個々の鎖の合成は、５’末端における１個のｓｉＮＡのアンチセンスセンス配列、続いて核酸リンカー又はヘキサエチレングリコール（ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｏｌ）などの合成リンカー、続いて別のｓｉＮＡの５’から３’方向のセンス鎖を含む。したがって、ｓｉＮＡ鎖の合成は、標準の３’から５’方向に実施することができる。三官能及び四官能ｓｉＮＡの代表例を図２４に示す。種々の鎖が効率的にアニールされる限り、類似の原理に基づいて、より高い官能性のｓｉＮＡ構築体を設計することができる。

ダイサーを使用可能な多官能ｓｉＮＡ
複数の標的の生物情報学的解析によって、異なる標的配列間で共有される、約２から約１４ヌクレオチド長の一連の同一配列を特定することができる。ダイサーによるプロセシングによって、第２の機能的５’アンチセンス部位が出現するように、これらの同一領域を設計して、長鎖ｓｉＮＡヘリックス（例えば、＞３０塩基対）にすることができる（例えば、図２５参照）。例えば、ｓｉＮＡアンチセンス鎖（例えば、３’−ＴＴオーバーハングを有する二本鎖中の２１ヌクレオチド鎖）の最初の１７ヌクレオチドが標的ＲＮＡに相補的であるときには、２５ｎＭで頑強なサイレンシングが認められた。同形式の１６ヌクレオチドのみの相補性によって８０％のサイレンシングが認められた。

約３０から４０又はそれを超える塩基対のｓｉＮＡの設計にこの性質を組み入れることによって、更に別の多官能ｓｉＮＡ構築体が得られる。図２５の例は、３０塩基対二本鎖が、Ｄｉｃｅｒ−ＲＮａｓｅＩＩＩによるプロセシング後に、３個の異なる配列を標的にし得る方法を示す。これらの配列は、ウイルス及び宿主因子メッセージ、所与の経路（例えば、炎症性カスケード）に沿った複数のポイントなど、同じｍＲＮＡ上、又は別々のＲＮＡ上に存在し得る。また、４０塩基対の二本鎖は、二官能性設計を直列に組み合わせて、４個の標的配列を標的にする単一の二本鎖を与え得る。更に大規模な手法は、１個の多官能二本鎖で５又は６個の標的をサイレンシングし得る相同配列の使用を含み得る。図２５の例は、その達成方法を示している。３０塩基対の二本鎖は、ダイサーによってどちらかの末端から２２と８塩基対の生成物に開裂する（８ｂ．ｐ．断片は示さず。）。見やすくするために、ダイサーによって作製されるオーバーハングを示していない（しかし、埋め合わせられ得る。）３個のターゲティング配列を示す。重複した必要な配列同一性を灰色の枠で示す。親の３０ｂ．ｐ．ｓｉＮＡの各Ｎは、安定化された化学反応で試験した場合にダイサー切断を可能にする２’−ＯＨ位置の示唆される部位である。Ｄｉｃｅｒ ＲＮａｓｅ ＩＩＩによる３０量体二本鎖のプロセシングは、正確な２２＋８開裂を与えず、一連の密接に関係した生成物を生成することに留意されたい（２２＋８は主要な部位である。）。したがって、ダイサーによるプロセシングによって、一連の活性なｓｉＮＡが生成する。別の非限定的例を図２６に示す。４０塩基対の二本鎖は、ダイサーによって、一方の末端から２０塩基対の生成物に開裂する。見やすくするために、ダイサーによって作製されるオーバーハングを示していない（しかし、埋め合わせられ得る。）４個のターゲティング配列を４色、すなわち、青色、淡青色、赤色及びオレンジ色で示す。重複した必要な配列同一性を灰色の枠で示す。この設計形式は、より大きなＲＮＡに拡張することができる。化学的に安定化されたｓｉＮＡがダイサーによって結合する場合には、戦略的に配置されたリボヌクレオチド結合によって、本発明者らの多官能性設計のより広範なレパートリーを可能にする切断産物の設計が可能になり得る。例えば、約２２ヌクレオチドのダイサー標準に限定されない切断産物は、例えば、約３から約１５ヌクレオチドの標的配列同一性重複を有する多官能ｓｉＮＡ構築体を可能にし得る。

診断用途
本発明のｓｉＮＡ分子は、種々の応用分野、例えば、臨床、工業、環境、農業及び／又は研究の場面における分子標的（例えば、ＲＮＡ）の特定などの種々の診断用途に使用することができる。ｓｉＮＡ分子のかかる診断上の使用は、再構成されたＲＮＡｉ系の利用、例えば、細胞溶解物、又はある程度精製された細胞溶解物の使用を含む。本発明のｓｉＮＡ分子を診断ツールとして用いて、疾患細胞内の遺伝的浮動及び変異を検査することができ、又は細胞における内因性若しくは外因性の、例えばウイルス性の、ＲＮＡの存在を検出することができる。ｓｉＮＡ活性と標的ＲＮＡ構造との密接な関係によって、分子の任意の領域において、標的ＲＮＡの塩基対形成及び３次元構造を変化させる変異を検出することができる。本発明に記載の複数のｓｉＮＡ分子を使用することによって、インビトロ並びに細胞及び組織におけるＲＮＡの構造及び機能に重要であるヌクレオチド変化をマッピングすることができる。ｓｉＮＡ分子を用いて標的ＲＮＡを切断することによって、遺伝子発現を阻害し、疾患又は感染の進行における特定の遺伝子産物の役割を規定することができる。このようにして、他の遺伝子標的を疾患の重要な媒介物質として規定することができる。これらの実験は、併用療法（例えば、異なる遺伝子を標的にする複数のｓｉＮＡ分子、公知の小分子阻害剤と組み合わせたｓｉＮＡ分子、又は組合せｓｉＮＡ分子及び／又は他の化学若しくは生体分子を用いた間欠的治療）が可能になることによって、疾患進行のより良好な治療につながる。本発明のｓｉＮＡ分子の他のインビトロでの使用は、当分野でよく知られており、疾患、感染、又は関係する症状に関連するｍＲＮＡの存在の検出を含む。かかるＲＮＡは、ｓｉＮＡで処理した後、標準の方法、例えば蛍光共鳴発光移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を用いて、切断産物の存在を判定することによって検出される。

特定の例においては、標的ＲＮＡの野生型又は変異型のみを切断するｓｉＮＡ分子をアッセイに使用する。第１のｓｉＮＡ分子（すなわち、標的ＲＮＡの野生型のみを切断するｓｉＮＡ分子）を用いて、試料中に存在する野生型ＲＮＡを特定し、第２のｓｉＮＡ分子（すなわち、標的ＲＮＡの変異型のみを切断するｓｉＮＡ分子）を用いて、試料中の変異型ＲＮＡを特定する。反応対照として、野生型と変異型の両方のＲＮＡの合成基質を両方のｓｉＮＡ分子によって切断して、反応における相対ｓｉＮＡ効率、及び「非標的」ＲＮＡ種の切断が存在しないことを実証する。合成基質からの切断産物は、試料集団中の野生型及び変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーの作製にも役立つ。したがって、各分析は２種類のｓｉＮＡ分子、２種類の基質、及び１種類の未知試料を必要とし、これらを組み合わせて６つの反応物にする。各ＲＮＡの完全長及び切断断片をポリアクリルアミドゲルの１レーンで分析できるように、切断産物の存在をＲＮａｓｅ保護アッセイによって判定する。標的細胞における変異ＲＮＡの発現、及び所望の表現型の変化の推定されるリスクを洞察するために、結果を定量することが絶対に必要というわけではない。タンパク質産物が表現型（すなわち、疾患に関係する表現型、又は感染に関係する表現型）の発生に関係しているｍＲＮＡの発現は、リスクを築くのに十分である。比活性の類似したプローブを両方の転写物に使用する場合には、ＲＮＡレベルの定性的比較が適切であり、初期診断コストを削減する。ＲＮＡレベルを定性的に比較しても、定量的に比較しても、変異型と野生型の比率が高いほど、リスクは高くなる。

本明細書で言及するすべての特許及び刊行物は、本発明が属する分野の当業者の技術レベルを示している。この開示において引用するすべての参考文献を、各参考文献を参照によりその全体を個々に組込む場合と同じ程度に、参照により本明細書に組込む。

当業者は、本発明が、その目的を実行して、記載した結果及び効果、並びに本発明に固有の結果及び効果を得るのに、十分に適合していることを容易に理解するはずである。好ましい実施形態の現時点での代表として本明細書に記載する方法及び組成物は、例示的なものであって、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書に記載する方法及び組成物の変更、並びに他の用途が当業者に生起するはずであるが、それらは、本発明の精神に包含され、特許請求の範囲によって規定される。

本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示する本発明に種々の置換及び改変をなし得ることを、当業者は容易に理解できるはずである。すなわち、かかる追加の実施形態は、本発明及び以下の特許請求の範囲の範囲内である。本発明は、ＲＮＡｉ活性を媒介する、活性の改善された核酸構築体を作製するために、本明細書に記載する化学修飾の種々の組合せ及び／又は置換を試験することを当業者に教示する。かかる活性の改善は、安定性の改善、生物学的利用能の改善、及び／又はＲＮＡｉを媒介する細胞応答の活性化の改善を含み得る。したがって、本明細書に記載する特定の実施形態は限定的なものではなく、ＲＮＡｉ活性が改善されたｓｉＮＡ分子を特定するために、本明細書に記載する修飾の特定の組合せを過度の実験なしに試験し得ることを当業者は容易に理解することができる。

本明細書に説明的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示しない任意の１つ以上の要素、制約の非存在下で適切に実施し得る。使用した用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定的な用語ではない。かかる用語及び表現の使用においては、示した、また、記述した特徴又はその一部の任意の等価物を除外することを意図したものではない。そうではなく、特許請求する本発明の範囲内で種々の改変が可能であることを認識されたい。かくして、本発明を好ましい実施形態、必須でない特徴によって具体的に開示したが、本明細書で開示する概念の改変及び変形が当業者によってなされ得るものであり、かかる改変及び変形は、明細書本文及び添付の特許請求の範囲に規定された本発明の範囲内とみなされることを理解すべきである。

また、発明の特徴又は態様がマーカッシュ群又は他の代替物の分類の観点から記載されている場合には、それによって、本発明が、マーカッシュ群又は他の群の任意の個々の構成要素又は構成要素の亜群の観点からも記載されていることを当業者は認識されたい。

図１は、ｓｉＮＡ分子の合成のためのスキームの非限定的な例を示している。相補的ｓｉＮＡ配列鎖（鎖１及び鎖２）が直列に合成され、ヌクレオチドスクシナート又は脱塩基スクシナートなどの切断可能な連結（固相支持体上での固相合成のために使用される切断可能なリンカーと同一又は別異であり得る。）によって接続されている。合成は、固相又は溶液相の何れかであり得、図示されている例では、合成は固相合成である。ジメトキシトリチル基などの保護基が直列オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチド上でそのままの状態を保つように、合成が実施される。オリゴヌクレオチドが切断及び脱保護されると、２つのｓｉＮＡ鎖は自発的にハイブリダイズして、ｓｉＮＡ二重鎖を形成し、これは、末端保護基の特性を使用することによって、例えば、精製方法に対してトリチルを適用することによって（末端保護基を有する二重鎖／オリゴヌクレオチドのみが単離される。）、二重鎖の精製を可能とする。 図２は、本発明の方法によって合成された、精製されたｓｉＮＡ二重鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示している。示されている２つのピークは、別個のｓｉＮＡ配列鎖の予想される質量に対応する。この結果は、直列合成から生成されたｓｉＮＡ二重鎖が、単純なトリチルーオン精製法を用いて単一分種として精製され得ることを示している。 図３は、ＲＮＡｉに関与する標的ＲＮＡ分解の、非限定的な提案された機序の模式図を示している。外来一本鎖ＲＮＡ、例えば、ウイルス、トランスポゾン又は他の外来ＲＮＡから、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によって生成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、ＤＩＣＥＲ酵素を活性化し、次いで、ＤＩＣＥＲ酵素が、ｓｉＮＡ二重鎖を生成する。あるいは、適切な手段によって、合成ｓｉＮＡ又は発現されたｓｉＮＡを細胞中に直接導入することができる。標的ＲＮＡを認識する活性なｓｉＮＡ複合体が形成し、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体による標的ＲＮＡの分解又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）による追加のＲＮＡの合成をもたらし、これは、ＤＩＣＥＲを活性化し、さらなるｓｉＮＡ分子をもたらすことによって、ＲＮＡｉ応答を増幅することができる。 図４Ａ−Ｆは、本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡ構築物の非限定的な例を示している。この図では、Ｎは、任意のヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、シトシン、ウリジン又は場合によってチミジン）を表しており、例えば、チミジンは、括弧（Ｎ Ｎ）によって表記された突出領域中で置換され得る。ｓｉＮＡ構築物のセンス鎖及びアンチセンス鎖に対して、様々な修飾が示されている。（Ｎ Ｎ）ヌクレオチド位置は、本明細書中に記載されているように化学的に修飾することができ（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２−フルオロなど）、対応する標的核酸配列に由来することができ、又は由来しないことができる（例えば、図６Ｃを参照）。さらに、図４に示されている配列は、場合によって、センス鎖の５末端から９番目の位置に、又はガイド鎖の５’末端中から１１ヌクレオチド位置をカウントすることによって、ガイド鎖の５末端を基礎として１１番目の位置にリボヌクレオチドを含むことができる（図６Ｃ参照）。 図４Ａ：センス鎖は２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドが場合によって塩基対を形成し、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的塩基又は本明細書に記載されている他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、存在する全てのヌクレオチドが、リボヌクレオチドである。アンチセンスセンス鎖は、３’末端グリセリル部分を場合によって有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは、場合によって、標的ＲＮＡ配列に対して相補的であり、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的塩基又は本明細書に記載されている他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、存在する全てのヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。「ｓ」として示されているホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又は本明細書に記載されているその他の修飾されたヌクレオチド間結合などの修飾されたヌクレオチド間結合は、場合によって、アンチセンス鎖中の（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを接続する。 図４Ｂ：センス鎖は２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは場合によって塩基対を形成し、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的塩基又は本明細書に記載されている他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、場合によって３’−末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは場合によって標的ＲＮＡ配列に対して相補的であり、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的塩基又は本明細書に記載されている他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドである。「ｓ」として示されているホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又は本明細書に記載されているその他の修飾されたヌクレオチド間結合などの修飾されたヌクレオチド間結合は、場合によって、センス及びアンチセンス鎖中の（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを接続する。 図４Ｃ：センス鎖は、５’及び３’末端キャップ部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは場合によって塩基対を形成し、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的塩基又は本明細書に記載されている他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル又は２’−デオキシ−２−フルオロ修飾されたヌクレオチドである。アンチセンスセンス鎖は、３’末端グリセリル部分を場合によって有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは、場合によって、標的ＲＮＡ配列に対して相補的であり、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的塩基又は本明細書に記載されている他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドである。「ｓ」として示されているホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又は本明細書に記載されているその他の修飾されたヌクレオチド間結合などの修飾されたヌクレオチド間結合は、場合によって、アンチセンス鎖中の（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを接続する。 図４Ｄ：センス鎖は、５’及び３’末端キャップ部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは場合によって塩基対を形成し、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的塩基又は本明細書に記載されている他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、場合によって３’−末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは場合によって標的ＲＮＡ配列に対して相補的であり、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的塩基又は本明細書に記載されている他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドである。「ｓ」として示されているホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又は本明細書に記載されているその他の修飾されたヌクレオチド間結合などの修飾されたヌクレオチド間結合は、場合によって、アンチセンス鎖中の（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを接続する。 図４Ｅ：センス鎖は、５’及び３’末端キャップ部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは場合によって塩基対を形成し、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的塩基又は本明細書に記載されている他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、場合によって３’−末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは場合によって標的ＲＮＡ配列に対して相補的であり、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的塩基又は本明細書に記載されている他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドである。「ｓ」として示されているホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又は本明細書に記載されているその他の修飾されたヌクレオチド間結合などの修飾されたヌクレオチド間結合は、場合によって、アンチセンス鎖中の（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを接続する。 図４Ｆ：センス鎖は、５’及び３’末端キャップ部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは場合によって塩基対を形成し、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的塩基又は本明細書に記載されている他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、場合によって３’−末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは場合によって標的ＲＮＡ配列に対して相補的であり、１つの３’−末端ホスホロチオアートヌクレオチド間結合を有し、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的塩基又は本明細書に記載されている他の化学的修飾を含み得る（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドである。「ｓ」として示されているホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又は本明細書に記載されているその他の修飾されたヌクレオチド間結合などの修飾されたヌクレオチド間結合は、場合によって、アンチセンス鎖中の（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを接続する。構築物Ａ−Ｆのアンチセンス鎖は、本発明の標的核酸配列の何れかに相補的な配列を含む。さらに、グリセリル部分（Ｌ）が図４Ａ−Ｆ中に示されている何れかの構築物に対するアンチセンス鎖の３’末端に存在し、修飾されたヌクレオチド間結合が場合によって存在する。 図５Ａ−Ｆは、本発明の化学的に修飾された特異的なｓｉＮＡ配列の非限定的な例を示している。Ａ−Ｆは、典型的なＨＣＶｓｉＮＡ配列に対して、図４Ａ−Ｆ中に記載されている化学的修飾を適用する。このような化学的修飾は、全てのＨＣＶ配列に対して適用することができる。さらに、図５に示されている配列は、場合によって、センス鎖の５’末端から９番目の位置に、又はガイド鎖の５’末端中から１１のヌクレオチド位置をカウントすることによって、ガイド鎖の５’末端を基礎として１１番目の位置にリボヌクレオチドを含むことができる（図６Ｃ参照）。さらに、図５に示されている配列は、場合によって、アンチセンス鎖の５’末端に最大約４つの位置に末端リボヌクレオチド（例えば、アンチセンス鎖の５’末端における約１、２、３又は４つの末端リボヌクレオチド）及び／又は細胞標的配列を含むことができる。 図６Ａ−Ｃは、本発明の異なるｓｉＮＡ構築物の非限定的な例を示している。図６Ａに示されている例（構築物１、２及び３）は、１９の代表的塩基対を有する。しかしながら、本発明の異なる実施形態は、本明細書に記載されている塩基対のあらゆる数を含む。括弧内の領域は、例えば、約１、２、３又は４ヌクレオチド長、好ましくは約２ヌクレオチドを含むヌクレオチド突出部を表す。構築物１及び２は、独立に、ＲＮＡｉ活性のために使用することができる。構築物２は、生物分解性リンカーとして場合によって設計することができるポリヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーを含むことができる。一実施形態において、構築物２に示されているループ構造は、インビボ及び／又はインビトロで、構築物１の形成をもたらす生物分解性リンカーを含むことができる。別の例において、インビボ及び／又はインビトロで活性なｓｉＮＡ構築物２を作製するためにリンカーが使用され、インビボ及び／又はインビトロで活性なｓｉＮＡ構築物１を作製するために別の生物分解可能リンカーを場合によって使用することができる同じ原理下で構築物２を作製するために、構築物３を使用することができる。従って、ｓｉＲＮＡ構築物の安定性及び／又は活性は、インビボ若しくはインビトロ及び／又はインビトロで使用するためのｓｉＮＡ構築物の設計に基づいて調節することができる。 図６Ａ−Ｃは、本発明の異なるｓｉＮＡ構築物の非限定的な例を示している。図６Ｂに示されている例は、部分的な相補性から生じる突出、膨隆、ループ及びステムループを挙げることができる、ミクロＲＮＡなどの本発明の二本鎖核酸分子の様々な変形物を表している。膨隆、ループ及びステムループを有するこのようなモチーフは、一般的に、ｍｉＲＮＡの特徴である。膨隆、ループ及びステムループは、本発明の二本鎖核酸分子の一方又は両方の鎖中に、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のヌクレオチドのミスマッチ又は膨隆などの部分的相補性のあらゆる程度から生じ得る。 図６Ａ−Ｃは、本発明の異なるｓｉＮＡ構築物の非限定的な例を示している。図６Ｃに示されている例は、二ヌクレオチドの３’突出を有する２つの２１ヌクレオチド配列の１９塩基対二重鎖を含む本発明のモデル二本鎖核酸分子を表す。上部鎖（１）は、センスストランド（パッセンジャー鎖）を表し、中央鎖（２）はアンチセンス（ガイド鎖）を表し、下部鎖（３）は標的ポリヌクレオチド配列を表す。二ヌクレオチド突出（ＮＮ）は、標的ポリヌクレオチドに由来する配列を含むことができる。例えば、ガイド鎖中の３’−（ＮＮ）配列は、標的ポリヌクレオチドの５’−［ＮＮ］配列に相補的であり得る。さらに、パッセンジャー鎖の５’−（ＮＮ）配列は、標的ポリヌクレオチド配列の５’−［ＮＮ］配列と同じ配列を含み得る。他の実施形態において、突出（ＮＮ）は、標的ポリヌクレオチド配列に由来せず、例えば、この場合、ガイド鎖中の３’−（ＮＮ）配列は標的ポリヌクレオチドの５’−［ＮＮ］配列に相補的ではなく、パッセンジャー鎖の５’−（ＮＮ）配列は、標的ポリヌクレオチド配列の５’−［ＮＮ］から得られる異なる配列を含み得る。さらなる実施形態において、何れかの（ＮＮ）ヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２−フルオロ及び／又は本明細書中の他の修飾として、化学的に修飾される。さらに、パッセンジャー鎖は、パッセンジャー鎖のリボヌクレオチド位置Ｎを含み得る。図示されている代表的な１９塩基対の２１マー二重鎖の場合、位置Ｎは、パッセンジャー鎖の３末端から９ヌクレオチドであり得る。しかしながら、異なる長さの二重鎖において、位置Ｎは、ガイド鎖の５’末端から１１ヌクレオチド位置をカウントし、パッセンジャー鎖中の塩基対形成された対応するヌクレオチドを選び出すことによって、ガイド鎖の５’末端に基づいて決定される。Ａｇｏ２による切断は、矢印で示されているように、位置１０と１１の間で起こる。さらなる実施形態において、２つのリボヌクレオチドＮＮは、ガイド鎖の５’末端から１０及び１１ヌクレオチド位置をカウントし、パッセンジャー鎖中の塩基対形成された対応するヌクレオチドを選び出すことによって、ガイド鎖の５’末端に基づいて、位置１０及び１１に存在する。 図７Ａ−Ｃは、ｓｉＮＡヘアピン構築物を得るための発現カセットを作製する際に使用されるスキームの模式図である。 図７Ａ：所定の標的配列と同一の配列を有する領域（ｓｉＮＡのセンス領域）が後置された５’−制限部位（Ｒ１）配列を用いて、ＤＮＡオリゴマーが合成され、センス領域は、例えば、約１９、２０、２１又は２２ヌクレオチド（Ｎ）長を含み、その後ろに、例えば、約３から約１０ヌクレオチドを含む所定の配列（Ｘ）のループ配列が続く。 図７Ｂ：標的配列に対して特異性を有し、並びに自己相補的なセンス及びアンチセンス領域を有するｓｉＮＡ転写物をもたらす自己相補性配列を有するヘアピン構造を生成するために、次いで、合成構築物は、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。 図７Ｃ：配列を直鎖化するために、構築物を（例えば、約９５℃まで）加熱し、第一の鎖の３’制限配列に対するプライマーを用いた相補的な第二のＤＮＡ鎖の伸長を可能とする。次いで、細胞中での発現のために、二本鎖ＤＮＡを適切なベクター中に挿入する。例えば、制限部位を操作し、及び／又は「Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２９， ５０５−５０８」に記載されているように、ポリ−Ｕ末端領域を用いることによって、３’末端ヌクレオチド突出が転写から生じるように、構築物が設計される。 図８Ａ−Ｃは、二本鎖ｓｉＮＡ構築物を得るための発現カセットを作製する際に使用されるスキームの模式図である。 図８Ａ：所定の標的配列と同一の配列を有する領域（ｓｉＮＡのセンス領域）が後置された５’−制限（Ｒ１）部位配列を用いて、ＤＮＡオリゴマーが合成され、センス領域は、例えば、約１９，２０、２１又は２２ヌクレオチド（Ｎ）長を含み、その後ろに、所定の配列のループ配列（Ｘ）が隣接する３’−制限部位（Ｒ２）が続く。 図８Ｂ：次いで、自己相補的配列を有するヘアピン構造を生成するために、合成構築物をＤＮＡポリメラーゼによって伸長する。 図８Ｃ：次いで、細胞中での発現のための適切なベクター中に挿入される二本鎖ＤＮＡを生成するために、Ｒ１及びＲ２に対して特異的な制限酵素によって構築物を加工処理する。Ｕ６プロモーター領域が、ｓｉＮＡの別個のセンス及びアンチセンス鎖を生成するｄｓＤＮＡの各側に隣接するように、転写カセットが設計される。得られた転写物中にＵ突出を生成させるために、ポリＴ終結配列を構築物に添加し得る。 図９Ａ−Ｅは、メッセンジャーＲＮＡなどの特定の標的核酸配列内に、ｓｉＮＲ媒介性ＲＮＡｉに対する標的部位を決定するために使用される方法の模式図である。 図９Ａ：ｓｉＮＡ構築物のアンチセンス領域が標的核酸配列全体にわたって標的部位に相補性を有し、センス領域がｓｉＮＡのアンチセンス領域に対して相補的な配列を含む、ｓｉＮＡオリゴヌクレオチドのプールを合成する。 図９Ｂ及びＣ：（図９Ｂ）配列をプールし、細胞中へのベクターの形質移入がｓｉＮＡの発現をもたらすように（図９Ｃ）、ベクター中に挿入される。 図９Ｄ：標的核酸配列の調節に関連する表現型の変化に基づいて、細胞を選別する。 図９Ｅ：選別された細胞からｓｉＮＡを単離し、標的核酸配列内の有効な標的部位を同定するために配列を決定する。 図１０は、（１）［３−３’］−逆方向デオキシリボース；（２）デオキシリボヌクレオチド；（３）［５’−３’］−３’−デオキシリボヌクレオチド；（４）［５’−３’］−リボヌクレオチド；（５）［５’−３’］−３’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；（６）３’−グリセリル；（７）［３’−５’］−３’−デオキシリボヌクレオチド；（８）［３’−３’］−デオキシリボヌクレオチド；（９）［５’−２’］−デオキシリボヌクレオチド；及び（１０）［５’−３’］−ジデオキシリボヌクレチドなど、例えば、本発明のｓｉＮＡ配列の３’末端を安定化させるために使用することができる様々な安定化化学（１−１０）の非限定的な例を示している。図に示されている修飾及び非修飾骨格化学に加え、これらの化学は、本明細書中に記載されている様々な異なる骨格修飾、例えば、式Ｉを有する骨格修飾と組み合わせることができる。さらに、図示されている末端修飾に対して５’に示されている２’−デオキシヌクレオチドは、本明細書中に記載されている別の修飾又は非修飾ヌクレオチドヌクレオチド又は非ヌクレオチド、例えば、式Ｉ−ＶＩＩの何れかを有する修飾又はこれらの何れかの組み合わせとすることができる。 図１１は、ＲＮＡｉ活性を媒介する能力を保ちながら、ヌクレアーゼ耐性である本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡ構築物を同定するために使用された戦略の非限定的な例を示している。経験に基づく設計パラメータ（例えば、２’修飾、塩基修飾、骨格修飾、末端キャップ修飾の導入など）に基づいて、化学的修飾がｓｉＮＡ構築物中に導入される。適切な系（例えば、示されているように、ヌクレアーゼ耐性に対してはヒト血清、又はＰＫ／送達パラメータに対しては動物モデル）内で、修飾された構築物を検査する。平行して、例えば、ルシフェラーゼレポーターアッセイなどの細胞培養系中で、ＲＮＡｉ活性についてｓｉＮＡ構築物を検査する。次いで、ＲＮＡｉ活性を維持しながら特定の特徴を有するリードｓｉＮＡ構築物を同定し、もう一度、さらに修飾及びアッセイを行うことができる。改善された薬物動態特性、送達及びＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ−抱合体分子を同定するために、この同じアプローチを使用することができる。 図１２は、直鎖及び二重鎖構築物並びにこれらの非対称誘導物を含む、本発明のリン酸化されたｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示している。 図１３は、本発明の化学的に修飾された末端ホスファート基の非限定的な例を示している。 図１４Ａは、標的核酸配列中に同定されるパリンドローム及び／又は反復核酸配列を用いて、自己相補的ＤＦＯ構築物を設計するために使用される方法の非限定的な例を示している。（１）核酸標的配列中に、パリンドローム又は反復配列を同定する。（２）標的核酸配列及びパリンドローム配列に対して相補的な配列を設計する。（３）相補的配列の非パリンドローム／反復部分の逆反復配列を、核酸標的に対して相補的な配列を含む自己相補的ＤＦＯ分子を作製するために、相補的配列の３’末端に付加する。（４）ＤＦＯ分子は、自己集合して、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成することができる。 図１４Ｂは、二重鎖形成オリゴヌクレオチド配列の非限定的な代表例を示している。 図１４Ｃは、代表的な二重鎖形成オリゴヌクレオチド配列の自己集合図式の非限定的な例を示している。 図１４Ｄは、遺伝子発現の調節をもたらす標的核酸配列との相互作用が後に続く、代表的な二重鎖形成オリゴヌクレオチド配列の自己集合図式の非限定的な例を示している。 図１５は、何れかの対象標的核酸配列に対して相補的な配列を有するＤＦＯ構築物中に取り込まれたパリンドローム及び／又は反復核酸配列を用いた、自己相補的ＤＦＯ構築物の設計の非限定的例を示している。これらのパリンドローム／反復配列の取り込みは、各鎖が例えばＲＮＡｉによって標的遺伝子発現の調節を媒介することができる二重鎖を形成するＤＦＯ構築物の設計を可能とする。まず、標的配列を同定する。次いで、人工パリンドローム（図では、ＸＹＸＹＸＹとして示されている。）を与える相補的配列中にヌクレオチド又は非ヌクレオチド修飾（Ｘ又はＹとして示されている。）が導入されている相補的配列を作製する。核酸標的に対して相補的な配列を含む自己相補的ＤＦＯを得るために、非パリンドローム／反復相補的配列の逆反復を相補的配列の３’末端に付加する。ＤＦＯは、自己集合して二本鎖オリゴヌクレオチドを形成することができる。 図１６は、それぞれ、異なる標的核酸配列のＲＮＡｉ誘導性切断を媒介することができる２つの別個のポリヌクレオチド配列を含む本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示している。図１６Ａは、第一の標的核酸配列に対して相補的である第一の領域（相補的領域１）及び第二の標的核酸配列に対して相補的である第二の領域（相補的領域２）を有し、第一及び第二の相補的領域が多機能ｓｉＮＡ中の各ポリヌクレオチド配列の３’末端に位置している多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示している。多機能ｓｉＮＡ構築物の各ポリヌクレオチド配列の破線が付された部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に関して相補性を有しているが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。図１６Ｂは、第一の標的核酸配列に対して相補的である第一の領域（相補的領域１）及び第二の標的核酸配列に対して相補的である第二の領域（相補的領域２）を有し、第一及び第二の相補的領域が多機能ｓｉＮＡ中の各ポリヌクレオチド配列の５’末端に位置している多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示している。多機能ｓｉＮＡ構築物の各ポリヌクレオチド配列の破線が付された部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に関して相補性を有しているが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。 図１７は、それぞれ、異なる標的核酸配列のＲＮＡｉ誘導性切断を媒介することができる異なる領域を含む単一のポリヌクレオチド配列を含む本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示している。図１７Ａは、第一の標的核酸配列に対して相補的である第一の領域（相補的領域１）及び第二の標的核酸配列に対して相補的である第二の領域（相補的領域２）を有し、第二の相補的領域が多機能ｓｉＮＡ中のポリヌクレオチド配列の３’末端に位置している多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示している。多機能ｓｉＮＡ構築物の各ポリヌクレオチド配列の破線が付された部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に関して相補性を有しているが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。図１７Ｂは、第一の標的核酸配列に対して相補的である第一の領域（相補的領域１）及び第二の標的核酸配列に対して相補的である第二の領域（相補的領域２）を有し、第一の相補的領域が多機能ｓｉＮＡ中のポリヌクレオチド配列の５’末端に位置している多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示している。多機能ｓｉＮＡ構築物の各ポリヌクレオチド配列の破線が付された部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に関して相補性を有しているが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。一実施形態において、多機能ｓｉＮＡ構築物は、図１６に示されているように、ｓｉＮＡ構築物を作製するために、インビボ又はインビトロで処理される。 図１８は、それぞれ、異なる標的核酸配列のＲＮＡｉ誘導性切断を媒介することができる２つの別個のポリヌクレオチド配列を含み、さらに自己相補的なパリンドローム又は反復領域を含んでいるために、異なる標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介することができるより短い二機能ｓｉＮＡ構築物を可能とする本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的例を示している。図１８Ａは、第一の標的核酸配列に対して相補的である第一の領域（相補的領域１）及び第二の標的核酸配列に対して相補的である第二の領域（相補的領域２）を有し、第一及び第二の相補的領域が多機能ｓｉＮＡ中の各ポリヌクレオチド配列の３’末端に位置しており、並びに第一及び第二の相補的領域が、自己相補的パリンドローム又は反復領域をさらに含む多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示している。多機能ｓｉＮＡ構築物の各ポリヌクレオチド配列の破線が付された部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に関して相補性を有しているが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。図１８Ｂは、第一の標的核酸配列に対して相補的である第一の領域（相補的領域１）及び第二の標的核酸配列に対して相補的である第二の領域（相補的領域２）を有し、第一及び第二の相補的領域が多機能ｓｉＮＡ中の各ポリヌクレオチド配列の５’末端に位置しており、並びに第一及び第二の相補的領域が、自己相補的パリンドローム又は反復領域をさらに含む多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示している。多機能ｓｉＮＡ構築物の各ポリヌクレオチド配列の破線が付された部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に関して相補性を有しているが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。 図１９は、小野の、異なる標的核酸配列のＲＮＡｉ誘導性切断を媒介することができる別個の領域を含む単一のポリヌクレオチド配列を含み、さらに自己相補的なパリンドローム又は反復領域を含んでいるために、異なる標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介することができるより短い二機能ｓｉＮＡ構築物を可能とする本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的例を示している。図１９Ａは、第一の標的核酸配列に対して相補的である第一の領域（相補的領域１）及び第二の標的核酸配列に対して相補的である第二の領域（相補的領域２）を有し、第二の相補的領域が多機能ｓｉＮＡ中のポリヌクレオチド配列の３’末端に位置しており、並びに第二の相補的領域が、自己相補的パリンドローム又は反復領域をさらに含む多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示している。多機能ｓｉＮＡ構築物の各ポリヌクレオチド配列の破線が付された部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に関して相補性を有しているが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。図１９Ｂは、第一の標的核酸配列に対して相補的である第一の領域（相補的領域１）及び第二の標的核酸配列に対して相補的である第二の領域（相補的領域２）を有し、第一の相補的領域が多機能ｓｉＮＡ中のポリヌクレオチド配列の５’末端に位置しており、並びに第一及び第二の相補的領域が、自己相補的パリンドローム又は反復領域をさらに含む多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示している。多機能ｓｉＮＡ構築物の各ポリヌクレオチド配列の破線が付された部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に関して相補性を有しているが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。一実施形態において、これらの多機能ｓｉＮＡ構築物は、図１８に示されているように、多機能ｓｉＮＡ構築物を作製するために、インビボ又はインビトロで処理される。 図２０は、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子が、異なるタンパク質、例えば、サイトカイン及びその対応する受容体、様々なウイルス株、ウイルス並びにウイルス感染若しくは複製に関与する細胞性タンパク質又は疾病の進行の維持に関与することが推定されている共通の生物経路若しくは多様な生物経路に関与する様々なタンパク質をコードする別個のＲＮＡ分子など、２つの別個の標的核酸分子を、どのようにして標的とすることができるかという非限定的な例を示している。多機能ｓｉＮＡ構築物の各鎖は、別個の標的核酸分子に対して相補性を有する領域を含む。その対応する標的のＲＮＡ干渉媒介性切断を開始するために、ｓｉＮＡの各鎖がＲＩＳＣ複合体によって使用され得るように、多機能ｓｉＮＡ分子が設計される。これらの設計パラメータには、ｓｉＮＡ構築物の各末端の脱安定化が含まれ得る（例えば、Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ，１１５，１９９−２０８参照）。例えば、グアノシン−シチジン塩基対、代替塩基対（例えば、ゆらぎ）を使用することによって、本分野で公知であるように、末端ヌクレオチド位の化学的に修飾されたヌクレオチドを脱安定化させることによって、このような脱安定化を達成することができる。 図２１は、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子が、ＲＮＡの代替コード領域、ＲＮＡのコード及び非コード領域又はＲＮＡの選択的スプライスバリアント領域など、同一標的核酸分子内の２つの別個の標的核酸配列をどのようにして標的とすることができるかについての非限定的な例を示している。多機能ｓｉＮＡ構築物の各鎖は、標的核酸分子の別個の領域に対して相補性を有する領域を含む。その対応する標的領域のＲＮＡ干渉媒介性切断を開始するために、ｓｉＮＡの各鎖がＲＩＳＣ複合体によって使用され得るように、多機能ｓｉＮＡ分子が設計される。これらの設計パラメータには、ｓｉＮＡ構築物の各末端の脱安定化が含まれ得る（例えば、Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ，１１５，１９９−２０８参照）。例えば、グアノシン−シチジン塩基対、代替塩基対（例えば、ゆらぎ）を使用することによって、本分野で公知であるように、末端ヌクレオチド位の化学的に修飾されたヌクレオチドを脱安定化させることによって、このような脱安定化を達成することができる。 図２２（Ａ−Ｈ）は、本発明の係留された多機能性ｓｉＮＡ構築物の非限定的な例を示している。図示されている例では、リンカー（例えば、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）が、２つのｓｉＮＡ領域（例えば、２つのセンス、２つのアンチセンス、あるいはセンス及びアンチセンス領域を一緒に）を接続する。第一の標的配列及び第二の標的配列に対応する別個のセンス（又はセンス及びアンチセンス）配列を、多機能性ｓｉＮＡ中のそれらの対応するセンス及び／又はアンチセンス配列にハイブリダイズさせる。さらに、選択的な又は改善された送達及び／又は薬物動態学的特性のために、様々な抱合体、リガンド、アプタマー、ポリマー又はレポーター分子をリンカー領域に付着させることができる。 図２２（Ａ−Ｈ）は、本発明の係留された多機能性ｓｉＮＡ構築物の非限定的な例を示している。図示されている例では、リンカー（例えば、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）が、２つのｓｉＮＡ領域（例えば、２つのセンス、２つのアンチセンス、あるいはセンス及びアンチセンス領域を一緒に）を接続する。第一の標的配列及び第二の標的配列に対応する別個のセンス（又はセンス及びアンチセンス）配列を、多機能性ｓｉＮＡ中のそれらの対応するセンス及び／又はアンチセンス配列にハイブリダイズさせる。さらに、選択的な又は改善された送達及び／又は薬物動態学的特性のために、様々な抱合体、リガンド、アプタマー、ポリマー又はレポーター分子をリンカー領域に付着させることができる。 図２２（Ａ−Ｈ）は、本発明の係留された多機能性ｓｉＮＡ構築物の非限定的な例を示している。図示されている例では、リンカー（例えば、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）が、２つのｓｉＮＡ領域（例えば、２つのセンス、２つのアンチセンス、あるいはセンス及びアンチセンス領域を一緒に）を接続する。第一の標的配列及び第二の標的配列に対応する別個のセンス（又はセンス及びアンチセンス）配列を、多機能性ｓｉＮＡ中のそれらの対応するセンス及び／又はアンチセンス配列にハイブリダイズさせる。さらに、選択的な又は改善された送達及び／又は薬物動態学的特性のために、様々な抱合体、リガンド、アプタマー、ポリマー又はレポーター分子をリンカー領域に付着させることができる。 図２２（Ａ−Ｈ）は、本発明の係留された多機能性ｓｉＮＡ構築物の非限定的な例を示している。図示されている例では、リンカー（例えば、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）が、２つのｓｉＮＡ領域（例えば、２つのセンス、２つのアンチセンス、あるいはセンス及びアンチセンス領域を一緒に）を接続する。第一の標的配列及び第二の標的配列に対応する別個のセンス（又はセンス及びアンチセンス）配列を、多機能性ｓｉＮＡ中のそれらの対応するセンス及び／又はアンチセンス配列にハイブリダイズさせる。さらに、選択的な又は改善された送達及び／又は薬物動態学的特性のために、様々な抱合体、リガンド、アプタマー、ポリマー又はレポーター分子をリンカー領域に付着させることができる。 図２２（Ａ−Ｈ）は、本発明の係留された多機能性ｓｉＮＡ構築物の非限定的な例を示している。図示されている例では、リンカー（例えば、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）が、２つのｓｉＮＡ領域（例えば、２つのセンス、２つのアンチセンス、あるいはセンス及びアンチセンス領域を一緒に）を接続する。第一の標的配列及び第二の標的配列に対応する別個のセンス（又はセンス及びアンチセンス）配列を、多機能性ｓｉＮＡ中のそれらの対応するセンス及び／又はアンチセンス配列にハイブリダイズさせる。さらに、選択的な又は改善された送達及び／又は薬物動態学的特性のために、様々な抱合体、リガンド、アプタマー、ポリマー又はレポーター分子をリンカー領域に付着させることができる。 図２２（Ａ−Ｈ）は、本発明の係留された多機能性ｓｉＮＡ構築物の非限定的な例を示している。図示されている例では、リンカー（例えば、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）が、２つのｓｉＮＡ領域（例えば、２つのセンス、２つのアンチセンス、あるいはセンス及びアンチセンス領域を一緒に）を接続する。第一の標的配列及び第二の標的配列に対応する別個のセンス（又はセンス及びアンチセンス）配列を、多機能性ｓｉＮＡ中のそれらの対応するセンス及び／又はアンチセンス配列にハイブリダイズさせる。さらに、選択的な又は改善された送達及び／又は薬物動態学的特性のために、様々な抱合体、リガンド、アプタマー、ポリマー又はレポーター分子をリンカー領域に付着させることができる。 図２２（Ａ−Ｈ）は、本発明の係留された多機能性ｓｉＮＡ構築物の非限定的な例を示している。図示されている例では、リンカー（例えば、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）が、２つのｓｉＮＡ領域（例えば、２つのセンス、２つのアンチセンス、あるいはセンス及びアンチセンス領域を一緒に）を接続する。第一の標的配列及び第二の標的配列に対応する別個のセンス（又はセンス及びアンチセンス）配列を、多機能性ｓｉＮＡ中のそれらの対応するセンス及び／又はアンチセンス配列にハイブリダイズさせる。さらに、選択的な又は改善された送達及び／又は薬物動態学的特性のために、様々な抱合体、リガンド、アプタマー、ポリマー又はレポーター分子をリンカー領域に付着させることができる。 図２２（Ａ−Ｈ）は、本発明の係留された多機能性ｓｉＮＡ構築物の非限定的な例を示している。図示されている例では、リンカー（例えば、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）が、２つのｓｉＮＡ領域（例えば、２つのセンス、２つのアンチセンス、あるいはセンス及びアンチセンス領域を一緒に）を接続する。第一の標的配列及び第二の標的配列に対応する別個のセンス（又はセンス及びアンチセンス）配列を、多機能性ｓｉＮＡ中のそれらの対応するセンス及び／又はアンチセンス配列にハイブリダイズさせる。さらに、選択的な又は改善された送達及び／又は薬物動態学的特性のために、様々な抱合体、リガンド、アプタマー、ポリマー又はレポーター分子をリンカー領域に付着させることができる。 図２３は、デンドリマーをベースとした様々な多機能性ｓｉＮＡの設計の非限定的な例を示している。 図２４は、様々な超分子多機能性ｓｉＮＡの設計の非限定的な例を示している。 図２５は、３０ヌクレオチドの前駆体ｓｉＮＡ構築物を用いた多機能性ｓｉＮＡの設計を可能にするダイサーの非限定的な例を示している。３０塩基対二重鎖は、ダイサーによって、何れかの末端から得られる２２塩基対の産物と８塩基対の産物へ切断される（８塩基対の断片は図示されていない。）。表示を容易にするために、ダイサーによって生成された突出は図示されていないが、補うことが可能である。３つの標的化配列が示されている。重複した必要とされる配列同一性は、灰色の箱によって示されている。３０塩基対のｓｉＮＡのＮは、安定化された化学で検査された場合に、ダイサー切断を可能とする２’−ＯＨ位置の推定される部位である。ダイサーＲＮアーゼＩＩＩによる３０マー二重鎖の処理が正確な２２＋８切断を与えず、むしろ、密接に関連した一連の産物を生じることに注目されたい（２２＋８が主要部位である。）。従って、ダイサーによる加工は、一連の活性なｓｉＮＡを与える。 図２６は、４０ヌクレオチドの前駆体ｓｉＮＡ構築物を用いた多機能性ｓｉＮＡの設計を可能にするダイサーの非限定的な例を示している。４０塩基対二重鎖は、ダイサーによって、何れかの末端から得られる２０塩基対の産物へ切断される。表示を容易にするために、ダイサーによって生成された突出は図示されていないが、補うことが可能である。４つの標的化配列が示されている。相同性を有する標的配列は、箱によって囲まれている。この設計方式は、より大きなＲＮＡへ拡張することができる。化学的に安定化されたｓｉＮＡがダイサーによって結合される場合、戦略的に配置されたリボヌクレオチド結合は、本発明者らの多機能性設計のより大規模なレパートリーを許容する切断産物の設計を可能とし得る。例えば、約２２ヌクレオチドのダイサー標準に限定されない切断産物は、標的配列同一性の重複が例えば約３から約１５ヌクレオチドにわたる多機能性ｓｉＮＡ構築物を可能とし得る。 図２７は、本発明のさらなる多機能性ｓｉＮＡ構築物設計の非限定的な例を示している。一例において、改善された送達又は薬物動態学的特性を可能とするために、抱合体、リガンド、アプタマー、標識又は他の部分が多機能性ｓｉＮＡの領域に付着される。 図２８は、本発明のさらなる多機能性ｓｉＮＡ構築物の設計の非限定的な例を示している。一例において、改善された送達又は薬物動態学的特性を可能とするために、抱合体、リガンド、アプタマー、標識又は他の部分が多機能性ｓｉＮＡの領域に付着される。 図２９は、本発明のコレステロール抱合されたｓｉＮＡ分子を合成するために使用することができるコレステロール連結されたホスホルアミダイトの非限定的な例を示している。コレステロール部分がｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端に連結された例が示されている。 図３０は、ＨＣＶ感染のマーモセットモデルにおいてＧＢＶ−Ｂを標的とする二本鎖核酸分子カクテル製剤の非限定的な例を示す。ＧＢＶ−Ｂは、抗ウイルス化合物及びＨＣＶ感染用ワクチンの検査のための小動物モデルを提供する。２匹の動物に、ＧＢＶ−Ｂを接種し、感染から一日後に、３ｍｇ／ｋｇの製剤化された活性なｓｉＮＡ（Ｓｉｒｎａ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｎｏｓ．３３１４９／３５１８０及び３１７０３／３５１７６、Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ＬＮＰ−０８６；表３及び４を参照。）で静脈内処理を開始した。陰性対照としての役割を果たすために、別の２匹の動物には、ＧＢＶ−Ｂを接種したが、処理は施さなかった。ＧＢＶ−Ｂ感染の治療の効果を決定するために、動物をモニターした。ウイルス力価を測定するために、研究の間、採血を行った。第０日目での接種から１日後、３日後及び７日後に、被処理動物中での製剤化されたｓｉＲＮＡの投薬を反復した。図に示されているように、これらの動物は、処理されていない対照動物と比べて、３週間にわたって、ＧＢＶ−Ｂの著しい阻害を示す。 図３１は、確立されたＧＢＶ感染を有し、感染から２８日、３１日及び３５日後の時点で、製剤化された活性なｓｉＮＡ（Ｓｉｒｎａ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｎｏｓ．３３１４９／３８７５８及び３１７０３／３８７５９、Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ＬＮＰ−０８６；表３及び４参照）で処理された動物におけるＧＢＶ感染の阻害の被限定的な例を示している。この動物は、処理されていない歴史的対照と比べて、活性化合物の投薬後に、検出限界を下回るまで、ウイルス力価の減少を示した。

Claims (23)

1. 互いに相補的である第１の鎖と第２の鎖を各々有する、第１の二本鎖核酸分子と第２の二本鎖核酸分子とを含む組成物であり、前記第１の二本鎖核酸分子の第２の鎖が、配列番号１４４４を含むＨＣＶ配列に相補的である１５から３０ヌクレオチドの配列を含み、および前記第２の二本鎖核酸分子の第２の鎖が、配列番号１４１７を含むＨＣＶ配列に相補的である１５から３０ヌクレオチドの配列を含む、組成物。
2. 陽イオン性脂質、中性脂質及びポリエチレングリコール抱合体を更に含む、請求項１の組成物。
3. 陽イオン性脂質、中性脂質、ポリエチレングリコール抱合体及びコレステロールを更に含む、請求項１の組成物。
4. 陽イオン性脂質、中性脂質、ポリエチレングリコール抱合体、コレステロール及び界面活性剤を更に含む、請求項１の組成物。
5. 前記陽イオン性脂質が、ＣＬｉｎＤＭＡ、ｐＣＬｉｎＤＭＡ、ｅＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ及びＤＭＬＢＡからなる群から選択される、請求項２の組成物。
6. 前記陽イオン性脂質が、ＣＬｉｎＤＭＡ、ｐＣＬｉｎＤＭＡ、ｅＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ及びＤＭＬＢＡからなる群から選択される、請求項３の組成物。
7. 前記陽イオン性脂質が、ＣＬｉｎＤＭＡ、ｐＣＬｉｎＤＭＡ、ｅＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ及びＤＭＬＢＡからなる群から選択される、請求項４の組成物。
8. 前記中性脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＯＢＡ及びコレステロールからなる群から選択される、請求項２の組成物。
9. 前記中性脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＯＢＡ及びコレステロールからなる群から選択される、請求項３の組成物。
10. 前記中性脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＯＢＡ及びコレステロールからなる群から選択される、請求項４の組成物。
11. 前記ポリエチレングリコール抱合体が、ＰＥＧ−ジミリストイルグリセリン及びＰＥＧ−コレステロールからなる群から選択される、請求項２の組成物。
12. 前記ポリエチレングリコール抱合体が、ＰＥＧ−ジミリストイルグリセリン及びＰＥＧ−コレステロールからなる群から選択される、請求項３の組成物。
13. 前記ポリエチレングリコール抱合体が、ＰＥＧ−ジミリストイルグリセリン及びＰＥＧ−コレステロールからなる群から選択される、請求項４の組成物。
14. 前記ＰＥＧが２ＫＰＥＧである、請求項１３の組成物。
15. 前記界面活性剤が、パルミチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール及びリノレイルアルコールからなる群から選択される、請求項４の組成物。
16. 前記陽イオン性脂質がＣＬｉｎＤＭＡであり、前記中性脂質がＤＳＰＣであり、前記ポリエチレングリコール抱合体が２ＫＰＥＧ−ＤＭＧであり、前記コレステロールがコレステロールであり、前記界面活性剤がリノレイルアルコールである、請求項４の組成物。
17. 前記ＣＬｉｎＤＭＡ、前記ＤＳＰＣ、前記２ＫＰＥＧ−ＤＭＧ、前記コレステロール及び前記リノレイルアルコールがそれぞれ４３：３８：１０：２：７のモル比で存在する、請求項１６の組成物。
18. 前記第１の二本鎖核酸分子の前記第１の鎖及び前記第２の鎖がそれぞれ配列番号１７９６及び２１０２を含み、ならびに前記第２の二本鎖核酸分子の前記第１の鎖及び前記第２の鎖がそれぞれ配列番号１６７７及び２１０３を含む、請求項１の組成物。
19. 前記第１の二本鎖核酸分子の前記第１の鎖及び前記第２の鎖がそれぞれ配列番号１７９６及び２０１０を含み、ならびに前記第２の二本鎖核酸分子の前記第１の鎖及び前記第２の鎖がそれぞれ配列番号１６７７及び２０１１を含む、請求項１の組成物。
20. 前記第１の二本鎖核酸分子の前記第１の鎖及び前記第２の鎖がそれぞれ配列番号１７９６及び２０１２を含み、ならびに前記第２の二本鎖核酸分子の前記第１の鎖及び前記第２の鎖がそれぞれ配列番号１６７７及び２０１３を含む、請求項１の組成物。
21. 薬剤として許容される担体又は希釈剤中に請求項１８の組成物を含む、組成物。
22. 薬剤として許容される担体又は希釈剤中に請求項１９の組成物を含む、組成物。
23. 薬剤として許容される担体又は希釈剤中に請求項２０の組成物を含む、組成物。

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