CN107058518A - 与芝麻抗茎点枯病主效基因位点紧密连锁的ssr分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了与芝麻抗茎点枯病主效基因位点紧密连锁的SSR分子标记及应用。与芝麻抗茎点枯病主效基因位点紧密连锁的SSR分子标记组，共四个，分别命名为ZMM0913、ZMM3752、ZMM5636和ZMM5775，各分子标记引物序列分别为：ZMM0913F：5’‑CTCATGTGGAACGAGGCATA‑3’ZMM0913R：5’‑ATGGCCACCACCTAACATTC‑3’ZMM3752F：5’‑CAACGATGAGATGGCTTTGA‑3’ZMM3752R：5’‑TCTTGCACGCACAGTAGTCC‑3’ZMM5636F：5’‑CTGCTCATCACCTCTGGAAAG‑3’ZMM5636R：5’‑TGACCTATGATGTGATAACAGTTGG‑3’ZMM5775F：5’‑TTCACTTTGCTTTTGTTGCC‑3’ZMM5775R：5’‑GCCCATTCCATGAGTTTTTG‑3’F2群体验证表明这四个分子标记ZZM0913、ZZM3752、ZZM5636和ZZM5775组合可以提高筛选抗茎点枯病芝麻的效率，可以应用于芝麻抗茎点枯病分子标记辅助选择育种。
Description
技术领域
本发明属于分子标记领域，具体涉及与芝麻抗茎点枯病主效基因位点紧密连锁的SSR分子标记及应用。
背景技术
芝麻是我国四大重要的油料作物之一，种植分布广泛，以黄淮和长江中下游地区较为集中，占全国芝麻面积的70％。芝麻的生育期约90天，属喜温作物，一般生长在6～8月份，主要产区芝麻生长期处在高温多雨季节，高温高湿易诱发茎点枯病。芝麻茎点枯病又称茎腐病、炭腐病，其病原为菜豆壳球孢(Macrophomina phaseoli(Maubl.)Ashby.)，属半知菌亚门真菌。该病原菌寄主范围广，可侵染75个科的500多种植物，除芝麻外，尚有麻类、豆类、苜蓿类、瓜类、向日葵、烟草、番茄、茄子、辣椒、甘蔗、高粱、玉米、茶、咖啡、椰子和香蕉等。
芝麻茎点枯病常年大面积发生，是造成我国芝麻减产的主要病害种类之一。该病病原菌以菌核及分生孢子器在种子、土壤及病株残体上越冬。初次侵染来源以菌核为主，田间分生孢子借雨水和气流传播，进行多次再侵染。芝麻苗期及盛花期最易感病。病菌发育最适温度为25～30℃。苗期染病则幼苗根部变褐，地上部萎蔫枯死，幼茎上密生黑色小点。开花结果期染病则从根部开始发病，后向茎扩展，有时从叶柄基部侵入后蔓延至茎部。根部染病，主根、支根变褐，剥开皮层可见布满黑色小菌核，致根部枯死。茎部染病多发生在中下部，初呈黄褐色水浸状，后扩展很快绕茎一周，中心有银灰色光泽，其上密生黑色小粒点，表皮下及髓部产生大量小菌核，茎秆中空易折断。
连锁分析主要是基于基因数据、表型数据通过统计学的方法去判断感兴趣的基因位点与已知的标记位点间的相对位置，重组率是连锁分析的重要参数。常规连锁分析群体是运用有限亲本的人工控制授粉群体，因此其经过有限次数的重组，通常基于有限亲本，其等位基因的个数也有限。关联分析是基于自然变异群体，利用连锁不平衡规律来研究遗传变异与目标性状相关的研究方法，与传统QTL定位相比，关联分析不需要构建作图群体、广度大、精度高、能检测到同一位点多个等位基因。但由于群体背景复杂，存在亚群结构，导致易产生假阳性，而且自然群体的连锁衰减较快，因此在群体里想找到足够的变异，需要高密度的分子标记。关联分析结合连锁分析，可以发挥两者的优势，提高定位中的阳性率及精度，提高复杂数量性状的挖掘效率。
发明内容
本发明的一个目的在于提供与芝麻抗茎点枯病主效基因位点紧密连锁的SSR分子标记。
本发明的另一个目的在于提供与芝麻抗茎点枯病主效基因位点紧密连锁的SSR分子标记的引物。
本发明的再一个发明目的在于提供与芝麻抗茎点枯病主效基因位点紧密连锁的SSR分子标记的引物的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
与芝麻抗茎点枯病主效基因位点紧密连锁的SSR分子标记组，共四个，分别命名为ZMM0913、ZMM3752、ZMM5636和ZMM5775，各分子标记引物序列为；
ZMM0913引物序列为：
ZMM0913F：5’-CTCATGTGGAACGAGGCATA-3’，如SEQ.ID.NO.1所示。
ZMM0913R：5’-ATGGCCACCACCTAACATTC-3’，如SEQ.ID.NO.2所示。
ZMM3752引物序列为：
ZMM3752F：5’-CAACGATGAGATGGCTTTGA-3’，如SEQ.ID.NO.3所示。
ZMM3752R：5’-TCTTGCACGCACAGTAGTCC-3’，如SEQ.ID.NO.4所示。
ZMM5636引物序列为：
ZMM5636F：5’-CTGCTCATCACCTCTGGAAAG-3’，如SEQ.ID.NO.5所示。
ZMM5636R 5’-TGACCTATGATGTGATAACAGTTGG-3’，如SEQ.ID.NO.6所示。
ZMM5775引物序列为：
ZMM5775F：5’-TTCACTTTGCTTTTGTTGCC-3’，如SEQ.ID.NO.7所示。
ZMM5775R：5’-GCCCATTCCATGAGTTTTTG-3’，如SEQ.ID.NO.8所示。
其中：SSR分子标记ZZM0913和ZZM3752与影响芝麻茎点枯病抗性的主效基因位点qCCR12.2(位于第12连锁群89.8cM处)紧密连锁；
SSR分子标记ZMM5636和ZZM ZMM5775与影响芝麻茎点枯病抗性的主效基因位点qCCR3.2紧密连锁(位于第3连锁群39.3cM处)。
与芝麻抗茎点枯病主效基因位点紧密连锁的SSR分子标记的引物组，其特征在于：引物序列为；
ZMM0913引物序列为：
ZMM0913F：5’-CTCATGTGGAACGAGGCATA-3’，如SEQ.ID.NO.1所示；
ZMM0913R：5’-ATGGCCACCACCTAACATTC-3’，如SEQ.ID.NO.2所示；
ZMM3752引物序列为：
ZMM3752F：5’-CAACGATGAGATGGCTTTGA-3’，如SEQ.ID.NO.3所示；
ZMM3752R：5’-TCTTGCACGCACAGTAGTCC-3’，如
SEQ.ID.NO.4所示；
ZMM5636引物序列为：
ZMM5636F：5’-CTGCTCATCACCTCTGGAAAG-3’，如SEQ.ID.NO.5所示；
ZMM5636R 5’-TGACCTATGATGTGATAACAGTTGG-3’，如SEQ.ID.NO.6所示；
ZMM5775引物序列为：
ZMM5775F：5’-TTCACTTTGCTTTTGTTGCC-3’，如SEQ.ID.NO.7所示；
ZMM5775R：5’-GCCCATTCCATGAGTTTTTG-3’，如SEQ.ID.NO.8所示。
与芝麻抗茎点枯病主效基因位点紧密连锁的SSR分子标记鉴定方法，其特征在于：用ZMM0913引物、ZMM3752引物、ZMM5636引物和ZMM5775引物分别扩增芝麻叶片总DNA，如果能分别扩增得到166bp、258bp、278bp和199bp的扩增片段，则表明存在本发明所述的芝麻抗抗茎点枯病主效基因，预测该芝麻具有较高的抗茎点枯病能力。
本发明所述的与芝麻抗茎点枯病主效基因位点紧密连锁的SSR分子标记的筛选获得方法，包括如下步骤：
(1)利用芝麻抗茎点枯病品种中芝13为母本和敏感种质“密蒴芝麻”进行杂交，获得F1种子，F1植株自交产生F2代种子，F2植株自交产生F3代种子，F3代开始按株行种植并自交产生种子，每个株行只收获1个单株的种子，种植成为下一代的1个株行，以此类推，最终获得F7代分离群体，即重组自交系(RIL)群体；
(2)采用CTAB法提取步骤(1)亲本及RIL分离群体叶片基因组总DNA；
(3)基于芝麻基因组序列和cDNA序列自主开发的7702对SSR标记引物对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色及带型统计，筛选亲本间有多态性的引物；
(4)将筛选得到的498对多态性引物对重组自交系(RIL)群体进行基因型分析和遗传图谱的构建，结合其抗茎点枯病病情指数数据进行QTL定位，检测到芝麻第12连锁群的89.8cM和第3连锁群的39.3cM各具有一个主效基因位点qCRR12.2和qCRR3.2，贡献率分别为14％和12％，与qCRR12.2紧密连锁的SSR分子标记为ZZM0913和ZZM3752，与qCRR3.2紧密连锁的SSR分子标记为ZZM5636和ZZM5775。
利用上述技术措施，申请人最终获得了与芝麻抗茎点枯病主效基因位点紧密连锁的SSR标记ZMM0913、ZMM3752、ZMM5636和ZMM5775。
上述与芝麻抗茎点枯病主效基因位点紧密连锁的SSR分子标记组在芝麻抗茎点枯病种质筛选中的应用，具体应用方法为：用SSR分子标记ZMM0913引物、ZMM3752引物、ZMM5636引物和ZMM5775引物分别扩增芝麻F2群体叶片总DNA，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果能扩增分别得到166bp、258bp、278bp和199bp的扩增片段，则表明存在本发明所述的芝麻抗茎点枯病主效基因，预测该芝麻具有较高的抗茎点枯病能力。
上述SSR分子标记ZMM0913、ZMM3752、ZMM5636和ZMM5775在芝麻育种中的应用，具体应用方法为：用所述SSR分子标记ZMM0913引物、ZMM3752引物、ZMM5636引物和ZMM5775引物扩增芝麻株系或品种总DNA，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果能扩增分别得到166bp、258bp、278bp和199bp的扩增片段，则表明存在本发明所述的芝麻抗茎点枯病主效基因，预测该芝麻具有较高的抗茎点枯病能力。
本发明采用的茎点枯病田间鉴定方法及病情调查标准，参照张秀荣等(2006)的芝麻种质资源描述规范和数据标准中的茎点枯病抗性鉴定方法、病情调查与分级标准以及病情指数计算方法(第67页)。
本发明的有益效果：
本发明首次发现定位了2个提高芝麻茎点枯病抗性的主效基因位点，可解释表型14％和12％的变异，将芝麻抗茎点枯病主效基因定位在第12连锁群上89.8cM处，位于ZZM0913和ZZM3752标记间，以及在第3连锁群上39.3cM处，位于ZZM5636和ZZM5775标记间。使得芝麻茎点枯病抗性主效基因位点的定位工作居于同领域前列。
F2群体验证表明这四个分子标记ZMM0913、ZMM3752、ZMM5636和ZMM5775组合可以预测芝麻抗茎点枯病的强弱，进而可以快速筛选抗茎点枯病株系用于芝麻抗病育种，辅助抗茎点枯病选择，目标明确，成本较低。传统抗病育种方法中，芝麻抗茎点枯病表型鉴定费时费力，且受环境影响很大，准确性低，且年份田块间自然鉴定重复性较差。本发明中抗茎点枯病主效基因位点的检测方便快速，不受环境影响，可以在苗期进行筛选和淘汰，大大提高了选择效率，节约了生产成本。
附图说明
图1为芝麻RIL群体茎点枯病发病后病情指数分布图。
图2为第3和12连锁群图谱。图中*号所示为抗茎点枯病性状主效基因位点qCRR3.2和qCRR12.2在连锁群上的位置，与其紧密连锁的分子标记分别为ZZM5636和ZZM5775以及ZZM0913和ZZM3752。
图3为分子标记ZZM5636、ZZM5775、ZZM0913和ZZM3752在F2群体1-20号单株中扩增后聚丙烯酰氨凝胶电泳的胶板照片示意图。
具体实施方式
下述实施例中按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002)所述的条件进行DNA提取、PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。实验过程中涉及的所有试剂成分均可从商业途径获得，并按照实验手册中的条件或所用试剂制造厂商所建议的条件使用。
实施例1：与芝麻茎点枯病性状相关基因紧密连锁的SSR分子标记的发掘
(1)构建抗/感茎点枯病芝麻重组自交系(RIL)群体并鉴定茎点枯病抗性
利用芝麻抗茎点枯病品种中芝13为母本和敏感种质“密蒴芝麻”进行杂交，获得F1种子，F1植株自交产生F2代种子，F2植株自交产生F3代种子，F3代开始按株行种植并自交产生种子，每个株行只收获1个单株的种子，种植成为下一代的1个株行，以此类推，最终获得F7代分离群体，即重组自交系(RIL)群体；
鉴定亲本及RIL各株系茎点枯病抗性，统计RIL分离群体感病后病情指数，结果见图1，统计分析表明RIL分离群体感病后的病情指数分布呈连续性分布，变异分布呈正态分布，且变异范围很宽，证明芝麻茎点枯病属于数量性状。
(2)亲本及RIL分离群体叶片基因组总DNA的提取
利用CTAB法提取叶片基因组总DNA，具体步骤如下：
A.在亲本及F7RIL群体植株4-5对真叶期，将各亲本及RIL分离群体顶端幼嫩组织适量放入已编号离心管中，经液氮速冻后超低温冰箱-80℃存放，备用。使用时，自超低温冰箱(-80℃)取出适量样品置于5ml离心管中，立即加入液氮后用玻璃棒迅速捣碎至粉状后；快速转入2ml离心管中，加入800ul在65℃的水浴锅中预热过的CTAB提取液(2％CTAB，2％PVP-K30，0.1MTris-HCl，1.4M NaCl，20mM EDTA，pH8.0)，混合均匀，放入65℃的水浴锅中水浴40-60min，水浴过程中每隔10min取出离心管轻微震荡混匀一次，使组织得到充分裂解；
B.水浴后取出离心管，待离心管冷却至室温后加入等体积的氯仿和异戊醇按体积比为24:1混合的混合液，缓慢上下颠倒混匀10min，12000rpm离心10min；
C.取离心后的上清于另一离心管中，重复B步骤一次。然后再取上清加入2.5倍体积冰冷无水乙醇中，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结为止。然后置于-20℃静置10min，12000rpm离心10min，弃上清。用75％(体积比)乙醇漂洗2-3次，干燥后加无菌水溶解，于-20℃冰箱中保存备用，即得各亲本及RIL分离群体叶片基因组总DNA。
(3)引物开发及PCR扩增
基于芝麻转录组测序结果自主开发的1770对SSR标记引物以及基于芝麻基因组序列自主开发的6002对SSR标记引物，对群体亲本进行PCR扩增，筛选多态性标记。PCR程序如下：
A.自父母本中各随机选择5株的DNA等量混合，总浓度调整至20ng/ul，用作筛选引物的DNA模板。
B.PCR扩增反应。具体反应体系及扩增程序如下：
PCR反应体系：
PCR扩增程序：
(4)PCR扩增产物凝胶电泳测试获得多态性筛选结果
将以上获得的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以获得双亲多态性筛选结果，具体步骤如下：
胶板制备：
玻璃板用10％(质量比)NaOH溶液浸泡24小时，洗净，晾干。短胶板用餐巾纸均匀涂抹硅烷化剂(AMMRESCO)，长胶板涂抹1ml反硅烷化剂，放置5min后，将玻璃装好，并以边条隔开，四周用制胶夹夹紧。准备就绪后用注射器将6％(质量比)聚丙烯酰胺胶液60ml缓慢注入玻璃间的缝隙中，直至灌满到玻璃板模具的顶部，注意避免产生气泡。小心插入梳子不带齿的一边，并用夹子夹牢，聚合2小时以上。
反硅烷化剂：500ml稀释液(95％无水乙醇，0.5％冰醋酸，4.5％ddH2O)中加1-2ml亲和硅烷；6％(质量比)聚丙烯酰胺胶液:5.7％(质量比)丙烯酰胺，0.3％(质量比)N,N’-甲叉二丙烯酰胺，42％(质量比)尿素，1×TBE缓冲液。灌胶前每60ml胶液加入10％(质量比)过硫酸铵390ul和TEMED 39ul；
电泳：
去掉制胶夹，取出胶板，小心的取出梳子，冲洗并擦净玻璃外侧，固定于电泳槽上，上下槽各加500ml 1×TBE缓冲液，以恒功率75W电泳30min直到电压回升，用注水器冲洗凝胶的上表面以冲走析出的尿素和碎胶，插上梳子。在PCR产物中加入0.5倍体积的上样缓冲液，95℃变性5min，冰浴冷却3min以上，每个点样孔点样5ul，1800伏恒压电泳约80min，当二甲苯青FF到达2/3胶板时停止电泳。取下胶板，用自来水冲洗降温。
1×TBE：Tris-base108g，硼酸55g，0.5M EDTA(PH8.0)40ml，定容至1000ml即成10×TBE，使用时稀释10倍即为1×TBE工作液；
上样缓冲液：98％(体积比)去离子甲酰胺,10mmol/L EDTA,0.005％(质量比)二甲苯青FF,0.005％(质量比)溴酚蓝。
银染法染色：
将两块玻璃板分离开来，长玻璃板连同凝胶用蒸馏水漂洗3次，每次3min，放入染色液(含0.15％的AgNO3)中染色10min，用蒸馏水快速漂洗5-6s。放入显影液(含0.2％的NaOH，0.04％的甲醛，35℃)中显影，至带型清晰，然后在蒸馏水中漂洗1次，室温下自然晾干，拍照保存。观察胶板上各引物在双亲中的扩增带型，双亲带型有差异的引物即为多态性引物。
(5)筛选得到的多态性引物在RIL群体中的分析
筛选结果表明，有498对引物在双亲间有多态性。以550个RIL群体为模板，利用498对多态性引物进行基因型检测。统计基因型结果，将与父本一致的带型记为A，与母本一致的带型记为B，杂合的记为H。在此基础上，采用JoinMap 4.0进行遗传图谱构建，然后利用RIL群体的茎点枯病病情指数数据、基因型数据及遗传连锁图谱数据，运行WinQTL cart4.0软件进行基因定位分析。结果发现2个影响芝麻茎点枯病抗性的主效基因位点qCCR12.2和qCCR3.2，分别位于第12和第3连锁群，分别解释抗茎点枯病表型14％的变异(即贡献率14％)和12％的变异(即贡献率12％)，与qCCR12.2(位于第12连锁群89.8cM处)紧密连锁的SSR分子标记分别为ZZM0913和ZZM3752；与qCCR3.2紧密连锁(位于第3连锁群39.3cM处)的SSR分子标记分别为ZZM5636和ZZM5775，各分子标记引物序列分别为：
ZMM0913F：5’-CTCATGTGGAACGAGGCATA-3’，
ZMM0913R：5’-ATGGCCACCACCTAACATTC-3’
ZMM3752F：5’-CAACGATGAGATGGCTTTGA-3’
ZMM3752R：5’-TCTTGCACGCACAGTAGTCC-3’
ZMM5636F：5’-CTGCTCATCACCTCTGGAAAG-3’
ZMM5636R：5’-TGACCTATGATGTGATAACAGTTGG-3’
ZMM5775F：5’-TTCACTTTGCTTTTGTTGCC-3’
ZMM5775R：5’-GCCCATTCCATGAGTTTTTG-3’
实施例2：与芝麻抗茎点枯病主效基因紧密连锁的分子标记在芝麻抗病育种中的应用
利用中芝13与另一茎点枯病敏感种质“加样芝麻”杂交后获得500个F2单株，由于不能对F2单株进行田间茎点枯病抗性鉴定，所以种植500个F2单株获得其对应的500个F2:3家系，F2:3家系的茎点枯病抗性代表F2单株的茎点枯病抗性。在苗期对F2单株进行分子鉴定，具体步骤包括叶片总DNA的提取(具体如实施例1中的DNA提取方法)和利用抗茎点枯病主效基因位点qCRR12.2和qCRR3.2紧密连锁的4对分子标记ZZM0913、ZZM3752、ZZM5636和ZZM5775进行分子鉴定，即经PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳测试及带型统计(具体如实施例1中的PCR扩增、凝胶电泳及带型统计方法)，保留4对标记引物扩增分别可得到166bp、258bp、278bp和199bp大小条带的F2单株共107个，其中F2群体1-20号单株凝胶电泳后染色得到的胶板图片见图3，图中可看出：第12、16和18号单株4个分子标记分别可扩增到166bp、258bp、278bp和199bp大小条带。另将所有500个F2单株对应的500个F2:3家系进行茎点枯病抗性鉴定试验并统计各株系的平均病情指数，结果表明：通过分子标记辅助选择得到的107个F2单株对应的F2:3家系中，茎点枯病发病后的平均病情指数低于500个F2:3家系群体均值(42％)的株系占81.3％(见表1，共87个)。与常规抗病育种方法相比，利用4个组合分子标记ZZM0913、ZZM3752、ZZM5636和ZZM5775鉴定辅助选择抗茎点枯病株系，可以大大提高选择效率，从而缩短芝麻抗茎点枯病品种的育种周期。
表1 茎点枯病发病后平均病情指数超过群体均值的87个株系
| 株系编号 | 病情指数(％) | 株系编号 | 病情指数(％) | 株系编号 | 病情指数(％) |
| AG018 | 28 | AG198 | 25 | AG373 | 23 |
| AG026 | 20 | AG203 | 40 | AG375 | 16 |
| AG033 | 36 | AG205 | 36 | AG376 | 11 |
| AG039 | 16 | AG207 | 9 | AG379 | 17 |
| AG046 | 14 | AG213 | 27 | AG381 | 19 |
| AG080 | 24 | AG214 | 6 | AG382 | 9 |
| AG094 | 5 | AG222 | 7 | AG384 | 11 |
| AG097 | 13 | AG223 | 17 | AG386 | 41 |
| AG099 | 18 | AG224 | 28 | AG401 | 22 |
| AG102 | 20 | AG230 | 11 | AG406 | 39 |
| AG108 | 17 | AG232 | 24 | AG411 | 24 |
| AG116 | 25 | AG233 | 39 | AG428 | 28 |
| AG119 | 19 | AG236 | 21 | AG440 | 33 |
| AG140 | 30 | AG240 | 37 | AG451 | 15 |
| AG143 | 14 | AG242 | 32 | AG467 | 23 |
| AG148 | 7 | AG259 | 33 | AG469 | 41 |
| AG149 | 35 | AG274 | 29 | AG473 | 27 |
| AG151 | 37 | AG287 | 11 | AG476 | 40 |
| AG153 | 22 | AG294 | 36 | AG482 | 15 |
| AG155 | 6 | AG327 | 10 | AG483 | 39 |
| AG156 | 28 | AG328 | 35 | AG488 | 24 |
| AG157 | 17 | AG331 | 27 | AG495 | 20 |
| AG158 | 10 | AG333 | 22 | AG508 | 33 |
| AG162 | 37 | AG342 | 27 | AG516 | 16 |
| AG167 | 25 | AG344 | 18 | AG522 | 13 |
| AG168 | 42 | AG360 | 16 | AG524 | 11 |
| AG171 | 34 | AG363 | 30 | AG529 | 26 |
| AG187 | 28 | AG365 | 33 | AG538 | 40 |
| AG196 | 9 | AG369 | 15 | AG539 | 25 |
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 与芝麻抗茎点枯病主效基因位点紧密连锁的SSR分子标记及应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 1
<400> 1
ctcatgtgga acgaggcata 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 2
<400> 2
atggccacca cctaacattc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 3
<400> 3
caacgatgag atggctttga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 4
<400> 4
tcttgcacgc acagtagtcc 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 5
<400> 5
ctgctcatca cctctggaaa g 21
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 6
<400> 6
tgacctatga tgtgataaca gttgg 25
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 7
<400> 7
ttcactttgc ttttgttgcc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 8
<400> 8
gcccattcca tgagtttttg 20
Claims (7)
1.与芝麻抗茎点枯病主效基因位点紧密连锁的SSR分子标记组，其特征在于：共四个，分别命名为ZMM0913、ZMM3752、ZMM5636和ZMM5775，各分子标记引物序列为；
ZMM0913引物序列为：
ZMM0913F：5’-CTCATGTGGAACGAGGCATA-3’，如SEQ.ID.NO.1所示；
ZMM0913R：5’-ATGGCCACCACCTAACATTC-3’，如SEQ.ID.NO.2所示；
ZMM3752引物序列为：
ZMM3752F：5’-CAACGATGAGATGGCTTTGA-3’，如SEQ.ID.NO.3所示；
ZMM3752R：5’-TCTTGCACGCACAGTAGTCC-3’，如SEQ.ID.NO.4所示；
ZMM5636引物序列为：
ZMM5636F：5’-CTGCTCATCACCTCTGGAAAG-3’，如SEQ.ID.NO.5所示；
ZMM5636R 5’-TGACCTATGATGTGATAACAGTTGG-3’，如SEQ.ID.NO.6所示；
ZMM5775引物序列为：
ZMM5775F：5’-TTCACTTTGCTTTTGTTGCC-3’，如SEQ.ID.NO.7所示；
ZMM5775R：5’-GCCCATTCCATGAGTTTTTG-3’，如SEQ.ID.NO.8所示。
2.与芝麻抗茎点枯病主效基因位点紧密连锁的SSR分子标记的引物组，其特征在于：引物序列为；
ZMM0913引物序列为：
ZMM0913F：5’-CTCATGTGGAACGAGGCATA-3’，如SEQ.ID.NO.1所示；
ZMM0913R：5’-ATGGCCACCACCTAACATTC-3’，如SEQ.ID.NO.2所示；
ZMM3752引物序列为：
ZMM3752F：5’-CAACGATGAGATGGCTTTGA-3’，如SEQ.ID.NO.3所示；
ZMM3752R：5’-TCTTGCACGCACAGTAGTCC-3’，如SEQ.ID.NO.4所示；
ZMM5636引物序列为：
ZMM5636F：5’-CTGCTCATCACCTCTGGAAAG-3’，如SEQ.ID.NO.5所示；
ZMM5636R 5’-TGACCTATGATGTGATAACAGTTGG-3’，如SEQ.ID.NO.6所示；
ZMM5775引物序列为：
ZMM5775F：5’-TTCACTTTGCTTTTGTTGCC-3’，如SEQ.ID.NO.7所示；
ZMM5775R：5’-GCCCATTCCATGAGTTTTTG-3’，如SEQ.ID.NO.8所示。
3.与芝麻抗茎点枯病主效基因位点紧密连锁的SSR分子标记鉴定方法，其特征在于：用权利要求2所述的分子标记ZMM0913引物、ZMM3752引物、ZMM5636引物和ZMM5775引物分别扩增芝麻叶片总DNA，如果能分别扩增得到166bp、258bp、278bp和199bp的扩增片段，则表明存在本发明所述的芝麻抗抗茎点枯病主效基因，预测该芝麻具有较高的抗茎点枯病能力。
4.权利要求2所述的SSR分子标记的引物组在芝麻抗茎点枯病种质筛选中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：应用方法为：用SSR分子标记ZMM0913引物、ZMM3752引物、ZMM5636引物和ZMM5775引物分别扩增芝麻F2群体叶片总DNA，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果能扩增分别得到166bp、258bp、278bp和199bp的扩增片段，则表明存在本发明所述的芝麻抗茎点枯病主效基因，预测该芝麻具有较高的抗茎点枯病能力。
6.权利要求2所述的分子标记的引物组在芝麻育种中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：应用方法为：用所述SSR分子标记ZMM0913引物、ZMM3752引物、ZMM5636引物和ZMM5775引物扩增芝麻株系或品种总DNA，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果能扩增分别得到166bp、258bp、278bp和199bp的扩增片段，则表明存在本发明所述的芝麻抗茎点枯病主效基因，预测该芝麻具有较高的抗茎点枯病能力。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109251994A (zh) * | 2018-11-07 | 2019-01-22 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 与芝麻矮杆性状主效基因位点紧密连锁的分子标记zmm5914及其应用 |
| CN109439785A (zh) * | 2018-11-07 | 2019-03-08 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 与芝麻矮杆性状主效基因位点紧密连锁的分子标记zmm5932及其应用 |
| CN113215297A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-08-06 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一个与芝麻含油量主效qtl位点紧密连锁的分子标记id0159及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090235394A1 (en) * | 2008-03-17 | 2009-09-17 | Derald Ray Langham | Non-dehiscent sesame variety sesaco 30 |
| CN103525919A (zh) * | 2013-09-27 | 2014-01-22 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 芝麻耐湿性状主效基因位点紧密连锁的分子标记及其应用 |
| CN103667480A (zh) * | 2013-12-06 | 2014-03-26 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 基于芝麻全基因组序列开发的ssr核心引物组及应用 |
| CN105177129A (zh) * | 2015-08-25 | 2015-12-23 | 河南省农业科学院芝麻研究中心 | 芝麻抗枯萎病基因紧密连锁分子标记SiFWR2145 |
-
2017
- 2017-03-15 CN CN201710153241.3A patent/CN107058518B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090235394A1 (en) * | 2008-03-17 | 2009-09-17 | Derald Ray Langham | Non-dehiscent sesame variety sesaco 30 |
| CN103525919A (zh) * | 2013-09-27 | 2014-01-22 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 芝麻耐湿性状主效基因位点紧密连锁的分子标记及其应用 |
| CN103667480A (zh) * | 2013-12-06 | 2014-03-26 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 基于芝麻全基因组序列开发的ssr核心引物组及应用 |
| CN105177129A (zh) * | 2015-08-25 | 2015-12-23 | 河南省农业科学院芝麻研究中心 | 芝麻抗枯萎病基因紧密连锁分子标记SiFWR2145 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LINHAI WANG等: "Development of an SSR-based genetic map in sesame and identification of quantitative trait loci associated with charcoal rot resistance", 《SCIENTIFIC REPORTS》 * |
| 于沐等: "芝麻NBS类抗茎点枯病相关基因的克隆与分析", 《河南农业科学》 * |
| 张艳欣等: "芝麻茎点枯病抗性关联分析及抗病载体材料挖掘", 《中国农业科学》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109251994A (zh) * | 2018-11-07 | 2019-01-22 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 与芝麻矮杆性状主效基因位点紧密连锁的分子标记zmm5914及其应用 |
| CN109439785A (zh) * | 2018-11-07 | 2019-03-08 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 与芝麻矮杆性状主效基因位点紧密连锁的分子标记zmm5932及其应用 |
| CN109439785B (zh) * | 2018-11-07 | 2021-07-13 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 与芝麻矮杆性状主效基因位点紧密连锁的分子标记zmm5932及其应用 |
| CN113215297A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-08-06 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一个与芝麻含油量主效qtl位点紧密连锁的分子标记id0159及其应用 |
| CN113215297B (zh) * | 2021-05-19 | 2022-08-26 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一个与芝麻含油量主效qtl位点紧密连锁的分子标记id0159及其应用 |
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