发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定番茄品种真实性与种子纯度。
为解决上述技术问题,本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物为成套引物1和/或成套引物2,所述成套引物1为名称分别为Sol_SSR19、Sol_SSR120、Sol_SSR305、Sol_SSR18、Sol_SSR132、Sol_SSR3、Sol_SSR110、Sol_SSR146、Sol_SSR125、Sol_SSR117、Sol_SSR101、Sol_SSR218、Sol_SSR225、Sol_SSR97、Sol_SSR185、Sol_SSR233、Sol_SSR184、Sol_SSR254、Sol_SSR318、Sol_SSR272、Sol_SSR68、Sol_SSR169、Sol_SSR13和Sol_SSR96的引物对中的至少一种;
所述成套引物2为名称分别为Sol_SSR190、Sol_SSR303、Sol_SSR302、Sol_SSR148、Sol_SSR304、Sol_SSR45、Sol_SSR24、Sol_SSR76、Sol_SSR306、Sol_SSR308、Sol_SSR201、Sol_SSR23、Sol_SSR126、Sol_SSR312、Sol_SSR224、Sol_SSR313、Sol_SSR239、Sol_SSR315、Sol_SSR69、Sol_SSR266、Sol_SSR317、Sol_SSR283、Sol_SSR321和Sol_SSR300的引物对中的至少一种;
所述Sol_SSR19、所述Sol_SSR120、所述Sol_SSR305、所述Sol_SSR18、所述Sol_SSR132、所述Sol_SSR3、所述Sol_SSR110、所述Sol_SSR146、所述Sol_SSR125、所述Sol_SSR117、所述Sol_SSR101、所述Sol_SSR218、所述Sol_SSR225、所述Sol_SSR97、所述Sol_SSR185、所述Sol_SSR233、所述Sol_SSR184、所述Sol_SSR254、所述Sol_SSR318、所述Sol_SSR272、所述Sol_SSR68、所述Sol_SSR169、所述Sol_SSR13、所述Sol_SSR96、所述Sol_SSR190、所述Sol_SSR303、所述Sol_SSR302、所述Sol_SSR148、所述Sol_SSR304、所述Sol_SSR45、所述Sol_SSR24、所述Sol_SSR76、所述Sol_SSR306、所述Sol_SSR308、所述Sol_SSR201、所述Sol_SSR23、所述Sol_SSR126、所述Sol_SSR312、所述Sol_SSR224、所述Sol_SSR313、所述Sol_SSR239、所述Sol_SSR315、所述Sol_SSR69、所述Sol_SSR266、所述Sol_SSR317、所述Sol_SSR283、所述Sol_SSR321和所述Sol_SSR300的两条引物的序列依次为如下c1)、c2)、c3)或c4):
c1)序列表中序列1-96所示的96条序列;
c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的96条序列;
c3)与c1)或c2)限定的序列具有85%以上的同一性的序列;
c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的序列杂交的序列;
其中序列表中序列2n与序列2n-1组成一个引物对(表1),序列2n为下游引物,序列2n-1为上游引物,n为1-24中的一个自然数。序列表中序列1-96中,各序列的第1位均为相应引物的5’端。
c2)所述在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列为在序列表中序列1-96所示的96条序列中的至少一条的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列1-96所示的96条序列中的至少一条的核苷酸序列具有85%或更高,或90%或更高,或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件,两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(%)表示,其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC,0.1%SDS的溶液中,在68℃下杂交并洗膜2次,每次5min,又于0.5×SSC,0.1%SDS的溶液中,在68℃下杂交并洗膜2次,每次15min;或,0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1%SDS的溶液中,65℃条件下杂交并洗膜。
上述85%以上同一性,可为85%、90%或95%以上的同一性。
上述成套引物中的各引物对均可由荧光物质标记。所述荧光物质具体可为FAM(如6-FAM)、NED、PET或VIC。所述荧光物质具体均可标记在各引物对上游引物的5’端。
在本发明的实施例中,所述Sol_SSR19、所述Sol_SSR120、所述Sol_SSR125、所述Sol_SSR101、所述Sol_SSR225、所述Sol_SSR68、所述Sol_SSR190、所述Sol_SSR304、所述Sol_SSR23、所述Sol_SSR313、所述Sol_SSR239、所述Sol_SSR266和所述Sol_SSR321均由6-FAM标记;
所述Sol_SSR3、所述Sol_SSR146、所述Sol_SSR117、所述Sol_SSR184、所述Sol_SSR272、所述Sol_SSR96、所述Sol_SSR24、所述Sol_SSR201、所述Sol_SSR126、所述Sol_SSR224、所述Sol_SSR315和所述Sol_SSR283均由NED标记;
所述Sol_SSR305、所述Sol_SSR132、所述Sol_SSR110、所述Sol_SSR233、所述Sol_SSR254、所述Sol_SSR318、所述Sol_SSR302、所述Sol_SSR148、所述Sol_SSR76、所述Sol_SSR308和所述Sol_SSR300均由PET标记;
所述Sol_SSR18、所述Sol_SSR218、所述Sol_SSR97、所述Sol_SSR185、所述Sol_SSR169、所述Sol_SSR13、所述Sol_SSR303、所述Sol_SSR45、所述Sol_SSR306、所述Sol_SSR312、所述Sol_SSR69和所述Sol_SSR317均由VIC标记。
上述成套引物中的各对引物可以单独使用分别进行单独的PCR扩增。各对引物单独使用时,这引物对间的配比没有要求。每种引物对中的两条单链DNA的摩尔比均可为1:1。
所述成套引物中的各引物对均可独立包装,各单链DNA也均可独立包装。
为解决上述技术问题,本发明还提供了鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性的方法,包括:利用所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物对两个或两个以上待测番茄基因组DNA进行PCR扩增,分别得到各待测番茄的PCR产物;根据各待测番茄的PCR产物的差异确定所述两个或两个以上待测番茄是否为同一品种。
上述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性的方法中,所述差异具体是指各待测番茄的各个引物对的PCR产物中DNA片段个数和/或长度在不同待测番茄间的差异。所述差异可通过DNA分析仪和/或DNA分析软件和/或模块进行确定。所述DNA分析仪具体可为ABI 3730xlDNA分析仪。所述DNA分析软件可为GENEMAPPER。
上述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性的方法中,确定所述两个或两个以上待测番茄是否为同一品种的具体方法可为:在两个待测番茄的所述番茄SSR引物对的PCR产物中,如两个待测番茄的PCR产物的差异个数≥2,这两个待测番茄为“不同品种”;如两个待测番茄的PCR产物的差异个数=1,这两个待测番茄为“近似品种”;如两个待测番茄的PCR产物的差异个数=0,这两个待测番茄为“极近似或相同品种”。
对利用48对SSR引物仍未检测到≥2个差异位点数的待测番茄,如果相关品种存在特定标记,必要时增加其特定标记进行检测。
上述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性的方法中,利用每个引物对进行PCR扩增的反应体系中各引物对的上下游引物在反应体系中的浓度均可为10pM。利用每个引物对进行PCR扩增的退火温度均可为56℃。
利用每个引物对进行PCR扩增的10μL反应体系均可为:2×Taq PCR Mix 5μL,上下游引物(上下游引物在反应体系中的浓度均为10pM),待测DNA样品,补水到终体积为10μL。其中2×Taq PCR Mix具体可为北京康为世纪生物科技有限公司产品,货号为CW0718M。
利用每个引物对进行PCR扩增的反应条件均可为:95℃预变性5min;95℃变性40s,56℃退火30s,72℃延伸45s,共35个循环;72℃延伸10min,4℃保存。
在利用所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物鉴定番茄品种真实性时,可先利用所述成套引物1进行鉴定,并按照上述确定所述两个或两个以上待测番茄是否为同一品种的方法确定待测番茄样品是否为同一品种;在利用所述成套引物1鉴定的结果为“近似品种”或“极近似或相同品种”时,再利用所述成套引物2进行进一步检测,并按照上述确定所述两个或两个以上待测番茄是否为同一品种的方法最终确定待测番茄样品是否为同一品种。在仅利用所述成套引物1进行检测时,利用所述成套引物1得到的结果即为最后结果,在先后利用所述成套引物1和所述成套引物2进行检测时,利用所述成套引物2得到的结果即为最终结果。
为解决上述技术问题,本发明还提供了鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度的方法,包括:利用所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物对待测番茄样品基因组DNA进行PCR扩增,分别得到各待测番茄样品的PCR产物;根据所述待测番茄样品间PCR产物的差异确定所述待测番茄样品的种子纯度。
所述根据所述待测番茄样品间PCR产物的差异确定所述待测番茄样品的种子纯度具体可为根据公式1和公式2计算待测番茄种子纯度;
种子纯度p=(NT-ND)/NT×100%(公式1),其中p表示利用一对番茄SSR引物对得到的种子纯度,所述番茄SSR引物对为所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物中的引物对,NT表示供检种子数目,ND表示利用一对番茄SSR引物对得到的杂种子数目;
种子纯度P=利用所用的所述番茄SSR引物对得到的种子纯度之和/n(公式2),其中n表示所用的所述番茄SSR引物对数目。
上述鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度的方法中,所述待测番茄样品的样品数可大于等于10,如大于等于94。
上述鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度的方法中,所述差异具体是指各待测番茄样品的各个引物对的PCR产物中DNA片段个数和/或长度在不同待测番茄样品间的差异。所述差异可通过DNA分析仪和/或DNA分析软件和/或模块进行确定。所述DNA分析仪具体可为ABI3730xl DNA分析仪。所述DNA分析软件可为GENEMAPPER。
上述鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度的方法中,利用每个引物对进行PCR扩增的反应体系中各引物对的上下游引物在反应体系中的浓度均可为10pM。利用每个引物对进行PCR扩增的退火温度均可为56℃。
利用每个引物对进行PCR扩增的10μL反应体系均可为:2×Taq PCR Mix 5μL,上下游引物(上下游引物在反应体系中的浓度均为10pM),待测DNA样品,补水到终体积为10μL。其中2×Taq PCR Mix具体可为北京康为世纪生物科技有限公司产品,货号为CW0718M。
利用每个引物对进行PCR扩增的反应条件均可为:95℃预变性5min;95℃变性40s,56℃退火30s,72℃延伸45s,共35个循环;72℃延伸10min,4℃保存。
上述鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度的方法中,再利用所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物鉴定种子纯度时,可先利用所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物对待测样本进行测试选出有利于鉴定所述待测样本种子纯度的引物对,选出的引物对可为1-48对,利用选出的引物对进行进一步的检测。
为解决上述技术问题,本发明还提供了鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性或种子纯度的系统。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性或种子纯度的系统,包括所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物。
所述系统可仅为鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物,也可由所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物与进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器组成,也可由所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物与进行DNA分析所需的仪器和/或软件和/或模块组成,也可由所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物与所述进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器以及所述进行DNA分析所需的仪器和/或软件和/或模块组成。所述进行PCR扩增所需的试剂可为2×Taq PCR Mix,2×Taq PCR Mix可为北京康为世纪生物科技有限公司产品,货号为CW0718M。所述进行PCR扩增所需的仪器可为PCR仪。所述进行DNA分析所需的仪器可为DNA分析仪,如ABI 3730xl DNA分析仪。所述进行DNA分析所需的软件可为GENEMAPPER。
为解决上述技术问题,本发明还提供了所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物在下述X1)-X5)中任一种中的应用:
X1)在制备鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性产品中的应用;
X2)在制备鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度产品中的应用;
X3)在鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性中的应用;
X4)在鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度中的应用;
X5)在番茄育种中的应用。
为解决上述技术问题,本发明还提供了所述系统在下述X1)-X5)中任一种中的应用:
X1)在制备鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性产品中的应用;
X2)在制备鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度产品中的应用;
X3)在鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性中的应用;
X4)在鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度中的应用;
X5)在番茄育种中的应用。
为解决上述技术问题,本发明还提供了番茄SSR指纹图谱构建方法。
本发明所提供的番茄SSR指纹图谱构建方法,包括利用所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物对供试番茄DNA进行PCR扩增,得到PCR扩增产物;检测所述PCR扩增产物构建供试番茄的SSR指纹图谱。
上述番茄SSR指纹图谱构建方法中,所述检测所述PCR扩增产物可通过DNA分析仪和/或DNA分析软件进行检测。所述DNA分析仪具体可为ABI 3730xl DNA分析仪。所述DNA分析软件具体可为GENEMAPPER。
上述番茄SSR指纹图谱构建方法中,利用所述DNA分析仪进行检测可包括:将不同荧光物质标记的PCR产物分别进行稀释混合后再利用所述DNA分析仪进行电泳。其中,6-FAM(蓝色)和VIC(绿色)荧光标记的PCR产物均可稀释30倍,NED(黑色)和PET(红色)荧光标记的PCR产物均可稀释10倍。各稀释后的PCR产物可等体积混合。利用所述DNA分析仪进行电泳前还可包括将稀释混合得到的液体95℃变性5min然后于冰上冷却10min。
上述番茄SSR指纹图谱构建方法中,利用每个引物对进行PCR扩增的反应体系中各引物对的上下游引物在反应体系中的浓度均可为10pM。利用每个引物对进行PCR扩增的退火温度均可为56℃。
利用每个引物对进行PCR扩增的10μL反应体系均可为:2×Taq PCR Mix 5μL,上下游引物(上下游引物在反应体系中的浓度均为10pM),待测DNA样品,补水到终体积为10μL。其中2×Taq PCR Mix具体可为北京康为世纪生物科技有限公司产品,货号为CW0718M。
利用每个引物对进行PCR扩增的反应条件均可为:95℃预变性5min;95℃变性40s,56℃退火30s,72℃延伸45s,共35个循环;72℃延伸10min,4℃保存。
为解决上述技术问题,本发明还提供了所述番茄SSR指纹图谱构建方法在鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性或种子纯度中的应用。
为解决上述技术问题,本发明还提供了所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物或所述系统的制备方法。
本发明所提供的所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物或所述系统的制备方法,包括A1)或A2):
A1)将所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物中各单链DNA单独包装;
A2)将所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物中各单链DNA包装在一起。
实验证明,本发明的鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物不仅可以用来鉴定番茄品种真实性,还可以鉴定番茄的种子纯度,且具有准确性高、结果稳定、不受环境条件及发育时期的影响、统计简便等优势。本发明还建立了番茄SSR指纹图谱及品种真实性鉴定方法与种子纯度鉴定,用于番茄品种真实性的鉴定和种子纯度的鉴定。利用本发明的鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物在鉴定种子纯度时,不仅可以鉴定同一父母本的杂交后代的纯度,还可以从一批种子中检测是否纯在杂种子及该批种子的纯度。
本发明立足于我国番茄育种产业发展,建立了精确、快速、高通量和高度自动化的基于SSR标记的番茄品种真实性鉴定及种子纯度鉴定技术体系,为保护我国番茄育种单位产权利益、维护我国番茄育种产业健康快速发展提供技术支撑,对规范、监管种子市场、保护种植户的产量和收入具有重要的现实意义。
实施例2、利用鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和种子纯度的成套引物进行番茄品种真实性鉴定
(1)构建图谱的番茄材料由北京农林科学院蔬菜中心李常保老师提供,从402份材料中,随机选取100份品种材料(表2)。所选杂交种如表3所示。
表2、100份供试番茄品种
表3、12份代表性番茄杂交品种材料
品种名称 |
类别 |
特征性状 |
备注 |
京番104 |
大粉 |
粉色超大果类 |
杂交种 |
京番203 |
大粉 |
粉色中大果类 |
杂交种 |
京番501 |
大红 |
红色中大果类 |
杂交种 |
京番601 |
大红 |
红色大果类 |
杂交种 |
京番701 |
大黄 |
黄色大果类 |
杂交种 |
京番彩星1号 |
小彩 |
黑彩色短椭圆樱桃类 |
杂交种 |
京番红罗1号 |
小红 |
红色罗曼型樱桃类 |
杂交种 |
京番黄星1号 |
小黄 |
黄色长椭圆樱桃类 |
杂交种 |
京番绿星1号 |
小绿 |
绿色正圆型樱桃类 |
杂交种 |
京番紫星1号 |
小紫 |
紫色正圆樱桃类 |
杂交种 |
京番相思豆 |
小红 |
红色迷你超小果樱桃类 |
杂交种 |
京番中彩1 |
绿彩 |
绿彩条纹中等果类 |
杂交种 |
(2)提取供试番茄品种的DNA
采用CTAB法提取供试品种的DNA:取番茄幼叶20mg~30mg至2.0mL离心管中,研磨机中研磨10min;加入750μL预热的CTAB提取液后,充分摇匀,65℃水浴45min;加入750μL氯仿,上下混匀3min,12000g离心5min;吸取500μL上清液至另一只2.0mL离心管中,加入0.7倍体积预冷的异丙醇,颠倒离心管数次,12000g离心10min,弃上清液;加入75%乙醇漂洗2次,离心后弃上清液,自然风干;加入100μL 1.0×TE缓冲液,充分溶解后得到供试番茄品种DNA,4℃保存备用。
其中,CTAB提取液的配制方法为:称取20g CTAB和81.816g NaCl溶于适量水中,然后加入1mol/L Tris-HCl(pH=8.0)100mL,0.5mol/L EDTA溶液(pH=8.0)40mL,定容至1000mL,在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。于4℃贮存。
(3)PCR扩增
用实施例1的成套引物1中的每对引物分别对供试番茄品种DNA进行单重PCR扩增,每个引物对的PCR扩增均采用如下10μL的反应体系:2×Taq PCR Mix(北京康为世纪生物科技有限公司产品,货号为CW0718M)5μL,上下游引物各0.04μL(上下游引物在反应体系中的浓度均为10pM),浓度为50ng/μL的供试番茄品种DNA 1μL,补水到终体积为10μL。
每个引物对的PCR扩增的条件均为:95℃预变性5min;95℃变性40s,56℃退火30s,72℃延伸45s,共35个循环;72℃延伸10min,4℃保存。
(4)PCR产物检测:
每种供试番茄品种DNA的PCR产物均按照如下方法经ABI 3730xl DNA分析仪进行检测:首先将6-FAM(蓝色)和VIC(绿色)荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍,NED(黑色)和PET(红色)荧光标记的PCR产物用超纯水稀释10倍;分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合形成混合液;吸取1μL混合液加入到ABI 3730xl DNA分析仪专用96深孔板孔中。板中各孔分别加入0.1μL LIZ500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min,取出后立即置于冰上,冷却10min以上。瞬时离心10s后置放到ABI 3730xlDNA分析仪上进行电泳,用GENEMAPPER进行图像分析及数据采集。
(5)数据记录:
将每一位点的待测样品间的扩增片段的带型(即PCR产物电泳条带数目)和移动位置(即PCR产物电泳条带大小)进行比较,确定待测样品该位点的等位变异大小,纯合位点的等位变异记录为X/X,杂合位点的等位变异记录为X/Y,其中X,Y分别为该位点上两个等位变异,小片段数据在前,大片段数据在后;缺失位点基因型数据记录为0/0;多个位点的数据整合在一起形成不同番茄品种的SSR指纹图谱库。
将成套引物1替换为成套引物2,按照步骤(3)-(5)的方法进行PCR扩增、检测及数据记录,最终得到的本发明的100份番茄品种的SSR指纹数据如表4所示。
表4、100份番茄品种的指纹数据(1)
表4、100份番茄品种的指纹数据(2)
表4、100份番茄品种的指纹数据(3)
表4、100份番茄品种的指纹数据(4)
表4、100份番茄品种的指纹数据(5)
注:表4的100份番茄品种的指纹数据(1)-(5)中,SSR19、SSR120、SSR305、SSR18、SSR132、SSR3、SSR110、SSR146、SSR125、SSR117、SSR101、SSR218、SSR225、SSR97、SSR185、SSR233、SSR184、SSR254、SSR318、SSR272、SSR68、SSR169、SSR13、SSR96、SSR190、SSR303、SSR302、SSR148、SSR304、SSR45、SSR24、SSR76、SSR306、SSR308、SSR201、SSR23、SSR126、SSR312、SSR224、SSR313、SSR239、SSR315、SSR69、SSR266、SSR317、SSR283、SSR321和SSR300分别表示Sol_SSR19、Sol_SSR120、Sol_SSR305、Sol_SSR18、Sol_SSR132、Sol_SSR3、Sol_SSR110、Sol_SSR146、Sol_SSR125、Sol_SSR117、Sol_SSR101、Sol_SSR218、Sol_SSR225、Sol_SSR97、Sol_SSR185、Sol_SSR233、Sol_SSR184、Sol_SSR254、Sol_SSR318、Sol_SSR272、Sol_SSR68、Sol_SSR169、Sol_SSR13、Sol_SSR96、Sol_SSR190、Sol_SSR303、Sol_SSR302、Sol_SSR148、Sol_SSR304、Sol_SSR45、Sol_SSR24、Sol_SSR76、Sol_SSR306、Sol_SSR308、Sol_SSR201、Sol_SSR23、Sol_SSR126、Sol_SSR312、Sol_SSR224、Sol_SSR313、Sol_SSR239、Sol_SSR315、Sol_SSR69、Sol_SSR266、Sol_SSR317、Sol_SSR283、Sol_SSR321和Sol_SSR300。
依据鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和种子纯度的成套引物中的48对核心SSR引物PCR产物的检测结果确定待测番茄是否为同一品种:当两个番茄样品的各个位点的PCR产物的差异个数(位点数)≥2,判定这两个样品为“不同品种”;当两个番茄样品的各个位点的PCR产物的差异个数(位点数)=1,判定这两个样品为“近似品种”;当两个番茄样品的各个位点的PCR产物的差异个数(位点数)=0,判定这两个样品为“极近似或相同品种”。在利用鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和种子纯度的成套引物鉴定番茄品种真实性时,可先利用成套引物1进行鉴定,并按照上述确定待测番茄是否为同一品种的方法确定待测番茄样品是否为同一品种;在利用成套引物1鉴定的结果为“近似品种”或“极近似或相同品种”时,再利用成套引物2进行进一步检测,并按照上述确定待测番茄是否为同一品种的方法最终确定待测番茄样品是否为同一品种。在仅利用成套引物1进行检测时,利用成套引物1得到的结果即为最后结果,在先后利用成套引物1和成套引物2进行检测时,利用成套引物2得到的结果即为最终结果。
结果分析:通过以上检测,获得100份番茄品种的指纹数据,进行比较后发现,每两个品种间的差异位点数都大于2,说明鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性的成套引物可以有效的把这些番茄品种鉴别开(表4);利用NTSYS软件进行品种聚类,分析品种间的遗传关系,从图中可以看出可以把这100份番茄品种全部区别开(图1)。