CN107326083A - 一种检测西瓜“京美”杂交种子纯度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定西瓜“京美”杂交种子纯度的方法。该方法包括：以待测样本基因组DNA为模板，采用引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增；将扩增产物进行凝胶电泳，根据电泳谱图上是否同时具有221bp和229bp目的条带来确定待测样本是否为真正的“京美”杂交种；进而计算待测西瓜种子中“京美”杂交种的纯度。本发明方法可将“京美”杂交种子与其母本、父本种子区分开，能快速、准确鉴定“京美”杂交种子纯度，具有高效、操作简单等优点，能够替代传统的田间纯度鉴定方法，且具有较高的商业应用价值，将对规范西瓜种子产业，保护育种者的合法权益及种植户的切身利益等具有重要的意义。

Description

一种检测西瓜“京美”杂交种子纯度的方法

技术领域

本发明属于蔬菜育种与应用技术领域，涉及一种检测西瓜“京美”杂交种子纯度的方法。

背景技术

西瓜是农民就业增收的高效园艺作物，西瓜种子纯度是种子质量的核心指标。在生产中，若种子纯度不高，会显著降低西瓜的产量和品质，直接导致瓜农蒙受巨大的经济损失。

西瓜是雌雄异花同株植物，杂交种制种时，母本和父本分别种植在不同的区域，雌花开花前，需要去除母本上所有的雄花。开花期，将父本的花粉授到母本雌花柱头上，从而产生杂交种。如果母本上的雄花去除不彻底，花粉就可能落到其自身的雌花柱头上产生自交种，出现假杂种。因此，西瓜杂交种必需进行种子纯度鉴定。但传统的西瓜种子纯度鉴定方法是以田间形态观察为依据，其周期超过90天、工作量大，且易受环境、季节因素影响，导致结果存在偏差。为了解决传统鉴定困难的问题，众多学者进行了研究，黄永红等采用同工酶的方法检测西甜瓜种子纯度，张国良采用叶形进行鉴定。但前者仍需要15-20天的时间，后者不能鉴别叶形相同的亲本且对种植环境要求苛刻。因此，开发快速、准确的种子纯度鉴定方法已成为种子科研单位和企业共同关注的课题。

SSR分子标记是近年来发展迅速的一种DNA分子遗传标记技术，具有共显性遗传、重复性好、稳定性高、成本低和易操作的优点，因此在作物种子纯度鉴定的工作中逐渐得到了应用。随着西瓜全基因组测序计划的完成和基因分型技术的完善，大量西瓜SSR标记被开发。

“京美”西瓜是以KWS为母本、TWF为父本育成的甜王类型西瓜一代杂种，具有甜度高、产量高、瓤色红等特点，是目前推广潜力很大的品种。为了保证优良品种产生最大的经济效益，发明一种快速、准确、有效的品种纯度鉴定方法非常重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测西瓜“京美”杂交种子纯度的方法。

本发明所提供的检测西瓜“京美”杂交种纯度的方法，可包括如下步骤：

(A1)从待测西瓜种子中随机选取若干样本，提取基因组DNA；以各样本的基因组DNA分别作为模板，采用由序列表中序列1和序列2所示两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，得到各样本的扩增产物。

(A2)将步骤(A1)所得各样本的扩增产物分别进行凝胶电泳，根据电泳谱图按照如下确定各样本是否为真正的“京美”杂交种：若所述样本的电泳图谱上同时具有大小分别为221bp和229bp的两个目的条带，则视所述样本为真正的“京美”杂交种；若所述样本的电泳图谱上不同时具有大小分别为221bp和229bp的两个目的条带，则视所述样本为假的“京美”杂交种。

(A3)根据步骤(A2)的统计结果计算所述待测西瓜种子中“京美”杂交种的纯度。

待测西瓜种子中“京美”杂交种子纯度(％)＝(供检样本数－假的“京美”杂交种子数)/供检样本数×100％。或者

待测西瓜种子中“京美”杂交种子纯度(％)＝真正的“京美”杂交种子数/供检样本数×100％。

其中，大小为221bp的目的条带为京美母本的特征谱带；大小为229bp的目的条带为京美父本的特征谱带。

基于以上，本发明还提供了一种鉴定待测西瓜种子是否为“京美”杂交种的方法。

本发明所提供的鉴定待测西瓜种子是否为“京美”杂交种的方法，可包括如下步骤：

(B1)从待测西瓜种子中提取基因组DNA，作为模板，采用由序列表中序列1和序列2所示两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物。

(B2)将步骤(B1)所得扩增产物进行凝胶电泳，根据电泳谱图按照如下确定所述待测西瓜种子是否为“京美”杂交种：若所述待测西瓜种子的电泳图谱上同时具有大小分别为221bp和229bp的两个目的条带，则所述待测西瓜种子为或候选为“京美”杂交种；若所述待测西瓜种子的电泳图谱上不同时具有大小分别为221bp和229bp的两个目的条带，则所述待测西瓜种子不为或候选不为“京美”杂交种。

其中，大小为221bp的目的条带为京美母本的特征谱带；大小为229bp的目的条带为京美父本的特征谱带。

在上述两种方法中，所述待测西瓜种子可为任意西瓜种子，进一步具体为西瓜“京美”和/或其母本和/或其父本的种子。

在上述两种方法中，所述凝胶电泳具体为聚丙烯酰胺凝胶电泳；如非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；更加具体如8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

在本发明中，所述8％非变性聚丙烯酰胺溶液具体由20ml ddH₂O、4ml 10×TBE、16ml 20％(质量百分比)Acr-Bis、40μl TEMED、400μl 10％(质量百分比)AP配制而成。

在上述两种方法中，将所述扩增产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，220V稳压电泳直至溴酚蓝指示剂迁移至可以使扩增DNA片段能够被清楚识别的距离时，停止电泳；银染法染色，拍照记录特征谱带。

在上述两种方法中，从种子中提取基因组DNA具体为从种子所发幼芽中提取基因组DNA。更加具体的，为：将待测样品种子35℃发芽3-4天，取1cm左右的幼芽，分别装入2ml离心管，加入0.1M的NaOH溶液100μl，用组织捣碎仪打碎样品，沸水水浴1min左右，加入pH 8.0的Tris-HCl缓冲液1ml，充分混匀，得待测样品基因组DNA，4℃下保存备用。

在上述两种方法中，进行PCR扩增采用的反应体系如下：基因组DNA 20ng、含Mg²⁺的10×buffer 1.25μl，dNTP 0.2mmol·L^-1 1μl，上下游引物0.25mmol·L^-1各1μl，Taq酶5U·μL^-1 0.2μl，ddH₂O补足至12.5μl。

在上述两种方法中，进行PCR扩增采用的退火温度为55℃。更加具体的，进行PCR扩增采用的扩增程序如下：94℃下预变性5min；94℃下变性30sec、55℃退火30sec、72℃下延伸30sec，35个循环反应；72℃延伸5min；16℃永久保存。

由序列表中序列1和序列2所示两条单链DNA组成的引物对在如下(C1)或(C2)中的应用也属于本发明的保护范围：

(C1)检测西瓜“京美”杂交种纯度；

(C2)制备用于检测西瓜“京美”杂交种纯度的试剂盒。

由序列表中序列1和序列2所示两条单链DNA组成的引物对在如下(D1)或(D2)中的应用也属于本发明的保护范围：

(D1)鉴定待测西瓜种子是否为“京美”杂交种；

(D2)制备用于鉴定待测西瓜种子是否为“京美”杂交种的试剂盒。

本发明的有益效果是：利用本发明的引物对(序列1和序列2)，可将“京美”杂交种子与其母本、父本种子区分开，能快速、准确鉴定“京美”杂交种子纯度。具有高效、操作简单等优点。能够替代传统的田间纯度鉴定方法，且具有较高的商业应用价值。将对规范西瓜种子产业，保护育种者的合法权益及种植户的切身利益等具有重要的意义。

附图说明

图1为利用本发明SSR引物扩增的“京美”及其父母本的特证谱带。其中，♀表示京美母本；♂表示京美父本；F1表示“京美”。

图2为利用本发明引物对“京美”商品种子的检测结果。其中，♀表示京美母本；♂表示京美父本；其余为“京美”(14为假“京美”)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、鉴定西瓜“京美”杂交种纯度

一、筛选用于鉴定西瓜“京美”杂交种纯度的SSR引物

以西瓜“京美”母本、父本、F₁的基因组DNA作为模板，筛选SSR引物，获得条带清晰、差异大、重复性好、共显性的1组引物，其序列为；

上游引物：5’-AAAATTACATCTTAAATGCGCC-3’(序列1)；

下游引物：5’-GGAACATTGACTTCAATCAGCA-3’(序列2)。

二、利用上述SSR引物对西瓜“京美”杂交种纯度进行鉴定

1、样品DNA的快速提取：将供试“京美”商品种子(杂交种子)样品96粒，35℃发芽3-4天，取0.5-1cm左右的幼芽，分别装入2ml离心管，加入0.1M的NaOH溶液100μl，用组织捣碎仪打碎样品，沸水水浴1min左右，加入pH 8.0的Tris-HCl缓冲液1ml，充分混匀，得待测样品基因组DNA，4℃下保存备用。

2、PCR扩增

①反应体系

12.5μl反应体系如下：基因组DNA 20ng、含Mg²⁺的10×buffer 1.25μl，dNTP0.2mmol·L^-1 1μl，上下游引物0.25mmol·L^-1各1μl，Taq酶5U·μL^-1 0.2μl，ddH₂O补足至12.5μl。

②反应条件

94℃下预变性5min；94℃下变性30sec、55℃退火30sec、72℃下延伸30sec，35个循环反应；72℃延伸5min；16℃永久保存。

3、聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳

扩增产物在8％聚丙烯酰胺非变性凝胶(由20ml ddH₂O、4ml 10×TBE、16ml 20％Acr-Bis、40μl TEMED、400μl 10％AP配制而成。％均表示质量百分比)电泳分离，120V稳压1.5小时，电泳结束后，0.1％AgNO₃银染6min；然后用2％NaOH、0.4％甲醛显色，直至条带清晰即可。

4、拍照记录样品DNA的特征谱带。

5、扩增结果分析：引物(序列1和序列2)能在“京美”父本、母本扩增出特异标记，产生221bp的母本特异标记和229bp的父本特异标记；杂交一代种子则同时扩增出两条特异标记(即“京美”能同时扩增出大小分别为221bp和229bp的两个目的条带)，如图1所示。96粒供试“京美”商品种子中，有1粒带型与母本带型一致(即仅扩增出大小为221bp的目的条带，未扩增出大小为229bp的目的条带)，为假杂种，如图2所示。说明引物(序列1和序列2)能准确鉴别“京美”杂交种子的纯度。

6、纯度鉴定结果分析：通过计算供试“京美”商品种子样品中杂交种的比例，确定供试“京美”商品西瓜种子纯度为98.96％。与田间调查结果一致(见步骤三)。

供试“京美”商品种子纯度％＝(96-1)/96×100％＝98.96％。

三、采用常规的田间种植进行供试“京美”商品种子纯度鉴定

1、浸种催芽

(1)时间：2017年2月20日

(2)方法：随机选取“京美”商品种子120粒进行浸种催芽，温度50～55℃，搅拌至室温浸泡4h，沥干水分用湿毛巾包裹置于35℃的恒温箱中进行催芽，48h后80％以上种子露白后即可播种。

2、播种

(1)时间：2017年2月23日

(2)方法：将100粒发芽种子，分别播种于育苗钵中，覆土，浇透水，一般2～3d即可出苗。

3、定植

(1)时间：2017年3月20日

(2)方法：三叶1心时，将幼苗从育苗钵中取出，栽到大棚中，定植时勿散坨，确保与土壤密切接触，定植后浇大水，不放风，以较高温度管理，促进缓苗。

4、田间管理

(1)时间：2017年3月30日-2017年5月20日

(2)方法：地爬栽培，三蔓整枝。伸蔓期前后以促秧为主。定植水要充足，浇团棵水时如缺肥可每亩追施复合肥10kg左右。在伸蔓期可适当灌水，以确保授粉期不缺水，但切勿浇水过大。授粉后7-10天，果实长到拳头大小时，及时浇膨果水，水分要充足，但不宜过量。瓜长到碗口大小时，再次浇水施肥。

5、鉴定结果

(1)时间：2017年5月20日

(2)方法：待果实长成后，表现为品种特性时进行统计，与该品种果实性状表现不一致者视为杂株。纯度％＝(总株数-杂株数)/总株数×100％

(3)结果：经田间观测调查，100株西瓜中，有1株所结果实为圆型，与该品种果实特点(短椭型)不一致，视为杂株，因此，“京美”纯度计算如下：

纯度％＝(100-1)/100×100％＝99.0％。

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种检测西瓜“京美”杂交种子纯度的方法

<130> GNCLN171417

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

aaaattacat cttaaatgcg cc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

ggaacattga cttcaatcag ca 22

Claims (7)

1.一种检测西瓜“京美”杂交种纯度的方法，包括如下步骤：

(A1)从待测西瓜种子中随机选取若干样本，提取基因组DNA；以各样本的基因组DNA分别作为模板，采用由序列表中序列1和序列2所示两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，得到各样本的扩增产物；

(A2)将步骤(A1)所得各样本的扩增产物分别进行凝胶电泳，根据电泳谱图按照如下确定各样本是否为真正的“京美”杂交种：若所述样本的电泳图谱上同时具有大小分别为221bp和229bp的两个目的条带，则视所述样本为真正的“京美”杂交种；若所述样本的电泳图谱上不同时具有大小分别为221bp和229bp的两个目的条带，则视所述样本为假的“京美”杂交种；

(A3)根据步骤(A2)的统计结果计算所述待测西瓜种子中“京美”杂交种的纯度。

2.一种鉴定待测西瓜种子是否为“京美”杂交种的方法，包括如下步骤：

(B1)从待测西瓜种子中提取基因组DNA，作为模板，采用由序列表中序列1和序列2所示两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；

(B2)将步骤(B1)所得扩增产物进行凝胶电泳，根据电泳谱图按照如下确定所述待测西瓜种子是否为“京美”杂交种：若所述待测西瓜种子的电泳图谱上同时具有大小分别为221bp和229bp的两个目的条带，则所述待测西瓜种子为或候选为“京美”杂交种；若所述待测西瓜种子的电泳图谱上不同时具有大小分别为221bp和229bp的两个目的条带，则所述待测西瓜种子不为或候选不为“京美”杂交种。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述凝胶电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述聚丙烯酰胺凝胶电泳为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：进行所述PCR扩增时采用的退火温度为55℃。

6.由序列表中序列1和序列2所示两条单链DNA组成的引物对在如下(C1)或(C2)中的应用：

(C1)检测西瓜“京美”杂交种纯度；

(C2)制备用于检测西瓜“京美”杂交种纯度的试剂盒。

7.由序列表中序列1和序列2所示两条单链DNA组成的引物对在如下(D1)或(D2)中的应用：

(D1)鉴定待测西瓜种子是否为“京美”杂交种；

(D2)制备用于鉴定待测西瓜种子是否为“京美”杂交种的试剂盒。