CN111100945B

CN111100945B - 红椿的内参基因及其引物和应用

Info

Publication number: CN111100945B
Application number: CN202010055429.6A
Authority: CN
Inventors: 李培; 宋慧云; 段志豪; 周玮; 毛文迈; 欧阳昆唏; 陈晓阳
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-01-17
Filing date: 2020-01-17
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2040-01-17
Also published as: CN111100945A

Abstract

本发明公开了红椿的内参基因及其引物和应用。本发明筛选出在红椿4℃胁迫下的内参基因60s‑L18和CYP95，茉莉酸甲酯(MeJA)胁迫下的内参基因UBC17和CYP95，干旱胁迫下的内参基因PP2C57和EF1‑α，红椿不同组织部位的内参基因18S rRNA和TUBα‑3，利用筛选的内参基因，可提高红椿相关基因表达量分析研究的稳定性和可靠性，填补了红椿研究领域中缺少内参基因的空白。

Description

红椿的内参基因及其引物和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及红椿的内参基因及其引物和应用。

背景技术

红椿(Toona ciliata)，隶属楝科(Meliaceae)香椿属(Toona)，为国家Ⅱ级重点保护野生濒危植物，广泛分布于中国的华南、华中地区以及北亚热带的南缘。红椿树干通直，材质优良，心材红褐色，纹理优美，是建筑、家具、室内装饰良材，具有很大的开发潜力，素有“中国桃花心木”之称为。近年来，学者一方面致力于开发红椿潜在价值，如红椿的茎皮化合物、生物药学、精油、木材密度以及胁迫影响等；另一方面加大了对红椿栽培技术的研究，通过遗传多样性分析、自然种群动态分析、优树选育、种群分布、扦插、组织培养以及病害防治等技术研究，为红椿自然资源的繁育和保护提供科学依据。红椿的良种选育极其重要，现有研究多采用传统育种，耗时，费力且成效低等。红椿分子育种方面的研究极少，单一的育种模式大大的限制了红椿育种工作的推进。分子育种具有高效、针对性强、节省人力物力等特点，已被广泛应用于林木良种选育，其主要是探究基因表达的机理及作用途径，然后通过调控基因的表达改变植株性状，从而获得新品种。

基因表达分析是植物分子生物学领域研究中重要手段之一，在探求基因模式、调控机理、揭示植物内部奥秘等方面有至关重要的作用。研究基因表达的方法有很多，如Northern，microarray，实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和高通量测序等，其中荧光定量PCR应用最为广泛，它具有高灵敏度，准确性、特异性等特点，是监测整个PCR过程的有力工具。但是荧光定量结果通常受到多个错误来源的影响，如起始材料的量，RNA的完整性，逆转录和qRT-PCR扩增等。因此，为了获得准确的qRT-PCR分析结果，需要一个表达稳定的内参基因进行校正和标准化，从而控制样品内部和样品间不必要的误差。内参基因的表达具有时空特异性，没有一个内参基因可以在所有的试验条件下都能持续的稳定表达，因此内参基因的选取必须具有目的性，针对特定实验条件筛选出特定实验条件下表达稳定的基因才能保证实验结果的准确性和严谨性。

目前，关于红椿内参基因的开发筛选的研究报道一片空白，若要对红椿特定胁迫条件下相关分子生物学机制进行研究，内参基因的开发和筛选至关重要。

发明内容

本发明针对现有技术中缺少对红椿基因表达量分析的有效校正和标准化的内参基因的不足，提供红椿的内参基因及其引物和应用；通过分析红椿转录组数据，进行内参基因的开发；选取红椿在4℃胁迫、茉莉酸甲酯(MeJA)胁迫、PEG6000干旱胁迫及红椿不同部位的内参基因的筛选和验证，获得适用于红椿在不同条件下的内参基因及其引物，克服了传统看家基因的缺点和不足。

因此，本发明的第一个目的是提供低温胁迫下红椿的内参基因，为内参基因60s-L18和CYP95，所述的内参基因60s-L18的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述的内参基因CYP95的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

本发明还提供所述的低温胁迫下红椿的内参基因的特异性引物，所述的内参基因60s-L18的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述的内参基因CYP95的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

因此，本发明的第二个目的是提供茉莉酸甲酯胁迫下红椿的内参基因，为内参基因UBC17和CYP95，所述的内参基因UBC17的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述的内参基因CYP95的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

本发明还提供所述的茉莉酸甲酯胁迫下红椿的内参基因的特异性引物，所述的内参基因UBC17的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述的内参基因CYP95的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

因此，本发明的第三个目的是提供干旱胁迫下红椿的内参基因，为内参基因PP2C57和EF1-α，所述的内参基因PP2C57的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述的内参基因EF1-α的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

本发明还提供所述的干旱胁迫下红椿的内参基因的特异性引物，所述的内参基因PP2C57的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，所述的内参基因EF1-α的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

因此，本发明的第四个目的是提供红椿不同组织部位的内参基因，为内参基因18SrRNA和TUBα-3，所述的内参基因18S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述的内参基因TUBα-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。

本发明还提供所述的红椿不同组织部位的内参基因的特异性引物，所述的内参基因18S rRNA的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，所述的内参基因TUBα-3的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。

本发明还提供所述的内参基因或所述的特异性引物的应用。

优选，所述的应用，为所述的内参基因或所述的特异性引物在制备荧光定量试剂盒中的应用。

本发明通过选取红椿在4℃胁迫、茉莉酸甲酯(MeJA)胁迫、PEG6000干旱胁迫及不同部位的样品；利用红椿转录组数据，筛选出红椿的候选内参基因；以候选内参基因的序列为模板，设计实时荧光定量PCR的内参基因扩增引物；进行实时荧光定量PCR；通过△Ct、GeNorm、NormFinder、BestKeeper对获得的荧光定量PCR数据进行统计分析，分别筛选出红椿在4℃胁迫、茉莉酸甲酯(MeJA)胁迫、PEG6000干旱胁迫及不同部位表达稳定的内参基因。

本发明遵循荧光定量PCR引物设计的原则，进行跨内含子设计荧光定量PCR引物，引物扩增片段长度为100-200bp，这样设计的引物可以避免gDNA污染带来的实验误差，使实验数据更加准去可靠。

相比于现有技术，本发明具有以下优点：

(1)本发明从20个候选内参基因中筛选出红椿在4℃胁迫、茉莉酸甲酯(MeJA)胁迫、PEG6000干旱胁迫及不同部位表达稳定的内参基因，数据真实可靠，为红椿抗虫抗冻、抗干旱等响应机制的分子生物学研究提供校正工具，填补了红椿研究领域中缺少合适的内参基因的空白。

(2)筛选出的内参基因适用于红椿在4℃胁迫、茉莉酸甲酯(MeJA)胁迫、PEG6000干旱胁迫及不同部位的关键基因的表达分析，可提高数据的准确性。

(3)本发明提供的内参基因可以为香椿属其他植物的研究提供参考价值。

附图说明

图1是以红椿DNA为模板，候选内参基因gDNA片段电泳图；

图2是以红椿cDNA为模板，候选内参基因CDS片段电泳图；

图3是以红椿cDNA为模板，利用设计的候选内参基因荧光定量PCR引物扩增红椿cDNA产物电泳图；

图4是所有候选内参基因利用对应的荧光定量PCR引物扩增后的熔解曲线；

图5是候选内参基因在所有样品中CP值分布范围；

图6是红椿不同胁迫下叶片中候选内参基因的稳定性；

图7是红椿不同胁迫下叶片中最适内参基因的个数；

图8是红椿不同胁迫下候选内参基因在NormFinder软件下稳定性分析；

图9是MYB基因在不同胁迫条件下叶片中的相对表达量。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：4℃低温胁迫下红椿稳定表达的内参基因筛选

1)材料选择及处理方法：

选择一年生、长势一致红椿无性系苗木，置于光照培养箱内(光照条件：60lx光照16h，28℃；黑暗8h，22℃；70％RH)预培养7d后分别做以下处理：在4℃胁迫0、6、12、24、36h后采取叶片；在茉莉酸甲酯(MeJA)胁迫下0、6、12、24、36h后采取叶片；在0％、5％、10％、20％、30％的PEG6000胁迫7d后采取叶片。同时，采取多年生红椿植株的花、成熟叶(选取的是从顶芽起最后三个叶的最后四个小叶)、嫩叶(选取的是从顶芽起前三个叶的前三个小叶)、芽(选取的是顶部的第一个芽，即顶芽)、嫩茎(选取的是从顶芽起1-6cm部分)及根作为不同部位的材料。每个时间点、每个处理、部位三个生物学重复，液氮速冻，-80℃保存。

2)RNA的提取与检测：

利用HiPure HP Plant RNAKit B(Magen)分别提取红椿叶片及其他部位的总RNA(提取方法与试剂盒说明书一致)；首先利用琼脂糖核酸电泳检测RNA的完整性，1*TAE缓冲液，1％琼脂糖凝胶，在150V电压下电泳15min；然后用全自动核酸蛋白快速检测仪对RNA的浓度和质量进行检测(选取OD260/280在2.0-2.2的RNA用于后续实验)。

红椿DNA的提取：利用天根植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)提取红椿叶片的DNA，用于扩增候选基因的gDNA片段。

3)cDNA的合成：

取0.5ug红椿的总RNA用于反转录，反转录试剂盒为HiScript II Q RT SuperMixfor qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme)；

4)候选内参基因的筛选：

查阅相关文献，结合红椿转录组数据，初步筛选一些内参基因，然后将初筛的内参基因在NCBI-Blast数据库中进行比对，选出与数据库中同源性较高的基因作为候选内参基因；

5)候选内参基因内含子与外显子区域的获得：

根据红椿转录组数据设计候选内参基因(PGK2、60s-L18、Histone-6、PP2C57、PP2C59、Histone-1、UBC5B、UBC17、Actin-7、SAMDC、EF2、CYP95、EF1-α、18S rRNA、60s-L13、TUBα-3、MUB1、TUBα-5、CYP26-2、TIP41)的克隆引物(表1)，以红椿DNA和cDNA为模板，克隆候选内参基因的gDNA序列(图1)和CDS序列(图2)，连接到pEasy-Blunt3载体上测序得到候选内参基因的gDNA序列和cDNA序列，在NCBI-Blast数据库进行序列比对分析，获得候选内参基因的外显子区域和内含子区域。

表1 克隆候选内参基因gDNA和CDS序列的引物

注：F为正向引物；R为反向引物。

6)特异性引物的设计及检测：

遵循荧光定量PCR引物设计的原则，在NCBI-Primer数据库中进行跨内含子设计荧光定量PCR引物(表2)，以红椿cDNA为模板，通过普通PCR对引物特异性进行初步检测(图3)。

表2 荧光定量PCR引物及标准曲线详情

注：F为正向引物；R为反向引物。

7)荧光定量PCR引物标准曲线的建立：

将反转录的cDNA稀释成6个浓度梯度(稀释倍数为1000、200、40、8、1.6、0.32)，作为标准曲线建立的模板，对每一对引物(表2)进行荧光定量PCR。

8)荧光定量PCR：

以反转录的cDNA为模板，对每一个内参基因进行荧光定量PCR扩增，获得Ct值；扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸10s，运行40个循环；用得到的Ct值绘制标准曲线，得到各候选内参基因的扩增效率和斜率，候选内参基因引物扩增效率均在90％-110％之间(表2)。20个候选内参基因其对应的荧光定量PCR引物扩增后的熔解曲线如图4所示。

9)内参基因稳定性分析：

利用△Ct、GeNorm、NormFinder、BestKeeper四种统计分析的方法对候选内参基因的稳定性进行分析。所有候选内参基因在叶片和嫩茎中的Ct值均分布在10-30之间，均符合内参基因表达量的要求。

通过geNorm软件计算各个候选内参基因在胁迫表达稳定性平均值M值，并对内参基因的表达稳定向排序。以0.15为阈值，通过标准化因子配对差异分析(V_n/n+1)值来判断内参基因的最佳数目。

4℃低温胁迫下分析结果如图6A所示，红椿候选内参基因在低温胁迫下稳定性由强到弱依次为60s-L18/CYP95>18S rRNA>TUBα-3>PGK2>Actin-7>EF1-α>PP2C57>UBC17>EF2>UBC5B>SAMDC>PP2C59>Histone-1>60s-L13>TIP41>TUBα-5>Histone-6>MUB1>CYP26-2。

茉莉酸甲酯胁迫下分析结果如图6B所示，红椿候选内参基因在茉莉酸甲酯胁迫下稳定性由强到弱依次为UBC17/CYP95>EF1-α>Histone-1>EF2>TIP41>Histone-6>Actin-7>18S rRNA>UBC5B>PP2C57>PGK2>TUBα-3>TUBα-5>60s-L18>60s-L13>MUB1>SAMDC>PP2C59>CYP26-2。

PEG6000胁迫下分析结果如图6C所示，红椿候选内参基因在PEG6000胁迫下稳定性由强到弱依次为PP2C57/EF1-α>MUB1>PP2C59>Histone-6>UBC5B>EF2>PGK2>18S rRNA>Actin-7>60s-L18>CYP95>SAMDC>CYP26-2>UBC17>TUBα-5>TIP41>TUBα-3>Histone-1>60s-L13。

红椿不同部位分析结果如图6D所示，候选内参基因在红椿不同部位下稳定性由强到弱依次为18S rRNA/TUBα-3>PGK2>TIP41>EF1-α>EF2>Histone-1>Actin-7>PP2C59>CYP95>UBC5B>60s-L18>UBC17>SAMDC>60s-L13>TUBα-5>MUB1>PP2C57>Histone-6>CYP26-2。

同时geNorm用于确定准确定量的最优内参基因数目，在第n个标准化因子和第n+1个标准化因子之间分析配比差异。分析结果如图7所示，在不同胁迫下V2/3<0.15，即红椿在不同胁迫下稳定表达的内参基因组合最小数目是2，即最佳内参组合为：低温胁迫(60s-L18、CYP95)；茉莉酸甲酯胁迫(UBC17、CYP95)；PEG6000胁迫(PP2C57、EF1-α)：不同组织部位(18S rRNA、TUBα-3)。其对应的特异性引物如表2所示。

NormFinder软件分析如图8所示，Stability value的值越小，该基因越稳定。

低温胁迫下20个候选内参基因的稳定性排序为CYP26-2<MUB1<Histone-6<TUBα-5<TIP41<60s-L13<PP2C59<Histone-1<SAMDC<UBC5B<CYP9518SrRNA<EF2<60s-L18<EF1-α<PP2C57<UBC17<PGK2<TUBα-3<Actin-7，如图8A所示；

茉莉酸甲酯胁迫下20个候选内参基因的稳定性排序为CYP26-2<PP2C59<SAMDC<60s-L13<60s-L18<MUB1<TUBα-5<TUBα-3<Histone-6<PGK2<EF2<TIP41<Histone-1<EF1-α<Actin-7<PP2C57<UBC5B<CYP95<UBC17<18S rRNA，如图8B所示；

PEG6000胁迫下20个候选内参基因的稳定性排序为60s-L13<Histone-1<TUBα-5<CYP26-2<60s-L18<CYP95<PGK2<UBC17<TUBα-3<TIP41<Actin-7<EF1-α<SAMDC<EF2<PP2C57<PP2C59<UBC5B<MUB1<Histone-6<18S rRNA，如图8C所示；

在红椿不同组织部位下20个候选内参基因的稳定性排序为CYP26-2<Histone-6<PP2C57<MUB1<60s-L13<TUBα-5<SAMDC<60s-L18<UBC17<Histone-1<A ctin-7<UBC5B<EF2<EF1-α<CYP95<PP2C59<TIP41<PGK2<TUBα-3<18S rRNA，如图8D所示。

BestKeeper是通过计算候选内参基因CP值的变异系数(CV)和标准差(SD)的大小来比较各候选内参基因的稳定性，变异系数和标准差越小，稳定性越好。表3(及图5)结果显示，在低温胁迫下，18S rRNA稳定性最强；在MeJA胁迫下，60s-L18稳定性最强；在PEG6000胁迫下，CYP26-2稳定性最强；在红椿不同组织部位中中，Histone-6稳定性最强。

表3 候选内参基因的稳定性(BestKeeper)

实施例2：对红椿的MYB基因表达量进行定量分析

为了验证筛选出来的内参基因的准确性及稳定性，用geNorm软件分析中在低温胁迫下最稳定的的两个内参基因及组合(60s-L18,CYP95,60s-L18+CYP95)与最不稳定的两个内参基因(CYP26-2,MUB1)分别定量验证基因MYB在低温下胁迫0、6、12、24、36h的表达量；用geNorm软件分析中在MeJA胁迫下最稳定的两个内参基因及组合(UBC17,CYP95,UBC17+CYP95)与最不稳定的两个内参基因(CYP26-2,PP2C59)分别定量验证基因MYB在MeJA胁迫0、6、12、24、36h的表达量；用geNorm软件分析中在PEG6000胁迫下最稳定的两个内参基因及组合(PP2C57,EF1-α,PP2C57+EF1-α)与最不稳定的两个内参基因(60s-L13,Histone-1)分别定量验证基因MYB在0％、5％、10％、20％、30％PEG6000胁迫下的表达量；用geNorm软件分析中在红椿不同组织部位最稳定的两个内参基因及组合(18S rRNA,TUBα-3,18S rRNA+TUBα-3)与最不稳定的两个内参基因(CYP26-2,Histone-6)分别定量验证基因MYB在花、成熟叶、嫩叶、芽、嫩茎、根中的表达量。最后利用2^-△△Ct法计算验证基因的相对表达量，△Ct＝Ct(目的基因)-Ct(内参基因)，△△Ct＝△Ct(处理)-△Ct(对照)，2^-△△Ct＝相对表达量。

低温胁迫下MYB基因的相对表达量如图9A所示，利用两个最稳定内参基因60s-L18和CYP95定量时，MYB基因的表达量均呈现出12h上调后在24h出现明显下调，在36h再次上调，表达趋势和相对表达量基本一致；而用CYP26-2定量时，MYB在36h继续下调；MUB1定量时，MYB随时间加长一直上调，且在同一时间处理下，相对表达量与最稳定的两个内参基因定量的MYB的表达量差异较大。

MeJA胁迫下MYB基因的相对表达量如图9B所示，用最稳定的两个内参基因及其组合定量MYB基因时，表达量和表达趋势基本一致；用CYP26-2定量时，表达趋势基本一致，但是在6h和12h的表达量相对较高；用PP2C59定量时，表达量差异较大且表达趋势不一致。

PEG6000胁迫下MYB基因的相对表达量如图9C所示，用最稳定的两个内参基因及组合定量时，MYB的表达量和表达趋势区域一致；用60s-L13和Histone-1定量时，表达趋势和表达量相差较大。

在红椿不同组织部位中，MYB基因在各个组织相对于成熟叶的表达量如图9D所示，用最稳定的两个内参基因及其组合定量MYB基因时，表达量和表达趋势基本一致；用CYP26-2定量时，MYB表达趋势和表达量的差异较大；用Histone-6定量时，表达趋势不一致且表达量也相差较大。

综合上述实验发现，使用筛选的稳定的两个内参基因及组合标准化定量分析时其结果一致；用不稳定的内参基因标准化分析时，定量结果差异较大。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 红椿的内参基因及其引物和应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcctggatgc cttgtatgtt g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggaaagcac caagcagttt c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acccggcctc ttatctatgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acaagctccc cgaataccac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgtcgaaac gcatcttgaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaaacacccc tcccgcataa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgttgcagct ttacaaggcg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgaacaaatc accgcctcca 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccgaccttct tcaggtagga a 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tccaaggatg gtcagactcg 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gctgctaaga gagagcggg 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gggagctcag aatgggttcg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tacaacagtt ggcggctgat 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgtaccgcgg agatgttgtt 20

<210> 15

<211> 264

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgtacaagg aatacagaga cacaactctt aacggtgctg ttgagcaaat gtacactgag 60

atggcatctc gccatagggt gaggtttcct tgcattcaaa tcattaagac agccaccatt 120

cctgcaaagc tctgcaagag ggaaagcacc aagcagtttc ataactccaa aatcaaattt 180

cccttggttt tcaggaaggt taggccccca actaggaagc tcaagacaac atacaaggca 240

tccaggccta acttattcat gtaa 264

<210> 16

<211> 4283

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttaaataaaa taccagatcg ggaaaaatcg gtaaacataa agaataactg agtgagaaaa 60

agggaaagta gacctagatt tgcctggatg atcatctacc acatcaggtt gtctatctgt 120

acttctgtta gatttagcat ctgcttcaat gccattgctc cgctgctctc cgttctcttt 180

gggagttcct tcatcctctt cctttgcaaa catgtcaaca tcctggctct ttttatgaag 240

aagggaagca gcttctttct ccacagctaa agcagactta ttcccacctg aagattatta 300

aaaaaaagat gtagcataaa actcaaaagc tatttaagaa tcgaccatcc gaagaaatat 360

ccaaaacata gatgaattca caaagtgctt cctttataag ccaagaccat ttaagaatgt 420

atttgtgttc taattaattg ccaagcagac agcacacgct tcccaaccct tgaccttgtg 480

caaggttgca taggtatgaa aggtggtaga agcacatcct attcctccat gtaccagatt 540

gtgacgacat gtaaaaggtc atgtctataa actaaaatta gtttaaataa aaaaagaaca 600

ccctcccacg cccccctctc tctctcttct tctgtttttt ttttcaatct ttcttatgca 660

gagatctgga cagaaaataa tctaagattg caaatatgaa aaggaagcaa tttctaggtt 720

taacattagc taatattgca aaaccaatca atattaaaac gtaacagcaa tcagctaact 780

gggagattac ctgctttctg agaaggttct ttctgtttcc tttcttttcc ttgaacatca 840

agatcatctt tgctactact atcacttgta ctatcgctgt cagtgtctga aagactatcc 900

aatgacctaa taaaaaggaa gcgaattata aacacatatt ggcttacatt cgtagatgga 960

agaagactgc aaaaggtact acatgctatg cagccatatt tggatgggat tttgtgataa 1020

ttaacaaact aaacatgata cttgagaatt atagatattg tagatacaac cttttagatc 1080

tgcgcttgga tctcttatca cgcctcttac gctttttttc ccgtcgtcta tctcttcttt 1140

ttccacgtct atgtttgtct cttttagaag atctctttct ctttctgcgt ctatcatcac 1200

ttgaagaact aatatcagac gacgacgaca aatataggtc agaatcgcta tctgattcag 1260

atgattccat ctcagaatct gaggaagtct ctgaatcaga ggaagagtat cttctcttct 1320

tcctcttgtt tcttgaagat ttcttgtcct tccccttcct ccgggcttca tggttgctac 1380

catcaaggga agcatctttt gccattttca atttgtttcc tttcctttta tctgtgcaaa 1440

aagaaacaat caacttaata tataatattg acaatcaata cttaaaaggc aagaaccact 1500

atccaacaaa gggctagaaa attttcttac cctcgctaaa ttcaccacaa ttgataattt 1560

tcactgttac agtaggtctc ccttcttcat cgccaacatt ttcaattctt ttcaatacct 1620

catgtccttg cacaagctcc ccgaatacca catatttcct gttaaaaatg acagaacaga 1680

gactgagaaa actagcaact tgatggcatg tcaaataaaa cttaaacaga gtaaatatta 1740

acaataaaga gatagacaaa tactgaacat agtctaatta gcgtttacaa aattcaagta 1800

cacaaacaaa agaatccaca gtacacatac ctgtcaaggt tatgattagc cttaaaggtg 1860

atgatgaatt gagaacctaa tgtgtcacga ttggcaatag gcatagataa gaggccgggt 1920

tcatcatgct ttagcctggg cgattcatct gaaattatgt catagctacc actagttacc 1980

aatcatgaaa attgaaaaga aaccttattc agtaaactat aacttaaaaa aagaaaatga 2040

tcaaaatatc ccaatgtact accactatca aattttaaag gcatactaac tttcatcttt 2100

catacattac aaaagagctt gtttgaccat ttattaaagt ctggaaaaag agatttcact 2160

tgcaaccgaa attcaaaaag catgaaatca ttatatggaa aattgacagt tatcataaga 2220

tatagcttct gtaaatgtgg caaaaatttg caaaaaactc aacatgatat atatgcttga 2280

gttaaaacgt aagttgacaa cataatatcc aagtatgcaa tagcagccaa aagaagcaat 2340

ttagaagcac cttgcaatgg ggcaagtcaa acaaacgttt cacaacctgc tcatcataca 2400

taagcaggaa ccactcagat aaactaatat gcacaaatca aaattacaaa tactcacata 2460

aaagagcata atgcaaatta tgcattatta taacctgtgt ataagaaaca aaactctaca 2520

attgaaatgt aattctacat ttatgtaaaa aaaaggttaa tttatttatt taaaattccc 2580

acaactctca cctcctgata catgaagtta actttacagg agaattcaaa ttagcaagaa 2640

tgcaatctca cctggaaatt tcccctcgta tatgctttct ccactactcc ctgtacaaaa 2700

gagtgaaatt gtaaagccaa tcaaatacaa taaactggta agataaaact aaatttggtt 2760

gtcaaaatta aaaaagaaat ctgtcagtag cattatcaca caaattcata atgatgctta 2820

cttggctggt tgatacatta atcaaaatct aaacctcatt tgaaaaacat tgattacact 2880

ataaccctat acaattagta acaaagaaac taaatgataa tcaggaacac agatggaatg 2940

aacacaaaac agactccaac gacaagattc tgaaaagggt ttgaatagta aacactccca 3000

gctaaatcat gtactccact tactctcaat atattattta ttcttgatag catagctttt 3060

cctaacttca ttatattaac ttaaccacca acctttttac tcaaatttct attttaatag 3120

gttactgatt cacaatagtt ccaacaaaag ctcaagatca catccactcc atttcaatta 3180

ctgattgtag taattggaaa agcaaacatc actagcaggt aatcaattca attcagtaat 3240

acactttata agtatatttc cagtataatt tataccccta ttttaaaagc cattttagta 3300

acacttgcaa taaaagaaaa ttagattctc ggcgcaacct taataaaaac agtaaagcag 3360

tacctaaatt gtacacaaaa taaaacaact acacaaaatg catatagaac tatagacaat 3420

atgaaaagtt tatacaaaag ttacatacca tctcttctta caaaatcacc accctgcaaa 3480

acaaagacaa attattagca cactgttaag aacaaagcca aaaaaatggt acagaactgg 3540

gtgggcgcgg cgaagttcag taaaattttg agtatgggca acttagtaag tacaacctta 3600

aaactacatc acaagaaaag cagtcgtgac catcagccct gtgtcctaca gcataaacaa 3660

tagtaactga ctaaagtaac tgactgaaag acagaccact tccaacccat gctttaaaaa 3720

gaaaaggaaa cttcaaacct attcaagtaa gacaattcag ataaaaaaat aagacaatat 3780

aacaaacctc agccatggaa cctttaatga ctcgatggaa aaaggacccc ttgtagtgca 3840

atggttttcc agttctagga ccaattccct tttctcctga ggatgcaata aaagtttgaa 3900

aaatatcagc caaacaacaa aatgaaccag ataagactaa gaatgttgca atcccacatg 3960

aaaacatgtt ataacaaaat aaaccacaca cacatgctac ctgtacaaag tgcccggaaa 4020

ttttcagcag tcttaggagc aacatcagag aaaatctgca taatcaaagg cccatttgtt 4080

aatcaaaact atgcacttat aatttggagg gacaatcata gtaatcaata agcaataacc 4140

taaacaccaa aaattaaaat acagaaacat aattacaatg tagctggcta caaacatgat 4200

aatacctcaa aaaccattct ttcaacagga tcaccgtcaa ttgaaacatc cataaacaca 4260

agtgtgttct tcttctttgc cat 4283

<210> 17

<211> 1546

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tcaaagccga atcctgatga taacaataaa aatgcaggaa aggtgatagt tagatgaaac 60

cttagaaata gtaagtgctg ggctccattg ttccttgaga atatccagac atatgcttcc 120

attgctattg atatttgggt ggaagacttt agtcctaaat gcaaccttaa acatataact 180

tgattagcct tatcacgtat ttattatatg aaacaaagaa aataacaatt tagatagaat 240

tttactaatt ccaacaaatt agcagtaatg acttaactga taaaatcaag aagataacat 300

gcaacttgaa attatattta aaaaaaataa tcgaataatt ttaaaatagc tttctgccac 360

tttttaactg ccaaaaggac catgttagca ttaaaccatt tgatagtcaa accacaacag 420

gagaattagt aattttttct aataacgaca aaagtaattt tcctggggat gtaaaagaaa 480

cacaatagat tttatcaatt ggcaaatttt ccgttagttt tagaaacttc agtaatccaa 540

aaaaaattgg tatccaaaaa aataacccaa gtctcaaaat gaagtaatga tggttgtata 600

caagtaaata caaatttgga aacttcagtt tataaggcac caggagacta catgtagact 660

ctaattttct tctttcctct cccctccatt tcgaaaacac ttagaagatt tactttcctt 720

tctaccggaa acttctctca tcacccatta ttcctcactt cccatctcct caatcagcaa 780

taacacctac aacaaatgaa cactcctaac ccaaaggaga atttaaagat ctcaactctt 840

agaaattaaa aaaaaaaaaa aaaatggata gtttgatcgt gttctgggaa ggcatgtcac 900

gttaatagat ttcttttaaa gccacaaact agagtatata aggaagaggt ttcaagaaat 960

taaaaaattc aagacttaac aagaaaatat atttaagatc agcattccaa attaagtaat 1020

tttatcattt taattcgttc gcaaaaccat gattcgagat ggaaatcatg aaaagagatt 1080

tccatattat tcaaacaaca ggagctagtc taccaacaag aacatgcaat ggggggaggt 1140

taacaaaaga atagatgatt taaaacacct gaatttacaa caaaagtaac caaaagctaa 1200

tatttttttt ccaattatca atgaaataat tgaacaaaaa gagaaaaaga aaaagattaa 1260

taccttgggg ggtttaaaag ggtaatcagg aggaaaatga atggaaacaa gaaacacccc 1320

tcccgcataa ggactatcag ttggtcccat tattgttgct tgccaatgaa acatgtcctc 1380

cgcaatagga cctacattac cacaaacaaa ttacagacta aattcataat tgttatttaa 1440

ataaaaagtg aaaaatcaaa aaataaaata caataccggc actgcaagag gtaggaggat 1500

ctttctgtaa atctttgagc tccttcaaga tgcgtttcga cgccat 1546

<210> 18

<211> 1359

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tcaaatttca catttcggat tgaagaaaat gtgagctaga agggaaagca aatacaagta 60

ggacaaaatt tgaagaacag gaaaacacac ccatccacct gcttctctga ttcttttaat 120

ttcttgaaga gaggcctgat tgcttccata aggccgatga ggattagtca gtatatctgc 180

ttttccagaa cgagatagaa cctgcatcaa aatatcaatt aagagaaaac aaaaatcata 240

aaatatttaa aggttttatt ctattcaatg tgaagagaaa aatttggaat actacaagag 300

ctgcccttct tgtacgtacc acgcatgagt caccaatatg tgagatgaac aaatcaccgc 360

ctccaatgat cataacagtc gccgttgaac cggattcatc cttctccgca ttcgtgtcaa 420

gcctttacaa aaaccaaaca ccatcgagat cttcaatgcc atgatataga tttcacaata 480

atcttacact gtatgtacta ttacatacag atttccatgg aaaagaataa ttttcgctca 540

aaccatcaat cgccttacca attcaacaat tttgcatcag cattttcaaa agcctcctgt 600

aatgccttcc taatggcatt gaaatctttt tctctcaaag caatccgcct tgtaaagctg 660

caacacactc cttgtatagc tcatccctgc aatgtgaaaa tcagatcatt ggcaacacgt 720

taaacaaatt atagaattga agtagtacca tatacaatat tcacttcata aatggaataa 780

tcctgaactg tagttaagat ttatgaacta atgataatta gttatttatt atcatacaca 840

tataaaatta ttctaaaaac ttctcaagct gagagaacat caatataact gaacatttca 900

ttagctttta tcgattggct taagcttttt ggtcaaatag tgaacccacg attacacaag 960

atgcatatag aacacaaaat cataataaca acaaattagt aagaatatca gaacttaatc 1020

atattggcca aacctaagaa acttgacaga agagactcca ccatggccat caaaaacagc 1080

tgcaaaagag aacccatcca agccatccga ttgtacaata acatcatctt ccatttcttc 1140

acgtgggccc tgaaaactcg ccgaccccca tcggattcca ccaactccac tcaacgaaga 1200

aggcgagtct attgcaatcg ccgagcagca ctggctttta cctctcgctg ttgttgtatt 1260

gacaaggttt gtaccggttt tgatagcggg cttgaagtta gagttgtagt tgagcctcgt 1320

taaaagaaat ctctgtaact gctgactcaa caacgccat 1359

<210> 19

<211> 1217

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctccttctcc aactccttgc cagatcgcct gtcaatcttg gtcaatagct ctgcaaactt 60

gacagcaatg tgggaggtgt ggcagtccag cactggggca taaccgttac caatctgtcc 120

tgggtggttc atgatgatga cctgcgaggt gaagttggca gcctccttgg cgggatcgtc 180

cttggagttg gaagcaacaa atccacgctt gagatccttg acagcaacgt tcttcacgtt 240

gaaaccgaca ttgtcaccag gaagggcctc ctggagagct tcgtggtgca tctcaacaga 300

cttaacttca gtggtcagtc ctgagggacc aaaagtaaca accataccgg gcttcaggac 360

accggtctca acacgaccca ctggaacagt tccaatacca ccaatcttgt acacatcctg 420

aagcgggagt cggaggggct tgtctgaggg cctctttggc tcattgatct ggtccagggc 480

atcaaggagg gttgggccct tgtaccagtc gaggttggtg gacctctcaa tcatgttgtc 540

accctcaaaa ccagaaatgg ggacaaaagg aatcttgtca gggttgtatc cgaccttctt 600

caggtaggaa gacacttcct tcacaatttc atcatacctt gctttagagt actttggggt 660

ggtggcatcc atctgtattg caaacatgat attagtttca attgctcatc aagactaaga 720

aaacagcaca aacttaaaac tgaagtaaag ctcaccttgt tacagcagca aatcatctgc 780

ttcacaccaa gagtaaaagc aagcaatgca tgctcacgag tctgaccatc cttggagata 840

ccagcttcaa aaccaccagt ggtggagtca atgatgagga cagcacagtc ggcctgtgaa 900

gtaccagtaa tcatgttctt gataaagtca cggtgtccgg gagcatcaat gacggtgcag 960

tagtactttg tggtctcaaa cttccacaag gcaatatcaa tggtaatacc acgctcacgc 1020

tcagccttta acttgtcaag cacccaagca tacttgaatg acctcttgtt catctcagca 1080

gcttcctttt cgaacctctc aatcacacgc ttgtcaatac caccaagctt gtagatcaag 1140

tgtccggtag tggtcgactt tccagagtcg acatgtccaa tgaccacaat gttgatgtga 1200

accttctcct tacccat 1217

<210> 20

<211> 1922

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atgaacagaa tgggtgagaa agagcacaat gataatgtag aaagaagcta acaggactga 60

gggagaacaa gaggtgaatc tagtgggtcc tcccgaggaa gagaatcaag aatcaaataa 120

aaaaaaatca gagagatgta acaagtctag cagtttatta catgtctcag ttgagttgtt 180

tctattgcag cttacaagaa tgctattcga gagcagaaac tagctttaga aatttctgct 240

gctaagggag agcgggattt ctatctttct aaagttgata agtcccgtgc gttgagtttt 300

atagaagaac gattaaagaa ggtgagcaat gtgttacttc ttccataatc cttgtttgtt 360

aaatttctat caaattgatt cagtttcact catagctttc gtagtttaag cattggatgc 420

atttaagtat cttaactggc atgcttgctt agcgctggtt atgatgagtg gcatggatga 480

attcaaagaa ctttaatact aggggaatat ctctgcttga tgaaatgaaa taaggaacag 540

accatttaaa acatgtggtt agctgtatgg gttaactctg taactgaaag ttggtcacaa 600

attttggagt tcttctgggt gcttgtcgtc tatgactctg aatatgtttg ctcattaagg 660

ttgtaatttt gagaggggaa aataaaaaat aaataagtga atgaaatggt cacaagcata 720

acaggagaaa ctttgttcct taattgttct ctatctatat ttatttttct tgaaagattt 780

tacttaaaag agttgcatta tactcttggt ttcgcagaat gttaaggagc tggtagtaca 840

tcaagaaatt gtagatccta gagtttaggt gtgtagaatc tggaggaaca ttcaatgttg 900

cctgttatat caaacggatt tatggtttgt aataactttg agagtaattt agcaccgaaa 960

cggtgcaact gataacttta cctggtgagg tccgacttgc ttaggcatgc taatgctact 1020

tcttgctaat gagtgatgct tatgacatct tcaatcacga aggcatgact tgagcaagtc 1080

tattatgtct gtggatatat attttcagga gtgagataat tttatatact tataacccta 1140

attattatgt tcatttacaa aattggtgaa gaagcaccct ttaaaggtaa cccaccctct 1200

ttttctcttt gacttgattg catttcttgt tgaatgcatc catgatttaa atctcttttc 1260

tatggtcaat ttcactgcat tctcttcttt tatactttct tctgtatgtt gcttctgtag 1320

tgtctctatc ttctcttgtt taagttaaag aattacagta aagtttggag gacaacatac 1380

tgatgtaaat gaactccctt gatgggcctt tgaagcttta attatcatca tctttagatt 1440

tttgctaaac tttgaaccta ataaggtcac ataattaaat cattgctctt gaatgataac 1500

ttaaaagttt tatttatgaa tggagctatt ttattcctta aaatccactg aaagcttgta 1560

aatttgtgcc gattccgttg atgacaatat ggaaaagatg atatattatt tgaacttaca 1620

caatatgctt gtcagttgta gatacactaa gattgtttga actgtaaagt tattgtaaat 1680

ttctttattt tttctctctc ttatgaaaaa gcatcatcta ctttgaaaag acatccatat 1740

aattcctcat gctctgttct tttcatttct cacagaagca aaaggtagaa gaagagtctc 1800

aaacccattc tgaattccct ggtagccagc aggtgaagaa ggtgattcgc caattcccac 1860

agaaacaacc agttgcagac agtgcaacac agagcaaatc tcgactctca aaagatgtcc 1920

tg 1922

<210> 21

<211> 2575

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tcaataatct tcaccttcct cttcatcgtc aacaccttct gcaccaactt cctcataatc 60

tttctcgaga gcagccagat cttcacgtgc ttctgagaat tccccttcct ccatgccttc 120

accgacatac cagtgcacaa atgccctctt ggcatacatg agatcaaatt tgtgatcaat 180

gcgtgagaac acttcagcca cagcggtgtt gttgctgatc atgcaaacag cccgctgcac 240

cttggccagg tcacccccgg gtacaacagt tggcggctga tagttaatac cacatttgaa 300

gccagttggg cacctgtcgt tccaaacagg caaatgtcat aaagaatagt ggatattatt 360

tccaaaaggt ggaccctaat ggatttgaat tttcatctct ctctgcagaa atcacacaat 420

ttctggcaag taatatggaa gtttccttac cagtcaacaa actgcacagt ccttttggtt 480

ttgatggtgg caacggcagc attaacatcc ttgggaacaa catctccgcg gtacatcaag 540

cagcaggcca tgtacttccc gtgtctgggg tcacacttgg ccatcatgct agagggctca 600

aacactgcat ttgtgatctc aggaactgat agctgctcat gatatgcttt ctcagctgag 660

atgacagggg catatgaaga gagcatgaaa tggatacggg gatatggtac aaggtttgtc 720

tggaactccg taatatcaac attaattgct ccatcaaacc tcaatgatgt cgtcaaagat 780

gatatgattt gagatatcaa tcgattcaaa ttagtgtaag ttggcctctc aatatctagg 840

gacctccgac aaatgtcgta aatagcttca ttgtccaaaa gcacagagac atctgtgtgc 900

tcaagaaggg catgagtaga cagaacacta ttataaggct ccacaactgc cgttgacacc 960

tgaaatatag gcagtatatt ccaattatgt tataatatat ctgtaagtat gaaagcacaa 1020

gaattagatt acaatttttt gatccatgtt accaagagta aatcacataa gaaatgaatg 1080

gaaaggagat ggggtagagt accatggatt aaagtcatca aatactatta taggtacctg 1140

aggagaagga tagatagtga agccaagctt cgacttcttt ccataatcta cagacaagcg 1200

ttctaggagc aacgacccga aaccagaacc agtaccacca ccaacagcac tgaacaccaa 1260

aaatccttgc aacccggtac agttatcagc caacttcctc actctatcga gacaaaggtc 1320

cacaatttcc ttcccaactg cacaacaaaa ctacaaccaa cgtaaccata aagaaaaaaa 1380

agaaataata aaataataca aaaagcacaa caaaacaatt gttatttcat gcaatttaca 1440

aacaacagca attacctgta tagtgacctc ttgcaaaatt gttagctgca tcttccttgc 1500

cagaaataag ctgctctggg tggaaaagtt ggcggtaagt accggtccta acttcatcga 1560

tgacagttgg ttcaagatca acaaacacag ctcttggcac atgcttgcca gcgctagttt 1620

cactgaagaa cgtattgaag gcatcatggg caacacccac tgaagtgtca ctgcacacac 1680

caatatttag aaagggcggt caatataatt tttcacctaa atctgagtaa acatactaaa 1740

acaaaaagca atattgtgca aacattcaac cagaatatta ttttcttgca aggaaaaaag 1800

ttaattgtag aatgtataga aattttgggc caaattcttg aactattata ctgctataat 1860

tcatccttat tcatccaaat tagctctaac cttctcatta aaaccaaaaa ggataaatca 1920

tagatgctaa aattgtaggt tcttctgaat aaccagtcta tagaaaatca ctaaaaggta 1980

actccacgcc catcccaatt cacataataa acacatacga aggaaaaaat gaattttttt 2040

tcataatgca ataaaccgac caacaagttt gatctttata agcccattaa tcaaaaattc 2100

acataaatta atggacataa tctactttta cactcacccc aactcataca acaaacacaa 2160

aagaaataaa aatattttta catcaaatgc aataaaccca ccacaaacca tgatctcatc 2220

atcaaatcca cacaaattca gccagaaaga tttgatcttc atatgctcat taaaaaaata 2280

caatcaaaat caactttaac actcatccag atctaaaact cggaactttt cacaaaaaat 2340

gcaacaaacc taccaacaaa aacccatgat ttctttcacg atcacatcca caaagtttcg 2400

atcttcacac tctcattaca aatgacgaac aaagaaacaa aaagggcacg tataaaacat 2460

acctgggcat catcccatca ggctgaattt catgttcaag gcagtaaagc tcccagcagg 2520

aatttcccac ctgaattcca gcttgtccaa tgtgtatact aattatttct ctcat 2575

Claims

1.荧光定量PCR检测4℃胁迫下红椿叶片的内参基因表达的特异性引物，其特征在于，所述的内参基因为内参基因60s-L18和CYP95，所述的内参基因60s-L18的核苷酸序列如SEQID NO.15所示，所述的内参基因CYP95的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述的内参基因60s-L18的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述的内参基因CYP95的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

2.荧光定量PCR检测茉莉酸甲酯胁迫下红椿叶片的内参基因表达的特异性引物，其特征在于，所述的内参基因为内参基因UBC17和CYP95，所述的内参基因UBC17的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述的内参基因CYP95的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述的内参基因UBC17的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述的内参基因CYP95的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

3.荧光定量PCR检测干旱胁迫下红椿叶片的内参基因表达的特异性引物，其特征在于，所述的内参基因为内参基因PP2C57和EF1-α，所述的内参基因PP2C57的核苷酸序列如SEQID NO.18所示，所述的内参基因EF1-α的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；所述的内参基因PP2C57的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，所述的内参基因EF1-α的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

4.荧光定量PCR检测红椿不同组织部位的内参基因表达的特异性引物，其特征在于，所述的内参基因为内参基因18S rRNA和TUBα-3，所述的内参基因18S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述的内参基因TUBα-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；所述的内参基因18S rRNA的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，所述的内参基因TUBα-3的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。

5.内参基因60s-L18和CYP95作为荧光定量PCR检测4℃胁迫下红椿叶片的基因表达的内参基因的应用，其特征在于，所述的内参基因为内参基因60s-L18和CYP95，所述的内参基因60s-L18的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述的内参基因CYP95的核苷酸序列如SEQID NO.16所示。

6.内参基因UBC17和CYP95作为荧光定量PCR检测茉莉酸甲酯胁迫下红椿叶片的基因表达的内参基因的应用，其特征在于，所述的内参基因为内参基因UBC17和CYP95，所述的内参基因UBC17的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述的内参基因CYP95的核苷酸序列如SEQID NO.16所示。

7.内参基因PP2C57和EF1-α作为荧光定量PCR检测干旱胁迫下红椿叶片的基因表达的内参基因的应用，其特征在于，所述的内参基因PP2C57的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述的内参基因EF1-α的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

8.内参基因18S rRNA和TUBα-3作为荧光定量PCR检测红椿不同组织部位的基因表达的内参基因的应用，其特征在于，所述的内参基因18S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述的内参基因TUBα-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。