CN105821154A - 一种用于丝瓜杂交种子纯度鉴定的ssr引物及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于丝瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物及其方法，所述引物包括引物SGSSR4的上游引物SGSSR4‑F其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，和下游引物SGSSR4‑R其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述方法步骤如下：提取丝瓜亲本以及杂种后代基因组DNA；以丝瓜基因组DNA为模板，使用引物SGSSR4进行PCR扩增；对扩增产物进行凝胶电泳；对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种，计算种子纯度，其中，引物SGSSR4能产生151bp的父本特异性条带以及135bp的母本特异性条带。本发明引物能产生父本特异性标记和母本特异性标记，特异性强；方法利用上述SSR引物，能快速、便捷、准确、有效的鉴定丝瓜杂交种子纯度。

Description

一种用于丝瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物及其方法
【技术领域】
本发明属于农业的蔬菜育种与应用技术领域，具体涉及一种丝瓜杂交种子纯度的鉴定的SSR引物及鉴定丝瓜杂交种子纯度的方法。
【背景技术】
植物新品种特异性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和稳定性(Stability)的测试(简称DSU测试)是农业部植物新品种保护办公室对申请品种授予新品种权进行实质审查最重要的工作内容。种子纯度是种子质量检验的最主要的质量指标之一。因种子纯度问题给农户造成大幅减产的事件时有发生，严重影响了农业生产的增产增收和农村社会的稳定。传统的种子纯度鉴定方法是以播种后植株的田间形态观察为依据，其周期长、工作量大，且易受环境、季节因素影响，导致结果存在偏差。因此，开发快速、准确的种子纯度鉴定方法已成为种子科研单位和企业共同关注的课题。
近年来随着分子生物学的发展，各种分子标记技术在杂交种纯度的鉴定中得到了大量应用。DNA分子标记是DNA在分子水平上遗传变异的直接反映，它们遗传性稳定，信息量大，不受内外环境的影响，而且具有与基因表达与否无关、检测迅速和操作简便等突出优点，因此，DNA分子标记成为理想的快速鉴定种子纯度的检测方法之一，其中RAPD、RFLP、AFLP、SSR及ISSR标记等在杂交种纯度鉴定中都有应用。和其它类型DNA分子标记相比，SSR标记具有共显性、多态性高、实验程序简单等优点，是目前作物品种鉴定和种子纯度鉴定研究中最常用的标记之一。
丝瓜(Luffa cylindrical)原产东印度，主要分布于热带、亚热带的亚洲各地，在我国南北均有栽培，是我国主要的瓜类蔬菜。利用杂种优势，培育一代杂交丝瓜品种是目前丝瓜育种的主要方法。由于在丝瓜杂交制种过程中，人工去雄不彻底或漏去雄等原因，常会出现假杂交种，导致种子遗传纯度下降，给生产造成巨大的经济损失，同时，一些不法分子或种子经营单位为追求高额利润，以劣充好，假冒伪劣种子进入市场并用于生产，造成丝瓜减产和品质降低，进而影响优良品种的市场销售信誉及其产业化发展。因此，优良一代杂交种种子真实性和/或品种纯度的快速、准确(简便、经济)鉴定成为丝瓜生产中最为迫切解决的问题之一。随着分子生物学的迅速发展，使从DNA分子水平上对品种纯度进行基因鉴定和分析成为可能。采用分子标记技术进行种子纯度鉴定是一种快速、便捷、准确、有效的方法。迄今为止，尚未见到利用SSR分子标记技术鉴定丝瓜杂交种子纯度的报道。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题技术问题之一，在于提供一种用于丝瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，该引物能产生父本特异性标记和母本特异性标记，特异性强。
本发明是这样实现上述技术问题之一的：
一种用于丝瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，所述引物包括引物SGSSR4的上游引物SGSSR4-F和下游引物SGSSR4-R，所述上游引物SGSSR4-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物SGSSR4-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明要解决的技术问题技术问题之二，在于提供一种丝瓜杂交种子纯度的鉴定方法，该方法利用上述SSR引物，能快速、便捷、准确、有效的鉴定丝瓜杂交种子纯度。
一种丝瓜杂交种子纯度的鉴定方法，所述方法步骤如下：
步骤(1)提取丝瓜亲本以及杂种后代基因组DNA；
步骤(2)以丝瓜基因组DNA为模板，使用权利要求1中的引物SGSSR4进行PCR扩增；
步骤(3)对扩增产物进行凝胶电泳；
步骤(4)对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种，计算种子纯度，其中，引物SGSSR4能产生151bp的父本特异性条带以及135bp的母本特异性条带。
进一步地，PCR扩增的反应总体积为25μL，其中：基因组DNA 75ng，0.2mmol.L-1dNTP，1.25u Taq酶，0.16umol·L-1的引物，2.0mmol·L-1Mg2+，2.5μL 10×Buffer。
进一步地，所述步骤(2)中PCR扩增时扩增程序为：95℃预变性5min；然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30min；最后72℃延伸7min，置于4℃保存。
本发明具有如下优点：
(1)本发明中的SSR引物SGSSR4能产生父本特异性标记和母本特异性标记，特异性强；
(2)本发明的方法可将丝瓜杂交种子与其父母本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度；
(3)本发明的检测方法在5h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、准确、低成本、操作方便等优势，能够代替传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为本发明方法实施例1中筛选获得的1对SSR引物用于丝瓜杂交种及其双亲扩增产物的电泳分析图谱。其中，M：Marker；P1：父本；F1：杂交种；P2：母本。
图2为本发明方法实施例2中12株单株及其双亲扩增产物的电泳分析图谱。其中，M：Marker；P1：父本；P2：母本；10：假杂种；1-9,11-12：抽样丝瓜杂交种。
图3为本发明方法实施例3中14株单株及其双亲扩增产物的电泳分析图谱。其中，M：Marker；P1：父本；P2：母本；1-14：抽样丝瓜杂交种。
【具体实施方式】
请参阅图1～3所示，对本发明的实施例进行详细的说明。
实施例1杂交种丝瓜种子纯度检测方法的建立
1、筛选纯度鉴定的SSR引物
根据丝瓜转录组测序结果设计的引物若干对在亲本及子代间进行筛选，选出共显性差异标记条带的引物SGSSR4，该标记带型清晰、重复性好，序列如下所示：
SGSSR4-F:5’-AGGGGTTAGTCGACCGATTT-3’(SEQ ID NO.1)；
SGSSR4-R:5’-TGCTTGCCACTTGAAGAAAC-3’(SEQ ID NO.2)。
以丝瓜基因组DNA为模板，使用上述SSR引物SGSSR4进行PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳，电泳结果显示，SSR引物SGSSR4能产生151bp的父本特异性条带以及135bp的母本特异性条带。
2、利用上述特异性引物对杂交丝瓜种子进行纯度鉴定
2.1丝瓜基因组DNA的提取
(1)用酒精擦拭所选取的长势良好，形态完整的丝瓜幼嫩叶片，之后快速剪取2-3片嫩叶放入研钵中，加入1-2勺的PVP，在液氮的条件下迅速研磨成粉状，之后将粉末放入1.5mL的离心管中；
(2)向离心管中加入预热至65℃2％CTAB Buffer 600μL和7μLβ-琉基乙醇，充分混匀后，放入65℃水浴锅中1h，期间多次摇匀；
(3)从水浴锅中取出离心管冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇600μL，轻缓颠倒混匀静置10min，随后在12000rpm，4℃条件下离心10min；
(4)用移液枪取离心管中的上清液加入另一新的1.5mL离心管中，随后加入100μL 3mol/L NaAc和300μL的氯仿/异戊醇充分混匀，在4℃的条件下，离心10min；
(5)再次用移液枪吸取上清液至新的1.5mL离心管中，并加入0.6倍体积异丙醇，轻轻颠倒混匀至能看到白色絮状物，在12000rpm，4℃条件下离10min；
(6)用75％的乙醇洗涤DNA2-3次，随后放于超净工作台上。将风干后的DNA溶于100μL TE溶液，再加入2.5μL RNase A去除RNA，并存于37℃的水浴锅中20min-30min保存备用；
(7)吸取4μL DNA溶液与2μL溴酚蓝混合，在1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测DNA纯度，保存于4℃或-20℃备用。
2.2SSR-PCR扩增
PCR扩增时采用的反应体系为：基因组DNA 75ng，0.2mmol.L-1dNTP，1.25u Taq酶，0.16umol·L-1的SSR引物，2.0mmol·L-1Mg2+，2.5μL10×Buffer。ddH2O补足至25μL。
PCR扩增时扩增程序为：95℃预变性5min；然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30min；最后72℃延伸7min，置于4℃保存。
PCR扩增产物经电泳后观察拍照。
2.3EST-SSR结果分析
供试品种杂交种带型为母本1条与父本相异于母本的1条，这2条特征谱带的集合，也就是共显性的互补带型，见图1，其为本实施例1中筛选获得的1对SSR引物用于丝瓜杂交种及其双亲扩增产物的电泳分析图谱。其中，M：Marker；P1：父本；F1：杂交种；P2：母本。
实施例2
采用实施例1的方法对从东张基地的种子纯度鉴定田间取的12株丝瓜，对其单株编号，提取单株DNA进行检测，见图2，其为本实施例2中12株单株及其双亲扩增产物的电泳分析图谱，其中，M：Marker；P1：父本；P2：母本；10：假杂种；1-9,11-12：抽样丝瓜杂交种。检测结果：杂交种子11株，父本1株(即假杂种)，种子纯度为91.67％，与田间检测结果一致。
实施例3
采用实施例1的方法对从蔬菜中心基地的种子纯度鉴定田间取的14株丝瓜，对其单株编号，提取单株DNA进行检测，见图3，其为本实施例3中14株单株及其双亲扩增产物的电泳分析图谱。其中，M：Marker；P1：父本；P2：母本；1-14：抽样丝瓜杂交种。检测结果：全部为真实杂种，种子纯度为100％，与田间检测结果一致。
以上实施例表明，本发明的方法可将丝瓜杂交种子与其父母本种子进行有效区分，快速、准确检测出种子纯度。
总之，本发明的优点如下：本发明具有如下优点：
(1)本发明中的SSR引物SGSSR4能产生父本特异性标记和母本特异性标记，特异性强；
(2)本发明的方法可将丝瓜杂交种子与其父母本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度；
(3)本发明的检测方法在5h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、准确、低成本、操作方便等优势，能够代替传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (4)

1.一种用于丝瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，其特征在于：所述引物包括引物SGSSR4的上游引物SGSSR4-F和下游引物SGSSR4-R，所述上游引物SGSSR4-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物SGSSR4-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种丝瓜杂交种子纯度的鉴定方法，其特征在于：所述方法步骤如下：
步骤(1)提取丝瓜亲本以及杂种后代基因组DNA；
步骤(2)以丝瓜基因组DNA为模板，使用权利要求1中的引物SGSSR4进行PCR扩增；
步骤(3)对扩增产物进行凝胶电泳；
步骤(4)对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种，计算种子纯度，其中，引物SGSSR4能产生151bp的父本特异性条带以及135bp的母本特异性条带。
3.根据权利要求2所述的一种丝瓜杂交种子纯度的鉴定方法，其特征在于：PCR扩增的反应总体积为25μL，其中：基因组DNA 75ng，0.2mmol.L-1dNTP，1.25u Taq酶，0.16umol·L-1的引物，2.0mmol·L-1Mg2+，2.5μL10×Buffer。
4.根据权利要求2所述的一种丝瓜杂交种子纯度的鉴定方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR扩增时扩增程序为：95℃预变性5min；然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30min；最后72℃延伸7min，置于4℃保存。
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