CN110607386B - 一套适用于番茄dna指纹库构建的kasp引物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一套适用于番茄DNA指纹库构建的KASP引物组合及其应用。本发明开发的番茄KASP核心引物及品种检测试剂盒，可以用来鉴定待测番茄品种鉴定，使得辨别品种真伪的操作变得准确便捷，其中KASP引物组合遍及番茄整个基因组且具有唯一的扩增稳点，代表性较强；该试剂盒的检测结果稳定可靠、操作简单快速，可以实现检测的规模化和标准化。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一套适用于番茄DNA指纹库构建的KASP引物组合及其应用。
背景技术
番茄(Lycopersicon esculentum L.)是世界上重要的蔬菜作物之一，具有极高的营养价值。由于番茄及其制品的独特食用、保健及辅助治疗的功效，在世界农业生产和贸易中占有重要的地位。根据世界加工番茄理事会(WPTC)发布的统计数据：2013年全球加工番茄产量为3301.2万吨。由于番茄是自花授粉的植物，在杂交制种的过程中，若人工去雄不及时，导致母本自交产生假杂种，同时也常常会存在生物学混杂与机械混杂，导致种子遗传纯度下降，种子上市后给生产者带来巨大的经济损失，产生不良的社会影响。因此，优良F1代杂种种子种苗的遗传纯度快速、准确鉴定成为番茄生产中最为迫切需要解决的问题之一。
传统鉴定番茄种子遗传纯度的方法主要有形态学田间小区鉴定与同工酶分析等1,2。田间小区鉴定方法主要是对番茄的子叶、叶片、第一束花的形成时间和果实的颜色、果实室数、果实表面构造和抗病特性等主要园艺形状进行鉴别，从而判断品种种子的纯度3。这种方法较费时、费工，占用大量的土地，需要经过3-5个月的生长成熟期；有时可用于杂种鉴定的形态特征数目有限，且多数形态性状易受环境因素的影响，所以仅靠形态特征来鉴别品种纯度的准确率会受到影响。用于番茄品种纯度鉴定的同工酶主要有POD，EST，ACP，ADH，MDH等4，但由于栽培番茄遗传变异小、多态性较低、可利用的酶种类少，且表达与组织发育及发育时期有关，难以用于一些F1杂种纯度检测与品种鉴定。
以DNA为基础的分子标记如RFLP、RAPD、SSR、AFLP与ISSR等，具有检测位点数量多、多态性高、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，已开始应用于蔬菜作物品种鉴定与纯度检测中。SNP是染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式，广泛用于群体遗传学分析、构建遗传连锁图和指纹图谱以及分子标记辅助育种等。为保证新培育出的番茄优良品种产生最大的经济效益，需要一种权威、准确、稳定检测方法进行番茄商品种子遗传纯度的快速鉴定。
迄今为止，有关番茄KASP标记核酸指纹库构建的报道还不多见，尚无用于核酸指纹库构建的专用试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一套适用于番茄DNA指纹库构建的KASP引物组合及其应用。
本发明首先保护用于检测48个SNP位点基因型的物质在番茄品种鉴定中的应用；
所述48个SNP位点如下表所示：
上述位置参照番茄基因组2.4版本，ftp://ftp.solgenomics.net/genomes/Solanum_lycopersicum/Heinz1706/wgs/assembly/build_2.40/。
在本发明的实施例中，所述用于检测48个SNP位点基因型的物质为引物组合；所述引物组合由48个特异引物组组成；
引物组1由序列表的序列1-3所示的单链DNA分子组成；
引物组2由序列表的序列4-6所示的单链DNA分子组成；
引物组3由序列表的序列7-9所示的单链DNA分子组成；
引物组4由序列表的序列10-12所示的单链DNA分子组成；
引物组5由序列表的序列13-15所示的单链DNA分子组成；
引物组6由序列表的序列16-18所示的单链DNA分子组成；
引物组7由序列表的序列19-21所示的单链DNA分子组成；
引物组8由序列表的序列22-24所示的单链DNA分子组成；
引物组9由序列表的序列25-27所示的单链DNA分子组成；
引物组10由序列表的序列28-30所示的单链DNA分子组成；
引物组11由序列表的序列31-33所示的单链DNA分子组成；
引物组12由序列表的序列34-36所示的单链DNA分子组成；
引物组13由序列表的序列37-39所示的单链DNA分子组成；
引物组14由序列表的序列40-42所示的单链DNA分子组成；
引物组15由序列表的序列43-45所示的单链DNA分子组成；
引物组16由序列表的序列46-48所示的单链DNA分子组成；
引物组17由序列表的序列49-51所示的单链DNA分子组成；
引物组18由序列表的序列52-54所示的单链DNA分子组成；
引物组19由序列表的序列55-57所示的单链DNA分子组成；
引物组20由序列表的序列58-60所示的单链DNA分子组成；
引物组21由序列表的序列61-63所示的单链DNA分子组成；
引物组22由序列表的序列64-66所示的单链DNA分子组成；
引物组23由序列表的序列67-69所示的单链DNA分子组成；
引物组24由序列表的序列70-72所示的单链DNA分子组成；
引物组25由序列表的序列73-75所示的单链DNA分子组成；
引物组26由序列表的序列76-78所示的单链DNA分子组成；
引物组27由序列表的序列79-81所示的单链DNA分子组成；
引物组28由序列表的序列82-84所示的单链DNA分子组成；
引物组29由序列表的序列85-87所示的单链DNA分子组成；
引物组30由序列表的序列88-90所示的单链DNA分子组成；
引物组31由序列表的序列91-93所示的单链DNA分子组成；
引物组32由序列表的序列94-96所示的单链DNA分子组成；
引物组33由序列表的序列97-99所示的单链DNA分子组成；
引物组34由序列表的序列100-102所示的单链DNA分子组成；
引物组35由序列表的序列103-105所示的单链DNA分子组成；
引物组36由序列表的序列106-108所示的单链DNA分子组成；
引物组37由序列表的序列109-111所示的单链DNA分子组成；
引物组38由序列表的序列112-114所示的单链DNA分子组成；
引物组39由序列表的序列115-117所示的单链DNA分子组成；
引物组40由序列表的序列118-120所示的单链DNA分子组成；
引物组41由序列表的序列121-123所示的单链DNA分子组成；
引物组42由序列表的序列124-126所示的单链DNA分子组成；
引物组43由序列表的序列127-129所示的单链DNA分子组成；
引物组44由序列表的序列130-132所示的单链DNA分子组成；
引物组45由序列表的序列133-135所示的单链DNA分子组成；
引物组46由序列表的序列136-138所示的单链DNA分子组成；
引物组47由序列表的序列139-141所示的单链DNA分子组成；
引物组48由序列表的序列142-144所示的单链DNA分子组成。
本发明还保护引物组合，由序列表的序列1至序列144所示的单链DNA分子组成。
所述引物组合中，每条引物的浓度相同。
所述引物组合的用途为番茄品种鉴定。
本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为番茄品种鉴定。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护一种番茄指纹图谱，是通过如下方式制备得到的：获得96种番茄品种在所述48个SNP位点的基因型，即为番茄指纹图谱；所述96种番茄品种为SAH01、SAH02、SAH03、SAF01、SAF02、SAF03、SAF04、SAF05、SAF06、SAF07、SAF08、SAF09、SAF10、SAY01、SAY02、SAY03、SAY04、SAY05、JZ801、SD46、农博粉帝、农博粉1026、农博粉霸1639、农博粉强、农博粉1228、农博粉1688、农博粉霸1428、农博粉6号、农博粉娇、中华绿宝、农博粉霸15号、农博粉霸10号、农博粉3号、农博粉帅、农博粉奇、冬霸、农博粉霸3号、万人迷、农博粉4号、农博粉霸1321、农博粉钻、农博粉霸1533、农博粉霸1510、农博粉霸1614、农博粉霸1615、农博粉霸1702、农博粉霸1304、农博粉霸1535、农博粉霸1763、农博粉霸9784、抗TY新1号、农博粉霸1726、农博粉霸1305、农博粉冠、HA1514、农1739、农博粉5号、农博红霸2号、农博红霸1号、508、509、702、705、709、711、712、713、714、718、17-20、17-23、17-24、17-30、17-32、17-35、17-36、17-37、17-46、17-53、17-54、17-64、17-80、寒丽、寒裕、禾胜280、禾胜39、禾胜雪龙、嘉宝丽、嘉红宝、凯旋、丽妍、欧龙、超19、粉多喜、京番101和京番T1605。
所述番茄指纹图谱的制备方法包括如下步骤：：采用所述48个引物组对番茄的基因组DNA进行PCR扩增，得到基因型结果。所述PCR扩增可采用荧光定量PCR仪AB-Q6 Flex或采用Douglas Scientific公司ArrayTape平台进行。
采用荧光定量PCR仪AB-Q6 Flex(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)检测时的反应体系(5μL)为：基因组DNA(50ng/μL)1.0μL+引物混液0.7μL(引物混液中各条引物的浓度均为100pmol/L)+2×KASP Mix(艾吉析科技(上海)有限公司，货号：1536)2.5μL+1.43μLddH2O；反应程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55℃退火60s，共40个循环。按照荧光定量PCR仪AB-Q6仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程序，保存数据。
采用ArrayTape平台检测时的反应体系(1.6μL)为：基因组DNA(50ng/μL)0.8μL+引物混液0.03μL(引物混液中各条引物的浓度均为100pmol/L)+2×KASP Mix(艾吉析科技(上海)有限公司，货号：1536)0.8μL；反应程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55℃退火60s，共40个循环。按照ArrayTape平台仪器操作手册，运行程序，保存数据。
所述番茄指纹图谱具体可如表4所示。
本发明还保护所述指纹图谱在番茄品种鉴定中的应用。
本发明还保护一种番茄品种鉴定方法，包括如下步骤：获得待测番茄在所述48个SNP位点的基因型，即为待测番茄的指纹图谱；将待测番茄的指纹图谱与前文所述番茄指纹图谱进行比对，如果待测番茄的的指纹图谱与前文所述番茄指纹图谱中某一种番茄的比对结果完全一致，则待测番茄为该品种番茄。
本发明还保护一种番茄品种鉴定方法，包括如下步骤：获得待测番茄在所述48个SNP位点的基因型，即为待测番茄的指纹图谱；如果两个待测番茄的指纹图谱比对后，差异位点数≥2，则两个待测番茄为不同品种；如果差异位点数＝1，则两个待测番茄为近似品种；如果差异位点数＝0，则两个待测番茄为极近似或相同品种。
以上任一所述方法中，所述“获得96种番茄品种在权利要求1所述的48个SNP位点的基因型”或“获得待测番茄在权利要求1所述的48个SNP位点的基因型”是通过如下方法实现的：采用所述48个引物组对番茄的基因组DNA基因PCR扩增，得到基因型结果。检测方法具体可参照前文。
以上任一所述待测番茄具体可为SAH01、SAH02、SAH03、SAF01、SAF02、SAF03、SAF04、SAF05、SAF06、SAF07、SAF08、SAF09、SAF10、SAY01、SAY02、SAY03、SAY04、SAY05、JZ801、SD46、农博粉帝、农博粉1026、农博粉霸1639、农博粉强、农博粉1228、农博粉1688、农博粉霸1428、农博粉6号、农博粉娇、中华绿宝、农博粉霸15号、农博粉霸10号、农博粉3号、农博粉帅、农博粉奇、冬霸、农博粉霸3号、万人迷、农博粉4号、农博粉霸1321、农博粉钻、农博粉霸1533、农博粉霸1510、农博粉霸1614、农博粉霸1615、农博粉霸1702、农博粉霸1304、农博粉霸1535、农博粉霸1763、农博粉霸9784、抗TY新1号、农博粉霸1726、农博粉霸1305、农博粉冠、HA1514、农1739、农博粉5号、农博红霸2号、农博红霸1号、508、509、702、705、709、711、712、713、714、718、17-20、17-23、17-24、17-30、17-32、17-35、17-36、17-37、17-46、17-53、17-54、17-64、17-80、寒丽、寒裕、禾胜280、禾胜39、禾胜雪龙、嘉宝丽、嘉红宝、凯旋、丽妍、欧龙、超19、粉多喜、京番101或京番T1605。
本发明的试验证明，本发明开发的番茄KASP核心引物及品种检测试剂盒，可以用来鉴定待测番茄品种鉴定，使得辨别品种真伪的操作变得准确便捷，其中KASP引物组合遍及番茄整个基因组且具有唯一的扩增稳点，代表性较强；该试剂盒的检测结果稳定可靠、操作简单快速，可以实现检测的规模化和标准化。
附图说明
图1为SNP物理位置。
图2为96份番茄品种聚类分析结果。
图3为采用表3所示引物对表1所示材料进行扩增检测的结果图。
图4为采用筛选过程中其他引物(对照)对表1所示材料进行扩增检测的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例中使用的番茄材料见表1。
表1
实施例1、KASP引物组合的筛选
对番茄基因组进行大量序列分析和功能分析，筛选48个SNP位点(表2)(物理坐标参照番茄基因组2.4版本，ftp://ftp.solgenomics.net/genomes/Solanum_lycopersicum/Heinz1706/wgs/assembly/build_2.40/)，并对其进行KASP引物设计，对设计的1000多对引物中进行大量筛选，选出扩增效果稳定、分型清晰的引物，得到番茄DNA指纹库构建的KASP引物组合，如表3(表3中的编号与表2中的相对应)和图1所示。采用表3所示引物对表1所示材料进行扩增检测的结果图见图3。采用筛选过程中其他引物(对照)对表1所示材料进行扩增检测的结果图见图4。
表2
| 编号 | SNP | 染色体 | 位置 | 编号 | SNP | 染色体 | 位置 |
| 1 | T/A | 1 | 6406128 | 25 | G/A | 8 | 30353631 |
| 2 | A/G | 1 | 41253067 | 26 | A/G | 8 | 38343686 |
| 3 | C/G | 1 | 47269989 | 27 | G/T | 8 | 40414481 |
| 4 | A/T | 1 | 53280651 | 28 | A/G | 8 | 4738089 |
| 5 | G/A | 1 | 59327512 | 29 | A/T | 9 | 15741715 |
| 6 | A/g | 2 | 2088175 | 30 | G/C | 9 | 35470822 |
| 7 | A/g | 2 | 3455416 | 31 | A/c | 9 | 5630176 |
| 8 | T/c | 3 | 1257561 | 32 | G/A | 9 | 59309722 |
| 9 | T/C | 3 | 9261715 | 33 | A/T | 9 | 62731865 |
| 10 | A/g | 3 | 14367485 | 34 | A/G | 9 | 66402556 |
| 11 | T/c | 3 | 27440773 | 35 | A/g | 10 | 4721437 |
| 12 | T/c | 3 | 43889809 | 36 | A/C | 10 | 21258714 |
| 13 | T/c | 3 | 45955051 | 37 | T/C | 10 | 31790149 |
| 14 | T/g | 4 | 49993944 | 38 | T/A | 10 | 39156059 |
| 15 | T/g | 6 | 2792207 | 39 | T/g | 10 | 46809726 |
| 16 | T/c | 6 | 2825064 | 40 | A/C | 10 | 56381219 |
| 17 | C/G | 7 | 11293045 | 41 | A/t | 11 | 1988859 |
| 18 | T/A | 7 | 22008618 | 42 | T/g | 11 | 5659261 |
| 19 | A/G | 7 | 30089067 | 43 | T/c | 11 | 16643589 |
| 20 | C/G | 7 | 38092414 | 44 | T/g | 11 | 26850743 |
| 21 | C/T | 7 | 42605378 | 45 | T/c | 11 | 51935919 |
| 22 | C/A | 7 | 5149873 | 46 | A/g | 11 | 52048131 |
| 23 | A/T | 8 | 10383588 | 47 | A/g | 12 | 6202164 |
| 24 | G/T | 8 | 25179116 | 48 | T/g | 12 | 6448039 |
表3
表3中，加粗字体所示的
为VIC接头序列；下划线字体所示的“GAAGGTGACCAAGTTCATGCT”为FAM接头序列。
实施例2、番茄DNA指纹库构建及其应用
一、番茄DNA指纹库构建
1、CTAB法提取96份待测番茄(表1)幼叶的基因组DNA。
2、采用表3中的48组引物对96份待测番茄进行PCR扩增(48组引物在同一反应体系中)，检测待测番茄在48个SNP位点的基因型。可采用荧光定量PCR仪AB-Q6 Flex检测或采用Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测。
采用荧光定量PCR仪AB-Q6 Flex(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)检测时的反应体系(5μL)为：基因组DNA(50ng/μL)1.0μL+引物混液0.7μL(引物混液中的实施例1的成套引物中各条引物的浓度均为100pmol/L)+2×KASP Mix(艾吉析科技(上海)有限公司，货号：1536)2.5μL+1.43μL ddH2O；反应程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55℃退火60s，共40个循环。按照荧光定量PCR仪AB-Q6仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程序，保存数据。
采用ArrayTape平台检测时的反应体系(1.6μL)为：基因组DNA(50ng/μL)0.8μL+引物混液0.03μL(引物混液中的实施例1的成套引物中各条引物的浓度均为100pmol/L)+2×KASP Mix(艾吉析科技(上海)有限公司，货号：1536)0.8μL；反应程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55℃退火60s，共40个循环。按照ArrayTape平台仪器操作手册，运行程序，保存数据。
数据记录：利用上述两种检测平台获得的数据中，纯合位点的基因型数据记录为Allele1/Allele1或者Allele2/Allele2，杂合位点的基因型数据记录为Allele1/Allele2，其中Allele1，Allele2分别为该变异位点上两个等位碱基；缺失位点基因型数据记录为0；例如，样品在某个位点上基因型为Allele1/Allele2，该位点的等位碱基为A/C，Allele1代表碱基A，在该位点的基因型记录为A/C。
96份待测番茄在48个SNP位点的基因型见表4。
表4
3、使用R(V 3.5.1)软件的Adegenet、Poppr、Ape、Phangorn、Hierfstat程序包对上述96个品种的DNA指纹图谱进行聚类分析并导出tree格式文件，通过Evolview在线软件(https://www.evolgenius.info/evolview/#login)进行聚类作图。如图2所示(图中的编号与表1和表2中相对应)。结果显示，48对KASP核心引物组合将96份番茄品种完全区分。
二、实际样本检测方法
1、提取待测番茄的基因组DNA。
2、采用步骤一中的方法进行PCR检测得到待测样本在48个SNP位点的基因型数据(DNA指纹图谱)。
3、根据步骤2的结果进行待测番茄品种判断，判断方法如下：
(1)将不同待测样本指纹图谱进行比对，当样品差异位点数≥2，判定为“不同品种”；当样品间差异位点数＝1，判定为“近似品种”；当样品间差异位点数＝0，判定为“极近似或相同品种”。
(2)使用R(V 3.5.1)软件的Adegenet、Poppr、Ape、Phangorn、Hierfstat程序包比对待测样本DNA指纹图谱和步骤一得到的96个番茄品种的DNA指纹图谱库，若所述待测样本DNA指纹图谱为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本为或候选为该品种。
序列表
<110> 北京通州国际种业科技有限公司
<120> 一套适用于番茄DNA指纹库构建的KASP引物组合及其应用
<160> 144
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggtcgga gtcaacggat tgatatcatt ccacaggttc cat 43
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtgacc aagttcatgc tgatatcatt ccacaggttc caa 43
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcagacaca acaaactgaa ttg 23
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtcgga gtcaacggat tcgtgaggtg aaggaacctc ta 42
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtgacc aagttcatgc tcgtgaggtg aaggaacctc tg 42
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccgtaatgt tttcagcttg ag 22
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaggtcgga gtcaacggat tacctaggtc aattgcctaa ttc 43
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaggtgacc aagttcatgc tacctaggtc aattgcctaa ttg 43
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggctcatcc aaatttacag tg 22
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaggtcgga gtcaacggat ttgaccaatt tacccatcat tcta 44
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaggtgacc aagttcatgc ttgaccaatt tacccatcat tctt 44
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctttgaaatt gcatggtaga aatc 24
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaaggtcgga gtcaacggat tgtctttcat ataataaatg gccg 44
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaaggtgacc aagttcatgc tgtctttcat ataataaatg gcca 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catttatata cccacattga taccc 25
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaaggtgacc aagttcatgc tcttagaatt aacaactgcg ctccg 45
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagtatacaa tctcaattgg agatgg 26
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaaggtcgga gtcaacggat tgatttataa caaaacgttc ggga 44
<210> 20
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaaggtgacc aagttcatgc tgatttataa caaaacgttc gggg 44
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctccattaac tgaactctcc acct 24
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gaaggtcgga gtcaacggat tagggccttc aatggtgttg at 42
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gaaggtgacc aagttcatgc tagggccttc aatggtgttg ac 42
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gaaggcacag agaaccacca aat 23
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gaaggtcgga gtcaacggat tcgagaactg tgatgagcca tatt 44
<210> 26
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gaaggtgacc aagttcatgc tcgagaactg tgatgagcca tatc 44
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gcctgctcga tattgtgatc aa 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gaaggtcgga gtcaacggat tgaaatgtgt attcaatgaa tgagcta 47
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gaaggtgacc aagttcatgc tgaaatgtgt attcaatgaa tgagctg 47
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtcttctcaa tttttccttc cca 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catctacagt gagcgggaac ga 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agattctcct actttcttat tcaaca 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gaaggtgacc aagttcatgc tcaaagcaag gtcttcgcca tg 42
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
agggtctgat ttctgcttct gaga 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gaaggtcgga gtcaacggat tcctaagtgt agcagccaca ttt 43
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<211> 43
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc tcctaagtgt agcagccaca ttg 43
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tccttttccc cttagagacc caa 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
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<400> 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
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<210> 53
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gaaggtgacc aagttcatgc tacaaagaat taccatcact gctta 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
agaaaaatca ttcatgagct accac 25
<210> 55
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gaaggtcgga gtcaacggat tgctaagaaa tttcttatcc actcaa 46
<210> 56
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
actatggtgc cagagtttgt agc 23
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
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<210> 59
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
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<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
aattgcgtgt tatcttaaga tgttc 25
<210> 61
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
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<210> 62
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gaaggtgacc aagttcatgc tagtgcttgt tgtactattc attgt 45
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
acatgctcat gaagctcaag tg 22
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
gaaggtcgga gtcaacggat tgatgtctta cataacagag aggacc 46
<210> 65
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gaaggtgacc aagttcatgc tgatgtctta cataacagag aggaca 46
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
tagtatccaa aaaatttcca agtcc 25
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gaaggtcgga gtcaacggat tttctaactc gtgcttgctc ata 43
<210> 68
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gaaggtgacc aagttcatgc tttctaactc gtgcttgctc att 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
ctaaaaatga cccaactcac aatc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gaaggtcgga gtcaacggat ttaagagact aatatgccct attctg 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
gaaggtgacc aagttcatgc ttaagagact aatatgccct attctt 46
<210> 72
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
ctatgcttgt tgtttgtttt gttg 24
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gaaggtcgga gtcaacggat ttatttaaga ttagcttgtg acgatg 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
gaaggtgacc aagttcatgc tgaccttagc tatgggtcta gttgg 45
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
gaaggtgacc aagttcatgc tataattagg tgattcctcc atacat 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
tctagaatgt cgtaatgtct agggg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
gaaggtcgga gtcaacggat tttaacaact ccaccgacaa ga 42
<210> 83
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
gaaggtgacc aagttcatgc tttaacaact ccaccgacaa gg 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
gaaggtcgga gtcaacggat tttaagtaat atttgaaccc aaacca 46
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
gaaggtgacc aagttcatgc tttaagtaat atttgaaccc aaacct 46
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
tgcataattt accctagagt tttga 25
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
gaaggtcgga gtcaacggat ttgggaagga atatttgcgt ag 42
<210> 89
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
gaaggtgacc aagttcatgc ttgggaagga atatttgcgt ac 42
<210> 90
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
atgataccta agaggctagt acaagg 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
gaaggtcgga gtcaacggat tctcttcttt ttcccttgaa aataa 45
<210> 92
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
gaaggtgacc aagttcatgc tctcttcttt ttcccttgaa aatac 45
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
atggctgcat tggtggttgt 20
<210> 94
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
gaaggtcgga gtcaacggat tttattccac ttaaatcttc atttgtg 47
<210> 95
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
gaaggtgacc aagttcatgc tttattccac ttaaatcttc atttgta 47
<210> 96
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
ttctaatttg cgataaataa tgcc 24
<210> 97
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
gaaggtcgga gtcaacggat tgtaccagga actggaggat cta 43
<210> 98
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
gaaggtgacc aagttcatgc tgtaccagga actggaggat ctt 43
<210> 99
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
taccttcttg cagaaagaag agg 23
<210> 100
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
gaaggtcgga gtcaacggat tccagctttc gtcattatat ctcta 45
<210> 101
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
gaaggtgacc aagttcatgc tccagctttc gtcattatat ctctg 45
<210> 102
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
ggctataaag agatctgcag tactt 25
<210> 103
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
gaaggtcgga gtcaacggat tgtcaacaag cttcggggaa a 41
<210> 104
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
gaaggtgacc aagttcatgc tgtcaacaag cttcggggaa g 41
<210> 105
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
tctacttatg cttcttgggg tgc 23
<210> 106
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
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<210> 107
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
gaaggtgacc aagttcatgc tcaacctatg tacccttagt ggtgc 45
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
tcaaaggagg gctcgagagt 20
<210> 109
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
gaaggtcgga gtcaacggat ttacctcgag ataccatgaa tggt 44
<210> 110
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
gaaggtgacc aagttcatgc ttacctcgag ataccatgaa tggc 44
<210> 111
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
cctttcacaa actcaataaa tctgt 25
<210> 112
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
gaaggtcgga gtcaacggat ttgaccaaat gacggttcat tt 42
<210> 113
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
gaaggtgacc aagttcatgc ttgaccaaat gacggttcat ta 42
<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
ccataacggt ccgttaattg a 21
<210> 115
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
gaaggtcgga gtcaacggat tcctatgggt tcaacctcct ttctt 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
gaaggtgacc aagttcatgc tcctatgggt tcaacctcct ttctg 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
gtccttgggc tgttgtaggt gat 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat tcttggggtc ctcctcaaag a 41
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gaaggtgacc aagttcatgc tcttggggtc ctcctcaaag c 41
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctaagatca gcgaccttcc tg 22
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gaaggtcgga gtcaacggat tgaggataag agtagagaaa cagaa 45
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gaaggtgacc aagttcatgc tgaggataag agtagagaaa cagat 45
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgctcgtgt ctttatcaaa ggat 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat tatgaattct tgtctctgca agtgt 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagaaaaccc ctttactctt tcaa 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat ttctgtgaca caagcctttc tacat 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc ttctgtgaca caagcctttc tacac 45
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atcaacaagc caaaccttca ag 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat tgatgtggtg gcctgtgaaa tt 42
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc tgatgtggtg gcctgtgaaa tg 42
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<212> DNA
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ttcttctgtg accaactcag aatg 24
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat taggtggcca acttccgcta t 41
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gaaggtgacc aagttcatgc taggtggcca acttccgcta c 41
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<212> DNA
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aagcaagcag aagaaattga cgt 23
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
gaaggtcgga gtcaacggat tatcagtgca caaactggct tca 43
<210> 137
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
gaaggtgacc aagttcatgc tatcagtgca caaactggct tcg 43
<210> 138
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgcaaagaa acaagatgat ataa 24
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
gaaggtcgga gtcaacggat tgaaagaacc aatttagtgc acca 44
<210> 140
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc tgaaagaacc aatttagtgc accg 44
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctggggttta gtaggaccta aaag 24
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
gaaggtcgga gtcaacggat ttcatctaag gttcttgttt ggtgt 45
<210> 143
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
gaaggtgacc aagttcatgc ttcatctaag gttcttgttt ggtgg 45
<210> 144
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
ccttccaagg ttcacagtag tctc 24
Claims (6)
1.用于检测48个SNP位点基因型的物质在番茄品种鉴定中的应用；
所述48个SNP位点如下表所示：
所述用于检测48个SNP位点基因型的物质为引物组合物；所述引物组合物由48个特异引物组组成；
引物组1由序列表的序列1-3所示的单链DNA分子组成；
引物组2由序列表的序列4-6所示的单链DNA分子组成；
引物组3由序列表的序列7-9所示的单链DNA分子组成；
引物组4由序列表的序列10-12所示的单链DNA分子组成；
引物组5由序列表的序列13-15所示的单链DNA分子组成；
引物组6由序列表的序列16-18所示的单链DNA分子组成；
引物组7由序列表的序列19-21所示的单链DNA分子组成；
引物组8由序列表的序列22-24所示的单链DNA分子组成；
引物组9由序列表的序列25-27所示的单链DNA分子组成；
引物组10由序列表的序列28-30所示的单链DNA分子组成；
引物组11由序列表的序列31-33所示的单链DNA分子组成；
引物组12由序列表的序列34-36所示的单链DNA分子组成；
引物组13由序列表的序列37-39所示的单链DNA分子组成；
引物组14由序列表的序列40-42所示的单链DNA分子组成；
引物组15由序列表的序列43-45所示的单链DNA分子组成；
引物组16由序列表的序列46-48所示的单链DNA分子组成；
引物组17由序列表的序列49-51所示的单链DNA分子组成；
引物组18由序列表的序列52-54所示的单链DNA分子组成；
引物组19由序列表的序列55-57所示的单链DNA分子组成；
引物组20由序列表的序列58-60所示的单链DNA分子组成；
引物组21由序列表的序列61-63所示的单链DNA分子组成；
引物组22由序列表的序列64-66所示的单链DNA分子组成；
引物组23由序列表的序列67-69所示的单链DNA分子组成；
引物组24由序列表的序列70-72所示的单链DNA分子组成；
引物组25由序列表的序列73-75所示的单链DNA分子组成；
引物组26由序列表的序列76-78所示的单链DNA分子组成；
引物组27由序列表的序列79-81所示的单链DNA分子组成；
引物组28由序列表的序列82-84所示的单链DNA分子组成；
引物组29由序列表的序列85-87所示的单链DNA分子组成；
引物组30由序列表的序列88-90所示的单链DNA分子组成；
引物组31由序列表的序列91-93所示的单链DNA分子组成；
引物组32由序列表的序列94-96所示的单链DNA分子组成；
引物组33由序列表的序列97-99所示的单链DNA分子组成；
引物组34由序列表的序列100-102所示的单链DNA分子组成；
引物组35由序列表的序列103-105所示的单链DNA分子组成；
引物组36由序列表的序列106-108所示的单链DNA分子组成；
引物组37由序列表的序列109-111所示的单链DNA分子组成；
引物组38由序列表的序列112-114所示的单链DNA分子组成；
引物组39由序列表的序列115-117所示的单链DNA分子组成；
引物组40由序列表的序列118-120所示的单链DNA分子组成；
引物组41由序列表的序列121-123所示的单链DNA分子组成；
引物组42由序列表的序列124-126所示的单链DNA分子组成；
引物组43由序列表的序列127-129所示的单链DNA分子组成；
引物组44由序列表的序列130-132所示的单链DNA分子组成；
引物组45由序列表的序列133-135所示的单链DNA分子组成；
引物组46由序列表的序列136-138所示的单链DNA分子组成；
引物组47由序列表的序列139-141所示的单链DNA分子组成；
引物组48由序列表的序列142-144所示的单链DNA分子组成。
2.引物组合物，由序列表的序列1至序列144所示的单链DNA分子组成。
3.含有权利要求2所述的引物组合物的试剂盒，所述试剂盒的用途为番茄品种鉴定。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
5.一种番茄品种鉴定方法，包括如下步骤：获得待测番茄在权利要求1中所述的48个SNP位点的基因型，即为待测番茄的指纹图谱；如果两个待测番茄的指纹图谱比对后，差异位点数≥2，则两个待测番茄为不同品种；如果差异位点数＝1，则两个待测番茄为近似品种；如果差异位点数＝0，则两个待测番茄为极近似或相同品种。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述获得待测番茄在权利要求1中所述的48个SNP位点的基因型是通过如下方法实现的：采用权利要求2所述的引物组合物对番茄的基因组DNA进行PCR扩增，得到基因型结果。
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