CN108384879A - 一种用于西瓜杂交品种纯度鉴定的ssr引物及方法 - Google Patents

一种用于西瓜杂交品种纯度鉴定的ssr引物及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于西瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，所述引物包括引物CISSR09643的上游引物CISSR09643‑F和下游引物CISSR09643‑R，所述上游引物CISSR09643‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物CISSR09643‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开一种用于西瓜杂交种子纯度鉴定的方法，用于西瓜品种博琳、安德、天福二号、黄凤凰杂交种子纯度鉴定；通过本发明引物及方法，只需简单提取西瓜叶片基因组DNA，然后进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可有效的鉴定博琳、安德、天福二号、黄凤凰4个西瓜杂交种子的纯度，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，大大缩短鉴定时间，节省鉴定成本，提高鉴定准确度，具有较强的商业应用价值。

Description

一种用于西瓜杂交品种纯度鉴定的SSR引物及方法
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种用于西瓜杂交品种纯度鉴定的SSR引物及方法。
背景技术
西瓜为异花授粉植物，在我国各地广泛栽培种植。近年来，西瓜杂交品种在我国迅速普及推广，栽培面积逐年扩大，已成为增加农民收人和促进农村经济发展的重要作物之一。
利用杂种优势，培育一代杂交西瓜品种是目前西瓜育种的主要方法。在西瓜杂交制种过程中，由于人工去雄不及时、不彻底等原因，常会出现假杂交种，导致种子遗传纯度下降，给生产造成巨大的经济损失。西瓜杂交种种子在包装销售前必须通过纯度检测，这对保证种子质量和提高生产效益具有重要意义。当前西瓜纯度鉴定主要方法是传统的田间小区种植鉴定法，整个鉴定过程周期长、费时费工、占地面积较大，且易受环境影响导致鉴定结果不准确，不能满足当年生产需要。因此，优良一代杂交种纯度的快速、准确鉴定成为西瓜生产中最为迫切解决的问题之一。
随着测序技术的迅速发展， 使得从基因组水平上检测杂交种纯度成为可能。分子标记技术能够从DNA 水平上检测子代与亲本间的微小差异，不受时空限制，可以大大缩短检测时间。在真核生物基因组中，SSR 标记具有数量丰富、分布均匀、操作方便、共显性遗传、稳定性好等有优点，是进行杂交种纯度鉴定的理想标记类型。提取西瓜亲本及其杂交后代的基因组已经完成测序，有很多开发的SSR标记，分子标记技术的发展为高效、准确检测西瓜品种纯度提供技术支撑。
发明内容
本发明针对目前西瓜杂交种子纯度鉴定大多靠田间表型观察方法存在受季节限制大、鉴定所需时间长等缺陷，本发明的第一个目的在于提供一种用于西瓜杂交种子纯度鉴定的SSR 引物，该引物能够在对应父母本中产生特异性标记，特异性强；本发明的第二个目的在于提供一种西瓜杂交种子纯度的鉴定方法，用于鉴定于博琳、安德、天福二号、黄凤凰4种西瓜杂交种子纯度，该方法利用上述SSR 引物，能快速、准确、有效的鉴定4种西瓜杂交种子纯度；
本发明所采用的技术方案是：
一种用于西瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，所述引物包括引物CISSR09643的上游引物CISSR09643-F和下游引物CISSR09643-R，所述上游引物CISSR09643-F 的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，所述下游引物CISSR09643-R 的核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示。
上述引物的具体核苷酸序列如下：
上游引物CISSR09643-F：5'- TTGTTTGACGAGATTCACGC-3' (SEQ ID NO.1)
下游引物CISSR09643-R：5'- GGACCGGAAAGATGAGACAG -3' (SEQ ID NO.2)
一种用于西瓜杂交种子纯度鉴定的方法，包括以下步骤：
（1）提取西瓜亲本或其杂交后代的基因组DNA；
（2）利用权利要求1所述的引物CISSR09643对提取西瓜亲本或其杂交后代的基因组DNA进行PCR扩增；
（3）对步骤(2)的PCR扩增产物进行8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；
（4）对步骤(3)电泳检测结果进行分析，真正杂交种的标准图谱为同时具有两个亲本特异性序列的图谱，否则为假杂种，利用统计结果计算杂交种子纯度。
在上述各步骤中：
所述步骤(1) 中提取西瓜亲本或其杂交后代的基因组DNA采用改良的CTAB法提取：①取新鲜叶片30mg放入2ml的离心管中，加入一个直径4mm的钢珠，盖紧盖子，将其放入液氮中90s，然后利用组织研磨仪磨样；
② 在磨好的样中加入800µl 2%的CTAB提取液，55℃水浴20min；
③12000rpm离心1min，吸取600µl上清于干净的1.5ml的离心管中，加入300µl氯仿和异戊醇混合物，充分混匀；氯仿和异戊醇混合物中氯仿和异戊醇的体积比为24：1；
④13000rpm离心1min，取300µl上清于另一1.5ml的离心管中，加入550µl无水乙醇与乙酸铵，混匀，放-20℃冰箱1h；无水乙醇与乙酸铵提前在-20℃条件下预冷；
⑤12000rpm、离心10分钟，倒掉上清液，室温放置；⑥ 待离心管中无酒精味时，加入100µl ddH2O溶解DNA。
所述步骤(2) 中PCR 扩增时采用的反应体系为：提取西瓜亲本或其杂交后代的基因组DNA 1μL，2*Taq MasterMix (for PAGE) 7.5μL，正反引物各1μL，加入灭菌的超纯水至15μL；
所述步骤(2) 中PCR 扩增时扩增程序为：94℃预变性3min；然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s， 55℃退火30s，72℃延伸30s；最后延伸2min，置于4℃保存。
所述步骤(3)中电泳检测时，银染法染色，白光下拍照记录特征条带。
一种用于西瓜杂交种子纯度鉴定的方法，用于西瓜品种博琳、安德、天福二号、黄凤凰杂交种子纯度鉴定；
利用上述用于西瓜杂交种子纯度鉴定的方法鉴定博琳、安德、天福二号、黄凤凰杂交种子纯度的方法如下：
若西瓜品种博琳杂交种子中能扩增203bp的母本特异性序列(SEQ ID NO.3)以及227bp的父本特异性序列(SEQ ID NO.4)，则为真正杂交种，否则为假杂种；
若在西瓜品种安德杂交种子中能扩增201bp的母本特异性序列(SEQ ID NO.5)以及225bp的父本特异性序列(SEQ ID NO.6)，则为真正杂交种，否则为假杂种；
若在西瓜品种天福二号杂交种子中能扩增201bp的母本特异性序列(SEQ ID NO.7)以及225bp的父本特异性序列(SEQ ID NO.8)；则为真正杂交种，否则为假杂种；
若在西瓜品种黄凤凰杂交种子中能扩增201bp的母本特异性序列(SEQ ID NO.9)以及225bp的父本特异性序列(SEQ ID NO.10)；则为真正杂交种，否则为假杂种。
本发明的有益效果：
1、本发明中的SSR引物CISSR09643能扩增出母本特异性标记和父本特异性标记，且特异性强，遗传稳定。
2、用本发明的引物CISSR09643及方法，可将博琳、安德、天福二号、黄凤凰4个西瓜品种的杂交种子与其对应的父母本种子、其他混杂的种子区分开来，快速检测出西瓜杂交种子的纯度。
3、通过本发明引物及方法，只需简单提取西瓜叶片基因组DNA，然后进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可有效的鉴定博琳、安德、天福二号、黄凤凰4个西瓜杂交种子的纯度。
4、本发明的检测方法，在取样后5个小时内即可完成西瓜杂交种子纯度鉴定工作，避免了传统田间小区鉴定周期长、费时费工、占地面积大等的不足，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，大大缩短鉴定时间，节省鉴定成本，提高鉴定准确度，具有较强的商业应用价值。
附图说明
图1 表示利用SSR引物CISSR09643扩增的博琳亲本与F1群体的电泳图；其中M表示Marker，P1表示母本，P2表示父本，F1表示杂交种，1与2表示杂株。
图2表示利用SSR引物CISSR09643扩增的安德亲本与F1杂交种的电泳图谱，其中M表示Marker，P1表示母本，P2表示父本，F1表示杂交种，1、2、3表示杂株。
图3表示利用SSR引物CISSR09643扩增的天福二号亲本与F1杂交种的电泳图谱，其中M表示Marker，P1表示母本，P2表示父本，F1表示杂交种。
图4表示利用SSR引物CISSR09643扩增的黄凤凰亲本与F1杂交种的电泳图谱，其中M表示Marker，P1表示母本，P2表示父本，F1表示杂交种。
具体实施方式
（一）材料与方法
1. 植物材料
本研究使用西瓜杂交种博琳、安德、天福二号、黄凤凰及其对应的亲本为实验材料，其中博琳杂交种470粒，父母本各5粒；安德、天福二号、黄凤凰杂交种各94粒，父母本各1粒。
2. DNA的提取与检测
利用改良的CTAB法，从14天左右新鲜植物叶片中提取西瓜亲本或其杂交后代的基因组DNA。
① 取新鲜叶片30mg放入2ml的离心管中，加入一个直径4mm的钢珠，盖紧盖子，将其放入液氮中90s，然后利用组织研磨仪磨样；
② 在磨好的样中加入800µl 2%的CTAB提取液（CTAB提取液需提前预热），55℃水浴20min；
③12000rpm离心1min，吸取600µl ml上清于干净的1.5ml的离心管中，加入300µl氯仿：异戊醇（体积比为24：1），充分混匀；
④13000rpm离心1min，取300µl上清于另一1.5ml的离心管中，加入550µl无水乙醇与乙酸铵（提前-20℃预冷），混匀，放-20℃冰箱1h；
⑤12000rpm、离心10分钟，倒掉上清液，室温放置；
⑥待离心管中无酒精味时，加入100µl ddH2O溶解DNA。
琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测DNA的质量与浓度。
3. PCR扩增及检测
PCR扩增在中国华盛公司LY96G ThermocyclerTM扩增仪上进行，反应体系为15μL，包括7.5μL 2×Taq MasterMix，1μLDNA提取物，10μM的正反向引物各1μL，4.5μL ddH2O。 反应程序为94℃预变性3min，[94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s]，35个循环， 72℃延伸2min，然后反应保持在4℃。
在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离PCR扩增的片段，银染法染色，并在白光下显现。
4. 具有多态性的引物筛选及纯度鉴定
随机选取32对西瓜SSR标记，通过PCR扩增与电泳，利用亲本筛选具有多态性引物。
用筛选到的具有多态性的引物，进行西瓜杂交种的扩增、电泳，完成纯度鉴定。
（二）结果与分析
1. 所选材料的基因组DNA的检测分析
使用超微量紫外可见分光光度计（DeNovix DS-11）对本研究所提取的西瓜叶片基因组DNA进行浓度检测，发现提取的DNA浓度均高于100ng /μl，而且OD260/OD280基本都在1.8~2.0之间。取不同浓度DNA用 2%的琼脂糖电泳检测，电泳图清晰明亮，无明显拖尾，说明提取的DNA质量较好。所以，提取到的高质量西瓜叶片基因组DNA，适用于PCR扩增、SSR等分子标记的生物学试验。
2. PCR扩增与纯度鉴定
从西瓜32对SSR引物中，通过PCR扩增与电泳，利用亲本筛选出一对具有多态性强、重复性好的SSR引物CISSR09643。该引物对西瓜杂交种博琳、安德、天福二号、黄凤凰4个品种对应的亲本分别具有母本特异性标记和父本特异性标记。
其中，在西瓜品种博琳中能产生203bp的母本特异性序列(SEQ ID NO.3)以及227bp的父本特异性序列(SEQ ID NO.4)；
在西瓜品种安德中能产生201bp的母本特异性序列(SEQ ID NO.5)以及225bp的父本特异性序列(SEQ ID NO.6)；
在西瓜品种天福二号中能产生201bp的母本特异性序列(SEQ ID NO.7)以及225bp的父本特异性序列(SEQ ID NO.8)；
在西瓜品种黄凤凰中能产生201bp的母本特异性序列(SEQ ID NO.9)以及225bp的父本特异性序列(SEQ ID NO.10)。
上述SSR引物CISSR09643的具体核苷酸序列为：
正向引物序列(SEQ ID NO.1)：5'- TTGTTTGACGAGATTCACGC-3'
反向引物序列(SEQ ID NO.2)：5'- GGACCGGAAAGATGAGACAG-3'
利用SSR引物CISSR09643对博琳西瓜杂交种进行PCR扩增、电泳，完成纯度鉴定，结果见图1，从图1可以清晰的看出，在博琳母本中扩增出203bp的特异性条带，父本中扩增出227bp的特异性条带，博琳标准杂交种的电泳图谱为同时具有父母本特异性标记的图谱。被检测种子中有468个泳道图谱与博琳标准杂交种图谱一致，有2个泳道的图谱与博琳杂交种标准图谱不一致，说明这两株为杂株，计算得出西瓜杂交种纯度为99.6%。
利用SSR引物CISSR09643分别对安德、天福二号、黄凤凰西瓜杂交种进行PCR扩增、电泳，完成纯度鉴定，结果见图2~4，与上述同样的分析检测方法，鉴定出安德的纯度为96.8%，天福二号与黄凤凰纯度都达到了100%。
以上案例表明，用本发明的SSR引物CISSR09643及其方法，可以高效稳定的鉴定4个西瓜杂交品种博琳、安德、天福二号、黄凤凰的纯度。

Claims (4)

1.一种用于西瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，其特征在于：所述引物包括引物CISSR09643的上游引物CISSR09643-F和下游引物CISSR09643-R，所述上游引物CISSR09643-F 的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物CISSR09643-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种用于西瓜杂交种子纯度鉴定的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）提取西瓜亲本或其杂交后代的基因组DNA；
（2）利用权利要求1所述的引物CISSR09643对提取西瓜亲本或其杂交后代的基因组DNA进行PCR扩增；
（3）对步骤(2)的PCR扩增产物进行8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；
（4）对步骤(3)电泳检测结果进行分析，真正杂交种的标准图谱为同时具有两个亲本特异性序列的图谱，否则为假杂种，利用统计结果计算杂交种子纯度。
3.如权利要求2所述的一种用于西瓜杂交种子纯度鉴定的方法，其特征在于：
所述步骤(1) 中提取西瓜亲本或其杂交后代的基因组DNA采用改良的CTAB法提取：①取新鲜叶片30mg放入2ml的离心管中，加入一个直径4mm的钢珠，盖紧盖子，将其放入液氮中90s，然后利用组织研磨仪磨样；
② 在磨好的样中加入800µl 2%的CTAB提取液，55℃水浴20min；
③12000rpm离心1min，吸取600µl上清于干净的1.5ml的离心管中，加入300µl氯仿和异戊醇混合物，充分混匀；氯仿和异戊醇混合物中氯仿和异戊醇的体积比为24：1；
④ 13000rpm离心1min，取300µl上清于另一1.5ml的离心管中，加入550µl无水乙醇与乙酸铵，混匀，放-20℃冰箱1h；无水乙醇与乙酸铵提前在-20℃条件下预冷；
⑤ 12000rpm、离心10分钟，倒掉上清液，室温放置；
⑥ 待离心管中无酒精味时，加入100µl ddH2O溶解DNA；
所述步骤(2) 中PCR 扩增时采用的反应体系为：提取西瓜亲本或其杂交后代的基因组DNA 1μL，2*Taq MasterMix 7.5μL，正反引物各1μL，加入灭菌的超纯水至15μL；
所述步骤(2) 中PCR 扩增时扩增程序为：94℃预变性3min；然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s， 55℃退火30s，72℃延伸30s；最后延伸2min，置于4℃保存；
所述步骤(3)中电泳检测时，银染法染色，白光下拍照记录特征条带。
4.根据权利要求2或3所述的一种用于西瓜杂交种子纯度鉴定的方法，其特征在于：用于西瓜品种博琳、安德、天福二号、黄凤凰杂交种子纯度鉴定；
利用权利要求2或3所述的用于西瓜杂交种子纯度鉴定的方法鉴定博琳、安德、天福二号、黄凤凰杂交种子纯度的方法如下：
若西瓜品种博琳杂交种子中能扩增203bp的母本特异性序列如SEQ ID NO.3 所示、以及227bp的父本特异性序列如SEQ ID NO.4所示，则为真正杂交种，否则为假杂种；
若在西瓜品种安德杂交种子中能扩增201bp的母本特异性序列如SEQ ID NO.5所示、以及225bp的父本特异性序列如SEQ ID NO.6所示，则为真正杂交种，否则为假杂种；
若在西瓜品种天福二号杂交种子中能扩增201bp的母本特异性序列如SEQ ID NO.7所示、以及225bp的父本特异性序列如SEQ ID NO.8所示，则为真正杂交种，否则为假杂种；
若在西瓜品种黄凤凰杂交种子中能扩增201bp的母本特异性序列如SEQ ID NO.9所示、以及225bp的父本特异性序列如SEQ ID NO.10所示，则为真正杂交种，否则为假杂种。
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