JP2012527248A - 転写因子ｅ３（ｔｆｅ３）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｔｆｅ３およびインスリン受容体基質２（ｉｒｓ２）関連疾患の処置 - Google Patents

転写因子ｅ３（ｔｆｅ３）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｔｆｅ３およびインスリン受容体基質２（ｉｒｓ２）関連疾患の処置 Download PDF

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ジョゼフ・カラード
オルガ・コルコヴァ・シャーマン
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Abstract

本発明は、とりわけ転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)の天然アンチセンスポリヌクレオチドを標的にすることによって、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドの発現および/または機能を変調するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの同定、ならびにTFE3および/またはIRS2の発現に関連する疾患および障害を処置する上でのこれらの使用にも関する。

Description

本出願は、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、2009年5月22日出願の米国仮特許出願第61/180,515号、および2009年12月31日出願の米国仮特許出願第61/291,419号の優先権を主張するものである。
本発明の実施形態は、TFE3および/またはIRS2の発現および/または機能を変調するオリゴヌクレオチド、ならびに関連の分子を含む。
DNA-RNAおよびRNA-RNAハイブリダイゼーションは、DNA複製、転写、および翻訳を含めた核酸機能の多くの局面にとって重要である。ハイブリダイゼーションは、特定の核酸を検出し、またはその発現を変更するいずれかの様々な技術にとっても重要である。例えば、アンチセンスヌクレオチドは、標的RNAにハイブリダイズすることによって遺伝子の発現を破壊し、それによってRNAのスプライシング、転写、翻訳、および複製に干渉する。アンチセンスDNAは、DNA-RNAハイブリッドが、殆どの細胞型に存在する活性である、リボヌクレアーゼHによる消化のための基質として働くさらなる特徴を有する。アンチセンス分子は、オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)の場合のように細胞中に送達され、またはRNA分子として内因性の遺伝子から発現され得る。最近、FDAはアンチセンス薬であるVITRAVENE(商標)(サイトメガロウイルス網膜炎治療用)を認可し、アンチセンスが治療上の有用性を有することを反映している。
米国特許第5,432,272号 米国特許第5,013,830号 米国特許第5,149,797号 米国特許第5,220,007号 米国特許第5,256,775号 米国特許第5,366,878号 米国特許第5,403,711号 米国特許第5,491,133号 米国特許第5,565,350号 米国特許第5,623,065号 米国特許第5,652,355号 米国特許第5,652,356号 米国特許第5,700,922号 米国特許第5,034,506号 米国特許第5,138,045号 米国特許第5,218,105号 米国特許第5,459,255号 米国特許第3,687,808号 米国特許第4,469,863号 米国特許第4,476,301号 米国特許第5,023,243号 米国特許第5,177,196号 米国特許第5,188,897号 米国特許第5,264,423号 米国特許第5,276,019号 米国特許第5,278,302号 米国特許第5,286,717号 米国特許第5,321,131号 米国特許第5,399,676号 米国特許第5,405,939号 米国特許第5,453,496号 米国特許第5,455,233号 米国特許第5,466,677号 米国特許第5,476,925号 米国特許第5,519,126号 米国特許第5,536,821号 米国特許第5,541,306号 米国特許第5,550,111号 米国特許第5,563,253号 米国特許第5,571,799号 米国特許第5,587,361号 米国特許第5,625,050号 米国特許第5,166,315号 米国特許第5,185,444号 米国特許第5,214,134号 米国特許第5,216,141号 米国特許第5,235,033号 米国特許第5,264,562号 米国特許第5,264,564号 米国特許第5,405,938号 米国特許第5,434,257号 米国特許第5,470,967号 米国特許第5,489,677号 米国特許第5,541,307号 米国特許第5,561,225号 米国特許第5,596,086号 米国特許第5,602,240号 米国特許第5,610,289号 米国特許第5,608,046号 米国特許第5,618,704号 米国特許第5,623,070号 米国特許第5,663,312号 米国特許第5,633,360号 米国特許第5,677,437号 米国特許第5,677,439号 米国特許第5,539,082号 米国特許第5,714,331号 米国特許第5,719,262号 米国特許第4,981,957号 米国特許第5,118,800号 米国特許第5,319,080号 米国特許第5,359,044号 米国特許第5,393,878号 米国特許第5,446,137号 米国特許第5,466,786号 米国特許第5,514,785号 米国特許第5,519,134号 米国特許第5,567,811号 米国特許第5,576,427号 米国特許第5,591,722号 米国特許第5,597,909号 米国特許第5,610,300号 米国特許第5,627,053号 米国特許第5,639,873号 米国特許第5,646,265号 米国特許第5,658,873号 米国特許第5,670,633号 米国特許第5,700,920号 米国特許第4,845,205号 米国特許第5,130,302号 米国特許第5,134,066号 米国特許第5,175,273号 米国特許第5,367,066号 米国特許第5,457,187号 米国特許第5,484,908号 米国特許第5,502,177号 米国特許第5,525,711号 米国特許第5,552,540号 米国特許第5,587,469号 米国特許第5,596,091号 米国特許第5,614,617号 米国特許第5,750,692号 米国特許第5,681,941号 米国特許第4,828,979号 米国特許第4,948,882号 米国特許第5,525,465号 米国特許第5,541,313号 米国特許第5,545,730号 米国特許第5,552,538号 米国特許第5,578,717号 米国特許第5,580,731号 米国特許第5,591,584号 米国特許第5,109,124号 米国特許第5,118,802号 米国特許第5,414,077号 米国特許第5,486,603号 米国特許第5,512,439号 米国特許第5,578,718号 米国特許第4,587,044号 米国特許第4,605,735号 米国特許第4,667,025号 米国特許第4,762,779号 米国特許第4,789,737号 米国特許第4,824,941号 米国特許第4,835,263号 米国特許第4,876,335号 米国特許第4,904,582号 米国特許第4,958,013号 米国特許第5,082,830号 米国特許第5,112,963号 米国特許第5,214,136号 米国特許第5,245,022号 米国特許第5,254,469号 米国特許第5,258,506号 米国特許第5,262,536号 米国特許第5,272,250号 米国特許第5,292,873号 米国特許第5,317,098号 米国特許第5,371,241号 米国特許第5,391,723号 米国特許第5,416,203号 米国特許第5,451,463号 米国特許第5,510,475号 米国特許第5,512,667号 米国特許第5,565,552号 米国特許第5,567,810号 米国特許第5,574,142号 米国特許第5,585,481号 米国特許第5,587,371号 米国特許第5,595,726号 米国特許第5,597,696号 米国特許第5,599,923号 米国特許第5,599,928号 米国特許第5,688,941号 国際特許出願第PCT/US92/09196号 米国特許第6,287,860号 米国特許第5,108,921号 米国特許第5,354,844号 米国特許第5,416,016号 米国特許第5,459,127号 米国特許第5,521,291号 米国特許第5,543,165号 米国特許第5,547,932号 米国特許第5,583,020号 米国特許第5,591,721号 米国特許第4,426,330号 米国特許第4,534,899号 米国特許第5,013,556号 米国特許第5,213,804号 米国特許第5,227,170号 米国特許第5,264,221号 米国特許第5,356,633号 米国特許第5,395,619号 米国特許第5,417,978号 米国特許第5,462,854号 米国特許第5,469,854号 米国特許第5,512,295号 米国特許第5,527,528号 米国特許第5,534,259号 米国特許第5,543,152号 米国特許第5,556,948号 米国特許第5,580,575号 米国特許第5,595,756号 米国特許出願第2007/0117772号 米国特許第6,632,427号 米国特許第6,756,523号 米国特許第4,866,042号 米国特許第6,294,520号 米国特許第6,936,589号 米国特許第7,563,884号
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本概要を、本発明の本質および実体を簡潔に示すための本発明の概要を表すために提供する。本概要は、特許請求の範囲または意味を解釈または制限するために用いられないという理解をもって提示されるものである。
一実施形態において、本発明は、天然アンチセンス転写物のあらゆる領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることによって、天然アンチセンス転写物の作用を阻害し、対応するセンス遺伝子の上方制御をもたらす方法を提供する。本明細書において、天然アンチセンス転写物の阻害は、本発明の範囲内であるとみなされる、siRNA、リボザイム、および小分子によって実現され得ることも企図される。
一実施形態は、in vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織におけるTFE3および/またはIRS2ポリヌクレオチドの機能および/または発現を変調する方法であって、配列番号5のヌクレオチド1から497内の連続した5から30ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのリバース相補体に対して少なくとも50%の配列同一性を有する、長さ5から30ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドと前記細胞または組織を接触させ、それによってin vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織における転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を変調する段階を含む、方法を提供する。
別の好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、TFE3ポリヌクレオチドの天然アンチセンス配列、例えば、配列番号3に記載したヌクレオチド、およびあらゆるバリアント、対立遺伝子、ホモログ、突然変異体、誘導体、フラグメント、およびこれらの相補配列を標的とする。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例を配列番号4から9に記載する。
別の一実施形態は、in vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織における、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を変調する方法であって、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドのアンチセンスのリバース相補体に対して少なくとも50%の配列同一性を有する、長さ5から30ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドと前記細胞または組織を接触させ、それによってin vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織におけるTFE3および/またはIRS2ポリヌクレオチドの機能および/または発現を変調することを含む、方法を提供する。
好ましい一実施形態において、組成物はセンスおよび/またはアンチセンスのTFE3および/またはIRS2ポリヌクレオチドに結合する1つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
別の好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドは1つまたは複数の修飾または置換されたヌクレオチドを含む。
別の好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドは1つまたは複数の修飾された結合を含む。
さらに別の一実施形態において、修飾されたヌクレオチドは、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ペプチド核酸、2'-O-メチル、フルオロ、または炭素、メチレンまたは他の固定核酸(LNA)分子を含む修飾された塩基を含む。好ましくは、修飾されたヌクレオチドは、α-L-LNAを含む固定核酸分子である。
別の好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、患者に、皮下的に、筋肉内に、静脈内に、または腹腔内に投与される。
別の好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドは医薬組成物において投与される。処置レジメンはアンチセンス化合物を少なくとも1回患者に投与することを含むが、この処置はある期間にわたって多数の投与量を含むように修飾されてよい。処置は、1つまたは複数の他のタイプの治療法と組み合わされてよい。
別の好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、リポソーム中に封入されており、またはキャリア分子(例えば、コレステロール、TATペプチド)に付着している。
他の態様を以下に記載する。
対照と比べた、リポフェクタミン2000を用いて導入したsiRNAオリゴヌクレオチドでHepG2細胞および518A2細胞を処置した後のIRS2 mRNAにおける倍数変化+標準偏差を示す、リアルタイムPCRの結果を示すグラフである。518A2 CUR-0603、518A2 CUR-0605と表示したバーは、それぞれ配列番号4および5で処置した518A2細胞の試料に対応する。また、HepG2 CUR-0603、HepG2 CUR-0605と表示したバーは、それぞれ配列番号4および5で処置したHepG2細胞の試料に対応する。 対照と比べた、リポフェクタミン2000を用いて導入したsiRNAオリゴヌクレオチドでHepG2細胞を処置した後のTFE3 mRNAにおける倍数変化+標準偏差を示す、リアルタイムPCRの結果を示すグラフである。TFE3 CUR-0603およびCUR-0605と表示したバーは、それぞれ配列番号4および5に対応する。 対照と比べた、リポフェクタミン2000を用いて導入したsiRNAオリゴヌクレオチドでHepG2細胞および518A2細胞を処置した後のTFE3 mRNAにおける倍数変化+標準偏差を示す、リアルタイムPCR結果を示すグラフである。リアルタイムPCRの結果は、TFE3アンチセンスHs.708291に対してデザインされたsiRNAの1つで処置し48時間後、HepG2細胞におけるTFE3mRNAのレベルは有意に上昇したことを示している。CUR-0603、CUR-0605、CUR-0607、CUR-0599、CUR-0601、およびCUR-0609と表示したバーは、それぞれ配列番号4から9に対応する。
配列リストの説明
配列番号1:ホモサピエンスインスリン受容体基質2(IRS2)、mRNA(受託番号:NM_003749)
配列番号2:IGHMエンハンサー3(TFE3)mRNAに結合するホモサピエンス転写因子(受託番号:NM_006521)
配列番号3:TFE3天然アンチセンス配列(Hs.708291)
配列番号4から9:Hs.708291アンチセンスオリゴヌクレオチド、「r」はRNAを示す。
配列番号10から15:Hs.708291センスオリゴヌクレオチド。これらはそれぞれアンチセンスオリゴヌクレオチド配列番号4から9のリバース相補体である。「r」はRNAを示す。
本発明のいくつかの態様を、説明のための例の適用を参照して以下に記載する。多くの特定の詳細、関連性、および方法を、本発明の十分な理解を提供するために記載することを理解すべきである。しかし、当業者であれば、1つまたは複数の特定の詳細なしで、または他の方法で、本発明を実践することができることを認識するのは容易である。本発明は、行為のいくつかが様々な順序において生じ、かつ/または他の行為もしくは事象と同時に生じることがあるので、行為または事象の順序によって制限されない。さらに、例示する行為または事象の全てが、本発明にしたがってある方法を実行するのに必要とされるわけではない。
本明細書に開示する全ての遺伝子、遺伝子の名称、および遺伝子生成物は、それに対して本明細書に開示する組成物および方法が適用可能であるあらゆる種からのホモログに対応するものとされる。したがって、用語は、それだけには限定されないが、ヒトおよびマウスからの遺伝子および遺伝子生成物を含む。特定の種からの遺伝子または遺伝子生成物が開示されている場合、この開示は例示的にすぎないものとされ、これが出現する文脈が明らかに指摘しなければ限定的なものとして解釈してはならないことが理解される。したがって、例えば、いくつかの実施形態において哺乳動物の核酸およびアミノ酸の配列に関連する、本明細書に開示する遺伝子は、それだけには限定されないが、他の哺乳動物、魚類、両生類、爬虫類、および鳥類を含めた他の動物からの相同遺伝子および/またはオーソロガス遺伝子、ならびに遺伝子生成物を含むものとされる。好ましい実施形態において、遺伝子または核酸の配列はヒトのものである。
定義
本明細書で用いる用語は、特定の実施形態のみを記載する目的であり、本発明を制限することを意図するものではない。本明細書で用いられる、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈による別段の指摘がなければ、複数形も含むものとされる。さらに、発明を実施するための形態および/または特許請求の範囲のいずれかにおいて「含んでいる(including)」、「含む(includes)」、「有している(having)」、「有する(has)」、「一緒の(with)」の語またはこれらの変形が用いられる範囲で、このような語は「含んでいる(comprising)」の語と同様に包括的であるものとされる。
「約(about)」または「およそ(approximately)」の語は、当業者が決定する特定の値に対して許容される誤差範囲内であることを意味し、この値を測定または決定した方法、すなわち測定系の限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野における慣習にしたがって、1または1を超える標準偏差内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の20%までの範囲、好ましくは10%まで、より好ましくは5%まで、より好ましくはさらに1%までの範囲を意味し得る。あるいは、とりわけ生物学的系またはプロセスに関して、この語は、値の、1桁内、好ましくは5倍以内、より好ましくは2倍以内であることを意味し得る。特定の値が出願および特許請求の範囲において記載されている場合、別段の記載がなければ、特定の値に対する許容される誤差範囲内であることを意味する「約」の語が想定されなければならない。
本明細書で用いられる「mRNA」の語は、現在知られている標的遺伝子のmRNA転写物、および解明され得るあらゆるさらなる転写物を意味する。
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス化合物」は、別のRNAまたはDNA(標的RNA、DNA)に結合するRNAまたはDNA分子を意味する。例えば、これがRNAオリゴヌクレオチドである場合、これはRNA-RNA相互作用によって別のRNA標的に結合し、標的RNAの活性を変える(Eguchiら、(1991年) Ann. Rev. Biochem.、60巻、631〜652頁)。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のポリヌクレオチドの発現および/または機能を上方制御または下方制御することができる。この定義は、治療上、診断上、または他の視点から有用であるあらゆる外来のRNAまたはDNA分子を含むことを意味する。このような分子には、例えば、アンチセンスRNAまたはDNA分子、干渉RNA(RNAi)、マイクロRNA、囮RNA分子、siRNA、酵素的RNA、治療エディティングRNA、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストのRNA、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外部誘導配列(EGS)オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー、プライマー、プローブ、ならびに標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズする他のオリゴマー化合物が含まれる。このようなものとして、これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、部分的な一本鎖、または環状のオリゴマー化合物の形態において導入されてよい。
本発明の文脈において、「オリゴヌクレオチド」の語は、リボ核酸(RNA)またはデオキシリボ核酸(DNA)またはこれらのミメチックの、オリゴマーまたはポリマーを意味する。「オリゴヌクレオチド」の語は、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、これらの置換型およびα-アノマー型、ペプチド核酸(PNA)、固定核酸(LNA)、ホスホロチオエート、メチルホスホネートなどを含めた、天然および/または修飾されたモノマーまたは連結の、直鎖または環状のオリゴマーも含む。オリゴヌクレオチドは、例えば、ワトソン-クリック型の塩基対、ホーグスティーンまたは逆ホーグスティーン型の塩基対などのモノマー対モノマーの相互作用の規則的なパターンによって標的ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。
オリゴヌクレオチドは「キメラ」であってよく、すなわち、様々な領域から構成されていてよい。本発明の文脈において「キメラの」化合物は、2つまたはそれを超える化学的領域を含むオリゴヌクレオチド、例えば、DNA領域、RNA領域、PNA領域などである。各化学的領域は、少なくとも1つのモノマー単位、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドから作られていている。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的に、少なくとも1つの領域を含み、この場合、オリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の所望の性質を表すために修飾されている。オリゴヌクレオチドの所望の性質には、それだけには限定されないが、例えば、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の増大、細胞の取込みの増大、および/または標的核酸に対する結合親和性の増大が含まれる。したがって、オリゴヌクレオチドの様々な領域が様々な性質を有することがある。本発明のキメラのオリゴヌクレオチドは、2つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および/または上記に記載したオリゴヌクレオチド類似体の混合した構造として形成され得る。
オリゴヌクレオチドは、すなわち、モノマーが、天然DNAにおいて連続的に連結している場合、またはスペーサーによって連結している場合、「レジスター(register)」において連結され得る領域から構成されていてよい。スペーサーは、領域間の共有結合性の「架橋」を構成するものとされ、好ましい場合には炭素原子約100個を超えない長さを有する。スペーサーは、例えば、正または負の電荷を有し、特別な核酸結合性の性質(インターカレーター、グルーブバインダー(groove binder)、毒素、フルオロフォアなど)を保有し、親油性であり、α-ヘリックスを誘導するアラニン含有ペプチドなどの特別な2次構造を誘導するなど、様々な機能性を保有し得る。
本明細書で用いられる「TFE3」および「転写因子E3」は、全てのファミリーメンバー、突然変異体、対立遺伝子、フラグメント、種、コードおよび非コード配列、センスおよびアンチセンスポリヌクレオチド鎖などを含む。
本明細書で用いられる、転写因子E3、TFE3、bHLHe33、RCCP2、およびTFEAの語は、文献におけるものと同じであるとみなされ、本出願において交換可能に用いられる。
本明細書で用いられる、インスリン受容体基質2、IRS2の語は、文献におけるものと同じであるとみなされ、本出願において交換可能に用いられる。
本明細書で用いられる「に特異的なオリゴヌクレオチド」または「を標的にするオリゴヌクレオチド」の語は、(i)標的遺伝子の一部分と安定な複合体を形成することができ、または(ii)標的遺伝子のmRNA転写物の一部分と安定な二重鎖を形成することができる、配列を有するオリゴヌクレオチドを意味する。複合体および二重鎖の安定性は、理論上の計算および/またはin vitroのアッセイによって決定することができる。ハイブリダイゼーション複合体および二重鎖の安定性を決定するための例示のアッセイは、以下の実施例において記載する。
本明細書で用いられる、「標的核酸」の語は、DNA、そのようなDNAから転写されたRNA(premRNAおよびmRNAを含む)、ならびにまたそのようなRNAに由来するcDNA、コード、非コード配列、センスまたはアンチセンスポリヌクレオチドを包含する。その標的核酸とのオリゴマー化合物の特異的なハイブリダイゼーションは、核酸の正常な機能に干渉する。標的核酸に特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸の機能のこの変調は、一般的に「アンチセンス」と呼ばれる。妨害されるDNAの機能には、例えば、複製および転写が含まれる。妨害されるRNAの機能には、例えば、タンパク質翻訳の部位へのRNAの転座、RNAからのタンパク質の翻訳、1つまたは複数のmRNA種を産生するためのRNAのスプライシング、RNAに関与し得るまたはRNAによって促進され得る触媒活性などの重要な機能全てが含まれる。標的核酸の機能のこのような妨害の全体的な効果は、コードされた生成物またはオリゴヌクレオチドの発現の変調である。
RNA干渉「RNAi」は、その「標的」核酸配列に対して配列特異的な相同性を有する二本鎖RNA(dsRNA)分子によって媒介される(Caplen, N. J.ら(2001年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、98巻、9742〜9747頁)。本発明のある実施形態において、媒介物質は、5〜25ヌクレオチドの「低分子干渉」RNA二重鎖(siRNA)である。siRNAは、ダイサーとして知られているリボヌクレアーゼによるdsRNAのプロセシングに由来する(Bernstein, E.ら(2001年) Nature、409巻、363〜366頁)。siRNA二重鎖生成物は、RISC(RNA誘導サイレンシング複合体)と呼ばれるマルチタンパク質siRNA複合体中にリクルートされる。いかなる特定の理論によって拘泥しようとするものではないが、次いで、RISCは標的核酸(適切にはmRNA)に導かれ、そこでsiRNA二重鎖は配列特異的に相互作用して触媒的に切断を媒介すると考えられている(Bernstein. E.ら(2001年) Nature、409巻、363〜366頁; Boutla, A.ら(2001年) Curr. Biol. 11巻、1776〜1780頁)。本発明にしたがって用いることができる低分子干渉RNAは、当技術分野においてよく知られており、当業者には馴染みのある手順にしたがって合成および使用することができる。本発明の方法において用いるための低分子干渉RNAは、約1から約50ヌクレオチド(nt)の間を含むのが適切である。非限定的な実施形態の例において、siRNAは約5ntから約40nt、約5ntから約30nt、約10ntから約30nt、約15ntから約25nt、または約20〜25ヌクレオチドを含むことができる。
好適なオリゴヌクレオチドの選択は、自動的に核酸配列をアラインし、同一性または相同性の領域を指摘するコンピュータプログラムを用いて促進される。このようなプログラムは、例えば、GenBankなどのデータベースを検索することによって、またはPCR生成物を配列決定することによって得られる核酸配列を比較するのに用いられる。ある範囲の種からの核酸配列を比較すると、種間の好適な度合いの同一性を示す核酸配列の選択が可能になる。配列決定されていない遺伝子の場合には、標的種における遺伝子と他の種における遺伝子との間の同一性の度合いの決定を可能にするために、サザンブロットを行う。当技術分野においてよく知られている通り、様々な度合いのストリンジェンシーでサザンブロットを行うことによって、同一性のおよその尺度を得るのが可能である。これらの手順により、コントロールすべき対象における標的核酸配列に対して高度の相補性を表し、他種における対応する核酸配列に対してより低度の相補性を表すオリゴヌクレオチドの選択が可能になる。当業者であれば、本発明において用いるのに好適な遺伝子の領域を選択する上でかなりの許容度が存在することを理解されよう。
「酵素的RNA」は、酵素活性を有するRNA分子を意味する(Cech. (1988年) J. American. Med. Assoc.、260巻、3030〜3035頁)。酵素的核酸(リボザイム)は、最初に標的RNAに結合することによって作用する。このような結合は、標的RNAを切断するように作用する分子の酵素的部分に密接に近接して保持される酵素的核酸の標的結合性部分によって起こる。このように、酵素的核酸は、最初に標的RNAを認識し、次いで塩基対形成によって標的RNAに結合し、正しい部位に結合した後は酵素的に作用して標的RNAを切断する。
「囮RNA」は、リガンドに対する天然の結合性ドメインを模倣するRNA分子を意味する。したがって、囮RNAは、天然の結合性標的と、特異的なリガンドの結合を競合する。例えば、HIVトランス活性化反応(TAR)RNAの過剰発現は「囮」として作用し、HIVtatタンパク質に効率的に結合し、それによってHIV RNAにおいてコードされるTAR配列に結合するのを妨ぎ得ることが示されている(Sullengerら(1990年) Cell、63巻、601〜608頁)。これは特異的な一例であることを意味する。当業者であればこれらはほんの一例であり、他の実施形態が当技術分野において一般的に知られている技術を用いて容易に産生され得ることを理解されよう。
本明細書で用いられる、「モノマー」の語は、典型的に、ホスホジエステル結合またはその類似体によって連結して、数モノマー単位から、例えば約3〜4から、約数百のモノマー単位までのサイズの範囲のオリゴヌクレオチドを形成するモノマーを示す。ホスホジエステル連結の類似体には、以下にさらに十分に記載する通り、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホルネート(methylphosphornate)、ホスホロセレノエート、ホスホラミデート(phosphoramidate)などが含まれる。
「ヌクレオチド」の語は、天然に存在するヌクレオチド、および非天然に存在するヌクレオチドを網羅する。当業者であれば、以前に「非天然に存在する」と考えられていた様々なヌクレオチドが引き続き天然において見出されていることは明らかである。したがって、「ヌクレオチド」は、知られているプリンおよびピリミジン複素環含有分子だけを含むのではなく、これらの複素環類似体および互変異性体も含む。他のタイプのヌクレオチドの説明的な例は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、ジアミノプリン、8-オキソ-N6-メチルアデニン、7-デアザキサンチン、7-デアザグアニン、N4,N4-エタノシトシン、N6,N6-エタノ-2,6-ジアミノプリン、5-メチルシトシン、5-(C3-C6)-アルキニルシトシン、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、プソイドイソシトシン(pseudoisocytosine)、2-ヒドロキシ-5-メチル-4-トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンを含む分子、およびBennerら、米国特許第5,432,272号に記載されている「非天然に存在する」ヌクレオチドである。「ヌクレオチド」の語は、ありとあらゆるこれらの例、ならびにこれらの類似体および互変異性体を網羅するものとされる。とりわけ興味深いヌクレオチドは、ヒトにおける治療上および診断上の適用に関連して、天然に存在するヌクレオチドと考えられる、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、およびウラシルを含むものである。ヌクレオチドは、天然の2'-デオキシおよび2'-ヒドロキシル糖、例えば、KornbergおよびBaker、DNA Replication、第2版(Freeman、San Francisco、1992年)に記載されているもの、ならびにこれらの類似体を含む。
ヌクレオチドに関連した「類似体」は、修飾された塩基部分および/または修飾された糖部分(例えば、Scheit、Nucleotide Analogs、John Wiley、New York、1980年; FreierおよびAltmann (1997年) Nucl. Acid. Res.、25巻(22)、4429〜4443頁;Toulme, J.J. (2001年) Nature Biotechnology、19巻、17〜18頁; Manoharan M. (1999年) Biochemica et Biophysica Acta、1489巻117〜139頁; Freier S. M. (1997年) Nucleic Acid Research、25巻、4429〜4443頁;Uhlman, E. (2000)年 Drug Discovery & Development、3巻、203〜213頁;Herdewin P. (2000年) Aniisense& Nucleic Acid Drug Dev.、10巻、297〜310頁によって一般的に記載されているものを参照されたい);2'-O,3'-C-連結した[3,2,0]ビシクロアラビノヌクレオシド(例えば、N.K. Christiensen.ら(1998年) J. Am. Chem. Soc、120巻、5458〜5463頁; Prakash TP. Bhat B. (2007年) Curr Top Med Chem. 、7巻(7)、641〜9頁; Cho EJ,ら(2009年) Annual Review of Analytical Chemistry、2巻、241〜264頁を参照されたい)を有する合成のヌクレオチドを含む。このような類似体は、結合性の性質、例えば、二重鎖または三重鎖の安定性、特異性などを増強するようにデザインされている合成のヌクレオチドを含む。
本明細書で用いられる「ハイブリダイゼーション」は、オリゴマー化合物の本質的に相補的な鎖の対形成を意味する。対形成の一メカニズムは、オリゴマー化合物の鎖の相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基(ヌクレオチド)の間の水素結合を伴うものであり、水素結合はワトソン-クリック、ホーグスティーン、または逆ホーグスティーンの水素結合であってよい。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成によって対形成する相補的なヌクレオチドである。ハイブリダイゼーションは様々な環境下で起こり得る。
アンチセンス化合物は、化合物の標的核酸に対する結合が標的核酸の正常の機能に干渉して機能および/または活性の変調をもたらす場合に「特異的にハイブリダイズすることができ」、特異的な結合が望ましい条件下で、すなわちin vivoのアッセイまたは治療的処置の場合には生理学的条件下で、in vitroのアッセイの場合はアッセイが行われる条件下で、アンチセンス化合物の非標的核酸配列に対する非特異的な結合を避けるのに十分な度合いの相補性が存在する。
本明細書で用いられる「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」の句は、その下で本発明の化合物がその標的配列にハイブリダイズするが、最小数の他の配列とハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な環境において、および本発明の文脈において異なり、その下でオリゴマー化合物が標的配列にハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、オリゴマー化合物の性質および組成、ならびにこれらが調査されるアッセイによって決定される。一般的に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Na++またはK++などの無機の陽イオンを有する低濃度(<0.15M)の塩(すなわち低イオン強度)、20℃〜25℃を超え、オリゴマー化合物のTm未満の温度、標的配列複合体、ならびに変性剤、例えば、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、または洗剤であるドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の存在を含む。例えば、ハイブリダイゼーション率は、各1%ホルムアミドに対して1.1%低下する。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の一例は、0.1×塩化ナトリウム-クエン酸ナトリウムバッファー(SSC)/0.1%(重量/容積)SDS、60℃、30分である。
本明細書で用いられる「相補性」は1つまたは2つのオリゴマー鎖上の2つのヌクレオチド間の正確な対形成のための能力を意味する。例えば、アンチセンス化合物のある位置の核酸塩基が標的核酸のある位置の核酸塩基と水素結合することができる場合、(前記標的核酸はDNA、RNA、またはオリゴヌクレオチド分子である、)オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置は相補的な位置であるとみなされる。各分子において十分な数の相補的な位置が、相互に水素結合することができるヌクレオチドにおいて占有されている場合、オリゴマー化合物およびさらなるDNA、RNA、またはオリゴヌクレオチド分子は相互に相補的である。このように、「特異的にハイブリダイズする」および「相補的である」は、安定かつ特異的な結合がオリゴマー化合物と標的核酸との間に起こるのに十分な数のヌクレオチドにわたる十分な程度の正確な対形成または相補性を示すのに用いられる語である。
当技術分野において、オリゴマー化合物の配列は、特異的にハイブリダイズする標的核酸の配列に100%相補的である必要がないことが理解される。さらに、オリゴヌクレオチドは、介在または隣接するセグメントがハイブリダイゼーションの事象(例えば、ループ構造、ミスマッチ、またはヘアピン構造)に関与しないように1つまたは複数のセグメントにわたってハイブリダイズすることができる。本発明のオリゴマー化合物は、これらが標的とする標的核酸配列内の標的領域に対して、少なくとも約70%、または少なくとも約75%、または少なくとも約80%、または少なくとも約85%、または少なくとも約90%、または少なくとも約95%、または少なくとも約99%の配列相補性を含む。例えば、アンチセンス化合物の20個のヌクレオチドのうち18個が標的領域に相補的であるアンチセンス化合物は、それゆえ特異的にハイブリダイズし、90パーセントの相補性を表す。この例において、残りの非相補的なヌクレオチドは、クラスター形成し、相補的なヌクレオチドとともに散在することがあり、互いに、または相補的なヌクレオチドに近接する必要はない。このようなものとして、標的核酸に完全に相補的である2つの領域が隣接する非相補的なヌクレオチドを4つ有する長さ18ヌクレオチドであるアンチセンス化合物は、標的核酸に77.8%の全相補性を有し、したがって本発明の範囲内に入る。標的核酸の領域を有するアンチセンス化合物のパーセント相補性は、当技術分野において知られているBLASTプログラム(ベーシックローカルアラインメント検索ツール)およびPowerBLASTプログラムを用いて日常的に決定され得る(Altschulら(1990年) J. Mol. Biol.、215巻、403〜410頁; ZhangおよびMadden (1997年) Genome Res.、7巻、649〜656頁)。パーセント相同性、配列同一性、または相補性は、例えば、SmithおよびWaterman (Adv. Appl. Math. (1981年) 2巻、482〜489頁)のアルゴリズムを用いるデフォルト設定を用いて、Gapプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package、Unix（登録商標）用バージョン8、Genetics Computer Group、University Research Park、Madison Wis.)によって決定することができる。
本明細書で用いられる「熱的融解点(Tm)」の語は、標的配列に相補的であるオリゴヌクレオチドの50%が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする、規定されたイオン強度、pH、および核酸濃度下の温度を意味する。典型的には、ストリンジェントな条件はpH7.0からpH8.3で、塩濃度が少なくとも約0.01Mから1.0MのNaイオン濃度(または他の塩)であり、短いオリゴヌクレオチド(例えば、10から50ヌクレオチド)に対して温度が少なくとも約30℃である条件である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を加えることでも実現することができる。
本明細書で用いられる「変調」は、遺伝子の発現における増大(刺激)または低減(阻害)のいずれかを意味する。
「バリアント」の語は、ポリヌクレオチド配列の文脈において用いられる場合、野生型の遺伝子に関連するポリヌクレオチド配列を包含することがある。この定義はまた、例えば、「対立遺伝子の」、「スプライスの」、「種の」、または「多型の」バリアントを含むことがある。スプライスバリアントは、参照分子に対して著しい同一性を有していてよいが、mRNAのプロセシングの間のエキソンの交互のスプライシングにより、一般的により多数またはより少数のポリヌクレオチドを有する。対応するポリペプチドは、さらなる機能性ドメインを有するかまたはドメインを有さないことがある。種のバリアントは種ごとに変化するポリヌクレオチド配列である。本発明においてとりわけ有用であるのは、野生型遺伝子生成物のバリアントである。バリアントは、核酸配列における少なくとも1つの突然変異に起因することがあり、mRNAの変更、またはその構造または機能が変更されることがあり、または変更されることのないポリペプチドをもたらすことがある。あらゆる所与の天然または組換えの遺伝子は、対立遺伝子型を有さず、1つ有し、または多く有することがある。バリアントを生じる一般的な突然変異性の変化は、一般的に、ヌクレオチドの天然の欠失、付加、または置換によるものである。これらのタイプの変化は各々、所与の配列において1回または複数回、単独で、または他者との組合せで起こることがある。
結果として生じるポリペプチドは、一般に相互に関して著しいアミノ酸の同一性を有する。多型バリアントは、所与の種の個体間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変形である。多型バリアントは、ポリヌクレオチド配列が1塩基だけ変化する「一塩基遺伝子多型」(SNP)または一塩基突然変異を包含することもある。SNPが存在するということは、例えば、疾患状態に対する傾向、すなわち感受性対抵抗性を有するある種の集団を示し得る。
誘導体のポリヌクレオチドは、化学的修飾、例えば、アルキル、アシル、またはアミノ基による水素の置換を受けさせた核酸を含む。誘導体、例えば、誘導体のオリゴヌクレオチドは、非天然に存在する部分、例えば、糖部分の改変または糖間連結を含むことができる。これらの中で例示的なものには、当技術分野において知られているホスホロチオエートおよび他のイオウ含有種がある。誘導体の核酸はまた、放射性核種、酵素、蛍光物質、化学発光物質、色素原性物質、基質、補助因子、阻害剤、磁性粒子などを含めた標識を含むことができる。
「誘導体の」ポリペプチドまたはペプチドは、例えば、グリコシル化、ペグ化、リン酸化、イオウ化、還元/アルキル化、アシル化、化学的カップリング、または温和なホルマリン処理によって修飾されているものである。誘導体は、それだけには限定されないが、放射性同位体、蛍光、および酵素の標識を含めた、直接的または間接的いずれかで検出可能な標識を含むように修飾されてもよい。
本明細書で用いられる「動物」または「患者」の語は、例えば、ヒト、ヒツジ、ヘラジカ、シカ、ミュールジカ、ミンク、哺乳動物、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、トリ、ニワトリ、爬虫類、魚類、昆虫、およびクモ類を含むことを意味する。
「哺乳動物」は、典型的に医薬的ケアの下にある温血の哺乳動物(例えば、ヒトおよび家畜)を網羅する。例として、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、およびヒトが含まれ、また、ヒトのみが含まれる。
「処置する」または「処置」は、哺乳動物における疾患状態の処置を網羅し、(a)とりわけ哺乳動物が疾患状態にかかりやすくなっているが疾患状態を有するとまだ診断されていない場合に、このような哺乳動物に疾患状態が生じるのを防ぎ、(b)疾患状態を阻害し、例えば、その発症を食い止め、かつ/または(c)疾患状態を軽減し、例えば、所望のエンドポイントに達するまで疾患状態の退行をもたらすことを含む。処置することはまた、疾患の症状の寛解も含み(例えば、疼痛または不快感を低減し)、このような寛解は疾患に直接影響(例えば、原因、伝染、発現など)を及ぼしてもよく、または及ぼさなくてもよい。乳頭状癌、肺胞性軟部乳頭癌
本明細書で用いられる「癌」は、哺乳動物において見られる、全てのタイプの癌、または新生物、または悪性腫瘍を意味し、それだけには限定されないが、白血病、リンパ腫、メラノーマ、癌腫、および肉腫を含む。癌は、「腫瘍」、または癌の悪性細胞を含む組織として顕在化する。腫瘍の例には、それだけには限定されないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫(endotheliosarcoma)、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腎細胞癌(papillary renal cell carcinoma)、肺胞性軟部癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫などの肉腫および癌腫が含まれる。本発明にしたがって開示する組成物によって処置することができるさらなる癌には、それだけには限定されないが、例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、大腸癌、悪性膵臓性膵島細胞腺腫(malignant pancreatic insulanoma)、悪性カルチノイド、膀胱癌、前癌性皮膚病変(premalignant skin lesions)、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症(hypercalcemia)、子宮頸癌、子宮体癌、副腎皮質性癌(adrenal cortical cancer)、および前立腺癌が含まれる。
「神経疾患または障害」は、神経系および/または視覚系のあらゆる疾患または障害を意味する。「神経疾患または障害」は、中枢神経系(脳、脳幹、および小脳)、末梢神経系(脳神経を含む)、ならびに自律神経系(その一部は中枢神経系および末梢神経系の両方に位置する)に関与する疾患または障害を含む。神経障害の例には、それだけには限定されないが、頭痛、昏迷および昏睡、痴呆、てんかん発作、睡眠障害、外傷、感染症、新生物、神経眼科、運動障害、脱髄疾患、脊髄障害、ならびに末梢神経、筋肉、および神経筋接合の障害が含まれる。中毒および精神病はそれだけには限定されないが、双極性障害および統合失調症を含み、これらも神経障害の定義に含まれる。以下のものは、本発明による組成物および方法を用いて処置することができる、いくつかの神経障害症状、徴候、および症候群の列挙である: 後天性てんかん様失語症、急性播種性脳脊髄炎、副腎白質萎縮症、加齢黄斑変性;脳梁欠損症、失認、エカルディ症候群、アレキサンダー病、アルパース病、交代性片麻痺、血管性痴呆、筋萎縮性側索硬化症、無脳症、アンジェルマン症候群、血管腫症、無酸素症、失語症、失行症、クモ膜嚢胞、クモ膜炎、アーノルド・キアリ奇形、動静脈奇形、アスペルガー症候群、血管拡張性失調症、注意欠陥多動性障害、自閉症、自律神経失調、背痛、バッテン病、ベーチェット病、ベル麻痺、良性本態性眼瞼痙攣、良性局在性、筋萎縮症、良性頭蓋内圧亢進症、ビンスワンガー病(Binswanger's disease)、眼瞼痙攣、ブロッホ・ザルツバーガー症候群、腕神経叢損傷、脳膿瘍、脳傷害;脳腫瘍(多形神経膠芽腫を含む)、脊髄腫瘍、ブラウン・セカール症候群、カナヴァン病、手根管症候群、灼熱痛、中枢性疼痛症候群、橋中心髄鞘融解、頭部障害(cephalic disorder)、脳動脈瘤、脳動脈硬化症、脳萎縮症、脳性巨人症、脳性麻痺,、シャルコー・マリー・トゥース病、化学療法誘発性神経障害および神経障害性疼痛、キアリ奇形、舞踏病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害;慢性疼痛、慢性限局性疼痛症候群(chronic regional pain syndrome)、コフィン・ローリー症候群、持続的な植物状態を含む昏睡、先天性顔面両側麻痺、大脳皮質基底核変性症、頭蓋動脈炎、頭蓋骨癒合症、クロイツフェルト・ヤコブ病、蓄積
外傷疾患、クッシング症候群、巨細胞性封入体病、サイトメガロウイルス感染症、眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調(dancing eyes-dancing feet syndrome)、ダンディー・ウォーカー症候群、ドーソン病、ド・モルシェ症候群、デジェリン・クルンプケ麻痺、痴呆、皮膚筋炎、糖尿病性神経障害、広汎性硬化症、自律神経障害、書字障害、失読症、筋緊張異常、早期乳児てんかん性脳症、トルコ鞍空洞症候群;脳炎、脳ヘルニア、大脳三叉神経性血管腫症、てんかん、エルブ麻痺、本態性振戦、ファブリー病、ファール症候群、失神、家族性強直性対麻痺、熱性けいれん、フィッシャー症候群、フリードライヒ失調症、前頭側頭型痴呆および他の「タウオパチー」、ゴーシェ病、ゲルストマン症候群、巨細胞性動脈炎、巨細胞封入体病、グロボイド細胞白質異栄養症、ギラン・バレー症候群、HTLV-1関連骨髄障害、ハラーフォルデン・シュパッツ病、頭部外傷;頭痛、片側顔面痙攣、遺伝性痙性対麻痺、遺伝性多発神経炎性失調、耳性帯状疱疹、帯状疱疹、ヒラヤマ症候群、HIV関連痴呆および神経障害(AIDSの神経症状も)、全前脳胞症、ハンチントン病および他のポリグルタミン繰り返し疾患、水頭性無脳症、水頭症、高コルチゾール症、低酸素症、免疫介在性脳脊髄炎、封入体筋炎、色素失調症、乳児性フィタン酸蓄積症、乳児性レフサム病、点頭てんかん、炎症性筋疾患、頭蓋内嚢胞、頭蓋内圧亢進、ジュベール症候群;カーンズ-セイヤー症候群、キンスボーン症候群(Kinsbourne syndrome)、クリッペル・ファイル症候群、クラッベ病、クーゲルベルク・ウェランダー病;クールー、ラフォラ病、ランバート・イートン筋無力症症候群、ランドー・クレッフナー症候群、延髄外側(ワレンベルグ)症候群、学習障害、リー病、レンノックス・ガストー症候群、レッシュ・ナイハン症候群: ロイコジストロフィー、レヴィ小体痴呆、脳回欠損、閉じ込め症候群、ルー・ゲーリック病(すなわち、運動ニューロン疾患または筋萎縮性側索硬化症)、椎間板疾患、ライム病-神経学的後遺症、マシャド・ジョセフ病、巨大脳髄症、巨脳症、メルカーソン・ローゼンタール症候群、メニエール病、髄膜炎、メンケス病、異染性白質ジストロフィー、小頭症、片頭痛、ミラー・フィッシャー症候群、軽い脳卒中、ミトコンドリアミオパ
チー、メビウス症候群、単肢の筋萎縮症、運動ニューロン疾患、もやもや病、ムコ多糖症、多発脳梗塞性痴呆、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症および他の脱髄性疾患、体位性低血圧を有する多系統萎縮症、筋ジストロフィー、重症筋無力症、アルパース病(myelinoclastic diffuse sclerosis)、乳児期ミオクロニー脳症、ミオクローヌス、ミオパチー、先天性筋緊張症、ナルコレプシー、神経線維腫症、神経弛緩性悪性症候群、AIDSの神経症状、狼瘡の神経学的後遺症、神経性筋強直症、神経セロイドリポフスチノーシス、神経細胞移動障害、ニーマン・ピック病;オサリバン・マクラウド症候群、後頭神経痛、続発性潜在性脊髄閉鎖不全(occult spinal dysraphism sequence)、大田原症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、眼球クローヌス・ミオクローヌス、視神経炎、起立性低血圧、過度使用症候群、感覚異常、神経変性疾患または障害(パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、痴呆、多発性硬化症、ならびに神経細胞死に関連する他の疾患および障害)、先天性パラミオトニー、腫瘍随伴性疾患、発作性発作(paroxysmal attacks)、パリー・ロンベルク症候群、ペリツェウス・メルツバッヘル病、周期性麻痺、末梢神経障害、有痛性の神経障害および神経因性疼痛、持続的な植物状態、広汎性発達障害、光性くしゃみ反射、フィタン酸蓄積症、ピック病、圧迫神経(pinched nerve)、下垂体腫瘍、多発性筋炎、孔脳症、ポリオ後症候群、帯状疱疹後神経痛、感染後脳脊髄炎、体位性低血圧、プラダー・ウィリ症候群、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性顔面片側萎縮症、進行性多巣性白質脳症、進行性硬化性ポリオジストロフィー(progressive sclerosing poliodystrophy)、進行性核上性麻痺、偽性脳腫瘍、ラムゼイハント症候群(I型およびII型)、ラスムッセン脳炎、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、レフサム病、反復動作障害(repetitive motion disorders)、反復ストレス傷害、レストレスレッグ症候群、レトロウイルス関連ミエロパチー、レット症候群、ライ症候群、舞踏病、サンドホフ病、シルダー病、裂脳症、中隔眼形成不全、揺さぶられっこ症候群、帯状疱疹、シャイ・ドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠時無呼吸、ソトス症候群、痙縮、脊椎披裂、脊髄損傷、脊髄腫瘍;脊髄性筋萎縮症、スティッフ・パーソン症候群(Stiff-Person syndrome)、脳卒中、スタージ・ウェーバー症候群;亜急性硬化性全脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、シデナム舞踏病、失神、脊髄空洞症、遅発性ジスキネジア、テイ・サックス病、側頭動脈炎、脊髄繋係留症候群(tethered spinal cord syndrome)、トムゼン病、胸郭出口症候群、三叉神経痛、トッド麻痺、トゥーレット症候群、一過性脳虚血発作、伝染性海綿状脳症、横断性脊髄炎、外傷性脳障害、振戦、三叉神経痛、熱帯性痙性不全対麻痺、結節性硬化症、脳血管性痴呆(多発脳梗塞性痴呆)、側頭動脈炎を含む血管炎、フォンヒッペル・リンダウ病、ワレンベルグ症候群、ウェルドニッヒ・ホフマン病、ウエスト症候群、むち打ち症、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ならびにツェルウェーガー症候群。
「炎症」は、全身的な炎症状態、ならびに単球、白血球、および/または好中球の遊走および誘引に局所的に関連する状態を意味する。炎症の例には、それだけには限定されないが、病原性生物体(グラム陽性菌、グラム陰性菌、ウイルス、真菌、および寄生体、例えば、原生動物および蠕虫を含む)の感染、移植片拒絶(腎臓、肝臓、心臓、肺、または角膜などの実質臓器の拒絶、ならびに骨髄移植の拒絶を含み、移植片対宿主病(GVHD)を含む)に起因する炎症、または限局性の慢性もしくは急性の自己免疫反応またはアレルギー反応に起因する炎症が含まれる。自己免疫疾患には、急性糸球体腎炎、関節リウマチまたは反応性関節炎、慢性糸球体腎炎;炎症性腸疾患、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、および壊死性腸炎;顆粒球輸血に関連する症候群;炎症性皮膚炎、例えば、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、乾癬;全身性エリテマトーデス(SLE)、自己免疫性甲状腺炎、多発性硬化症、およびいくつかの形態の糖尿病、または対象自身の免疫系による攻撃が病的な組織の破壊をもたらすあらゆる他の自己免疫状態が含まれる。アレルギー反応には、アレルギー性喘息、慢性気管支炎、急性および遅発性の過敏症が含まれる。全身性炎症状態には、外傷、火傷、虚血現象後の再潅流(例えば、心筋梗塞および脳卒中を含む、心臓、脳、腸、または末梢血管における血栓現象)、敗血症、ARDS、または多臓器機能不全症候群に関連する疾患が含まれる。炎症細胞のリクルートも動脈硬化プラークにおいて生じる。炎症には、それだけには限定されないが、非ホジキンリンパ腫、ウェゲナー肉芽腫症、橋本甲状腺炎、肝細胞癌、胸腺萎縮、慢性膵炎、関節リウマチ、反応性リンパ組織増殖症、骨関節炎、潰瘍性腸炎、乳頭状癌、クローン病、潰瘍性腸炎、急性胆嚢炎、慢性胆嚢炎、硬変、慢性唾液腺炎、腹膜炎、急性膵炎、慢性膵炎、慢性胃炎、腺筋症、子宮内膜症、急性子宮頸炎、慢性子宮頸炎、リンパ組織過形成、多発性硬化症、特発性血小板減少性紫斑病に二次的である肥大、原発性IgA腎症、全身性エリテマトーデス、乾癬、肺気腫、慢性腎盂腎炎、および慢性膀胱炎が含まれる。
心臓血管疾患または障害には、虚血を引き起こし得る、または心臓の再潅流によって引き起こされるいずれかの障害が含まれる。例として、それだけには限定されないが、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、肉芽腫性心筋炎(granulomatous myocarditis)、慢性心筋炎(非肉芽腫性)、原発性肥大型心筋症、末梢動脈疾患(PAD)、発作、狭心症、心筋梗塞、心停止によって引き起こされる心臓血管組織の損傷、心臓バイパスによって引き起こされる心臓血管組織の損傷、心原性ショック、および当業者であれば知っている、あるいは心臓もしくは血管系の機能不全または心臓もしくは血管系に対する組織の損傷を伴う状態、とりわけ、それだけには限定されないが、ADAM活性化に関連する組織の損傷が含まれる。CVS疾患には、それだけには限定されないが、アテローム性動脈硬化、肉芽腫性心筋炎、心筋梗塞、心臓弁膜症に二次的な心筋線維症、梗塞のない心筋線維症、原発性肥大型心筋症、および心筋炎(非肉芽腫性)が含まれる。
「メタボリック疾患または障害」は、内分泌系の広範囲の疾患および障害を意味し、インスリン抵抗性、糖尿病、肥満、耐糖能障害、血中高コレステロール、高血糖、高インスリン血症、異脂肪血症、および高脂血症を含む。
結合組織の疾患または障害には、それだけには限定されないが、嚢胞性線維症、心筋線維症、骨髄線維症、肝線維症、間質性肺線維症、腫瘍性線維症、膵線維症、肺線維症、表皮下線維症(subepidermal fibrosis)、膀胱の全壁性線維化、増殖性線維症、置換性線維形成、後腹膜線維症および神経根嚢線維症(root sleeve fibrosis)、骨形成不全症、エーラース・ダンロス症候群、軟骨発育不全、マルファン症候群、アルポート症候群、家族性大動脈瘤、軟骨形成不全、ムコ多糖症、骨粗鬆症、大理石骨病、パジェット病、くる病、骨軟化症、副甲状腺機能亢進症、腎性骨異栄養症、骨壊死、骨髄炎、骨腫、類骨骨腫、骨芽細胞腫、骨肉腫、骨軟骨腫、軟骨腫、軟骨芽、軟骨粘液線維腫、軟骨肉腫、線維性骨皮質欠損、非骨化性線維腫、繊維性骨異形成症、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、ユーイング肉腫、原始神経外胚葉性腫瘍、巨細胞腫瘍、骨関節炎、関節リウマチ、強直性脊椎関節炎、ライター症候群、乾癬性関節炎、腸疾患に基づく関節炎、感染性関節炎、痛風、痛風性関節炎、ピロリン酸カルシウム結晶沈着症、結節腫、滑膜嚢胞、絨毛結節性滑膜炎、全身性硬化症、デュピュイトラン拘縮、紅斑性狼瘡、混合性結合組織病、単純性表皮水疱症、水疱性先天性魚鱗癬様紅皮症(表皮剥離性角質増殖症)、非表皮剥離性および表皮剥離性の掌蹠角化症、ジーメンスの魚鱗癬水疱症、先天性爪肥厚症、白色海綿状母斑が含まれる。
細胞増殖性疾患または障害には、それだけには限定されないが、光線性角化症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病(MCTD)、骨髄線維症、発作性夜間血色素尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、および腺癌、白血病、リンパ腫、メラノーマ、骨髄腫、肉腫、奇形腫を含む癌、とりわけ、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頸部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、上皮小体、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれる。
ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの組成物および分子
標的:一実施形態において、標的は転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)の核酸配列を含み、制限なく、TFE3および/またはIRS2に関連するセンスおよび/またはアンチセンス非コードおよび/またはコード配列を含む。
TFE3は、塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス(bHLH)タンパク質であり、そのプロモーターにおいてE-boxによって制御される代謝遺伝子のトランス活性化因子である。培養中およびin vivoの肝細胞においてアデノウイルスが媒介するTFE3の発現は、IRS-2およびAktの発現を強力に活性化し、Akt、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β、およびp70S6キナーゼなどのインスリンのシグナル伝達キナーゼのリン酸化を増強した。TFE3は、様々なインスリンのシグナル伝達分子を強力に活性化し、インスリン抵抗性の発生およびメタボリックシンドロームに対して保護するbHLH転写因子である(Nakagawa Y.ら(2005年) Nature Medicine、12巻、107〜113頁)。
TFE3としても知られている、IGHMエンハンサー3に結合する転写因子はヒトの遺伝子である。TFE3は転写因子のヘリックス-ループ-ヘリックスファミリーのメンバーであり、免疫グロブリン重鎖エンハンサーのmu-E3モチーフに結合し、多くの細胞型において発現される。
IRS-2の制御は、Foxo1と相乗作用したTFE3、およびSREBP-1cが集中する主要な部位である。まとめると、TFE3/FoxolおよびSREBP-1cは、肝臓においてIRS-2発現およびインスリン感受性を相互に制御する(Shimano H. (2007年) J. Mol. Med.、85巻(5)、437〜44頁)。
IRS-タンパク質ファミリーのメンバーは、インスリンおよびIGF-1に対する受容体、およびヤヌスキナーゼに連結しているある種のサイトカイン受容体によってリン酸化されたチロシンである(Yenush Lら(1997年) Bio Essays、19巻、491〜500頁)。少なくとも4つのIRS-タンパク質が、哺乳動物において生じ、IRS-1およびIRS-2は広く発現され、IRS-3は脂肪組織、β細胞、およびおそらく肝臓に限定され、IRS-4は胸腺、脳、および腎臓において発現される。IRS-タンパク質は、近接するプレクストリン相同性ドメイン、および活性化された受容体チロシンキナーゼに対する連結を媒介するホスホチロシン結合性ドメインから構成される保存されているアミノ末端を有する。
アンチセンス化合物を用いて得られた幹細胞から再生される細胞/組織で処置することができる、例示の転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)媒介疾患および障害の例は:糖尿病またはその関連障害(例えば、I型、II型糖尿病、妊娠糖尿病、糖尿病性ケトアシドーシス、非ケトン性高浸透圧性昏睡、低血糖、糖尿病性昏睡など)、メタボリック疾患または障害(例えば、インスリン抵抗性非糖尿病状態、例えば、肥満、耐糖能障害(IGT)、およびメタボリックシンドローム)、多嚢胞性卵巣症候群、アテローム性動脈硬化症、癌(例えば、乳頭状腎細胞癌、胞状軟部肉腫)、アポトーシス、加齢、および老化に関連する疾患;神経学的疾患または障害(例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症など)、感染性生物体に関連する疾患または障害、自己免疫、免疫系に関連する疾患または障害、炎症、アレルギー、心臓血管疾患または障害(例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性筋萎縮症、糖尿病性腎症、糖尿病性心筋症)、大血管性疾患または障害、冠状動脈疾患、アンギナ、心筋梗塞(「心臓発作」)、脳卒中、末梢血管疾患(例えば、間欠性跛行の原因となるもの(労作に関連する脚および足の疼痛)ならびに糖尿病性足病変、糖尿病性筋壊死(「筋肉疲労」)、糖尿病足などを含む)、結合組織疾患または障害、細胞増殖性疾患または障害を含む。
好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、制限なく非コード領域を含む、TFE3および/またはIRS2のポリヌクレオチドに特異的である。TFE3および/またはIRS2の標的はTFE3および/またはIRS2のバリアント;SNPを含むTFE3および/またはIRS2の突然変異体、TFE3および/またはIRS2の非コード配列、;対立遺伝子、フラグメントなどを含む。オリゴヌクレオチドがアンチセンスRNA分子であるのが好ましい。
本発明の実施形態によると、標的核酸分子はTFE3および/またはIRS2ポリヌクレオチド単独に限定されず、TFE3および/またはIRS2のあらゆるイソ型、受容体、ホモログ、非コード領域などに拡大する。
別の好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、制限なく、バリアント、対立遺伝子、ホモログ、突然変異体、誘導体、フラグメント、およびそれらの相補配列を含む、TFE3標的天然アンチセンス配列(コードおよび非コード領域に対して天然アンチセンス)を標的とする。オリゴヌクレオチドがアンチセンスのRNAまたはDNA分子であるのが好ましい。
別の好ましい一実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は、化合物におけるヌクレオチドの1つまたは複数の位置に異なる塩基が存在するバリアントも含む。例えば、第1のヌクレオチドがアデニンである場合、チミジン、グアノシン、シチジン、または他の天然もしくは非天然ヌクレオチドをこの位置に含むバリアントを生成することができる。これは、アンチセンス化合物のあらゆる位置で行われてよい。次いで、これらの化合物を、本明細書に記載する方法を用いて試験して、標的核酸の発現を阻害するその能力を決定する。
いくつかの実施形態において、アンチセンス化合物と標的との間の相同性、配列同一性、または相補性は、約50%から約60%までである。いくつかの実施形態において、アンチセンス化合物と標的との間の相同性、配列同一性、または相補性は、約60%から約70%までである。いくつかの実施形態において、相同性、配列同一性、または相補性は、約70%から約80%までである。いくつかの実施形態において、相同性、配列同一性、または相補性は、約80%から約90%までである。いくつかの実施形態において、相同性、配列同一性、または相補性は、約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または約100%である。
アンチセンス化合物は、標的核酸に対する化合物の結合が標的核酸の正常な機能に干渉して活性の喪失をもたらす場合に特異的にハイブリダイズすることができ、特異的な結合が望ましい条件下でアンチセンス化合物の非標的核酸配列に対する非特異的な結合を避けるのに十分な度合いの相補性が存在する。このような条件は、すなわちin vivoのアッセイまたは治療的処置の場合は生理学的条件、およびin vitroのアッセイの場合はアッセイが行われる条件を含む。
アンチセンス化合物は、DNA、RNA、キメラ、置換でも標的DNAまたはRNA分子に対する化合物の結合が標的DNAまたはRNAの正常な機能に干渉して有用性の喪失をもたらす場合に特異的にハイブリダイズすることができ、特異的な結合が望ましい条件下(すなわち、in vivoのアッセイまたは治療的処置の場合は生理学的条件下、およびin vitroのアッセイの場合はアッセイが行われる条件下)でアンチセンス化合物の非標的配列に対する非特異的な結合を避けるのに十分な度合いの相補性が存在する。
別の好ましい一実施形態において、TFE3のターゲッティングは、制限なく、例えば、PCR、ハイブリダイゼーションなどを用いて同定および拡大されるアンチセンス配列、配列番号5に記載し、TFE3および/またはIRS2の発現または機能を変調する1つまたは複数の配列などを含む。一実施形態において、発現または機能は、対照に比べて上方制御される。別の好ましい一実施形態において、発現または機能は、対照に比べて下方制御される。
別の好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えば、PCR、ハイブリダイゼーションなどを用いて同定および拡大されるアンチセンス配列を含む、配列番号4から9に記載する核酸配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾されたヌクレオチド、より短いまたは長いフラグメント、修飾された結合などを含むことができる。修飾された結合またはヌクレオチド間連結の例として、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなどが含まれる。別の好ましい一実施形態において、ヌクレオチドはリン誘導体を含む。本発明の修飾されたオリゴヌクレオチドにおける糖または糖の類似体部分に付着することができるリン誘導体(もしくは修飾されているリン酸基)は、一リン酸、二リン酸、三リン酸、アルキルリン酸、アルカンリン酸(alkanephosphate)、ホスホロチオエートなどであってよい。上記に記載したリン酸類似体の調製、ならびにヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチド中へのこれらの組入れは、それ自体がやはり知られており、本明細書に記載する必要はない。
アンチセンスの特異性および感受性も、当業者によって治療用に利用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトにおける疾患状態の処置における治療部分として使用されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドはヒトに対して安全かつ効果的に投与されており、多数の臨床試験が現在行われている。このように、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織、および動物、とりわけヒトの処置に対する処置レジメンにおいて有用であるように構成され得る、有用な治療モダリティであり得ることが確立されている。
本発明の実施形態において、オリゴマーのアンチセンス化合物、とりわけオリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に結合し、標的遺伝子によってコードされる分子の発現および/または機能を変調する。干渉すべきDNAの機能は、例えば、複製および転写を含む。干渉すべきRNAの機能は、例えば、RNAのタンパク質翻訳の部位への転座、RNAからのタンパク質の翻訳、1つまたは複数のmRNA種を産生するためのRNAのスプライシング、およびRNAが関与しまたは促進し得る触媒活性など、重要な機能を全て含む。この機能は、所望の機能に応じて、上方制御されることがあり、または阻害されることもある。
アンチセンス化合物には、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外部誘導配列(EGS)オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー、プライマー、プローブ、および標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズする他のオリゴマー化合物が含まれる。このようなものとして、これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、部分的な一本鎖、または環状のオリゴマー化合物の形態において導入されてよい。
本発明の文脈において、特定の核酸分子に対するアンチセンス化合物のターゲッティングは、多段階のプロセスであってよい。このプロセスは通常、その機能を変調すべき標的核酸の同定で始まる。この標的核酸は、例えば、その発現が特定の障害または疾患状態に関連する細胞の遺伝子(もしくは、遺伝子から転写されたmRNA)、または感染因子からの核酸分子であってよい。本発明において、標的核酸は、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)をコードしている。
ターゲッティングのプロセスは、通常、アンチセンスの相互作用が生じ、その結果所望の効果(例えば、発現の変調)がもたらされるための標的核酸内の少なくとも1つの標的領域、セグメント、または部位の決定も含む。本発明の文脈内では、「領域」の語は、少なくとも1つの同定可能な構造、機能、または特徴を有する標的核酸の一部分と定義される。標的核酸の領域内にセグメントがある。「セグメント」は、標的核酸内のより小さな領域またはサブポーション(sub-portion)の領域と規定される。本発明において用いられる「部位」は、標的核酸内の位置と定義される。
好ましい一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、インスリン受容体基質2(IRS2)および/または転写因子E3(TFE3)の天然アンチセンス配列に結合し、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)の発現および/または機能を変調する。アンチセンス配列の例として配列番号3から9が含まれる。
別の好ましい一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)の1つまたは複数のセグメントに結合し、TFE3および/またはIRS2の発現および/または機能を変調する。セグメントは、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)のセンスまたはアンチセンスポリヌクレオチドの少なくとも5つの連続したヌクレオチドを含む。
別の好ましい一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは転写因子E3(TFE3)の天然アンチセンス配列に特異的であり、オリゴヌクレオチドの、TFE3の天然アンチセンス配列に対する結合は、TFE3および/またはIRS2の発現および/または機能を変調する。
別の好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、配列番号4から9に記載する配列を含み、例えば、PCR、ハイブリダイゼーションなどを用いて同定および拡大されるアンチセンス配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾されたヌクレオチド、より短いまたは長いフラグメント、修飾された結合などを含むことができる。修飾された結合またはヌクレオチド間連結の例として、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなどが含まれる。別の好ましい一実施形態において、ヌクレオチドはリン誘導体を含む。本発明の修飾されたオリゴヌクレオチドにおける糖または糖類似体部分に付着していてよいリン誘導体(もしくは修飾されているリン酸基)は、一リン酸、二リン酸、三リン酸、アルキルリン酸、アルカンリン酸、ホスホロチオエートなどであってよい。上記に記載したリン酸類似体の調製、ならびにヌクレオチド、修飾されているヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチド中へのこれらの組入れは、それ自体がやはり知られており、本明細書に記載する必要はない。
当技術分野において知られている通り、翻訳開始コドンは典型的に5'-AUG(転写されるmRNA分子における;対応するDNAにおいては5'-ATG)であるので、翻訳開始コドンは「AUGコドン」、「開始コドン」、または「AUG開始コドン」とも呼ばれる。少数の遺伝子は、RNA配列5'-GUG、5'-UUG、または5'-CUGを有する翻訳開始コドンを有し、5'-AUA、5'-ACG、および5''-CUGはin vivoで機能することが示されている。したがって、各場合における開始アミノ酸は典型的にメチオニン(真核生物において)またはホルミルメチオニン(原核生物において)であったとしても、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」の語は多くのコドン配列を包含することができる。真核生物および原核生物の遺伝子は、2つまたはそれを超える代替の開始コドンを有することができ、そのいずれも、特定の細胞型もしくは組織における翻訳の開始に、または特定のセットの条件下で利用され得るのが好ましい。本発明の文脈において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、このようなコドンの配列とは関係なく、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)をコードする遺伝子から転写されたmRNAの翻訳を開始するためにin vivoで用いられるコドンまたは複数のコドンを意味する。遺伝子の翻訳終結コドン(または「終止コドン」)は、3つの配列、すなわち、5'-UAA、5'-UAG、および5'-UGA(対応するDNA配列は、それぞれ5'-TAA、5'-TAG、および5'-TGAである)のうちの1つを有することができる。
「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」の語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向(すなわち、5'または3')における約25から約50までの連続したヌクレオチドを包含するmRNAまたは遺伝子のような部分を意味する。同様に、「終止コドン領域」および「翻訳終結コドン領域」の語は、翻訳終結コドンからいずれかの方向(すなわち、5'または3')における約25から約50までの連続したヌクレオチドを包含するmRNAまたは遺伝子のような部分を意味する。したがって、「開始コドン領域」(または「翻訳開始コドン領域」)および「終止コドン領域」(または「翻訳終結コドン領域」)は全て、本発明のアンチセンス化合物で効果的に標的にされ得る領域である。
「オープンリーディングフレーム(ORF)」または「コード領域」は、当技術分野において翻訳開始コドンと翻訳終結コドンとの間の領域を意味することが知られており、効果的に標的にされ得る領域でもある。本発明の文脈内で、標的領域は、遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)の翻訳開始コドンまたは翻訳終結コドンを包含する遺伝子内の領域である。
別の標的領域は、当技術分野において翻訳開始コドンから5'方向におけるmRNAの部分を意味することが知られている、5'非翻訳領域(5'UTR)を含み、したがって5'キャップ部位とmRNAの翻訳開始コドンとの間のヌクレオチド(または遺伝子上の対応するヌクレオチド)を含む。さらに別の標的領域は、当技術分野において翻訳終結コドンから3'方向におけるmRNAの部分を意味することが知られている3'非翻訳領域(3'UTR)を含み、したがって翻訳終結コドンとmRNAの3'末端との間のヌクレオチド(または遺伝子上の対応するヌクレオチド)を含む。mRNAの5'キャップ部位は、5'-5'三リン酸連結によってmRNAの5'-の殆どの残基に接続しているN7-メチル化されたグアノシン残基を含む。mRNAの5'キャップ領域は、5'キャップ構造自体、およびキャップ部位に隣接する最初の50個のヌクレオチドを含むと考えられる。本発明のための別の標的領域は5'キャップ領域である。
いくつかの真核生物のmRNA転写物は直接翻訳されるが、多くは、それが翻訳される前に転写物から切り出される、「イントロン」として知られる1つまたは複数の領域を含んでいる。残余の(したがって翻訳されている)領域は「エキソン」として知られており、一緒にスプライスされて連続したmRNA配列を形成する。一実施形態において、ターゲッティングするスプライス部位、すなわち、イントロン-エキソン接合部またはエキソン-イントロン接合部は、疾患において異常なスプライシングが関係づけられる状況において、または疾患において特定のスプライス生成物の過剰生成が関係づけられる状況においてとりわけ有用である。再配列または欠失による異常な融合の接合部は、標的部位の別の一実施形態である。異なる遺伝子源から2つ(またはそれを超える)mRNAのスプライシングのプロセスによって生成されるmRNA転写物は、「融合転写物」として知られている。DNAまたはプレ-mRNAなどを標的とするアンチセンス化合物を用いて、イントロンは効果的に標的にされ得る。
別の好ましい一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドのコードおよび/または非コード領域に結合し、標的分子の発現および/または機能を変調する。
別の好ましい一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然アンチセンスポリヌクレオチドに結合し、標的分子の発現および/または機能を変調する。
別の好ましい一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、センスポリヌクレオチドに結合し、標的分子の発現および/または機能を変調する。
代替のRNA転写物は、DNAの同じゲノム領域から生成され得る。これらの代替の転写物は、一般的に「バリアント」として知られている。より詳しくは、「プレ-mRNAバリアント」は、開始または終止位置のいずれかにおいて同じゲノムDNAから生成された他の転写物と異なり、イントロン配列およびエキソン配列の両方を含む、同じゲノムDNAから生成された転写物である。
スプライシングの間に1つまたは複数のエキソンまたはイントロン領域、またはこれらの部分を切り取る際、プレ-mRNAバリアントはより小さな「mRNAバリアント」を生成する。したがって、mRNAバリアントはプロセシングされたプレ-mRNAバリアントであり、各々の独特なプレ-mRNAバリアントは、スプライシングの結果として独特なmRNAバリアントを常に生成しなければならない。これらのmRNAバリアントは「選択的スプライシングバリアント」としてやはり知られている。プレ-mRNAバリアントのスプライシングが起きない場合は、プレ-mRNAバリアントはmRNAバリアントと同一である。
バリアントは、転写を開始または終止するための代替シグナルの使用によって生成され得る。プレ-mRNAおよびmRNAは、1つを超える開始コドンまたは終止コドンを所有することができる。代替開始コドンを用いるプレ-mRNAまたはmRNAを起源とするバリアントは、プレ-mRNAまたはmRNAの「代替開始バリアント」として知られている。代替終止コドンを用いるこれらの転写物は、プレ-mRNAまたはmRNAの「代替終止バリアント」として知られている。代替終止バリアントの1つの具体的なタイプは、生成された多数の転写物が、転写機構によって「ポリA終止シグナル」の1つの代替的選択に起因し、それによって独特のポリA部位で終結する転写物を生成するする「ポリAバリアント」である。本発明の文脈内で、本明細書に記載するバリアントのタイプは、標的核酸の実施形態でもある。
それに対してアンチセンス化合物がハイブリダイズする標的核酸の位置は、活性のアンチセンス化合物が標的にする標的領域の少なくとも5ヌクレオチド長の部分と定義される。
ある種の例示の標的セグメントの詳しい配列を本明細書に記載するが、当業者であれば、これらは例示的なものをもたらし、本発明の範囲内の特定の実施形態を記載するものであることを理解されよう。さらなる標的セグメントは、当業者であれば、本開示に鑑みて用意に確認することができる。
例示の好ましい標的セグメント内から選択される少なくとも5つの連続したヌクレオチドの一続きを含む、長さ5〜100ヌクレオチドの標的セグメントは、ターゲッティングにやはり適すると考えられる。
標的セグメントは、例示の好ましい標的セグメントの1つの5'-末端から少なくとも5つの連続したヌクレオチドを含むDNAまたはRNA配列を含むことができる(残余のヌクレオチドは、標的セグメントの5'-末端のすぐ上流に始まり、DNAまたはRNAまで続く同じDNAまたはRNAの連続した一続きであり、約5個から約100個のヌクレオチドを含む)。同様に、好ましい標的セグメントは、例示の好ましい標的セグメントの1つの3'-末端から少なくとも5つの連続したヌクレオチドを含むDNAまたはRNA配列によって表される(残余のヌクレオチドは、標的セグメントの3'-末端のすぐ下流に始まり、DNAまたはRNAまで続く同じDNAまたはRNAの連続した一続きであり、約5個から約100個のヌクレオチドを含む)。本明細書で説明する標的セグメントを備えた当業者であれば、過度の実験を行わずに、さらなる好ましい標的セグメントを同定することができよう。
1つまたは複数の標的領域、セグメント、または部位が同定された後は、所望の効果をもたらすために、標的に対して十分に相補的である、すなわち、十分良好に、かつ十分な特異性でハイブリダイズする、アンチセンス化合物が選択される。
本発明の実施形態において、オリゴヌクレオチドは特定の標的アンチセンス鎖に結合する。オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも5ヌクレオチドであり、各オリゴヌクレオチドがオーバーラップ配列を標的とするように合成され得、したがってオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの全長を網羅するように合成される。標的は、やはりコード領域および非コード領域を含む。
一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって特定の核酸を標的にするのが好ましい。特定の核酸に対するアンチセンス化合物のターゲッティングは多段階のプロセスである。このプロセスは通常、その機能が変調される核酸配列を同定することから始まる。これは、例えば、その発現が特定の障害または疾患状態に関連する細胞の遺伝子(または遺伝子から転写されたmRNA)、または例えば非コードRNA(ncRNA)などの非コードポリヌクレオチドであってよい。
RNAは、(1)タンパク質に翻訳されるメッセンジャーRNA(mRNA)、および(2)非タンパク質コードRNA(ncRNA)に分類され得る。ncRNAは、マイクロRNA、アンチセンス転写物、および高密度の終止コドンを含み、いかなる広範な「オープンリーディングフレーム」のない他の転写単位(TU)を含む。多くのncRNAは、タンパク質コード座位の3'非翻訳領域(3'UTR)における開始部位から開始すると思われる。ncRNAは希であることが多く、FANTOMコンソーシアムによって配列決定されているncRNAの少なくとも半分はポリアデニル化されていないと思われる。殆どの研究者が明らかな理由で、プロセシングされ、細胞質に輸送される、ポリアデニル化mRNAに注目している。最近、非ポリアデニル化の核RNAのセットが非常に大型であることがあり、このような転写物の多くがいわゆる遺伝子間領域に起因することが示された(Cheng, J.ら(2005年) Science、308巻(5725)、1149〜1154頁; Kapranov, P.ら(2005年)Genome Res、15巻(7)、987〜997頁)。それによってncRNAが遺伝子発現を制御することがあるメカニズムは、標的転写物との塩基対形成によるものである。塩基対形成によって機能するRNAは、(1)同じ遺伝子の位置であるが、これらが作用するRNAに対して反対の鎖上でコードされ、したがってその標的に対して完全な相補性を表すシスコード化RNA、および(2)これらが作用するRNAとは別の染色体位置でコードされ、一般的にその標的と完全な塩基対形成の可能性を示さないトランスコード化RNA、に分類され得る。
理論によって拘泥しようとするものではないが、本明細書に記載するアンチセンスオリゴヌクレオチドによるアンチセンスポリヌクレオチドの撹乱は、対応するセンスメッセンジャーRNAの発現を変更し得る。しかし、この制御は、不調和性(アンチセンスのノックダウンがメッセンジャーRNAの上昇をもたらす)または調和性(アンチセンスのノックダウンが随伴性のメッセンジャーRNAの低下をもたらす)のいずれかであってよい。これらの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス転写物の重複する、または非重複の部分を標的としてよく、そのノックダウンまたは隔離をもたらす。コードおよび非コードのアンチセンスは全く同じに標的にされてよく、このいずれのカテゴリーも調和性に、または不調和性のいずれかに対応するセンス転写物を制御することができる。標的に対して用いるための新しいオリゴヌクレオチドを同定する上で用いられる戦略は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるアンチセンスRNA転写物のノックダウン、または所望の標的を変調するあらゆる他の手段に基づくことができる。
戦略I:不調和性の制御の場合、アンチセンス転写物のノックダウンにより、従来の(センス)遺伝子の発現が上昇する。センス遺伝子が既知の、または推定上の薬物標的をコードしていれば、そのアンチセンス対応物のノックダウンは、受容体アゴニストまたは酵素刺激物質の作用をおそらく模倣し得る。
戦略II:調和性の制御の場合、アンチセンスおよびセンス両方の転写物を同時にノックダウンし、それによって従来の(センス)遺伝子の発現の相乗的な低下を実現し得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてノックダウンを実現する場合、この戦略を、センス転写物を標的とした1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンス転写物を標的とした別のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または重複するセンスおよびアンチセンスの転写物を同時に標的にするエネルギー的に対称性の単一のアンチセンスオリゴヌクレオチドに応用するのに用いることができる。
本発明によると、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部誘導配列(EGS)オリゴヌクレオチド、siRNA化合物、siRNA化合物などの一本鎖または二本鎖RNA干渉(RNAi)化合物、および標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズし、その機能を変調する他のオリゴマー化合物を含む。このようなものとして、これらは、DNA、RNA、DNA様、RNA様、もしくはこれらの混合物であってよく、またはこれらの1つもしくは複数を模倣していてもよい。これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状またはヘアピン状のオリゴマー化合物であってよく、内部または末端のバルジ、ミスマッチ、またはループなどの構造エレメントを含んでいてよい。アンチセンス化合物は、日常的に直鎖状に調製されるが、連結していてよく、あるいはそうでなければ環状および/または分枝状に調製することができる。アンチセンス化合物は、例えば、全体に、もしくは部分的に二本鎖の化合物を形成するようにハイブリダイズされる2本の鎖、または完全に、もしくは部分的に二本鎖の化合物のハイブリダイゼーションおよび形成を可能にする十分な自己相補性を有する一本鎖などの構築物を含むことができる。2本の鎖は、フリーの3'末端もしくは5'末端を残して内部的に連結されてよく、または連続するヘアピン構造もしくはループを形成するように連結されてよい。ヘアピン構造は、5'末端または3'末端いずれかの上にオーバーハングを含み、一本鎖の特徴の拡大を生成してもよい。二本鎖の化合物は、場合により、末端上にオーバーハングを含むことができる。さらなる修飾は、末端の一方、選択されたヌクレオチド位置、糖位置に、またはヌクレオシド間連結の1つに付着しているコンジュゲート基を含むことができる。あるいは、2本の鎖は、非核酸部分またはリンカー基によって連結されていてよい。1本の鎖のみから形成される場合、dsRNAは、自身の上に二重になって二重鎖を形成する自己相補性のヘアピン型分子の形態をとることがある。このように、dsRNAは、完全に、または部分的に二本鎖であってよい。遺伝子発現の特異的な変調は、トランスジェニック細胞系統においてdsRNAヘアピンの安定な発現によって実現され得るが、いくつかの実施形態において、遺伝子の発現または機能は上方制御される。2本の鎖、または
自身の上に二重になって二重鎖を形成する自己相補性のヘアピン型分子の形態をとる一本鎖から形成される場合、2本の鎖(または一本鎖の二本鎖形成領域)は、塩基がワトソン-クリック様式において対形成する相補的なRNA鎖である。
本発明の化合物は、システムに導入された後、標的核酸の切断もしくは他の修飾をもたらすための1つもしくは複数の酵素もしくは構造タンパク質の作用を誘発することができ、または占有率ベースのメカニズムによって働くことができる。一般的に、核酸(オリゴヌクレオチドを含む)は、「DNA様」(すなわち、一般的に1つもしくは複数の2'-デオキシ糖を有し、一般的にU塩基よりもT塩基を有する)、または「RNA様」(すなわち、一般的に1つもしくは複数の2'-ヒドロキシもしくは2'-修飾された糖を有し、一般的にT塩基よりもU塩基を有する)と記載され得る。核酸のヘリックスは、最も一般的にはA型およびB型の、1つを超えるタイプの構造をとることができる。一般的に、B型様構造を有するオリゴヌクレオチドは「DNA様」であり、A型様構造を有するオリゴヌクレオチドは「RNA様」であると考えられている。いくつかの(キメラの)実施形態において、アンチセンス化合物は、A型およびB型両方の領域を含むことができる。
別の好ましい一実施形態において、所望のオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス化合物は、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、キメラのアンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾された連結を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉RNA(RNAi)、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロ干渉RNA(miRNA)、スモールテンポラルRNA(small temporal RNA)(stRNA)、または短ヘアピンRNA(short hairpin RNA)(shRNA)、低分子RNA誘導性遺伝子活性化(RNAa)、低分子活性化RNA(saRNA)、またはこれらの組合せの少なくとも1つを含む。
dsRNAも、「低分子RNA誘導性遺伝子活性化」またはRNAaと呼ばれるメカニズムである、遺伝子発現を活性化することができる。dsRNA標的遺伝子プロモーターは、関連の遺伝子の強力な転写活性化を誘導する。RNAaは、「低分子活性化RNAa」(saRNA)と呼ばれる、合成dsRNAを用いてヒト細胞において実証された。RNAaが他の生物体において保存されているかどうかは現在分かっていない。
低分子干渉RNA(siRNA)およびマイクロRNA(miRNA)などの低分子二本鎖RNA(dsRNA)は、RNA干渉(RNAi)として知られている、進化上保存されているメカニズムの引き金であることが見出されている。RNAiは、クロマチンの再構築によって常に遺伝子のサイレンシングをもたらし、それによって転写を抑制し、相補的mRNAを分解し、またはタンパク質の翻訳を阻止する。しかし、後の実施例のセクションにおいて詳しく記載する場合では、オリゴヌクレオチドはTFE3および/またはIRS2ポリヌクレオチドならびにこれらのコードされた生成物の発現および/または機能を増大することが示されている。dsRNAは低分子活性化RNA(saRNA)として働くこともある。理論によって拘泥しようとするものではないが、遺伝子プロモーターにおける配列を標的にすることによって、saRNAは、dsRNA誘導性転写活性化(RNAa)と呼ばれる現象において標的遺伝子の発現を誘導する。
さらなる一実施形態において、本明細書で同定される「好ましい標的セグメント」は、TFE3および/またはIRS2ポリヌクレオチドの発現を変調するさらなる化合物に対するスクリーニングにおいて用いられ得る。「モジュレーター」は、TFE3および/またはIRS2をコードする核酸分子の発現を低減または増大し、好ましい標的セグメントに相補的である少なくとも5ヌクレオチド部分を含む化合物である。スクリーニング方法は、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)のセンスまたは天然アンチセンスポリヌクレオチドをコードする核酸分子の好ましい標的セグメントを、1つまたは複数の候補のモジュレーターと接触させる段階と、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)をコードする核酸分子、例えば、配列番号4から9の発現を低減または増大する1つまたは複数の候補のモジュレーターに対して選択する段階とを含む。候補のモジュレーターまたは複数のモジュレーターが、TFE3および/またはIRS2ポリヌクレオチドをコードする核酸分子の発現を変調(例えば、低減または増大のいずれか)することができることが示されたら、次いでモジュレーターを、TFE3および/またはIRS2ポリヌクレオチドの機能のさらなる調査研究において、または本発明による調査、診断、または治療薬として用いることができる。
天然アンチセンスの転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)の配列のターゲッティングが、標的遺伝子のTFE3および/またはIRS2(例えば、受諾番号NM_003749および/またはNM_006521)の機能を変調するのが好ましい。好ましい一実施形態において、標的は転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチドである。好ましい一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)のセンスおよび/または天然アンチセンス配列(例えば、受諾番号NM_003749および/またはNM_006521)のバリアント、対立遺伝子、イソ型、ホモログ、突然変異体、誘導体、フラグメント、およびそれに対して相補配列を標的とする。オリゴヌクレオチドがアンチセンス分子であり、標的がアンチセンスおよび/またはセンスのTFE3および/またはIRS2ポリヌクレオチドのコード領域および非コード領域を含むのが好ましい。
本発明の好ましい標的セグメントを、本発明のそれぞれの相補的なアンチセンス化合物と組み合わせて、安定化した二本鎖(二重鎖)オリゴヌクレオチドを形成してもよい。
このような二本鎖オリゴヌクレオチド部分は、当技術分野において、アンチセンスのメカニズムによって、標的発現を変調し、翻訳およびRNAのプロセシングを制御することが示されている。さらに、二本鎖部分に化学修飾を受けさせてもよい(Fireら(1998年) Nature、391巻、806〜811頁; TimmonsおよびFire (1998年) Nature、395巻、854頁; Timmonsら(2001年) Gene、263巻、103〜112頁; Tabaraら(1998年) Science、282巻、430〜431頁: Montgomeryら(1998年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、95巻、15502〜15507頁; Tuschlら(1999年) Genes Dev.、13巻、3191〜3197頁; Elbashirら(2001年) Nature、411巻、494〜498頁; Elbashirら(2001年) Genes Dev.、15巻、188〜200頁)。例えば、このような二本鎖部分は、二重鎖のアンチセンス鎖の標的に対する古典的なハイブリダイゼーションによって標的を阻害し、それによって標的の酵素的分解を誘発することが示されている(Ti jstermanら(2002年) Science、295巻、694〜697頁)。
好ましい一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)(例えば、受諾番号NM_003749および/またはNM_006521)バリアント、対立遺伝子、イソ型、ホモログ、突然変異体、誘導体、フラグメント、およびこれらに対して相補配列を標的とする。オリゴヌクレオチドがアンチセンス分子であるのが好ましい。
本発明の実施形態によると、標的核酸分子は、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)単独に限定されないが、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)分子のあらゆるイソ型、受容体、ホモログなどに拡張される。
別の好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドはTFE3および/またはIRS2ポリヌクレオチドの天然アンチセンス配列、例えば、配列番号5に記載するポリヌクレオチド、およびあらゆるバリアント、対立遺伝子、ホモログ、突然変異体、誘導体、フラグメント、およびこれらに対して相補配列を標的とする。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例を、配列番号4から9に記載する。
一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)アンチセンスの核酸配列(制限なく、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドに関連する非コードのセンスおよび/またはアンチセンス配列を含む)に相補的であり、あるいはそれに結合し、TFE3および/またはIRS2分子の発現および/または機能を変調する。
別の好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号3に記載するTFE3および/またはIRS2の天然アンチセンスの核酸配列に相補的であり、あるいはそれに結合し、TFE3および/またはIRS2分子の発現および/または機能を変調する。
好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号4から9の少なくとも5つの連続したヌクレオチドの配列を含み、TFE3および/またはIRS2分子の発現および/または機能を変調する。
ポリヌクレオチドの標的は、TFE3および/またはIRS2のファミリーメンバー、TFE3および/またはIRS2のバリアント、SNPを含めたTFE3および/またはIRS2の突然変異体、TFE3および/またはIRS2の非コード配列、TFE3および/またはIRS2の対立遺伝子、種バリアント、フラグメントなどを含めたTFE3および/またはIRS2を含む。オリゴヌクレオチドがアンチセンス分子であるのが好ましい。
別の好ましい一実施形態において、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)を標的とするオリゴヌクレオチドは、アンチセンスRNA、干渉RNA(RNAi)、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロ干渉RNA(miRNA)、スモールテンポラルRNA(stRNA)、または短ヘアピンRNA(shRNA)、低分子RNA誘導性遺伝子活性化(RNAa)、または低分子活性化RNA(saRNA)を含む。
別の好ましい一実施形態において、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチド、例えば、配列番号5のターゲッティングは、これらの標的の発現または機能を変調する。一実施形態において、発現または機能は、対照に比べて上方制御されている。別の好ましい一実施形態において、発現または機能は、対照に比べて下方制御されている。
別の好ましい一実施形態において、アンチセンス化合物は、配列番号4から9に記載する配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾されたヌクレオチド、より短い、または長いフラグメント、修飾された結合などを含むことができる。
別の好ましい一実施形態において、配列番号4から9は1つまたは複数のLNAヌクレオチドを含む。
Table 1(表1)は、本発明の方法において有用な例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドを示すものである。
所望の標的核酸の変調は、当技術分野において知られているいくつかの方法において行うことができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNAなど。酵素的核酸分子(例えば、リボザイム)は、ヌクレオチド塩基配列に特異的に他の別々の核酸分子を繰り返し切断する能力を含む、1つまたは複数の様々な反応を触媒することができる核酸分子である。このような酵素的核酸分子は、例えば、実質的にあらゆるRNA転写物を標的にするのに用いられ得る(Zaugら、324、Nature、429、1986年; Cech、260、JAMA、3030、1988年;およびJefferiesら、17、Nucleic Acids Research、1371、1989年)。
これらは配列特異的であるので、トランス切断性の酵素的核酸分子は、ヒトの疾患に対する治療薬としての見込みを示す(UsmanおよびMcSwiggen (1995年) Ann. Rep. Med. Chem.、30巻、285〜294頁;ChristoffersenおよびMarr (1995年) J. Med. Chem.、38巻、2023〜2037頁)。酵素的核酸分子は、細胞のRNAのバックグラウンド内で特定のRNAを切断するようにデザインされ得る。このような切断の事象はmRNAを非機能性にし、そのRNAからのタンパク質の発現を抑止する。この方法において、疾患状態に関連するタンパク質の合成が、選択的に阻害され得る。
一般的に、RNA切断活性を有する酵素的核酸は、最初に標的RNAに結合することによって作用する。このような結合は、標的RNAを切断するように作用する分子の酵素性の部分に非常に密接して保持されている酵素的核酸の標的結合性部分によって生じる。このように、酵素的核酸は、最初に標的RNAを認識し、次いで、相補的な塩基対形成によって標的RNAに結合し、正確な部位に結合した後、酵素的に作用して標的RNAを切断する。このような標的RNAの戦略的な切断により、コードされたタンパク質の合成を指示するその能力が破壊される。酵素的核酸がそのRNA標的に結合し、それを切断した後は、酵素的核酸はRNAから放出されて別の標的を探し、新しい標的に繰り返し結合し、切断することができる。
ホスホジエステル連結およびアミド連結の切断およびライゲーションなど、様々な反応を触媒することができる新しい核酸の触媒を進化させるのに、in vitro選択(進化)戦略(Orgel (1979年) Proc. R. Soc. London、B 205巻、435頁)などのいくつかの取組みが用いられている(Joyce (1989年) Gene、82巻、83〜87頁;Beaudryら(1992年) Science、257巻、635〜641頁;Joyce (1992年) Scientific American、267巻、90〜97頁;Breakerら(1994年) TlBTECH、12巻、268頁;Bartelら(1993年)Science、261巻、1411〜1418頁; Szostak (1993年) TIBS、17巻、89〜93頁;Kumarら(1995年) FASEB J.、9巻、1183頁; Breaker (1996年) Curr. Op. Biotech.、7巻、442頁)。
酵素活性に最適であるリボザイムの開発は、遺伝子発現を制御する目的で、RNA切断性リボザイムを用いるあらゆる戦略に意義深く貢献するものである。例えば、ハンマーヘッド型リボザイムは、飽和濃度(10mM)のMg2+補助因子の存在下、約(1分)-1の触媒速度(kcat)で機能する。人工の「RNAリガーゼ」リボザイムは、約(100分)-1の速度で、対応する自己修飾反応を触媒することが示されている。さらに、DNAでできている基質結合性アームを有するある種の修飾されたハンマーヘッド型リボザイムは、(100分)-1に近づく複数の回転速度でRNA切断を触媒することが知られている。最後に、ハンマーヘッドの触媒性のコア内の特定の残基をある種のヌクレオチド類似体で置換すると、触媒速度において10倍もの改善を示す修飾されたリボザイムがもたらされる。これらの所見は、リボザイムが、殆どの天然の自己切断性リボザイムによって、in vitroで示したものよりも著しく大きい触媒速度で、化学的トランスフォーメーションを促進することができることを実証している。次いで、ある種の自己切断性リボザイムの構造を、最大の触媒活性をもたらすように最適化してもよく、またはRNAホスホジエステル切断に対して著しく速い速度を示す全く新しいRNAモチーフを作成することができる可能性がある。
「ハンマーヘッド型」モデルに適合するRNA触媒によるRNA基質の分子内切断は、1987年に始めて示された(Uhlenbeck, O. C. (1987年) Nature、328巻、596〜600頁)。RNA触媒は回収され、複数のRNA分子と反応し、本当に触媒作用があることが実証された。
「ハンマーヘッド型」モチーフに基づいてデザインされた触媒性のRNAは、標的配列を有する必要な塩基対形成を維持するように触媒性のRNAにおいて好適な塩基変化を行うことによって、特定の標的配列を切断するのに用いられている(HaseloffおよびGerlach (1988年) Nature、334巻、585頁; WalbotおよびBruening (1988年) Nature、334巻、196頁; Uhlenbeck, O. C. (1987年) Nature、328巻、596〜600頁; Koizumi, M.ら(1988年) FEBS Lett.、228巻、228〜230頁)。これは特定の標的配列を切断する触媒性RNAの使用を可能にし、「ハンマーヘッド型」モデルにしたがってデザインされた触媒性RNAはin vivoで特異的な基質のRNAを切断する可能性があり得ることを指摘している(HaseloffおよびGerlach (1988年) Nature、334巻、585頁; Walbot and Bruening (1988年) Nature、334巻、196頁; Uhlcenbeck, O. C. (1987年) Nature、328巻、596〜600頁を参照されたい)。
RNA干渉(RNAi)は、哺乳動物および哺乳動物細胞における遺伝子の発現を変調するための強力なツールとなっている。この取組みは、発現プラスミドまたはウイルス、ならびにsiRNAにプロセシングされる短ヘアピンRNAに対するコード配列を用いて、RNA自体として、またはDNAとしてのいずれかで低分子干渉RNA(siRNA)の送達を必要とする。このシステムによりプレsi-RNAの細胞質への効率的な輸送が可能になり、細胞質ではプレ-siRNAは活性であり、遺伝子発現のための制御された組織特異的なプロモーターの使用が可能となる。
好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドまたはアンチセンス化合物は、リボ核酸(RNA)および/またはデオキシリボ核酸(DNA)のオリゴマーまたはポリマー、あるいはこれらのミメチック、キメラ、類似体、またはホモログを含む。この語は、天然に存在するヌクレオチド、糖、および共有結合性のヌクレオシド間(バックボーン)連結から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに同様に機能する非天然に存在する部分を有するオリゴヌクレオチドを含んでいる。このように修飾され、または置換されているオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞の取込みの増強、標的核酸に対する親和性の増強、およびヌクレアーゼ存在における安定性の増大など、望ましい性質のために、天然型よりもしばしば望まれる。
本発明によると、オリゴヌクレオチドまたは「アンチセンス化合物」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、RNA、DNA、ミメチック、キメラ、類似体、またはこれらのホモログ)、リボザイム、外部誘導配列(EGS)オリゴヌクレオチド、siRNA化合物、siRNA化合物などの一本鎖または二本鎖RNA干渉(RNAi)化合物、saRNA、aRNA、および標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズし、その機能を変調する他のオリゴマー化合物を含む。このようなものとして、これらは、DNA、RNA、DNA様、RNA様、もしくはこれらの混合物であってよく、または1つもしくは複数のこれらのミメチックであってよい。これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、またはヘアピン状のオリゴマー化合物であってよく、内部もしくは末端のバルジ、ミスマッチ、またはループなどの構造エレメントを含むことができる。アンチセンス化合物は、日常的に直鎖状に調製されるが、結合することができ、あるいは環状および/または分枝状に調製することができる。アンチセンス化合物は、例えば、全体的に、もしくは部分的に二本鎖の化合物を形成するようにハイブリダイズされる2本の鎖、または十分に、もしくは部分的に二本鎖の化合物のハイブリダイゼーションおよび形成を可能にする十分な自己相補性を有する一本鎖などの構築物を含むことができる。この2本の鎖は、フリーの3'末端または5'末端を残して内部的に連結されてよく、または連続するヘアピン構造もしくはループを形成するように連結されてよい。ヘアピン構造は、5'末端または3'いずれかの末端上にオーバーハングを含み、一本鎖の特徴の延長を生成することがある。二本鎖の化合物は、場合により、末端上にオーバーハングを含むことができる。さらなる修飾は、末端の、選択されたヌクレオチド位置、糖位置の1つに、またはヌクレオシド間連結の1つに付着しているコンジュゲート基を含むことができる。あるいは、2本の鎖は、非核酸部分またはリンカー基によって連結されていてよい。1本の鎖のみから形成される場合、dsRNAは、自身の上に二重になって二本鎖を形成する自己相補性のヘアピン型分子の形態をとることができる。このように、dsRNAは、完全に、または部分的に二本鎖であってよい。遺伝子発現の特異的な変調は、トランスジェニック細胞系統において
dsRNAヘアピンの安定な発現によって実現され得る(Hammondら(1991年) Nat. Rev. Genet.、2巻、110〜119頁; Matzkeら(2001年) Curr. Opin. Genet. Dev.、11巻、221〜227頁; Sharp (2001年) Genes Dev.、15巻、485〜490頁)。2本の鎖、または自身の上に二重になって二本鎖を形成する自己相補性のヘアピン型分子の形態をとる一本鎖から形成される場合、2本の鎖(または一本鎖の二重鎖形成領域)は、塩基がワトソン-クリック様式において対形成する相補的なRNA鎖である。
本発明の化合物はシステムに導入された後、標的核酸の切断もしくは他の修飾をもたらすための1つもしくは複数の酵素もしくは構造タンパク質の作用を誘発することがあり、または占有率ベースのメカニズムによって働くことができる。一般的に、核酸(オリゴヌクレオチドを含む)は、「DNA様」(すなわち、一般的に1つもしくは複数の2'-デオキシ糖を有し、一般的にU塩基よりもT塩基を有する)、または「RNA様」(すなわち、一般的に1つもしくは複数の2'-ヒドロキシもしくは2'-修飾された糖を有し、一般的にT塩基よりもU塩基を有する)と記載され得る。核酸のヘリックスは、最も一般的にはA型およびB型の、1つを超えるタイプの構造をとることができる。一般的に、B型様の構造を有するオリゴヌクレオチドは「DNA様」であり、A型様構造を有するオリゴヌクレオチドは「RNA様」であると考えられている。いくつかの(キメラの)実施形態において、アンチセンス化合物は、A型およびB型両方の領域を含むことができる。
本発明によるアンチセンス化合物は、長さ約5から約80ヌクレオチドまでのアンチセンス部分(すなわち、約5から約80までの連結したヌクレオシド)を含むことができる。これは、アンチセンス化合物のアンチセンス鎖または部分の長さを意味する。換言すると、本発明の一本鎖のアンチセンス化合物は、約5から約80ヌクレオチドを含み、本発明の二本鎖のアンチセンス化合物(例えば、dsRNAなど)は、長さ5から約80ヌクレオチドのセンスおよびアンチセンス鎖または部分を含む。当業者であれば、これは、長さ5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、もしくは80ヌクレオチド、またはその中のあらゆる範囲のアンチセンス部分を含むことが理解されよう。
一実施形態において、本発明のアンチセンス化合物は、長さ10から50ヌクレオチドのアンチセンス部分を有する。当業者であれば、これは長さ10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50ヌクレオチド、またはその中のあらゆる範囲のアンチセンス部分を有するオリゴヌクレオチドを包含することが理解されよう。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは長さ15ヌクレオチドである。
一実施形態において、本発明のアンチセンスまたはオリゴヌクレオチド化合物は、長さ12または13から30ヌクレオチドのアンチセンス部分を有する。当業者であれば、これは長さ12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30ヌクレオチド、またはその中のあらゆる範囲のアンチセンス部分を有するアンチセンス化合物を包含することが理解されよう。
別の好ましい一実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は、化合物における1つまたは複数のヌクレオチド部分に異なる塩基が存在するバリアントも含む。例えば、第1のヌクレオチドがアデノシンである場合、この位置にチミジン、グアノシン、またはシチジンを含むバリアントを生成することができる。これは、アンチセンスまたはdsRNA化合物のいかなる位置で行われてよい。これらの化合物を、次いで、本明細書に記載する方法を用いて試験して、標的核酸の発現を阻害するその能力を決定する。
いくつかの実施形態において、アンチセンス化合物と標的との間の相同性、配列同一性、または相補性は、約40%から約60%までである。いくつかの実施形態において、相同性、配列同一性、または相補性は、約60%から約70%までである。いくつかの実施形態において、相同性、配列同一性、または相補性は、約70%から約80%までである。いくつかの実施形態において、相同性、配列同一性、または相補性は、約80%から約90%までである。いくつかの実施形態において、相同性、配列同一性、または相補性は、約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または約100%である。
別の好ましい一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号4から9において記載する核酸分子などは、1つまたは複数の置換または修飾を含む。一実施形態において、ヌクレオチドは固定核酸(LNA)で置換されている。
別の好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、TFE3ならびに/またはIRS2ならびに配列番号1、2、および3に記載する配列に関連するコードならびに/または非コード配列の核酸分子のセンスおよび/またはアンチセンスの1つまたは複数の領域を標的にする。オリゴヌクレオチドは、配列番号1、2、および3の重複する領域も標的にする。
本発明のある種の好ましいオリゴヌクレオチドはキメラのオリゴヌクレオチドである。本発明の文脈における「キメラのオリゴヌクレオチド」または「キメラ」は、各々が少なくとも1つのヌクレオチドから構成される2つまたはそれを超える化学的に別個の領域を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的に、1つまたは複数の有益な性質(例えば、ヌクレアーゼ抵抗性の増大、細胞中への取込みの増大、標的に対する結合親和性の増大)を付与する修飾されたヌクレオチドの領域、およびRNA:DNAまたはRNA:DNAハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質である領域の少なくとも1つを含む。一例として、リボヌクレアーゼHは、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞のエンドヌクレアーゼである。したがって、リボヌクレアーゼHを活性化すると、RNA標的の切断がもたらされ、それによって遺伝子発現のアンチセンス変調の効率が大幅に増強される。その結果、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドに比べて、キメラのオリゴヌクレオチドを用いた場合、しばしばより短いオリゴヌクレオチドで匹敵する結果を得ることができる。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要であれば当技術分野において知られている関連の核酸ハイブリダイゼーション技術によって日常的に検出することができる。好ましい一実施形態において、キメラのオリゴヌクレオチドは、標的の結合親和性を増大するように修飾された少なくとも1つの領域、および、通常リボヌクレアーゼHに対する基質として働く領域を含む。その標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性(この場合、rasをコードする核酸)は、オリゴヌクレオチド/標的対のTmを測定することによって日常的に決定され、Tmはオリゴヌクレオチドと標的とが解離する温度であり、解離は分光光度法で検出される。Tmが高いほど、標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性は大きい。
本発明のキメラのアンチセンス化合物は、上記に記載したオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および/またはオリゴヌクレオチドミメチックの2つまたはそれを超える複合構造として形成され得る。このような化合物は、当技術分野においてハイブリッドまたはギャップマーとも呼ばれている。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許は、それだけには限定されないが、その各々が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第5,013,830号、第5,149,797号、第5,220,007号、第5,256,775号、第5,366,878号、第5,403,711号、第5,491,133号、第5,565,350号、第5,623,065号、第5,652,355号、第5,652,356号、および第5,700,922号を含む。
別の好ましい一実施形態において、修飾されるオリゴヌクレオチドの領域は、糖の2'位を修飾した少なくとも1つのヌクレオチド、最も好ましくは、2'-O-アルキル、2'-O-アルキル-O-アルキル、または2'-フルオロ修飾されたヌクレオチドを含む。他の好ましい実施形態において、RNA修飾は、RNAの3'末端の脱塩基残基または逆位塩基である、ピリミジンのリボース上の2'-フルオロ、2'-アミノ、および2'O-メチル修飾を含む。このような修飾はオリゴヌクレオチド中に日常的に組み入れられ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して2'-デオキシオリゴヌクレオチドよりもTmが高い(すなわち、標的結合親和性が高い)ことが示されている。このように親和性が高い効果は、遺伝子発現のRNAiオリゴヌクレオチド阻害を大幅に増大することである。リボヌクレアーゼHは、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞のエンドヌクレアーゼであり、したがって、この酵素を活性化するとRNA標的の切断がもたらされ、したがってRNAi阻害の効率を大幅に増強し得る。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動によって日常的に実証することができる。別の好ましい一実施形態において、キメラのオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ抵抗性を増強するようにやはり修飾される。細胞は、核酸を分解することができる様々なエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含んでいる。数々のヌクレオチドおよびヌクレオシドを修飾することで、その中に組み入れられるオリゴヌクレオチドが、天然オリゴデオキシヌクレオチドよりもヌクレアーゼの消化に対して抵抗性になることが示されている。ヌクレアーゼの抵抗性は、オリゴヌクレオチドを、細胞の抽出物または単離されたヌクレアーゼ溶液とインキュベートし、経時的に残存するインタクトなオリゴヌクレオチドの度合いを通常はゲル電気泳動によって測定することによって日常的に測定される。ヌクレアーゼ抵抗性を増強するように修飾されているオリゴヌクレオチドは、非修飾のオリゴヌクレオチドよりも長い時間、インタクトで生存する。様々なオリゴヌクレオチドの修飾がヌクレアーゼ抵抗性を増強または付与することが実証されている。少なくとも1つのホスホロチオエート修飾を含むオリゴヌクレオチドが、現在、より好まれている。いくつかの場合において、標的の結合親和性を増
強するオリゴヌクレオチドの修飾はまた、独立に、ヌクレアーゼ抵抗性を増強することができる。いくつかの望ましい修飾は、De Mesmaekerら(1995年) Acc. Chem. Res.、28巻、366〜374頁において見出すことができる。
本発明に想定されるいくつかの好ましいオリゴヌクレオチドの具体的な例は、修飾されたバックボーン、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環糖間連結を含むものを含む。最も好ましいのは、ホスホロチオエートバックボーンを有するオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子のバックボーンを有するオリゴヌクレオチド、とりわけCH2-NH-O-CH2、CH-N(CH3)-O-CH2[メチレン(メチルイミノ)またはMMIバックボーンとして知られている]、CH2-O-N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2およびO-N(CH3)-CH2-CH2バックボーンが最も好ましく、天然ホスホジエステルバックボーンはO-P-O-CHと表される。De Mesmaekerら(1995年) Acc. Chem. Res.、28巻、366〜374頁によって開示されているアミドのバックボーンがやはり好ましい。モルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチド(SummertonおよびWeller、米国特許第5,034,506号)も好ましい。他の好ましい実施形態において、ペプチド核酸(PNA)バックボーンなどのオリゴヌクレオチドのホスホジエステルバックボーンはポリアミドのバックボーンによって置換され、ヌクレオチドはポリアミドバックボーンのアザ窒素原子に対して直接または間接的に結合している(Nielsenら(1991年) Science、254巻、1497頁)。オリゴヌクレオチドはまた、1つまたは複数の置換されている糖部分を含むことができる。好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に以下の1つを含んでおり: OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3OCH3、OCH3 O(CH2)n CH3、O(CH2)n NH2、またはO(CH2)n CH3、式中、nは1から約10であり、C1からC10低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換されている低級アルキル、アルカリル(alkaryl)、またはアラルキル、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、O-、S-、またはN-アルキル: O-、S-、またはN-アルケニル、SOCH3、SO2 CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル(heterocycloalkaryl)、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されているシリル、RNA切断性基(cleaving group)、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、および同様の性質を有する他の置換基である。好ましい修飾は2'-メトキシエトキシ[2'-O-(2-メトキシエチル)としても知られる、2'-O-CH2 CH2 OCH3]を含む(Martinら(1995年) Helv. Chim. Acta、78巻、486頁)。他の好ましい修飾は、2'-メトキシ(2'-O-CH3)、2'-プロポキシ(2'-OCH2 CH2CH3)、および2'-フルオロ(2'-F)を含む。同様の修飾をまた、オリゴヌクレオチド上の他の位置、とりわけ3'末端ヌクレオチド上の糖の3'位、および5'末端ヌクレオチドの5'位に行ってもよい。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖ミメチックを有することもできる。
オリゴヌクレオチドは、さらにまたはあるいは、核酸塩基(当技術分野において単に「塩基」としばしば呼ばれる)の修飾または置換を含んでいてもよい。本明細書で用いられる、「非修飾」または「天然」のヌクレオチドは、アデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)、シトシン(C)、およびウラシル(U)を含む。修飾されているヌクレオチドは、天然核酸中に、希にまたは一過性にのみ見出されるヌクレオチド、例えば、ヒポキサンチン、6-メチルアデニン、5-Meピリミジン、とりわけ5-メチルシトシン(5-メチル-2'デオキシシトシンとも呼ばれ、当技術分野において5-Me-Cとしばしば呼ばれる)、5-ヒドロキシメチルシトシン(HMC)、グリコシルHMC、およびゲントビオシル(gentobiosyl)HMC、ならびに合成のヌクレオチド、例えば、2-アミノアデニン、2-(メチルアミノ)アデニン、2-(イミダゾリルアルキル)アデニン、2-(アミノアルキルアミノ)アデニン、または他のヘテロ置換されているアルキルアデニン、2-チオウラシル、2-チオチミン、5-ブロモウラシル、5-ヒドロキシメチルウラシル、8-アザグアニン、7-デアザグアニン、N6(6-アミノヘキシル)アデニン、および2,6-ジアミノプリンを含む(Kornberg, A.、DNA Replication、W. H. Freeman & Co.、San Francisco、1980年、75〜77頁; Gebeyehu, G.ら(1987年) Nucl. Acids Res.、15巻、4513頁)。イノシンなどの当技術分野において知られている「普遍的な」塩基も含まれ得る。5-Me-C置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6〜1.2℃増大することが示されており(Crooke, S. T.およびLebleu, B.著、Antiscnse Research and Applications、CRC Press、Boca Raton、1993年、276〜278頁におけるSanghvi, Y. S.)、現在好ましい塩基置換である。
本発明のオリゴヌクレオチドの別の一修飾は、オリゴヌクレオチドの活性または細胞の取込みを増強する、オリゴヌクレオチドの1つまたは複数の部分またはコンジュゲートに対する化学的連結を含むものである。このような部分は、それだけには限定されないが、コレステロール部分などの脂質部分、コレステロール部分(Letsingerら(1989年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86巻、6553頁)、コール酸(Manoharanら(1994年) Bioorg. Med. Chem, Let.、4巻、1053頁)、チオエーテル、例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール(Manoharanら(1992年) Ann. N. Y. Acad. Sci、660巻、306頁; Manoharanら(1993年) Bioorg. Med. Chem. Let.、3巻、2765頁)、チオコレステロール(Oberhauserら(1992年) Nucl. Acids. Res.、20巻、533頁)、脂質鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoarasら、EMBO J.、1991年、10巻、111頁; Kabanovら(1990年) FEBS Lett.、259巻、327頁; Svinarchukら(1993年) Biochimie、75巻、49頁)、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート(Manoharanら(1995年) Tetrahedron Lett.、36巻、3651頁; Sheaら(1990年) Nucl. Acids Res.、18巻、3777頁)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharanら(1995年) Nucleosides & Nucleotides、14巻、969頁)、またはアダマンタン酢酸(Manoharanら(1995年) Tetrahedron Lett.、36巻、3651頁)を含む。親油性部分を含むオリゴヌクレオチド、およびそのようなオリゴヌクレオチドを調製するための方法は、例えば、米国特許第5,138,045号、第5,218,105号、および第5,459,255号など、当技術分野では知られている。
所与のオリゴヌクレオチドにおける全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際、1つを超える上述の修飾が単一のオリゴヌクレオチド中に、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシド内にも組み入れられてよい。本発明は、本明細書上記で定義したキメラのオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドも含む。
別の一実施形態において、本発明の核酸分子は、それだけには限定されないが、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、またはポリ炭化水素化合物を含む別の部分とコンジュゲートしている。当業者であれば、これらの分子は、糖、塩基、またはリン酸基上のいくつかの位置に核酸分子を含む1つまたは複数のあらゆるヌクレオチドに連結することができることを認識されよう。
本発明にしたがって用いられるオリゴヌクレオチドは、固相合成のよく知られている技術によって好都合に、かつ日常的に作成され得る。このような合成の装置は、Applied Biosystemsを含めたいくつかの業者によって販売されている。このような合成のためのあらゆる他の手段も用いることができ、オリゴヌクレオチドの実際の合成は当業者の力量の範囲内に十分ある。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製するのに同様の技術を使用することもよく知られている。同様の技術および市販の修飾したアミダイト、および多孔性ガラス(CPG)製品、例えば、ビオチン、フルオレセイン、アクリジン、もしくはソラレン修飾したアミダイトおよび/またはCPG(Glen Research、Sterling、VAから入手)を用いて、蛍光標識した、ビオチン化した、または他の修飾したオリゴヌクレオチド、例えばコレステロール修飾オリゴヌクレオチドを合成することもよく知られている。
本発明にしたがって、作用の強度、特異性、および持続時間を増強し、オリゴヌクレオチドの投与経路を広げるための、LNAモノマーの使用などの修飾の使用は、MOE、ANA、FANA、PSなどの現在の化学作用を含む(Uhlmanら(2000年) Current Opinions in Drug Discovery & Development、3巻2号)。これは、現在のオリゴヌクレオチドにおけるいくつかのモノマーの、LNAモノマーによる置換によって実現され得る。LNA修飾したオリゴヌクレオチドは、親化合物と同様のサイズを有していてよく、またはそれより大きくてもよく、もしくは好ましくは小さくてもよい。このようなLNA修飾したオリゴヌクレオチドが、約70%未満の、より好ましくは約60%未満の、最も好ましくは約50%未満のLNAモノマーを含み、これらのサイズが約5ヌクレオチドと25ヌクレオチドとの間、より好ましくは約12ヌクレオチドと20ヌクレオチドとの間であることが好ましい。
好ましい修飾されているオリゴヌクレオチドのバックボーンは、それだけには限定されないが、ホスホロチオエート、キラルのホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルリン酸(3'アルキレンホスホネート(3'alkylene phosphonates)およびキラルのホスホネートを含む)、ホスフィン酸塩(phosphinate)、ホスホラミデート(3'-アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含む)、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の3'-5'連結を有するボラノホスフェート、これらの2'-5'連結した類似体、ヌクレオシド単位の隣接する対が3'-5'から5'-3'または2'-5'から5'-2'に連結している逆の極性を有するものを含む。様々な塩、混合の塩、および遊離の酸の形態も含まれる。
上記のリン酸含有連結の調製を教示する代表的な米国特許は、それだけには限定されないが、その各々が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第3,687,808号、第4,469,863号、第4,476,301号、第5,023,243号、第5,177,196号、第5,188,897号、第5,264,423号、第5,276,019号、第5,278,302号、第5,286,717号、第5,321,131号、第5,399,676号、第5,405,939号、第5,453,496号、第5,455,233号、第5,466,677号、第5,476,925号、第5,519,126号、第5,536,821号、第5,541,306号、第5,550,111号、第5,563,253号、第5,571,799号、第5,587,361号、および第5,625,050を含む。
その中にリン原子を含まない、好ましい修飾されたオリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキルまたは環状アルキルヌクレオシド間連結、混合のヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または1つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド連結によって形成されるバックボーンを有する。これらは、モルホリノ連結(部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される)、シロキサンのバックボーン、硫化物、スルホキシド、およびスルホンのバックボーン、ホルムアセチル(formacetyl)およびチオホルムアセチルのバックボーン、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルのバックボーン、アルケン含有バックボーン、スルファメートのバックボーン、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノのバックボーン、スルホネートおよびスルホンアミドのバックボーン、アミドのバックボーン、および混合のN、O、S、およびCH2成分の部分を有するその他を有するものを含む。
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許は、それだけには限定されないが、その各々が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,214,134号、第5,216,141号、第5,235,033号、第5,264,562号、第5,264,564号、第5,405,938号、第5,434,257号、第5,466,677号、第5,470,967号、第5,489,677号、第5,541,307号、第5,561,225号、第5,596,086号、第5,602,240号、第5,610,289号、第5,602,240号、第5,608,046号、第5,610,289号、第5,618,704号、第5,623,070号、第5,663,312号、第5,633,360号、第5,677,437号、および第5,677,439号を含む。
他の好ましいオリゴヌクレオチドミメチックにおいて、ヌクレオチド単位の、糖およびヌクレオシド間連結の両方、すなわちバックボーンは新規の基で置換されている。塩基単位は、好適な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持されている。このようなオリゴマー化合物の1つである、優れたハイブリダイゼーション性質を有することが示されているオリゴヌクレオチドミメチックは、ペプチド核酸(PNA)と呼ばれる。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖のバックボーンは、アミド含有バックボーン、とりわけアミノエチルグリシンバックボーンで置換されている。核酸塩基は保持されており、バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合している。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、それだけには限定されないが、その各々が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第5,539,082号、第5,714,331号、および第5,719,262号を含む。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsenら(1991年) Science、254巻、1497〜1500頁に見出すことができる。
本発明の別の好ましい一実施形態において、ホスホロチオエートバックボーンを有するオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子のバックボーンを有するオリゴヌクレオチド、とりわけ-CH2-NH-O-CH2-、メチレン(メチルイミノ)またはMMIバックボーンとして知られる-CH2-N(CH3)-O-CH2-、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2N(CH3)-N(CH3)CH2-、および-O-N(CH3)-CH2-CH2-(式中、天然ホスホジエステルバックボーンは、上記の参照の米国特許第5,489,677号の-O-P-O-CH2-、および上記の参照の米国特許第5,602,240号のアミドのバックボーンとして表される。上記の参照の米国特許第5,034,506号のモルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい。
修飾されているオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の置換されている糖部分も含むことができる。好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に以下: OH;F; O-、S-、もしくはN-アルキル; O-、S-、もしくはN-アルケニル; O-、S-、もしくはN-アルキニル;またはOアルキル-O-アルキルの1つを含み、式中、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のCからCOアルキルまたはC2からCOアルケニルおよびアルキニルであってよい。O (CH2)n OmCH3、O(CH2)n,OCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2nON(CH2)nCH3)2がとりわけ好ましく、式中、nおよびmは1から約10であってよい。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に以下: CからCO、(低級アルキル、置換した低級アルキル、アルカリル(alkaryl)、アラルキル、O-アルカリルまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されているシリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、および同様の性質を有する他の置換基の1つを含む。好ましい修飾は、2'-メトキシエトキシ(2'-O-(2-メトキシエチル)または2'-MOEとしても知られている2'-O-CH2CH2OCH3)、すなわちアルコキシアルコキシ基を含む(Martinら(1995年) Helv. Chim. Acta、78巻、486〜504頁)。さらに好ましい修飾は、T-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書以下の実施例に記載する2'-DMAOEとしても知られているO(CH2)2ON(CH3)2基、および2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ(当技術分野において2'-O-ジメチルアミノエトキシエチルまたは2'-DMAEOEとして知られている)、すなわち2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2を含む。
他の好ましい修飾は、2'-メトキシ(2'-OCH3)、2'-アミノプロポキシ(2'-OCH2CH2CH2NH2)、および2'-フルオロ(2'-F)を含む。同様の修飾をまた、オリゴヌクレオチド上の他の位置、とりわけ、3'末端ヌクレオチド上または2'-5'連結したオリゴヌクレオチドにおける糖の3'位、および5'末端ヌクレオチドの5'位に行うことができる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の場所におけるシクロブチル部分などの糖ミメチックを有することもできる。このような修飾されている糖の構造の調製を教示する代表的な米国特許は、それだけには限定されないが、その各々が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第4,981,957号、第5,118,800号、第5,319,080号、第5,359,044号、第5,393,878号、第5,446,137号、第5,466,786号、第5,514,785号、第5,519,134号、第5,567,811号、第5,576,427号、第5,591,722号、第5,597,909号、第5,610,300号、第5,627,053号、第5,639,873号、第5,646,265号、第5,658,873号、第5,670,633号、および第5,700,920号を含む。
オリゴヌクレオチドは、核酸塩基(当技術分野において単に「塩基」としばしば呼ばれる)の修飾または置換を含むこともある。本明細書で用いられる「非修飾」または「天然」のヌクレオチドは、プリン塩基のアデニン(A)およびグアニン(G)、ならびにピリミジン塩基のチミン(T)、シトシン(C)、およびウラシル(U)を含む。修飾されているヌクレオチドは、他の合成および天然のヌクレオチド、例えば、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシン、およびチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル、および他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、とりわけ5-ブロモ、5-トリフルオロメチル、および他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニン、ならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンを含む。
さらに、ヌクレオチドは、米国特許第3,687,808号に開示されているもの、「The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering」、858〜859頁、Kroschwitz, J. I.著、John Wiley & Sons、1990年に開示されているもの、Englischら、「Angewandte Chemie, International Edition」、1991年、30巻、613頁によって開示されているもの、およびSanghvi, Y. S.、第15章、「Antisense Research and Applications」、289〜302頁、Crooke, S.T.およびLebleu, B. ca., CRC Press、1993年によって開示されているものを含む。これらヌクレオチドのあるものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大するのにとりわけ有用である。これらは、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、ならびにN-2、N-6、およびO-6置換されているプリン(2-アミノプロピルアデニンを含む、5-プロピニルウラシル、ならびに5-プロピニルシトシン)を含む。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6〜1.2℃増大することが示されており(Sanghvi, Y.S.、Crooke, S.T.、およびLebleu, B.著、「Antiscnsc Research and Applications」、CRC Press、Boca Raton、1993年、276〜278頁)、現在好まれている塩基置換であり、2'-Oメトキシエチル糖修飾と組合せた場合にさらにとりわけ好まれている塩基置換である。
上記に記載した修飾されたヌクレオチドおよび他の修飾されたヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許は、それだけには限定されないが、その各々が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第3,687,808号、および第4,845,205号、第5,130,302号、第5,134,066号、第5,175,273号、第,5,367,066号、第5,432,272号、第5,457,187号、第5,459,255号、第5,484,908号、第5,502,177号、第5,525,711号、第5,552,540号、第5,587,469号、第5,596,091号、第5,614,617号、第5,750,692号、および第5,681,941を含む。
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの、活性、細胞の分布、または細胞の取込みを増強する、オリゴヌクレオチドの1つまたは複数の部分またはコンジュゲートに対する化学的連結を伴う。
このような部分は、それだけには限定されないが、コレステロール部分などの脂質部分(Letsingerら(1989年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86巻、6553〜6556頁)、コール酸(Manoharanら(1994年) Bioorg. Med. Chem. Let.、4巻、1053〜1060頁)、チオエーテル、例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール(Manoharanら(1992年) Ann. N. Y. Acad. Sci、660巻、306〜309頁; Manoharanら(1993年) Bioorg. Med. Chem. Let.、3巻、2765〜2770頁)、チオコレステロール(Oberhauserら(1992年) Nucl. Acids Res.、20巻、533〜538頁)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Kabanovら(1990年) FEBS Lett.、259巻、327〜330頁; Svinarchukら(1993年) Biochimie、75巻、49〜54頁)、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート(Manoharanら(1995年) Tetrahedron Lett.、36巻、3651〜3654頁; Sheaら(1990年) Nucl. Acids Res.、18巻、3777〜3783頁)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Mancharanら(1995年) Nucleosides & Nucleotides、14巻、969〜973頁)、またはアダマンタン酢酸(Manoharanら(1995年) Tetrahedron Lett.、36巻、3651〜3654頁)、パルミチル部分(Mishraら(1995年) Biochim. Biophys. Acta、1264巻、229〜237頁)、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-tオキシコレステロール部分(Crookeら(1996年) J. Pharmacol. Exp. Ther.、277巻、923〜937頁)を含む。
このようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、それだけには限定されないが、その各々が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第4,828,979号、第4,948,882号、第5,218,105号、第5,525,465号、第5,541,313号、第5,545,730号、第5,552,538号、第5,578,717号、第5,580,731号、第5,580,731号、第5,591,584号、第5,109,124号、第5,118,802号、第5,138,045号、第5,414,077号、第5,486,603号、第5,512,439号、第5,578,718号、第5,608,046号、第4,587,044号、第4,605,735号、第4,667,025号、第4,762,779号、第4,789,737号、第4,824,941号、第4,835,263号、第4,876,335号、第4,904,582号、第4,958,013号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,245,022号、第5,254,469号、第5,258,506号、第5,262,536号、第5,272,250号、第5,292,873号、第5,317,098号、第5,371,241号、第5,391,723号、第5,416,203号、第5,451,463号、第5,510,475号、第5,512,667号、第5,514,785号、第5,565,552号、第5,567,810号、第5,574,142号、第5,585,481号、第5,587,371号、第5,595,726号、第5,597,696号、第5,599,923号、第5,599,928号、および第5,688,941号を含む。
薬物の発見:本発明の化合物は、薬物の発見および標的の確認の領域にも応用することができる。本発明は、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)と疾患状態、表現型、または状態との間に存在する関係を解明する薬物の発見の努力において、本明細書で同定される化合物および好ましい標的セグメントの使用を包含する。これらの方法は、試料、組織、細胞、または生物体を本発明の化合物と接触させること、TFE3および/またはIRS2ポリヌクレオチドおよび/または関連の表現型、あるいは処置後ある時間の化学的エンドポイントの核酸またはタンパク質レベルを測定すること、場合により測定値を非処置の試料または本発明のさらなる化合物で処置した試料と比較することを含む、TFE3および/またはIRS2ポリヌクレオチドの検出または変調を含む。これらの方法は、標的の確認のプロセスに対する未知の遺伝子の機能を決定するために、または特定の疾患、状態、または表現型の処置または防止のための標的として特定の遺伝子生成物の有効性を決定するために、他の実験と平行して、または組み合わせて行うこともできる。
遺伝子発現の上方制御または阻害の評価
外来の核酸の宿主細胞または生物体中へ移動は、細胞または生物体中の核酸の存在を直接検出することによって評価することができる。このような検出は、当技術分野においてよく知られているいくつかの方法によって実現することができる。例えば、外来の核酸の存在は、サザンブロットによって、または核酸に関連するヌクレオチド配列を特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法によって検出され得る。外来の核酸の発現は、また、遺伝子発現分析を含む、従来の方法を用いて測定され得る。例えば、外来の核酸から生成されたmRNAは、ノーザンブロットおよび逆転写PCR(RT-PCR)を用いて検出および定量され得る。
外来の核酸からのRNAの発現は、また、酵素活性またはレポータータンパク質の活性を測定することによってやはり検出され得る。例えば、アンチセンスの変調作用は、外来の核酸がエフェクターRNAを生成する指標として、標的核酸発現における低減または増大として間接的に測定され得る。配列の保存に基づいて、プライマーを、標的遺伝子のコード領域を増幅するようにデザインし、用いることができる。最初に、各遺伝子から最も高度に発現されたコード領域を用いてモデルとなる制御遺伝子を構築することができるが、あらゆるコードまたは非コード領域が用いられてよい。各制御遺伝子は、各コード領域を、レポーターコード領域とそのポリ(A)シグナルとの間に挿入することによって組み立てられる。これらのプラスミドは、遺伝子の上流部分にレポーター遺伝子を、および3'非コード領域に潜在的なRNAi標的を有するmRNAを生成する。個々のアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性は、レポーター遺伝子の変調によってアッセイされる。本発明の方法において有用なレポーター遺伝子は、アセトヒドロキシ酸合成酵素(AHAS)、アルカリホスファターゼ(AP)、ベータグルコシダーゼ(LacZ)、ベータグルクロニダーゼ(GUS)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、ルシフェラーゼ(Luc)、ノパリン合成酵素(NOS)、オクトピン合成酵素(OCS)、およびこれらの誘導体を含んでいる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、ホスフィノスリシン、ピューロマイシン、およびテトラサイクリンに対する抵抗性を付与する複数の選択マーカーが利用可能である。レポーター遺伝子の変調を決定するための方法は当技術分野においてよく知られており、それだけには限定されないが、蛍光定量法(例えば、蛍光分光法、蛍光標示式細胞分取器(FACS)、蛍光顕微鏡)、抗生物質耐性の決定が含まれる。
TFE3および/またはIRS2タンパク質およびmRNAの発現を、当業者には知られており、本明細書他所に記載する方法を用いてアッセイすることができる。例えば、ELISAなどの免疫アッセイを用いてタンパク質レベルを測定することができる。ELISA用のTFE3および/またはIRS2抗体は、例えば、Abnova(Walnut、CA)、Abcam(Cambridge、MA)から市販されている。
実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処置した試料(例えば、in vivoまたはin vitroの細胞または組織)中のTFE3および/またはIRS2の発現(例えば、mRNAもしくはタンパク質)は、対照試料中のTFE3および/またはIRS2の発現と比較することによって評価される。例えば、タンパク質または核酸の発現は、当業者には知られている方法を用いて、偽処置または非処置の試料における発現と比較することができる。あるいは、対照のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した試料(例えば、変更された配列または異なる配列を有するもの)との比較を、所望の情報に応じて行うことができる。別の一実施形態において、処置対非処置の試料における、TFE3および/またはIRS2タンパク質または核酸の発現における違いを、処置試料対非処置試料における様々な核酸(研究者が好適であるとみなすあらゆる標準を含む、例えば、ハウスキーピング遺伝子)の発現における違いと比較することができる。
観察される違いは、所望により、対照との比較において用いるための、例えば、比率または分数の形態において表現され得る。実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した試料中のTFE3および/またはIRS2のmRNAまたはタンパク質のレベルは、非処置の試料または対照の核酸で処置した試料に比べて、約1.25倍から約10倍またはそれを超えて増大または低減する。実施形態において、TFE3および/またはIRS2 mRNAまたはタンパク質のレベルは、少なくとも約1.25倍、少なくとも約1.3倍、少なくとも約1.4倍、少なくとも約1.5倍、少なくとも約1.6倍、少なくとも約1.7倍、少なくとも約1.8倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約3.5倍、少なくとも約4倍、少なくとも約4.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約5.5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約6.5倍、少なくとも約7倍、少なくとも約7.5倍、少なくとも約8倍、少なくとも約8.5倍、少なくとも約9倍、少なくとも約9.5倍、もしくは少なくとも約10倍、またはそれを超えて増大または低減する。
キット、研究用試薬、診断、および治療
本発明の化合物は、診断、治療、および予防、ならびに研究用試薬およびキットの成分に利用することができる。さらに、絶妙な特異性で遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子の機能を解明するために、または生物学的経路の様々なメンバーの機能間を区別するために当業者によってしばしば用いられる。
キットおよび診断において、および様々な生物学的系において用いるために、本発明の化合物は、単独で、または他の化合物もしくは治療と組み合わせてのいずれかで、細胞および組織内で発現された遺伝子の部分または全体の相補体の発現パターンを解明するための示差分析および/または組合せ解析におけるツールとして有用である。
本明細書において用いられる、「生物学的系」または「系」の語は、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)遺伝子の発現生成物を発現し、またはそれらに対して競合するようになされているあらゆる生物体、細胞、細胞培養物、または組織と定義される。これらは、それだけには限定されないが、ヒト、トランスジェニック動物、細胞、細胞培養物、組織、異種移植片、移植片、およびこれらの組合せを含む。
非限定的な一例として、1つまたは複数のアンチセンス化合物で処置した細胞または組織内の発現パターンを、アンチセンス化合物で処置しない対照の細胞または組織と比較し、生成されたパターンを、これらが、例えば、疾患の関連、シグナル経路、細胞の局在、発現レベル、サイズ、試験した遺伝子の構造、または機能に関係する遺伝子発現の差次的なレベルに対して分析する。
当技術分野において知られている遺伝子発現の方法の例として、DNAアレイまたはマイクロアレイ(BrazmaおよびVilo (2000年) FEBS Lett.、480巻、17〜24頁; Celisら(2000年) FEBS Lett.、480巻、2〜16頁)、SAGE (遺伝子発現の連続分析) (Maddenら(2000年) Drug Discov. Today、5巻、415〜425頁)、READS (消化されたcDNAの制限酵素増幅) (PrasharおよびWeissman (1999年) Methods Enzymol、303巻、258〜72頁)、TOGA (全体の遺伝子発現分析) (Sutcliffeら(2000年) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.、97巻、1976〜81頁)、タンパク質アレイおよびプロテオミクス(Celisら(2000年) FEBS Lett.、480巻、2〜16頁; Jungblutら、Electrophoresis、1999年、20巻、2100〜10頁)、発現された配列タグ(EST)の配列決定(Celisら、FEBS Lett.、2000年、480巻、2〜16頁; Larssonら、J. Biotechnol.、2000年、80巻、143〜57頁)、減算RNAフィンガープリント法(SuRF) (Fuchsら(2000年) Anal. Biochem. 286巻、91〜98頁; Larsonら(2000年) Cytometry、41巻、203〜208頁)、減法クローニング、ディファレンシャルディスプレイ(DD) (JurecieおよびBelmont (2000年) Curr. Opin. Microbiol.、3巻、316〜21頁)、比較ゲノムハイブリダイゼーション(Carulliら(1998年) J. Cell Biochem. Suppl.、31巻、286〜96頁)、FISH (蛍光インサイチューハイブリダイゼーション)法(GoingおよびGusterson (1999年) Eur. J. Cancer、35巻、1895〜904頁)、および質量分析法(To, Comb. (2000年) Chem. High Throughput Screen、3巻、235〜41頁)が含まれる。
本発明の化合物は、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)をコードする核酸とハイブリダイズするので、研究および診断に有用である。例えば、有効な転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)モジュレーターであるとして本明細書に開示した効率で、および本明細書に開示した条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、遺伝子の増幅または検出に好都合である条件下で、それぞれ有効なプライマーまたはプローブである。これらのプライマーおよびプローブは、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)をコードする核酸分子の特異的な検出を必要とする方法において、ならびに転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)のさらなる研究における検出または使用のための前記核酸分子の増幅において有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、とりわけプライマーおよびプローブの、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)をコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当技術分野において知られている手段によって検出することができる。このような手段は、酵素の、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの放射標識、またはあらゆる他の適切な検出手段に対するコンジュゲーションを含むことができる。試料中の転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)のレベルを検出するためのこのような検出手段を用いたキットも調製することができる。
アンチセンスの特異性および感受性も、当業者によって治療用の使用に利用される。アンチセンス化合物は、ヒトを含めた動物における疾患状態の処置において、治療用部分として用いられている。アンチセンスオリゴヌクレオチドの薬物はヒトに対して、安全かつ効果的に投与されており、多くの臨床試験が現在行われている。したがって、アンチセンス化合物は、細胞、組織、および動物、とりわけヒトの処置のための処置レジメンにおいて有用であるように構成され得る有用な治療モダリティであり得ることが確立されている。
治療には、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)の発現を変調することによって処置することができる疾患または障害を有すると疑われる動物、好ましくはヒトを、本発明にしたがってアンチセンス化合物を投与することによって処置する。例えば、非限定的な一実施形態において、この方法は、処置を必要とする動物に治療有効量の転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)モジュレーターを投与するステップを含む。本発明の転写因子E3(TFE3)モジュレーターは、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)の活性を効果的に変調し、あるいはTFE3および/またはIRS2の発現を変調する。一実施形態において、動物におけるTFE3および/またはIRS2の活性または発現は、対照に比べて約10%阻害される。好ましくは、動物における転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)の活性または発現は、約30%阻害される。より好ましくは、動物におけるTFE3および/またはIRS2の活性または発現は、約50%またはそれを超えて阻害される。このように、オリゴマー化合物は、TFE3および/またはIRS2mRNAの発現を、対照に比べて、少なくとも10%、少なくとも50%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%変調する。
一実施形態において、動物における転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)の活性または発現は、対照に比べて約10%増大される。好ましくは、動物におけるTFE3および/またはIRS2の活性または発現は、約30%増大される。より好ましくは、動物におけるTFE3および/またはIRS2の活性または発現は、約50%またはそれを超えて増大される。このように、オリゴマー化合物は、インスリンTFE3および/またはIRS2 mRNAの発現を、対照に比べて、少なくとも10%、少なくとも50%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%変調する。
例えば、TFE3および/またはIRS2の発現の低減は、動物の血清、血液、脂肪組織、肝臓またはあらゆる他の体液、組織または器官において測定され得る。好ましくは、分析される前記の液体、組織、または器官内に含まれる細胞は、TFE3および/またはIRS2タンパク質自体をコードする核酸分子を含んでいる。
本発明の化合物は、有効量の化合物を適切な薬学的に許容される希釈剤または担体に加えることによって、医薬組成物において利用され得る。本発明の化合物の使用および方法はまた、予防的に有用でもある。
コンジュゲート
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞の分布、または細胞の取込みを増強する、オリゴヌクレオチドの1つまたは複数の部分に対する化学的連結またはコンジュゲートを伴う。これらの部分またはコンジュゲートは、1級または2級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合性に結合しているコンジュゲート基を含むことができる。本発明のコンジュゲート基は、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、オリゴマーの薬物動態学的性質を増強する基、およびオリゴマーの薬力学的性質を増強する基を含む。典型的なコンジュゲート基には、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が含まれる。本発明の文脈において、薬物動態学的性質を増強する基には、取込みを改善し、分解に対する抵抗性を増強し、かつ/または標的核酸との配列特異的なハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。本発明の文脈において、薬力学的性質を増強する基には、本発明の化合物の取込み、分布、代謝、または排泄を改善する基が含まれる。代表的なコンジュゲート基は、本明細書に参照によって組み入れられる、1992年10月23日出願の国際特許出願第PCT/US92/09196号、および米国特許第6,287,860号に開示されている。コンジュゲート部分には、それだけには限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル-5-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム、1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-Hホスホネート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドは、活性な薬物物質、例えば、アスピリン、ワーファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(S)-(+)-プラノプロフェン、カルプロ
フェン、ダンシルサルコシン、2,3,5-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド(benzothiadiazide)、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン(indomethicin)、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗細菌薬、または抗生物質とコンジュゲートすることもできる。
このようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、それだけには限定されないが、米国特許第4,828,979号、第4,948,882号、第5,218,105号、第5,525,465号、第5,541,313号、第5,545,730号、第5,552,538号、第5,578,717号、第5,580,731号、第5,580,731号、第5,591,584号、第5,109,124号、第5,118,802号、第5,138,045号、第5,414,077号、第5,486,603号、第5,512,439号、第5,578,718号、第5,608,046号、第4,587,044号、第4,605,735号、第4,667,025号、第4,762,779号、第4,789,737号、第4,824,941号、第4,835,263号、第4,876,335号、第4,904,582号、第4,958,013号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,245,022号、第5,254,469号、第5,258,506号、第5,262,536号、第5,272,250号、第5,292,873号、第5,317,098号、第5,371,241号、第5,391,723号、第5,416,203号、第5,451,463号、第5,510,475号、第5,512,667号、第5,514,785号、第5,565,552号、第5,567,810号、第5,574,142号、第5,585,481号、第5,587,371号、第5,595,726号、第5,597,696号、第5,599,923号、第5,599,928号、および第5,688,941号を含む。
製剤
本発明の化合物は、取込み、分布、および/または吸収を助けるために、例えば、リポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所、または他の製剤などの、他の分子、分子構造、または化合物の混合物と、混合され、封入され、コンジュゲートされ、または他の方法で会合されていてよい。このような取込み、分布、および/または吸収を助ける製剤の調製を教示する代表的な米国特許には、それだけには限定されないが、その各々が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第5,108,921号、第5,354,844号、第5,416,016号、第5,459,127号、第5,521,291号、第5,543,165号、第5,547,932号、第5,583,020号、第5,591,721号、第4,426,330号、第4,534,899号、第5,013,556号、第5,108,921号、第5,213,804号、第5,227,170号、第5,264,221号、第5,356,633号、第5,395,619号、第5,416,016号、第5,417,978号、第5,462,854号、第5,469,854号、第5,512,295号、第5,527,528号、第5,534,259号、第5,543,152号、第5,556,948号、第5,580,575号、および第5,595,756号が含まれる。
標的の発現および/または機能を変調するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドをベクターの状況において投与する必要はないが、本発明の実施形態は、プロモーター、ハイブリッドプロモーター遺伝子配列を含み、強力な構成的プロモーター活性または所望の場合において誘導され得るプロモーター活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現のための発現ベクター構築物に関する。
一実施形態において、発明の実践は、少なくとも1つの前述のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、適切な核酸送達系と一緒に投与することを含む。一実施形態において、この系は、ポリヌクレオチドに操作可能に連結している非ウイルスのベクターを含む。このような非ウイルスのベクターの例には、単独(例えば、配列番号4から9のあらゆる1つもしくは複数)、または適切なタンパク質、多糖、もしくは脂質製剤との組み合わせたオリゴヌクレオチドが含まれる。
さらなる適切な核酸送達系には、ウイルスベクター、典型的には、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、ヘルパー依存アデノウイルス、レトロウイルス、またはセンダイウイルス-リポソーム(HVJ)複合体の少なくとも1つからの配列が含まれる。好ましくは、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに操作可能に連結している強力な真核生物のプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを含んでいる。
さらに好ましいベクターには、ウイルスベクター、融合タンパク質、および化学的コンジュゲートが含まれる。レトロウイルスベクターには、モロニーマウス白血病ウイルスおよびHIVベースのウイルスが含まれる。好ましいHIVベースのウイルスベクターの1つは、gagおよびpol遺伝子がHIVゲノムからのものであり、env遺伝子が別のウイルスからのものである少なくとも2つのベクターを含んでいる。DNAウイルスベクターも好ましい。これらのベクターは、オルソポックスベクターまたはアビポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスIウイルス(HSV)ベクターなどのヘルペスウイルスベクター(Geller, A.I.ら(1995年) J. Neurochem、64巻、487頁; DNA Cloning: Mammalian Systems、D. Glover著(Oxford Univ. Press, Oxford、英国) (1995年)におけるLim, F.ら; Geller, A.I.ら(1993年) Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A.、90巻、7603頁; Geller, A.I.ら(1990年) Proc. Natl. Acad. Sci USA、87巻、1149頁)、アデノウイルスベクター(LeGal LaSalleら、Science、259巻、988頁(1993年); Davidsonら、(1993年) Nat. Genet.、3巻、219頁; Yangら(1995年) J. Virol、69巻、2004頁)、およびアデノ随伴ウイルスベクター(Kaplitt, M.G.ら(1994年) Nat. Genet.、8巻、148頁)を含む。
本発明のアンチセンス化合物は、あらゆる薬学的に許容される塩、エステル、もしくはこのようなエステルの塩、または、ヒトを含めた動物に投与した際に生物学的に活性な代謝物もしくはその残渣を(直接もしくは間接的に)もたらすことができるあらゆる他の化合物を包含する。
「薬学的に許容される塩」の語は、本発明の化合物の生理学的および薬学的に許容される塩、すなわち、親化合物の望ましい生物学的活性を維持し、望ましくない毒性学的効果をそれに付与しない塩を意味する。オリゴヌクレオチドに対して、薬学的に許容される塩およびその使用の好ましい例は、参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。
本発明は、本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本発明の医薬組成物は、局所的または全身的な処置が望ましいか否かに応じて、および処置する部位に応じて数々の方法において投与され得る。投与は局所的であってよく(眼科的な、ならびに膣および直腸の送達を含めた粘膜への投与を含む)、肺(例えば、ネブライザー、気管内、鼻腔内、上皮、および経皮によるものを含めた、粉末もしくはエアロゾルの吸入もしくはガス注入によって)、経口、または非経口であってよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内の注射もしくは注入、または頭蓋内、例えば、くも膜下腔内または脳室内投与が含まれる。
中枢神経系における組織を処置するために、例えば、脳脊髄液中への注射または注入によって投与を行ってもよい。アンチセンスRNAの脳脊髄液中への投与は、例えば、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許出願第2007/0117772号、「Methods for slowing familial ALS disease progression」に記載されている。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを中枢神経系における細胞に投与しようとする場合、血液脳関門を越えて対象のアンチセンスオリゴヌクレオチドの浸透を促進することができる1つまたは複数の薬剤と投与を行うことができる。注射は、例えば、嗅内皮質または海馬中に行うことができる。筋肉組織における運動ニューロンへのアデノウイルスベクターの投与による神経栄養因子の送達は、例えば、参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第6,632,427号、「Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons」に記載されている。線条体、視床、海馬、または黒質などの脳へのベクターの直接的な送達は当技術分野において知られており、例えば、参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第6,756,523号、「Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain」に記載されている。投与は、注射によって迅速であってよく、または徐放製剤のゆっくりとした注入もしくは投与によってある期間にわたってなされてもよい。
対象のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、望ましい製剤上の、または薬物動態学的性質をもたらす薬剤と連結またはコンジュゲートしていてもよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、トランスフェリン受容体に対する抗体など、血液脳関門を越えた浸透または輸送を促進することが当技術分野において知られているあらゆる物質と連結され、静脈内注射によって投与されてよい。アンチセンス化合物は、例えば、アンチセンス化合物をより効果的にし、かつ/または血液脳関門を越えたアンチセンス化合物の輸送を増大する、ウイルスベクターと連結されてもよい。血液脳関門の浸透圧性の撹乱も、例えば、それだけには限定されないが、メソエリスリトール、キシリトール、D(+)ガラクトース、D(+)ラクトース、D(+)キシロース、ズルシトール、ミオイノシトール、L(-)フコース、D(-)マンニトール、D(+)グルコース、D(+)アラビノース、D(-)アラビノース、セロビオース、D(+)マルトース、D(+)ラフィノース、L(+)ラムノース、D(+)メリビオース、D(-)リボース、アドニトール、D(+)アラビトール、L(-)アラビトール、D(+)フコース、L(-)フコース、D(-)リキソース、L(+)リキソース、およびL(-)リキソースを含む糖の注入、または、それだけには限定されないが、グルタミン、リジン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、チロシン、バリン、およびタウリンを含むアミノ酸によっても実現され得る。血液脳関門の浸透を増強するための方法および物質は、例えば、全てがその全文において参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第4,866,042号、「Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier」、第6,294,520号、「Material for passage through the blood-brain barrier」、および第6,936,589号、「Parenteral delivery systems」に記載されている。
対象のアンチセンス化合物は、取込み、分布、および/または吸収を助けるための、リポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所、または他の製剤などの他の分子、分子構造、または化合物の混合物と混合され、封入され、コンジュゲートされ、または別の方法で会合され得る。例えば、オリゴヌクレオチドの取込みを促進するために、陽イオン性の脂質が製剤中に含まれていてよい。取込みを促進することが示されているこのような組成物の1つはLIPOFECTIN(GIBCO-BRL、Bethesda、MDから入手)である。
少なくとも1つの2'-O-メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは経口投与にとりわけ有用であると考えられている。局所投与のための医薬組成物および製剤は、経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤、および散剤を含むことができる。従来の製薬用の担体、水性の、粉末の、または油性の基剤、増粘剤などは、必要であることがあり、または望ましいことがある。コーティングされているコンドーム、手袋なども有用であり得る。
本発明の医薬製剤は、単位剤形において提示され得ると便利であり、製薬業界においてよく知られている従来の技術にしたがって調製され得る。このような技術は、有効成分の、製薬用の担体または賦形剤との会合をもたらすステップを含んでいる。一般的に、製剤は、有効成分を液状の担体または微細の固体担体または両方との会合を均一かつ均質にもたらし、次いで、必要であれば製品を成形することによって調製される。
本発明の組成物は、例えば、それだけには限定されないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液状シロップ剤、ソフトゲルカプセル剤、坐剤、および浣腸剤などのあらゆる多くの可能な剤形に調合されてよい。本発明の組成物は、水性、非水性、または混合の媒体中の懸濁剤として調合されてもよい。水性懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、およびデキストランを含めた、懸濁液の粘性を増大する物質をさらに含むことができる。懸濁液は安定化剤も含むことができる。
本発明の医薬組成物は、それだけには限定されないが、液剤、乳剤、泡沫剤、およびリポソーム含有製剤を含む。本発明の医薬組成物および製剤は、1つまたは複数の浸透増強剤、担体、賦形剤、または他の有効成分もしくは不活性成分を含むことができる。
乳剤は、典型的に、通常直径0.1μmを超える液滴の形態において別のものに分散されている1つの液体の不均一系である。乳剤は、分散相の他にさらなる成分、および水相、油相、または別々の相としてそれ自体のいずれかにおける溶液として存在し得る有効な薬物を含むことができる。マイクロエマルジョンが本発明の実施形態として含まれる。乳剤およびその使用は当技術分野においてよく知られており、米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。
本発明の製剤はリポソーム製剤を含む。本発明で用いられる、「リポソーム」の語は、球状の二重層、または(複数の)二重層中に配列された両親媒性の脂質から構成される小胞を意味する。リポソームは、親油性材料および送達される組成物を含む水性の内部から形成される膜を有する単層状または多層状の小胞である。陽イオン性のリポソームは、負に荷電したDNA分子と相互作用して安定な複合体を形成すると考えられている正に荷電したリポソームである。pH感受性であり、または負に荷電しているリポソームは、DNAと複合するよりむしろDNAを捕獲すると考えられている。陽イオン性のリポソームおよび非陽イオン性のリポソームの両方とも、DNAを細胞に送達するのに用いられている。
リポソームは「立体的に安定化した」リポソームも含み、本明細書で用いられるこの語は、1つまたは複数の特殊化した脂質を含むリポソームを意味する。これらの特殊化した脂質は、リポソーム中に組み入れられると、このような特殊化した脂質のリポソームスラッキング(liposomeslacking)に比べて循環寿命の増強したリポソームをもたらす。立体的に安定化したリポソームの例は、リポソームの小胞形成性の脂質部分が1つもしくは複数の糖脂質を含む、またはポリエチレングリコール(PEG)部分などの1つもしくは複数の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。リポソームおよびその使用は、米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。
本発明の医薬製剤および組成物は界面活性剤も含むことができる。薬物製品、製剤、および乳剤における界面活性剤の使用は、当技術分野においてよく知られている。界面活性剤およびその使用は、参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。
一実施形態において、本発明は、核酸、とりわけオリゴヌクレオチドの効率的な送達をもたらすために様々な浸透増強剤を使用している。細胞膜を越えた非親油性薬物の拡散を助ける他に、浸透増強剤は、親油性薬物の浸透性も増強する。浸透増強剤は、5つの広範なカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート性非界面活性剤の1つに属すると分類され得る。浸透増強剤およびその使用は、参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。
当業者であれば、製剤は、その意図された使用、すなわち投与経路にしたがって日常的にデザインされることが理解されよう。
局所投与に好ましい製剤には、本発明のオリゴヌクレオチドが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤、および界面活性剤などの局所送達剤と混合されているものが含まれる。好ましい脂質およびリポソームには、中性(例えば、ジオレオイルホスファチジルDOPEエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、ジステアロリホスファチジルコリン(distearolyphosphatidyl choline)、陰性(例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールDMPG)、ならびに陽性(例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルDOTAPおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOTMA)が含まれる。
局所または他の投与に対して、本発明のオリゴヌクレオチドは、リポソーム内に封入されてもよく、またはリポソームと、とりわけ陽イオン性リポソームと複合体を形成してもよい。あるいは、オリゴヌクレオチドは脂質、とりわけ陽イオン性脂質と複合されてもよい。好ましい脂肪酸およびエステル、薬学的に許容されるその塩およびこれらの使用は、米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。
経口投与のための組成物および製剤には、散剤、または顆粒剤、微粒子、ナノ粒子、水または非水性媒体中の懸濁剤または液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤、またはミニ錠剤が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤が望ましいことがある。好ましい経口製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドを、1つまたは複数の浸透増強剤、界面活性剤、およびキレート剤と組み合わせて投与するものである。好ましい界面活性剤には、脂肪酸および/またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および/またはその塩が含まれる。好ましい胆汁酸/塩および脂肪酸ならびにこれらの使用は、参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。浸透増強剤、例えば、胆汁酸/塩と組み合わせた脂肪酸/塩の組み合わせも好ましい。とりわけ好ましい組合せは、ラウリン酸、カプリン酸、およびUDCAのナトリウム塩である。さらなる浸透増強剤には、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-20-セチルエーテルが含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドは、スプレードライ粒子を含めた顆粒形態において、または複合して微粒子もしくはナノ粒子を形成して、経口的に送達され得る。オリゴヌクレオチド複合剤およびその使用は、参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。
非経口、くも膜下腔内、または脳室内の投与のための組成物および製剤は、バッファー、希釈剤、ならびに他の適切な添加剤(例えば、それだけには限定されないが、浸透増強剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体または賦形剤)を含むことができる無菌の水溶液を含むことができる。
本発明のある実施形態は、1つまたは複数のオリゴマー化合物、および非アンチセンスのメカニズムによって機能する1つまたは複数の他の化学療法薬を含む医薬組成物を提供するものである。このような化学療法薬の例として、それだけには限定されないが、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マフォスファミド、イフォスファミド、シトシン、アラビノシド、ビスクロロエチル-ニトロソ尿素、ブスルファン、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、デカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、4-ヒドロキシペルオキシシクロ-ホスホラミド、5-フルオロウラシル(5-FU)、5-フルオロデオキシウリジン(5-FUdR)、メトトレキセート(MTX)、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド(VP-16)、トリメトレキセート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチン、およびジエチルスチルベストロール(DES)などの癌の化学療法薬が含まれる。本発明の化合物と一緒に用いる場合、このような化学療法薬は、個々に(例えば、5-FUとオリゴヌクレオチド)、逐次(例えば、ある期間の5-FUとオリゴヌクレオチド、その後MTXとオリゴヌクレオチド)、あるいは1つまたは複数の他のこのような化学療法薬と組み合わせて(例えば、5-FU、MTX、およびオリゴヌクレオチド、もしくは5-FU、放射線治療、およびオリゴヌクレオチド)用いてもよい。それだけには限定されないが、非ステロイド抗炎症薬およびコルチコステロイドを含む抗炎症薬、ならびにそれだけには限定されないが、リバビリン、ビダラビン、アシクロビル、およびガンシクロビルを含む抗ウイルス薬を、本発明の組成物と組み合わせてもよい。アンチセンス化合物と他の非アンチセンス薬との組合せも、本発明の範
囲内である。2つまたはそれを超える組合せの化合物を、一緒にまたは逐次に用いることができる。
別の関連の一実施形態において、本発明の組成物は、第1の核酸を標的にした1つまたは複数のアンチセンス化合物、とりわけオリゴヌクレオチド、および第2の核酸標的を標的にした1つまたは複数のさらなるアンチセンス化合物を含むことができる。例えば、第1の標的は、TFE3および/またはIRS2の特定のアンチセンス配列であってよく、第2の標的は別のヌクレオチド配列からの領域であってよい。あるいは、本発明の組成物は、同じ転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)核酸標的の異なる領域を標的とする2つまたはそれを超えるアンチセンス化合物を含むことができる。アンチセンス化合物の多くの例を本明細書に例示し、他のものは当技術分野において知られている適切な化合物の中から選択され得る。2つまたはそれを超える組み合わされた化合物は、一緒にまたは逐次に用いられ得る。
投薬
治療用組成物の製剤およびこれらのその後の投与(投薬)は、当業者の技術の範囲内であると考えられている。投薬は処置する疾患状態の重症度および反応性に依存し、処置の経過は数日から数ヶ月まで、または治癒がもたらされるまで、または疾患状態の減少が実現されるまで継続する。最適の投薬スケジュールは、患者の身体における薬物の蓄積の測定から計算することができる。当業者であれば、最適の投与量、投薬方法、および反復速度を容易に決定することができる。最適の投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的な作用強度に応じて変化することがあり、一般にin vitroおよびin vivoの動物モデルにおいて効果的であることが見出されるEC50に基づいて推定され得る。一般的に、投与量は体重1kgあたり0.01μgから100gまでであり、1日、1週間、1ヶ月、もしくは1年に1回もしくは複数回、または2から20年ごとに1回投与され得る。当業者であれば、測定した滞留時間、および身体の体液または組織中の薬物の濃度に基づいて投薬のための反復速度を容易に推定することができる。処置が成功した後は、患者に疾患状態の再発を防ぐための維持療法を受けさせるのが望ましいことがあり、この場合、オリゴヌクレオチドを、体重1kgあたり0.01μgから100gまでの範囲の維持投与量において、1日1回または複数回、20年ごとに1回まで投与する。
実施形態において、患者を、体重1kgあたり、少なくとも約1mg、少なくとも約2mg、少なくとも約3mg、少なくとも約4mg、少なくとも約5mg、少なくとも約6mg、少なくとも約7mg、少なくとも約8mg、少なくとも約9mg、少なくとも約10mg、少なくとも約15mg、少なくとも約20mg、少なくとも約25mg、少なくとも約30mg、少なくとも約35mg、少なくとも約40mg、少なくとも約45mg、少なくとも約50mg、少なくとも約60mg、少なくとも約70mg、少なくとも約80mg、少なくとも約90mg、または少なくとも約100mgである薬物の投与量で処置する。アンチセンスオリゴヌクレオチドのある注入投与量は、例えば、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第7,563,884号、「Antisense modulation of PTPIB expression」に記載されている。
本発明の様々な実施形態を上記に記載してきたが、これらは例示によってのみ提示するものであり、限定的なものではないことを理解すべきである。本発明の精神または範囲から逸脱せずに、本明細書の開示にしたがって開示した実施形態に対して本明細書にしたがって数々の変更を行うことができる。したがって、本発明の広さおよび範囲は、上記に記載したあらゆる実施形態によって制限されてはならない。
本明細書で言及した文書は全て、参照によって本明細書に組み入れられる。本開示において引用した出版物および特許文書は全て、個々の出版物または特許文書の各々が個々に記載されていたごとく、同程度に全ての目的で参照によって組み入れられる。本文書において様々な参考文献を引用することにより、出願者はあらゆる特定の参照が本発明に対する「先行技術」であることを認めるものではない。発明の組成物および方法の実施形態を以下の実施例において説明する。
(実施例)
以下の非限定的な実施例は、選択された本発明の実施形態の説明を提供するものである。比率における変形、および示した成分の要素における代替物は、当業者には明らかであり、本発明の実施形態の範囲内にあることが理解されよう。
(実施例1)
転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)に対する核酸分子アンチセンス、ならびに/あるいはTFE3および/またはIRS2ポリヌクレオチドのセンス鎖に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドのデザイン
上記で示した通り、「に特異的なオリゴヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド標的」の語は、(i)標的遺伝子の一部分と安定な複合体を形成することができ、または(ii)標的遺伝子のmRNA転写物の一部分と安定な二重鎖を形成することができる配列を有するオリゴヌクレオチドを意味する。
好適なオリゴヌクレオチドの選択は、核酸配列を自動的にアラインし、同一性または相同性の領域を指摘するコンピュータプログラムを用いることによって促進される。このようなプログラムは、例えば、GenBankなどの検索データベースによって、またはPCR生成物を配列決定することによって、得られた核酸配列を比較するのに用いられる。ある範囲の種からの核酸配列の比較により、好適な度合いの種間の同一性を示す核酸配列の選択が可能になる。配列決定されていない遺伝子の場合には、サザンブロットを行って、標的の種と他の種との間の遺伝子間の同一性の度合いを決定することができる。様々な度合いのストリンジェンシーでサザンブロットを行うことによって、当技術分野においてよく知られている通り、同一性のおよその測定を得るのは可能である。これらの手順により、制御すべき対象における標的核酸配列に対する高度の相補性、および他種における対応する核酸配列に対する低度の相補性を示すオリゴヌクレオチドの選択が可能になる。当業者であれば、本発明において用いるのに好適な遺伝子の領域を選択する上でかなりの許容度が存在することが理解されよう。
標的核酸に対する化合物の結合が標的核酸の正常な機能を妨害して機能および/または活性の変調をもたらす場合、ならびに特異的な結合が望ましい条件下、すなわちin vivoのアッセイまたは治療的処置の場合は生理学的条件下、in vitroの場合はアッセイを行う条件下で、非標的核酸配列に対するアンチセンス化合物の非特異的な結合を避けるのに十分な度合いの相補性が存在する場合、アンチセンス化合物は「特異的にハイブリダイズする」。
本明細書に記載するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの性質は、当技術分野において知られている1つまたは複数のin vitroのアッセイによって決定することができる。例えば、本明細書に記載するオリゴヌクレオチドの性質は、融解曲線アッセイを用いて、標的天然アンチセンスと潜在的な薬物分子との間の結合強度を決定することによって決定することができる。
標的天然アンチセンスと潜在的な薬物分子(モレキュール)との間の結合強度は、融解曲線アッセイなど、分子間相互作用の強度を測定するあらゆる確立された方法を用いて推定され得る。
融解曲線アッセイは、二本鎖から一本鎖への高次構造の速やかな移行が天然アンチセンス/モレキュール複合体に生じる温度を決定するものである。この温度は、2つの分子間の相互作用の強度の信頼できる測定として広く受け入れられている。
融解曲線アッセイは、実際の天然アンチセンスRNA分子のcDNAコピー、またはモレキュールの結合部位に対応する合成のDNAもしくはRNAヌクレオチドを用いて行われ得る。このアッセイを行うのに必要な試薬を全て含む多数のキットが入手可能である(例えば、Applied Biosystems Inc.、MeltDoctor kit)。これらのキットは二本鎖DNA(dsDNA)結合性色素(例えば、ABI HRM色素、SYBR Green、SYTOなど)の1つを含む適切なバッファー溶液を含む。dsDNA色素の性質は、これらは遊離型の蛍光を殆ど放射しないが、dsDNAに結合すると高度に蛍光性であるということである。
アッセイを行うには、cDNAまたは対応するオリゴヌクレオチドを、特定の製造元のプロトコールによって規定された濃度のモレキュールと混合する。この混合物を95℃に加熱して予め形成したdsDNA複合体を全て分解し、次いで、室温またはキットの製造元が規定する他の低い温度にゆっくりと冷却してDNA分子をアニーリングさせる。次いで、新しく形成した複合体を、同時に、反応によって生成する蛍光の量に対するデータを持続的に収集して95℃にゆっくりと加熱する。蛍光強度は、反応中に存在するdsDNAの量に逆比例する。キットと適合するリアルタイムPCR装置を用いてデータを収集することができる(例えば、ABIのStepOne Plus Real Time PCR SystemまたはLightTyper instrument、Roche Diagnostics、Lewes、英国)。
好適なソフトウエア(例えば、LightTyper (Roche)またはSDS Dissociation Curve、ABI)を用いて、温度(x軸)に対して、温度に関して蛍光のネガティブ誘導体をプロット(y軸上が、-d(蛍光)/dT)することによって融解ピークを構築する。データを分析して、dsDNA複合体から一本鎖分子に速やかに移行する温度を決定する。この温度をTmと呼び、2つの分子間の相互作用の強度に正比例する。典型的にTmは40℃を超える。
(実施例2)
TFE3および/またはIRS2ポリヌクレオチドの変調
アンチセンスオリゴヌクレオチドでのHepG2細胞の処置
ATCC(カタログ番号HB-8065)からのHepG2細胞を増殖培地中(MEM/EBSS (Hycloneカタログ番号SH30024、またはMediatechカタログ番号MT-10-010-CV)+10% FBS (Mediatechカタログ番号MT35-011-CV)+ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatechカタログ番号MT30-002-CI))37℃および5%CO2で増殖させた。実験1日前、細胞を1.5×105/mlの密度で6ウエルプレート中に再び蒔き、37℃および5%CO2でインキュベートした。実験日、6ウエルプレート中の培地を新鮮な増殖培地に交換した。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、20μMの濃度に希釈した。この溶液2μlを、室温で20分間、Opti-MEM培地(Gibcoカタログ番号31985-070)400μlおよびリポフェクタミン2000(Invitrogenカタログ番号11668019)4μlとインキュベートし、6ウエルプレートの各ウエルにHepG2細胞を適用した。オリゴヌクレオチド溶液の代わりに水2μlを含む同様の混合物を、偽トランスフェクトの対照に用いた。37℃および5%CO2で3〜18時間インキュベートした後、培地を新たな増殖培地に交換した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを加えて48時間後、培地を除去し、製造元の使用説明書にしたがってPromegaからのSV Total RNA Isolation System(カタログ番号Z3105)またはQiagenからのRNeasy Total RNA Isolationキット(カタログ番号74181)を用いて、細胞からRNAを抽出した。製造元のプロトコールに記載されている通り、RNA600ngを、Thermo ScientificからのVerso cDNAキット(カタログ番号AB 1453B)またはHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (カタログ番号4368813)を用いて行われている逆転写反応に加えた。この逆転写反応からのcDNAを用いて、ABI Taqman Gene Expression Mix (カタログ番号4369510)、およびABIによってデザインされたプライマー/プローブ(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00275843_s1(IRS2)、およびApplied Biosystems Inc.、Foster City CAによるHs00232406_m1(TFE3))を用いて、リアルタイムPCRによって遺伝子の発現をモニタリングした。以下のPCRサイクルを用いた: StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)を用いて、50℃で2分間、95℃で10分間、(95℃で15秒、60℃で1分)を40サイクル。
アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した後の遺伝子発現における倍数変化を、処置試料と偽トランスフェクト試料との間の18Sで基準化したdCt値における違いに基づいて計算した。
結果
リアルタイムPCRの結果は、HepG2細胞におけるIRS2mRNAのレベルは、TFE3アンチセンスHs.708291に対するsiRNAでの処置48時間後に著しく上昇することを示している(図1)。
リアルタイムPCRの結果は、対照に比べた、リポフェクタミン2000を用いて導入したsiRNAオリゴヌクレオチドでHepG2細胞を処置した後、TFE3mRNAにおける倍数変化+標準偏差を示している(図2)。
リアルタイムPCRの結果は、HepG2細胞におけるTFE3mRNAのレベルは、TFE3アンチセンスHs.708291に対してデザインされたsiRNAの1つで処置48時間後、著しく上昇することを示している(図3)。
アンチセンスオリゴヌクレオチドでの518A2細胞の処置
Albert Einstein-Montefiore Cancer Center、NYから得た518A2細胞を、増殖培地(MEM/EBSS (Hycloneカタログ番号SH30024、またはMediatechカタログ番号MT-10-010-CV)+10%FBS (Mediatechカタログ番号MT35-011-CV)+ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatechカタログ番号MT30-002-CI))中、37℃および5%CO2で増殖させた。実験1日前、細胞を1.5×105/mlの密度で6ウエルプレート中に再び蒔き、37℃および5%CO2でインキュベートした。実験日、6ウエルプレート中の培地を、新たな増殖培地に交換した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを全て、20μMの濃度に希釈した。この溶液2μlを、Opti-MEM培地(Gibcoカタログ番号31985-070)400μlおよびリポフェクタミン2000 (lnvitrogenカタログ番号11668019)4μlと室温で20分間インキュベートし、6ウエルプレートの各ウエルに518A2細胞を適用した。オリゴヌクレオチド溶液の代わりに水2μlを含む同様の混合物を、偽トランスフェクトの対照に用いた。37℃および5%CO2で3〜18時間インキュベートした後、培地を新たな増殖培地に交換した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを加えて48時間後、培地を除去し、製造元の使用説明書にしたがってPromegaからのSV Total RNA Isolation System(カタログ番号Z3105)またはQiagenからのRNeasy Total RNA Isolationキット(カタログ番号74181)を用いて、細胞からRNAを抽出した。製造元のプロトコールに記載されている通り、RNA600ngを、Thermo ScientificからのVerso cDNAキット(カタログ番号AB 1453B)またはHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (カタログ番号4368813)を用いて行われている逆転写反応に加えた。この逆転写反応からのcDNAを用いて、ABI Taqman Gene Expression Mix (カタログ番号4369510、およびABIによってデザインされたプライマー/プローブ(Applied Biosystems Inc.、Foster City CAによるApplied Biosystcins Taqman Gene Expression Assay: Hs00275843_s1)を用いて、リアルタイムPCRによって遺伝子の発現をモニタリングした。以下のPCRサイクルを用いた: StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)を用いて、50℃で2分間、95℃で10分間、(95℃で15秒、60℃で1分)を40サイクル。
アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した後の遺伝子発現における倍数変化を、処置試料と偽トランスフェクト試料との間の18Sで基準化したdCt値における違いに基づいて計算した。
結果
リアルタイムPCRの結果は、518A2細胞におけるIRS2mRNAのレベルは、TFE3アンチセンスHs.708291に対するsiRNAでの処置48時間後に著しく上昇することを示している(図1)。
本発明を、1つまたは複数の実施態様に関して説明し、記載してきたが、当業者であれば本明細書および添付の図面を読み、理解すれば同等の変更および修正が生じるであろう。さらに、本発明の特定の特徴は、いくつかの実施態様の1つのみに関して開示され得るが、このような特徴は、あらゆる所与の、または特定の応用に対して望ましく、また有利であり得るので、他の実施態様の1つまたは複数の他の特徴と組み合わせることができる。
本開示の要約書により、読者は本技術開示の本質を速やかに確認することができる。これは、以下の特許請求の範囲の範囲または意味を解釈し、または制限するのに用いられるものではないという理解をもって提示するものである。

Claims (37)

  1. in vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織におけるインスリン受容体基質2(IRS2)および/または転写因子E3(TFE3)転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を変調する方法であって、
    配列番号3のヌクレオチド1から497内の連続した5から30ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのリバース相補体に対して少なくとも50%の配列同一性を有する、長さ5から30ヌクレオチドの少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと前記細胞または組織を接触させ、それによってin vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織における転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を変調する段階を含む、方法。
  2. in vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織における転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を変調する方法であって、
    転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドの天然アンチセンスのリバース相補体に対して少なくとも50%の配列同一性を有する、長さ5から30ヌクレオチドの少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと前記細胞または組織を接触させ、それによってin vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織における転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を変調する段階を含む、方法。
  3. in vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織における転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を変調する方法であって、
    転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドに対して少なくとも50%の配列同一性を有する、長さ5から30ヌクレオチドの少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと前記細胞または組織を接触させ、それによってin vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織における転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を変調する段階を含む、方法。
  4. in vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織における転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を変調する方法であって、
    転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドの天然アンチセンスオリゴヌクレオチドの領域を標的とする少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと前記細胞または組織を接触させ、それによってin vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織における転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)の機能および/または発現を変調する段階を含む、方法。
  5. 転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)の機能および/または発現がin vivoまたはin vitroで対照に比べて増大している、請求項4に記載の方法。
  6. 少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドの天然アンチセンス配列を標的とする、請求項4に記載の方法。
  7. 少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドのコードおよび/または非コード核酸配列を含む核酸配列を標的とする、請求項4に記載の方法。
  8. 少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドのオーバーラップおよび/または非オーバーラップ配列を標的とする、請求項4に記載の方法。
  9. 少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの修飾された糖部分、少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間連結、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド、およびこれらの組合せから選択される1つまたは複数の修飾を含む、請求項4に記載の方法。
  10. 1つまたは複数の修飾が、2'-O-メトキシエチル修飾された糖部分、2'-メトキシ修飾された糖部分、2'-O-アルキル修飾された糖部分、2環式糖部分、およびこれらの組合せから選択される少なくとも1つの修飾された糖部分を含む、請求項9に記載の方法。
  11. 1つまたは複数の修飾が、ホスホロチオエート、2'-O-メトキシエチル(MOE)、2'-フルオロ、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミデート、カーバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、およびこれらの組合せから選択される少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間連結を含む、請求項9に記載の方法。
  12. 1つまたは複数の修飾が、ペプチド核酸(PNA)、固定核酸(LNA)、アラビノ核酸(FANA)、類似体、誘導体、およびこれらの組合せから選択される少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項9に記載の方法。
  13. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、配列番号4から9に記載する少なくとも1つのオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の方法。
  14. in vivoまたはin vitroで哺乳動物の細胞または組織における転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)遺伝子の機能および/または発現を変調する方法であって、
    転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチドに特異的であり、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドのアンチセンスおよび/またはセンスの核酸分子の少なくとも約5つの連続した核酸の相補配列に対して少なくとも50%の配列同一性を有する、長さ5から30ヌクレオチドの少なくとも1つの低分子干渉RNA(siRNA)オリゴヌクレオチドと前記細胞または組織を接触させる段階;ならびに
    in vivoまたはin vitroで哺乳動物細胞または組織における転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)の機能および/または発現を変調する段階を含む、方法。
  15. 前記オリゴヌクレオチドが、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドのアンチセンスおよび/またはセンスの核酸分子に対して相補的である少なくとも約5つの連続した核酸の配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項14に記載の方法。
  16. in vivoまたはin vitroで哺乳動物細胞または組織における転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)の機能および/または発現を変調する方法であって、
    前記少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号1、2、5に記載する少なくとも1つの核酸配列に対して少なくとも50%の配列同一性を有し、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドのセンスおよび/または天然アンチセンス鎖の非コードおよび/またはコード配列に特異的である、長さ約5から30ヌクレオチドの少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと前記細胞または組織を接触させる段階;ならびに
    in vivoまたはin vitroで哺乳動物細胞または組織における転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)の機能および/または発現を変調する段階を含む、方法。
  17. 少なくとも1つの修飾された糖部分、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド間連結、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド、およびこれらの組合せから選択される少なくとも1つの修飾を含み、in vivoまたはin vivoで、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)遺伝子にハイブリダイズし、その機能および/または発現をin vivoまたはin vivoで正常の対照に比べて変調するアンチセンス化合物である、合成の、修飾されたオリゴヌクレオチド。
  18. 少なくとも1つの修飾が、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミデート、カーバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、およびこれらの組合せからなる群から選択されるヌクレオチド間連結を含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
  19. 少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
  20. ホスホロチオエートヌクレオチド間連結のバックボーンを含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
  21. ペプチド核酸、固定核酸(LNA)、類似体、誘導体、およびこれらの組合せから選択される少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
  22. ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミデート、カーバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、およびこれらの組合せから選択される修飾されたヌクレオチドを含む複数の修飾を含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
  23. ペプチド核酸、固定核酸(LNA)、類似体、誘導体、およびこれらの組合せから選択される修飾されたヌクレオチドを含む複数の修飾を含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
  24. 2'-O-メトキシエチル修飾された糖部分、2'-メトキシ修飾された糖部分、2'-O-アルキル修飾された糖部分、2環式糖部分、およびこれらの組合せから選択される少なくとも1つの修飾された糖部分を含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
  25. 2'-O-メトキシエチル修飾された糖部分、2'-メトキシ修飾された糖部分、2'-O-アルキル修飾された糖部分、2環式糖部分、およびこれらの組合せから選択される修飾された糖部分を含む複数の修飾を含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
  26. 少なくとも長さ約5から30ヌクレオチドであり、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドのアンチセンスおよび/またはセンス鎖にハイブリダイズし、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドのアンチセンスおよび/またはセンスのコードおよび/または非コード核酸配列の少なくとも約5つの連続した核酸の相補配列に対して少なくとも約20%の配列同一性を有する、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
  27. 転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドのアンチセンスおよび/またはセンスのコードおよび/または非コード核酸配列の少なくとも約5つの連続した核酸の相補配列に対して少なくとも約80%の配列同一性を有する、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
  28. in vivoまたはin vivoで、転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドの少なくとも1つにハイブリダイズし、その発現および/または機能を正常の対照に比べて変調する、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
  29. 配列番号4から9に記載する配列を含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
  30. アンチセンス配列、相補配列、対立遺伝子、ホモログ、イソ型、バリアント、誘導体、突然変異体、フラグメント、またはこれらの組合せを含む転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドの1つまたは複数に特異的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む組成物。
  31. オリゴヌクレオチドが、配列番号4から9に記載するいずれか1つのヌクレオチド配列に比べて少なくとも約40%の配列同一性を有する、請求項30に記載の組成物。
  32. オリゴヌクレオチドが、配列番号4から9に記載するヌクレオチド配列を含む、請求項30に記載の組成物。
  33. 配列番号4から9に記載するオリゴヌクレオチドが1つまたは複数の修飾または置換を含む、請求項32に記載の組成物。
  34. 1つまたは複数の修飾が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ペプチド核酸、固定核酸(LNA)分子、およびこれらの組合せから選択される、請求項33に記載の組成物。
  35. 少なくとも1つの転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドおよび/または少なくとも1つのコードされたそれらの生成物に関連する疾患を防止または処置する方法であって、
    前記少なくとも1つの転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドの天然アンチセンス配列に結合し、前記少なくとも1つの転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドの発現を変調する、少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療有効量を患者に投与し、それによって、少なくとも1つの転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドおよび/または少なくとも1つのコードされたそれらの生成物に関連する疾患を防止または処置する段階を含む、方法。
  36. 少なくとも1つの転写因子E3(TFE3)および/またはインスリン受容体基質2(IRS2)ポリヌクレオチドに関連する疾患が、1型および2型糖尿病、インスリン抵抗性非糖尿病状態(例えば、肥満、耐糖能障害(IGT)、およびメタボリックシンドローム)、多嚢胞性卵巣症候群、アテローム性動脈硬化、癌;アポトーシス、加齢、および老化に関連する疾患;ならびに神経変性疾患または障害(例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症など)から選択される、請求項35に記載の方法。
  37. in vivoで投与するための少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを同定および選択する方法であって、
    疾患状態に関連する標的ポリヌクレオチドを選択する段階と、
    選択された標的ポリヌクレオチドに対して、または選択された標的ポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるポリペプチドに対して、相補的である少なくとも5つの連続したヌクレオチドを含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを同定する段階と、
    ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下における、アンチセンスオリゴヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチド、または選択された標的ポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるポリヌクレオチドとのハイブリッドの熱的融解点を測定する段階と、
    得られた情報に基づいて、in vivoで投与するための少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを選択する段階とを含む、方法。
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