CN103361346A - 胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法，属于生物技术领域，具体包括：采用PCR技术从胡杨DNA中克隆得到胡杨microRNAs前体序列，并对其进行茎环二级结构分析和命名；首次在胡杨中同时对miRNA成熟体与前体在脱水与高盐逆境处理下进行表达检测，得出microRNA前体与成熟体之间可能的关系模式，同时发现了一些与脱水，高盐逆境胁迫相关的microRNAs基因。

Description

胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法。 

背景技术

根据本实验室筛选出的以及经文献报导的响应逆境胁迫的microRNA，我们选取12个microRNA基因：miR156j、miR168a、miR168b、miR169o、miR171a、miR393a、miR408、miR1444a、miR1446a、miR1447、miR1448、miR1450进行胡杨microRNA前体的克隆。 

其中miR168a、miR168b、miR171a、miR393a、miR408为物种间保守的miRNAs(Barakat et al，2007)，文献报道miR168a及miR168b的靶基因AGO1参与siRNA和成熟miRNA的形成通路，即成熟miR168通过靶基因AGO1调控所有下游miRNAs的合成，对其自身合成也形成了一个反馈调节(Vaucheret et al，2006)，研究miR168在胡杨逆境胁迫中的表达及功能可有效探索miR168对逆境响应miRNAs表达量的调节，进而影响靶基因及逆境信号传导途径。生物信息学预测miR171a的靶基因为GRAS转录因子，拟南芥GRAS家族基因可能响应渗透胁迫和干旱胁迫(Liu et al，2006)。毛果杨miR408的靶基因为早期干旱响应蛋白(Lu et al，2005)。拟南芥miR393a在旱胁迫下表达明显上调(Sunkar et al，2004)，其靶基因F-box protein是一类含有50个氨基酸左右具有蛋白质间相互作用的功能的基序的蛋白质，这一类蛋白质具有许多种生物学功能；bHLH transcription factor转录因子家族有报道与植物的抗逆性密切相关(Dharmasiri et al，2005；Danielle et al，2002)。miR7015、miR156j、miR169o、miR1444a、miR1446a、miR1447、miR1448、miR1450为毛果杨中特有而拟南芥中未发现的miRNAs，可能与植物发育，代谢及生物、 非生物抗性相关。毛果杨miR1444a的靶基因多酚氧化酶(polyphenol oxidase，简称PPO)是一类普遍存在于动物、植物、细菌和真菌中的金属蛋白酶。其功能包括甲酚酶(Cresolase，将单酚氧化为二酚)、二酚氧化酶/儿茶酚氧化酶(catecholase，将二酚氧化为醌)。PPO基因进行组织特异性表达，参与植物生物抗性与非生物抗性(Lu et al，2008)。miR1b、miR3a、miR4、miR7a、miR12为Li等(2009)通过构建小RNA cDNA文库的方法在脱水逆境处理的胡杨中发现的新的特异性非保守miRNAs，可能与干旱等非生物逆境信号相关，需要进一步的表达与抗逆功能分析。 

基于以上理由，我们有针对性地对这些与抗逆性可能相关的miRNA在胡杨中进行前体克隆以及成熟体测序，以便进行下一步逆境表达分析及功能验证研究，通过实验验证确定它们的抗逆功能，为揭示胡杨miRNAs逆境信号调控机制打下基础。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法，有效推进科学发展。 

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法，包括： 

采用PCR技术从胡杨DNA中克隆得到胡杨microRNAs前体序列，并对其进行茎环二级结构分析和命名； 

首次在胡杨中同时对miRNA成熟体与前体在脱水与高盐逆境处理下进行表达检测，得出microRNA前体与成熟体之间可能的关系模式，同时发现了一些与脱水，高盐逆境胁迫相关的microRNAs基因。 

优选的，所述胡杨microRNA前体的克隆包括： 

杨基因组DNA提取； 

PCR扩增； 

目的片段的回收与纯化； 

目的片段连入载体及转化； 

大肠杆菌单克隆送测。 

优选的，所述的胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法还包括：不同胁迫处理下胡杨microRNA前体及成熟体的实时定量分析。 

优选的，所述不同胁迫处理下胡杨microRNA前体及成熟体的实时定量分析，具体包括： 

CTAB-PVP法提取胡杨总RNA； 

胡杨microRNA前体及成熟体的实时定量RT-PCR引物设计； 

胡杨microRNA前体及成熟体的反转录(RT)反应； 

胡杨microRNA前体及成熟体的实时荧光定量PCR反应； 

PCR数据的标准化与Treeview分析。 

附图说明

图1是本发明具体实施方法所述的胡杨与毛果杨microRNA前体DNA水平的同源性结构框图； 

图2是本发明具体实施方式所述的12个microRNAprecursors能折叠成典型的二级结构示意图； 

图3是本发明具体实施方式所述的胡杨miRNAs前体(A)及成熟体(B)实时RT-PCR数据的Treeview分析的示意图。 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。 

目前很少有关于miRNA前体(miRNA precursor)的表达的报道，Schmittgen等人在2004年报道了一种检测miRNA前体表达的实时PCR高通量方法，即设计前体特异性反转引物反转RNA，基于前体5’与3’端序列设计的引物进行PCR，应用此种方法成功检测了6个人类癌细胞系中的23个miRNA前体的表达，而后Jiang等又在2005年检测了32个人类癌细胞系中222个miRNA前体的表达，这种方法为以后研究miRNA前体的表达提供了很好的参考。2008年他们又同时检测了miRNA前体与成 熟体的表达，这有利于观察miRNA形成过程中所受的外界影响程度(Schmittgen et al，2008)。 

基于之前的报道(Lu et al.2005；Barakat et al.2007；Lu et al.2008；Li et al.2009)，我们选择一些响应非生物胁迫的植物miRNAs来确定它们的前体与成熟体在胡杨脱水与高盐胁迫处理下的表达情况。我们选取来自13个胡杨miRNA家族的14个microRNA前体：peu-MIR156j、peu-MIR168a、peu-MIR168b、peu-MIR169o、peu-MIR171a、peu-MIR393a、peu-MIR408、peu-MIR1444a、peu-MIR1446a、peu-MIR1447、peu-MIR1448、peu-MIR1450、peu-MIR1b、peu-MIR3a以及来自17个胡杨miRNA家族的17个microRNA成熟体使用SYBR Green RT-PCR方法进行表达分析，这是第一次在胡杨中同时进行miRNA前体与成熟体的表达研究。 

2.1材料与方法 

2.1.1植物材料 

实验所用胡杨材料取自内蒙古自治区两年生胡杨苗，栽种在北京林业大学苗圃，栽种后三天浇一次水，待胡杨长出新叶后取材，取叶片速冻于液氮中，置于-80℃冰箱中保存备用。 

2.1.2仪器和试剂 

试验中使用试剂如大肠杆菌感受态Top10、T4-DNA连接酶及DNA凝胶回收试剂盒均购自天根生物公司，ExTa酶购自大连宝生物(TaKaRa)工程公司，常用试剂购自拜尔迪公司。PCR仪购自ABI公司，离心机购自SIGMA公司，超低温冰箱购自三洋公司，紫外凝胶成像仪购自Bio-rad公司。引物合成和测序由上海生工完成。 

2.1.3培养基及抗生素 

LB培养基的配方： 

酵母提取物        5g/L 

胰蛋白胨          10g/L 

NaCL              10g/L 

NaOH调节PH值至7.0，若制成固体LB培养基则加15g/L的琼脂。 

YEB培养基的配方： 

NaOH调节PH值至7.0，若制成固体YEB培养基则加15g/L的琼脂。 

氨苄青霉素，潮霉素的配制：用无菌水配制成100mg/ml的溶液，用滤膜抽滤，保存于-20℃冰箱中。 

2.1.4胡杨microRNA前体的分离 

2.1.4.1胡杨基因组DNA提取 

(1)取胡杨新鲜叶片(约100mg)置于研钵中，用液氮磨至粉状，将粉末迅速转移至预先装有700ul预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，其间混匀2-3次； 

(2)取出离心管冷却2min后，加入700ul氯仿，斡旋振荡器上振荡10min，使两者混合均匀，然后12000rpm离心5min； 

(3)小心吸取上清至新的2ml灭菌离心管中，加入700ul缓冲液GP2，充分混匀。 

(4)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒，弃掉废液。(吸附柱容积为700ul左右，可分次加入离心) 

(5)向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管。 

(6)向吸附柱CB3中加入700ul漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 

(7)向吸附柱CB3中加入500ul漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液。 

(8)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 

2.1.4.2PCR扩增 

根据从miRBase数据库上下载的毛果杨miRNA茎环前体序列：ptc-MIR156j、ptc-MIR168a、ptc-MIR168b、ptc-MIR169o、ptc-MIR171a、 

表2-1PCR引物用来扩增以胡杨miRNA茎环前体为中心的基因组DNA片段 

ptc-MIR393a、ptc-MIR408、ptc-MIR1444a、ptc-MIR1446a、ptc-MIR1447、ptc-MIR1448、ptc-MIR1450，将上述毛果杨miRNA茎环前体序列在毛果杨JGI基因组数据库v1.1(http://genome.jgi-psf.org/Poptr1_1/)BLAST得到包括miRNA茎环前体两端的基因组DNA序列，根据所得到的以miRNA茎环前体为中心的基因组DNA序列设计引物，所用软件为DNAMAN。以胡杨DNA为模板，使用以下引物进行PCR扩增(如表2-1)。 

Table 2-1 PCR primers used to amplify the fragments of genomic DNA centered on P.euphratica miRNAs hairpin precursors 

PCR反应体系为： 

PCR反应程序：95℃预变性5min后进行35个循环，每个循环为95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，最后，样品在72℃延伸10min。获得的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，对目标条带进行割胶回收。 

2.1.4.3目的片段的回收与纯化 

采用TIANGEN公司的Midi Purification Kit，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)回收PCR扩增目的片段。 

操作步骤： 

(1)柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管)加入500μl平衡液BL，12,000转/分离心1分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱重新放入收集管。 

(2)将琼脂糖凝胶电泳后的单一目的片段切出，放入1.5ml灭菌离心管中，加入6倍凝胶量的溶胶液(体积比，0.1g凝胶视为100μl)，50℃水浴10分钟使胶块完全融化，其间不断温和地上下翻转离心管。 

(3)所得液体(降至室温)加入吸附柱CA2中，室温静置2分钟，12,000转/分离心30-60秒，弃去离心管中液体。 

(4)向吸附柱CA2中加入700μl漂洗液PW，12,000转/分离心30-60秒，弃去离心管中液体。 

(5)向吸附柱CA2中加入500μl漂洗液PW，12,000转/分离心30-60秒，弃去离心管中液体。 

(6)将吸附柱CA2重新放入收集管，再于12,000转/分离心2分钟，尽量除尽漂洗液，将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底晾干，以防止残留漂洗液影响下一步实验。 

(7)将吸附柱CA2转移至1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温静置2分钟，12,000转/分离心2分钟，离心管内的液体即含有目的DNA片段。将DNA储存于-20℃备用。 

2.1.4.4目的片段连入载体 

pMD19-T Simple Vector是一种高效克隆PCR产物(TA Cloning)的专用载体。本载体由pUC19载体改建而成，它消除了pUC19载体上的多克隆酶切位点，再在pUC19载体的多克隆酶切位点处导入了EcoR V酶切位点，使用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3′端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3′末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 

操作方法 

(1)在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为10μl。 

(2)16℃反应3小时以上。 

2.1.4.5转化 

采用TIANGEN的TOP10感受态细胞 

操作方法： 

(1)取100μl感受态细胞置于冰浴中，向感受态细胞悬液中加入目的DNA(50μl的感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和)，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30min. 

(2)将离心管置于42℃水浴中放置60-90秒，快速将管转移至冰浴中，使细胞冷却2-3分钟，该过程不要摇动离心管。 

(3)向每个离心管中加入500μl无菌的SOC或LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床振荡培养1-3小时(150转/分)，目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。 

(4)将离心管内容物混匀，吸取100μl已转化的感受态细胞加到含相应抗生素(氨苄)的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16小时。 

2.1.4.6大肠杆菌单克隆送测 

在大肠杆菌转化平板上随机挑取单克隆白斑，在装有含100mg/L氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基中37℃，180转/分，震荡培养5-7h。菌液送上海生工生物公司测序。 

2.1.5胡杨microRNA前体基因分析 

采用DNAMAN软件对测序得到的胡杨microRNA前体基因DNA序列与毛果杨microRNA前体基因DNA序列进行比对分析。选取与毛果杨microRNA前体茎环结构同源性高的那段RNA序列运用RNAfold(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)网站获得胡杨microRNA前体的二级结构。 

2.2结果与分析 

2.2.1胡杨microRNA前体DNA序列比对 

通过测序得到的以胡杨microRNA前体为中心的基因组DNA序列与毛果杨基因组DNA序列同源性很高，我们用p-miR156j、p-miR168a、p-miR168b、p-miR169o、p-miR171a、p-miIR393a、p-miR408、p-miR1444a、p-miR1446a、p-miR1447、p-miR1448、p-miR1450来表示所得到的以胡杨microRNA前体为中心的基因组DNA序列，扩增长度分别为118bp，206bp，193bp，151bp，205bp，95bp，144bp，163bp，168bp，203bp，243bp，283bp。选取所测序列中与毛果杨microRNA前体茎环结构相似的片段进行比对，比对结果如下： 

如图1所示：其中peu-MIR156j与ptc-MIR156j，peu-MIR393a与ptc-MIR393a 相似度为100％，peu-MIR168b，peu-MIR171a，peu-MIR408，peu-MIR1446a与毛果杨中相应的miRNA前体比较有2个碱基差异，它们的相似度依次为98.53％、98.08％、96.19％、98.1％。毛果杨与胡杨中miR168a，miR169o，miR1444a，miR1447，miR1448and miR1450的前体序列有大于或等于3个碱基差异，相似度依次为：95.63％、93.27％、96.67％、96.55％、96.47％、90.73％。其中miR1450的前体序列存在14个不同的碱基，是这些前体中存在碱基差异数最大的。通过胡杨与毛果杨microRNA前体序列比对，可看出它们的同源性很高，从胡杨与毛果杨microRNA前体序列的高度同源性可以说明胡杨与毛果杨有很近的亲缘关系，在遗传方面比较保守。另，图2是12个microRNAprecursors能折叠成典型的二级结构示意图。 

3 胡杨microRNAs前体与成熟体的表达分析 

检测植物microRNA成熟体的表达最初使用的是传统的Northern杂交试验，此种方法具有直观易察的特点，适于microRNA这种片段较短的小分子RNA，大多数植物microRNA成熟体表达检测均采用此种方法，Sunkar等(2004)在拟南芥中使用Northern杂交验证了13个miRNA成熟体的组织差异性表达以及非生物胁迫下5个miRNA成熟体的表达差异。杨树miRNA成熟体的表达检测也多应用这种方法(Lu et al，2005；Lu et al，2008)。新的探针技术为miRNA成熟体的表达研究提供了广阔的前景，Ramkissoon等人(2006)将地高辛标记的3’端核苷酸探针(3’-digoxigenin(DIG)-labeled RNA oligo probes)改善了microRNA成熟体研究中的Northern杂交试验。Havelda实验室Valoczi等(2006)采用Locked nucleic acid-LNA(亚甲基连接2’氧原子和4’碳原子的核酸)杂交的方法，分析了一些保守植物miRNA成熟体的表达，此方法会增加RNA与DNA的特异性结合。基因芯片技术提供了另外一种高通量的研究miRNA成熟体表达的方法，Liu等人(2008)应用基于已知拟南芥miRNA成熟体序列的miRNA芯片研究miRNA逆境响应的表达情况；另外Castoldi等人(2006)研究出了一种基于LNA的能与miRNA高度特异性结合的基因芯片(miChip)，预示了基因芯片在miRNA成熟体的表达研究中将有广泛应用。近年来，实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative Real Time-PCR，qRT-PCR)用来定量检测miRNA成熟体的表达，其优点为高灵敏性，重复性与特异性，鉴于miRNA成熟体长度仅21个碱基左右而PCR引物也约20个核苷酸，人们使用茎环RT引物的方法(Chen et al，2005)或者引物接头法(Shi et al，2005)来解决这一难题。Chen等人使用茎环RT引物Taqman探针法检测到只有一个或两个碱基数差异的let-7成熟体家族成员的表达，说明此方法具有高度的灵敏度。 

目前很少有关于miRNA前体(miRNA precursor)的表达的报道，Schmittgen等人在2004年报道了一种检测miRNA前体表达的实时PCR高通量方法，即设计前体特异性反转引物反转RNA，基于前体5’与3’端序列设计的引物进行PCR，应用此种方法成功检测了6个人类癌细胞系中的23个miRNA前体的表达，而后Jiang等又在2005年检测了32个人类癌细胞系中222个miRNA前体的表达，这种方法为以后研究miRNA前体的表达提供了很好的参考。2008年他们又同时检测了miRNA前体与成熟体的表达，这有利于观察miRNA形成过程中所受的外界影响程度(Schmittgen et al，2008)。 

基于之前的报道(Lu et al.2005；Barakat et al.2007；Lu et al.2008；Li et al.2009)，我们选择一些响应非生物胁迫的植物miRNAs来确定它们的前体与成熟体在胡杨脱水与高盐胁迫处理下的表达情况。我们选取来自13个胡杨miRNA家族的14个microRNA前体：peu-MIR156j、peu-MIR168a、peu-MIR168b、peu-MIR169o、peu-MIR171a、peu-MIR393a、peu-MIR408、peu-MIR1444a、peu-MIR1446a、peu-MIR1447、peu-MIR1448、peu-MIR1450、peu-MIR1b、peu-MIR3a以及来自17个胡杨miRNA家族的17个microRNA成熟体使用SYBR Green RT-PCR方法进行表达分析，这是第一次在胡杨中同时进行miRNA前体与成熟体的表达研究。 

3.1材料与方法 

3.1.1植物材料处理 

实验所用胡杨材料取自内蒙古自治区两年生胡杨苗，栽种在北京林业大学苗圃，栽种后三天浇一次水，待胡杨长出新叶后，进行脱水与高盐处理。 

脱水处理：胡杨根暴露于空气中置于37℃处理，并分别于1h(d1)、2h(d2)、 4h(d4)、6h(d6)收集叶片存于液氮中，置于-80℃冰箱中保存备用。 

高盐处理：一年生胡杨苗充分浇灌NaCl浓度为300mmol/L进行瞬时盐处理，并分别于4h(s4)、8h(s8)收集叶片存于液氮中，置于-80℃冰箱中保存备用。 

3.1.2不同胁迫处理下胡杨microRNA前体及成熟体的实时定量分析 

3.1.2.1CTAB-PVP法提取胡杨总RNA 

试剂配置： 

1)RNA提取缓冲液： 

2％十二烷基肌氨酸钠(CTAB)(w/v) 

2％聚乙烯吡咯烷酮-40(PVP-40)(w/v) 

100mmol/LTris-HCl(pH8.0) 

25mmol/L sodium-EDTA(pH8.0) 

2.0mol/LNaCl 

2)2％的β-巯基乙醇； 

3)V(苯酚)∶V(氯仿)∶V(异戊醇)＝25∶24∶1 

4)3mol/L醋酸钠(pH5.2)。 

5)Dr.GenTLE Precipitation Carrier 

6)无水乙醇 

7)80％乙醇； 

8)RNase-free水 

所有溶液的配制均需保证无RNA酶污染。 

实验步骤： 

(1)在2ml离心管中加入1.5mlbuffer，加入2％终体积的巯基乙醇后，65℃温育； 

(2)用液氮研磨脱水或高盐处理后的胡杨材料后，按0.1g材料/1ml buffer的比例加入65℃抽提液中，剧烈震荡； 

(3)65℃，10min水浴，其间振荡2～3次； 

(4)15000r/min，4℃，10min离心取上清； 

(5)等体积V(苯酚)∶V(氯仿)∶V(异戊醇)＝25∶24∶1抽提2次，每次充 

分振荡5min，离心(15000r/min，4℃，10min)； 

(6)取上清加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2)，10μL Dr.GenTLE Precipitation Carrier，2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀，-80℃，沉淀10～30min；离心(15000r/min，4℃，1h) 

(7)80％乙醇洗沉淀，溶于50μLRNase-free水；-80℃保存，检测备用。 

3.1.2.2胡杨microRNA前体及成熟体的实时定量RT-PCR引物设计胡杨前体与成熟体序列来自已发表的文章(Barakat et al.2007；Li et al.2009)，本研究已经确定的序列以及miRNAs公共数据库miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)。为了检测miRNA前体的表达，根据Schmittgen等人(2004)描述的标准设计位于miRNA前体5’端的PCR上游引物，下游引物则来自miRNA前体3’端，下游引物同时也是RT反应的RT引物。所有miRNA前体引物的熔点范围是49-59℃(表3-1)。 

表3-1.实时RT-PCR引物用来扩增胡杨miRNAs前体 

Table 3-1.Real-time RT-PCR primers used to amplify the P.euphratica miRNAs precursors. 

为定量miRNAs成熟体的表达，我们使用基于Chen等人在2005年描述的stem-loop RT引物法来设计RT反应中的stem-loop RT引物，stem-loop RT引物序列为CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCCGGCAATTCAGTTGAG+每个miRNA成熟体序列的反向互补序列的前8个碱基，PCR正向引物为：ACACTCCAGCTGGG+每个miRNA成熟体序列的前10个碱基，PCR反向引物序列一律为：AACTGGTGTCGTGGAG，来自stem-loop RT引物的5’端(表3-2)。内参基因为胡杨18s rRNA。 

表3-2.实时RT-PCR引物用来扩增胡杨miRNAs成熟体 

Table 3-2.Real-time RT-PCR primers used to amplify the P.euphratica mature miRNAs. 

3.1.2.3胡杨microRNA前体及成熟体的反转录(RT)反应 

使用从TaKaRa公司的购买的1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录胡杨microRNA前体反转录(RT)反应步骤为： 

(1)在PCR管中加入下列试剂： 

gene-specific RT primers(10μM)     1.5μl 

Total RNA                           1μg 

(2)将PCR管放在PCR仪上80℃5分钟，然后60℃5分钟，冷却至室温 

(3)在上述PCR管中加入下列反应液： 

(4)将PCR管放在PCR仪上进行下列反应： 

60℃        45min 

85℃        5min 

4℃反应产物放于-20℃冰箱中保存。 

胡杨microRNA成熟体反转录(RT)反应步骤为： 

(1)在PCR管中加入下列试剂： 

stem-loop RT primers(10μM)    1.5μl 

Total RNA                      1μg 

(2)将PCR管放在PCR仪上80℃5分钟，然后60℃5分钟，冰上放 置5min； 

(3)在上述PCR管中加入下列反应液： 

(4)将PCR管放在PCR仪上进行下列反应： 

反应产物放于-20℃冰箱中保存。 

3.1.2.4胡杨microRNA前体及成熟体的实时荧光定量PCR反应 

胡杨microRNA前体及成熟体的定量分析采用的是SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(Applied Biosystems)，PCR反应包括2μl cDNA，10μl2×SYBR green PCR master mix，0.3μl引物(10μM)各一条，RNase Free dH₂O共25μl，使用Applied Biosystems 7500型仪器(Applied Biosystems)进行反应，每个反应至少三次生物重复。反应程序为：95℃10min然后40个循环包括95℃15s，60℃1min，内参基因为胡杨18s rRNA，microRNA前体及成熟体的相对定量使用2^-ΔΔCt计算(Livak and Schmittgen 2001；Chen et al.2009)。Ct(cycle threshold)值使用默认阈值设置，扩增产物的特异性参考溶解曲线。成熟miRNAs PCR产物进一步测序。 

3.1.2.5PCR数据的标准化与Treeview分析 

MiRNA表达数据使用Cluster 3.0及Java Treeview软件进行标准化与分析。miRNA表达相对定量采用2^-ΔΔCt法计算，未处理胡杨叶作为参照样品 校准，18s rRNA作为内参进行数据标准化。2^-ΔΔCt值转化为以log10为底的对数作为每个miRNA表达的相对定量值(RQ)。转化的标准值用Cluster 3.0软件的层级聚类中的平均连接法及欧式距离转化为可视化图并用Java Treeview软件显示(Jiang et al.2005；Bandrés et al.2006)。参照样品的表达设为0并用黑色表示，红色代表表达诱导而绿色代表表达抑制。使用Microsoft Office Excel 2003的成对t检验来检测非生物胁迫处理与未处理样品中差异表达基因的显著性，那些P＜0.01的miRNA表达具有统计学意义差异。 

3.2结果与分析 

3.2.1胡杨microRNA前体及成熟体的实时荧光定量数据处理 

使用2^-ΔΔCt计算microRNA前体及成熟体的相对定量，内参基因为胡杨18s rRNA，通过实时荧光定量RT-PCR技术得到了miRNA基因在脱水，高盐的处理条件下不同时间的诱导表达模式。在相同反应条件和相同RNA模板量的情况下，作为内参的18s rRNA基因的扩增量表现一致，而miRNA前体及成熟体的表达量在不同处理不同时间下则明显不同。我们通过实时荧光定量RT-PCR检测胡杨microRNA前体及成熟体的表达情况，得出了一些microRNA前体及成熟体为逆境诱导基因，这些基因与脱水，高盐相关。 

表3-3胡杨非生物胁迫处理下的miRNA前体实时RT-PCR表达数据 

Table 3-3 MiRNA precursor real-time RT-PCR data from Populus euphratica abiotic stress treatments 

表3-4胡杨非生物胁迫处理下的miRNA成熟体实时RT-PCR表达数据 

Table 3-4 MiRNA mature real-time RT-PCR data from Populus euphratica abiotic stress treatments 

3.2.2胡杨microRNA前体及成熟体的Treeview分析 

参见图3，图3-1.胡杨miRNAs前体(A)及成熟体(B)实时RT-PCR数据的Treeview分析。 

植物37℃脱水处理1小时(d1),2小时(d2),4小时(d4)与6(d6)小时，300mM NaCl处理4(s4)与8(s8)小时。，每个基因的相对表达由3个独立实验平均数据确定。层级聚类步骤在材料与方法中描述。聚类之前数据未过滤，以对数形式存在。红色代表相对未处理对照的表达水平上调，绿色表示相对未处理对照的表达水平下调。纵列表示不同处理后的样本，横行表示miRNA前体与miRNA成熟体，具体参见图2。(Fig.3-1 Treeview analysis of real-time RT-PCR data for P.euphratica mature miRNAs and their precursors.Plants underwent dehydration treatment at 37℃ for 1(d1)，2(d2)，4(d4)and 6(d6)hours and were treated with 300mM NaCl for 4(s4)and 8(s8)hours.The relative expression of each gene was determined from the mean data of three independent experiments.Hierarchical clustering was performed as described in Materials and Methods.Data were unfiltered prior to clustering and are presented on a logarithmic scale.Red indicates increased levels of expression and green represents decreased levels of expression relative to an untreated sample.The samples after the different treatments are in the columns and the miRNAs precursors(Fig.2A)and mature miRNAs(Fig.2B)are in rows。) 

脱水以及高盐胁迫处理下胡杨叶中miRNA前体(pri-miRNA+pre-miRNA)与成熟体相对于内参18s rRNA的相对表达量通过2^-ΔΔCt计算得到，miRNA前体相对表达水平的Treeview分析(图3-1A)以及表达数据的显著性差异分析(表3-3)显示在脱水逆境胁迫处理下miR3a，miR1444a and miR1447前体在不止一个时间点显著上调，miR3a前体在2h到达最高表达水平而miR1444a与miR1447前体的表达在4-6h明显上调。此外，miR156j与miR393a前体在1-2h明显受抑制。这个结果意味着miRNA前体在脱水逆境胁迫早期发生响应。在300mM NaCl高盐处理下，miR1447及miR408前体被强烈诱导而miR169o，miR1b与miR3a前体在其中两个时间点表达下调。不同的miRNA前体在不同的逆境处理环境下显示不同的表达水平。值得注 意的是，miR169o与miR1b前体的表达水平在脱水胁迫时增加而在高盐逆境处理的组织中受抑制，miR156j则情况相反。 

如图3-1B及表3-4所示，大多数成熟miRNA在同一处理下不同时间点显示比较恒定一致趋势的表达水平，miR169o-p与miR4成熟体在脱水与高盐两种处理下都表现为明显上调，miR1446a-e and miR1448成熟体的表达情况正好相反，在两种非生物逆境胁迫下均表现出受抑制。这两种观察到的miRNAs成熟体的表达模式暗示它们的非生物逆境响应机制在不同的处理下并没有区别，意味着miRNA在应付外界环境刺激时起到了重要作用。除了以上描述的miRNA的相似性表达外，其它miRNAs在我们研究的不同非生物逆境中表达水平不同。如miR408成熟体的表达只在脱水胁迫早期受诱导，miR156g-j，miR1447与miR1b只在盐处理下受诱导，总之，第二种miRNA成熟体在不同的逆境处理下表现出不同的影响，它们也许参与更特异的非生物逆境信号转导。 

以上对本发明所提供的胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。 

Claims (4)

1.一种胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法，包括：

采用PCR技术从胡杨DNA中克隆得到胡杨microRNAs前体序列，并对其进行茎环二级结构分析和命名；

首次在胡杨中同时对miRNA成熟体与前体在脱水与高盐逆境处理下进行表达检测，得出microRNA前体与成熟体之间可能的关系模式，同时发现了一些与脱水，高盐逆境胁迫相关的microRNAs基因。

2.根据权利要求1所述的胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法，其特征在于，所述胡杨microRNA前体的克隆包括：

杨基因组DNA提取；

PCR扩增；

目的片段的回收与纯化；

目的片段连入载体及转化；

大肠杆菌单克隆送测。

3.根据权利要求1所述的胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法，其特征在于，还包括：不同胁迫处理下胡杨microRNA前体及成熟体的实时定量分析。

4.根据权利要求3所述的胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法，其特征在于，所述不同胁迫处理下胡杨microRNA前体及成熟体的实时定量分析，具体包括：

CTAB-PVP法提取胡杨总RNA；

胡杨microRNA前体及成熟体的实时定量RT-PCR引物设计；

胡杨microRNA前体及成熟体的反转录(RT)反应；

胡杨microRNA前体及成熟体的实时荧光定量PCR反应；

PCR数据的标准化与Treeview分析。

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