CN110066799A - 靶向朱砂叶螨脱皮激素受体基因EcR的dsRNA及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向朱砂叶螨脱皮激素受体基因EcR的dsRNA及应用，由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列和其反向互补序列组成的双链RNA。本发明通过合成特异性dsRNA，利用饲喂法将其导入朱砂叶螨体内，并结合基因表达量检测、表型观察等实验方法证实干扰朱砂叶螨蜕皮激素受体基因的表达，可以有效阻断朱砂叶螨的发育过程，具有显著的致死效应，将其作为RNAi靶标具有较高的应用价值。

Description

靶向朱砂叶螨脱皮激素受体基因EcR的dsRNA及应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种靶向朱砂叶螨脱皮激素受体基因EcR的dsRNA及应用。

背景技术

RNAi(RNA interference)是指由特异dsRNA/siRNA/miRNA引起的靶基因mRNA分解的现象。因为可导致目标基因无法指导蛋白的合成，该现象也被称作基因沉默。由于利用RNAi沉默某些关键基因的表达可起到致死的效果，将其应用于田间防控是目前新型有害生物防控方法的发展方向。对基于RNAi的防控方法来说，靶基因的选择至关重要，理想的靶基因在对目标生物有良好致死效果的同时，还需具有较高的特异性，即对天敌和哺乳动物等非靶标生物安全。

朱砂叶螨别名棉红蜘蛛、棉叶螨、红叶螨，是一种重要的农业害螨，寄主广泛，可为害蔬菜、棉花、花卉、水果等多种经济作物。朱砂叶螨的防控多年来一直以施用化学农药为主，但是由于该螨具有世代周期短，繁殖能力强，可孤雌生殖等特点，导致田间防控过程中朱砂叶螨的抗药性发展十分迅速，是目前抗性问题最为严重的节肢动物之一。研发新型防控技术是缓减朱砂叶螨田间抗性、提高防控效果、降低田间化学农药施用量的一个重要途径。由于螨类个体微小，大多数体长不到1mm，直接注射难度较大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种防治朱砂叶螨的dsRNA，解决朱砂叶螨对化学药产生抗药性而难以防治的问题。

本发明的技术方案为：一种防治朱砂叶螨的dsRNA，由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列和其反向互补序列组成的双链RNA。

一种防治朱砂叶螨的dsRNA的制备方法，步骤如下：

1)提取朱砂叶螨的总RNA；

2)将总RNA反转录成cDNA作为扩增dsRNA序列的模板；

3)使用SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物，利用PCR扩增靶向朱砂叶螨EcR基因的片段，PCR反应体系和条件如下所示：

PCR反应体系

4)反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳，然后用试剂盒回收电泳产物，以回收的电泳产物作为模板，用转录试剂盒合成dsRNA，合成的dsRNA由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列和其反向互补序列组成。

由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列和其反向互补序列组成的dsRNA在以下至少一种上的应用：

1)防治朱砂叶螨或制备防治朱砂叶螨的产品；

2)促进朱砂叶螨死亡或制备促进朱砂叶螨死亡的产品；

3)抑制朱砂叶螨生长或制备抑制朱砂叶螨生产的产品；

4)抑制朱砂叶螨体EcR基因的表达或制备抑制朱砂叶螨体EcR基因表达的产品。

通过寄主叶片进行饲喂或构建表达能由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列和其反向互补序列组成的dsRNA的转基因植株来导入朱砂叶螨体内，从而达到防治朱砂叶螨的目的。

蜕皮激素是节肢动物最重要的激素之一，而蜕皮激素受体(ecdysone receptor，EcR)是节肢动物特有的一类核受体。本发明通过合成特异性dsRNA，利用饲喂法将其导入朱砂叶螨体内，并结合基因表达量检测、表型观察等实验方法证实干扰朱砂叶螨蜕皮激素受体基因的表达，可以有效阻断朱砂叶螨的发育过程，具有显著的致死效应，将其作为RNAi靶标具有较高的应用价值。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的dsRNA致死效果达到91.93％，显著高于现有的同类产品和方法。

2、本发明是将dsRNA直接通过寄主叶片饲喂叶螨，与田间实际应用更为接近，便于大范围的推广应用。

附图说明

图1沉默EcR基因对朱砂叶螨的致死效果；注:L:幼螨期；I-1：幼螨静伏期；N1:1龄若螨；I-2:1若静伏期；N2:2龄若螨；I-3：2若静伏期；A：成螨；

图2沉默朱砂叶螨EcR基因的致死表型。

具体实施方式

1、朱砂叶螨EcR基因序列及所用引物设计

朱砂叶螨EcR基因开放阅读框碱基排列如SEQ ID No.1所示，包含1290个碱基，可编码430个氨基酸，根据其碱基序列设计两对引物分别用于合成dsRNA和qPCR检测(表1)。dsRNA引物和qPCR引物如表1所示。

表1朱砂叶螨EcR基因dsRNA及qPCR引物序列信息

2、靶向朱砂叶螨EcR基因的dsRNA合成

1)朱砂叶螨总RNA提取及cDNA制备

挑取200-300头3-5日龄的朱砂叶螨成螨用于总RNA提取，操作步骤严格按照Qiagen公司提供的RNeasy plus Micro Kit试剂盒使用说明进行。利用核酸浓度分析仪测定获得的总RNA浓度和OD_260/280值，浓度大于100ng/μL，OD_260/280值介于1.9-2.1之间的样品可用于进一步检测。

利用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性。电泳条件为：150V电压电泳25min，然后利用凝胶成像系统进行观察和拍照。电泳结果显示有两条清晰亮带(28S条带和18S条带)且28S︰18S条带亮度比大约为2:1时，说明提取RNA完整性良好。

使用Takara公司的PrimeScript^TMRT reagent Kit将总RNA反转录成cDNA作为扩增dsRNA序列的模板，操作按试剂盒说明书进行。

2)合成靶向朱砂叶螨EcR基因的dsRNA

使用设计的dsRNA引物利用PCR扩增靶向朱砂叶螨EcR基因的片段，PCR反应体系和条件如下所示：

表2 PCR反应体系

反应完成后进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件如前所述，使用Takara公司的MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit试剂盒回收电泳产物，操作步骤按照说明书进行。以回收的电泳产物作为模板，使用Promega公司的TranscriptAid T7High YieldTranscription试剂盒合成dsRNA，操作步骤按照说明书进行，将最终合成的dsRNA用无酶水稀释至1000ng/μL。合成的dsRNA由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列和其反向互补序列组成。

3、利用叶碟饲喂法干扰朱砂叶螨EcR基因的表达

将新鲜豇豆叶剪裁为约2cm×2cm的四方形，经60℃烘烤1min；在去酶灭菌的培养皿中加入30μL dsRNA溶液，将叶片正面朝上覆盖在液滴上放置4h；随后在培养皿中放置海绵，用水浸湿后覆盖滤纸，将处理好的叶片背面朝上置于滤纸上，每片叶片上最多可挑80-100头的初孵幼螨，以绿色荧光蛋白(GFP)的dsRNA作为对照，饲喂48小时后提取RNA进行qPCR检测基因沉默效率，并观察相应表型变化。

4、沉默朱砂叶螨EcR基因的致死效果

利用体外合成的靶向EcR基因的dsRNA饲喂朱砂叶螨后，qPCR检测结果显示目的基因的沉默效率达到49.13％。表型观察显示沉默该基因后可有效阻断朱砂叶螨幼螨至成螨的发育过程，其中75.03％的幼螨无法发育至1龄若螨而直接死亡，16.9％的若螨无法顺利发育至成螨，即沉默朱砂叶螨EcR基因的表达致死率可达91.93％，具有显著的效果，见图1。

5、致死表型

沉默朱砂叶螨EcR基因的致死表型如图2所示，典型的表型为表皮皱缩、溶解导致死亡，其原因是蜕皮激素受体在朱砂叶螨发育过程中可调控与表皮几丁质降解和合成的相关基因，而该基因的表达缺失后，导致朱砂叶螨蜕皮过程中旧表皮的溶解和新表皮的合成过程均受到影响，从而导致死亡。从表型观察的结果与基因功能一致，说明沉默朱砂叶螨EcR基因可有效阻断该螨的发育过程。

除使用本发明所采用的叶碟饲喂法导入dsRNA外，利用显微注射以及构建可以表达朱砂叶螨dsRNA的转基因植株也可达到沉默目的基因的效果。

序列表

<110> 西南大学

<120> 靶向朱砂叶螨脱皮激素受体基因EcR的dsRNA及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1290

<212> DNA

<213> 朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)

<400> 1

atgattctga aaacgggagt ggaactgatt tcatcaatga agaaaaaact atttgataca 60

aatgatggtg aatgggaggg taaagaagat atgagcccgc caaacagtgt taatggttac 120

aacagtgcag atagctttgg cgatcctaag aaaaagaaag gtccagctcc aagacagcaa 180

gaagagcttt gccttgtctg tggtgataga gcctctggtt accattataa tgcccttacc 240

tgtgaaggat gtaaaggatt tttccgtcga agtataacaa aaaatgcggt ttatcagtgc 300

aaatatggaa acaattgtga cattgatatg tacatgaggc gtaaatgtca agaatgtcga 360

ttaaagaaat gcctgaatgt tggcatgagg cctgaatgtg ttgtcccgga gtaccaatgt 420

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attaaacaac tagtctatta tcaagactta catgagtctc cctcagagac tgatgttaaa 660

cgtgtaacgc ctttccctgt aggtgaaact gaagacgaca atatgagaag gtttcaacat 720

atagctgaga tgacaatttt aacggtccaa ttgattgtcg agttttccaa aagggttcca 780

ggtttcgata cattgttaag ggaagatcaa attactttac tgaaatcttg ctcaagtgaa 840

gttatgatgt taagatgctc tcgtaaatat gacctaaaga ccgattcgat tgtgtacgca 900

aacaatcaac cttatacacg acaaaactac caaagtgcag gtgtaggtcc agaaattgag 960

ccaacattta gattttgtcg acatatgtgt caactaaagg ttgacaatgc cgagtacgca 1020

cttctcactg ccatagtgat tttcagtgag aggccacagt taattgaacc gaaaaaagtg 1080

gaaaagattc aagaatttta tatcgacact ctaaaaagtt acattgaaaa tcacaggcct 1140

ccagcgaggt gctatttcgc caaattgttg gcaattttaa cagaacttcg gactcttggt 1200

aaccttaatt ctgagctgtg cttctcactt aaagtccaaa acaagaagct acctcctttc 1260

cttgccgaga tttgggatat tcaagagtga 1290

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taatacgact cactataggg taatgccctt acctgtga 38

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taatacgact cactataggg gcgttgtggt cggtgttt 38

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtaggtcca gaaattgagc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaatagcac ctcgctggag 20

<210> 6

<211> 320

<212> DNA

<213> 朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)

<400> 6

taatgccctt acctgtgaag gatgtaaagg atttttccgt cgaagtataa caaaaaatgc 60

ggtttatcag tgcaaatatg gaaacaattg tgacattgat atgtacatga ggcgtaaatg 120

tcaagaatgt cgattaaaga aatgcctgaa tgttggcatg aggcctgaat gtgttgtccc 180

ggagtaccaa tgtgccatca aacgggaatc caaaagagcc caaaaggaga aagataagcc 240

taatagtact acaaaagacg cctcaccaga caaggaggat aaaactctgg ttttaggtac 300

caaaacaccg accacaacgc 320

Claims (4)

1.一种靶向朱砂叶螨脱皮激素受体基因EcR的dsRNA，由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列和其反向互补序列组成的双链RNA。

2.一种靶向朱砂叶螨脱皮激素受体基因EcR的dsRNA的制备方法，步骤如下：

1)提取朱砂叶螨的总RNA；

2)将总RNA反转录成cDNA作为扩增dsRNA序列的模板；

3)使用SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的上游引物和下游引物，利用PCR扩增靶向朱砂叶螨EcR基因的片段，PCR反应体系和条件如下所示：

PCR反应体系

4)反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳，然后用试剂盒回收电泳产物，以回收的电泳产物作为模板，用转录试剂盒合成dsRNA，合成的dsRNA由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列和其反向互补序列组成。

3.由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列和其反向互补序列组成的dsRNA在以下至少一种上的应用：

1)防治朱砂叶螨或制备防治朱砂叶螨的产品；

2)促进朱砂叶螨死亡或制备促进朱砂叶螨死亡的产品；

3)抑制朱砂叶螨生长或制备抑制朱砂叶螨生产的产品；

4)抑制朱砂叶螨体EcR基因的表达或制备抑制朱砂叶螨体EcR基因表达的产品。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的应用为通过寄主叶片进行饲喂或构建表达能由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列和其反向互补序列组成的dsRNA的转基因植株导入朱砂叶螨体内。