CN104711361A - 快速鉴定西瓜新品种红和平杂交种子纯度的方法以及采用的引物和试剂盒 - Google Patents

快速鉴定西瓜新品种红和平杂交种子纯度的方法以及采用的引物和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及快速检测西瓜‘红和平’杂交种子纯度的方法以及采用的引物和试剂盒。西瓜‘红和平’种子纯度的鉴定方法，该方法包括以下步骤：一、根据已公布的西瓜基因组序列进行SSR引物开发；二、取单粒西瓜种仁进行基因组DNA的提取；三、用开发的SSR引物在亲本及杂交一代中进行PCR扩增及电泳，获得存在差异的引物及在凝胶上的相对位置，制作为‘红和平’品种标准图谱；四、待测样品种子纯度鉴定。相比于传统田间鉴定(需要80～100天)，该方法仅需1～2天，且具有不依赖季节、快速、准确、低成本等优点，能够替代传统西瓜杂交种鉴定方法。本发明可在‘红和平’的制种、繁种、经销企业推广应用。

Description

快速鉴定西瓜新品种红和平杂交种子纯度的方法以及采用的引物和试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及快速检测西瓜新品种‘红和平’杂交种子纯度的方法以及采用的引物和试剂盒。
背景技术
西瓜新品种【Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.&Nakai】是一种重要的经济作物。我国每年西瓜新品种种植面积约为1.73×106hm2，总产量约为6.28×107t，面积和产量分别占世界的54％和60％以上，均居世界第一位。因此，西瓜新品种种子纯度对种植者来说是必需保证的。
西瓜新品种杂交种制种的过程中，母本和父本分别种植在不同的区域，雌花开花前，把母本上所有的雄花都去除。开花期用父本的花粉授到母本的雌花柱头上，从而产生杂交种。如果母本上的雄花去除不彻底，花粉就可能落到雌花柱头上产生自交种，出现杂种。因此，杂交种必需进行种子纯度鉴定。
传统的西瓜新品种种子纯度鉴定主要是通过将杂交种种植后对其进行形态学鉴定。西瓜新品种的全生育期需要80～100天，漫长的生长周期易受环境影响。某些易受环境影响的性状就会难以判定，所以需要对其品种特性极其了解的专业育种者。这些都使得鉴定过程受到了极大的限定。为了解决传统鉴定困难的问题，农业工作者进行了研究，其中黄永红等采用同工酶的方法检测西甜瓜种子纯度，张国良采用叶形进行鉴定。但前者仍需要15-20天的时间，后者不能鉴别叶形相同的亲本且对种植环境要求苛刻。
随着分子标记的快速发展，将分子标记应用到其中将加速种子纯度的鉴定过程，而且鉴定过程不需要特定的育种家。分子标记对种子纯度的鉴定主要是依据父母本及杂交一代中的遗传信息存在多样性，因此鉴定过程包括分子标记所需引物的开发，DNA的提取，筛选等等。西瓜新品种基因组测序的完成，为采用分子标记进行种子纯度鉴定提供了可能。发明基于SSR分子标记技术的种子纯度检测方法，将对规范西瓜新品种种子产业，保护育种者的合法权益及种植户的切身利益等都有重要的意义。
发明内容
本发明针对目前西瓜新品种种子纯度鉴定大多靠田间表型观察的方法、存在受季节限制大，鉴定所需时间长等缺陷，本发明的第一个目的是提供了一种不依赖季节、快速、准确、低成本检测西瓜新品种“红和平”种子纯度的方法。本发明的第二个目的是提供了上述方法采用的引物。本发明的第三个目的是提供了上述方法采用的试剂盒。
为了实现上述第一个目的，本发明采用的技术方案如下：
西瓜新品种‘红和平’种子纯度的鉴定方法，该方法包括以下步骤：
1)西瓜新品种基因组SSR引物的开发：根据公布的西瓜新品种基因组序列进行全序列的下载，使用Mreps 2.5SSR序列鉴定程序，鉴定DNA序列上含SSR的序列区段，设计出跨越SSR位点的PCR引物；
2)单粒西瓜新品种种仁基因组DNA提取：采用SDS法提取西瓜新品种种仁基因组DNA；对提取的DNA样品进行评估；
3)PCR反应体系及程序：在200μl PCR管中加入基因组DNA50ng、10pmol/μl引物各1μl，该引物由上游引物和下游引物，所述的上游引物的序列为5＇-CCAAGAAACGAGAAATTCGC-3＇和下游引物5＇-GCAAGCTCCTCCATAAACCC-3＇，12.5μl混合液，混合液包括10×Buffer、dNTP、Mg2+、TaqDNA聚合酶，灭菌双蒸水补充到25μl，同时设置空白对照实验，空白对照实验以无菌水代替基因组DNA；混匀后置于PCR反应仪上进行扩增，PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共40个循环；最后72℃延伸7min；4℃保存；
4)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，在扩增产物中加入上样缓冲液，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯酰胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚蓝刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后再可见光下观察、照相；将PHF/PHR引物的亲本和F1电泳图绘制成标准图谱；
5)待测样品种子纯度鉴定利用PHF/PHR引物，将待测样品种子按上述步骤制备出指纹图谱后，再分别与‘红和平’品种标准图谱进行比对；如果相同，即可确定为‘红和平’杂交种，否则为杂种；种子纯度按以下公式计算：
种子纯度＝(检测所得真种子数/检测种子总数)×100％。
作为优选，所述的步骤2)提取西瓜新品种种仁基因组DNA的方法如下：在1.5ml离心管中加入200μl SDS的提取缓冲液；取1粒种子，去除种壳后放入上述缓冲液，研磨呈糊状，用600μl SDS提取缓冲液冲洗玻璃棒；颠倒混匀后65℃水浴15min，短暂离心；加入500μl氯仿∶异戊醇＝24：1混合液，翻转混匀，12,000rpm离心5min，将上清转入一新的1.5ml的离心管中；加入500μl氯仿，翻转混匀，12,000rpm离心5min，将上清转入一新的1.5ml的离心管中；加入2.5倍体积的无水乙醇，缓慢翻转，静置5min，10,000rpm，室温离心5min，弃上清；于沉淀中加入1ml 70％的乙醇洗涤，12,000rpm离心2min。倒掉上清液，通风干燥；加入25μl含有1μl 10mg/ml RNase A的TE缓冲液溶解，37℃温育30min，-20℃保存。
作为优选，所述的步骤2)根据西瓜新品种action基因设计引物，W-actinF:5'>AATGTGCCTGCTATGTATGTCG<3'；W-actinR:5'>GATGGAGTTGTAGGTAGTTTCG<3'；对提取的DNA样品进行评估。
为了实现上述第二个目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于检测西瓜新品种‘红和平’杂交种纯度的引物，该引物由上游引物和下游引物，所述的上游引物的序列为5＇-CCAAGAAACGAGAAATTCGC-3＇和下游引物5＇ -GCAAGCTCCTCCATAAACCC-3＇。
为了实现上述第三个目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于检测西瓜新品种品种“红和平”种子纯度的试剂盒，该试剂盒包括盒体和7支PCR管及标准图谱照片；其中，在5支PCR管中分别装有MgCl2，dNTP，10×Buffer，Taq聚合酶及loading buffer，在另外2支PCR管中分别装有鉴定“红和平”西瓜新品种种子纯度的引物：上游引物的序列为5＇-CCAAGAAACGAGAAATTCGC-3＇和下游引物5＇-GCAAGCTCCTCCATAAACCC-3＇。
本发明由于采用了上述的技术方案，本发明的优势：
1、快速高效，该方法检测过程仅需要1-2天，且不受环境的限制；
2、准确性高：基因组DNA不受环境的影响，避免了田间表型鉴定因为环境影响带来的误差；
3、操作简单：本方法所需的设备和试剂都是常规实验室拥有的，简便易行；
4、成本低廉：该方法避免了种植西瓜新品种所需的各种设备及管理，节省了大量的人工、土地和物力。
本发明相比于传统田间鉴定(需要80～100天)，该方法仅需1～2天，且具有不依赖季节、快速、准确、低成本等优点，能够替代传统西瓜新品种杂交种鉴定方法。本发明可在‘红和平’的制种、繁种、经销企业推广应用。
附图说明
图1为提取的西瓜新品种种仁基因组DNA 1％琼脂糖凝胶电泳和EB染色示意图；M：marker1：水2-5：种仁DNA。
图2为利用引物W-actinF:5'>AATGTGCCTGCTATGTATGTCG<3'；W-actinR:5'>GATGGAGTTGTAGGTAGTTTCG<3'；对提取的基因组DNA进行检测的电泳图；1：marker 1-5：种子6：水。
图3为利用引物PHF：5＇-CCAAGAAACGAGAAATTCGC-3＇和下游引物5＇-GCAAGCTCCTCCATAAACCC-3＇；获得的凝胶图谱；M：marker；P1：母本；P2：父本；1-5：杂交F1代。
图4为待测样品种子制备出指纹图谱。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步的说明。
材料说明：“红和平”(浙审瓜2013003)系浙江省农科院蔬菜所选育的设施西瓜新品种。全生育期100d左右，果实发育期30d。果实圆球形，果面绿，覆深绿齿条带，有蜡粉；果肉大红色，中心可溶性固形物含量11％～12％，肉质致密，口感好；单瓜质量4～5kg，果 皮韧，耐贮运；易坐瓜，耐低温，中抗枯萎病，产量42t·hm-2左右，商品率高。
实施例1 用于西瓜新品种‘红和平’种子纯度鉴定开发的SSR引物：
首先，根据公布的西瓜新品种基因组序列(www.icugi.org/)进行全序列的下载。随后，使用Mreps 2.5SSR序列鉴定程序，鉴定DNA序列上含SSR的序列区段。设计出跨越SSR位点的PCR引物200对，交予南京金斯瑞公司合成。西瓜新品种actin基因(Cla008455)如SEQ ID NO:1所示。
实施例2 西瓜新品种种仁基因组DNA的提取
本发明步骤如下：
(1)取1.5ml离心管，加入200μl新鲜配制SDS的提取缓冲液(0.5M NaCl，0.1M Tris.HCl，0.05M Na.EDTA，12％SDS)；
(2)取1粒种子，用镊子去除种壳后，将种仁放到上述离心管中，玻璃棒研磨至糊状，再用600μl提取缓冲液冲洗玻璃棒；
(3)颠倒混匀后65℃水浴15min，期间每隔5min混匀一次，水浴结束后短暂离心；
(4)加入500μl氯仿∶异戊醇(24：1)混合液，翻转混匀，12,000rpm离心5min，转移600μl上清转入一新的1.5ml的离心管中；
(5)加入500μl氯仿，翻转混匀，12,000rpm离心5min，转移400μl转入一新的1.5ml的离心管中；
(6)加入1000μl的-20℃预冷的无水乙醇，缓慢翻转50次混匀，静置5min，10,000rpm，离心5min(室温)，弃上清；
(7)于沉淀中加入1ml 70％的乙醇洗涤，12,000rpm离心2min。倒掉上清液，通风干燥；
(8)加入25μl含有1μl RNase A(10mg/ml)的TE缓冲液溶解，37℃温育30min。
(9)取1.5μl在1％琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，结果表明，本方法得到的DNA比较清晰，且无拖尾现象，样品间重复性好。
实施例3 ‘红和平’西瓜新品种基因组DNA的PCR检测
以西瓜新品种内源基因ACTIN为模板设计引物，引物序列为：W-actinF:5'>AATGTGCCTGCTATGTATGTCG<3'；W-actinR:5'>GATGGAGTTGTAGGTAGTTTCG<3'；PCR反应体系总体积25μl，于200μl离心管中加入基因组DNA(实施例1中制备)50ng、10pmol/μl引物各1μl，12.5μl Mix(10×Buffer，dNTP，Mg2+，TaqDNA聚合酶)，灭菌双蒸水补充到25μl，同时设置空白对照实验(以无菌水代替基因组DNA)。混匀后置于PCR反应仪上进行扩增。PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共40个循环；最后72℃延伸7min；4℃保存。取8μl扩增产物加入2μl上样缓冲液(Takara公司) 于1％琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，用凝胶成像系统成像记录。
结果：如图2所示，5个样品均实现有效扩增，扩增产物片段条带清晰，长度约500bp，与设计引物的特异性片段长度相符，说明核酸抽提液为西瓜新品种基因组DNA，能满足后续PCR实验的需要。
实施例4 利用上游引物：5＇-CCAAGAAACGAGAAATTCGC-3＇和下游引物：5＇-GCAAGCTCCTCCATAAACCC-3＇制备西瓜新品种“红和平”种子纯度标准图谱
(1)DNA的提取：取5粒“红和平”F1、1粒父本、1粒母本，去除种皮后，利用SDS法分别提取基因组DNA；
(2)PCR反应体系及扩增程序与实施例3中相同，扩增结束后在扩增产物中加入5μl上样缓冲液，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯酰胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚蓝刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后再可见光下观察、照相(图3)；该图即为‘红和平’标准图谱。
实施例5 待测样品种子纯度鉴定
利用PHF/PHR引物，将待测样品种子按上述步骤4同样的工艺分别制备出指纹图谱后，再分别与‘红和平’品种标准图谱进行比对。如果相同，即可确定为‘红和平’杂交种，否则为杂种。如图4所示，其中28号样品与标准图谱不同，故为杂种，其余的为‘红和平’杂交种。
序列表

Claims (5)

1.一种用于检测西瓜新品种‘红和平’杂交种纯度的引物，其特征在于：该引物由上游引物和下游引物，所述的上游引物的序列为5＇-CCAAGAAACGAGAAATTCGC-3＇和下游引物5＇-GCAAGCTCCTCCATAAACCC-3＇。
2.一种用于检测西瓜新品种品种“红和平”种子纯度的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括盒体和7支PCR管及标准图谱照片；其中，在5支PCR管中分别装有MgCl2，dNTP，10×Buffer，Taq聚合酶及loading buffer，在另外2支PCR管中分别装有鉴定“红和平”西瓜新品种种子纯度的引物：上游引物的序列为5＇-CCAAGAAACGAGAAATTCGC-3＇和下游引物5＇-GCAAGCTCCTCCATAAACCC-3＇。
3.西瓜新品种‘红和平’种子纯度的鉴定方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
1)西瓜新品种基因组SSR引物的开发：根据公布的西瓜新品种基因组序列进行全序列的下载，使用Mreps 2.5SSR序列鉴定程序，鉴定DNA序列上含SSR的序列区段，设计出跨越SSR位点的PCR引物；
2)单粒西瓜新品种种仁基因组DNA提取：采用SDS法提取西瓜新品种种仁基因组DNA；对提取的DNA样品进行评估；
3)PCR反应体系及程序：在200μl PCR管中加入基因组DNA50ng、10pmol/μl引物各1μl，引物采用权利要求1所述的引物，12.5μl混合液，混合液包括10×Buffer、dNTP、Mg2+、TaqDNA聚合酶，灭菌双蒸水补充到25μl，同时设置空白对照实验，空白对照实验以无菌水代替基因组DNA；混匀后置于PCR反应仪上进行扩增，PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共40个循环；最后72℃延伸7min；4℃保存；
4)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，在扩增产物中加入上样缓冲液，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯酰胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚蓝刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后再可见光下观察、照相；将PHF/PHR引物的亲本和F1电泳图绘制成标准图谱；
5)待测样品种子纯度鉴定利用PHF/PHR引物，将待测样品种子按上述步骤制备出指纹图谱后，再分别与‘红和平’品种标准图谱进行比对；如果相同，即可确定为‘红和平’杂交种，否则为杂种；种子纯度按以下公式计算：
种子纯度＝(检测所得真种子数/检测种子总数)×100％。
4.根据权利要求3所述的西瓜新品种‘红和平’种子纯度的鉴定方法，其特征在于步骤2)提取西瓜新品种种仁基因组DNA的方法如下：在1.5ml离心管中加入200μl SDS的提取缓冲液；取1粒种子，去除种壳后放入上述缓冲液，研磨呈糊状，用600μl SDS提取缓冲液冲洗玻璃棒；颠倒混匀后65℃水浴15min，短暂离心；加入500μl氯仿∶异戊醇＝24：1混合液，翻转混匀，12,000rpm离心5min，将上清转入一新的1.5ml的离心管中；加入500μl氯仿，翻转混匀，12,000rpm离心5min，将上清转入一新的1.5ml的离心管中；加入2.5倍体积的无水乙醇，缓慢翻转，静置5min，10,000rpm，室温离心5min，弃上清；于沉淀中加入1ml 70％的乙醇洗涤，12,000rpm离心2min。倒掉上清液，通风干燥；加入25μl含有1μl 10mg/ml RNase A的TE缓冲液溶解，37℃温育30min，-20℃保存。
5.根据权利要求3所述的西瓜新品种‘红和平’种子纯度的鉴定方法，其特征在于步骤2)根据西瓜新品种action基因设计引物，W-actinF:5'>AATGTGCCTGCTATGTATGTCG<3'；W-actinR:5'>GATGGAGTTGTAGGTAGTTTCG<3'；对提取的DNA样品进行评估。
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