CN104726457A - 一种与大豆抗疫霉病相关的microRNA - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与大豆抗疫霉病相关的microRNA，属于大豆分子生物学领域。本发明通过与已知抗病免疫相关基因的筛选得到抗疫霉病基因223个，miRNA256个。利用表达谱测序、严谨的生物信息学分析以及实时定量PCR检测建立了与抗病相关miRNA-Target预测系统，可预测miRNA的功能，大大提高了大豆抗疫霉病基因以及miRNA的筛选鉴定效率。本发明提供了对MIRNA-target关系进行分类的方法，发现了通路Plant-pathogen interaction在对疫霉菌的防御中起到十分关键的作用。并证实了gma-miR482c-3p是通路Plant-pathogen interaction中的主要成分并与大豆对疫霉根腐病的抗病紧密相关。

Description

一种与大豆抗疫霉病相关的microRNA

技术领域

本发明涉及一种与大豆抗疫霉病相关的microRNA，属于大豆分子生物学领域。

背景技术

大豆是一种重要农作物，富含蛋白质和脂肪以及对人体有利的活性成分如皂贰、异黄酮、磷脂等，是世界上植物性蛋白和油分的主要来源之一。目前我国大豆种植面积、总产及单产均居世界第四位，生产水平落后于世界大豆生产。2012年中国大豆种植面积718万公顷，总产量1280万吨，而进口大豆达到创记录的5750万吨，占据我国五分之四的大豆市场。造成我国大豆生产滞后、供给严重不足、国内大豆产业遭受进口转基因大豆严重冲击的原因是多方面的，但主要原因之一是综合抗病虫害和抗逆能力差，单产低，种植效益低下，国际竞争力弱。控制大豆合适的百粒重是实现大豆高产的有效办法。但是，目前对可以用于大豆育种过程中父母本筛选的标记位点的报道较少，对于实现在育种前期对亲本或者杂交后代的百粒重遗传背景进行选择的手段和方法还比较有限。

通过对大豆抗病品种的筛选与鉴定，近些年在中国发现了许多抗病品种。由于新的毒力小种的出现和长期使用单一抗性品种，这些含有主效抗病基因的品种通常抗病有效时间为8至15年。利用含有Rps抗病基因的栽培品种虽然能有效的控制大豆疫霉根腐病的发生。但是随着该品种种植年份的增长，新的生理小种不断出现，原有的抗病品种会逐渐丧失抗性。近年来发现，miRNA为重要的转录后调控因子，通过降解或抑制mRNA从而达到负调控效果。由于miRNA在植物体中的这一重要角色，基于miRNA对植物抗病、耐性、生理等方面的研究日益增多。

发明内容

本发明首先提供了一种与大豆抗疫霉病相关的microRNA：gma-miR482c-3p，其核苷酸序列为：UUCCCAAUUCCGCCCAUUCCU。该microRNA所调控的靶基因Glyma08g42971的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述gma-miR482c-3p与产生特异监测蛋白的过程相关，涉及植物-病原互作(Plant-pathogen interaction)通路中的应答层面：Effector-triggered immunity(ETI)。ETI是通过产生特异的细胞内监测蛋白监测病原菌产生的毒力蛋白，从而达到对病原菌的高灵敏度的应答。

所述miRNA分子gma-miR482c-3p通过抑制或者降解的方式调控靶基因Glyma08g42971。

本发明还提供了一种获得gma-miR482c-3p的方法，一方面，通过比较疫霉根腐病感染样品与正常样品的差异表达基因，结合软件预测结果、数据库注释信息，取交集，并进一步通过实时定量PCR确认microRNA及其靶基因与大豆抗疫霉根腐病的关系；另一方面，对筛选预测得到的miRNA-靶基因关系进行归纳分类，并对分类结果的信息进行归纳分析，获得与植物体积极适应环境相关的通路的基因，进一步确认microRNA与大豆抗疫霉根腐病相关。

本发明所述的microRNA小分子gma-miR482c-3p的靶基因在接种疫霉根腐病菌后的转录组数据中，不同时间段内具有明显变化，这一表达特性被基于茎环法的实时定量PCR实验所验证，基于茎环法的实时定量PCR同时证实了gma-miR482c-3p与其靶基因Glyma08g42971的调控关系。本发明还通过生物信息学手段对该miRNA小分子的功能进行了分析，进一步证实了其与抗大豆疫霉根腐病相关。

本发明通过比较疫霉根腐病感染样品与正常样品的差异表达基因，结合软件预测结果、数据库注释信息，初步获得候选microRNA及其靶基因，并进一步通过实时定量PCR确认microRNA及其靶基因与大豆抗疫霉根腐病的关系。同时还对miRNA-靶基因关系进行聚类分析，并对聚类分析结果进行了注释及代谢通路研究，进一步证实gma-miR482c-3p与抗大豆疫霉根腐病相关。miRNA的抗病机制是通过作用于mRNA从而抑制或降解mRNA，从而达到抗病效果的。目前已经有大量的研究是针对大豆抗疫霉根腐病的基因，而对大豆抗疫霉根腐病的miRNA研究鲜有报道。而抗病miRNA的提出，更是为抗病机制的研究提供了一种新的途径。而gma-miR482c-3p对疫霉根腐病抗性的证明，为后续的研究奠定了基础，使后续的研究更为便捷。

附图说明

图1为miRNA-target关系预测韦恩图。

图2为6个时间段内，不同样品中gma-miR482c-3p、Glyma08g42971的表达量；CK：为不做任何处理的样品，M：为不接种疫霉根腐病菌的样品，T：为接种疫霉根腐病菌的样品。

图3为3个时间段内miRNA与其预测靶基因的变化趋势图

图4为接种位置及方法图示

图5为miRNA与植物-病原互作通路中功能位置标注。

具体实施方式

在以下的实施方案中，除非特别说明，否则所有操作均按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京:科学出版社，2002)所提供的方法进行。

实施例1预测筛选抗病gma-miR482c-3p

(1)筛选大豆中与抗疫霉根腐病相关的基因

对侵染疫霉根腐病菌1号生理小种的绥农10号大豆品种进行表达谱测序。采用了侵染相同疫霉根腐病菌1号生理小种的SCKL，SML，STL0.5，STL2和STL4这5个样品，用Qiagen公司的RNeasy Mini Kit分别提取了总RNA作为测序样品，样品的表达谱测序由华大基因完成。其中，SCKL为不做任何处理的样品，SML为不接种疫霉根腐病菌的样品，STL0.5、STL2、STL4为接种疫霉根腐病菌后分别于0.5h、2h、4h取样的样品。接种位置及方法如图4所示，在SCKL，SML，STL0.5，STL2，STL4这5个样品的表达谱测序数据中，一共检测到33683个拼接序列片段。采用算法log₂Ratio(RPKM(sample2)/RPKM(sample1))对样品间具有表达量变化的序列片段进行了筛选，得到差异表达基因，当|log₂Ratio(RPKM(sample2)/RPKM(sample1))|>1时，说明该基因在样品1与样品2之间为差异表达基因。经过上述方法的筛选，得到较为可靠的7401个受疫霉根腐病影响，发生表达量变化的基因。

其中，测序结果由RPKM表示基因的表达量，RPKM计算公式为：

$\mathrm{RPKM}=\frac{{10}^{6}C}{\mathrm{NL}/{10}^3}$

式中，C为基因区读段计数，N为测序深度，L为基因长度。

(2)预测与疫霉根腐病相关的miRNA

根据基因表达谱数据中的33683个基因以及第2015年最新的(V21)版miRBase数据库中已知的大豆miRNAs，利用三种不同的miRNA靶基因预测软件：blast、psRNATarget和psRobot，预测与抗病相关的miRNA。首先，如图1所示，得到了2031个miRNA-靶基因关系，其中包含987个基因，445个miRNAs。然后，将结果与步骤(1)筛选出来的差异表达基因取交集。最后，得到233个与疫霉根腐病相关的基因及256个与疫霉根腐病相关的miRNA。

根据SoyBase数据库中对大豆基因的注释，我们从这233个疫霉根腐病相关的基因中筛选出5个与疾病或免疫相关的基因，它们分别是Glyma16g33681、Glyma16g33910、Glyma14g02760、Glyma05g17470、Glyma08g42971，调控这些基因的miRNA有miR5374、miR5041、miR5668、miR2109、miR482c-3p，经分析得出大豆中的miR482c-3p极度与疫霉根腐病的抗性相关。

实施例2抗疫霉根腐病检验

根据预测，gma-miR482c-3p的靶基因为Glyma08g42971，Glyma08g42971在大豆侵染疫霉菌过程中差异表达，且在SoyBase中与抗病和免疫均相关。本实施例针对gma-miR482c-3p，利用设计的特异反转录引物与特异的PCR引物对对绥农10号大豆品种中gma-miR482c-3p进行抗疫霉根腐病检验。

首先要提取样品中的总的RNA，并对每一个样品的总的RNA进行两次反转录，一次是根据特异的反转录引物反转录gma-miR482c-3p，一次是根据RNA通用的反转录引物将所有的RNA进行反转录。接下来对两次反转录产物利用具有针对性的特异引物分别进行定量PCR。结果发现，不做任何处理的样品SCKL与不接菌的样品SML相比，Glyma08g42971与gma-miR482c-3p在6个时间段内的表达量折线趋势一致，这说明对不接菌样品的处理对基因表达量的变化没有影响；而接菌样品STL中gma-miR482c-3p在0.5h的时候表达量升高，而Glyma08g42971则在1h的时候表达量才升高(图2)，这说明当样品接种疫霉根腐病菌后，Glyma08g42971与gma-miR482c-3p的表达量都发生了变化，进一步说明Glyma08g42971与gma-miR482c-3p都与接种疫霉根腐病菌相关，即基因的表达受疫霉根腐病菌直接诱导。而图3中，在三个时间段内，gma-miR482c-3p的表达量变化与Glyma08g42971的表达量变化呈现负相关，而Glyma08g42971与gma-miR482c-3p的调控关系被三个miRNA靶基因预测软件预测到，符合miRNA抑制或降解的调控原则，这说明gma-miR482c-3p通过抑制或者降解的方式调控着Glyma08g42971。具体步骤如下：

1、提取总RNA

(1)疫霉根腐病菌1号生理小种(东北农业大学大豆研究所保存)的培养

1)将胡萝卜洗净，将表面水分晾干，取200g，用榨汁机搅碎，四层纱布过滤，用超纯水定容至1L，加入18g琼脂，121℃高压灭菌锅中灭菌20分钟。

2)将超净工作台紫外灭菌20分钟，将灭菌的培养基倒入已灭菌的培养皿中，每个培养皿倒15ml，得到CA平板培养基。

3)在平板凝结后，挑取少量疫霉根腐病菌1号生理小种菌丝体接种于CA培养基中，25℃无光条件下培养10天，即可用于接种。

(2)对绥农10号大豆进行接种

1)在同一培养条件下，待植株生长到三叶期，挑取长势一致的植株利用下胚轴伤口接种法接种疫霉根腐病菌1号生理小种(如图4)。

2)在对生真叶下1cm处划伤长1.5cm厚0.8mm的伤口，接种直径为1cm带有CA培养基的疫霉根腐病菌。

3)取样部位为三出复叶。

(3)提取总RNA

1)对所选取的0、0.5、1、2、4、5h，6个时间点的SCKL、SML、STL(如实施例1)进行取样，每一个样品具有三个生物学重复。并利用液氮对样品进行速冻。

2)将研钵在180℃的温度下进行灭菌除核酸酶，并对样品进行研磨。

3)将50-100mg的研磨组织放入含有1mlTrizol的离心管中，温度15-25℃(室温)。使组织溶解在Trizol试剂中，确保没有聚集在一起的组织块，变成匀浆。

4)将所得匀浆在15-25℃放置(孵化)5min，以确保蛋白质复合体充分解离。

5)向各管加入氯仿200μl，将离心管盖盖好后剧烈震荡15s，放在15-25℃条件下孵化2-15min。

6)离心12000rpm15min4℃，将无水上清溶液转移至一个新的离心管中。

7)向上清液中加入异丙醇500-600μl，沉淀RNA，盖上盖翻转几次充分混匀，在15-25摄氏度孵化5-10min，沉淀RNA。

8)12000rpm15min4℃分离样品。弃上清液，加入75％酒精1ml吹洗RNA。

9)7500rpm4℃离心5min，自然干燥5-10min，使乙醇挥发。

10)加入40μlDEPC水对RNA进行保存，放于4℃冰箱中利于溶解。

2、两次反转录

利用特异的茎环引物对本实施步骤1中得到的全部RNA进行反转录，可以得到指定的miRNA。利用根据通用的反转录引物oligo dT与引物Random 6mers对所有RNA进行反转录。反转录茎环引物序列如SEQ ID NO.3所示。反应体系如表1所示：

表1 反转录PCR体系

以两次反转录得到的cDNA为模板，分别进行定量PCR，Glyma08g42971的定量PCR引物序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示，gma-miR482c-3p的定量PCR特异引物序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示，反应体系如下表表2所示，并利用△△Ct法进行结果的分析。

表2 miRNA及其靶基因qPCR体系

表3 用于实时定量的模板cDNA浓度

续表3

实施例3对miRNA-靶基因关系进行聚类分析

(1)利用clustalx软件对实施例1筛选预测得到的miRNA与基因分别进行两两比对，将两两比对结果利用mega呈现出来，得到向导树。并根据向导树中呈现的两两基因之间的关系远近对miRNA与靶基因进行了分类。

(2)由于miRNA序列短且家族相似性极高，因此将miRNA划分为家族MIRNA的形式，然后再对miRNA家族与靶基因进行连线分析。

(3)对连线中miRNA与靶基因关系进行归类整理，如表4所示，发现这些预测出来的miRNA-靶基因关系中，有大部分的miRNA对其靶基因具有调控倾向性，根据这种倾向性(表3)，可以将miRNA-靶基因关系分为8类a1b1，a1b2，a1b3，a21b3，a22b1，a22b2，a3b1，a3b2。

表4 MIRNA-target靶基因关系聚类统计表

说明：GC为基因集，MC为miRNA集，GN为基因数量，MN为MIRNA数量，c为MIRNA靶基因数量，d＝c/MN/GN，e＝d/(d₁+d₂+d₃)*100％，f＝d/(a₁d+a₂₁d+a₂₂d+a₃d)*100％，e_total＝e₁+e₂+e₃＝1，totalf＝a₁f+a₂₁f+a₂₂f+a₃f＝1。表中a1e1,a22e1,a3e1,a21e1,a1f1,a1f2,a2f3为各种情况所占比例最大值，a22e2,a3e2,a1e3,a3f1,a3f2,a1f3所占比例大于平均值。ae表示ai与bi之间的MIRNA-target关系的绝对量占ai与b之间MIRNA-target关系绝对量的百分比，同理af表示ai与bi之间MIRNA-target关系的绝对量占a与bi之间MIRNA-target关系绝对量的百分比。

(4)对这8类关系中的基因通路进行研究，发现Circadian rhythm，Plant-pathogeninteraction这两个通路与植物对环境的被动适应相关，也就是说与这两个通路相关的miRNA-靶基因关系很有可能是与接种疫霉根腐病1号生理小种相关的，且分析得到的3类关系囊括了81％的在两个通路起作用的基因，那么可以推导出这三类miRNA-靶基因关系a22b1、a22b2、a3b1更倾向于与疾病直接相关。

(5)对两个通路中的基因进行了go注释与通路分析，将miRNA在通路中发挥作用的位置进行了定位。植物-病原互作(Plant-pathogen interaction)通路中包含两个应答层面：PAMP-triggered immunity(PTI)与effector-triggered immunity(ETI)，ETI是通过产生特异的细胞内监测蛋白监测病原菌产生的毒力蛋白，从而达到对病原菌的高灵敏度的应答，其中gma-miR482c-3p的功能是与产生特异监测蛋白的过程相关，因此将gma-miR482c-3p发挥功能的位置定位在ETI，为图5中用点虚线框所圈范围。

1)发现gma-miR482c-3p可能与产生特异监测蛋白的过程相关，并将发挥作用的位置在通路中进行了定位。

2)经过生物信息学分析过程可以进一步验证gma-miR482c-3p参与抗疫霉根腐病1号生理小种的特性。

以上实验结果说明利用茎环法实时定量验证的gma-miR482c-3p抗病性与生物信息学推理方法结果一致，说明本发明gma-miR482-3p与抗疫霉根腐病1号生理小种的特性相关真实可靠。

实施例4应用实时定量PCR方法鉴定gma-miR482c-3p

(1)提取新鲜待测大豆样品叶片中的全部RNA；

(2)以步骤1)所得的待测大豆样品全部RNA为模板，分别利用特异茎环引物以及通用引物对gma-miR482c-3p与全部RNA进行反转录，PCR条件设定为37℃15min，85℃5s，20℃终止；

(3)对步骤2)所获得的扩增产物进行稀释，稀释倍数为10倍如表5、6所示，可见在同一稀释倍数下，每个样品的浓度差异不大，说明由于模板浓度误差导致的结果不确定可以忽略不计。利用gma-miR482c-3p的上下游引物以及其靶基因的上下游引物分别对稀释产物进行实时定量检测，均采用PCR扩增标准程序：预变性95℃30s，Repeat：1，PCR反应95℃5s，60℃30s，Repeat：40。

表5 用于实时定量的模板cDNA浓度

表6 用于实时定量的模板cDNA浓度

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种与大豆抗疫霉病相关的microRNA：gma-miR482c-3p，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种权利要求1所述microRNA调控的靶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种获得权利要求1所述microRNA的方法，其特征在于，通过比较疫霉根腐病感染样品与正常样品的差异表达基因，结合软件预测结果、数据库注释信息，取交集，获得候选microRNA及其靶基因，并进一步通过实时定量PCR确认microRNA及其靶基因与大豆抗疫霉根腐病的关系。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，对候选的miRNA-靶基因关系进行生物信息学的聚类分析，获得与植物体积极适应环境相关的通路的基因，进一步确认microRNA与大豆抗疫霉根腐病相关。

5.权利要求1所述的miRNA分子在调控靶基因Glyma08g42971中的应用。

6.权利要求1所述的miRNA分子在大豆抗疫霉根腐病中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述miRNA分子gma-miR482c-3p通过抑制或者降解的方式调控靶基因Glyma08g42971的表达，达到抗疫霉根腐病的效果。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述miRNA分子gma-miR482c-3p涉及植物-病原互作通路中的应答层面，所述植物-病原互作通路中的应答层面是通过产生特异的细胞内监测蛋白监测病原菌产生的毒力蛋白，从而达到对病原菌的高灵敏度的应答。