CN118207359A - 假俭草非生物胁迫下的内参基因rip及其引物和应用 - Google Patents
假俭草非生物胁迫下的内参基因rip及其引物和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118207359A CN118207359A CN202410541364.4A CN202410541364A CN118207359A CN 118207359 A CN118207359 A CN 118207359A CN 202410541364 A CN202410541364 A CN 202410541364A CN 118207359 A CN118207359 A CN 118207359A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- stress
- genes
- under
- eremochloa ophiuroides
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000025852 Eremochloa ophiuroides Species 0.000 title claims abstract description 54
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 162
- 230000035882 stress Effects 0.000 claims abstract description 87
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 63
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 7
- 102100022419 RPA-interacting protein Human genes 0.000 abstract 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 20
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 18
- 102100024365 Arf-GAP domain and FG repeat-containing protein 1 Human genes 0.000 description 17
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 description 16
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 9
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 5
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 4
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 4
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 4
- 108010043934 Sucrose synthase Proteins 0.000 description 4
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 101150077062 pal gene Proteins 0.000 description 4
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101150109071 UBC gene Proteins 0.000 description 3
- 102100023038 WD and tetratricopeptide repeats protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 3
- 101710190951 50S ribosomal protein L2 Proteins 0.000 description 2
- -1 ANI Proteins 0.000 description 2
- 101100408351 Arabidopsis thaliana PIP1 gene Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 2
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 101000929940 Homo sapiens Adrenocortical dysplasia protein homolog Proteins 0.000 description 2
- 101000730577 Homo sapiens p21-activated protein kinase-interacting protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 2
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 102100032579 p21-activated protein kinase-interacting protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- CQOQDQWUFQDJMK-SSTWWWIQSA-N 2-methoxy-17beta-estradiol Chemical compound C([C@@H]12)C[C@]3(C)[C@@H](O)CC[C@H]3[C@@H]1CCC1=C2C=C(OC)C(O)=C1 CQOQDQWUFQDJMK-SSTWWWIQSA-N 0.000 description 1
- 101710117445 60S ribosomal protein L2 Proteins 0.000 description 1
- 101710117436 60S ribosomal protein L8 Proteins 0.000 description 1
- 102000016954 ADP-Ribosylation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010053971 ADP-Ribosylation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241001633683 Centipeda <firmicute> Species 0.000 description 1
- 108050001186 Chaperonin Cpn60 Proteins 0.000 description 1
- 102000052603 Chaperonins Human genes 0.000 description 1
- 102000001493 Cyclophilins Human genes 0.000 description 1
- 108010068682 Cyclophilins Proteins 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000018932 HSP70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010027992 HSP70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100033636 Histone H3.2 Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 101710132637 Protein C2 Proteins 0.000 description 1
- 101710132697 Protein L2 Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101710195626 Transcriptional activator protein Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 108060008747 Ubiquitin-Conjugating Enzyme Proteins 0.000 description 1
- 102000003431 Ubiquitin-Conjugating Enzyme Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- QLULGSLAHXLKSR-UHFFFAOYSA-N azane;phosphane Chemical compound N.P QLULGSLAHXLKSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000001921 nucleic acid quantification Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了假俭草非生物胁迫下的内参基因RIP及其引物和应用，属于分子生物学领域，本发明提供了RIP基因作为内参基因在检测假俭草非生物胁迫下假俭草基因表达量的应用，所述非生物胁迫为铝胁迫。本发明还提供了RIP内参基因的特异性引物，该特异性引物的特异性强，能够大大提高检测假俭草基因表达量时的检测效率，并提高检测结果的可信度。
Description
本申请是分案申请，原申请的申请号为：202211536965.3，申请日为
2022.12.02，发明名称是：假俭草非生物胁迫下的内参基因及其引物和应用。
技术领域
本发明属于分子生物学领域，尤其涉及假俭草的内参基因RIP及其引物与应用。
背景技术
假俭草[Eremochloa ophiuroides(Munro)Hack]是C4结构的暖季型多年生草本植物，属禾本科黍亚科蜈蚣草属，蔓延速度快、匍匍茎发达，具有植株低矮、水肥需求少、耐粗放管理、抗病性强等特点，为城乡绿化、边坡绿化、水土保持及生态治理的理想草坪草，是全球三大暖季型草坪草之一。目前，干旱和寒冷等极端天气频繁发生、南方酸性土壤和滨海土地盐碱等因子都严重影响假俭草的正常生长，耐草铵膦的新品种缺乏，这些都为假俭草后期育种提出了新的要求，选育抗逆、耐盐、耐酸、耐草铵膦的假俭草品种非常有必要。
选择抗旱、抗寒等抗逆基因及耐草铵膦基因对研究假俭草的相关分子机理，促进相关新品种选育具有重要意义。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是一种进行精准核酸定量的重要试验方法，具有灵敏度高、重复性好、特异性强和高通量等的特点，在基因表达研究中被广泛使用。稳定表达的内参基因是基因表达分析结果准确的重要前提，理想的内参基因应具备在所有细胞中、不同的生长阶段及各种生理状态下均能稳定表达的特点，但传统的管家基因稳定性不一，因此，根据具体的实验条件，筛选合适的内参基因是保障目标基因表达定量准确、可靠的关键。
目前，还没有关于假俭草抗寒、抗旱、耐盐、耐铝和耐草铵膦的内参基因筛选的报道，因此，开发一组假俭草在低温、干旱、盐、铝和草铵膦胁迫下的内参基因以保证对假俭草的选育效果是十分必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一组假俭草非生物胁迫下的内参基因及其引物和应用，本发明利用qRT-PCR技术对13个假俭草内参基因在低温、干旱、盐、铝和草铵膦胁迫下的表达稳定性进行检测，以geNorm、NormFinder和BestKeeper3个软件分析的基因稳定性评价为参考，以RefFinder软件进行基因稳定性评价为主要依据，综合软件分析结果，分别筛选出在各胁迫下稳定表达的内参基因，每个胁迫处理筛选2个基因，共筛选出内参基因10个；解决了现有假俭草定量PCR检测中没有内参基因的现状。
为实现上述目的，本发明通过下述技术方案来实现：
UBC基因作为内参基因在检测假俭草非生物胁迫下假俭草基因表达量的应用；
优选的，所述非生物胁迫为铝胁迫或低温胁迫。
内参基因UBC的特异性引物，正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。
ANI基因作为内参基因在检测假俭草非生物胁迫下假俭草基因表达量的应用；
优选的，所述非生物胁迫为草铵膦胁迫。
内参基因ANI的特异性引物，正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。
RIP基因作为内参基因在检测假俭草非生物胁迫下假俭草基因表达量的应用；
优选的，所述非生物胁迫为干旱胁迫、草铵膦胁迫或盐胁迫。
内参基因RIP的特异性引物，正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示。
MD基因作为内参基因在检测假俭草非生物胁迫下假俭草基因表达量的应用；
优选的，所述非生物胁迫为盐胁迫、低温胁迫、干旱胁迫或铝胁迫。
内参基因MD的特异性引物，正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明基于假俭草前期转录组测序挖掘出一组假俭草内参基因，并利用这些内参基因的碱基序列设计出了各内参基因的引物；本发明不仅解决了现有假俭草定量PCR检测中没有内参基因的现状，而且在将内参基因的引物分别用于假俭草低温、干旱、盐、铝和草铵膦胁迫下的基因表达分析时，能够提高假俭草基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性。同时，本发明所设计的内参基因的引物的特异性强，能够大大提高检测假俭草基因表达量时的检测效率，并提高检测结果的可信度。
附图说明
图1为13个候选内参基因的引物特异性(从左向右依次代表UBC、GADPH、ACT、SuS、ANI、ADP、CYP、H3、50S、RIP、MD、CP、HSP70)
图2为不同胁迫下各内参基因的Ct值；
图3为各内参基因在不同胁迫下的表达稳定性；
图4为在不同胁迫下内参基因归一化后目的基因的表达水平；
图4中的a代表干旱胁迫下不同内参基因归一化后目的基因的表达水平；
图4中的b代表盐胁迫下不同内参基因归一化后目的基因的表达水平；
图4中的c代表低温胁迫下不同内参基因归一化后目的基因的表达水平；
图4中的d代表铝胁迫下不同内参基因归一化后目的基因的表达水平；
图4中的e代表草铵膦胁迫下不同内参基因归一化后目的基因的表达水平。
具体实施方式
本发明提供了UBC基因作为内参基因在检测假俭草非生物胁迫下假俭草基因表达量的应用；所述非生物胁迫为铝胁迫或低温胁迫。
本发明提供了所述UBC基因的特异性引物，正向引物和反向引物分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明提供了ANI基因作为内参基因在检测假俭草非生物胁迫下假俭草基因表达量的应用；所述非生物胁迫为草铵膦胁迫。
本发明提供了所述ANI基因的特异性引物，正向引物和反向引物分别如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了RIP基因作为内参基因在检测假俭草非生物胁迫下假俭草基因表达量的应用；所述非生物胁迫为干旱胁迫、草铵膦胁迫或盐胁迫。
本发明提供了所述RIP基因的特异性引物，正向引物和反向引物分别如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示。
本发明提供了MD基因作为内参基因在检测假俭草非生物胁迫下假俭草基因表达量的应用；所述非生物胁迫为盐胁迫、低温胁迫、干旱胁迫或铝胁迫。
本发明提供了所述MD基因的特异性引物，正向引物和反向引物分别如SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示。
在本发明中，检测假俭草非生物胁迫下假俭草基因表达量的方法为荧光定量PCR法；
在本发明中，内参基因UBC、ANI、RIP和MD的核苷酸序列如表1所示。
表1各内参基因的碱基序列
在本发明中，所述各内参基因的特异性引物如表2所示，
表2各内参基因的特异性引物
所述F代表正向引物，R代表反向引物。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.材料及处理
将假俭草种子，用10％氢氧化钠浸泡5min，随后用无菌蒸馏水冲洗干净，将种子播于20×15×5cm塑料盆中，每盆1.3g，浇注浓度为50％的霍格兰营养液，在昼夜温度分别为23℃和19℃、光周期12h、相对湿度75％、光照强度250(umol·m-2·s-1)的生长室中培养90天后，分别进行4℃的低温胁迫、20％PEG-6000干旱胁迫、200mM NaCl盐胁迫、100μmMAlCl3铝胁迫、6μL/mL草铵膦胁迫，每个处理组采用3个重复(即3个花盆)。在每个处理后的0、0.5、1.5、3、6、12、24、48和72h采集叶片样品，采集的样品立即在液氮中冷冻，并储存于-80℃的冰箱用于后续RNA提取。
2.方法
2.1总RNA的提取和逆转录
用组织研磨仪粉碎重为0.1g的假俭草叶片组织，用M5 HiPer Plant ComplexMini Kit(北京聚合美生物科技有限公司)提取总RNA。RNA的质量通过运行1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行验证。每个样本提取总RNA(200ng)，使用M5 SuperplusQpcrRTkitwithgDNARemover(北京聚合美生物科技有限公司)逆转录成cDNA的第一链，并保存在-80℃进行进一步分析。
2.2特异性引物的设计与验证
在假俭草转录组测序的基础上，选择了13个候选内参基因，分别为：UBC(Ubiquitin-conjugating enzyme：泛素结合酶)、GADPH(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase：甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、ACT(Actin：肌动蛋白)、SuS(sucrose synthase：蔗糖合成酶)、ANI(Alkaline andneutral invertase：碱性和中性转化酶)、ADP(ADP-ribosylation factor：ADP核糖基化因子)、CYP(Cyclophilin：亲环蛋白)、H3(Histone H3：组蛋白H3)、50S(50S ribosomalprotein L2：50S核糖体蛋白L2)、RIP(60SRibosomalprotein L2：60S核糖体蛋白L2)、MD(Malate dehydrogenase：苹果酸脱氢酶)、CP(Chaperone protein：伴侣蛋白)、HSP70(Heat shock70kDaprotein：热休克70k Da蛋白)。
所述13个内参基因的特异性引物通过Primer Quest软件设计，由有康生物技术公司(成都，中国)合成。通过RT-qPCR反应的熔融曲线，验证了引物的特异性，见图1。
RT-qPCR中候选内参基因引物序列见表3。
表313个候选内参基因的引物序列
所述F为正向引物，R为反向引物。
2.3实时荧光定量PCR
采用北京聚合美生物科技有限公司生产的2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq(with Tli RnaseH)和实时PCR系统(Bio-Rad，美国)进行定量分析。实验在10μL体积的冰浴反应中进行。其中，PCR反应体系包括：1μL cDNA、0.2μLPrimer、0.2μL Primer R、5μL 2×M5HiPer SYBR Premix EsTaq、3.6μL ddH2O。
扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，55℃退火1min，35个循环，然后进行65～95℃溶解曲线分析，每个循环增加0.5℃，持续5s获得解链温度，采集溶解曲线荧光信号，Ct值数据由CFX96TM Real Time System荧光定量PCR仪自动读取。在每个时间点，每个胁迫进行3次技术重复。
2.4数据分析
通过RT-qPCR获得每个参考基因的循环阈值(Ct值)，并通过GeNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件进行分析。用GeNorm和NormFinder进行数据分析时，首先通过公式Q＝2-ΔCt(ΔCt＝Ctsample-Ctmin)，将Ct值转换为相对定量Q值。Ctsample是每个胁迫处理中管家基因的Ct值；Ctmin表示每个胁迫处理中该基因的Ct值最低。然后用GeNorm程序计算每个候选参考基因的表达稳定性测量(M)值。Best Keeper直接利用Ct值进行稳定性分析，无需额外的转换步骤，以衡量变异系数(CV)和标准差(SD)的比较。最后，RefFinder综合上述3种方法，计算出每个参考基因的几何平均和稳定性综合排序指数。较低的指标值表明参考基因的稳定性较高。以成对变异系数Vn/Vn+1确定最佳参考基因数。一般认为，当Vn/Vn+1的值小于0.15时，无需引入新的参考基因；否则，需要第(n+1)个参考基因。
2.5通过目的基因来验证内参基因
本研究在不同胁迫下采用不同的目的基因来对内参基因进行验证。干旱胁迫采用PIP1基因，盐胁迫采用PAL基因，低温胁迫采用Cor413基因，铝胁迫采用ALMT基因，草铵膦胁迫采用BAR基因。为验证所选内参基因，采用各胁迫下最稳定的两个内参基因和最不稳定的一个内参基因分析两个基因的表达水平，采用2-ΔΔCt方法进行计算。每个处理3个生物学重复，每个生物学重复进行3个技术重复。
表45个目的基因碱基序列
/>
/>
/>
/>
/>
3.实验结果
3.1内参基因Ct值分析
内参基因的Ct值与该基因的表达水平成反比。内参基因的Ct值越大，靶基因在样本中的表达量就越低。箱型图最上限和下限分别表示Ct值的最大值和最小值，最矮就表示表达量最高。不同胁迫下各内参基因的Ct值如图2所示。
由图2可知，GADPH在盐胁迫、干旱胁迫和铝胁迫下Ct值最低，说明其表达丰度最高。
3.2内参基因的表达稳定性评价
3.2.1geNorm软件分析
通过geNorm软件分析内参基因的表达稳定性，并计算出M值，M值越低，内参基因的稳定性就越高。各内参基因在不同胁迫下的表达稳定性如图3所示。
由图3可知，在盐胁迫下，RIP和MD基因是表达最稳定的基因；低温胁迫下，UBC和MD基因表达最稳定；干旱胁迫下，RIP和MD基因是表达最稳定的基因；铝胁迫下，RIP和MD基因是表达最稳定的基因，而50S基因表达最不稳定；在草铵膦胁迫中，RIP和ADP基因是表达最稳定的基因，50S基因的表达稳定性最差。
3.2.2NormFinder软件分析
通过NormFinder软件计算候选内参基因的稳定值并进行基因评价，稳定值与内参基因的稳定性成负相关。值越低，稳定性越高。各内参基因在不同胁迫下的稳定值如表5所示，
表5利用NormFinder计算13个假俭草内参基因的表达稳定性值
可知，UBC为低温胁迫下表达最稳定的基因，ANI为草铵膦胁迫下最稳定的基因，MD为盐胁迫、干旱胁迫和铝胁迫下最稳定的基因。
3.2.3Bestkeeper分析
计算内参基因CV±SD的值，当(CV+SD)-(CV-SD)的值为最小时，即为表达稳定性最好的内参基因。各内参基因在不同胁迫下的稳定值如表6所示。
表6利用BestKeeper计算13个假俭草内参基因的表达稳定性值
由表6可知，RIP是铝胁迫与草铵膦胁迫下表达最佳的基因，此外，UBC是低温胁迫下表达良好的内参基因，MD是盐胁迫下表达良好的内参基因，GADPH为干旱胁迫下表达最稳定的基因。
3.2.4RefFinder分析
采用在线网址http://blooge.cn/RefFinder/？type＝reference对geNorm、NormFinder和BestKeeper数据排序进行整合分析并进行综合排序。排序结果如表7所示。
表7利用ReFinder计算13个假俭草内参基因的表达稳定性值
由表7可知：MD和RIP是干旱胁迫下表达稳定性最好的基因；UBC和MD是低温胁迫下表达稳定性最好的基因；MD和RIP是盐胁迫下表达稳定性最好的基因；UBC和MD是铝胁迫下表达稳定性最好的基因；RIP和ANI是草铵膦胁迫下表达稳定性最好的基因；HSP70基因在干旱胁迫、低温胁迫下的表达稳定性均最差，H3在盐胁迫和草铵膦胁迫下的稳定性最差；SuS在铝胁迫下的稳定性最差。
通过geNorm软件分析，以成对变异系数Vn/Vn+1确定最佳参考基因数。一般认为，当Vn/Vn+1的值小于0.15时，无需引入新的参考基因；否则，需要第(n+1)个参考基因。通过geNorm软件分析可知，V2/V3<0.15，因此只需要两个基因来进行验证。
综上，选取MD和RIP为假俭草干旱胁迫下的内参基因，选取UBC和MD为假俭草低温胁迫下的内参基因，选取MD和RIP为假俭草盐胁迫下的内参基因，选取UBC和MD为假俭草铝胁迫下的内参基因，选取RIP和ANI为假俭草草铵膦胁迫下的内参基因。
实施例2内参基因归一化后的目的基因表达水平的检测
为了验证软件程序分析中内参基因的可靠性，在每个胁迫下各选择一个目的基因进行验证，选取实施例1表7中两个表达最稳定的内参基因和一个表达最不稳定的内参基因进行表达模式分析，结果采用2-ΔΔCt方法进行计算。结果如图4所示。图4中所示柱状图代表不同胁迫下不同内参基因归一化后目的基因的表达水平。
由图4中的a可知，在干旱胁迫下，采用PIP1基因进行验证，当使用最佳内参基因组合(MD和RIP基因)进行归一化时，PIP1的表达水平呈上升降低再上升再降低的趋势，这与最稳定的基因MD、RIP的表达趋势相一致；当使用最不稳定的基因HSP70进行归一化时，PIP1的表达水平呈现先上升后下降的趋势，在胁迫6h时表达量达到最大值，大致为0小时的30倍；
由图4中的b可知，在盐胁迫下，采用PAL基因进行验证，当用最稳定表达的基因组合(MD和RIP基因)进行验证时，PAL基因的表达量趋势基本呈现先增大后减小的趋势；但是当采用最不稳定的基因H3时，PAL基因的表达量在胁迫12h时达到最大，而后逐渐降低；
由图4中的c可知，在低温胁迫下，采用Cor413基因进行验证，当使用最稳定的内参基因(UBC和MD基因)进行归一化时发现，Cor413基因的表达量呈先升高后降低其后又逐渐增大的趋势；当使用最不稳定表达的基因HSP70进行归一化时，Cor413基因的表达量并没有明显的趋势；
由图4中的d可知，在铝胁迫下，采用ALMT基因进行验证，使用最不稳定的基因SuS进行归一化时，ALMT基因的表达趋势无明显变化且表达量极高；而当使用最稳定表达基因(UBC或MD基因)进行归一化时，ALMT基因的表达水平较低；
由图4中的e可知，在草铵膦胁迫下，采用BAR基因进行验证，当使用最稳定内参基因的组合(RIP和ANI基因)进行归一化时，BAR的表达量呈现先降低后升高的趋势，在72h时，BAR基因的表达量达到最大值；当使用最不稳定的内参基因H3进行归一化时，BAR基因的表达量呈现逐渐降低的趋势。
综上所述，本发明筛选出来的内参基因具有一定的准确性和可靠性，即干旱胁迫和盐胁迫下MD和RIP基因表达最稳定，低温胁迫下UBC和MD基因的表达稳定性最好，铝胁迫下UBC和MD基因的表达稳定性最好，草铵膦胁迫下RIP和ANI基因的表达稳定性最好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.RIP基因作为内参基因在检测假俭草非生物胁迫下假俭草基因表达量的应用，其特征在于，所述非生物胁迫为铝胁迫。
2.权利要求1所述的RIP基因的特异性引物，其特征在于，正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410541364.4A CN118207359A (zh) | 2022-12-02 | 2022-12-02 | 假俭草非生物胁迫下的内参基因rip及其引物和应用 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211536965.3A CN116144822B (zh) | 2022-12-02 | 2022-12-02 | 假俭草非生物胁迫下的内参基因及其引物和应用 |
| CN202410541364.4A CN118207359A (zh) | 2022-12-02 | 2022-12-02 | 假俭草非生物胁迫下的内参基因rip及其引物和应用 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211536965.3A Division CN116144822B (zh) | 2022-12-02 | 2022-12-02 | 假俭草非生物胁迫下的内参基因及其引物和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118207359A true CN118207359A (zh) | 2024-06-18 |
Family
ID=86357298
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410541364.4A Pending CN118207359A (zh) | 2022-12-02 | 2022-12-02 | 假俭草非生物胁迫下的内参基因rip及其引物和应用 |
| CN202410541358.9A Pending CN118222757A (zh) | 2022-12-02 | 2022-12-02 | 假俭草非生物胁迫下的内参基因ubc及其引物和应用 |
| CN202211536965.3A Active CN116144822B (zh) | 2022-12-02 | 2022-12-02 | 假俭草非生物胁迫下的内参基因及其引物和应用 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410541358.9A Pending CN118222757A (zh) | 2022-12-02 | 2022-12-02 | 假俭草非生物胁迫下的内参基因ubc及其引物和应用 |
| CN202211536965.3A Active CN116144822B (zh) | 2022-12-02 | 2022-12-02 | 假俭草非生物胁迫下的内参基因及其引物和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (3) | CN118207359A (zh) |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101416506B1 (ko) * | 2012-08-10 | 2014-07-09 | 연세대학교 산학협력단 | 비생물학적 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자 및 그의 용도 |
| AR112764A1 (es) * | 2017-07-24 | 2019-12-11 | Spogen Biotech Inc | Enzimas detoxificantes de herbicidas y sus usos |
| CN109517920B (zh) * | 2018-11-27 | 2020-11-24 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法及应用 |
| CN111100945B (zh) * | 2020-01-17 | 2022-06-21 | 华南农业大学 | 红椿的内参基因及其引物和应用 |
| CN111826381B (zh) * | 2020-04-13 | 2021-09-17 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 假俭草促进生根基因EoSINAT5及其植物表达载体和应用 |
| CN112795631B (zh) * | 2021-03-16 | 2022-09-20 | 南京林业大学 | 柳杉非生物胁迫下荧光定量内参基因及其专用引物和应用 |
| CN113249388A (zh) * | 2021-04-14 | 2021-08-13 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 一种假俭草EoPHR2基因及其表达蛋白和应用 |
| CN115044693B (zh) * | 2022-03-07 | 2024-06-25 | 四川农业大学 | 黑药仲彬草实时荧光定量pcr内参基因及其应用 |
-
2022
- 2022-12-02 CN CN202410541364.4A patent/CN118207359A/zh active Pending
- 2022-12-02 CN CN202410541358.9A patent/CN118222757A/zh active Pending
- 2022-12-02 CN CN202211536965.3A patent/CN116144822B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116144822B (zh) | 2024-03-22 |
| CN118222757A (zh) | 2024-06-21 |
| CN116144822A (zh) | 2023-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Haling et al. | Direct measurement of roots in soil for single and mixed species using a quantitative DNA-based method | |
| Rohloff et al. | Metabolite profiling reveals novel multi-level cold responses in the diploid model Fragaria vesca (woodland strawberry) | |
| CN107190062B (zh) | 梨果实不同发育时期荧光定量内参基因的筛选及应用 | |
| CN110331228B (zh) | 珊瑚菜的内参基因及其筛选方法与应用 | |
| CN110055306A (zh) | 一种基于转录组测序挖掘玉米耐低氮基因的方法 | |
| CN114196772B (zh) | 南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量pcr内参基因及其筛选方法和应用 | |
| CN108411007B (zh) | Snp标记及其应用 | |
| CN116144822B (zh) | 假俭草非生物胁迫下的内参基因及其引物和应用 | |
| Juan et al. | Genetic diversity and population structure of Commelina communis in China based on simple sequence repeat markers | |
| CN118291667A (zh) | 假俭草非生物胁迫下的内参基因act及其引物和应用 | |
| CN115044693B (zh) | 黑药仲彬草实时荧光定量pcr内参基因及其应用 | |
| CN109609685B (zh) | 基于芒草转录组序列开发的内参基因及其应用 | |
| CN113046460B (zh) | 灰霉病胁迫条件下的韭菜内参基因及内参基因的引物和应用 | |
| CN115927296A (zh) | 菜心高温胁迫内参基因及其筛选方法和应用 | |
| CN108085409A (zh) | 不同组织中杉木内参基因的筛选方法和筛选基因作为内参基因的应用 | |
| CN107513567A (zh) | 鹰嘴豆ssr指纹图谱的构建方法及应用 | |
| CN111218525A (zh) | 棉花纤维品质相关的GhCYSb基因SNP标记及其应用 | |
| Abiko et al. | Screening of candidate genes associated with constitutive aerenchyma formation in adventitious roots of the teosinte Zea nicaraguensis | |
| CN116064576B (zh) | 紫外线胁迫下燕麦的内参基因及引物序列与内参基因的应用 | |
| CN108424954A (zh) | 一个增加水稻产量的邻氨基苯甲酸合酶等位基因片段及其应用 | |
| CN116179746B (zh) | 一种鉴定梨早期糖积累量的kasp分子标记的引物组及应用 | |
| CN108179222A (zh) | 与水稻高产相关的分支酸变位酶核苷酸序列及其应用 | |
| CN116064919A (zh) | 甘蔗割手密种不同组织荧光定量内参基因的筛选和应用 | |
| CN106244683A (zh) | 用于检测“琼丽”小型西瓜杂交种纯度的引物组合及其方法和应用 | |
| CN117448480A (zh) | 一种检测梨需冷量性状的分子标记及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |