CN109517920B - 一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法及其应用，涉及种质鉴定技术领域，本发明所述构建方法首先分别提取不同种质来源的假俭草样品的基因组DNA；以各假俭草样品的基因组DNA为模板，以(ACA)5、(CTG)11、(GAG)10、(CTG)12、(CCT)7、(CTC)11、(ATC)14、(CTC)10和(CTAC)18的一种或多种SSR分子标记的引物分别进行PCR扩增；将各样品的PCR扩增结果转化为计算机可识别的数码，得到假俭草种质鉴定的指纹图谱。本发明所述构建方法选用9对假俭草SSR分子标记构建指纹图谱，可简便有效地对不同种质来源的假俭草进行区分，经济实用、稳定可靠。

Description

一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法及应用
技术领域
本发明涉及种质鉴别技术领域，尤其涉及一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法及其应用。
背景技术
假俭草在植物分类学上属于单子叶植物纲(Moncotyledoneae)，禾本目(Graminales)，禾本科(Gramineae)，蜈蚣草属(Eremochloa)，是该属中唯一可用作草坪草的优良暖季型C4草本植物。假俭草主要分布于中国长江流域及以南地区，中国中南部为其天然分布中心，它以耐瘠薄、病虫害少及养护水平低而著称，是国内外公认的起源于中国的最好草坪草，有“中国草坪草”(Chinese lawn grass)的美誉。作为乡土草种，假俭草具有良好的观赏与应用价值，非常符合当前国内外草坪产业的发展趋势，是现代城市园林绿化和景观生态建设的优选草种。中国拥有全球最丰富的假俭草种质资源，这些种质资源覆盖了假俭草的分布范围(20°02′～34°36′N、98°36′～120°34′E，海拔0～1460m)，且其分布地域及生境条件各异，从而为假俭草种质资源的遗传基础研究和品种选育提供了得天独厚的优越性。为今后能更好、更便捷地开发利用中国丰富的假俭草资源，首先要做的就是对不同来源的假俭草种质进行鉴定和甄别。
早期，人们多采用形态学的方法对假俭草种质材料进行鉴定，即根据其外部特征以及田间表现来识别不同品种材料。这些方法具有操作简单、相对经济的优点，但鉴定周期长，还易受环境、栽培技术、鉴定者的经验等因素影响，并且随着育种亲本利用集中化，通过形态差异进行假俭草品种鉴定愈来愈困难。近年来，包括同工酶电泳、蛋白质电泳、高效液相色谱等内容的生物化学检测方法，逐渐被应用到植物品种鉴定中来。该技术具有简便、快速、分辨力高、受环境影响小等优点。不过蛋白质具有表达的组织特异性和发育的阶段性，因此，取样部位或时间不一致都会带来误差，影响鉴定工作；而且同工酶一般要从幼苗或生长期的植株中提取，也需一定的鉴定周期；另外可利用的同工酶和所揭示的位点都比较有限，较难区分细小差异。
随着生物技术的飞速发展，基于分子标记技术而建立起来的DNA指纹图谱(fingerprint)在品种、品系鉴别方面发挥着重要作用。品种DNA指纹数据库的构建在一些作物品种纯度及真实性鉴定、种子质量标准化、品种审定及产权登记保护、真假种辨别、品种纠纷等方面具有重要应用价值，在探究某一作物种质资源的亲缘关系、杂种优势群划分、种质资源创新利用及新品种选育等方面发挥着显著作用。当前用于构建植物DNA指纹图谱的标记技术主要有RFLP、RAPD、AFLP、EST、ISSR、SSR等。简单重复序列(Simple sequencerepeat，SSR)，是第二代基于PCR技术的分子标记技术，具有多态性丰富、遗传信息多、操作便利、共显性、高度可重复性等优点，已被广泛应用于植物资源遗传研究和分子辅助育种实践中。
DNA指纹图谱能够从DNA水平上鉴定出品种间的差异或遗传相似性。微卫星(又称为简单重复序列，SSR)是由1-6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段DNA。由于微卫星中重复单元的重复次数不同，因而扩增出的微卫星序列的长度呈现多态性。微卫星序列具有多态性高，重复性和稳定性好等特点，是十分有效的分子标记，被广泛应用于品种鉴定、指纹图谱构建等领域。为了有效保护中国假俭草种质资源和品种知识产权，急需要在中国开展假俭草微卫星标记开发，并应用于假俭草优良品种“分子身份证”构建的研究。
发明内容
本发明为了克服现有假俭草不同种质资源之间的鉴定方法不足的问题，提供了一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法，可更好地开展假俭草种质资源鉴定，保护地方品种、发掘新种质，并弥补传统鉴定方法的不足，且能用最简化的标记对野生和新创制种质进行准确、经济、快速的鉴定。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)分别提取不同种质来源的假俭草样品的基因组DNA；
(2)以各假俭草样品的基因组DNA为模板，以(ACA)5、(CTG)11、(GAG)10、(CTG)12、(CCT)7、(CTC)11、(ATC)14、(CTC)10和(CTAC)18中的一种或多种SSR分子标记的引物分别进行PCR扩增；
(3)将各样品的PCR扩增结果转化为计算机可识别的数码，得到假俭草种质鉴定的指纹图谱。
优选的，所述步骤(2)中，
(ACA)5的引物如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；
(CTG)11的引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；
(GAG)10的引物如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；
(CTG)12的引物如SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8所示；
(CCT)7的引物如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；
(CTC)11的引物如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示；
(ATC)14的引物如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示；
(CTC)10的引物如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示；
(CTAC)18的引物如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示。
优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增使用的体系每10μL，包括：5μL2x Taq PCRMasterMix、上下游引物各0.5μL、1.5μL基因组DNA模板和2.5μL超纯水；
所述上游引物或下游引物浓度独立地为10μmol/L，基因组DNA模板浓度为30ng/μL。
优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增的程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；最后72℃延伸7min。
优选的，所述步骤(3)中，所述将各样品的PCR扩增结果转化为计算机可识别的数码：将各样品的PCR扩增结果中，有扩增目的产物的计作“1”、无扩增目的产物的计作“0”、缺失该SSR分子标记位点计作“9”，转化为依次排列的矩阵，得到计算机可识别的假俭草种质鉴定的指纹图谱。
优选的，所述步骤(1)中，假俭草样品包括全球统一编号为E004、E006、E013、E015、E017、E019、E022、E041、E042、E047、E055、E061、E063、E065、E072、E074、E077、E078、E084、E087、E091、E092-1、E097、E098、E099、E112、E115、E124、E131、E134、E135、E141、E144、E145、E152、E154、E155、E182、E183、E187、E188、E102和E158的假俭草。
本发明提供了上述技术方案所述的构建方法在区分不同种质来源的假俭草中的应用。
优选的，按照上述技术方案所述的构建方法得到假俭草的指纹图谱，以构建所述指纹图谱时采用的SSR分子标记(ACA)5、(CTG)11、(GAG)10、(CTG)12、(CCT)7、(CTC)11、(ATC)14、(CTC)10和(CTAC)18的一种或多种的引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增结果在指纹图谱中的位置，判断待测样品的种质来源。
本发明取得的有益效果：
本发明提供了一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法，分别提取不同种质来源的假俭草样品的基因组DNA；以各假俭草样品的基因组DNA为模板，以(ACA)5、(CTG)11、(GAG)10、(CTG)12、(CCT)7、(CTC)11、(ATC)14、(CTC)10和(CTAC)18的一种或多种SSR分子标记的引物分别进行PCR扩增；将各样品的PCR扩增结果转化为计算机可识别的数码，得到假俭草种质鉴定的指纹图谱。本发明提供的构建方法选用了9对假俭草SSR分子标记，采用这9对假俭草SSR分子标记的引物对假俭草样品DNA扩增，不同来源的假俭草种质资源所得到的特异性条带各有不同，同一SSR分子标记位点上，有些品种有条带，有些则没有，根据SSR分子标记分布差异可以快速有效地区分不同种质来源的假俭草，快速简便、经济实用、稳定可靠。每种假俭草种质都具有自己区别于其它种质材料的特异性条带。
在本发明优选的技术方案中，本发明提供了9对SSR分子标记的引物，这些引物的特异性强、分辨率高、稳定性好。
本发明还提供了上述技术方案所述假俭草种质的指纹图谱的构建方法在区分不同种质来源的假俭草中的应用。
附图说明
图1为(ACA)5的引物对43种假俭草种质材料的PCR扩增图谱；
图2为(CTG)11的引物对43种假俭草种质材料的PCR扩增图谱；
图3为(GAG)10的引物对43种假俭草种质材料的PCR扩增图谱；
图4为(CTG)12的引物对43种假俭草种质材料的PCR扩增图谱；
图5为(CCT)7的引物对43种假俭草种质材料的PCR扩增图谱；
图6为(CTC)11的引物对43种假俭草种质材料的PCR扩增图谱；
图7为(ATC)14的引物对43种假俭草种质材料的PCR扩增图谱；
图8为(CTC)10的引物对43种假俭草种质材料的PCR扩增图谱；
图9为(CTAC)18的引物对43种假俭草种质材料的PCR扩增图谱；
图10为假俭草各种质间的UPGMA聚类图。
具体实施方式
本发明提供了一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)收集不同来源的假俭草种质样品；
(2)分别提取收集的假俭草样品的基因组DNA；
(3)以各假俭草样品的基因组DNA为模板，以(ACA)5、(CTG)11、(GAG)10、(CTG)12、(CCT)7、(CTC)11、(ATC)14、(CTC)10和(CTAC)18的一种或多种SSR分子标记的引物分别进行PCR扩增；
(4)将各样品的PCR扩增结果转化为计算机可识别的数码，得到假俭草种质鉴定的指纹图谱。
本发明对假俭草的样品来源无特殊限定，包括但不限于来源于中国和美国的假俭草样品，更优选的包括全球统一编号为E004、E006、E013、E015、E017、E019、E022、E041、E042、E047、E055、E061、E063、E065、E072、E074、E077、E078、E084、E087、E091、E092-1、E097、E098、E099、E112、E115、E124、E131、E134、E135、E141、E144、E145、E152、E154、E155、E182、E183、E187、E188、E102和E158的假俭草；其中全球统一编号为E004、E006、E013、E015、E017、E019、E022、E041、E042、E047、E055、E061、E063、E065、E072、E074、E077、E078、E084、E087、E091、E092-1、E097、E098、E099、E112、E115、E124、E131、E134、E135、E141、E144、E145、E152、E154、E155、E182、E183、E187和E188的假俭草来源于中国，全球统一编号为E102和E158的假俭草来源于美国。
收集到不同来源的假俭草种质样品后，分别对上述假俭草样品进行基因组DNA提取，得到各假俭草样品的基因组DNA。本发明对如何提取基因组DNA的方式无特殊限定，采用本领域已知的方式即可。在本发明的具体实施例中，采用多糖多酚植物总DNA提取试剂盒(EZgeneTM SuperFast Plant Leaves DNAKit，Biomiga)进行假俭草样品的基因组DNA提取，也可以采用其他市售试剂盒或者自行按照基因组DNA提取方法制备。
得到各假俭草样品的基因组DNA后，本发明以各假俭草样品的基因组DNA为模板，以(ACA)5、(CTG)11、(GAG)10、(CTG)12、(CCT)7、(CTC)11、(ATC)14、(CTC)10和(CTAC)18的一种或多种SSR分子标记的引物分别进行PCR扩增。
在本发明中，本发明优选的对PCR得到的扩增产物进行凝胶电泳，更优选的进行银染，以确定是否有PCR扩增产物。
本发明以(ACA)5、(CTG)11、(GAG)10、(CTG)12、(CCT)7、(CTC)11、(ATC)14、(CTC)10和(CTAC)18这9个SSR分子标记的引物中的一种或多种对基因组DNA进行扩增能够有效区分不同种质的假俭草，不同来源的假俭草种质在本发明所述的SSR分子标记处有不同体现，采用上述SSR分子标记的引物越多则最终构建的指纹图谱特异性越强。
在本发明中，所述(ACA)5、(CTG)11、(GAG)10、(CTG)12、(CCT)7、(CTC)11、(ATC)14、(CTC)10和(CTAC)18中的数字指的是重复括号内碱基排列的次数。
在本发明中，所述(ACA)5的引物优选的如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示：
上游引物SEQ ID No.1：AGCAGGCGATAGACGAGTGT；
下游引物SEQ ID No.2：CAGGTGGTGAGTCGTTGTTG。
在本发明中，所述(CTG)11的引物优选的如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示：
上游引物SEQ ID No.3：GGTGCTCAGTTGCAGCATAA；
下游引物SEQ ID No.4：CGTCATACAACCGGAGGTG；
在本发明中，所述(GAG)10的引物优选的如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示：
上游引物SEQ ID No.5：AGGGCTAGAATTAGGAGGCG；
下游引物SEQ ID No.6：GCGTGAACGCTCACTCACT；
在本发明中，所述(CTG)12的引物优选的如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示：
上游引物SEQ ID No.7：TCAGCAGTTGTGCTGGAATC；
下游引物SEQ ID No.8：CCATGGGAGTGATGATGATG；
在本发明中，所述(CCT)7的引物优选的如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示：
上游引物SEQ ID No.9：TGAGAGAACCCTCATAACACAGA；
下游引物SEQ ID No.10：GGAAAGGCTGTCTATGCTGC；
在本发明中，所述(CTC)11的引物优选的如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示：
上游引物SEQ ID No.11：CTTTGAGAGGGCGCTTATTG；
下游引物SEQ ID No.12：TGACCTTGAGTACGTGCTGG；
在本发明中，所述(ATC)14的引物优选的如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示：
上游引物SEQ ID No.13：AAGCGCCTTCTCCTCTAACC；
下游引物SEQ ID No.14：ATTACTCGGAGGGTCCGTTT；
在本发明中，所述(CTC)10的引物优选的如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示：
上游引物SEQ ID No.15：GGGTACGTCATGATCGTGGT；
下游引物SEQ ID No.16：CTCCGTCTCCTCCTCCTCTG；
在本发明中，所述(CTAC)18的引物优选的如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示：
上游引物SEQ ID No.17：GGCCACACTGCTTTAACCAT；
下游引物SEQ ID No.18：TCGCGGTAAATCTTTTCGAC。
在本发明中，所述PCR反应优选的采用10μL体系，包括：5μL 2x Taq PCRMasterMix、上下游引物各0.5μL、1.5μL基因组DNA模板和2.5μL超纯水；在本发明中，所述上游引物或下游引物浓度独立地优选为10μmol/L；在本发明中，所述基因组DNA模板浓度优选为30ng/μL。
在本发明中，所述PCR扩增程序独立地优选为：95℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；最后72℃延伸7min，反应结束后，产物于4℃下保存。
得到PCR扩增产物后，本发明将各样品的PCR扩增结果转化为计算机可识别的数码，得到假俭草种质鉴定的指纹图谱。
在本发明中，所述将各样品的PCR扩增结果转化为计算机可识别的数码优选为：将各样品的PCR扩增结果中，有扩增目的产物的计作“1”、无扩增目的产物的计作“0”、缺失该SSR分子标记位点计作“9”，转化为依次排列的矩阵，得到计算机可识别的假俭草种质鉴定的指纹图谱。
本发明还提供了上述技术方案所述构建方法在区分不同来源的假俭草种质中的应用。
具体的，按照本发明构建方法得到假俭草的指纹图谱，以构建所述指纹图谱时采用的SSR分子标记(ACA)5、(CTG)11、(GAG)10、(CTG)12、(CCT)7、(CTC)11、(ATC)14、(CTC)10和(CTAC)18的一种或多种的引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增结果在指纹图谱中的位置，判断待测样品的种质来源。
通过对比待测样品的PCR扩增结果和指纹图谱即可快速有效地判断假俭草的种质来源，加之本发明将指纹图谱转化为计算机可识别的数码，利用计算机检索既方便又快速，特异性高。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、假俭草种质资源的选择
假俭草种质样品来源于我国不同地区和美国的43个种质材料，其中来源于中国41份，来源于美国2份(E102，E158)，如表1。
表1供试假俭草核心种质材料
Figure BDA0001881116890000091
Figure BDA0001881116890000101
2、生化试剂
多糖多酚植物总DNA提取试剂盒(EZgeneTM SuperFast Plant Leaves DNAKit，Biomiga)；PCR扩增用的Mix(2x TaqPCR MasterMix)和凝胶电泳分析用的100bp DNAladder marker购自北京擎科新业生物技术有限公司；9对SSR引物购自加拿大生工公司上海分公司。
3、SSR引物序列
根据已报道的假俭草转录组信息以及相关报道，筛选出9对假俭草SSR引物，具体见表2。
表2假俭草SSR引物组序列
引物名称 正向引物(5′-3′) 反向引物(5′-3′) 重复基序
TR2941 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 (ACA)<sub>5</sub>
TR5354 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 (CTG)<sub>11</sub>
TR8741 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 (GAG)<sub>10</sub>
TR34533 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 (CTG)<sub>12</sub>
TR39482 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:10 (CCT)<sub>7</sub>
TR46887 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12 (CTC)<sub>11</sub>
TR51210 SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:14 (ATC)<sub>14</sub>
TR52704 SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16 (CTC)<sub>10</sub>
TR53584 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18 (CTAC)<sub>18</sub>
4、仪器设备
离心机(SIGMR1-15K)，Epoch超微量分光光度计，电泳仪(BG-Power-300)，PCR扩增仪(TC-412与MY Cycler)。
5、假俭草基因组DNA提取
1)、取1g左右的新鲜幼嫩叶片，在液氮中研磨成粉末，备用；
2)、取0.05g粉末至2.0mL离心管中，加入1mL Buffer BL2和20μLβ-巯基乙醇，立即涡旋使样品充分分散，室温放置2min，10000xg离心2min；
3)、完全倒弃上清液，加入600μL Buffer FP和10μLβ-巯基乙醇，并加入8μL RNaseA，迅速涡旋1min，室温放置2min，15000xg离心2min；
4)、小心转移500μL上清液至新的1.5mL离心管中，加入250μL无水乙醇至样品中，迅速涡旋并振荡数次；
5)、把DNA结合柱装在2mL收集管，转移上述混合液体至结合柱中，10000rpm离心60s；
6)、倒弃滤液，把结合柱装回收集管，加入500μL Buffer KB至DNA结合柱，13000rpm离心1min；
7)、再次倒弃滤液，把结合柱装回收集管，加入600μL DNA Wash Buffer至DNA结合柱，13000rpm离心1min；倒弃滤液，并重复步骤7；
8)、将结合柱转移至倒弃滤液的收集管中，并打开DNA结合柱盖子，13000rpm离心2min；
9)、将结合柱转移至新的1.5mL离心管中，加入50μL预加热到65℃的ElutionBuffer至结合柱膜中央，65℃水浴下静置5min，13000rpm离心1min。
10)、丢弃DNA结合柱，收集提取液，并进行核酸含量检测，并将DNA保存在-20℃，备用。
6、SSR-PCR反应体系及扩增程序
PCR反应采用10μL体系，包括5μL 2x TaqPCR MasterMix、1μL引物(上下游引物1:1混合)、1.5μL基因组DNA模板和2.5μL超纯水；所述上游引物或下游引物浓度独立地为10μmol/L，基因组DNA模板浓度为30ng/μL。
PCR扩增程序为：95℃预变性3min，94℃变性30s，Tm＝55℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；94℃变性30s，Tm＝55℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；最后72℃延伸7min，反应结束后，产物于4℃下保存。
7、PCR扩增产物凝胶电泳及银染显色
扩增产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳缓冲液为1×TBE，200V稳压电泳2～2.5h，至加样缓冲液移到凝胶底部时电泳结束。银染显色，照相记录。
1)、玻璃板清洗用清水和洗涤剂将平、凹玻璃板充分清洗干净，然后用蒸馏水冲洗，置于玻璃板架晾干；为防止灌胶时有气泡产生，灌胶前用酒精擦洗玻璃板，晾干备用；将组装好的玻璃板水平放齐，用夹子固定。
2)、灌胶在45mL 8％PAGE胶中加入35～45μL TEMED和300～450μL 10％过硫酸铵(注：TEMED和过硫酸铵的使用量应依据环境温度做出相应调整)，迅速混匀后灌胶。待胶液充满玻璃板夹层时，在上部轻轻插入梳子，使其聚合30～45min左右。在灌胶过程中，应防止气泡的产生，若有气泡产生，可用注射器抽除。
3)、PCR扩增产物预处理在10μLPCR扩增产物中加入2μL 6×Loading buffer，混匀30s待用。
4)、电泳用移液器吹吸加样槽，清除杂质和气泡。每加样孔点入2μL产物进行检测，电泳2～2.5h小时(电压200V，电流56mA)，电泳时间长短可根据目标片段大小和实际功率适度调节。待上部的指示带(溴酚蓝)到达胶板底部，电泳结束，小心剥离聚丙烯酰胺凝胶，待染色。
5)、银染
(1)固定将凝胶置于盛有固定液(360mL蒸馏水+40mL乙醇+2mL醋酸)的瓷盒中，室温下固定10min。
(2)银染在400mL染色液(含0.8g硝酸银)中对固定后的凝胶进行染色，平行震荡染色10min。
(3)清洗染色后，将染色液倒入废液桶，用蒸馏水漂洗2次，每次不超过15s。
(4)显色漂洗后，在装有凝胶的瓷盒中加入400mL显影液(含80μL硫代硫酸钠)，显影20～30s至胶块呈现微黄色，立即倒弃显影液，并加入400mL定影液(400mL蒸馏水+6g氢氧化钠+2mL甲醛)后，置于平行震荡仪上，使凝胶与定影液充分作用，直至条带清晰。
(5)洗涤将定影液倒掉并用蒸馏水清洗2-3次，每次不超过15s。
(6)保存：清洗干净后，将凝胶平铺在玻璃板上，晾约10min后拍照、封膜保存，读出条带结果并统计记录。
8、数据处理方法
参照100bp DNA Ladder指示的标准分子量，对比样品的迁移位置来估计片段大小。电泳条带的判读根据电泳图谱人工分析，SSR扩增产物在相同迁移率位置上，有带记作“1”，无带记作“0”，缺失记作“9”，不稳定的条带或弱带不进行统计，生成原始数据矩阵，来进行相关计算。应用POPGENE1.31软件和MEGA4软件，绘制出各种质间的UPGMA聚类图。
9、9对引物构建43份假俭草核心种质材料的SSR标准指纹图谱
根据不同SSR引物对43份假俭草种质材料的PCR扩增图谱(图1～9)可知，9对SSR引物应用于假俭草种质均有效，扩增出的DNA片段大小在100-300bp之间，共计25个特异性条带位点；根据不同位点不同假俭草种质材料特异性条带的有或无，转化成为易于识别的计算机系统语言(1代表有，0代表无)，形成直观、便于分析鉴定的SSR指纹图谱，具体详见表3。采用POPGENE1.31软件和MEGA4软件，绘制出各种质间的UPGMA聚类图，见图10。
表3 9组SSR引物对43种假俭草种质鉴定的指纹图谱
Figure BDA0001881116890000131
Figure BDA0001881116890000141
根据表3可知，每种假俭草种质都具有自己区别于其它种质材料的特异性条带。更进一步，根据9组SSR引物对43份假俭草种质材料所得到的特异性位点中，在同一位点上，有的品种有条带，有的则没有，根据位点间不同种质材料的特异性差别，可以将这43份假俭草种质全部分开，并且重复性好，多态性较高。
由以上实施例可知，本发明提供的方法可以构建得到一种可特异性区分假俭草不同来源种质的指纹图谱，采用该指纹图谱进行鉴别的准确性高、特异性强、简便快捷。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
<120> 一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法及应用
<141> 2018-11-27
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcaggcgat agacgagtgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggtggtga gtcgttgttg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtgctcagt tgcagcataa 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtcatacaa ccggaggtg 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agggctagaa ttaggaggcg 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcgtgaacgc tcactcact 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcagcagttg tgctggaatc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccatgggagt gatgatgatg 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgagagaacc ctcataacac aga 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggaaaggctg tctatgctgc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctttgagagg gcgcttattg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgaccttgag tacgtgctgg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aagcgccttc tcctctaacc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
attactcgga gggtccgttt 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gggtacgtca tgatcgtggt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctccgtctcc tcctcctctg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggccacactg ctttaaccat 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcgcggtaaa tcttttcgac 20

Claims (6)

1.一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)分别提取不同种质来源的假俭草样品的基因组DNA；
(2)以各假俭草样品的基因组DNA为模板，以(ACA)5、(CTG)11、(GAG)10、(CTG)12、(CCT)7、(CTC)11、(ATC)14、(CTC)10和(CTAC)18SSR分子标记的引物分别进行PCR扩增；
(3)将各样品的PCR扩增结果转化为计算机可识别的数码，得到假俭草种质鉴定的指纹图谱；
所述步骤(1)中，假俭草样品包括全球统一编号为E004、E006、E013、E015、E017、E019、E022、E041、E042、E047、E055、E061、E063、E065、E072、E074、E077、E078、E084、E087、E091、E092-1、E097、E098、E099、E112、E115、E124、E131、E134、E135、E141、E144、E145、E152、E154、E155、E182、E183、E187、E188、E102和E158的假俭草；
所述步骤(2)中，
(ACA)5SSR分子标记的引物如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；
(CTG)11SSR分子标记的引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；
(GAG)10SSR分子标记的引物如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；
(CTG)12SSR分子标记的引物如SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8所示；
(CCT)7SSR分子标记的引物如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；
(CTC)11SSR分子标记的引物如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示；
(ATC)14SSR分子标记的引物如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示；
(CTC)10SSR分子标记的引物如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示；
(CTAC)18SSR分子标记的引物如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增使用的体系每10μL，包括：5μL 2x Taq PCR MasterMix、上下游引物各0.5μL、1.5μL基因组DNA模板和2.5μL超纯水；
所述上游引物或下游引物浓度独立地为10μmol/L，基因组DNA模板的浓度为30ng/μL。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增的程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；最后72℃延伸7min。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述将各样品的PCR扩增结果转化为计算机可识别的数码是：将各样品的PCR扩增结果中，有扩增目的产物的计作“1”、无扩增目的产物的计作“0”、缺失该SSR分子标记位点计作“9”，转化为依次排列的矩阵，得到计算机可识别的假俭草种质鉴定的指纹图谱。
5.权利要求1~4任意一项所述的构建方法在区分假俭草种质中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，按照权利要求1~4任意一项所述的构建方法得到假俭草的指纹图谱，以构建所述指纹图谱时采用的SSR分子标记(ACA)5、(CTG)11、(GAG)10、(CTG)12、(CCT)7、(CTC)11、(ATC)14、(CTC)10和(CTAC)18的引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增结果在指纹图谱中的位置，区分假俭草种质。
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CN113699263B (zh) * 2021-07-28 2023-12-22 宁波城市职业技术学院 槭属园艺品种的ssr引物序列对、分子指纹图谱的构建方法、鉴别方法及应用
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103571833B (zh) * 2013-11-18 2016-06-15 四川农业大学 一种ssr标记引物设计方法、小麦ssr标记引物
CN104673929A (zh) * 2015-03-25 2015-06-03 中国科学院昆明植物研究所 一种高分辨率ssr分子标记基因分型的方法
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