CN103937873A

CN103937873A - 棉花品种‘中棉所49号’的dna指纹检测方法

Info

Publication number: CN103937873A
Application number: CN201310380280.9A
Authority: CN
Inventors: 匡猛; 杨伟华; 严根土; 王延琴; 周大云; 方丹; 马磊; 许红霞; 冯新爱
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-08-27
Filing date: 2013-08-27
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2033-08-27
Also published as: CN103937873B

Abstract

本发明提供一种棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法，该方法利用SSR标记技术，使用选自CIR246、DPL0917、BNL3033、BNL1053、NAU3839、HAU0878、DPL0176、NAU3424、Gh132和BNL1154中的至少一种特征引物进行PCR检测，该方法包括如下步骤：DNA提取、SSR-PCR扩增、电泳和银染检测。本发明方法简单快速、准确稳定，仅需2d即可完成1份‘中棉所49号’样品的纯度与真伪检测。

Description

棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法。

背景技术

‘中棉所49号’系中国农业科学院棉花研究所选育的常规早中熟陆地棉品种。该品种是西北内陆棉区主栽棉花品种之一。2006～2013年，连续8年被农业部推荐为西北地区棉花主导品种；2008～2013年，连续6年被列为国家西北内陆棉区棉花早中熟组区域试验对照品种；2007～2013年，连续7年被列为自治区棉花早中熟组区域试验对照品种；2005～2012年在南疆和东疆累计推广面积3207.1万亩，年均400万亩，占当地棉花面积30%左右。并因原棉品质稳定而优异，被选为国家原棉实物标样。

然而，随着棉花品种数量的日益增加和遗传基础的日益狭窄，使得完全根据形态性状进行棉花品种的辨别越来越困难，给种子生产、经营、管理、维权等诸环节带来不同程度的困难，造成诸如品种多、乱、杂的现象。近年来，分子生物学的发展使品种鉴定进入到基因水平，与传统的形态学方法和蛋白质电泳技术相比，DNA标记技术能揭示更多的多态性，具有准确可靠、简单快速、易于自动化的优点，是品种鉴定技术的发展趋势。与其它分子标记相比，以微卫星序列为基础的简单重复序列（SSR）标记在DNA指纹鉴定上显示了独特的优越性：SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高，以孟德尔方式遗传，呈共显性。SSR标记已成为品种鉴定首选技术之一，并已在玉米，水稻等作物上初步应用。

目前，我国棉种的真实性与品种纯度鉴定仍依靠田间小区种植鉴定方法，需投入大量的人力、物力，成本高、耗时长，时效性差。武耀廷，张天真，郭旺珍等进行了陆地棉品种SSR标记的多态性及用于杂交种纯度检测的研究；马轩，杜雄明，孙君灵等进行了18个彩色棉品系的SSR指纹分析；殷剑美，陈旭升，狄佳春等进行了杂交棉苏杂118的SSR指纹图谱构建研究。研究者普遍认为，利用分子标记进行棉花品种鉴定是可行的。但利用现有的分子标记技术进行品种鉴定缺乏系统性研究，存在鉴别能力不够高、操作步骤较多、耗费时间较长、实验成本较高等问题，不能完全适应实践检测的需要。因此，有必要针对限制棉花DNA指纹鉴定实用化的因素，迅速开展我国棉花品种DNA指纹鉴定的研究工作，建立高效准确、经济简便的以SSR技术为基础的DNA指纹鉴定体系，在此基础上开发棉花品种纯度和真伪DNA指纹检测专用试剂盒，为棉花品种质量监控及品种权保护提供有利的工具。

发明内容

本发明的目的是提供棉花常规种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供用于检测棉花品种‘中棉所49号’的特异性PCR引物，所述PCR引物选自CIR246、DPL0917、BNL3033、BNL1053、NAU3839、HAU0878、DPL0176、NAU3424、Gh132和BNL1154中的至少一对引物（表1）。

表1 特异性PCR引物

本发明还提供棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测试剂盒，其包括表1中列出的用于检测棉花品种‘中棉所49号’的特异性PCR引物中的至少一对引物。优选地，所述试剂盒中包括表1中列出全部引物的组合。更优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的至少一种。

本发明还提供棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法，包括以下步骤：

1）提取待测棉花的基因组DNA；

2）以待测棉花的基因组DNA为模板，利用表1中的至少一对引物进行PCR扩增；

3）检测PCR扩增产物。

20μL PCR反应体系中包括：添加Mg²⁺的10×反应缓冲液2.0μL，2.5mM dNTPs1.6μL，20μM上、下游引物各0.15μL，2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，20ng/μL基因组DNA2.0μL，余量为ddH₂O。

PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，32个循环；72℃延伸12min，4℃保存。

前述方法中，优选使用银染法检测PCR扩增产物。

本发明进一步提供所述试剂盒在检测棉花品种‘中棉所49号’中的应用。

本发明通过对特征引物筛选、DNA快速提取法、分子检测试验体系等环节的研究，从实践上解决了限制DNA指纹技术商业化的关键技术问题，建立了快速准确、经济简便、稳定可靠的棉花DNA指纹鉴检测实验体系，并在此基础上开发一种适用于棉花常规种‘中棉所49号’的DNA检测专用试剂盒，采用该试剂盒不仅检测结果稳定可靠，而且操作简单方便，成本低廉，有利于技术的标准化。

（1）特征引物的筛选

以包括‘中棉所49号’在内的12个来源于我国现阶段三大棉区的主导棉花品种为特征引物的筛选材料，包括长江流域棉区的4个品种：‘鄂杂棉10号’、‘苏杂3号’、‘湘杂棉10号’与‘中棉所63号’；黄河流域棉区的5个品种：‘中棉所70号’、‘鲁棉研21号’、‘鲁棉研28号’、‘中植棉2号’与‘中棉所50号’；新疆棉区的3个品种：‘中棉所49号’、‘新陆早33号’与‘新陆早42号’。

从3000多对候选SSR引物中筛选出在’中棉所49号’上表现为独特基因型的特征引物共10对：DPL0917、CIR246、BNL3033、BNL1053、NAU3839、HAU0878、DPL0176、NAU3424、Gh132和BNL1154。使用其中任一特征引物均可实现对‘中棉所49号’进行纯度检测，不同特征引物的检测结果可相互验证，同时使用还可对‘中棉所49号’进行真伪检测。

（2）利用上述筛选出的特征引物对‘中棉所49号’进行指纹检测，包括以下步骤：

1）DNA快速提取

采用全自动样品快速研磨仪将去壳棉种充分粉碎后，加入800μLSDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min左右轻摇一次。加入等体积800μL酚、氯仿和异戊醇的混合液（其体积比依次为25:24:1），混匀至不分层，10000rpm离心10min。取上清。重复抽提一次后离心取上清，加入0.7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，加入200μL TE或ddH₂O充分溶解DNA，备用。该方法相比常规的以叶片为材料的CTAB提取法不仅能获得高质量的DNA，而且简单快速，省去了育苗时间和液氮研磨等环节，降低实验成本的同时大大提高了工作效率。

2）SSR-PCR扩增体系

20μL SSR-PCR反应体系包括：添加Mg²⁺的10×反应缓冲液2.0μL，2.5mM dNTPs1.6μL，20μM上、下游引物各0.15μL，2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，20ng/μL基因组DNA2.0μL，余量为ddH₂O。

反应程序：94℃预变性4min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，32个循环；72℃延伸12min，4℃保存。该SSR-PCR扩增体系稳定可靠，确保了实验结果的可重复性。

3）电泳

PCR扩增产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒功率90W电泳1h。相比非变性胶和琼脂糖凝胶电泳，6%变性胶更适于高分辨率的棉种DNA指纹鉴定，不仅有效提高品种指纹鉴别能力，而且缩短了电泳时间。

4）银染检测

采用快速银染法，流程如下：

①固定液（10%乙醇，0.5%冰醋酸）固定5min；②双蒸水快速漂洗1次；③0.2%AgNO₃溶液染色5min；④双蒸水快速漂洗1次；⑤显影液（3%NaOH，0.5%甲醛）显影5min；⑥固定液（10%无水乙醇，0.5%冰醋酸）定影5min。该银染法操作简单，背景容易掌握，灵敏度高，且减少了冰醋酸的使用量，30分钟内即可获得背景清晰的染色效果。

本发明建立了快速准确、经济简便、稳定可靠的棉花DNA指纹检测体系，并在此基础上开发出专用于棉花常规种‘中棉所49号’DNA指纹检测的试剂盒，利用该试剂盒对棉花常规种‘中棉所49号’进行检测，一份样品从送样到出结果仅需2d，且检测结果稳定可靠，容易统计，只需具备常规的分子生物学设备即可达到检测目的，易于基层推广使用。对于口岸物种检验工作及品种资源鉴别、种质资源保护具有重大意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中利用特征引物CIR246对48个‘中棉所49号’种子样品纯度检测图谱。

图2为本发明实施例1中利用特征引物DPL0917对48个‘中棉所49号’种子样品纯度检测图谱。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法

对‘中棉所49号’种子样品进行纯度检测包括以下步骤。其中，本方法中所用引物序列信息见表1，所用的试剂配制见表2。

1、DNA提取

（1）将单粒棉花种子去壳，置于2ml离心管，加入100μL超纯水和1个钢珠，置于全自动样品快速研磨仪中，60赫兹30s充分粉碎。

（2）加入800μL DNA提取液(1%SDS，0.01M EDTA8.0，0.7M NaCl，0.05M Tris-HCl，0.5%山梨醇，1%PVP，1%β-巯基乙醇)，漩涡至充分混匀后，65℃水浴30min，间隔10min左右轻摇一下。

（3）水浴结束后，加入等体积800μL苯酚、氯仿和异戊醇的混合液（其体积比依次为25:24:1），上下颠倒混匀至不分层，10000rpm离心10min。

（4）吸取上清液转移到另一2mL离心管中，加入等体积800μL的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），上下颠倒混匀至不分层，10000rpm离心10min。

（5）将上清液转移到另一2mL离心管中，加入0.7倍体积异丙醇缓慢摇动几次，静置30min，絮状DNA成团析出。

（6）用剪口枪头吸取DNA转移至盛有70%乙醇的离心管中，洗涤两次。

（7）倒掉乙醇，自然通风干燥DNA，加入200μL TE（pH8.0）或ddH₂O，充分溶解备用。

（8）紫外检测DNA浓度，用ddH₂O将DNA原液稀释至使用浓度20ng/μL，4℃保存备用。

表2 试剂配制

2、SSR-PCR扩增

选用特征引物DPL0917与CIR246，PCR反应体系见表3。

表3 PCR反应体系（总体积20μL）

反应程序：94℃预变性4min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸12min；4℃保存待用。

利用其余8对引物进行SSR-PCR扩增，使用的反应体系及反应程序同以上描述。

3、电泳检测

(1)清洗玻璃板：用自来水沾上洗涤灵把玻璃板反复擦洗干净，用纯水擦洗一遍，再用95%酒精擦洗一遍。在方板上涂上1mL Binding Silane(0.5%)，凹板上涂上1mL Repel silane（2%）。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。

(2)6%胶的制备：见表4。

表4 6%胶的配方

注：40%PA胶:190g丙烯酰胺+10g双丙烯酰胺用水稀释至500mL。

TEMED和10%APS在灌胶前加入。

（3）灌胶：灌胶过程中防止出现气泡，轻轻插入梳子，使其聚合2小时以上。

（4）变性：20μL PCR样品中加入5μL6×上样缓冲液，混匀后，在PCR仪上运行变性程序：95℃变性5分钟，4℃冷却10分钟。

（5）电泳：用移液器吹吸加样槽，清除气泡，擦入样品梳子，每个加样孔点加入3μL样品。90W恒功率电泳1小时。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，胶会紧贴在涂Binding silane的玻璃板上。

4、银染

固定：10%无水乙醇+0.5%冰醋酸固定液，固定5min分钟；

漂洗：双蒸水快速漂洗；

染色：0.2%AgNO₃溶液中染色5分钟；

漂洗：双蒸水快速漂洗；

显影：3%NaOH+0.5%甲醛显影液，显影5min；

定影；固定液中定影5分钟；

5、数据统计与分析

依据SSR扩增产物在电泳凝胶上的相对位置及带型特征，对引物生成的不同基因型直接编号，建立其DNA分子指纹图谱。

图1所示为特征引物CIR246对48个‘中棉所49号’种子样品纯度检测图谱，编号1-48为种子样品泳道，编号M为分子量Marker泳道。 48个样品表现为两种基因型，编号为42的样品表现为一种基因型，其他47个样品均表现为另一种主要基因型，其中，主要基因型为‘中棉所49号’的真实基因型，编号为42的样品为杂株基因型。即‘中棉所49号’种子的纯度为97.9%。

图2所示为特征引物DPL0917对同样的48个‘中棉所49号’种子样品纯度检测图谱，编号1-48为种子样品泳道，编号M为分子量Marker泳道。48个样品表现为两种基因型，编号为42的样品表现为一种基因型，其他47个样品均表现为另一种主要基因型，其中，主要基因型为‘中棉所49号’的真实基因型，编号为42的样品为杂株基因型。即‘中棉所49号’种子的纯度为97.9%。两个特征引物检测的结果得到了相互验证，且结果完全一致。

利用其余8对引物进行SSR-PCR扩增，电泳结果与上述2对引物的相同，表明引物间检测结果的一致性。

实施例2棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法的应用

鉴定市面上正在热销的常规棉品种X是否为主导棉花品种‘中棉所49号’。

按照实施例1的步骤，随机挑取待测品种X与对照品种中棉所49干种子各24粒进行DNA制备，同时使用DPL0917、CIR246、BNL3033、BNL1053、NAU3839、HAU0878、DPL0176、NAU3424、Gh132和BNL1154共10对特征引物进行PCR扩增、电泳及银染检测。

结果分析：通过以上检测，获得两个品种在10个位点上的DNA指纹图谱，进行比较，若两个品种在10个特征引物位点上指纹完全相同，表明X品种是常规棉品种中棉所49；若两个品种在大于等于2个特征引物位点上指纹不相同，表明X品种不是常规棉品种中棉所49；若两个品种仅在1个特征引物位点上指纹不相同，表明X品种是常规棉品种中棉所49的近似品种。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献：

[1]武耀廷,张天真,郭旺珍，等.陆地棉品种SSR标记的多态性及用于杂交种纯度检测的研究[J].棉花学报,2001,13(3):131-133.

[2]马轩,杜雄明,孙君灵.18个彩色棉品系的SSR指纹分析[J].植物遗传资源学报,2003,4(4)305-310.

[3]殷剑美,陈旭升,狄佳春，等.杂交棉苏杂118的SSR指纹图谱构建[J].江苏农业科学,2007,4:29-31。

Claims

1.用于检测棉花品种‘中棉所49号’的特异性PCR引物，其特征在于，所述PCR引物选自CIR246、DPL0917、BNL3033、BNL1053、NAU3839、HAU0878、DPL0176、NAU3424、Gh132和BNL1154中的至少一对引物；

CIR246 上游引物：5′-TTAGGGTTTAGTTGAATGG-3′

下游引物：5′-ATGAACACACGCACG-3′；

DPL0917 上游引物：5′-GTTGCTGAGGAATGGGAAGA-3′

下游引物：5′-TGTGCAATTTGTGACCACCT-3′；

BNL3033 上游引物：5′-TTTTTTGTTTCCACCCAAGC-3′

下游引物：5′-GTCGCCCCATCCGATGTC-3′；

BNL1053 上游引物：5′-AGGGTCTGTCATGGTTGGAG-3′

下游引物：5′-CATGCATGCGTACGTGTGTA-3′；

NAU3839 上游引物：5′-GGGTAGGGGAAAAGTTTGTT-3′

下游引物：5′-CGTGAATTCCATCTCTCACA-3′；

HAU0878 上游引物：5′-TCATTCCTGAAACCCAAAAT-3′

下游引物：5′-CTAACAGGGGTGACATAGGG-3′；

DPL0176 上游引物：5′-GAAACTGGGAGTGAAAGAACAAGT-3′

下游引物：5′-TGGATGTTAGCTTTGGTTTACCC-3′；

NAU3424 上游引物：5′-GTCAGGAAAAGCTGAAAGGA-3′

下游引物：5′-AAGAGGGCATTTCCATGATA-3′；

Gh132 上游引物：5′-TCATGGAACACCAAAGTTGGA-3′

下游引物：5′-ACATGATAGATTATTCAGCAATGCA-3′；

BNL1154 上游引物：5′-CATCTATTTTCGTGGGGTGC-3′

下游引物：5′-AACCCTTTGTTCAATTTCTCG-3′。

2.棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的用于检测棉花品种‘中棉所49号’的特异性PCR引物。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，包括CIR246、DPL0917、BNL3033、BNL1053、NAU3839、HAU0878、DPL0176、NAU3424、Gh132和BNL1154的引物组合。

4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的至少一种。

5.棉花品种‘中棉所49号’的DNA指纹检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取待测棉花的基因组DNA；

2）以待测棉花的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；

3）检测PCR扩增产物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，20μL PCR反应体系中包括：添加Mg²⁺的10×反应缓冲液2.0μL，2.5mM dNTPs1.6μL，20μM上、下游引物各0.15μL，2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，20ng/μL基因组DNA2.0μL，余量为ddH₂O。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，32个循环；72℃延伸12min，4℃保存。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，使用银染法检测PCR扩增产物。

9.权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测棉花品种‘中棉所49号’中的应用。