CN101484588B - 抑制pcsk9基因表达的组合物和方法 - Google Patents
抑制pcsk9基因表达的组合物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于抑制PCSK9基因(PCSK9基因)表达的双链核糖核酸(dsRNA),所述dsRNA包含长度小于30个核苷酸且通常为19-25个核苷酸的核苷酸序列反义链,并且所述反义链与PCSK9基因的至少一部分基本互补。本发明还涉及包含所述dsRNA和药学上可接受的载体的药物组合物,使用所述药物组合物治疗由PCSK9基因的表达和PCSK9基因表达导致的疾病的方法,和。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2006年5月11日递交的美国临时申请第60/799,458号,于2006年6月27日递交的美国临时申请第60/817,203号,于2006年8月25日递交的美国临时申请第60/840,089号,于2006年10月18日递交的美国临时申请第60/829,914号和于2007年2月13日递交的美国临时申请第60/901,134号的优先权。所有这些临时申请的内容均通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及双链核糖核酸(dsRNA)及其介导RNA干涉以抑制PCSK9基因表达的用途,以及dsRNA在治疗如高脂血症等可由PCSK9下调介导的病理过程的用途。
背景技术
枯草溶菌素前蛋白转化酶9(Proprotein convertase subtilisin kexin 9,PCSK9)是枯草溶菌素丝氨酸蛋白酶家族的成员。其它8个哺乳动物枯草溶菌素蛋白酶PCSK1-PCSK8(也被称为PC1/3、PC2、弗林蛋白酶、PC4、PC5/6、PACE4、PC7和S1P/SKI-1)是加工多种分泌通路中蛋白质并在多种生物进程中发挥作用的前蛋白转化酶(Bergeron,F.(2000)J.Mol.Endocrinol.24,1-22,Gensberg,K.,(1998)Semin.Cell Dev.Biol.9,11-17,Seidah,N.G.(1999)BrainRes.848,45-62,Taylor,N.A.,(2003)FASEB J.17,1215-1227,和Zhou,A.,(1999)J.Biol.Chem.274,20745-20748)。现已提出PCSK9在胆固醇代谢中发挥作用。PCSK9 mRNA的表达在胆固醇膳食饲养的小鼠中下调(Maxwell,K.N.,(2003)J.Lipid Res.44,2109-2119),在HepG2细胞系中上调(Dubuc,G.,(2004)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.24,1454-1459),而在固醇调节元件结合蛋白(SREBP)的转基因小鼠中上调(Horton,J.D.,(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100,12027-12032),这类似于胆固醇生物合成酶以及低密度脂蛋白受体 (LDLR)。此外,现已发现PCSK9错义突变与常染色体显性高胆固醇血症(Hchola3)相关(Abifadel,M.,et al.(2003)Nat.Genet.34,154-156,Timms,K.M.,(2004)Hum.Genet.114,349-353,Leren,T.P.(2004)Clin.Genet.65,419-422)。因为现已在日本人中发现单核苷酸多态性(SNP)与胆固醇水平相关,因此PCSK9可能还决定普通人群的LDL胆固醇水平(Shioji,K.,(2004)J.Hum.Genet.49,109-114)。
常染色体显性高胆固醇血症(ADH)是单基因疾病,其患者表现为升高的总胆固醇水平和LDL胆固醇水平、肌腱黄色瘤和过早的动脉粥样硬化(Rader,D.J.,(2003)J.Clin.Invest.111,1795-1803)。ADH及退行性疾病隐性遗传性高胆固醇血症(ARH)(Cohen,J.C.,(2003)Curr.Opin.Lipidol.14,121-127)的发病机理是肝脏对LDL吸收的缺陷。阻碍LDL吸收的LDLR突变或LDL上与LDLR结合的载脂蛋白B的突变均可导致ADH。ARH是由ARH蛋白质中的突变造成的,其中ARH蛋白质是通过与网格蛋白相互作用而内吞LDLR-LDL复合物所必需的。因此,如果PCSK9突变是Hchola3家族病的病因,那么PCSK9很可能在受体介导的LDL吸收中起作用。
过表达研究指出PCSK9可以控制LDLR的水平,并以此控制肝脏对LDL的吸收(Maxwe1l,K.N.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101,7100-7105,Benjannet,S.,et al.(2004)J.Biol.Chem.279,48865-48875,Park,S.W.,(2004)J.Biol.Chem.279,50630-50638)。小鼠中由腺病毒介导的小鼠或人PCSK9过表达3或4天可导致总胆固醇水平和LDL胆固醇水平的升高,而在LDLR敲除动物中则未发现此作用(Maxwell,K.N.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101,7100-7105,Benjannet,S.,et al.(2004)J.Biol.Chem.279,48865-48875,Park,S.W.,(2004)J.Biol.Chem.279,50630-50638)。此外,PCSK9过表达造成肝脏LDLR蛋白质的大量减少,但不影响LDLR mRNA水平、SREBP蛋白质水平或SREBP蛋白的细胞核/细胞质比例。这些结果说明PCSK9通过转录后机制直接或间接地降低LDLR蛋白质水平。
现已设计出PCSK9功能缺失突变的小鼠模型(Rashid et.al.,(2005)PNAS,102,5374-5379),并在人类个体中鉴定出PCSK9功能缺失突变(Cohen et al.,(2005),Nature Genetics.,37,161-165)。在这两种情况下,PCSK9功能缺失均导致总胆固醇水平和LDLc胆固醇水平的降低。回顾过去15年的研究成果发 现,缺失一个拷贝PCSK9可降低LDLc,并有助于提高对抗心血管疾病风险的能力(Cohen et.al.,2006N.Engl.J.Med.,354.,1264-1272.)。迄今为止的证据清楚地说明降低PCSK9水平可降低LDLc。
目前已发现双链RNA分子(dsRNA)通过被称为RNA干扰(RNAi)的高度保守的调控机制来阻断基因表达。WO99/32619(Fire et al.)公开了长度为至少25个核苷酸的dsRNA在抑制线虫(C.elegans)基因表达中的用途。现还发现dsRNA在其它生物体中降解靶RNA,其中所述生物体包括植物(参见,例如WO99/53050,Waterhouse et al.和WO99/61631,Heifetz et al.)、果蝇(参见,例如Yang,D.,et al.,Curr.Biol.(2000)10:1191-1200)和哺乳动物(参见WO00/44895,Limmer和DE 101 00 586.5,Kreutzer et al.)。这种天然机制现已成为治疗因基因异常或有害调控而引发的疾病的新型药物的研发热点。
除了在RNAi领域的显著进展以及由下调PCSK9基因表达介导的病理过程治疗的进展之外,人们还需要能够抑制PCSK9基因表达并能够治疗如高脂血症等与PCSK9基因表达相关疾病的药剂。
发明内容
本发明通过使用双链核糖核酸(dsRNA)沉默枯草溶菌素前蛋白转化酶9(PCSK9)表达,从而提供了关于可受PCSK9基因下调调节的疾病治疗的问题解决方案。
本发明提供了双链核糖核酸(dsRNA)以及使用此类dsRNA抑制细胞或哺乳动物中PCSK9基因表达的组合物和方法。本发明还提供了用于治疗如高脂血症等可受PCSK9基因表达下调调节的病症的组合物和方法。本发明的dsRNA包含具有长度小于30个核苷酸且通常长度为19-24个核苷酸区域的RNA链(反义链),并且其中所述区域基本与PCSK9基因mRNA转录本的至少一部分互补。
在一个实施方案中,本发明提供了用于抑制PCSK9基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子。所述dsRNA包含至少两条彼此互补的序列。所述dsRNA包含具有第一序列的正义链和具有第二序列的反义链。所述反义链包含与PCSK9编码mRNA的至少一部分基本互补的核苷酸序列,并且互补区的长度小于30个核苷酸,通常为19-24个核苷酸。所述dsRNA在与表达PCSK9 的细胞接触时可至少抑制40%的PCSK9基因表达。
例如,本发明的dsRNA分子可由dsRNA的第一序列和第二序列组成,其中所述第一序列选自于由表1和表2中正义序列组成的组,所述第二序列选自于由表1和表2中反义序列组成的组。本发明的dsRNA分子可包含天然存在的核苷酸或包含至少一种修饰核苷酸,所述修饰核苷酸例如为2′-O-甲基修饰的核苷酸、包含5′-硫代磷酸酯基团的核苷酸以及与胆甾醇基衍生物相连接的末端核苷酸。或者,所述修饰核苷酸可选自以下组:2′-脱氧-2′-氟代修饰核苷酸、2′-脱氧-修饰核苷酸、锁核苷酸(locked nucleotide)、无碱基核苷酸、2′-氨基-修饰核苷酸、2′-烷基-修饰核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和含有非天然碱基的核苷酸。通常,此类修饰序列可基于所述dsRNA的第一序列和第二序列,其中所述第一序列选自于由表1和表2中正义序列组成的组,所述第二序列选自于由表1和表2中反义序列组成的组。
在另一个实施方案中,本发明提供了包含一种本发明dsRNA的细胞。所述细胞通常为哺乳动物细胞,例如人类细胞。
在另一个实施方案中,本发明提供了抑制生物体(通常为人类受试者)体内PCSK9基因表达的药物组合物,所述药物组合物包含一种或多种本发明的dsRNA以及药学上可接受的载体或递送载体。
在另一个实施方案中,本发明提供了抑制细胞内PCSK9基因表达的方法,所述方法包含以下步骤:
(a)将双链核糖核酸(dsRNA)引入细胞中,其中所述dsRNA包含至少两条彼此互补的序列。所述dsRNA包含正义链和反义链,其中所述正义链包含第一序列,所述反义链包含第二序列。所述反义链包含与PCSK9编码mRNA的至少一部分基本互补的互补区,并且所述互补区域的长度小于30个核苷酸,通常为19-24个核苷酸,并且所述dsRNA在与表达PCSK9接触时可至少抑制40%的PCSK9基因表达;和
(b)将步骤(a)中得到的细胞维持足够长的时间以降解PCSK9基因的mRNA转录本,从而抑制细胞内PCSK9基因的表达。
在另一个实施方案中,本发明提供了治疗、预防或控制如高脂血症等可由PCSK9基因表达下调介导的病理过程的方法,所述方法包含向需要此类治疗、预防或控制的患者施用治疗有效量或预防有效量的一种或多种本发明的 dsRNA。
在另一个实施方案中,本发明提供了抑制细胞内PCSK9基因表达的载体,所述载体包含可操作地与编码本发明dsRNA的至少一条链的核苷酸序列连接的调控序列。
在另一个实施方案中,本发明提供了一种细胞,其包含抑制细胞内PCSK9基因表达的载体。所述载体包含可操作地与编码本发明dsRNA的至少一条链的核苷酸序列连接的调控序列。
附图说明
图1:显示ND-98脂质的结构。
图2:显示靶向PCSK9mRNA的不同ORF区域(具有图中所指出的ORF位点的第一个核苷酸)的16种小鼠特异性PCSK9 siRNA(AL-DP-9327至AL-DP-9342)在C57/BL6小鼠(每组5只)体内的筛选结果。计算各处理组肝脏裂解物中PCSK9 mRNA与GAPDH mRNA比例的平均值,并与使用PBS处理的对照组或使用不相关siRNA(凝血因子VII)的对照组进行比较。
图3:显示靶向PCSK9 mRNA的不同ORF区域(具有图中所指出的ORF位点的第一个核苷酸)的16种人/小鼠/大鼠交叉反应性PCSK9 siRNA(AL-DP-9311至AL-DP-9326)在C57/BL6小鼠(每组5只)体内的筛选结果。计算各处理组肝脏裂解物中PCSK9 mRNA与GAPDH mRNA比例的平均值,并与使用PBS处理的对照组或使用不相关siRNA(凝血因子VII)的对照组进行比较。
PCSK9 mRNA的沉默造成血清总胆固醇水平的下降。
能最有效地敲除PSCK9信使的siRNA显示最显著的胆固醇降低效果(约20-30%)。
图4:显示16种小鼠特异性PCSK9 siRNA(AL-DP-9327至AL-DP-9342)在C57/BL6小鼠(每组5只)体内的筛选结果。计算各处理组血清总胆固醇水平的平均值,并与使用PBS处理的对照组或使用不相关siRNA(凝血因子VII)的对照组进行比较。
图5:显示在16种人/小鼠/大鼠交叉反应性PCSK9 siRNA(AL-DP-9327至AL-DP-9342)在C57/BL6小鼠(每组5只)体内的筛选结果。计算各处理组血清总胆固醇水平的平均值,并与使用PBS处理的对照组或使用不相关 siRNA(凝血因子VII)的对照组进行比较。
图6:显示体外和体内PCSK9沉默结果的比较。
图7A和图7B:显示使用猴原代肝细胞在体外沉默PCSK9的结果。
图8:显示由LNP-01配制的靶向pcsk-9的siRNA的体内活性。
图9:显示由LNP-01配制的修饰亲本分子9314和10792在不同时期的体内活性。修饰型10792清楚地显示出体内沉默活性。
具体实施方式
本发明提供了关于可受PCSK9基因下调调节的治疗疾病的问题解决方案,通过使用双链核糖核酸(dsRNA)沉默PCSK9基因从而提供如高脂血症等疾病的治疗方法。
本发明提供了双链核糖核酸(dsRNA)以及以及使用所述dsRNA抑制细胞或哺乳动物中PCSK9基因表达的组合物和方法。本发明还提供了用于治疗由PCSK9基因表达下调调节的病理过程和疾病的组合物和方法。dsRNA通过被称为RNA干扰(RNAi)的过程指导序列特异性mRNA降解。本发明的dsRNA包含具有长度小于30个核苷酸,通常长度为19-24个核苷酸区域的RNA链(反义链),其中所述区域与PCSK9基因mRNA转录本的至少一部分互补。使用这些dsRNA能够靶向降解参与钠运输的mRNA。使用基于细胞的试验以及动物试验,本发明人已证明极低剂量的这些dsRNA可特异且高效介导RNAi,造成PCSK9基因表达的显著抑制。因此,本发明中包含这些dsRNA的方法和组合物可用于可受PCSK9下调介导的病理过程治疗,例如高脂血症的治疗。
下文的详细说明公开了制备和使用dsRNA和包含dsRNA的组合物以抑制靶基因PCSK9表达,以及治疗如高脂血症等可受PCSK9表达下调调节的疾病的组合物和方法。本发明的药物组合物包含dsRNA和药学上可接受的载体,其中所述dsRNA具有长度小于30个核苷酸,通常长度为19-24个核苷酸互补区域的反义链,其中所述互补区域与PCSK9基因mRNA转录本的至少一部分互补。
因此,本发明的某些方面提供了包含本发明的dsRNA和药学上可接受的载体的药物组合物,使用所述组合物抑制PCSK9基因表达的方法和使用所述 药物组合物治疗可受PCSK9表达下调调节的疾病的方法。
I.定义
为了方便起见,下文提供了本说明书、实施例和权利要求书中使用的特定术语和短语的含义。如果某术语在本说明书其它部分中的用法与本节中提供的其定义之间有明显差异,应以本节中的定义为准。
“G”、“C”、“A”和“U”通常分别代表包含鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而,应理解的是术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可指如下文详述的修饰核苷酸,或具替换部分的替代物(surrogatereplacement moiety)。技术人员熟知可将鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶替换成其它部分而基本不改变包含带有此类替换部分的核苷酸的寡核苷酸碱基配对性质。例如但不限于:包含次黄嘌呤作为其碱基的核苷酸可与包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此,本发明的核苷酸序列中包含尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可被替换成包含如次黄嘌呤等的核苷酸。包含此类替换部分的序列是本发明的实施方案。
本文所使用的“PCSK9”是指枯草溶菌素前蛋白转化酶9基因或蛋白(也被称为FH3、HCHOLA3、NARC-1、NARC1)。所提供的PCSK9的mRNA序列有人类:NM_174936;小鼠:NM_153565;和大鼠:NM_199253。
本文所使用的“靶序列”是指PCSK9基因转录过程中形成的mRNA分子核苷酸序列中的连续部分,包括作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。
本文所用术语“包含序列的链”是指包含核苷酸链的寡核苷酸,该寡核苷酸链通过利用标准核苷酸命名法表示的序列进行阐述。
除非另有说明,否则在用于描述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的关系时,本文所用术语“互补”是指包含所述第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含所述第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双螺旋结构的能力,本领域技术人员可理解这一点。例如,此类条件可以是严格条件,其中所述严格条件可包括400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA,在50℃或70℃下持续12-16小时,随后进行清洗。也可应用其它条件,例如可能在生物体内遇到的生理相关条件。本领域技术人员能够根据杂交核苷酸的最终应用决定最适合于两序列互补试验的系列条件。
这包括包含所述第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含所述第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的全长范围内的碱基配对。本文中这些序列被称为彼此“完全互补”。然而,在本文中当提到所述第一序列与所述第二序列“基本互补”时,所述两个序列可完全互补或在杂交时形成一个或多个,但通常不超过4个、3个或2个错配碱基对,同时保留与其最终应用最相关的条件下的杂交能力。但是,当两个寡核苷酸经设计以杂交形成一个或多个单链悬端时,考虑到互补的定义这种悬端不应该被认做是错配。例如,在包含一条长度为21个核苷酸的寡核苷酸和另一条长度为23个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA中,较长寡核苷酸包含与较短寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列,在本发明的目的下,这种情况也属于“完全互补”。
只要其杂交能力能够满足上述需求,本文所用“互补”序列也可以包含或完全由非Watson-Crick碱基对形成和/或由非天然和修饰核苷酸形成的碱基对形成。
本文中对于dsRNA的正义链与反义链间碱基配对,或dsRNA的反义链与靶序列间碱基配对可使用术语“互补”、“完全互补”和“基本互补”,所述术语可根据其所处上下文进行理解。
本文所用的与信使RNA(mRNA)的“至少一部分基本互补”的多核苷酸是指与目标mRNA(例如,编码PCSK9的mRNA)的连续片段基本互补的多核苷酸。例如,如果多核苷酸的序列与编码PCSK9的mRNA中的非中断片段基本互补,那么所述多核苷酸与PCSK9 mRNA的至少一部分互补。
本文所用术语“双链RNA”或“dsRNA”是指核糖核酸分子的复合物,所述复合物具有双链结构并包含两条反平行且如上所述的基本互补的核酸链。形成所述双链结构的两条链可以是同一条较大RNA分子的不同部分,或者是单独的RNA分子。如果所述两条链为单独的RNA分子,此类dsRNA在文献中常被称为siRNA(“小干扰RNA”)。如果所述两条链为一个较大分子的部分并且通过形成双链结构的一条链3′-末端及另一条链5′-末端之间的非中断核苷酸链相连接,那么所述相连的RNA链被称为“发夹环”、“短发夹RNA”或“shRNA”。如果所述两条链通过形成双链结构的一条链3′-末端及另一条链5′-末端之间的非中断链之外的方式共价连接,那么所述连接结构 被称为“接头(linker)”。所述RNA链可具有相同或不同数量的核苷酸。碱基对的最大值是dsRNA中的最短链减去双链中存在的任何悬端后的核苷酸数目。除双链结构之外,dsRNA可包含一个或多个核苷酸悬端。此外,在本说明书中使用的“dsRNA”可包括对核糖核苷酸的化学修饰,包括对多个核苷酸的修饰,并包括本文公开或本领域已知的所有修饰类型。基于本说明书和权利要求书的目的,“dsRNA”涵盖用于siRNA类型分子的所有此类修饰。
本文所用“核苷酸悬端”是指当dsRNA的一条链的3’末端超过另一条链的5’末端或反之时从dsRNA的双链结构突出的一个或多个未配对核苷酸。“平端”或“平末端”是指在dsRNA的末端没有未配对的核苷酸,即没有核苷酸悬端。“平末端化的”dsRNA是指在其全长范围均为双链的dsRNA,即在此分子任一个末端均没有核苷酸悬端。为清楚起见,在确定siRNA是否具有悬端或平端时,不考虑结合到siRNA的3′-末端或5′-末端的化学帽或非核苷酸的化学部分。
术语“反义链”是指dsRNA中的一条链,其包含与靶序列基本互补的区域。本文所用术语“互补区”是指反义链上与本文所定义的序列(例如靶序列)基本互补的区域。如果互补区与靶序列不完全互补,则最能容许的错配发生在末端区域,并且如果存在错配,则通常位于末端区域,或者例如5′和/或3′末端的6、5、4、3或2个核苷酸之内。
本文所用术语“正义链”是指dsRNA中的一条链,其包含与所述反义链区域基本互补的区域。
如本领域技术人员的理解,所述“引入到细胞中(或向细胞引入)”在用于dsRNA时,是指便于摄取或吸收进入细胞。dsRNA的吸收或摄取可通过非辅助性扩散或主动的细胞过程发生,或者通过辅助试剂或设备发生。此术语的内涵不限定于体外细胞;也可以将dsRNA“引入到细胞中(或向细胞引入dsRNA)”,其中所述细胞是活生物体一部分。在此情况下,引入到细胞中将包括向生物体的递送。例如,在体内递送中,可将dsRNA注射到组织位点或进行全身施用。向体外细胞的引入包括本领域已知的方法,例如电穿孔法和脂质体转染法(lipofection)。
当术语“沉默”和“抑制表达”是针对PCSK9基因的表达时,它们在本文指 至少部分抑制PCSK9基因的表达,通过与第二细胞或细胞群相比可以从第一细胞或细胞群中分离的转录自PCSK9基因的mRNA数量的减少来表示,其中所述第一细胞或细胞群中PCSK9基因被转录且其已经被处理以至PCSK9基因的表达被抑制,所述第二细胞或细胞群与所述第一细胞或细胞群基本相当但其没有作此处理(对照细胞)。抑制度通常用以下方式表示:
或者,将抑制度表示为与PCSK9基因转录在功能上相关的参数的减小,例如由细胞分泌的PCSK9基因编码蛋白质的量,或显示特定表型的细胞数量,例如凋亡细胞的数量。理论上讲,可以组成型地或通过基因工程方法或任意合适的试验在任意表达所述靶标的细胞中测定PCSK9基因沉默。然而,当需要参考以测定给定dsRNA是否在特定程度上抑制PCSK9基因的表达并因此属于本发明的范围之内时,以下实施例中提供的试验可作为此类参考。
例如,在某些情况下,通过施用本发明的双链寡核苷酸将PCSK9基因的表达抑制至少约20%、25%、35%或50%。在一些实施方案中,通过施用本发明的双链寡核苷酸将PCSK9基因抑制至少约60%、70%或80%。在一些实施方案中,通过施用本发明的双链寡核苷酸将PCSK9基因抑制至少约85%、90%或95%。表1和表2提供了在体外试验中使用不同浓度的不同PCSK9dsRNA分子所获得的宽范围的表达抑制值。
如本文在PCSK9表达的上下文中所使用的,术语“治疗”(“treat”,“treatment”)等是指由下调PCSK9基因介导的病理过程的缓解或减轻。在本发明的上下文中只要它涉及下文陈述的其它任意病症(除可通过下调PCSK9基因介导的病理过程之外),术语“治疗”等表示缓解或减轻至少一种与所述病症相关的症状,或者减缓或逆转所述病症的进程。例如,对于高脂血症,所述治疗可包括降低血脂水平。本文所用短语“治疗有效量”和“预防有效量”是指在可通过PCSK9基因下调介导的病理过程或在可通过PCSK9基因下调介导的病理过程的一个明显症状的治疗、预防或控制中产生治疗效果的量。治疗有效的特定量可简单地由普通医务工作者来确定,并可根据本领域已知的因素进行改变,例如可通过下调PCSK9基因介导的病理过程的类 型,患者的病史和年龄,可通过下调PCSK9基因表达介导的病理过程的阶段,以及对可通过下调PCSK9基因表达介导的病理过程的抗性药物的施用。
本文所用“药物组合物”包含药理学有效量的dsRNA和药学上可接受的载体。本文所用“药理学有效量”、“治疗有效量”或“有效量”是指有效产生所需药理学、治疗性或预防性结果的RNA量。例如,如果认为使疾病或病变相关的可测量参数下降至少25%的给定临床治疗为有效治疗,那么用于治疗所述疾病或病变的药物的治疗有效量是将所述参数减少至少25%时所必需的量。术语“药学上可接受的载体”是指施用治疗剂所用的载体。此类载体包括但不限于盐溶液、缓冲盐溶液、葡萄糖、水、甘油、乙醇和其组合物,并在下文中有详细描述。所述术语明确地排除了细胞培养基。
本文所用“转化细胞”是指向其引入载体的细胞,其中所述载体可表达dsRNA分子。
II.双链核糖核酸(dsRNA)
在一个实施方案中,本发明提供了用于抑制细胞或哺乳动物中PCSK9基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子,其中所述dsRNA包含具有互补区的反义链,所述互补区与PCSK9基因表达过程中形成的mRNA至少一部分互补,并且所述互补区的长度小于30个核苷酸,通常为19-24个核苷酸,并且所述dsRNA在与表达所述PCSK9基因的细胞接触时,可将所述PCSK9基因的表达抑制至少40%。所述dsRNA包含两条充分互补以杂交从而形成双链结构的RNA链。所述dsRNA中的一条链(反义链)包含与靶基因基本互补,或通常为完全互补的互补区,而另一条链(正义链)包含与所述反义链互补的区域,这样当在适当的条件下混合时所述两条链就会杂交并形成双链结构,其中所述靶基因衍生自PCSK9基因表达期间形成的mRNA序列。通常,所述双链结构的长度为15-30个碱基对,更常见18-25个,还更常见19-24个,最常见为19-21个碱基对。类似地,与靶序列互补的区域的长度为15-30个碱基对,更常见18-25个,还更常见19-24个,最常见为19-21个碱基对。本发明的dsRNA还可以包含一个或多个单链核苷酸悬端。可通过下文进一步讨论的本领域已知的标准方法合成所述dsRNA,例如使用自动DNA合成仪(例如,可商购自Biosearch,Applied Biosystems,Inc.)。在优选的实施方案中,所 述PCSK9基因是人类PCSK9基因。在特定的实施方案中,所述dsRNA的反义链包含选自于表1和表2中正义序列链和选自于表1和表2中反义链的第二链。可简单地使用靶序列和PCSK9侧翼序列容易地确定靶向表1和表2提供的靶序列中其它靶向部位的其它反义试剂。在另一个实施方案中,所述dsRNA包含至少一条选自于由表1和表2所示序列组成的组的核苷酸序列。在其它实施方案中,所述dsRNA包含至少两条选自所述组的序列,其中所述至少两条序列中的一条与所述至少两条序列中的另一条互补,并且所述至少两条序列中的一条与在PCSK9基因表达过程中产生的mRNA序列基本互补。通常,所述dsRNA包含两条寡核苷酸,其中将一条寡核苷酸描述为如表1和表2中的正义链,而将第二寡核苷酸描述为如表1和表2中的反义链。
本领域技术人员清楚地知道,目前广泛认为包含20-23个,特别是21个碱基对的双链结构的dsRNA可特别有效地诱导RNA干扰(Elbashir et al.,EMBO 2001,20:6877-6888)。然而,也发现较短或较长的dsRNAs也可同样有效。在一个上述实施方案中,借助于表1和表2提供的寡核苷酸的特质,本发明的dsRNA可包含至少一条最短长度为21nt的链。可以合理地期望,包含一条仅在一端或两端缺失若干个核苷酸的表1和表2的序列的较短dsRNA可具有与上述dsRNA相类似的功效。因此,本发明关注以下所描述的dsRNA:其包含来自表1和表2的一条序列的部分序列(至少15、16、17、18、19、20或更多个连续的核苷酸),且在下文中所述的FACS试验中其抑制PCSK9基因表达能力的区别在于抑制能力不超过包含全长序列dsRNA的抑制能力的5、10、15、20、25或30%。可使用所提供的PCSK9序列和靶序列简单地制备在表1和表2提供的靶序列内部进行切割的其它dsRNA。此外,表1和表2提供的RNAi试剂可识别PCSK9 mRNA内对基于RNAi的切割敏感的位点。因此,本发明还包括靶向被本发明一种试剂靶向的序列之内的RNAi试剂。如本文所使用的,如果第二RNAi试剂在与第一RNAi试剂反义链互补的mRNA中任意位点进行切割,则第二RNAi试剂可被称为靶向所述第一RNAi试剂的序列之内的RNAi试剂。此类第二试剂可通常由来自表1和表2提供的一条序列的至少15个连续核苷酸组成,并连接有来自PCSK9基因中选定序列的相邻区域的其它核苷酸序列。例如,将SEQ ID NO:1(减去添加的AA序列)的最后15个核苷酸和靶基因PCSK9的随后6个核苷酸结合可产生 基于表1和表2提供的一条序列且长度为21个核苷酸的单链试剂。
本发明的dsRNA可以包含与靶序列的一个或多个错配。在一个优选实施方案中,本发明的dsRNA包含不超过3个错配。如果所述dsRNA的反义链包含与靶序列的错配,则优选所述错配区域不位于互补区的中心。如果所述dsRNA的反义链包含与靶序列的错配,则优选所述错配区域被限制为任一末端的5个核苷酸,例如互补区5′-或3′-末端的5、4、3、2或1个核苷酸。例如,对于与PCSK9基因中一个区域互补的23个核苷酸dsRNA链而言,所述dsRNA通常在其中心的13个核苷酸内不包含任何错配。本文所述的方法可用于检测包含与靶序列错配的dsRNA是否能有效抑制PCSK9基因的表达。对带有错配的dsRNA在抑制PCSK9基因表达中的效力的考虑非常重要,特别是在已知PCSK9基因中的特定互补区在群体中具有多态性序列变异的情况下。在一个实施方案中,dsRNA的至少一个末端具有1-4个,通常1或2个核苷酸的单链核苷酸悬端。与其平端对应物相比,具有至少一个核苷酸悬端的dsRNA具有意想不到的较高的抑制特性。此外,本发明人还发现仅一个核苷酸悬端的存在可增强dsRNA的干扰活性,而不影响其整体稳定性。已证明仅具有一个悬端的dsRNA在体内以及多种细胞、细胞培养基、血液和血清中尤其稳定和有效。通常,单链悬端位于反义链的3′-末端,或者正义链的3′-末端。所述dsRNA也可以具有平端,通常位于反义链的5′-末端。此类dsRNA具有改进的稳定性和抑制活性,因此能够以低剂量施用,即每天施用小于5mg/kg受试者体重。通常,所述dsRNA的反义链在3′-末端具有核苷酸悬端,而5′-末端为平端。在另一个实施方案中,悬端中的一个或多个核苷酸被替代为核苷硫代磷酸酯。
在另一个实施方案中,对所述dsRNA进行化学修饰以增强稳定性。可通过本领域的常规方法合成和/或修饰本发明的核酸,例如那些描述于"Currentprotocols in nucleic acid chemistry",Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley &Sons,Inc.,New York,NY,USA中的方法,以上文献通过引用并入本文。所述化学修饰可包括但不限于2′-修饰,对寡核苷酸中其它碱基或糖位点的修饰,向寡核苷酸链中引入非天然碱基,与配体或化学部分的共价连接以及将核苷酸间磷酸键替换成如硫代磷酸酯的其它连接键。可使用不只一种此类修饰。
可通过任意的多种熟知技术完成两条单独dsRNA链的化学连接,例如通 过引入共价键、离子键或氢键、疏水相互作用、范德华或堆积相互作用;通过金属离子配位或通过使用嘌呤类似物完成所述化学连接。通常,可用来修饰dsRNA的化学基团包括但不限于亚甲基蓝;双官能团,通常为双-(2-氯乙基)胺;N-乙酰-N′-(p-乙醛酰苯甲酰基)半胱胺;4-硫尿嘧啶和补骨脂素。在一个实施方案中,所述接头是六乙二醇接头。在这种情况下,可通过固相合成制备所述dsRNA,并根据标准方法(例如,Williams,D.J.,and K.B.Hall,Biochem.(1996)35:14665-14670)并入六乙二醇接头。在特定的实施方案中,通过六乙二醇接头化学连接反义链的5′-末端和正义链的3′-末端。在另一个实施方案中,所述dsRNA中的至少一个核苷酸包含硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯基团。所述dsRNA末端的化学键通常通过三螺旋键形成。表1和表2提供了本发明的修饰RNAi试剂的实例。
在另一个实施方案中,可对两条单链中一个或两个末端的核苷酸进行修饰以防止或抑制细胞酶(例如,但不限于某些核酸酶)的降解活性。本领域中抑制细胞酶对核酸降解活性的已知技术包括但不限于2′-氨基修饰、2′-氨基糖修饰、2′-F糖修饰、2′-F修饰、2′-烷基糖修饰、无电荷骨架修饰、吗啉基修饰、2′-O-甲基修饰和氨基磷酸酯(参见,例如Wagner,Nat.Med.(1995)1:1116-8)。因此,所述dsRNA中核苷酸的至少一个2′-羟基基团被化学基团取代,通常被取代为2′-氨基或2′-甲基。同样可对至少一个核苷酸进行修饰以形成锁核苷酸。此类锁核苷酸包含连接核糖2′-氧和核糖4′-碳的亚甲基桥。包含所述锁核苷酸的寡核苷酸描述于Koshkin,A.A.,et al.,Tetrahedron(1998),54:3607-3630)和Obika,S.et al.,Tetrahedron Lett.(1998),39:5401-5404)。向寡核苷酸中引入锁核苷酸可改进对互补序列的亲和力,并将解链温度提高若干度(Braasch,D.A.and D.R.Corey,Chem.Biol.(2001),8:1-7)。
将配体与dsRNA结合可增强其细胞吸收性以及对特定组织的靶向性或被特定类型的细胞(例如,肝细胞)摄取。在某些情况下,使疏水性配体与dsRNA相结合从而促进对细胞膜的直接穿透或经肝细胞的吸收。或者,与dsRNA结合的配体是受体介导的内吞作用的底物。现已将这些方法用于促进反义寡核苷酸和dsRNA试剂的细胞穿透。例如,现已将胆固醇与多种反义寡核苷酸结合,从而产生与其非结合类似物相比,更具活性的化合物。参见M.Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002,12,103。与寡 核苷酸结合的其它亲脂性化合物包括1-芘丁酸、1,3-双-O-(十六烷基)甘油和甲醇。用于受体介导的内吞作用的配体的一个实例是叶酸。叶酸通过叶酸受体介导的内吞作用进入细胞。带有叶酸的dsRNA化合物可通过叶酸受体介导的内吞作用有效地被运输到细胞中。Li及其同事报道将叶酸结合到寡核苷酸的3′-末端导致所述寡核苷酸的细胞吸收增加8倍(Li,S.;Deshmukh,H.M.;Huang,L Pharm.Res.1998,15,1540)。与寡核苷酸结合的其它配体包括聚乙二醇、糖簇(carbohydrate cluster)、交联剂、卟啉偶联物、运载肽和例如胆固醇的脂类。
在某些情况下,阳离子配体与寡核苷酸的结合导致对核酸酶的抗性提高。阳离子配体的代表性实例是丙基铵和二甲基丙基铵。令人感兴趣的是,有报道称当阳离子配体分散于整个反义寡核苷酸时,所述寡核苷酸保持了其对mRNA的高结合亲和力。参见M.Manoharan Antisense & Nucleic Acid DrugDevelopment 2002,12,103及其参考文献。
可使用具有反应性官能团侧链的dsRNA(例如,将连接分子连接到dsRNA而得到的dsRNA)来合成与配体结合的本发明dsRNA。这种反应性寡核苷酸可直接与商购的配体反应,其中所述配体经合成而具有多种保护基团,或该配体具有与其结合的连接部分。在一些优选实施方案中,本发明的方法通过使用已经适当地与配体结合并且可进一步结合固体支持物的核苷单体来促进与配体结合的dsRNA的合成。可根据本发明方法的一些优选实施方案通过选定的血清结合配体与位于核苷或寡核苷酸的5′-位连接部分之间的反应来制备此类任意结合到固体支持物上的配体-核苷酸偶联物。在某些情况下,首先通过长链氨烷基基团将单体构件单元(monomer building block)共价结合到可控孔度玻璃支持物上,从而制备3′-末端结合有芳烷基配体的dsRNA。随后,通过标准固相合成技术使单体构件单元与结合在固体支持物上的核苷酸相结合。所述单体构件单元可以是核苷酸或适合于固相合成的其它有机化合物。
可通过熟知的固相合成技术便捷且常规制备用于本发明偶联物的dsRNA。有多个供货商销售用于此类合成的设备,包括例如AppliedBiosystems(Foster City,CA)。可额外地或任选地采用其它本领域已知的合成技术。还已知使用类似技术制备其它寡核苷酸,例如硫代磷酸酯和烷基化衍 生物。
可在以下美国专利中找到关于合成特定修饰寡核苷酸的教导:美国专利第5,138,045号和第5,218,105号,涉及结合多胺的寡核苷酸;美国专利第5,212,295号,涉及用于制备具有手性磷连接的寡核苷酸的单体;美国专利第5,378,825号和第5,541,307号,涉及具有修饰骨架的寡核苷酸;美国专利第5,386,023号,涉及骨架经修饰的寡核苷酸和其通过还原性偶联的制备方法;美国专利第5,457,191号,涉及基于3-氮杂嘌呤环系统的修饰核碱基及其合成方法;美国专利第5,459,255号,涉及基于N-2取代嘌呤的修饰核碱基;美国专利第5,521,302号,涉及具有手性磷连接的寡核苷酸的制备方法;美国专利第5,539,082号,涉及肽核酸;美国专利第5,554,746号,涉及具有β-内酰胺骨架的寡核苷酸;美国专利第5,571,902号,涉及合成寡核苷酸的方法和材料;美国专利第5,578,718号,涉及具有烷硫基基团的核苷,其中所述基团可用作接头以与结合至所述核苷酸其它各位点的部分连接;美国专利第5,587,361号和第5,599,797号,涉及具有高手性纯度的硫代磷酸酯键的寡核苷酸;美国专利第5,506,351号,涉及制备2′-O-烷基鸟嘌呤核苷和包括2,6-二氨基嘌呤化合物的相关化合物的方法;美国专利第5,587,469号,涉及具有N-2取代嘌呤的寡核苷酸;美国专利第5,587,470号,涉及具有3-氮杂嘌呤的寡核苷酸;美国专利第5,223,168号和美国专利第5,608,046号,均涉及结合有4′-去甲基核苷的类似物;美国专利第5,602,240号和第5,610,289号,涉及骨架经修饰的寡核苷酸类似物;美国专利第6,262,241号和第5,459,255号,特别涉及合成2′-氟-寡核苷酸的方法。
在本发明的与配体结合的dsRNA以及具有序列特异性连接核苷的配体分子中,可使用标准核苷酸或核苷前体,或者已经具有连接部分的核苷酸或核苷偶联物前体、已经具有连接分子的配体-核苷酸或核苷-偶联物前体,或者具有配体的非核苷构件单元在合适的DNA合成仪上组装寡核苷酸和寡聚核苷。
在使用已经具有连接部分的核苷酸偶联物前体时,通常要完成序列特异性连接核苷的合成,随后使配体分子与连接部分反应以形成结合有配体的寡核苷酸。先前已描述过具有多种分子(例如,类固醇、维生素、脂质和报告分子)的寡核苷酸偶联物(参见Manoharan et al.,PCT申请WO 93/07883)。在优 选的实施方案中,通过使用衍生自配体-核苷偶联物的亚磷酰胺以及可商购并常规用于寡核苷酸合成的标准亚磷酰胺和非标准亚磷酰胺在自动合成仪上合成本发明的寡核苷酸或连接核苷。
向寡核苷酸中的核苷中引入2′-O-甲基、2′-O-乙基、′-O-丙基、′-O-烯丙基、′-O-氨烷基或2′-脱氧-2′-氟代基团可增强所述寡核苷酸的杂交性质。此外,包含硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸具有增强的核酸酶稳定性。因此,本发明的官能化的连接核苷(linked nucleotide)可进一步包括硫代磷酸酯骨架和2′-O-甲基、2′-O-乙基、′-O-丙基、′-O-氨烷基、′-O-烯丙基或2′-脱氧-2′-氟代基团中的一种或两种。例如,可在PCT公开WO 200370918中找到本领域已知的一些寡核苷酸修饰的总结表。
在一些实施方案中,使用DNA合成仪制备在5′-末端具有氨基基团的本发明的官能化核苷序列,并随后与选定配体的活性酯衍生物反应。所述活性酯衍生物为本领域技术人员所熟知。代表性的活性酯包括N-羟基琥珀酰亚胺酯、四氟酚酯、五氟酚酯和五氯酚酯。所述氨基基团与所述活性酯发生反应生成寡核苷酸,其中所述选定配体通过连接基团结合到5′-位点。5′-末端的氨基基团可使用5′-氨基-修饰剂C6试剂制备。在一个实施方案中,可通过使用配体-核苷亚磷酸酰胺将配体分子结合到寡核苷酸的5′-位点,其中所述配体直接地或通过接头间接地连接到5′-羟基基团。通常在自动合成程序结束时使用此类配体-核苷亚磷酸酰胺以获得在5′-末端具有配体的配体结合的寡核苷酸。
修饰的核苷间连接键或骨架的实例包括,例如,硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基膦酸烷基酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3′-5′连接键的硼烷磷酸酯及其2′-5′连接的类似物,以及具有反极性的那些类似物(其中相邻核苷单位对的连接由3′-5′变成5′-3′或由2′-5′变成5′-2′)。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。
涉及制备上述含磷原子连接键的代表性美国专利包括但不限于美国专利第3,687,808号、第4,469,863号、第4,476,301号、第5,023,243号、第5,177,196号、第5,188,897号、第5,264,423号、第5,276,019号、第5,278,302号、第 5,286,717号、第5,321,131号、第5,399,676号、第5,405,939号、第5,453,496号、第5,455,233号、第5,466,677号、第5,476,925号、第5,519,126号、第5,536,821号、第5,541,306号、第5,550,111号、第5,563,253号、第5,571,799号、第5,587,361号、第5,625,050号和第5,697,248号,所述各专利均通过引用并入本文。
其中(即,寡聚核苷中)修饰核苷间连接键或骨架不包含磷原子的实例具有通过短链烷基或环烷基糖间连接键、混合的杂原子和烷基或环烷基糖间连接键,或者一个或多个短链杂原子或杂环糖间连接键形成的骨架。这些包括具有吗啉代连接键(部分由核苷的糖部分形成)的骨架;硅氧烷骨架;硫化物、亚砜和砜骨架;formacetyl和thioformacetyl骨架;methyleneformacetyl和thioformacetyl骨架;含有烯烃的骨架;氨基磺酸酯骨架;亚甲基亚胺和亚甲基肼基骨架;磺酸酯和磺酰胺骨架;酰胺骨架;和其它具有混合的N、O、S和CH2组成部分的骨架。教导制备上述寡聚核苷的代表性美国专利包括但不限于美国专利第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,214,134号、第5,216,141号、第5,235,033号、第5,264,562号、第5,264,564号、第5,405,938号、第5,434,257号、第5,466,677号、第5,470,967号、第5,489,677号、第5,541,307号、第5,561,225号、第5,596,086号、第5,602,240号、第5,610,289号、第5,602,240号、第5,608,046号、第5,610,289号、第5,618,704号、第5,623,070号、第5,663,312号、第5,633,360号、第5,677,437号和第5,677,439号,所述各专利均通过引用并入本文。
在某些情况下,可通过非配体基团修饰寡核苷酸。现已将多种非配体分子与寡核苷酸结合以改善所述寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取,而且可从科技文献中获得进行此类结合的方法。这些非配体部分包括脂质部分,例如胆固醇(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86:6553),胆酸(Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4:1053);硫醚,例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306;Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765);硫代胆固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20:533);脂肪族链,例如,十二烷基二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J.,1991,10:111;Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259:327;Svinarchuk et al.,Biochimie,1993, 75:49);磷脂,例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-磷酸酯(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651;Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18:3777);多胺或聚乙二醇链(Manoharan etal.,Nucleosides & Nucleotides,1995,14:969)或金刚烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651);棕榈基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229)或十八胺或己胺-羰基氧基胆固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923)。上文已经列出了教导此类寡核苷酸偶联物的制备方法的代表性美国专利。典型的结合方法包含合成在序列中一个或多个位点具有氨基接头的寡核苷酸。随后,使用合适的偶联或活化试剂使氨基基团与将要被结合的分子反应。所述结合反应可在寡核苷酸仍结合在固体支持物时进行,或者在寡核苷酸被切割至溶液相后进行。通常通过HPLC纯化寡聚核苷酸偶联物以获得纯的偶联物。特别优选使用胆固醇偶联物,因为此部分(此基团)能够增强对肝细胞的靶向性,而肝细胞是PCSK9的表达位点。
编码RNAi试剂的载体
本发明的dsRNA也可以由重组病毒载体在体内细胞中表达。本发明的重组病毒载体包含编码本发明dsRNA的序列以及任意适合于表达所述dsRNA序列的启动子。合适的启动子包括,例如,U6或H1 RNA pol III启动子序列和巨细胞病毒启动子。对其它合适启动子的选择属于本领域的技术范围。本发明的重组病毒载体也可包含可诱导的或可调控的启动子,以在特定组织或特定细胞内环境中表达dsRNA。下文中更详细地讨论了重组病毒载体在将本发明dsRNA递送至体内细胞中的用途。
本发明的dsRNA可以由重组病毒载体表达为两个分离的互补RNA分子或具有两个互补区域的单个RNA分子。
可以使用能够接受表达dsRNA分子的编码序列的任何病毒载体,例如衍生自腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒(如慢病毒(LV)、棒状病毒、鼠白血病病毒)、疱疹病毒和类似病毒的载体。可适当地通过使用来自其它病毒的包膜蛋白或其它表面抗原对病毒载体进行假型化或通过取代不同的病毒衣壳蛋白,从而改变所述病毒载体的趋向性。
例如,可使用来自于疱疹性口腔炎病毒(VSV)、狂犬病毒、埃博拉病毒、 Mokola病毒和类似病毒的表面蛋白对本发明的慢病毒载体进行假型化。可通过对载体进行基因改造以表达不同的衣壳蛋白血清型而使本发明的AAV载体靶向不同的细胞。例如,表达2型血清型基因组上的2型血清型衣壳蛋白的AAV载体被称为AAV2/2。可以由5型血清型的衣壳蛋白基因取代AAV2/2载体中的此类2型血清型衣壳蛋白基因以产生AAV2/5载体。构建表达不同衣壳蛋白血清型的技术属于本领域的技术范围;参见,例如Rabinowitz J E etal.(2002),J Virol 76:791-801,其公开的全文通过引用并入本文。
适合本发明使用的重组病毒载体的选择、将表达dsRNA的核酸序列插入载体内的方法和将病毒载体递送至目标细胞的方法都属于本领域的技术范围。参见,例如Dornburg R(1995),Gene Therap.2:301-310;Eglitis M A(1988),Biotechniques 6:608-614;Miller A D(1990),Hum Gene Therap.1:5-14;Anderson W F(1998),Nature 392:25-30;和Rubinson D A et al.,Nat.Genet.33:401-406,其公开的全文通过引用并入本文。
优选的病毒载体是那些衍生自AV和AAV的载体。在尤其优选的实施方案中,本发明的dsRNA可以由重组AAV载体表达为两个单独且互补的单链RNA分子,其中所述重组AAV载体包含例如U6或H1RNA启动子,或巨细胞病毒(CMV)启动子。
适合于表达本发明dsRNA的AV载体、构建重组AV载体的方法和将所述载体递送至靶标细胞的方法描述于Xia H et al.(2002),Nat.Biotech.20:1006-1010。
适合于表达本发明dsRNA的AAV载体、构建重组AV载体的方法和将所述载体递送至靶标细胞的方法描述于Samulski R et al.(1987),J.Virol.61:3096-3101;Fisher K J et al.(1996),J.Virol,70:520-532;Samulski R et al.(1989),J.Virol.63:3822-3826;美国专利第5,252,479号;美国专利第5,139,941号;国际专利申请WO94/13788和国际专利申请WO93/24641中,其公开的全文通过引用并入本文。
III.包含dsRNA的药物组合物
在一个实施方案中,本发明提供了包含如本文所述的dsRNA和药学上可接受载体的药物组合物。所述包含dsRNA的药物组合物可用于治疗与PCSK9 基因的表达或活性相关的疾病或病变,例如,由PCSK9基因表达下调介导的病理过程的治疗,例如高脂血症。此类药物组合物根据给药方式进行配制。一个实例是配制成经非肠道给药而递送至肝脏的组合物。
以足够抑制PCSK9基因表达的剂量施用本发明的药物组合物。本发明人现已发现,因为其效力得到提高,包含本发明dsRNA的组合物能够以意想不到的低剂量施用。每天5mg dsRNA/kg受试者体重的剂量足以抑制PCSK9基因的表达,并且可向患者全身给药(系统给药)。
通常,dsRNA的合适剂量是每天0.01至5.0mg/kg受试者体重,通常为每天1μg至1mg/kg体重。药物组合物可以每天施用一次,或者可以在一天内以适当的间隔分两个、三个或多个亚剂量施用dsRNA,或者甚至通过连续输注或通过控释制剂递送给药。在这种情况下,每个亚剂量中所包含的dsRNA必须相对较少以达到每天的总剂量。也可将剂量单位组合以用于数天的给药,例如使用常规持续释放制剂以在数天内提供持续释放的dsRNA。持续释放制剂是本领域所熟知的技术。
熟练的技术人员可以理解某些因素可能影响有效治疗受试者所需要的剂量和时间,所述因素包括但不限于疾病或病变的严重程度、先期治疗、受试者的综合健康度和/或年龄以及存在的其它疾病。此外,使用治疗有效量的组合物对受试者进行的治疗可以包括单次治疗或一系列治疗。如本文其它部分所述,可以使用常规方法学或者使用合适的动物模型在体内检测的基础上评估本发明所涵盖的单个dsRNA的有效量和体内半衰期。
随着小鼠遗传学的进展,已经产生了用于研究多种人类疾病(例如,可由PCSK9基因表达下调介导的病理过程)的多种小鼠模型。此类模型可用于dsRNA的体内检测以及确定治疗有效剂量。
可使用任何方法向哺乳动物施用本发明的dsRNA。例如,可直接服用、口服或经胃肠外(例如,通过皮下、心室内、肌肉或腹膜内注射或通过静脉点滴)施用。可快速施用(例如,通过注射)或在一段时间内进行施用(例如,通过慢速输注或施用缓释制剂)。
通常,在治疗患有高脂血症的哺乳动物时通过胃肠外途径全身施用dsRNA分子。例如,可以经静脉向患者施用使用或不使用脂质体制备的结合或未结合的dsRNA。因此,可将dsRNA分子制备成组合物,例如灭菌和未 灭菌的水溶液、非水溶液(如在常规溶剂(例如,醇类)中的非水溶液)、或者其为在液态或固态油基质中的溶液。此类溶液也可包含缓冲剂、稀释剂和其它适合的添加剂。在经肠胃外、鞘内或心室内施用时,可将dsRNA分子制备成组合物(例如灭菌水溶液),所述组合物也可包含缓冲剂、稀释剂和其它适合的添加剂(例如,促透剂、载体化合物和其它药学上可接受的载体)。
此外,可通过如美国专利第6,271,359号所述的生物或非生物方式向哺乳动物施用dsRNA分子。非生物给药可通过多种方法完成,包括但不限于(1)将本发明提供的dsRNA酸分子负载到脂质体,和(2)将dsRNA分子与脂质或脂质体复合以形成核酸-脂质或核酸-脂质体复合物。所述脂质体由常用于体外细胞转染的阳离子脂质和中性脂质组成。阳离子脂质可复合(例如,电结合)带负电的核酸以形成脂质体。阳离子脂质体的实例包括但不限于:lipofectin、lipofectamine、lipofectace和DOTAP。形成脂质体的方法是本领域熟知的,例如,可由卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二棕榈酰卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油或二油酰磷脂酰乙醇胺形成所述脂质体组合物。可商购多种亲脂性试剂,包括Lipofectin.RTM.(Invitrogen/Life Technologies,Carlsbad,Calif.)和Effectene.TM.(Qiagen,Valencia,Calif.)。此外,可使用商购的阳离子脂质(例如,DDAB或DOTAP)优化全身性给药方法,其中分别将各阳离子脂质与中性脂质(例如,DOPE或胆固醇)相混合。在一些情况下,可使用如Templetonet al.(Nature Biotechnology,15:647-652(1997))中所述的那些脂质体。在其它实施方案中,可使用如聚乙烯亚胺的聚阳离子完成体内和转体(ex vivo)给药(Boletta et al.,J.Am Soc.Nephrol.7:1728(1996))。关于使用脂质体递送核酸的其它信息可在美国专利第6,271,359号、PCT公开WO 96/40964和Morrissey,D.et al.2005.Nat Biotechnol.23(8):1002-7中找到。
生物递送可通过多种方法完成,包括但不限于使用病毒载体。例如,可使用病毒载体(例如,腺病毒和疱疹病毒载体)向肝细胞递送dsRNA分子。可使用标准的分子生物学技术将一条或多条本文所提供dsRNA引入到早期开发的用于向细胞递送核酸的多种不同病毒载体之一中。例如,可使用所得的这些病毒载体通过转染将一条或多条dsRNA递送到细胞中。
可在药学上可接受的载体或稀释剂中制备本发明的dsRNA。所述“药学上可接受的载体”(本文中也称为“赋形剂”)为药学上可接受的溶剂、悬浮剂或任意其它药学上惰性的载体。所述药学上可接受的载体可以是液体或固体,并可根据所计划的施用方式进行选择以提供所需的体积、稠度和其它相关的输送性质和化学性质。通常的药学上可接受的载体包括但不限于例如水、盐溶液、粘合剂(例如,聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填料(例如,乳糖和其它糖、明胶或硫酸钙)、润滑剂(例如,淀粉、聚乙二醇或乙酸钠)、崩解剂(例如,淀粉或淀粉乙醇酸钠)和湿润剂(例如,十二烷基硫酸钠)。
此外,可将靶向PCSK9基因的dsRNA制备成包含所述dsRNA的组合物,其中所述dsRNA与其它分子、分子结构或核酸混合物相混合、包封、结合或联合。例如,包含一种或多种靶向PCSK9基因的dsRNA的组合物可包含其它治疗剂,例如其它降脂剂(例如,他汀类)。
可受PCSK9表达下调调节的疾病的治疗方法
本文所述的方法和组合物可用于治疗可受PCSK9基因表达下调调节的疾病和病症。例如,本文所述的组合物可用于治疗高脂血症和其它形式的脂质失衡,例如高胆固醇血症、高甘油三酯血症以及与这些病变相关的病理症状,例如心脏和循环系统疾病。
抑制PCSK9基因表达的方法
另一方面,本发明提供了抑制哺乳动物中PCSK9基因表达的方法。所述方法包含向哺乳动物施用本发明的组合物,从而沉默靶基因PCSK9的表达。因为其高特异性,本发明的dsRNA特异性地靶向于靶基因PCSK9的RNA(初级RNA或加工过的RNA)。可根据本文其它部分的描述实施利用dsRNA抑制这些PCSK9基因表达的组合物和方法。
在一个实施方案中,所述方法包括施用包含dsRNA的组合物,其中所述dsRNA包含与待治疗哺乳动物的PCSK9基因RNA转录物的至少一部分互补的核苷酸序列。当待治疗生物体为哺乳动物(例如,人类)时,可以通过本领域已知的任意方式施用所述组合物,包括但不限于经口或非肠道途径,包括经静脉、肌肉、皮下、透皮、气管(气溶胶)施用。在优选的实施方案中,通过静脉输注或注射施用所述组合物。
除非另有定义,否则本文所使用的所有科技术语与本发明所属领域中普
除非另有定义,否则本文所使用的所有科技术语与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的意思相同。虽然在本发明的实施或检验中可以使用与本文所述的类似或等价的方法和材料,但下文仍阐述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献,包括定义均通过参考方式将其全文并入本文。在有冲突的情况下,以包括定义的本说明书为准。另外,所述材料、方法和实施例的目的仅在于进行说明而不具有限定性。
实施例
PCSK9基因的基因步移(gene walking)
进行siRNA设计以在两个单独的筛选组中进行鉴定:
a)靶向人和小鼠或大鼠PCSK9mRNA的siRNA,和
b)预测对靶基因PCSK9具有特异性的所有反应性人siRNA。
使用了人类、小鼠和大鼠PCSK9的mRNA序列。在全部siRNA选择过程中使用人类序列NM_174936.2作为参照序列。
19-mer延伸片段在人类和小鼠中是保守的,在第一步中鉴定出人和大鼠的PCSK9 mRNA序列,产生人-小鼠交叉反应性siRNA以及人-大鼠靶标交叉反应性siRNA的筛选组。
在第二个筛选中鉴定特异靶向人PCSK9的siRNA。摘录所有可能的人PCSK9的19-mer序列并将其定义为候选靶序列。表1和表2列出了所有与人、猴有交叉反应的序列,以及对小鼠、大鼠、人和猴有交叉反应的序列。表1和表2以及附图2-8的实例中还列出了这些序列的化学修饰变体及其在体外和体内试验中的活性。
为了对候选靶序列及其对应siRNA进行分级并选择适合的候选序列,采用经预测的所述siRNA与无关靶标相互作用的潜力(脱靶潜力)作为分级参数。将具有低脱靶潜力的siRNA定义为优选并假定其具有较高的体内特异性。
为了预测siRNA特异性脱靶潜力,提出了一下假定:
1)链中第2至第9位(由5′向3′计数)(种子区)对脱靶潜力的贡献可能大于其余序列(非种子区和切割位点区)
2)链中第10和第11位(由5′向3′计数)(切割位点区)对脱靶潜力的贡献可能大于非种子区
3)每条链中的第1和第19位与脱靶相互作用无关
4)可基于siRNA链序列与基因序列的互补性以及错配位点计算各基因和各链的脱靶分数
5)对于脱靶潜力必须考虑预测脱靶数量以及最高脱靶分数
6)认为脱靶分数与脱靶潜力的关联性高于脱靶数量
7)假设通过引入内在修饰可能终止正义链活性,那么siRNA的脱靶分数仅与反义链的脱靶潜力相关
19-mer候选序列与可公开获取的人mRNA序列进行同源性检索,从而鉴定潜在的脱靶基因。
摘录每条19-mer输入序列,针对各脱靶基因的以下脱靶性质以计算脱靶分数:
非种子区中的错配数量
种子区中的错配数量
切割位点区中的错配数量
参考第1-3条假设按下式计算脱靶分数:
脱靶分数=种子区错配数×10+切割位点区错配数×1.2+非种子区错配数×1
将每条对应于19-mer输入序列的siRNA的最相关脱靶基因定义为具有最低脱靶分数的基因。因此,将最低脱靶分数定义为各siRNA的相关脱靶分数。
dsRNA合成
试剂来源
在本文中未明确指出试剂来源时,可以从任意分子生物学试剂供货商处获得符合分子生物学应用的质量/纯度标准的所述试剂。
siRNA合成
使用Expedite 8909合成仪(Applied Biosystems,Applera DeutschlandGmbH,Darmstadt,Germany)并使用可控孔度玻璃(CPG,ProligoBiochemie GmbH,Hamburg,Germany)作为固相支持物,通过1μ摩尔规模的固相合成产生单链RNA。分别使用相应的亚磷酰胺和2′-O-甲基亚磷酰胺(Proligo Biochemie GmbH,Hamburg,Germany)通过固相合成产生RNA和含2′-O-甲基核苷酸的RNA。利用标准的核苷亚磷酰胺化学法(例如,Current protocols innucleic acid chemistry,Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA所述),将这些构件单元引入寡核苷酸链序列中的选定位点。将碘氧化剂溶液替换成Beaucage试剂(Chruachem Ltd,Glasgow,UK)的乙腈溶液(1%)以引入硫代磷酸酯键。其它助剂可由Mallinckrodt Baker(Griesheim,Germany)获得。
根据常规方法,通过阴离子交换HPLC进行寡核苷酸粗品的脱保护和纯化。利用分光光度计(DU 640B,Beckman Coulter GmbH,Unterschleiβheim,Germany)通过在260nm波长下各RNA溶液的UV吸收测定收率和浓度。通过在退火缓冲液(20mM磷酸钠,pH6.8;100mM氯化钠)中混合等摩尔互补链,在85-90℃的水浴中加热3分钟并在3-4小时内冷却至室温,生成双链RNA。退火的RNA溶液在-20℃储存直至使用。
为了合成3′偶联胆固醇的siRNA(本文中称为-Chol-3′),在RNA合成中使用适当修饰的固体支持物。通过以下方法制备所述修饰的固体支持物:
2-氮杂丁烷-1,4-二羧酸二乙酯 AA
将4.7M的氢氧化钠水溶液(50mL)加入到经搅拌、冰冷却的甘氨酸乙酯盐酸盐(32.19g,0.23摩尔)的水溶液(50mL)中。随后,加入丙烯酸乙酯(23.1g,0.23摩尔)并在室温下搅拌混合物直至通过TLC确认反应完成。19小时后,使用二氯甲烷(3×100mL)使溶液分层。使用无水硫酸钠干燥有机层、过滤并蒸除溶剂。蒸馏残留物以获得AA(28.8g,61%)。
3-{乙氧基羰甲基-[6-(9H-芴-9-基-甲氧基羰基-氨基)-己酰基]-氨基}-丙酸乙酯 AB
将Fmoc-6-氨基-己酸(9.12g,25.83mmol)溶解于二氯甲烷(50mL)中,并用冰冷却。在0℃下,向所得溶液中加入二异丙基碳二亚胺(3.25g,3.99mL,25.83mmol)。随后,加入氮杂丁烷-1,4-二羧酸乙酯(5g,24.6mmol)和二甲基氨基吡啶(0.305g,2.5mmol)。使所得溶液达到室温,并进一步搅拌6小时。通过TLC确定反应完成。真空浓缩反应混合物并加入乙酸乙酯以沉淀二异丙基脲。过滤悬浮液。使用5%盐酸水溶液、5%碳酸氢钠和水清洗滤液。使用硫酸钠干燥合并的有机层并将其浓缩,得到粗产物,通过柱层析(50%EtOAC/己烷)纯化粗产物获得11.87g AB(88%)。
3-[(6-氨基-己酰基)-乙氧基羰甲基-氨基]-丙酸乙酯 AC
在0℃下,将3-{乙氧基羰甲基-[6-(9H-芴-9-基甲氧基羰基-氨基)-己酰基]-氨基}-丙酸乙酯AB(11.5g,21.3mmol)溶解于含20%哌啶的二甲基甲酰胺溶液中。将溶液持续搅拌1小时。真空浓缩反应混合物,向残留物中添加水并使用乙酸乙酯萃取所得产物。将粗产物转化成其盐酸盐而进行纯化。
3-({6-[17-(1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基-氧基羰基氨基]-己酰基}乙氧基羰甲基-氨基)-丙酸乙酯 AD
将3-[(6-氨基-己酰基)-乙氧基羰甲基-氨基]-丙酸乙酯AC的盐酸盐(4.7g,14.8mmol)加入二氯甲烷中。将悬浮液在冰上冷却至0℃。向悬浮液中添加二异丙基乙胺(3.87g,5.2mL,30mmol)。向所得溶液中添加氯甲酸胆固醇酯(6.675g,14.8mmol)。将反应混合物搅拌过夜。使用二氯甲烷稀释反应混合物并使用10%盐酸洗涤。通过快速层析纯化产物(10.3g,92%)。
1-{6-[17-(1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基-氧基羰基氨基]-己酰基}-4-氧代-吡咯烷-3-羧酸乙酯 AE
在30mL干甲苯中使叔丁醇钾(1.1g,9.8mmol)成浆状。将所得混合物在冰上冷却至0℃,并在搅拌下于20分钟内加入5g(6.6mmol)AD二酯。在添加过程中将温度保持在5℃以下。在0℃下持续搅拌30分钟,并加入1mL冰醋酸,随后立即加入含4g NaH2PO4·H2O的40mL水。将所得混合物由二氯甲烷萃取两次(每次100mL),使用磷酸盐缓冲液将合并的有机萃取物洗涤两 次(每次10mL),干燥并蒸发至干。将残留物溶解于60mL甲苯中,冷却至0℃并由三份50mL pH9.5的冷碳酸盐缓冲液进行萃取。使用磷酸将水性萃取物调整至pH3,并使用5份40mL氯仿进行萃取,将萃取液合并、干燥并蒸发至干。使用25%乙酸乙酯/己烷通过柱层析纯化得到1.9g b-酮酯(39%)。
[6-(3-羟基-4-羟甲基-吡咯烷-1-基)-6-氧代-己基]-氨基甲酸17-(1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基酯 AF
在1小时内将甲醇(2mL)滴加到含b-酮酯AE(1.5g,2.2mmol)和硼氢化钠(0.226g,6mmol)的四氢呋喃(10mL)回流混合物中。在回流温度下持续搅拌1小时。冷却至室温后,加入1N HCl(12.5mL),用乙酸乙酯(3×40mL)萃取所得混合物。使用无水硫酸钠干燥合并的乙酸乙酯层,真空浓缩,柱层析(10%MeOH/CHCl3)纯化,得到产物(89%)。
(6-{3-[双-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-4-羟基-吡咯烷-1-基}-6-氧代-己基)-氨基甲酸17-(1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基酯 AG
在真空下与吡啶(2×5mL)一起蒸发从而干燥AF二醇(1.25gm 1.994mmol)。在搅拌下加入无水吡啶(10mL)和4,4′-二甲氧基三苯甲基氯(0.724g,2.13mmol)。在室温下反应过夜。通过加入甲醇终止反应。真空浓缩反应混合物,并向残留物加入二氯甲烷(50mL)。用1M碳酸氢钠水溶液洗涤有机层。使用无水硫酸钠干燥有机层、过滤并浓缩。通过与甲苯进行蒸发除去残留的吡啶。通过柱层析(2%MeOH/氯仿,在5%MeOH/CHCl3中,Rf=0.5)纯化粗产物(1.75g,95%)。
琥珀酸单-(4-[双-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-1-{6-[17-(1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基-氧基羰基氨基]-己酰基}-吡咯烷-3-基)酯 AH
将化合物AG(1.0g,1.05mmol)与琥珀酸酐(0.150g,1.5mmol)和DMAP (0.073g,0.6mmol)混合并在40℃下真空干燥过夜。将所得混合物溶解于无水二氯乙烷(3mL)中,加入三乙胺(0.318g,0.440mL,3.15mmol),并在室温和氩气气氛中将所得溶液搅拌16小时。随后,使用二氯甲烷(40mL)稀释,并使用冰冷的柠檬酸水溶液(5wt%,30mL)和水(2×20mL)洗涤。使用无水硫酸钠干燥有机相,并浓缩至干。将所得残留物直接用于下一个步骤。
胆固醇衍生的CPG AI
将琥珀酸酯AH(0.254g,0.242mmol)溶解于二氯甲烷/乙腈的混合物(3:2,3mL)中。向所得溶液中连续加入DMAP(0.0296g,0.242mmol)的乙腈溶液(1.25mL)、2,2′-二硫代-双(5-硝基吡啶)(0.075g,0.242mmol)的乙腈/二氯乙烷(3:1,1.25mL)溶液。向所得溶液中加入三苯基膦(0.064g,0.242mmol)的乙腈溶液(0.6ml)。反应混合物的颜色变为亮橙色。使用手动震荡器短暂地搅拌溶液(5分钟)。加入长链烷基胺-CPG(LCAA-CPG)(1.5g,61mM)。将悬浮液搅拌2小时。通过烧结漏斗过滤CPG,并依次使用乙腈、二氯甲烷和乙醚洗涤。利用乙酸酐/吡啶掩蔽未反应的氨基基团。采用UV测量法计算所获取的CPG的载量(37mM/g)。
根据WO 2004/065601中的描述合成具有5′-12-月桂酸双癸酰胺基团(本文称为“5′-C32-”)或5′-胆固醇基衍生基团(本文称为“5′-Chol-”)的siRNA,不同的是,对于胆固醇基衍生物,使用Beaucage试剂进行氧化步骤以在核酸寡聚物的5′末端引入硫代磷酸酯键。
使用标准命名法,特别是表1-2的缩写来表示以下核酸序列。
表1-2:在核酸序列表示法中所使用的核苷酸单体的缩写。可以理解这些单体存在于寡核苷酸中时通过5′-3′-磷酸二酯键相互连接。
缩写a | 核苷酸 |
A,a | 2′-脱氧-腺苷-5′-磷酸酯,腺苷-5′-磷酸酯 |
C,c | 2′-脱氧-胞苷-5′-磷酸酯,胞苷-5′-磷酸酯 |
G,g | 2′-脱氧-鸟苷-5′-磷酸酯,鸟苷-5′-磷酸酯 |
T,t | 2′-脱氧-胸苷-5′-磷酸酯,胸苷-5′-磷酸酯 |
U,u | 2′-脱氧-尿苷-5′-磷酸酯,尿苷-5’-磷酸酯 |
N,n | 任意2′-脱氧-核苷酸/核苷酸(G,A,C,或T,g,a,c或u) |
Am | 2′-O-甲基腺苷-5′-磷酸酯 |
Cm | 2′-O-甲基胞苷-5′-磷酸酯 |
Gm | 2′-O-甲基鸟苷-5′-磷酸酯 |
Tm | 2′-O-甲基-胸苷-5′-磷酸酯 |
Um | 2′-O-甲基尿苷-5′-磷酸酯 |
Af | 2′-氟-2′-脱氧-腺苷-5′-磷酸酯 |
Cf | 2′-氟-2′-脱氧-胞苷-5′-磷酸酯 |
Gf | 2′-氟-2′-脱氧-鸟苷-5′-磷酸酯 |
Tf | 2′-氟-2′-脱氧-胸苷-5′-磷酸酯 |
Uf | 2′-氟-2′-脱氧-尿苷-5′-磷酸酯 |
A,C,G,T,U,a,c,g,t, u | 下划线:核苷-5′-硫代磷酸酯 |
am,cm,gm,tm,um | 下划线:2-O-甲基-核苷-5′-硫代磷酸酯 |
a大写字母表示2′-脱氧核糖核酸(DNA),小写字母表示核糖核酸(RNA)
在HuH7、HepG2、Hela和猴原代肝细胞中进行的PCSK9 siRNA筛选发现了高活性序列
HuH-7细胞从JCRB Cell Bank(Japanese Collection of ResearchBioresources)(Shinjuku,Japan,cat.No.:JCRB0403)获取。在37℃和5%CO2气氛的加湿培养箱(Heraeus HERAcell,Kendro Laboratory Products, Langenselbold,Germany)中培养补充有10%胎牛血清(FCS)(Biochrom AG,Berlin,Germany,cat.No.S0115)、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml(Biochrom AG,Berlin,Germany,cat.No.A2213)和2mM L-谷氨酰胺(BiochromAG,Berlin,Germany,cat.No K0282)的Dulbecco’s MEM培养基(Biochrom AG,Berlin,Germany,cat.No.F0435)中的HuH-7细胞。HepG2细胞和Hela细胞从AmericanType Culture Collection(Rockville,MD,cat.No.HB-8065)获取,并在37℃和5%CO2气氛的加湿培养箱(Heraeus HERAcell,Kendro LaboratoryProducts,Langenselbold,Germany)中于补充有10%胎牛血清(FCS)(BiochromAG,Berlin,Germany,cat.No.S0115)、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml(Biochrom AG,Berlin,Germany,cat.No.A2213)、1×非必需氨基酸(BiochromAG,Berlin,Germany,cat.No.K-0293)和1mM丙酮酸钠(Biochrom AG,Berlin,Germany,cat.No.L-0473)的MEM(Gibco Invitrogen,Karlsruhe,Germany,cat.No.21090-022)中培养。
为了进行siRNA转染,将HuH7、HepG2或Hela细胞以2.0×104细胞/孔的密度接种到96孔板中,并直接转染。根据制造商的描述使用lipofectamine2000(Invitrogen GmbH,Karlsruhe,Germany,cat.No.11668-019)进行siRNA(30nM的单剂量筛选)的转染。
转染24小时后,裂解HuH7细胞和HepG2细胞,并根据实验方案使用Quantigene Explore试剂盒(Genosprectra,Dumbarton Circle Fremont,USA,cat.No.QG-000-02)对PCSK9mRNA水平进行定量。相对于GAP-DH mRNA的水平对PCSK9 mRNA水平进行标准化。对每条siRNA记录8个单独的数据点。使用与PCSK9基因无关的siRNA双链作为对照。给定PCSK9特异性siRNA双链的活性表示为经处理细胞中的PCSK9 mRNA浓度相对于使用对照siRNA双链处理的细胞中的PCSK9 mRNA浓度的百分比。
由Invitro Technologies,Inc.(Baltimore,Maryland,USA,cat No M00305)获得猕猴原代肝细胞(冷冻保藏)并于37℃和5%CO2气氛的加湿培养箱内、在InVitroGRO CP培养基(cat No Z99029)中培养。
为了进行siRNA转染,将猕猴原代细胞以3.5×104细胞/孔的密度接种到骨胶原包被的96孔板(Fisher Scientific,cat No.08-774-5)中,并直接转染。根据制造商的描述使用lipofectamine 2000(Invitrogen GmbH,Karlsruhe, Germany,cat.No.11668-019)进行siRNA(从30nM开始进行8次2倍系列稀释)的转染,每个浓度做两份。
转染后16小时,将培养基替换成添加Torpedo Antibiotic Mix(In vitroTechnologies,Inc,cat.No Z99000)的新鲜InVitroGRO CP培养基。
更换培养基24小时后,裂解猕猴原代细胞,并根据实验方案使用Quantigene Explore试剂盒(Genosprectra,Dumbarton Circle Fremont,USA,cat.No.QG-000-02)对PCSK9 mRNA水平进行定量。相对于GAP-DH mRNA的水平对PCSK9mRNA水平进行标准化。随后,比较标准化的PCSK9/GAPDH比值和作为对照组lipofectamine 2000的PCSK9/GAPDH比值。
表1-2(和图6)总结了所得结果并提供了以不同剂量在不同细胞系中进行体内筛选的实例。将PCSK9转录本的沉默表示为给定剂量下残留转录本的百分比。高活性序列是在使用小于或等于100nM剂量的给定siRNA处理后残留的转录本小于70%的序列。极高活性序列是在使用小于或等于100nM剂量的给定siRNA处理后残留的转录本小于60%的序列。活性序列是在使用高剂量(100nM)的给定siRNA处理后残留的转录本小于85%的序列。还使用下文所述的脂质体制剂在小鼠体内对活性siRNA进行了筛选。在体外具有活性的序列通常也在体内具有活性(参见图6)。
PCSK9 siRNA的体内功效筛选
制剂的制备过程
使用lipidoid LNP-01·4HCl(MW1487)(图1)、胆固醇(Sigma-Aldrich)和PEG-神经酰胺C16(Avanti Polar Lipids)制备脂质-siRNA纳米颗粒。分别制备以下乙醇储备溶液:LNP-01 133mg/mL,胆固醇25mg/mL,PEG-神经酰胺C16 100mg/mL。随后,以42:48:10的摩尔比混合LNP-01、胆固醇和PEG-神经酰胺C16的储备溶液。将混合的脂溶液与siRNA水溶液(乙酸钠水溶液,pH5)迅速混合,使乙醇终浓度为35-45%,乙酸钠终浓度为100-300mM。通过混合自然形成脂质-siRNA纳米颗粒。根据所需的粒径分布,在某些情况下使用热桶挤出机(thermobarrel extruder)(Lipex Extruder,Northern Lipids,Inc)将所得纳米颗粒混合物挤过聚碳酸酯膜(截留值为100nm)。在其它情况下,可以省略挤出步骤。通过透析或切向流动过滤除去乙醇并同时完成缓冲液的 更换。将缓冲液更换成磷酸盐缓冲液(PBS)pH7.2。
制剂的表征
由相似的方式表征经标准方法或无挤出方法制备的制剂。首先通过目视检查来表征所述制剂。所述制剂应该是没有聚集或沉积的白色半透明溶液。使用MalvernZetasizer Nano ZS(Malvern,USA)通过动态光散射测定脂质纳米颗粒的粒径和粒径分布。粒径应该为20-300nm,理想地是40-100nm。粒径分布应该为单峰分布。采用染料排斥试验评估制剂中以及诱捕部分中的总siRNA浓度。在存在或不存在破坏制剂的表面活性剂0.5% Triton-X100的条件下,将制备的siRNA样品与RNA结合染料Ribogreen(Molecular Probes)一起温育。通过将由包含表面活性剂的样品产生的信号与标准曲线相比较来测定制剂中的总siRNA。从总siRNA含量中减去“游离”siRNA含量(由不存在表面活性剂时的信号所测定)确定诱捕部分。诱捕siRNA的百分比通常>85%。
单次浓注给药(bolus dosing)
使用27G针通过尾静脉注射对C57/BL6小鼠(每组5只,8-10周龄,Charles River Laboratories,MA)进行siRNA制剂的单次浓注给药。将siRNA以0.5mg/ml的浓度制备成LNP-01制剂(随后使用PBS透析)从而能够以10μl/g体重递送5mg/kg的剂量。给药前将小鼠在红外线灯下放置约3分钟以便于注射。
给药48小时后,通过CO2窒息处死小鼠。通过眼球后部放血收集0.2ml血液,收集肝脏并在液氮中冷冻。将血清和肝脏在-80℃下保存。
使用6850 Freezer/Mill Cryogenic Grinder(SPEX CentriPrep,Inc)粉碎冷冻的肝脏,并在分析前将粉末保存在-80℃下。
根据实验方案,使用来自QuantiGene Reagent System(Genospectra)的基于分支DNA技术的试剂盒检测PCSK9 mRNA水平。在65℃下,将10-20mg冷冻肝脏粉末在含0.16ug/ml蛋白酶K(Epicentre,#MPRK092)的600ul组织和细胞裂解溶液(Epicentre,#MTC096H)中裂解3小时。随后,将10ul裂解物加入到90ul裂解工作液(含1倍体积裂解存储混合液的2倍体积水)中,并在具有小鼠PCSK9特异性探针组和小鼠GAPDH或亲环素B特异性探针组的Genospectra捕获板上于52℃下温育过夜。在软件QuantiGene ProbeDesigner Software2.0(Genospectra,Fremont,CA,USA,cat.No.QG-002-02)的协助下从PCSK9、GAPDH和亲环素B的核酸序列中选择用于捕获增补剂(CaptureExtender(CE))、标记增补剂(Label Extender(LE))和封闭(BL)探针的核酸序列。在Victor2-Light(Perkin Elmer)上读取化学发光作为相对光单位。对各实验组肝脏裂解物中PCSK9 mRNA与GAPDH或亲环素B mRNA的比值计算平均值,并将其与使用PBS的对照组或不相关siRNA(凝血因子VII)的对照组进行比较。
根据制造商的说明书,使用StanBio Cholesterol LiquiColor试剂盒(StanBio Laboratoriy,Boerne,Texas,USA)测定小鼠血清中的总血清胆固醇。使用Victor21420Multilabel Counter(Perkin Elmer)在495nm处进行测定。
实施例
在小鼠模型体内检测制备于LNP-01脂质体中的32种PCSK9 siRNA。所述试验在5mg/kg siRNA剂量下进行,并且与经PBS处理的对照组相比,至少10种PCSK9 siRNA显示出大于40%的PCSK9 mRNA敲除,而经不相关siRNA(凝血因子VII)处理的对照组没有任何影响(图2-5)。PCSK9转录本的沉默还与这些动物中胆固醇的降低相关(图4-5)。此外,具有体外活性的分子与具有体内活性的分子之间具有密切相关性(图6)。对包含不同化学修饰的序列也进行了体外(表1和表2)和体内筛选。例如,在体外(猴原代肝细胞)测试了在LNP-01中制备的较低修饰序列9314和9318以及序列9314的较高修饰型(10792、10793和10796)和序列9318的较高修饰型(10794、10795、10797),或在体内测试了制备在LNP-01中的序列(9314和10792)。图7(也可参见表1和表2)表明在体外亲本分子9314和9318以及其修饰型均具有活性。作为实例的图8表明在体内亲本9314和其较高修饰的10792序列均具有活性,其使小鼠内源PCSK9沉默50-60%。图9进一步例证出亲本9314和10792的其它化学修饰型的活性。
dsRNA表达载体
在本发明的另一方面,由插入到DNA或RNA载体的转录单位表达调节PCSK9基因表达活性的PCSK9特异性dsRNA分子(参见,例如Couture,A,et al.,TIG.(1996),12:5-10;Skillern,A.,et al.,国际PCT公开号WO 00/22113;Conrad,国际PCT公开号WO 00/22114和Conrad,美国专利第6,054,299号)。可将这些转基因作为线性构建物、环状质粒或病毒载体引入,并可以作为整合到宿主基因组的转基因使其并入基因中进行遗传。也可构建所述转基因使其作为染色体外质粒进行遗传(Gassmann,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:1292)。
可通过位于共转染到同一靶细胞的两个单独表达载体上的启动子转录dsRNA的两条单链。或者,通过位于同一表达质粒的两个启动子转录dsRNA的各条单链。在优选的实施方案中,将dsRNA表达为通过多核苷酸序列接头连接的反向重复,从而使所述dsRNA具有茎环结构。
重组dsRNA表达载体通常为DNA质粒或病毒载体。表达dsRNA的病毒载体可以基于但不限于腺相关病毒(综述可参见Muzyczka,et al.,Curr.Topics Micro.Immunol.(1992)158:97-129))、腺病毒(参见,例如Berkner,et al.,BioTechniques(1998)6:616);Rosenfeld et al.(1991,Science 252:431-434),andRosenfeld et al.(1992),Cell 68:143-155))或甲病毒以及其它本领域已知的病毒进行构建。现已使用逆转录病毒将多种基因引入到包括上皮细胞在内的体外和/或体内的多种不同细胞类型中(参见,例如Eglitis,et al.,Science(1985)230:1395-1398;Danos and Mulligan,Proc.NatI.Acad.Sci.USA(1998)85:6460-6464;Wilson et al.,1988,Proc.NatI.Acad.Sci.USA 85:3014-3018;Armentano et al.,1990,Proc.NatI.Acad.Sci.USA 87:61416145;Huber et al.,1991,Proc.NatI.Acad.Sci.USA 88:8039-8043;Ferry et al.,1991,Proc.NatI.Acad.Sci.USA 88:8377-8381;Chowdhury et al.,1991,Science 254:1802-1805;van Beusechem.et al.,1992,Proc.Nad.Acad.Sci.USA 89:7640-19;Kay et al.,1992,Human Gene Therapy 3:641-647;Dai et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10892-10895;Hwu et al.,1993,J.Immunol.150:4104-4115;美国专利第4,868,116号;美国专利第4,980,286号;PCT申请WO 89/07136;PCT申请WO 89/02468;PCT申请WO 89/05345;和PCT申请WO 92/07573)。可以通过将重组逆转录病毒基因组转染到合适的包装细胞系(例如,A317和Psi-CRIP)中从而产生能够进行转化并表达插入到细胞基因组中基因的重组逆转录病毒载体(Comette et al.,1991,Human Gene Therapy 2:5-10;Cone et al., 1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6349)。重组腺病毒载体可以用于感染易感宿主(例如,大鼠、仓鼠、狗和黑猩猩)中的多种细胞和组织(Hsu et al.,1992,J.Infectious Disease,166:769),并且具有不需要用于感染的有丝分裂活性细胞的优点。
在本发明DNA质粒或病毒载体中驱动dsRNA表达的启动子可以是真核RNA聚合酶I(例如,核糖体RNA启动子)、RNA聚合酶II(例如,CMV早期启动子,或肌动蛋白启动子,或U1 snRNA启动子),或通常为RNA聚合酶III启动子(例如,U6 snRNA或7SK RNA启动子)或者原核启动子(例如,T7启动子,前提是该表达质粒还编码T7启动子转录所需的T7 RNA聚合酶)。所述启动子还可以引导转基因在胰腺的表达(参见,例如胰腺的胰岛素调控序列,(Bucchini et al.,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:2511-2515))。
另外,可以通过利用如可诱导的调控序列和表达系统精确调控转基因的表达,例如通过使用对某些生理调节剂(例如,循环系统葡萄糖浓度或激素)敏感的调控序列进行调控(Docherty et al.,1994,FASEB J.8:20-24)。适合在细胞或哺乳动物中控制转基因表达的可诱导表达系统包括通过蜕皮激素、雌激素、孕酮、四环素、二聚作用的化学诱导剂和异丙基-β-D1-硫代半乳糖吡喃糖苷(EPTG)进行的调控。本领域的技术人员能够根据dsRNA转基因的期望用途选择适当的调控/启动子序列。
通常,如下文所述将表达dsRNA分子的重组载体递送到并保留在靶细胞中。或者,可使用提供dsRNA分子瞬时表达的病毒载体。如果需要,可以重复施用此类载体。所述dsRNA一经表达即与靶标RNA结合并调节其功能或表达。可以全身递送表达dsRNA的载体,例如通过静脉或肌肉施用,通过施用于来自患者的外植靶细胞随后将其重新引入到患者体内,或可将其引入到所需靶细胞的其它任何方式进行递送。
通常将表达dsRNA的DNA质粒与阳离子脂质载体(例如,Oligofectamine)或基于脂质的非阳离子载体(例如,Transit-TKOTM)一起作为复合体转染到靶细胞中。本发明也关注于可在一周或更长的时间内对单个PCSK9基因的不同区域或多个PCSK9基因进行dsRNA介导的靶向敲除的多重脂质转染。可使用多种已知方法监测本发明载体向宿主细胞的成功引入。例如,在瞬时转染中,可使用报告子,例如荧光标记(例如,绿色荧光蛋白(GFP))发出信号。可 使用向转染细胞提供对特定环境因子(例如,抗生素和药物)抗性,例如,潮霉素B抗性的标记,从而确保离体细胞的稳定转染。
也可将PCSK9特异性dsRNA分子插入到载体中并作为基因治疗载体用于人类患者。例如,可以通过静脉注射、局部施用(参见美国专利第5,328,470号),或者通过立体定位注射(参见,例如Chen et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3054-3057)将基因治疗载体递送至受试者中。基因治疗载体的药物制剂可以包括基因治疗载体的可接受稀释液溶液,或者可以包含包埋有基因递送载体的缓释基质。或者,在可以完整地从重组细胞中产生完全基因递送载体(例如,逆转录病毒载体)时,所述药物制剂可以包含一种或多种产生基因递送系统的细胞。
本领域技术人员熟知所述方法和组合物以及本公开中特别列出的那些方法和组合物,这些方法和组合物能够使本领域技术人员在下文全部权利要求书范围内实施本发明。
Claims (18)
1.用于抑制细胞内人PCSK9基因表达的双链核糖核酸,其中所述双链核糖核酸包含两条互补的序列,所述双链核糖核酸由长度为19-24个核苷酸的双链结构和,在存在单链核苷酸悬端的情况下,1-4个核苷酸的单链核苷酸悬端组成,并且其中的正义链包含第一序列,反义链包含第二序列,所述第二序列包含与编码PCSK9的mRNA的至少一部分基本互补的互补区,其中所述第一序列是序列号1229的序列且所述第二序列是序列号1230的序列;或所述第一序列是序列号1227的序列且所述第二序列是序列号1228的序列,且其中所述双链核糖核酸在接触表达所述PCSK9的细胞时抑制所述PCSK9基因的表达。
2.如权利要求1所述的双链核糖核酸,其中所述正义链由第一序列组成,和所述反义链由第二序列组成。
3.如权利要求1或2所述的双链核糖核酸,其中所述双链核糖核酸进一步包含至少一个核苷酸修饰。
4.如权利要求3所述的双链核糖核酸,其中所述核苷酸修饰选自:2′-O-甲基修饰核苷酸、包含5′-硫代磷酸酯基团的核苷酸、与胆固醇衍生物或月桂酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸、2′-脱氧-2′-氟代修饰核苷酸、2′-脱氧-修饰核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2′-氨基-修饰核苷酸、2′-烷基-修饰核酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然碱基的核苷酸。
5.用于抑制人体内PCSK9基因表达的药物组合物,所述药物组合物包含双链核糖核酸和药学上可接受的载体,其中所述双链核糖核酸包含两条彼此互补的序列,所述双链核糖核酸由长度为19-24个核苷酸的双链结构和,在存在单链核苷酸悬端的情况下,1-4个核苷酸的单链核苷酸悬端组成,并且其中的正义链包含第一序列,反义链包含第二序列,且所述第二序列包含与编码PCSK9的mRNA的至少一部分基本互补的互补区,其中所述第一序列是序列号1229的序列且所述第二序列是序列号1230的序列;或所述第一序列是序列号1227的序列且所述第二序列是序列号1228的序列,且其中所述双链核糖核酸在接触表达所述PCSK9的细胞时抑制所述PCSK9基因的表达。
6.如权利要求5所述的药物组合物,其中所述正义链由第一序列组成,和所述反义链由第二序列组成。
7.体外抑制细胞内人PCSK9基因表达的方法,所述方法包括:
(a)向所述细胞引入双链核糖核酸,其中所述双链核糖核酸包含两条彼此互补的序列,所述双链核糖核酸由长度为19-24个核苷酸的双链结构和,在存在单链核苷酸悬端的情况下,1-4个核苷酸的单链核苷酸悬端组成,并且其中的正义链包含第一序列,反义链包含第二序列,且所述第二序列包含与编码PCSK9的mRNA的至少一部分基本互补的互补区,其中所述第一序列是序列号1229的序列且所述第二序列是序列号1230的序列;或所述第一序列是序列号1227的序列且所述第二序列是序列号1228的序列,且其中所述双链核糖核酸在接触表达所述PCSK9的细胞时抑制所述PCSK9基因的表达,和
(b)将步骤(a)中得到的细胞维持足够长的时间以降解PCSK9基因的mRNA转录本,从而抑制细胞中PCSK9基因的表达。
8.如权利要求7所述的方法,其中所述正义链由第一序列组成,和所述反义链由第二序列组成。
9.双链核糖核酸在制备治疗、预防或控制可由人PCSK9基因表达下调介导的病理过程的药物中的用途,所述可由PCSK9基因表达下调介导的病理过程是高脂血症,其中所述双链核糖核酸包含两条彼此互补的序列,所述双链核糖核酸由长度为19-24个核苷酸的双链结构和,在存在单链核苷酸悬端的情况下,1-4个核苷酸的单链核苷酸悬端,并且其中的正义链包含第一序列,反义链包含第二序列,且所述第二序列包含与编码PCSK9的mRNA的至少一部分基本互补的互补区,其中所述第一序列是序列号1229的序列且所述第二序列是序列号1230的序列;或所述第一序列是序列号1227的序列且所述第二序列是序列号1228的序列,且其中所述双链核糖核酸在接触表达所述PCSK9的细胞时抑制所述PCSK9基因的表达。
10.如权利要求9所述的用途,其中所述正义链由第一序列组成,和所述反义链由第二序列组成。
11.如权利要求10所述的用途,其中所述可由PCSK9基因表达下调介导的病理过程是高胆固醇血症或高甘油三酯血症。
12.抑制细胞内人PCSK9基因表达的载体,其中所述载体包含可操作地连接于编码双链核糖核酸中至少一条链的核苷酸序列的调节序列,其中所述双链核糖核酸的一条链与编码PCSK9的mRNA的至少一部分基本互补,并且其中所述双链核糖核酸的长度小于30个碱基对,其中所述与编码PCSK9的mRNA的至少一部分基本互补的双链核糖核酸的一条链为序列号1230的序列或序列号1228的序列,且其中所述双链核糖核酸在接触表达所述PCSK9的细胞时抑制所述PCSK9基因的表达。
13.细胞,其包含权利要求1-4任一项所述的双链核糖核酸或权利要求12所述的载体。
14.双链核糖核酸在制备用于降低细胞内人PCSK9基因表达水平的药物中的用途,其中所述双链核糖核酸包含两条彼此互补的序列,所述双链核糖核酸由长度为19-24个核苷酸的双链结构和,在存在单链核苷酸悬端的情况下,1-4个核苷酸的单链核苷酸悬端组成,并且其中的正义链包含第一序列,反义链包含第二序列,且所述第二序列包含与编码PCSK9的mRNA的至少一部分基本互补的互补区,其中所述第一序列是序列号1229的序列且所述第二序列是序列号1230的序列;或所述第一序列是序列号1227的序列且所述第二序列是序列号1228的序列,且其中所述双链核糖核酸在接触表达所述PCSK9的细胞时降低所述PCSK9基因的表达水平。
15.如权利要求14所述的用途,其中所述正义链由第一序列组成,和所述反义链由第二序列组成。
16.如权利要求14所述的用途,其中所述接触降低所述PCSK9基因的表达水平。
17.如权利要求15所述的用途,其中所述接触在体外以30nM或更低浓度进行。
18.如权利要求14所述的用途,其中所述药物用于治疗或预防高脂血症。
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US20070173473A1 (en) * | 2001-05-18 | 2007-07-26 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin Kexin 9 (PCSK9) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
KR20140142311A (ko) * | 2003-06-27 | 2014-12-11 | 암젠 프레몬트 인코포레이티드 | 상피 성장 인자 수용체의 결실 돌연변이체 지향 항체 및 그 용도 |
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CA2713379A1 (en) * | 2008-01-31 | 2009-11-05 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene |
AR070316A1 (es) | 2008-02-07 | 2010-03-31 | Merck & Co Inc | Antagonistas de pcsk9 (proproteina subtilisina-kexina tipo 9) |
AR070315A1 (es) | 2008-02-07 | 2010-03-31 | Merck & Co Inc | Anticuerpos 1b20 antagonistas de pcsk9 |
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JP2011517404A (ja) * | 2008-03-20 | 2011-06-09 | クォーク・ファーマシューティカルズ・インク | RTP801を阻害するための新規なsiRNA化合物 |
US10138485B2 (en) | 2008-09-22 | 2018-11-27 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Neutral nanotransporters |
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KR101829469B1 (ko) | 2008-12-04 | 2018-03-30 | 큐알엔에이, 인크. | Epo에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 에리트로포에틴(epo) 관련된 질환의 치료 |
ES2600781T3 (es) | 2008-12-04 | 2017-02-10 | Curna, Inc. | Tratamiento para enfermedades relacionadas con el factor de crecimiento del endotelio vascular (vegf) mediante la inhibición de transcritos antisentido naturales de vegf |
WO2010078536A1 (en) * | 2009-01-05 | 2010-07-08 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Inhibition of pcsk9 through rnai |
WO2010090762A1 (en) | 2009-02-04 | 2010-08-12 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Rna duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality |
WO2010093904A2 (en) | 2009-02-12 | 2010-08-19 | Curna, Inc. | Treatment of brain derived neurotrophic factor (bdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bdnf |
EP2408919B1 (en) | 2009-03-16 | 2017-10-18 | CuRNA, Inc. | Treatment of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (nrf2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf2 |
ES2627763T3 (es) | 2009-03-17 | 2017-07-31 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con el homólogo tipo delta 1 (dlk1) por inhibición de transcrito antisentido natural a dlk1 |
CN102459596B (zh) | 2009-05-06 | 2016-09-07 | 库尔纳公司 | 通过针对脂质转运和代谢基因的天然反义转录物的抑制治疗脂质转运和代谢基因相关疾病 |
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CN102575251B (zh) | 2009-05-18 | 2018-12-04 | 库尔纳公司 | 通过抑制针对重编程因子的天然反义转录物来治疗重编程因子相关的疾病 |
JP2012527248A (ja) | 2009-05-22 | 2012-11-08 | クルナ・インコーポレーテッド | 転写因子e3(tfe3)に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるtfe3およびインスリン受容体基質2(irs2)関連疾患の処置 |
KR101704988B1 (ko) | 2009-05-28 | 2017-02-08 | 큐알엔에이, 인크. | 항바이러스 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 항바이러스 유전자 관련된 질환의 치료 |
WO2010141511A2 (en) | 2009-06-01 | 2010-12-09 | Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. | Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof |
MX2011013421A (es) * | 2009-06-15 | 2012-03-16 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Arnds formulado con lipido de direccionamiento del gen pcsk9. |
WO2010147992A1 (en) * | 2009-06-15 | 2010-12-23 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods for increasing efficacy of lipid formulated sirna |
CA2765509C (en) | 2009-06-16 | 2021-08-17 | Joseph Collard | Treatment of paraoxonase 1 (pon1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to pon1 |
WO2010148050A2 (en) | 2009-06-16 | 2010-12-23 | Curna, Inc. | Treatment of collagen gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a collagen gene |
KR101807323B1 (ko) | 2009-06-24 | 2017-12-08 | 큐알엔에이, 인크. | Tnfr2에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 종양 괴사 인자 수용체 2(tnfr2) 관련된 질환의 치료 |
CA2765815A1 (en) | 2009-06-26 | 2010-12-29 | Opko Curna, Llc | Treatment of down syndrome gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a down syndrome gene |
ES2613498T3 (es) | 2009-07-01 | 2017-05-24 | Protiva Biotherapeutics Inc. | Nuevas formulaciones de lípidos para el suministro de agentes terapéuticos a tumores sólidos |
WO2011009697A1 (en) | 2009-07-21 | 2011-01-27 | Santaris Pharma A/S | Antisense oligomers targeting pcsk9 |
CA2768947C (en) | 2009-07-24 | 2018-06-19 | Opko Curna, Llc | Treatment of sirtuin (sirt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (sirt) |
EP2462229B1 (en) | 2009-08-05 | 2016-05-11 | CuRNA, Inc. | Treatment of insulin gene (ins) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an insulin gene (ins) |
CN102625841A (zh) | 2009-08-11 | 2012-08-01 | 欧科库尔纳有限责任公司 | 通过抑制脂连蛋白(adipoq)的天然反义转录物治疗脂连蛋白(adipoq)相关疾病 |
US8791087B2 (en) | 2009-08-21 | 2014-07-29 | Curna, Inc. | Treatment of ‘C terminus of HSP70-interacting protein’ (CHIP)related diseases by inhibition of natural antisense transcript to CHIP |
CA2771172C (en) | 2009-08-25 | 2021-11-30 | Opko Curna, Llc | Treatment of 'iq motif containing gtpase activating protein' (iqgap) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to iqgap |
WO2011028938A1 (en) * | 2009-09-02 | 2011-03-10 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods for lowering serum cholestrol in a subject using inhibition of pcsk9 |
WO2011038031A1 (en) * | 2009-09-22 | 2011-03-31 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Dual targeting sirna agents |
JP6175236B2 (ja) | 2009-09-25 | 2017-08-09 | カッパーアールエヌエー,インコーポレイテッド | フィラグリン(flg)の発現および活性の調整によるflg関連疾患の処置 |
US20130079382A1 (en) | 2009-10-12 | 2013-03-28 | Larry J. Smith | Methods and Compositions for Modulating Gene Expression Using Oligonucleotide Based Drugs Administered in vivo or in vitro |
AR079336A1 (es) * | 2009-12-11 | 2012-01-18 | Irm Llc | Antagonistas de la pro-proteina convertasa-subtilisina/quexina tipo 9 (pcsk9) |
KR101823702B1 (ko) | 2009-12-16 | 2018-01-30 | 큐알엔에이, 인크. | 막 결합 전사 인자 펩티다제, 부위 1(mbtps1)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 mbtps1 관련 질환의 치료 |
US20110152343A1 (en) * | 2009-12-22 | 2011-06-23 | Functional Genetics, Inc. | Protease inhibitors and broad-spectrum antiviral |
CN102869776B (zh) | 2009-12-23 | 2017-06-23 | 库尔纳公司 | 通过抑制肝细胞生长因子(hgf)的天然反义转录物而治疗hgf相关疾病 |
RU2619185C2 (ru) | 2009-12-23 | 2017-05-12 | Курна, Инк. | Лечение заболеваний, связанных с разобщающим белком 2 (ucp2), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к ucp2 |
US8962585B2 (en) | 2009-12-29 | 2015-02-24 | Curna, Inc. | Treatment of tumor protein 63 (p63) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to p63 |
WO2011090740A2 (en) | 2009-12-29 | 2011-07-28 | Opko Curna, Llc | Treatment of nuclear respiratory factor 1 (nrf1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf1 |
KR101853511B1 (ko) | 2009-12-31 | 2018-06-20 | 큐알엔에이, 인크. | 인슐린 수용체 기질 2 및 전사 인자 e3(tfe3)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 irs2 관련된 질환의 치료 |
KR101878501B1 (ko) | 2010-01-04 | 2018-08-07 | 큐알엔에이, 인크. | 인터페론 조절 인자 8 (irf8)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 인터페론 조절 인자 8 (irf8) 관련된 질환의 치료 |
KR101853509B1 (ko) | 2010-01-06 | 2018-04-30 | 큐알엔에이, 인크. | 췌장 발달 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 췌장 발달 유전자와 관련된 질환의 치료 |
CA2786535C (en) | 2010-01-11 | 2019-03-26 | Curna, Inc. | Treatment of sex hormone binding globulin (shbg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to shbg |
JP5981850B2 (ja) | 2010-01-25 | 2016-08-31 | カッパーアールエヌエー,インコーポレイテッド | RNaseH1に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるRNaseH1関連疾患の治療 |
JP5976548B2 (ja) | 2010-02-22 | 2016-08-23 | カッパーアールエヌエー,インコーポレイテッド | Pycr1に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるピロリン−5−カルボン酸レダクターゼ1(pycr1)関連疾患の治療 |
US8980856B2 (en) | 2010-04-02 | 2015-03-17 | Curna, Inc. | Treatment of colony-stimulating factor 3 (CSF3) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to CSF3 |
WO2011127337A2 (en) | 2010-04-09 | 2011-10-13 | Opko Curna Llc | Treatment of fibroblast growth factor 21 (fgf21) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to fgf21 |
CA2798218A1 (en) | 2010-05-03 | 2011-11-10 | Curna, Inc. | Treatment of sirtuin (sirt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (sirt) |
TWI531370B (zh) | 2010-05-14 | 2016-05-01 | 可娜公司 | 藉由抑制par4天然反股轉錄本治療par4相關疾病 |
EP2576783B1 (en) | 2010-05-26 | 2017-11-29 | CuRNA, Inc. | Treatment of atonal homolog 1 (atoh1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to atoh1 |
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CN103025873B (zh) | 2010-06-23 | 2018-05-08 | 库尔纳公司 | 通过抑制电压门控钠通道α亚基(SCNA)的天然反义转录物而治疗SCNA相关疾病 |
JP5998131B2 (ja) | 2010-07-14 | 2016-09-28 | カッパーアールエヌエー,インコーポレイテッド | Discslargehomolog(dlg)dlg1への天然アンチセンス転写物の阻害によるdlg関連疾患の治療 |
RU2624048C2 (ru) | 2010-10-06 | 2017-06-30 | Курна, Инк. | Лечение заболеваний, связанных с геном сиалидазы 4 (neu4), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена neu4 |
WO2012054723A2 (en) | 2010-10-22 | 2012-04-26 | Opko Curna Llc | Treatment of alpha-l-iduronidase (idua) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to idua |
EP2633046A4 (en) * | 2010-10-29 | 2015-05-06 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING PCSK9 GENES |
US10000752B2 (en) | 2010-11-18 | 2018-06-19 | Curna, Inc. | Antagonat compositions and methods of use |
KR102010598B1 (ko) | 2010-11-23 | 2019-08-13 | 큐알엔에이, 인크. | Nanog에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 nanog 관련된 질환의 치료 |
AR084938A1 (es) | 2011-01-28 | 2013-07-10 | Sanofi Sa | Anticuerpos humanos contra la proproteina convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (anti pcsk9) para usar en metodos para tratar grupos de pacientes |
EP2699271A4 (en) | 2011-04-20 | 2015-10-07 | Larry J Smith | METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING GENE EXPRESSION USING COMPONENTS THAT SELF-ASSEMBLED IN CELLS AND PRODUCE RNAI ACTIVITY |
RU2620980C2 (ru) | 2011-06-09 | 2017-05-30 | Курна, Инк. | Лечение заболеваний, связанных с фратаксином (fxn), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта fxn |
AR087305A1 (es) | 2011-07-28 | 2014-03-12 | Regeneron Pharma | Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit |
EA029151B1 (ru) | 2011-09-06 | 2018-02-28 | Курна, Инк. | ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С АЛЬФА-СУБЪЕДИНИЦАМИ ПОТЕНЦИАЛЗАВИСИМЫХ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ (SCNxA), С ПОМОЩЬЮ МАЛЫХ МОЛЕКУЛ |
DK2570135T3 (en) * | 2011-09-13 | 2016-02-15 | Affiris Ag | PCSK9-Vaccine |
EP3988104A1 (en) | 2012-02-24 | 2022-04-27 | Arbutus Biopharma Corporation | Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof |
WO2013138374A2 (en) | 2012-03-15 | 2013-09-19 | Curna, Inc. | Treatment of brain derived neurotrophic factor (bdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bdnf |
US9255154B2 (en) | 2012-05-08 | 2016-02-09 | Alderbio Holdings, Llc | Anti-PCSK9 antibodies and use thereof |
JP6574383B2 (ja) * | 2012-12-05 | 2019-09-11 | アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッドAlnylam Pharmaceuticals, Inc. | PCSK9iRNA組成物及びその使用方法 |
MX2015007550A (es) | 2012-12-12 | 2017-02-02 | Broad Inst Inc | Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas. |
EP2931892B1 (en) | 2012-12-12 | 2018-09-12 | The Broad Institute, Inc. | Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof |
TW201515650A (zh) | 2013-05-06 | 2015-05-01 | 艾爾妮蘭製藥公司 | 遞送經脂質調配之核酸分子之劑量及方法 |
EP2810955A1 (en) | 2013-06-07 | 2014-12-10 | Sanofi | Methods for inhibiting atherosclerosis by administering an inhibitor of PCSK9 |
KR20160024906A (ko) | 2013-06-07 | 2016-03-07 | 사노피 바이오테크놀로지 | Pcsk9의 억제제를 투여함에 의한 죽상경화증의 억제 방법 |
EP2862877A1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-22 | Sanofi | Methods for inhibiting atherosclerosis by administering an inhibitor of PCSK9 |
AU2014281031B2 (en) * | 2013-06-17 | 2020-05-21 | Massachusetts Institute Of Technology | Delivery, use and therapeutic applications of the CRISPR-Cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using viral components |
DK3011029T3 (da) | 2013-06-17 | 2020-03-16 | Broad Inst Inc | Administration, modificering og optimering af tandem-guidesystemer, fremgangsmåder og sammensætninger til sekvensmanipulering |
WO2014204725A1 (en) | 2013-06-17 | 2014-12-24 | The Broad Institute Inc. | Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation |
WO2014204727A1 (en) | 2013-06-17 | 2014-12-24 | The Broad Institute Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof |
DK3011031T3 (da) | 2013-06-17 | 2020-12-21 | Broad Inst Inc | Fremføring og anvendelse af crispr-cas-systemerne, vektorer og sammensætninger til levermålretning og -terapi |
BR112015031611A2 (pt) * | 2013-06-17 | 2017-12-12 | Massachusetts Inst Technology | aplicação, manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições para direcionamento e modelação de doenças e distúrbios de células pós-mitóticas |
EP3591054A1 (en) | 2013-06-27 | 2020-01-08 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Antisense oligomers and conjugates targeting pcsk9 |
EP3079725B1 (en) | 2013-12-12 | 2019-10-16 | The Broad Institute, Inc. | Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for genome editing |
EP3080257A1 (en) | 2013-12-12 | 2016-10-19 | The Broad Institute Inc. | Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders |
WO2015089486A2 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | The Broad Institute Inc. | Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems |
WO2015089465A1 (en) * | 2013-12-12 | 2015-06-18 | The Broad Institute Inc. | Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for hbv and viral diseases and disorders |
WO2015089364A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | The Broad Institute Inc. | Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof |
US9023359B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-05-05 | Kymab Limited | Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment |
US9067998B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-06-30 | Kymab Limited | Targeting PD-1 variants for treatment of cancer |
US9034332B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-05-19 | Kymab Limited | Precision medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment |
US8986691B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-03-24 | Kymab Limited | Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA |
US9051378B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-06-09 | Kymab Limited | Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment |
US8986694B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-03-24 | Kymab Limited | Targeting human nav1.7 variants for treatment of pain |
US9017678B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-04-28 | Kymab Limited | Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R |
US8980273B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-03-17 | Kymab Limited | Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA |
US8883157B1 (en) | 2013-12-17 | 2014-11-11 | Kymab Limited | Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment |
US9045545B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-06-02 | Kymab Limited | Precision medicine by targeting PD-L1 variants for treatment of cancer |
US8945560B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-02-03 | Kymab Limited | Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R |
US9045548B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-06-02 | Kymab Limited | Precision Medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment |
US8992927B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-03-31 | Kymab Limited | Targeting human NAV1.7 variants for treatment of pain |
US9914769B2 (en) | 2014-07-15 | 2018-03-13 | Kymab Limited | Precision medicine for cholesterol treatment |
SG11201605247XA (en) * | 2013-12-27 | 2016-08-30 | Bonac Corp | Artificial match-type mirna for controlling gene expression and use therefor |
GB201403775D0 (en) | 2014-03-04 | 2014-04-16 | Kymab Ltd | Antibodies, uses & methods |
US9139648B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-09-22 | Kymab Limited | Precision medicine by targeting human NAV1.9 variants for treatment of pain |
US9150660B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-10-06 | Kymab Limited | Precision Medicine by targeting human NAV1.8 variants for treatment of pain |
KR20170029613A (ko) | 2014-07-16 | 2017-03-15 | 사노피 바이오테크놀로지 | 이형접합성 가족성 고콜레스테롤혈증(heFH) 환자의 치료방법 |
JOP20200115A1 (ar) * | 2014-10-10 | 2017-06-16 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | تركيبات وطرق لتثبيط التعبير الجيني عن hao1 (حمض أوكسيداز هيدروكسيلي 1 (أوكسيداز جليكولات)) |
WO2016094867A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | The Broad Institute Inc. | Protected guide rnas (pgrnas) |
US10792299B2 (en) | 2014-12-26 | 2020-10-06 | Nitto Denko Corporation | Methods and compositions for treating malignant tumors associated with kras mutation |
US11045488B2 (en) | 2014-12-26 | 2021-06-29 | Nitto Denko Corporation | RNA interference agents for GST-π gene modulation |
US20180002702A1 (en) | 2014-12-26 | 2018-01-04 | Nitto Denko Corporation | Methods and compositions for treating malignant tumors associated with kras mutation |
ES2789049T3 (es) * | 2014-12-26 | 2020-10-23 | Nitto Denko Corp | Agentes de interferencia de ARN para modulación génica de GST-pi |
US10264976B2 (en) * | 2014-12-26 | 2019-04-23 | The University Of Akron | Biocompatible flavonoid compounds for organelle and cell imaging |
TW202400626A (zh) | 2015-06-18 | 2024-01-01 | 美商博得學院股份有限公司 | 降低脫靶效應的crispr酶突變 |
WO2016205759A1 (en) | 2015-06-18 | 2016-12-22 | The Broad Institute Inc. | Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation |
EP3337828A1 (en) | 2015-08-18 | 2018-06-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-pcsk9 inhibitory antibodies for treating patients with hyperlipidemia undergoing lipoprotein apheresis |
AU2016312530A1 (en) | 2015-08-24 | 2018-03-01 | Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. | Polynucleotide nanoparticles for the modulation of gene expression and uses thereof |
CN114469984A (zh) | 2015-08-25 | 2022-05-13 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 用于治疗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin(pcsk9)基因相关障碍的方法和组合物 |
WO2017070151A1 (en) | 2015-10-19 | 2017-04-27 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Reduced size self-delivering nucleic acid compounds targeting long non-coding rna |
AU2017346879B2 (en) * | 2016-10-18 | 2023-11-30 | Novartis Ag | Methods for preventing cardiovascular events through proprotein convertase subtilisin kexin 9 (PCSK9) protein reduction |
WO2018083248A1 (en) | 2016-11-03 | 2018-05-11 | Kymab Limited | Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods |
JOP20190112A1 (ar) | 2016-11-14 | 2019-05-14 | Amgen Inc | علاجات مدمجة لتصلب الشرايين، شاملة مرض قلبي وعائي تصلبي |
EP3548005A4 (en) | 2016-11-29 | 2020-06-17 | Puretech Health LLC | EXOSOMES FOR THE ADMINISTRATION OF THERAPEUTIC AGENTS |
JP2019508379A (ja) * | 2017-02-16 | 2019-03-28 | 日東電工株式会社 | 悪性腫瘍に対する治療方法及び治療用組成物 |
JOP20190215A1 (ar) * | 2017-03-24 | 2019-09-19 | Ionis Pharmaceuticals Inc | مُعدّلات التعبير الوراثي عن pcsk9 |
CN110997919B (zh) | 2017-12-01 | 2024-04-02 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 双链寡核苷酸、含双链寡核苷酸的组合物与缀合物及制备方法和用途 |
EP3719127A4 (en) | 2017-12-01 | 2021-10-20 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | NUCLEIC ACID, COMPOSITION AND CONJUGATE WITH IT, MANUFACTURING METHOD AND USE |
CN109957567B (zh) * | 2017-12-26 | 2022-09-23 | 阿格纳生物制药有限公司 | 一种抑制PCSK9基因表达的siRNA分子及其应用 |
AU2017445584B2 (en) * | 2017-12-26 | 2021-08-12 | Argorna Pharmaceuticals Limited | SiRNA molecule inhibiting the expression of the PCSK9 gene and use thereof |
CN109957565B (zh) * | 2017-12-26 | 2023-04-07 | 广州市锐博生物科技有限公司 | 一种修饰的siRNA分子及其应用 |
JP7436030B2 (ja) | 2017-12-29 | 2024-02-21 | スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド | 複合体及びその調製方法と使用 |
EP3765611A4 (en) * | 2018-04-18 | 2022-05-04 | Dicerna Pharmaceuticals, Inc. | OLIGONUCLEOTIDES TARGETING PCSK9 FOR THE TREATMENT OF HYPERCHOLESTEROLEMIA AND RELATED CONDITIONS |
CN111655849B (zh) | 2018-08-21 | 2024-05-10 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 一种核酸、含有该核酸的药物组合物和缀合物及其用途 |
CN111655297A (zh) | 2018-09-30 | 2020-09-11 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 一种siRNA缀合物及其制备方法和用途 |
CN111378656B (zh) * | 2018-12-28 | 2022-07-26 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 一种抑制埃博拉病毒的核酸、含有该核酸的药物组合物及其用途 |
WO2021185765A1 (en) * | 2020-03-16 | 2021-09-23 | Argonaute RNA Limited | Antagonist of pcsk9 |
WO2022089486A1 (zh) * | 2020-10-28 | 2022-05-05 | 江苏柯菲平医药股份有限公司 | 抑制PCSK9基因表达的siRNA及其修饰物与应用 |
WO2023017004A1 (en) * | 2021-08-09 | 2023-02-16 | Cargene Therapeutics Pte. Ltd. | Inhibitory nucleic acids for pcsk9 |
CN113980966A (zh) * | 2021-09-29 | 2022-01-28 | 阿格纳生物制药有限公司 | 一种抑制pcsk9靶基因表达的核酸序列及其应用 |
CN117384907B (zh) * | 2023-12-11 | 2024-03-29 | 上海鼎新基因科技有限公司 | 抑制PCSK9表达的siRNA分子及其应用 |
Family Cites Families (133)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3687808A (en) | 1969-08-14 | 1972-08-29 | Univ Leland Stanford Junior | Synthetic polynucleotides |
US4469863A (en) | 1980-11-12 | 1984-09-04 | Ts O Paul O P | Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof |
US5023243A (en) | 1981-10-23 | 1991-06-11 | Molecular Biosystems, Inc. | Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same |
US4476301A (en) | 1982-04-29 | 1984-10-09 | Centre National De La Recherche Scientifique | Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon |
US5550111A (en) | 1984-07-11 | 1996-08-27 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof |
US5235033A (en) | 1985-03-15 | 1993-08-10 | Anti-Gene Development Group | Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof |
US5185444A (en) | 1985-03-15 | 1993-02-09 | Anti-Gene Deveopment Group | Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages |
US5166315A (en) | 1989-12-20 | 1992-11-24 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
US5405938A (en) | 1989-12-20 | 1995-04-11 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
US5034506A (en) | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
IL79289A (en) | 1985-07-05 | 1992-01-15 | Whitehead Biomedical Inst | Introduction and expression of foreign genetic material into keratinocytes using a recombinant retrovirus |
US4980286A (en) | 1985-07-05 | 1990-12-25 | Whitehead Institute For Biomedical Research | In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells |
US5139941A (en) | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
US5264423A (en) | 1987-03-25 | 1993-11-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
US5276019A (en) | 1987-03-25 | 1994-01-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
WO1989002468A1 (en) | 1987-09-11 | 1989-03-23 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Transduced fibroblasts and uses therefor |
US4924624A (en) | 1987-10-22 | 1990-05-15 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof |
US5188897A (en) | 1987-10-22 | 1993-02-23 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates |
ATE110108T1 (de) | 1987-12-11 | 1994-09-15 | Whitehead Biomedical Inst | Genetische modifizierung von endothelialen zellen. |
JP2917998B2 (ja) | 1988-02-05 | 1999-07-12 | ホワイトヘッド・インスティチュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ | 修飾された肝細胞およびその用途 |
JPH03503894A (ja) | 1988-03-25 | 1991-08-29 | ユニバーシィティ オブ バージニア アランミ パテンツ ファウンデイション | オリゴヌクレオチド n‐アルキルホスホラミデート |
US5278302A (en) | 1988-05-26 | 1994-01-11 | University Patents, Inc. | Polynucleotide phosphorodithioates |
US5216141A (en) | 1988-06-06 | 1993-06-01 | Benner Steven A | Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages |
US5328470A (en) | 1989-03-31 | 1994-07-12 | The Regents Of The University Of Michigan | Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor |
US5399676A (en) | 1989-10-23 | 1995-03-21 | Gilead Sciences | Oligonucleotides with inverted polarity |
US5264564A (en) | 1989-10-24 | 1993-11-23 | Gilead Sciences | Oligonucleotide analogs with novel linkages |
US5264562A (en) | 1989-10-24 | 1993-11-23 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide analogs with novel linkages |
US5177198A (en) | 1989-11-30 | 1993-01-05 | University Of N.C. At Chapel Hill | Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates |
US5223168A (en) | 1989-12-12 | 1993-06-29 | Gary Holt | Surface cleaner and treatment |
US5212295A (en) | 1990-01-11 | 1993-05-18 | Isis Pharmaceuticals | Monomers for preparation of oligonucleotides having chiral phosphorus linkages |
US5506351A (en) | 1992-07-23 | 1996-04-09 | Isis Pharmaceuticals | Process for the preparation of 2'-O-alkyl guanosine and related compounds |
US5578718A (en) | 1990-01-11 | 1996-11-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Thiol-derivatized nucleosides |
US5459255A (en) | 1990-01-11 | 1995-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-2 substituted purines |
US5587470A (en) | 1990-01-11 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 3-deazapurines |
US5457191A (en) | 1990-01-11 | 1995-10-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 3-deazapurines |
US5587361A (en) | 1991-10-15 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
US5321131A (en) | 1990-03-08 | 1994-06-14 | Hybridon, Inc. | Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling |
US5470967A (en) | 1990-04-10 | 1995-11-28 | The Dupont Merck Pharmaceutical Company | Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages |
US5541307A (en) | 1990-07-27 | 1996-07-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof |
US5138045A (en) | 1990-07-27 | 1992-08-11 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
US5623070A (en) | 1990-07-27 | 1997-04-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Heteroatomic oligonucleoside linkages |
US5218105A (en) | 1990-07-27 | 1993-06-08 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
US5386023A (en) | 1990-07-27 | 1995-01-31 | Isis Pharmaceuticals | Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling |
US5378825A (en) | 1990-07-27 | 1995-01-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogs |
US5602240A (en) | 1990-07-27 | 1997-02-11 | Ciba Geigy Ag. | Backbone modified oligonucleotide analogs |
US5489677A (en) | 1990-07-27 | 1996-02-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms |
US5677437A (en) | 1990-07-27 | 1997-10-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Heteroatomic oligonucleoside linkages |
US5610289A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogues |
US5618704A (en) | 1990-07-27 | 1997-04-08 | Isis Pharmacueticals, Inc. | Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling |
US5608046A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds |
HU217036B (hu) | 1990-08-03 | 1999-11-29 | Sanofi | Eljárás génexpresszió gátlására alkalmas vegyületek előállítására |
US6262241B1 (en) | 1990-08-13 | 2001-07-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compound for detecting and modulating RNA activity and gene expression |
US5177196A (en) | 1990-08-16 | 1993-01-05 | Microprobe Corporation | Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof |
US5214134A (en) | 1990-09-12 | 1993-05-25 | Sterling Winthrop Inc. | Process of linking nucleosides with a siloxane bridge |
US5561225A (en) | 1990-09-19 | 1996-10-01 | Southern Research Institute | Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages |
CA2092002A1 (en) | 1990-09-20 | 1992-03-21 | Mark Matteucci | Modified internucleoside linkages |
AU659824B2 (en) | 1990-10-31 | 1995-06-01 | Cell Genesys, Inc. | Retroviral vectors useful for gene therapy |
US5539082A (en) | 1993-04-26 | 1996-07-23 | Nielsen; Peter E. | Peptide nucleic acids |
DE69217994T2 (de) | 1991-07-25 | 1997-09-04 | Whitaker Corp | Flüssigkeitsstandsmesser |
US5571799A (en) | 1991-08-12 | 1996-11-05 | Basco, Ltd. | (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response |
US5599797A (en) | 1991-10-15 | 1997-02-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
ATE239484T1 (de) | 1991-10-24 | 2003-05-15 | Isis Pharmaceuticals Inc | Derivatisierte oligonukleotide mit verbessertem aufnahmevermögen |
US5252479A (en) | 1991-11-08 | 1993-10-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vector for gene therapy |
US5633360A (en) | 1992-04-14 | 1997-05-27 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation |
US5434257A (en) | 1992-06-01 | 1995-07-18 | Gilead Sciences, Inc. | Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages |
US5587308A (en) | 1992-06-02 | 1996-12-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter |
US5478745A (en) | 1992-12-04 | 1995-12-26 | University Of Pittsburgh | Recombinant viral vector system |
US5476925A (en) | 1993-02-01 | 1995-12-19 | Northwestern University | Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups |
GB9304618D0 (en) | 1993-03-06 | 1993-04-21 | Ciba Geigy Ag | Chemical compounds |
WO1994022891A1 (en) | 1993-03-31 | 1994-10-13 | Sterling Winthrop Inc. | Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages |
US5571902A (en) | 1993-07-29 | 1996-11-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Synthesis of oligonucleotides |
US5625050A (en) | 1994-03-31 | 1997-04-29 | Amgen Inc. | Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics |
US6054299A (en) | 1994-04-29 | 2000-04-25 | Conrad; Charles A. | Stem-loop cloning vector and method |
US5554746A (en) | 1994-05-16 | 1996-09-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Lactam nucleic acids |
CA2222328C (en) | 1995-06-07 | 2012-01-10 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
US6506559B1 (en) | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
EP2267139B1 (en) | 1998-04-08 | 2017-03-22 | Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation | Methods and means for obtaining modified phenotypes |
AR020078A1 (es) | 1998-05-26 | 2002-04-10 | Syngenta Participations Ag | Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta |
CA2346155A1 (en) | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Ingene, Inc. | Enzymatic synthesis of ssdna |
CA2345936A1 (en) | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Ingene, Inc. | Production of ssdna in a cell |
DE19956568A1 (de) | 1999-01-30 | 2000-08-17 | Roland Kreutzer | Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens |
US6271359B1 (en) | 1999-04-14 | 2001-08-07 | Musc Foundation For Research Development | Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes |
DE10100586C1 (de) | 2001-01-09 | 2002-04-11 | Ribopharma Ag | Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens |
AU2001247951A1 (en) * | 2000-02-07 | 2001-08-14 | Roche Diagnostics Corporation | Novel cationic amphiphiles |
WO2003070918A2 (en) * | 2002-02-20 | 2003-08-28 | Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated | Rna interference by modified short interfering nucleic acid |
US20070026394A1 (en) * | 2000-02-11 | 2007-02-01 | Lawrence Blatt | Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth using nucleic acid based technologies |
CZ302719B6 (cs) * | 2000-12-01 | 2011-09-21 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Izolovaná molekula dvouretezcové RNA, zpusob její výroby a její použití |
US20030170891A1 (en) * | 2001-06-06 | 2003-09-11 | Mcswiggen James A. | RNA interference mediated inhibition of epidermal growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
US20070173473A1 (en) * | 2001-05-18 | 2007-07-26 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin Kexin 9 (PCSK9) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
US20080249040A1 (en) * | 2001-05-18 | 2008-10-09 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of sterol regulatory element binding protein 1 (SREBP1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
US7514099B2 (en) * | 2005-02-14 | 2009-04-07 | Sirna Therapeutics, Inc. | Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules |
US20040009216A1 (en) * | 2002-04-05 | 2004-01-15 | Rodrigueza Wendi V. | Compositions and methods for dosing liposomes of certain sizes to treat or prevent disease |
US7923547B2 (en) * | 2002-09-05 | 2011-04-12 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
ATE517992T1 (de) * | 2002-11-14 | 2011-08-15 | Dharmacon Inc | Funktionelle und hyperfunktionelle sirna |
DE10302421A1 (de) | 2003-01-21 | 2004-07-29 | Ribopharma Ag | Doppelsträngige Ribonukleinsäure mit verbesserter Wirksamkeit |
WO2004090108A2 (en) | 2003-04-03 | 2004-10-21 | Alnylam Pharmaceuticals | Irna conjugates |
WO2004080406A2 (en) | 2003-03-07 | 2004-09-23 | Alnylam Pharmaceuticals | Therapeutic compositions |
EP1471152A1 (en) * | 2003-04-25 | 2004-10-27 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Mutations in the human PCSK9 gene associated to hypercholesterolemia |
DK3604537T3 (da) * | 2003-06-13 | 2022-02-28 | Alnylam Europe Ag | Dobbeltstrenget ribonukleinsyre med forøget effektivitet i en organisme |
US20050064595A1 (en) | 2003-07-16 | 2005-03-24 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Lipid encapsulated interfering RNA |
EP1675953A2 (en) * | 2003-10-23 | 2006-07-05 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF RAS GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
WO2006073419A2 (en) * | 2004-04-01 | 2006-07-13 | Gang Zheng | Lipoprotein nanoplatforms |
AU2005251403B2 (en) | 2004-06-07 | 2011-09-01 | Arbutus Biopharma Corporation | Cationic lipids and methods of use |
ATE536418T1 (de) * | 2004-06-07 | 2011-12-15 | Protiva Biotherapeutics Inc | Lipidverkapselte interferenz-rna |
CA2603730A1 (en) * | 2005-03-31 | 2006-10-05 | Calando Pharmaceuticals, Inc. | Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof |
US7915230B2 (en) | 2005-05-17 | 2011-03-29 | Molecular Transfer, Inc. | Reagents for transfection of eukaryotic cells |
CN103989633A (zh) | 2005-07-27 | 2014-08-20 | 普洛体维生物治疗公司 | 制造脂质体的系统和方法 |
EP2395012B8 (en) | 2005-11-02 | 2018-06-06 | Arbutus Biopharma Corporation | Modified siRNA molecules and uses thereof |
US20070218122A1 (en) | 2005-11-18 | 2007-09-20 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | siRNA silencing of influenza virus gene expression |
EP2008274B1 (en) * | 2006-03-31 | 2015-05-27 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of eg5 gene |
CN101484588B (zh) | 2006-05-11 | 2013-11-06 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 抑制pcsk9基因表达的组合物和方法 |
US8598333B2 (en) * | 2006-05-26 | 2013-12-03 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | SiRNA silencing of genes expressed in cancer |
EP2052079A2 (en) * | 2006-07-17 | 2009-04-29 | Sirna Therapeutics Inc. | Rna interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin kexin 9 (pcsk9) gene expression using short interfering nucleic acid (sina) |
DK2068886T3 (da) | 2006-10-03 | 2013-11-18 | Tekmira Pharmaceuticals Corp | Lipidholdige præparater |
EP2453016A1 (en) | 2006-11-27 | 2012-05-16 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating hypercholesterolemia |
WO2008109369A2 (en) | 2007-03-02 | 2008-09-12 | Mdrna, Inc. | Nucleic acid compounds for inhibiting tnf gene expression and uses thereof |
JOP20080381B1 (ar) * | 2007-08-23 | 2023-03-28 | Amgen Inc | بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9) |
JP5697988B2 (ja) * | 2007-12-27 | 2015-04-08 | プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド | 干渉rnaを使用したポロ様キナーゼ発現のサイレンシング方法 |
WO2009086558A1 (en) | 2008-01-02 | 2009-07-09 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids |
CA2713379A1 (en) | 2008-01-31 | 2009-11-05 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene |
CN102014932B (zh) | 2008-03-05 | 2015-11-25 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 用于抑制Eg5和VEGF基因表达的组合物和方法 |
WO2009114475A2 (en) | 2008-03-09 | 2009-09-17 | Intradigm Corporation | Compositions comprising human pcsk9 and apolipoprotein b sirna and methods of use |
US8058069B2 (en) | 2008-04-15 | 2011-11-15 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Lipid formulations for nucleic acid delivery |
CA3018487A1 (en) * | 2008-10-20 | 2010-04-29 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin |
CA3039251C (en) | 2008-11-10 | 2024-01-09 | Arbutus Biopharma Corporation | Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics |
CA2746514C (en) | 2008-12-10 | 2018-11-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Gnaq targeted dsrna compositions and methods for inhibiting expression |
US8311190B2 (en) * | 2008-12-23 | 2012-11-13 | International Business Machines Corporation | Performing human client verification over a voice interface |
CA2751342C (en) | 2009-01-29 | 2019-05-07 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulations comprising cationic lipid and a targeting lipid comprising n-acetyl galactosamine for delivery of nucleic acid |
SG10201911942UA (en) | 2009-05-05 | 2020-02-27 | Muthiah Manoharan | Lipid compositions |
LT2440183T (lt) | 2009-06-10 | 2018-08-10 | Arbutus Biopharma Corporation | Patobulinta lipido kompozicija |
WO2010147992A1 (en) | 2009-06-15 | 2010-12-23 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods for increasing efficacy of lipid formulated sirna |
MX2011013421A (es) * | 2009-06-15 | 2012-03-16 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Arnds formulado con lipido de direccionamiento del gen pcsk9. |
WO2011009697A1 (en) | 2009-07-21 | 2011-01-27 | Santaris Pharma A/S | Antisense oligomers targeting pcsk9 |
-
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2023
- 2023-03-03 US US18/116,903 patent/US20240093199A1/en active Pending
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
J Downward.Science,medicine,and the future:RNA interference.《British Medical Journal》.2004,第328卷(第7450期),1245-1248. * |
Sayda ME等.Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate.《The EMBO Journal》.2001,第20卷(第23期),6877-6888. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108265052A (zh) * | 2016-12-30 | 2018-07-10 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 一种小干扰核酸和药物组合物及其用途 |
CN108265052B (zh) * | 2016-12-30 | 2021-05-28 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 一种小干扰核酸和药物组合物及其用途 |
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AU2012261570B2 (en) | Compositions and methods for inhibiting expression of the PCSK9 gene | |
AU2016203687A1 (en) | Compositions and methods for inhibiting expression of the pcsk9 gene |
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