CN113774065A - 美国白蛾不同性别成虫荧光定量内参基因及其引物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了美国白蛾不同性别成虫的荧光定量内参基因及其引物和应用，属于林业昆虫分子生物学领域。该荧光定量内参基因为RPL13和RPS15基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明通过美国白蛾的转录组测序数据库，选择了常用作内参基因的8个候选内参基因，通过5种算法评估候选内参基因的稳定性，获得了美国白蛾不同性别成虫的荧光定量内参基因，并设计了内参基因的实时荧光定量PCR引物，该引物特异性强，扩增效率高。本申请填补了美国白蛾不同性别成虫下没有合适内参基因的现状，为美国白蛾不同性别实验条件下的相关功能基因的表达定量提供了可靠的分析依据。

Description

美国白蛾不同性别成虫荧光定量内参基因及其引物和应用

技术领域

本发明属于林业昆虫分子生物学领域。具体涉及美国白蛾不同性别成虫荧光定量内参基因及其引物和应用。

背景技术

美国白蛾(Hyphantria cunea(Drury))属属鳞翅目Lepidortera，灯蛾科Arctiidae，是世界性检疫害虫，被我国列入首批外来入侵物种之一。寄主广泛，具有食性杂、传播快、危害猖獗等特点。其主要危害果树、行道树和观赏树木，尤以阔叶树为重，包括糖槭、桑、榆、臭椿、花曲柳、山楂、杏、法国梧桐等。以取食叶片为害，严重影响植物的正常生长果蔬产量和质量等。同时对园林树木、经济林、农田防护林等造成严重的危害，以及对城市环境绿化和美化、经济发展、生态人文景观等发展具有巨大的影响。为了能够防治和应对这种世界性检疫害虫，就需要对美国白蛾进行研究，了解其生物学特性以及生活习性。

实时荧光定量(Reverse transcription quantitative polymerase chainreaction，RT-qPCR)是功能基因表达量的一种精确的定量方法，但它依赖于合适的内参基因对功能基因的相对表达定量进行数据标准化。内参基因必须在特定的实验条件下稳定表达。美国白蛾雌、雄成虫之间存在明显的生物学差异。因此，利用实时荧光定量方法探究美国白蛾不同性别成虫下功能基因的差异表达分析，就需要稳定可靠的内参基因。因此，有必要对该害虫不同性别成虫下的内参基因稳定性进行筛选，否则无法对该害虫不同性别成虫功能基因的相对表达定量进行研究。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供不同性别成虫的荧光定量内参基因，满足实时荧光定量分析美国白蛾转录表达水平的要求，为不同性别成虫下的相关功能基因的表达定量提供可靠的分析依据；本发明所要解决的另一技术问题是提供美国白蛾不同性别成虫的荧光定量内参基因的引物；本发明所要解决的再一技术问题是提供上述基因及其引物在美国白蛾不同性别成虫荧光定量中的应用。

为了解决上述问题，本发明采用的技术方案为：

美国白蛾不同性别成虫的荧光定量内参基因，为RPL13和RPS15，其中，RPL13基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，RPS15基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的美国白蛾不同性别成虫的荧光定量内参基因的引物，RPS13基因的引物序列如下：

RPL13正向引物：5′-TCCATTAAGGCCGGTTGTCC-3′；

RPL13反向引物：5′-AGGATCCACTGCAATGCCAA-3′。

所述的美国白蛾不同性别成虫的荧光定量内参基因的引物，RPS15基因的引物序列如下：

RPS15正向引物：5′-GCGTCACTCTCAAGATCAGC-3′；

RPS15反向引物：5′-ATGGTGCAGATCCTCCAGTC-3′。

上述内参基因在美国白蛾不同性别成虫荧光定量中的应用。

RPL13基因的引物序列在美国白蛾不同性别成虫荧光定量中的应用。

RPS15基因的引物序列在美国白蛾不同性别成虫荧光定量中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通过美国白蛾的转录组测序数据库，参考选择了常用作内参基因的8个候选内参基因，鉴定了8个内参基因的基因序列，通过5种算法(geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Cq和RefFinder)评估候选内参基因的稳定性，获得了适用于美国白蛾不同性别成虫的荧光定量内参基因，并设计了候选内参基因的实时荧光定量PCR引物，该引物特异性强，扩增效率高，填补了美国白蛾不同性别成虫下没有内参基因的现状，为美国白蛾不同性别成虫下的相关功能基因的表达定量提供可靠的分析依据，为功能基因的挖掘奠定必要的前期基础，同时可提高功能基因研究的重复性、稳定性和可靠性。

附图说明

图1是RT-qPCR引物扩增的特异性图；图中，第一排从左到右依次为RT-qPCR引物扩增内参基因β-actin、RPL13和AK的特异性图；第二排从左到右依次为RT-qPCR引物扩增内参基因EIF4A、α-tub和UBI的特异性图；第三排从左到右依次为RT-qPCR引物扩增内参基因RPS26、RPS15和HcSP2；

图2是美国白蛾不同寄主植物内参基因的平均C_q值图；

图3是内参基因的RefFinder综合评价结果图；

图4是geNorm算法中的成对变异值V_n/V_n+1图；

图5是目的基因HcSP2验证内参基因稳定性图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行。

以下实施例所采用的供试材料为：美国白蛾幼虫被采集于江苏省淮安市楚州区古城墙遗址公园樱花上(33.62°N，119.02°E)。带回室内，采用人工饲料在温度26±1℃的温度，65％±5％的湿度，16L：8D的光周期条件下的恒温光照培养箱(RXZ型智能人工气候箱，宁波江南仪器厂)进行饲养，直至化蛹、羽化。利用室内繁殖的卵卡在室内利用110ml容量(上底径*下底径*高＝7.1*5.3*4.5)的饲养盒饲养直至化蛹、羽化；在饲养的过程中分别收集雌成虫(2日龄3头)、雄成虫(2日龄3头)作为不同性别成虫的样品，每个性别进行3次生物学重复。

实施例1

1、美国白蛾不同性别成虫总RNA提取及cDNA的合成

收集不同性别成虫饲养下的美国白蛾，每种处理均有三个生物学重复，并分别用液氮冷冻处理，处理后分别采用Trizol方法提取总RNA，并用5mL无RNase的DNase I(TakaraBio Inc.，Kusatsu，Shiga Prefecture，Japan)处理15分钟以去除DNA。使用ThermoScientific NanoDrop 2000紫外可见分光光度计(Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA)检测RNA的浓度和质量。利用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。使用PrimeScript^TMII第一链cDNA合成试剂盒(TaKaRa，大连，中国)，按照说明书进行RNA的纯化和合成cDNA第一条链。在20.0μL反应体系中进行反转录，其中包含4.0μL 5XPrimeScript IV cDNA Synthesis Mix，1.0μL随机引物(50μM)，4.0μL总RNA，11.0μLRNase-free ddH₂O；反转录程序为：30℃持续10分钟，42℃持续15分钟，70℃持续15分钟，最后降至4℃。cDNA产物保存在-20℃。

2、内参基因的选择及其引物的设计

根据文献查询其他昆虫中主要的内参基因并最终选择并设计了本实施例所需的8条候选内参基因，分别为β-αctin、RPL13(SEQ ID NO.1)、AK、EIF4A、α-tub、UBI、RPS26和RPS15(SEQ ID NO.2)。在本申请人已经获得的美国白蛾转录组测序数据库中寻找并鉴定各候选内参基因的开放阅读框open reading frames(ORFs)，根据已鉴定正确的ORFs，利用Primer Primer5.0设计引物。引物(表1)均在南京金斯瑞生物科技有限公司合成，利用普通PCR检测引物特异性，利用琼脂糖胶与凝胶成像系统观察PCR产物的条带。进一步通过RT-qPCR检测引物的特异性与扩增效率，选择单一峰，扩增效率高且阴性对照无峰的引物作为最终引物。

表1内参基因、目的基因及实时荧光定量引物

3、内参基因引物标准曲线的建立

对内参基因的每一对引物制作各自的标准曲线，并计算各自引物的扩增效率。将反转录的cDNA混合后，以10为倍数稀释成5个浓度梯度(100μg/μL、10μg/μL、1μg/μL、0.1μg/μL和0.01μg/μL)，作为标准曲线的建立模板。同时，以ddH₂O作为阴性对照，以检测试剂或人为污染。所有样品均设置3次重复。用Applied Biosystem 7500 System(AppliedBiosystems，Carlsbad，CA，USA)进行RT-qPCR，对获得的数据计算斜率与扩增效率，RT-qPCR引物的扩增效率合格区间为85％-130％之间。

4、实时荧光定量

利用SYBR Premix Ex Taq^TM II(No.RR820A；TaKaRa，Kusatsu，Japan)进行实时荧光定量，反应体系总体积为20.0μL，其中10.0μLSYBR Premix Ex-Taq^TMII，正反向引物(10mM)各1.0μL，2.0μLeDNA(100ng/μL)，6.0μL RNase-free ddH₂O。反应程序为：95℃持续5s，60℃持续30s。加入熔解步骤循环(55℃持续10s，然后每10s 0.5℃升至95℃)，验证每个反应产物是否存在单个峰。

5、稳定性评估

内参基因稳定性分析，利用geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Cq和RefFinder等五种算法综合分析内参基因的表达稳定性。筛选出稳定的内参基因。

6、内参基因稳定性验证

选用美国白蛾丝氨酸蛋白酶基因基因HcSP2当作目的基因，验证已筛选的稳定内参基因与最不稳定的内参基因，荧光定量PCR程序同步骤4。

7、结果

(1)总RNA提取质量及引物特异性检测

各样品的OD_260/280与OD_260/230比值均符合要求。总RNA完整，无降解现象，各样品平均总RNA浓度为1568±382ng/μL。8对内参基因的引物在实时荧光定量中的熔解曲线均显示单一峰(图1)，扩增效率(表1)较高，说明所有引物不存在引物二聚体，可进行特异性扩增，实时荧光定量结果准确可信。

(2)内参基因C_q值分析

C_q值与基因的相对表达量呈反比，C_q值越小说明基因的相对表达量越高，反之C_q值越大说明基因的相对表达量越低。8个内参基因C_q值的平均值在14.42-32.94之间(图2)。

(3)稳定性评估

应用geNorm、NormFinder、BestKeeper和Delta Cq等四种算法对内参基因的稳定性进行分析，获得稳定性排序结果见表2，内参基因RPL13在geNorm和NormFinder算法结果中均排第一，且在Delta Cq算法结果中排第二，表明内参基因RPL13是最稳定的参考基因(表2)。而a-tub四种算法中均排倒数第一，表明在不同性别成虫条件下α-tub是最不稳定内参基因。基于RefFinder算法的综合分析，结果表明8个候选参考基因的稳定性结果从高到低排列如下：RPL13、RPS15、AK、RPS26、β-actin、UBI、EIF4A和α-tub(图3)。此外，根据geNorm成对变异值V_n/V_n+1分析来确定合适的内参基因个数，当V_n/V_n+1＜0.15时，采用n个内参基因个数，当V_n/V_n+1＞0.15时，采用n+1个内参基因个数。本实施例的成对变异值V_2/3＝0.053＜0.15，表明不同性别成虫下仅需要选择2个内参基因进行基因的相对表达量分析(图4)。综合C_q值与geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Cq和RefFinder等五种算法的评估结果，表明RPS15和RPL13基因是适用于美国白蛾不同性别成虫下的荧光定量内参基因。

表2geNorm、NormFinder、BestKeeper和Delta Cq等四种算法对内参基因的稳定性的评估结果

(4)内参基因稳定性验证

选用美国白蛾丝氨酸蛋白酶基因HcSP2当作目的基因，来验证所筛选的2个稳定内参基因RPS15和RPL13，荧光定量PCR程序同上，同时选用最不稳定的a-tub基因进行比较，发现用稳定的2个内参基因对目的基因在不同性别成虫条件下的相对表达量进行校正时，RPS15和RPL13存在相似的变化趋势，而用内参基因α-tub校正时，目的基因的相对表达量的变化趋势显著不同，说明本实施例的结果可靠，所筛选获得的内参基因RPS15和RPL13可适用于美国白蛾不同性别成虫条件下功能基因的实时荧光定量分析(图5)。

需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京市园林和林业科学研究院（南京市园林绿化指导站）

<120> 美国白蛾不同性别成虫荧光定量内参基因及其引物和应用

<130> 100

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 610

<212> DNA

<213> Hyphantria cunea

<400> 1

atgggtaagg gtaataatat gatacccaat ggtcatttcc ataaggattg gcaaagattt 60

gtcaaaacat ggttcaatca accagcgaga cgtcaccgca gaaagcaaaa cagagtcaag 120

aaggctaagg ctattgcacc acgtcctgct gccggtccat taaggccggt tgtccgttgt 180

cctactgttc gttatcatac caaggttcgg gcaggacgtg ggtttactct ccgtgaaatc 240

agggcagccg gacttaaccc tgcttttgcc agaactattg gcattgcagt ggatcctcgc 300

agacgtaaca aatctgtaga gtcgcttcaa accaatgttc aaaggataaa agagtaccgt 360

gcccgtctca tcttgttccc gaagggcaag aaggtactga agggtgaggc taatgaggaa 420

gaacgtaagt tagctacaca gctccgtgga cctctgatgc cagtgcagca gccagcgccc 480

aagtccattg cacgtgctat cactgaggag gagaaggact tcaaagccta ccaatatctg 540

cgaggggctc gttctattgc caaacttgtt ggaatccgtg ctaagcgact gaaggatgcg 600

gcagagaacc 610

<210> 2

<211> 512

<212> DNA

<213> Hyphantria cunea

<400> 2

ctgtcaggtt gacatgcaca gtttttgact acttcttttc tctcgattct gtcatacaaa 60

tcggaaacat ggctgaggtt gatgaaactc ttaagaaaaa acgtaccttc aggaagttta 120

ccttccgagg agttgatctc gatcaactac tggatatgcc caatgaacaa ctcatggagc 180

tcatgcactc ccgcgcccgt aggcggtttg cccgcggctt aaagcgcaaa ccaatggcgc 240

tggttaaaaa actcagacgc gccaagaaag aagcaccacc aaatgagaag cctgagattg 300

tgaagactca cttgagaaac atgatcattg tccccgaaat ggttggctcc atcgtcggta 360

tctacaatgg aaagactttt aaccaggttg aaatcaagcc cgagatgatt ggacattacc 420

taggcgagtt ttcagttaca tacaagcctg tgaagcacgg taggcccggt attggtgcca 480

cccacagttc caggttcatc ccactcaagt ag 512

Claims (6)

1.美国白蛾不同性别成虫的荧光定量内参基因，其特征在于，为RPL13和RPS15，其中，RPL13基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，RPS15基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的美国白蛾不同性别成虫的荧光定量内参基因的引物，其特征在于，RPS13基因的引物序列如下：

RPL13正向引物：5′-TCCATTAAGGCCGGTTGTCC-3′；

RPL13反向引物：5′-AGGATCCACTGCAATGCCAA-3′。

3.权利要求1所述的美国白蛾不同性别成虫的荧光定量内参基因的引物，其特征在于，RPS15基因的引物序列如下：

RPS15正向引物：5′-GCGTCACTCTCAAGATCAGC-3′；

RPS15反向引物：5′-ATGGTGCAGATCCTCCAGTC-3′。

4.权利要求1所述的内参基因在美国白蛾不同性别成虫荧光定量中的应用。

5.权利要求2所述的RPL13基因的引物序列在美国白蛾不同性别成虫荧光定量中的应用。

6.权利要求3所述的RPS15基因的引物序列在美国白蛾不同性别成虫荧光定量中的应用。

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