CN106497967B - 木薯eIF4E3基因RNAi载体沉默效果的检测方法 - Google Patents

木薯eIF4E3基因RNAi载体沉默效果的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106497967B
CN106497967B CN201610936028.5A CN201610936028A CN106497967B CN 106497967 B CN106497967 B CN 106497967B CN 201610936028 A CN201610936028 A CN 201610936028A CN 106497967 B CN106497967 B CN 106497967B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ca4e3
eif4e3
gene
carrier
cassava
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201610936028.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106497967A (zh
Inventor
张秀春
刘志昕
陈柏岑
冼淑丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences filed Critical Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority to CN201610936028.5A priority Critical patent/CN106497967B/zh
Publication of CN106497967A publication Critical patent/CN106497967A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106497967B publication Critical patent/CN106497967B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种针对靶标木薯eIF4E3基因的RNAi载体的制备及针对该RNAi载体的较为快捷和简便的沉默效果的检测方法的专利申请。构建载体过程为：首先构建含有反义插入片段的中间载体pRNAiCa4E3R，其次将正义插入片段定向插入，获得含有发夹结构的中间载体pRNAiCa4E3，再将其定向插入表达载体pCAMBIA1300，获得RNAi表达载体p1300‑Ca4E3。本申请同时提供了一种较为快捷、操作较为简便的RNAi载体沉默效果的检测方法。所提供检测方法中，不需常规转基因转化育种制备过程，且可规避原生质体制备困难的缺陷，因而可大幅缩短检测时限，具有较好实用性。

Description

木薯eIF4E3基因RNAi载体沉默效果的检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种针对靶标木薯eIF4E3基因的RNAi载体的制备及针对该RNAi载体的较为快捷和简便的沉默效果的检测方法的专利申请。
背景技术
RNA沉默又称RNA干扰（RNAi），是指在真核生物中双链RNA专一的RNaseIII家族的核酸内切酶——Dicer或Dicer-like(简称DCL)剪切双链RNA或部分双链发夹结构产生20nt长度左右的siRNA（small interference RNA），然后形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，简称RISCs)，该复合体利用RNA序列匹配，专一地识别靶标基因，在转录水平、转录后水平或翻译水平抑制靶标基因表达的现象。RNAi普遍存在于大多数真核生物中，它可以阻断生物体内特定基因的表达，从而使细胞表现出特定基因缺失的表型，是一种在进化上高度保守的调节机制。RNAi在植物中，除了能调控其生长发育外，在植物抵抗病毒的入侵方面同样起着非常重要的作用。
RNAi技术因其高度专一性和作用迅速等特点而被广泛应用于基因功能研究。该技术可以基于非保守区设计RNAi，用于仅沉默其中的部分成员或单个成员，也可基于基因保守区的RNAi设计，可以沉默整个基因家族。因此，RNAi也可以作为多倍体植物调控基因表达和探究整个基因组基因功能研究的有效工具。
已有研究认为，在作物遗传育种中，发夹结构诱导的RNAi比反义RNA技术具有更好的沉默效果和稳定性。但由于植物转化工作不仅耗时长、而且对有些植物而言，转化难度较高，因此很有必要在用于转化植物之前鉴定所构建的RNAi载体是否能够有效的沉默靶标基因。
现有检测RNAi载体沉默效果的方法是：将所构建的RNAi载体先转化体系成熟的模式植物如拟南芥等或导入原生质体后再进行RT-PCR检测，以评价沉默效果。但即使是转化体系成熟的模式植物，转化获得转基因植物至少也需要3个月的时间，耗时显然较长；而利用原生质体检测沉默效果时，耗时虽然相对较短，但由于原生质体的制备相对困难，因而该检测方法也难以有效推广。基于上述缺陷，探索建立新的、较为快捷的、操作简便的RNAi载体沉默效果的检测方法就具有十分重要的应用意义。
发明内容
本发明目的提供一种针对靶标木薯eIF4E3基因的RNAi载体及提供一种针对该RNAi载体的快捷和操作简便的沉默效果的检测方法，同时也可为其他RNAi载体沉默效果的评价提供借鉴和参考。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种靶标木薯eIF4E3基因的RNAi载体，其制备过程为：首先构建含有反义插入片段的中间载体pRNAiCa4E3R，其次将正义插入片段定向插入中间载体pRNAiCa4E3R，获得含有发夹结构的中间载体pRNAiCa4E3，通过双酶切、回收含发夹结构的目的片段并将其定向插入表达载体pCAMBIA1300，获得RNAi表达载体p1300-Ca4E3；具体制备过程包括如下步骤：
（一）首先，构建中间载体pRNAiCa4E3R，具体为：
（1）干扰片段选择
登录网站sirna.wi.mit.edu，根据软件说明书对木薯eIF4E3（015501m）基因进行分析，选取eIF4E3基因的第305~494 bp为反义插入片段；
所述木薯eIF4E3基因序列如SEQ ID NO.1所示，
所述木薯eIF4E3基因的第305~494 bp的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；
（2）设计扩增反义插入片段Ca4E3R的引物
为便于定向克隆，在目的片段的5’端分别添加p18TRNAi酶切位点Eco RI和Cla I两侧的序列，具体引物序列为：
G-Ca4E3-305FE： 5’-AAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCCCTAGTCCCACTGATCTACATCTC-3’，
（其中5’端AAACAGCTATGACCATGATTACGAATTC部分序列为EcoRI酶切位点序列）G-Ca4E3-494RC：
5’-AAAAGAAGAAATAAATAATTTAAATATCGATAGTACTGCACCGCATATGTTATCAC-3’；
（其中5’端AAAAGAAGAAATAAATAATTTAAATATCGAT部分序列为Cla I酶切位点序列）
（3）PCR扩增
以pGBKT7-eIF4E3为模板，利用步骤（2）中所设计引物进行PCR扩增，获得反义插入片段Ca4E3R；
（4）构建中间载体pRNAiCa4E3R
利用Gibson Assembly技术，根据试剂盒说明书，将步骤（3）中所获得反义插入片段Ca4E3R与经EcoRI和ClaI双酶切后回收的p18TRNAi大片段进行连接，实现将Ca4E3R片段插入到p18TRNAi载体的目的，最终构建获得中间载体pRNAiCa4E3R（其中p表示质粒，RNAi表示该质粒来源于RNAi克隆载体p18TRNAi；Ca4E3R表示靶标木薯eIF4E3基因的反向插入片段）；
（二）其次，构建中间载体pRNAiCa4E3，具体为：
（1）干扰片段选择
登录网站sirna.wi.mit.edu，根据软件说明书对木薯eIF4E3（015501m）基因进行分析，选取eIF4E3基因第266~494 bp为正义插入片段；
所述木薯eIF4E3基因第266~494 bp的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；
（2）设计扩增正义插入片段Ca4E3的引物
为便于定向克隆，在目的片段的5’端分别添加上述（一）中构建的中间载体pRNAiCa4E3R的酶切位点BamHI和XhoI两侧的序列，具体引物序列为：
G-Ca4E3-266FB：
5’-TGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGATCCGGGTCTGCTATTGCCACTTGGCTC-3’，
（其中5’端TGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGATCC部分序列为BamHI酶切位点序列）
G-Ca4E3-494RX：
5’-TATGATATCATGCAGGTACGAGCGCTCGAGAGTACTGCACCGCATATGTTATCAC-3’；
（其中5’端TATGATATCATGCAGGTACGAGCGCTCGAG部分序列为XhoI酶切位点序列）
（3）PCR扩增
以pGBKT7-eIF4E3为模板，根据试剂盒说明书，利用步骤2中所设计引物进行PCR扩增，获得正义插入片段Ca4E3F；
（4）构建中间载体pRNAiCa4E3
利用Gibson Assembly技术，根据试剂盒说明书，将步骤3中所获得正义插入片段Ca4E3F与经BamHI和XhoI双酶切后回收的pRNAiCa4E3R大片段进行连接，实现将Ca4E3F片段插入到pRNAiCa4E3R载体的目的，最终构建获得含有发夹结构的中间载体pRNAiCa4E3（p表示质粒；RNAi表示该质粒来源于RNAi克隆载体p18TRNAi；Ca4E3表示含有靶标木薯eIF4E3基因的发夹结构）；
（三）构建RNAi载体p1300-Ca4E3，具体为：
将表达载体pCAMBIA1300与步骤（二）中所构建的中间载体pRNAiCa4E3分别进行BamHI和EcoRI的双酶切，分别回收酶切产物并对酶切产物进行连接，构建获得RNAi表达载体p1300-Ca4E3。
对所构建的RNAi表达载体p1300-Ca4E3沉默效果的检测方法，该方法基于本生烟瞬时表达系统构建而成，其主要技术思路为：首先分别构建靶标木薯eIF4E3基因的RNAi表达载体p1300-Ca4E3以及木薯eIF4E3基因的过量表达载体pAI-Ca4E3，然后利用农杆菌注射法将载体在本生烟叶片中表达，通过半定量RT-PCR比较分析过量表达载体pAI-Ca4E3单独注射或与RNAi表达载体p1300-Ca4E3共同注射的样品中eIF4E3基因的表达情况，判断和评价RNAi表达载体p1300-Ca4E3对靶标木薯eIF4E3基因的沉默效果，具体的操作步骤如下所述：
（一）首先，构建中间载体pRNAiCa4E3R，具体为：
（1）干扰片段选择
登录网站sirna.wi.mit.edu，根据软件说明书对木薯eIF4E3（015501m）基因进行分析，选取eIF4E3基因的第305~494 bp为反义插入片段；
（2）设计扩增反义插入片段Ca4E3R的引物
为便于定向克隆，在目的片段的5’端分别添加p18TRNAi酶切位点Eco RI和Cla I两侧的序列，具体引物序列为：
G-Ca4E3-305FE： 5’-AAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCCCTAGTCCCACTGATCTACATCTC-3’，
（其中5’端AAACAGCTATGACCATGATTACGAATTC部分序列为EcoRI酶切位点序列）G-Ca4E3-494RC：
5’-AAAAGAAGAAATAAATAATTTAAATATCGATAGTACTGCACCGCATATGTTATCAC-3’；
（其中5’端AAAAGAAGAAATAAATAATTTAAATATCGAT部分序列为Cla I酶切位点序列）
（3）PCR扩增
以pGBKT7-eIF4E3为模板，利用步骤（2）中所设计引物进行PCR扩增，获得反义插入片段Ca4E3R；
（4）构建中间载体pRNAiCa4E3R
利用Gibson Assembly技术，根据试剂盒说明书，将步骤（3）中所获得反义插入片段Ca4E3R与经EcoRI和ClaI双酶切后回收的p18TRNAi大片段进行连接，实现将Ca4E3R片段插入到p18TRNAi载体的目的，最终构建获得中间载体pRNAiCa4E3R（其中p表示质粒，RNAi表示该质粒来源于RNAi克隆载体p18TRNAi；Ca4E3R表示靶标木薯eIF4E3基因的反向插入片段）；
（二）其次，构建中间载体pRNAiCa4E3，具体为：
（1）干扰片段选择
登录网站sirna.wi.mit.edu，根据软件说明书对木薯eIF4E3（015501m）基因进行分析，选取eIF4E3基因第266~494 bp为正义插入片段；
（2）设计扩增正义插入片段Ca4E3的引物
为便于定向克隆，在目的片段的5’端分别添加上述（一）中构建的中间载体pRNAiCa4E3R的酶切位点BamHI和XhoI两侧的序列，具体引物序列为：
G-Ca4E3-266FB：
5’-TGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGATCCGGGTCTGCTATTGCCACTTGGCTC-3’，
（其中5’端TGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGATCC部分序列为BamHI酶切位点序列）
G-Ca4E3-494RX：
5’-TATGATATCATGCAGGTACGAGCGCTCGAGAGTACTGCACCGCATATGTTATCAC-3’；
（其中5’端TATGATATCATGCAGGTACGAGCGCTCGAG部分序列为XhoI酶切位点序列）
（3）PCR扩增
以pGBKT7-eIF4E3为模板，根据试剂盒说明书，利用步骤2中所设计引物进行PCR扩增，获得正义插入片段Ca4E3F；
（4）构建中间载体pRNAiCa4E3
利用Gibson Assembly技术，根据试剂盒说明书，将步骤3中所获得正义插入片段Ca4E3F与经BamHI和XhoI双酶切后回收的pRNAiCa4E3R大片段进行连接，实现将Ca4E3F片段插入到pRNAiCa4E3R载体的目的，最终构建获得含有发夹结构的中间载体pRNAiCa4E3（p表示质粒；RNAi表示该质粒来源于RNAi克隆载体p18TRNAi；Ca4E3表示含有靶标木薯eIF4E3基因的发夹结构）；
（三）构建RNAi载体p1300-Ca4E3，具体为：
将表达载体pCAMBIA1300与步骤（二）中所构建的中间载体pRNAiCa4E3分别进行BamHI和EcoRI的双酶切，分别回收酶切产物并对酶切产物进行连接，构建获得RNAi表达载体p1300-Ca4E3；
（四）构建过量表达载体pAI-Ca4E3，具体为：
（1）设计扩增eIF4E3基因的引物，在目的片段的5’端分别添加载体pAI-sGFP的XhoI和XbaI酶切序列片段，具体引物设计为：
G-Ca4E3-1FX：
5’-ATTTCATTTGGAGAGGACCTCGAGATGGAGATCACTGAGAAGAAGG-3’，
（其中5’端ATTTCATTTGGAGAGGACCTCGAG部分序列为XhoI酶切位点）
G-Ca4E3-687RX：
5’-CTGGTGATTTTTGCGGACTCTAGATTATCCTCTCAACCATGTGTTTCT-3’；
（其中5’端CTGGTGATTTTTGCGGACTCTAGA部分序列为XbaI酶切位点）
（2）PCR扩增，以pGBKT7-eIF4E3为模板，利用步骤1中所设计引物进行PCR扩增，获得eIF4E3基因序列；
（3）构建载体pAI-Ca4E3，利用Gibson Assembly技术，根据试剂盒说明书，将步骤（2）中所获得PCR扩增产物（即eIF4E3基因序列）与经XbaI和 XhoI双酶切并回收的pAI-sGFP的产物进行连接，从而构建获得过量表达载体pAI-Ca4E3 ；
（五）转化农杆菌，并进行瞬时表达，具体为：
利用液氮冻融法，将步骤（三）、步骤（四）中所构建的RNAi载体p1300-Ca4E3、过量表达载体pAI-Ca4E3分别转化农杆菌EHA105，并筛选、鉴定获得正确的转化菌株；
利用农杆菌注射法，将鉴定正确的分别含有p1300-Ca4E3和pAI-Ca4E3的农杆菌菌液共同注射本生烟烟叶，以进行共表达；
同时以单独注射含有pAI-Ca4E3农杆菌菌液的本生烟烟叶作为空白对照，以同时注射射含有pAI-Ca4E3农杆菌和含GFP的表达载体pCAMBIA1300的农杆菌的本生烟烟叶作为阳性对照；
（六）半定量RT-PCR检测RNAi表达载体p1300-Ca4E3的沉默效果进行评价，具体为：
（1） 收集步骤（五）中农杆菌注射4天后本生烟叶叶片，提取叶片总RNA；
（2）将步骤1中所提取RNA反转录获得cDNA第一链，并将所得cDNA进行3倍梯度稀释作为半定量PCR扩增时模板应用；
（3）以NbActin基因为内参基因，利用如下引物进行PCR扩增，引物序列如下：
NbACT-247F：5’-CAGCCACACTGTCCCAATTTATGAG-3’，
NbACT-780R：5’-CTACCTTAATCTTCATGCTGCTTGGA-3’；
（4）取步骤3中Actin扩增大致一致的样品，利用如下引物序列进行eIF4E3基因PCR扩增，引物序列如下：
Ca4E3-1F：5’-ATGGAGATCACTGAGAAGAAGG-3’，
Ca4E3-290R：5’-CGAGCCAAGTGGCAATAGCA-3’；
如果RNAi载体能有效的沉默靶标eIF4E3基因，那么过量表达载体pAI-Ca4E3与RNAi表达载体p1300-Ca4E3共同注射后样品中的eIF4E3基因表达量要比单独注射过量表达载体pAI-Ca4E3的样品低得多；即，根据半定量RT-PCR结果，通过比较分析样品中eIF4E3基因的mRNA水平，就能快速检测所构建的RNAi载体是否能有效沉默靶标基因。
木薯等植物的原生体制备和转基因操作等，由于其操作技术要求相对较高、难度较大，且工作量大，耗时长，因而针对这类植物体的基因沉默效果检测时，如果沿用现有基因沉默检测方法时，其操作可行性显然较低。本发明所提供的针对木薯eIF4E3基因的沉默效果的检测方法，其通过常规干扰载体p1300-Ca4E3及过表达载体pAI-Ca4E3的构建，并将载体共表达于本生烟瞬时表达系统，进一步通过半定量RT-PCR的检测，即可判定干扰载体对特定基因的沉默效果，从而可以大幅缩短检测时间。
总体而言，本申请通过提供靶标木薯eIF4E3基因的RNAi载体并通过对该载体沉默效果的检测，提供了一种较为快捷、操作较为简便的RNAi载体沉默效果的检测方法，同时也可为其他RNAi载体沉默效果的评价提供借鉴和参考。所提供检测方法中，由于不需常规转基因转化育种制备过程，且可规避原生质体制备困难的缺陷，因而可大幅缩短检测时限；同时由于相关转基因操作技术较为成熟，操作较为简便且经济性较好，因而使得本发明所提供检测方法具有较好实用性，同时也为本领域中其他类似基因沉默效果检测提供较好的参考和借鉴。
附图说明
图1为构建干扰载体p1300-Ca4E3过程中部分PCR扩增产物电泳图及鉴定图，其中1．干扰片段Ca4E3R的PCR扩增；2. 中间载体pRNAiCa4E3R的PCR鉴定；3. 干扰片段Ca4E3F的PCR扩增；4. 中间载体pRNAiCa4E3 的PCR鉴定；5. 干扰载体p1300-Ca4E3的PCR鉴定；6.含载体p1300-Ca4E3的农杆菌EHA105的PCR鉴定；M. DL 2000 DNA Marker；
图2为干扰载体p1300Ca4E3构建相关EcoRI和BamHI双酶切鉴定结果，其中1. 载体p18TRNAi；2. 中间载体pRNAiCa4E3R；3. 中间载体pRNAiCa4E3；4. 干扰载体p1300Ca4E3；5.载体pCAMBIA1300；M. DL 15000 DNA Marker；
图3 为过量表达载体pAI-Ca4E3 构建相关PCR扩增与鉴定结果，其中1. 目的片段eIF4E3 PCR扩增；2. 过量表达载体pAI-Ca4E3 PCR鉴定；3. 含载体pAI-Ca4E3的农杆菌EHA105 PCR鉴定；M. DL 2000 DNA Marker；
图4为过量表达载体pAI-Ca4E3 XhoI和XbaI双酶切鉴定结果，其中1. 干扰载体pAI-Ca4E3；2. 载体pAI-TCV；M. DL 15000 DNA Marker；
图5为半定量RT-PCR分析本生烟瞬时表达木薯eIF4E3基因，其中1. 过量表达载体pAI-Ca4E3与干扰载体p1300Ca4E3共同注射；2. 过量表达载体pAI-Ca4E3单独注射；3. 过量表达载体pAI-Ca4E3与表达载体pCAMBIA1300共同注射。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分所涉及部分生物材料、实验试剂等情况简要介绍如下：
克隆载体p18TRNAi的原始形式为大连宝生物公司克隆载体pMD18-T；
表达载体pCAMBIA1300购自BioVector NTCC保藏中心；
pAI-sGFP为pCAMBIA1300经改造去除潮霉素筛选标记后的载体；
相关基因测序及引物序列合成均由上海生物工程技术服务有限公司进行；
本生烟在26~28℃的培养室内光照培养，每日光照时长12 h，光照强度为1500 lx；
EcoRI、BamHI等限制性内切酶，连接酶等关键试剂均购自宝生物（大连）有限公司。
实施例1
由于靶标木薯eIF4E3基因的RNAi表达载体p1300-Ca4E3的构建是本申请较为核心技术部分内容，因而本实施例就该载体的构建过程简要介绍如下。
靶标木薯eIF4E3基因的RNAi载体p1300-Ca4E3，其制备过程为：首先构建含有反义插入片段的中间载体pRNAiCa4E3R，其次将正义插入片段定向插入中间载体pRNAiCa4E3R，获得含有发夹结构的中间载体pRNAiCa4E3，通过双酶切、回收含发夹结构的目的片段并将其定向插入表达载体pCAMBIA1300，获得RNAi表达载体p1300-Ca4E3；具体制备过程详述如下。
（一）首先，构建中间载体pRNAiCa4E3R，具体为：
（1）干扰片段选择
登录网站sirna.wi.mit.edu，根据软件说明书对木薯eIF4E3（015501m）基因进行分析，选取eIF4E3基因的第305~494 bp为反义插入片段。
（2）设计扩增反义插入片段Ca4E3R的引物
为便于定向克隆，在目的片段的5’端分别添加p18TRNAi酶切位点Eco RI和Cla I两侧的序列，具体引物序列为：
G-Ca4E3-305FE： 5’-AAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCCCTAGTCCCACTGATCTACATCTC-3’，
（其中5’端AAACAGCTATGACCATGATTACGAATTC部分序列为EcoRI酶切位点序列）G-Ca4E3-494RC：
5’-AAAAGAAGAAATAAATAATTTAAATATCGATAGTACTGCACCGCATATGTTATCAC-3’；
（其中5’端AAAAGAAGAAATAAATAATTTAAATATCGAT部分序列为Cla I酶切位点序列）。
（3）PCR扩增
以pGBKT7-eIF4E3为模板，利用步骤（2）中所设计引物进行PCR扩增（采用美国赛默飞世尔Arktik 多功能PCR仪），获得反义插入片段Ca4E3R；
PCR扩增时50μL扩增体系设计如下：
10 X Pfu Buffer，5μL；
dNTP Mix (2.5 each)，5μL；
引物G-Ca4E3-305FE，10μM、1μL；
引物Ca4E3-494RC，10μM、1μL；
Pfu，2.5U/μL、1.0μL；
pGBKT7-eIF4E3，1μL；
ddH2O加至50μL；
PCR反应程序为，98℃、3min；98℃、30s，58℃、30s，72℃、30s，30个循环；72℃、5min。
对扩增产物进行电泳分析，结果如图1中泳道1所示。扩增目标片段长度为191bp，从图1中电泳结果来看，所扩增片段长度符合预期。
（4）构建中间载体pRNAiCa4E3R
利用Gibson Assembly技术，根据试剂盒说明书，将步骤（3）中所获得反义插入片段Ca4E3R与经EcoRI和ClaI双酶切后回收的p18TRNAi大片段进行连接，实现将Ca4E3R片段插入到p18TRNAi载体的目的，经Amp+（氨苄西林阳性，100mg/L）筛选，最终构建获得中间载体pRNAiCa4E3R（其中p表示质粒，RNAi表示该质粒来源于RNAi克隆载体p18TRNAi；Ca4E3R表示靶标木薯eIF4E3基因的反向插入片段）。
利用上述步骤（2）中的引物G-Ca4E3-305FE和G-Ca4E3-494RC，对筛选所获得的中间载体pRNAiCa4E3R的阳性克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定体系设计如下：
2X PCR Mix，25μL；
引物G-Ca4E3-305FE，10μM、1μL；
引物Ca4E3-494RC，10μM、1μL；
菌落稀释液，1μL；
ddH2O加至50μL；
PCR反应程序为，95℃、3min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，30个循环；72℃、5min。
对PCR产物进行电泳鉴定，结果如图1中泳道2所示。从图中可以看出，扩增片段与目的片段Ca4E3R的长度大小一致，初步表明筛选所获得载体中含有Ca4E3R片段。
进一步对筛选所得载体利用EcoRI和BamHI进行双酶切鉴定，酶切体系及条件如下：
10 x Buffer K，2μL；
EcoRI，1μL；
BamHI，1μL；
待鉴定质粒，1μg；
ddH2O加至50μL；
37℃温浴2小时。
对酶切产物进行电泳，结果如图2泳道2所示。从图中可以看出，获得了与预期一致的、小于500bp的片段。
更进一步的测序结果表明，PCR扩增的Ca4E3R基因片段正确重组进入p18TRNAi载体中，表明：中间载体pRNAiCa4E3R构建成功，可以用于下一步实验。
（二）其次，构建中间载体pRNAiCa4E3，具体为：
（1）干扰片段选择
登录网站sirna.wi.mit.edu，根据软件说明书对木薯eIF4E3（015501m）基因进行分析，选取eIF4E3基因第266~494 bp为正义插入片段。
（2）设计扩增正义插入片段Ca4E3的引物
为便于定向克隆，在目的片段的5’端分别添加上述（一）中构建的中间载体pRNAiCa4E3R的酶切位点BamHI和XhoI两侧的序列，具体引物序列为：
G-Ca4E3-266FB：
5’-TGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGATCCGGGTCTGCTATTGCCACTTGGCTC-3’，
（其中5’端TGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGATCC部分序列为BamHI酶切位点序列）
G-Ca4E3-494RX：
5’-TATGATATCATGCAGGTACGAGCGCTCGAGAGTACTGCACCGCATATGTTATCAC-3’；
（其中5’端TATGATATCATGCAGGTACGAGCGCTCGAG部分序列为XhoI酶切位点序列）。
（3）PCR扩增
以pGBKT7-eIF4E3为模板，根据试剂盒说明书，利用步骤2中所设计引物进行PCR扩增，获得正义插入片段Ca4E3F；
扩增体系及PCR反应程序参考前述中间载体pRNAiCa4E3R构建过程中反义插入片段Ca4E3R的制备过程即可。
对扩增产物进行电泳分析，结果如图1中泳道3所示。扩增目标片段长度为229bp，从图1中电泳结果来看，所扩增片段长度符合预期。
（4）构建中间载体pRNAiCa4E3
利用Gibson Assembly技术，根据试剂盒说明书，将步骤3中所获得正义插入片段Ca4E3F与经BamHI和XhoI双酶切后回收的pRNAiCa4E3R大片段进行连接，实现将Ca4E3F片段插入到pRNAiCa4E3R载体的目的，经Amp+（氨苄西林阳性，100mg/L）筛选，最终构建获得含有发夹结构的中间载体pRNAiCa4E3（p表示质粒；RNAi表示该质粒来源于RNAi克隆载体p18TRNAi；Ca4E3表示含有靶标木薯eIF4E3基因的发夹结构）。
利用上述步骤（2）中所设计G-Ca4E3-266FB和G-Ca4E3-494RX引物，对筛选所获得的中间载体pRNAiCa4E3的阳性克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定体系及PCR反应程序参考上述中间载体pRNAiCa4E3R中菌落PCR鉴定过程即可。
对PCR产物进行电泳鉴定，结果如图1中泳道4所示。从图中可以看出，扩增片段与目的片段Ca4E3F的长度大小一致，初步表明筛选所获得载体中含有Ca4E3F片段。
进一步对筛选所得载体利用EcoRI和BamHI进行双酶切鉴定，酶切体系设计如下：
10 x Buffer K，2μL；
EcoRI，1μL；
BamHI，1μL；
待鉴定质粒，1μg；
ddH2O加至50μL；
37℃温浴2小时。
对酶切产物进行电泳，结果如图2泳道3所示。从图中可以看出，获得了与预期一致的、小于500bp的片段。
更进一步的测序结果表明，PCR扩增的Ca4E3基因片段正确重组进入载体基因组中，表明：中间载体pRNAiCa4E3构建成功，可以用于下一步实验。
（三）构建RNAi载体p1300-Ca4E3，具体为：
将表达载体pCAMBIA1300与步骤（二）中所构建的中间载体pRNAiCa4E3分别进行BamHI和EcoRI的双酶切，分别回收酶切产物并对酶切产物进行连接，进行大肠杆菌转化，并进行Kan+（卡那霉素阳性，50mg/L）筛选，获得阳性克隆，鉴定获得构建正确的RNAi表达载体p1300-Ca4E3。
酶切时，50μL酶切体系设计如下：
10 X Buffer K，5μL；
BamHI，2.5μL；
EcoRI，2.5μL；
pCAMBIA1300（或pRNAiCa4E3），2μg；
ddH2O加至50μL；
37℃温浴2小时。
酶切结束后，回收酶切产物中表达载体pCAMBIA1300的大片段及中间载体pRNAiCa4E3的小片段，利用连接酶进行连接，10μL酶切体系设计如下：
10 X Ligase Buffer，1μL；
Ligase（连接酶），1μL；
pCAMBIA1300酶切产物，100~200 ng；
pRNAiCa4E3酶切产物，100~200 ng；
ddH2O 加至10μL；
16℃连接过夜。
转化结束后，挑取阳性克隆菌株，利用上述步骤（2）中所设计G-Ca4E3-266FB和G-Ca4E3-494RX引物，对筛选所获得的RNAi表达载体p1300-Ca4E3阳性克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定体系及PCR反应程序参考上述中间载体pRNAiCa4E3R中菌落PCR鉴定过程即可。
对PCR产物进行电泳鉴定，结果如图1中泳道5所示。从图中可以看出，扩增片段与目的片段Ca4E3F的长度大小一致，初步表明筛选所获得载体中含有Ca4E3F片段。
进一步对筛选所得RNAi载体p1300-Ca4E3利用EcoRI和BamHI进行双酶切鉴定，
10 x Buffer K，2μL；
EcoRI，1μL；
BamHI，1μL；
待鉴定质粒，1μg；
ddH2O加至50μL；
37℃温浴2小时。
对酶切产物进行电泳，结果如图2泳道4所示。对图2中泳道4分别与泳道3、5进行对比可以看出，双酶切后，可获得比sGFP小，但与pRNAiCa4E3一致的大约500 bp的片段产物。
综合上述菌落PCR鉴定及酶切鉴定结果，可以认为成功构建获得了RNAi载体p1300-Ca4E3。
实施例2
对实施例1所构建的RNAi表达载体p1300-Ca4E3沉默效果进行检测，其主要技术思路为：首先分别构建靶标木薯eIF4E3基因的RNAi表达载体p1300-Ca4E3以及木薯eIF4E3基因的过量表达载体pAI-Ca4E3，然后利用农杆菌注射法将载体在本生烟叶片中表达，通过半定量RT-PCR比较分析过量表达载体pAI-Ca4E3单独注射或与RNAi表达载体p1300-Ca4E3共同注射的样品中eIF4E3基因的表达情况，判断和评价RNAi表达载体p1300-Ca4E3对靶标木薯eIF4E3基因的沉默效果，具体的操作步骤介绍如下。
（一）构建RNAi表达载体p1300-Ca4E3，相关过程在实施例1中有详细介绍，不再重复。
（二）构建过量表达载体pAI-Ca4E3，具体为：
（1）设计扩增eIF4E3基因的引物，在目的片段的5’端分别添加载体pAI-sGFP的XhoI和XbaI酶切序列片段，具体引物设计为：
G-Ca4E3-1FX：
5’-ATTTCATTTGGAGAGGACCTCGAGATGGAGATCACTGAGAAGAAGG-3’，
（其中5’端ATTTCATTTGGAGAGGACCTCGAG部分序列为XhoI酶切位点）
G-Ca4E3-687RX：
5’-CTGGTGATTTTTGCGGACTCTAGATTATCCTCTCAACCATGTGTTTCT-3’；
（其中5’端CTGGTGATTTTTGCGGACTCTAGA部分序列为XbaI酶切位点）。
（2）PCR扩增，以pGBKT7-eIF4E3为模板，利用步骤1中所设计引物进行PCR扩增，获得eIF4E3基因序列；
PCR扩增体系及PCR反应程序参考实施例1中设置即可。
对扩增产物进行电泳检测，结果如图3泳道1所示。从图中可以看出，扩增片段与目的片段的735bp长度大小一致，扩增片段长度符合预期。
（3）构建载体pAI-Ca4E3，利用Gibson Assembly技术，根据试剂盒说明书，将步骤（2）中所获得PCR扩增产物（即eIF4E3基因序列）与经XbaI和 XhoI双酶切并回收的pAI-sGFP的产物进行连接，转化，进行Kan+（卡那霉素阳性，50mg/L）筛选，获得阳性克隆，最终鉴定获得构建正确的过量表达载体pAI-Ca4E3。
对筛选所获得的阳性克隆，利用上述步骤（2）中所设计的G-Ca4E3-1FX和G-Ca4E3-687RX为引物，进行菌落PCR鉴定。鉴定体系及PCR反应程序参考实施例1设置即可。
鉴定结果如图3泳道2所示，表明所扩增条带与目的片段eIF4E3（图3泳道1）大小一致，即，初步证明目的基因整合进入载体中。
进一步地，以XbaI和 XhoI对所构建pAI-Ca4E3载体进行双酶切鉴定。结果表明，切下的片段比pAI-sGFP切下小，与预期大小一致（比较图4泳道1与泳道2）。
上述鉴定结果表明，eIF4E3基因过量表达载体pAI-Ca4E3构建成功（其中p表示质粒，AI表示该质粒来源于植物表达载体pAI-sGFP；Ca4E3表示靶标木薯eIF4E3基因的发夹结构）。
（三）转化农杆菌，并进行瞬时表达，具体为：
利用液氮冻融法，将步骤（三）、步骤（四）中所构建的RNAi载体p1300-Ca4E3、过量表达载体pAI-Ca4E3分别转化农杆菌EHA105，并添加Kan+（卡那霉素阳性，50mg/L）、Rif+（利福平，50mg/L）和 Str+（链霉素，50mg/L）三种抗生素的平板进行筛选，获得阳性克隆，并进一步鉴定，获得正确的转化菌株。
鉴定时，采用菌落PCR鉴定方式进行鉴定，反应体系及PCR鉴定条件参考实施例1即可。
对含有RNAi载体p1300-Ca4E3的转化菌株的菌落PCR鉴定（引物采用G-Ca4E3-266FB和G-Ca4E3-494RX），结果如图1泳道6所示。从图中可以看出，扩增条带与目的片段Ca4E3F（图1泳道3）大小一致，说明p1300-Ca4E3已成功转入到农杆菌，形成了工程菌，可用于本生烟瞬时表达。
对含有过量表达载体pAI-Ca4E3的转化菌株的菌落PCR鉴定（引物采用G-Ca4E3-1FX和G-Ca4E3-687RX），结果如图3泳道8所示。从图中可以看出，扩增条带与目的片段eIF4E3（图3泳道1）大小一致，说明pAI-Ca4E3已成功转入到农杆菌，形成了工程菌，可用于本生烟瞬时表达。
利用农杆菌注射法，将鉴定正确的分别含有p1300-Ca4E3和pAI-Ca4E3的农杆菌菌液共同注射7叶龄本生烟烟叶（大约移栽后4周可达7叶龄，培养温度为28℃，12小时光照培养），以进行共表达；
同时以单独注射含有pAI-Ca4E3农杆菌菌液的本生烟烟叶作为空白对照，以同时注射射含有pAI-Ca4E3农杆菌和含GFP的表达载体pCAMBIA1300的农杆菌的本生烟烟叶作为阳性对照；
注射后28 ℃、12小时光照培养。
注射时，注射液制备步骤具体如下：
（1）把含有载体的农杆菌菌株分别接种于同时含Rif + （50μg/mL）和Kan+ （50μg/mL）的LB平板上，28℃培养48~36h；
（2）收集LB板上的阳性克隆，悬浮于5mL同时含Kan+ （50μg/mL）和Rif + （50μg/mL）的LB液体培养基中，28℃、180rpm震荡培养12~16h；
（3）将步骤（2）中菌液按照1:50的体积比例接入到同时含Kan+ （50μg/mL）和Rif +（50μg/mL）的LB溶液中，同时加入终浓度为10 mmol/L MES（pH 8.2）、150μmol/L AS，28℃、180rpm震荡培养，使菌液浓度至OD600=0.8~1.0左右；
（4）将步骤（3）中菌液25℃、5000rpm离心15min，收集菌体；用终浓度为10mmol/LMgCl2、10mmol/L MES（pH 8.2）和150μmol/L AS的水溶液重悬菌体沉淀；室温静止放置3~5h后作为本生烟叶片注射用注射液体。
（四）半定量RT-PCR检测RNAi表达载体p1300-Ca4E3的沉默效果进行评价，具体为：
（1） 收集步骤（五）中农杆菌注射4天后本生烟叶叶片，提取叶片总RNA；
（2）将步骤1中所提取RNA反转录获得cDNA第一链，并将所得cDNA进行3倍梯度稀释作为半定量PCR扩增时模板应用；
（3）以NbActin基因为内参基因，利用如下引物进行PCR扩增，引物序列如下：
NbACT-247F：5’-CAGCCACACTGTCCCAATTTATGAG-3’，
NbACT-780R：5’-CTACCTTAATCTTCATGCTGCTTGGA-3’；
（4）取步骤3中Actin扩增大致一致的样品，利用如下引物序列进行eIF4E3基因PCR扩增，引物序列如下：
Ca4E3-1F：5’-ATGGAGATCACTGAGAAGAAGG-3’，
Ca4E3-290R：5’-CGAGCCAAGTGGCAATAGCA-3’；
根据PCR扩增情况，判定eIF4E3基因的mRNA转录水平，并据此判定RNAi载体对目标基因的沉默效果；具体判定原则为：
如果RNAi载体能有效的沉默靶标eIF4E3基因，那么过量表达载体pAI-Ca4E3与RNAi表达载体p1300-Ca4E3共同注射后样品中的eIF4E3基因表达量要比单独注射过量表达载体pAI-Ca4E3的样品低得多。
PCR结果如图5所示。
在采用本生烟NbActin基因为内标，调整样品cDNA浓度基本一致的情况下（比较图5下图的所有样品），过量表达载体pAI-Ca4E3单独注射或与表达载体pCAMBIA1300共同注射的样品木薯eIF4E3基因的表达量都很高，并且表达量基本一致，说明与所制备的干扰载体仅插入片段不同的表达载体pCAMBIA1300对过量表达载体pAI-Ca4E3中eIF4E3基因表达没有影响；然而过量表达载体pAI-Ca4E3与所制备的RNAi载体p1300-Ca4E3 共同注射的样品仅检测到微量的木薯eIF4E3基因，说明木薯该基因已被有效的沉默。
由于RNAi载体p1300-Ca4E3与表达载体pCAMBIA1300的区别仅在于插入片段分别为靶标木薯eIF4E3基因的发夹结构和sGFP基因，因此发挥沉默作用的是靶标木薯eIF4E3基因的发夹结构，说明所制备的RNAi载体p1300-Ca4E3能有效的沉默靶标基因，并且利用本生烟瞬时表达系统能快速检测RNAi载体的沉默效果。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120> 木薯eIF4E3基因RNAi载体沉默效果的检测方法
<130> none
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 687
<212> DNA
<213> Manihot esculenta
<400> 1
atggagatca ctgagaagaa ggatacagag aacaacacaa acaacagcaa taataatgct 60
caaacgacat tggattcagc atcacttgag aacatagaca aagaagccga agaacgccaa 120
gcacgcgacc tcaaagctgg gttgcatcct ctcaagcaca agtttgtatt ttggtacact 180
cgccgaacac caggagttcg aacacaaact tcatatgagg ataatataaa gaaaattgtg 240
gagttcagta cagttgaagg cttttgggtc tgctattgcc acttggctcg gccttcatct 300
ttgcctagtc ccactgatct acatctcttc aaggagggaa tccgtcctct atgggaggat 360
tctgcaaact ccaatggagg caagtggata atacgattca aaaaagttgt ctctggtcgc 420
ttttgggagg acatggtgct tgccttagtg ggtgaccaac ttgattatgg tgataacata 480
tgcggtgcag tactaagcat tcgttttaat gaagatatac tgagtgtttg gaatcgtaat 540
tcctctgatc atcaggctgt gatggctcta agggattcga tcaaaaggca cttaaagctt 600
ccccacagct acgttatgga atacaagccc catgatgcgt ctttgcgtga caactcatca 660
tatagaaaca catggttgag aggataa 687
<210> 2
<211> 191
<212> DNA
<213> Manihot esculenta
<400> 2
cctagtccca ctgatctaca tctcttcaag gagggaatcc gtcctctatg ggaggattct 60
gcaaactcca atggaggcaa gtggataata cgattcaaaa aagttgtctc tggtcgcttt 120
tgggaggaca tggtgcttgc cttagtgggt gaccaacttg attatggtga taacatatgc 180
ggtgcagtac t 191
<210> 3
<211> 229
<212> DNA
<213> Manihot esculenta
<400> 3
gggtctgcta ttgccacttg gctcggcctt catctttgcc tagtcccact gatctacatc 60
tcttcaagga gggaatccgt cctctatggg aggattctgc aaactccaat ggaggcaagt 120
ggataatacg attcaaaaaa gttgtctctg gtcgcttttg ggaggacatg gtgcttgcct 180
tagtgggtga ccaacttgat tatggtgata acatatgcgg tgcagtact 229

Claims (2)

1.一种靶标木薯eIF4E3基因的RNAi载体，其特征在于，该载体通过如下步骤制备而成：
（一）首先，构建中间载体pRNAiCa4E3R，具体为：
（1）干扰片段选择
选取木薯eIF4E3基因的第305~494 bp为反义插入片段；
所述木薯eIF4E3基因序列如SEQ ID NO.1所示，
所述木薯eIF4E3基因的第305~494 bp的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；
（2）设计扩增反义插入片段Ca4E3R的引物
具体引物序列为：
G-Ca4E3-305FE： 5’-AAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCCCTAGTCCCACTGATCTACATCTC-3’，
G-Ca4E3-494RC：
5’-AAAAGAAGAAATAAATAATTTAAATATCGATAGTACTGCACCGCATATGTTATCAC-3’；
（3）PCR扩增
以pGBKT7-eIF4E3为模板，利用步骤（2）中所设计引物进行PCR扩增，获得反义插入片段Ca4E3R；
（4）构建中间载体pRNAiCa4E3R
利用Gibson Assembly技术，将步骤（3）中所获得反义插入片段Ca4E3R与p18TRNAi进行连接，实现将Ca4E3R片段插入到p18TRNAi载体的目的，最终构建获得中间载体pRNAiCa4E3R；
（二）其次，构建中间载体pRNAiCa4E3，具体为：
（1）干扰片段选择
选取木薯eIF4E3基因第266~494 bp为正义插入片段；
所述木薯eIF4E3基因第266~494 bp的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；
（2）设计扩增正义插入片段Ca4E3的引物
具体引物序列为：
G-Ca4E3-266FB：
5’-TGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGATCCGGGTCTGCTATTGCCACTTGGCTC-3’，
G-Ca4E3-494RX：
5’-TATGATATCATGCAGGTACGAGCGCTCGAGAGTACTGCACCGCATATGTTATCAC-3’；
（3）PCR扩增
以pGBKT7-eIF4E3为模板，利用步骤（2）中所设计引物进行PCR扩增，获得正义插入片段Ca4E3F；
（4）构建中间载体pRNAiCa4E3
利用Gibson Assembly技术，将步骤（3）中所获得正义插入片段Ca4E3F与pRNAiCa4E3R进行连接，实现将Ca4E3F片段插入到pRNAiCa4E3R载体的目的，最终构建获得含有发夹结构的中间载体pRNAiCa4E3；
（三）构建RNAi载体p1300-Ca4E3，具体为：
将表达载体pCAMBIA1300与步骤（二）中所构建的中间载体pRNAiCa4E3进行酶切并连接，构建获得RNAi表达载体p1300-Ca4E3。
2.对权利要求1所构建靶标木薯eIF4E3基因的RNAi载体沉默效果的检测方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤：
（一）首先，构建中间载体pRNAiCa4E3R，具体为：
（1）干扰片段选择
选取木薯eIF4E3基因的第305~494 bp为反义插入片段；
所述木薯eIF4E3基因序列如SEQ ID NO.1所示，
所述木薯eIF4E3基因的第305~494 bp的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；
（2）设计扩增反义插入片段Ca4E3R的引物
具体引物序列为：
G-Ca4E3-305FE： 5’-AAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCCCTAGTCCCACTGATCTACATCTC-3’，
G-Ca4E3-494RC：
5’-AAAAGAAGAAATAAATAATTTAAATATCGATAGTACTGCACCGCATATGTTATCAC-3’；
（3）PCR扩增
以pGBKT7-eIF4E3为模板，利用步骤（2）中所设计引物进行PCR扩增，获得反义插入片段Ca4E3R；
（4）构建中间载体pRNAiCa4E3R
利用Gibson Assembly技术，将步骤（3）中所获得反义插入片段Ca4E3R与p18TRNAi进行连接，实现将Ca4E3R片段插入到p18TRNAi载体的目的，最终构建获得中间载体pRNAiCa4E3R；
（二）其次，构建中间载体pRNAiCa4E3，具体为：
（1）干扰片段选择
选取木薯eIF4E3基因第266~494 bp为正义插入片段；
所述木薯eIF4E3基因第266~494 bp的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；
（2）设计扩增正义插入片段Ca4E3的引物
具体引物序列为：
G-Ca4E3-266FB：
5’-TGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGATCCGGGTCTGCTATTGCCACTTGGCTC-3’，
G-Ca4E3-494RX：
5’-TATGATATCATGCAGGTACGAGCGCTCGAGAGTACTGCACCGCATATGTTATCAC-3’；
（3）PCR扩增
以pGBKT7-eIF4E3为模板，利用步骤（2）中所设计引物进行PCR扩增，获得正义插入片段Ca4E3F；
（4）构建中间载体pRNAiCa4E3
利用Gibson Assembly技术，将步骤（3）中所获得正义插入片段Ca4E3F与pRNAiCa4E3R进行连接，实现将Ca4E3F片段插入到pRNAiCa4E3R载体的目的，最终构建获得含有发夹结构的中间载体pRNAiCa4E3；
（三）构建RNAi载体p1300-Ca4E3，具体为：
将表达载体pCAMBIA1300与步骤（二）中所构建的中间载体pRNAiCa4E3进行酶切并连接，构建获得RNAi表达载体p1300-Ca4E3；
（四）构建过量表达载体pAI-Ca4E3，具体为：
（1）设计扩增eIF4E3基因的引物，具体引物设计为：
G-Ca4E3-1FX：
5’-ATTTCATTTGGAGAGGACCTCGAGATGGAGATCACTGAGAAGAAGG-3’，
G-Ca4E3-687RX：
5’-CTGGTGATTTTTGCGGACTCTAGATTATCCTCTCAACCATGTGTTTCT-3’；
（2）PCR扩增，以pGBKT7-eIF4E3为模板，利用步骤（1）中所设计引物进行PCR扩增，获得eIF4E3基因序列；
（3）构建载体pAI-Ca4E3，利用Gibson Assembly技术，将步骤（2）中所获得PCR扩增产物与pAI-sGFP进行连接，从而构建获得过量表达载体pAI-Ca4E3；
（五）转化农杆菌，并进行瞬时表达，具体为：
利用液氮冻融法，将步骤（三）、步骤（四）中所构建的RNAi载体p1300-Ca4E3、过量表达载体pAI-Ca4E3分别转化农杆菌EHA105，并筛选、鉴定获得正确的转化菌株；
利用农杆菌注射法，将鉴定正确的分别含有p1300-Ca4E3和pAI-Ca4E3的农杆菌菌液共同注射本生烟烟叶，以进行共表达；
同时以单独注射含有pAI-Ca4E3农杆菌菌液的本生烟烟叶作为空白对照，以同时注射射含有pAI-Ca4E3农杆菌和含GFP的表达载体pCAMBIA1300的农杆菌的本生烟烟叶作为阳性对照；
（六）半定量RT-PCR检测RNAi表达载体p1300-Ca4E3的沉默效果进行评价，根据半定量RT-PCR结果，通过比较分析样品中eIF4E3基因的mRNA水平，快速检测所构建的RNAi载体是否能有效沉默靶标基因。
CN201610936028.5A 2016-10-25 2016-10-25 木薯eIF4E3基因RNAi载体沉默效果的检测方法 Expired - Fee Related CN106497967B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610936028.5A CN106497967B (zh) 2016-10-25 2016-10-25 木薯eIF4E3基因RNAi载体沉默效果的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610936028.5A CN106497967B (zh) 2016-10-25 2016-10-25 木薯eIF4E3基因RNAi载体沉默效果的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106497967A CN106497967A (zh) 2017-03-15
CN106497967B true CN106497967B (zh) 2019-09-13

Family

ID=58318994

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610936028.5A Expired - Fee Related CN106497967B (zh) 2016-10-25 2016-10-25 木薯eIF4E3基因RNAi载体沉默效果的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106497967B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11193124B2 (en) * 2016-11-15 2021-12-07 City University Of Hong Kong Small-interfering RNA expression systems for production of small-interfering RNAs and their use

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010135695A2 (en) * 2009-05-22 2010-11-25 Curna, Inc. TREATMENT OF TRANSCRIPTION FACTOR E3 (TFE3) and INSULIN RECEPTOR SUBSTRATE 2 (IRS2) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO TFE3
CN105039355A (zh) * 2015-09-09 2015-11-11 福建农林大学 利用RNAi沉默翻译起始因子基因培育抗花叶病甘蔗的方法
CN105039356A (zh) * 2015-09-09 2015-11-11 福建农林大学 利用RNAi沉默SceIF4E1基因培育抗条纹花叶病甘蔗的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010135695A2 (en) * 2009-05-22 2010-11-25 Curna, Inc. TREATMENT OF TRANSCRIPTION FACTOR E3 (TFE3) and INSULIN RECEPTOR SUBSTRATE 2 (IRS2) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO TFE3
CN105039355A (zh) * 2015-09-09 2015-11-11 福建农林大学 利用RNAi沉默翻译起始因子基因培育抗花叶病甘蔗的方法
CN105039356A (zh) * 2015-09-09 2015-11-11 福建农林大学 利用RNAi沉默SceIF4E1基因培育抗条纹花叶病甘蔗的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106497967A (zh) 2017-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2012264606B2 (en) Transcription terminator sequences
CN107278231A (zh) 真菌基因组修饰系统及使用方法
CN107446919B (zh) 一种恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒
CN109477115A (zh) 用于真核生物的表达系统
CN108610427A (zh) 飞蝗滞育激素基因及其在调控昆虫滞育中的应用
CN106497967B (zh) 木薯eIF4E3基因RNAi载体沉默效果的检测方法
CN101918578A (zh) 启动子检测及分析
CN102181482B (zh) 一种快速调控水稻内源miRNA活性的方法
CN108823222A (zh) 白背飞虱几丁质合成酶1（SfCHS1）基因片段及其dsRNA在害虫防治中的应用
CN105647973B (zh) 一种罗氏沼虾的雌雄性别调控方法
CN104745584B (zh) 一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的核酸分子及其制备方法
CN104232648A (zh) 一种靶向脂肪酸合成酶的调控因子及其应用
CN114807138B (zh) 一种植物环状rna过表达载体及其构建方法和应用
CN112522278B (zh) 基于美洲大蠊嗅觉受体基因OR3X设计的dsRNA、编码基因及其制备方法与应用
CN106047896B (zh) 一种青蒿bZIP类转录因子编码序列及克隆方法与应用
CN107760682A (zh) 一种可用于分子防治害虫的核酸序列及其应用
CN110066799A (zh) 靶向朱砂叶螨脱皮激素受体基因EcR的dsRNA及应用
CN106754866B (zh) 启动子文库及其构建方法
CN110511937A (zh) Snf7基因及其防治瓢虫的应用
CN110511936A (zh) 茄二十八星瓢虫生长发育相关基因chs1及其应用
CN109868288A (zh) 用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA及质粒DNA和体外转录方法
CN112725345B (zh) 基于美洲大蠊性信息素受体基因OR5M设计的dsRNA、编码基因及其制备方法与应用
KR101222121B1 (ko) 중금속 처리 목재의 부후를 야기하는 균에서 발현된 특이 유전자
KR101432897B1 (ko) 제초제 저항성 pat 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도
CN112574995B (zh) 用于马立克病病毒LAT基因簇miRNA基因编辑的gRNA引物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20190913

Termination date: 20201025