CN101407845B - 云南水稻老品种籼粳鉴定的分子技术方法 - Google Patents

云南水稻老品种籼粳鉴定的分子技术方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种云南水稻老品种籼粳鉴定分子技术的方法，属于农业生物技术领域育种领域。本发明的技术方案是取待鉴定材料种子5粒于20-35℃发芽，发芽5天取叶片提取水稻总DNA；测定DNA浓度并将DNA定量稀释为25ng/ul；用依照水稻第10染色体特定长臂区段序列设计的特异引物JI，进行PCR反应；2％的琼脂糖(含EtBr0.1ug/ml)凝胶电泳；在紫外透射仪上检测PCR产物，依据电泳结果鉴定材料籼粳特性。籼稻有两个分子量分别是280bp、380bp的PCR产物；粳稻的有一个分子量为280bp的PCR产物，由此鉴定云南水稻老品种籼粳特性。本发明的效果用途能快速、有效鉴别云南水稻老品种籼粳类型。

Description

云南水稻老品种籼粳鉴定的分子技术方法
技术领域
本发明涉及一种云南水稻老品种籼粳鉴定的分子技术方法，属于农业生物技术领域，更具体地说属于育种领域。
背景技术
我国是世界公认的亚洲栽培稻起源中心之一，是世界上稻种资源最丰富的国家之一，也是世界上种稻最早的国家之一。而云南由于纬度低，海拔高差大(海拔最低点为76米，最高点为6800米)，具有明显的立体气候特点，其地理气候多样性孕育了丰富多样性的稻种资源，是中国稻作生态和遗传资源多样性最丰富的中心，构成了亚洲栽培稻最重要的基因库之一。
目前，已从云南收集到6000余份的稻种资源，云南稻种几乎拥有我国栽培稻种的各种类型及特点，这些材料为水稻育种、研究亚洲栽培稻的籼粳分化历史提供了宝贵的资源。云南水稻籼粳有垂直分布的特点，从海拔76m的河口县到2695m的宁蒗县永宁镇均有稻作分布，其中海拔1600m以上主要为粳稻栽培区，76—1400m为籼稻栽培区，1400-1600m为籼粳交错区，以宁蒗县永宁2695m为最高，是我国目前水稻种植最高海拔。发掘利用云南稻种资源时，须对稻种资源特性有充分的了解，尤其是材料的籼粳分化特性。
籼粳分化是亚洲栽培稻演化过程中重要的进化事件。虽然亚洲栽培稻起源于亚洲的热带、亚热带的野生稻，但在漫长的自然进化与受人工选择过程中已演变分化为种质资源类型丰富、广泛种植的作物，适于在热带、亚热带、温带等许多温度条件不同的地区种植。随着纬度由南向北增加或海拔由低向高的增加，水稻分化形成了适应于不同温度环境的气候生态型，即籼稻(indica)和粳稻(japonica)两个亚种。典型的籼稻和粳稻在地理分布上有明显不同，籼稻主要分布在热带、亚热带的低海拔及低纬度的湿热地区种植，在我国主要分布于华南热带和淮河以南的亚热带地区。粳稻适应于高纬度或低纬度中高海拔温凉的地区。在亚洲，粳稻主要分布于夏季气候温和、纬度较高的北方(如我国的东北和朝鲜、日本)，以及低纬度的一些海拔较高的地区，如中国的西南地区。在我国主要分布于华东太湖流域和华北、西北、东北等温度较低的地区以及南部热带、亚热带的高地，如我国的云贵高原区。
典型的籼稻、粳稻在农艺性状及生理生化特性上差异较大。粳稻一般表现为耐寒性较强，较抗白叶枯病、抗倒、叶片硬而坚实、不易早衰、以及谷粒短圆、出米粒高、胚乳直链淀粉含量较低、胀性小等。籼稻通常适宜在炎热气候条件下栽培，一般表现为耐热性较强，较抗稻瘟病，易倒，生长繁茂以及谷粒长，胚乳直链淀粉含量较高、胀性大等。
前人依据典型籼粳稻的差异，已形成一些鉴别籼粳稻的指标体系，列举的性状多达十几项。在云南，程侃声等根据抽穗时壳色、叶毛、子粒长宽比、酚反应、1-2穗节长和稃毛等6项形态学指标的综合评分，提出了以形态为指标的“形态指数法”，可以区分绝大多数籼、粳品种(表1)。他的这种分类法简易快速，经得起杂交亲和力和同工酶分析的检验，已开始为国内一些学者所采用，是目前研究水稻籼粳分化较为常用的体系之一。但这种方法须将材料种植于田中，并做大量的田间观察记载，耗时费力，尤其是面对大量的稻种资源时。而且，用现在的方法对一些籼粳分化不明显、既表现籼稻特征又有粳稻特征的老品种很难区分。总而言之，目前，还没有一种技术能准确、快速、经济的鉴别水稻云南老品种籼粳的方法。
                    表1  籼粳分化指标
Figure G2008102336312D00021
各性状的分数相加，0-8分为籼，9-13为偏籼，14-17为偏粳，18-24为粳。
发明内容
本发明克服现有鉴定方法的不足，提供一种准确、快速、高效的籼粳鉴定方法。
本发明的技术方案是取待鉴定材料种子5粒于20-35℃发芽，发芽5天取叶片，提取水稻总DNA；测定样品DNA浓度并将DNA定量稀释为25ng/ul；然后用依照水稻第10染色体特定长臂区段的序列设计特异性引物JI，进行PCR反应；2％的琼脂糖(含EtBr0.1ug/ml)凝胶电泳分离；在紫外透射仪上检测PCR扩增产物及电泳结果，依据电泳结果鉴定材料籼粳特性。云南水稻老品种籼稻材料的PCR有两个产物分子量分别是280bp，380bp；云南水稻老品种粳稻材料PCR有一个产物的分子量为280bp，由此鉴定云南水稻老品种材料籼粳分化特性。PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序如下：
JI引物序列 F：AAGAAGGGAGGGTTATAGAATCTG
           R：ATATCAGGACTAACACCACTGCTC
反应液组成：反应总体积为12.5ul，含ddH2O 8.95ul，模板DNA 1ul，引物各
            1.6pmol，1×buffer，60uM dNTP，0.5U Taq酶，1.8Mm MgCL2
扩增程序：94℃4min；
          94℃50s、58℃50s、72℃1min，38个循环；
          72℃4min。
本发明的有益效果是由于利用了分子遗传学、分子生物学技术及水稻基因组测序结果，并结合多年来我们对云南水稻老品种特征特性及分子研究的结果，为快速准确鉴别云南水稻老品种籼粳特性提供了有力的工具。具体表现为：(1)用JI作引物鉴别云南水稻老品种籼粳特性准确性高，准确率为99％以上，而且用时不超过10天，鉴别材料只需发芽，提取DNA，PCR反应及电泳即可；(2)由于鉴别方法简单易行，鉴别不受季节及材料数量的限制，避免了田间农艺性状鉴定的繁琐程序，鉴别方法简单经济，鉴定一个材料需人民币约1.5元。
具体实施案例
具体实施方式为用不同海拔(高海拔：2000m以上；中：1400—2000m；低：低于1400m)云南水稻老品种，分别用“形态指数法”及分子鉴定法鉴定材料籼粳特性，比较两种方法鉴别结果，考察分子鉴别法的可靠性。
实施例一
来源于云南高海拔的稻种资源30份，分别用“形态指数法”及分子鉴定法鉴定材料籼粳特性，比较两种方法鉴别结果，考察分子鉴别法的可靠性。
分子鉴定时，取待鉴定材料种子5粒于20℃发芽，发芽5天取叶片提取水稻总DNA，测定样品DNA浓度并将DNA定量稀释为25ng/ul，然后用特异性引物JI进行PCR反应；2％的琼脂糖(含EtBr0.1ug/ml)凝胶电泳分离；在紫外透射仪上检测PCR扩增产物及电泳结果，依据电泳结果鉴定材料籼粳特性。云南水稻老品种籼稻材料的PCR有两个分子量分别是280bp、380bp的产物，云南水稻老品种粳稻材料PCR有一个分子量为280bp的产物，由此鉴定云南水稻老品种材料籼粳分化特性。PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序如下：
JI引物序列 F：AAGAAGGGAGGGTTATAGAATCTG
           R：ATATCAGGACTAACACCACTGCTC
反应液组成：反应总体积为12.5ul，含ddH2O 8.95ul，模板DNA 1ul，引物各
            1.6pmol，1×buffer，60uM dNTP，0.5U Taq酶，1.8Mm MgCL2
扩增程序：94℃4min；
          94℃ 50s、58℃ 50s、72℃ 1min，38个循环；
          72℃4min。
结果见表2，由表2可看出，来源于云南高海拔的稻种资源30份，均为粳稻材料，“形态指数法”鉴定为粳稻或偏粳稻材料，分子鉴定法为粳稻材料，表明分子鉴定与形态鉴定完全一致，分子鉴定准确率为100％。
   表2 供试云南高海拔水稻老品种材料农艺性状及分子鉴定表现
Figure G2008102336312D00051
实施例二
来源于云南中海拔的稻种资源34份，分别用“形态指数法”及分子鉴定法鉴定材料籼粳特性，比较两种方法鉴别结果，考察分子鉴别法的可靠性。
分子鉴定时，取待鉴定材料种子5粒于35℃发芽，发芽5天取叶片提取水稻总DNA，测定样品DNA浓度并将DNA定量稀释为25ng/ul，然后用特异性引物JI进行PCR反应；2％的琼脂糖(含EtBr0.1ug/ml)凝胶电泳分离；在紫外透射仪上检测PCR扩增产物及电泳结果，依据电泳结果鉴定材料籼粳特性。云南水稻老品种籼稻材料的PCR有两个分子量分别是280bp、380bp的产物，云南水稻老品种粳稻材料PCR有一个分子量为280bp的产物，由此鉴定云南水稻老品种材料籼粳分化特性。PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序如下：
JI引物序列 F：AAGAAGGGAGGGTTATAGAATCTG
           R：ATATCAGGACTAACACCACTGCTC
反应液组成：反应总体积为12.5ul，含ddH2O 8.95ul，模板DNA 1ul，引物各
            1.6pmol，1×buffer，60uM dNTP，0.5U Taq酶，1.8Mm MgCL2
扩增程序：94℃4min；
          94℃ 50s、58℃ 50s、72℃ 1min，38个循环；
          72℃ 4min。
结果见表3，由表3可看出，来源于云南高海拔的稻种资源34份，“形态指数法”鉴定将其分为4类，即籼稻、偏籼、偏粳及粳稻，其中籼稻和偏籼材料分子鉴定为籼稻，偏粳及粳稻分子鉴定为粳稻，表明分子鉴定与形态鉴定完全一致，分子鉴定准确率为100％。
 表3 供试云南中海拔水稻老品种材料农艺性状及分子鉴定表现
Figure G2008102336312D00061
实施例三
来源于云南低海拔的稻种资源120份，分别用“形态指数法”及分子鉴定法鉴定材料籼粳特性，比较两种方法鉴别结果，考察分子鉴别法的可靠性。
分子鉴定时，取待鉴定材料种子5粒于30℃发芽，发芽5天取叶片提取水稻总DNA，测定样品DNA浓度并将DNA定量稀释为25ng/ul，然后用特异性引物JI进行PCR反应；2％的琼脂糖(含EtBr0.1ug/ml)凝胶电泳分离；在紫外透射仪上检测PCR扩增产物及电泳结果，依据电泳结果鉴定材料籼粳特性。云南水稻老品种籼稻材料的PCR有两个分子量分别是280bp、380bp的产物，云南水稻老品种粳稻材料PCR有一个分子量为280bp的产物，由此鉴定云南水稻老品种材料籼粳分化特性。PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序如下：
JI引物序列  F：AAGAAGGGAGGGTTATAGAATCTG
            R：ATATCAGGACTAACACCACTGCTC
反应液组成：反应总体积为12.5ul，含ddH2O 8.95ul，模板DNA1ul，引物各
            1.6pmol，1×buffer，60uM dNTP，0.5U Taq酶，1.8Mm MgCL2
扩增程序：94℃4min；
          94℃ 50s、58℃ 50s、72℃ 1min，38个循环；
          72℃ 4min。
结果见表4，由表4可看出，来源于云南低海拔的稻种资源120份，其中籼稻98份，粳稻10份，光壳16份，光籼4份，光粳12份，除黄皮糯号外，其余分子鉴定与田间形态鉴定结果一致，分子鉴定与田间形态鉴定的一致性为99.2％。。
 表4 供试云南低海拔水稻老品种材料农艺性状及分子鉴定表现
 
编号 品种 分子鉴定 形态鉴定 编号 品种 分子鉴定 形态鉴定
1 毫玉烂 籼 籼 61 大蚂蚱谷 籼 光籼
2 小黄糯 籼 籼 62 红蚂蚱谷 籼 籼
3 毫拔归 粳 粳 63 惰地谷 籼 籼
4 老苍谷 籼 籼 64 黄瓜糯 籼 籼
5 乌嘴谷 籼 籼紫米 65 毛母糯 籼 籼
6 忙东糯 籼 籼 66 摆衣糯 籼 籼
7 毫勐黿 籼 籼 67 老皮香 籼 籼
8 中白糯 粳 粳 68 罗平糯 籼 籼
9 毫浪女 籼 籼紫米 69 忙种谷 籼 籼
 
10 细出芽 籼 籼 70 挫地谷 籼 籼
11 五子堆酒谷 籼 籼 71 猪屎谷 籼 光壳
12 毫糯 籼 籼 72 思毛糯 籼 籼
13 叶白谷 粳 粳 73 黄皮谷 籼 籼
14 大花糯 籼 籼 74 短子乌骚 籼 籼
15 后黄谷 粳 粳 75 矮棵林 籼 籼
16 乱脚谷 籼 籼偏粳 76 南高谷 籼 籼
17 大黄皮谷 籼 籼 77 黑节子白谷 籼 籼
18 长毛谷 籼 籼 78 猛来谷 籼 籼
19 花壳糯 籼 籼 79 红壳糯 籼 光壳
20 大香糯 籼 籼 80 红脚谷 籼 籼
21 冷水黄谷 籼 籼 81 毫东黿 籼 籼
22 白谷 籼 籼 82 大香糯 籼 籼
23 玉林苞谷 籼 籼 83 还债谷 籼 籼
 
24 大花谷 籼 籼 84 大黄糯 籼 籼
25 黄皮糯 籼 籼 85 黄皮糯 粳 籼
26 越南糯 籼 籼 86 大白糯 粳 光壳
27 毫罗罕 籼 籼 87 毛谷 粳 光壳
28 大毫气 粳 光壳 88 光壳谷 粳 光壳
29 毫玉昂 籼 籼 89 毛石谷 籼 籼
30 细杆谷 粳 光壳 90 豪相糯 粳 光壳
31 冷水白谷 粳 光壳 91 孟足糯 籼 籼紫米
32 老鼠牙 籼 籼 92 大黄皮糯 籼 籼
33 毫木黄谷 粳 粳糯米 93 毫糯毫 籼 籼
34 勐腊糯 籼 籼 94 大白糯 籼 籼
35 大白谷 粳 光壳 95 鸡血糯 籼 籼
36 三皮秧 籼 籼 96 鱼子糯 籼 籼
37 红心糯 籼 籼 97 骡子谷 籼 籼
38 二白谷 籼 籼 98 黑皮糯 籼 籼
39 毫糯 籼 籼 99 兰巴糯 籼 籼
40 毫好黿 籼 籼 100 毫拔归 籼 粳
41 九香糯 籼 籼 101 紫谷 籼 籼
42 紫糯 籼 籼 102 紫糯 籼 籼
43 紫糯 籼 籼 103 大花谷 籼 籼
44 老庄麻线谷 籼 籼 104 木邦谷 粳 光壳谷
45 冷水谷 粳 粳 105 牧丁糯 籼 籼
46 毫大利 籼 籼 106 蒙蒙谷 籼 籼
47 大灰糯 籼 籼 107 大香谷 籼 光壳
48 灰糯 粳 光壳 108 黑糯 籼 籼
49 三粒寸 籼 籼 109 小白谷 籼 籼
50 毫山小白谷 粳 光壳 110 毫来弄 粳 粳
51 老羊谷 籼 籼 111 元江香糯 籼 籼
52 海谷 籼 籼 112 南帕谷 粳 光壳谷
 
53 山道红谷 籼 籼 113 勐龙曼龙扣香米 籼 籼
54 冷水谷 籼 籼 114 博罗矮 籼 籼
55 细糯 籼 籼 115 毫干 籼 籼
56 江西糯 籼 籼 116 紫糯 籼 籼
57 光壳冷水谷 籼 籼 117 澜沧红软米 籼 籼
58 九月谷 籼 籼 118 茉莉香籼 籼 籼
59 半线谷 粳 籼 119 毫栖 籼 籼
60 麻谷白线 粳 粳 120 博选 籼 籼
表5是分子鉴定方法与常规方法比较。
  表5 不同鉴定方法的比较
Figure G2008102336312D00091
由表1～表5可看出，用JI引物鉴别云南水稻老品种籼粳特性时，准确率为99％以上，且分子技术鉴定较田间形态鉴定的成本低，可明显缩短育种进程(表4)。

Claims (2)

1.一种云南水稻老品种籼粳鉴定的分子技术方法，其步骤是：
1)将待鉴定材料种子5粒于20-35℃发芽；
2)发芽5天取叶片，提取水稻总DNA；
3)测定样品DNA浓度并将DNA定量稀释为25ng/ul；
4)用依照水稻第10染色体特定长臂区段的序列设计的特异性引物JI进行PCR反应；特异性引物JI序列为：F：AAGAAGGGAGGGTTATAGAATCTG，
                R：ATATCAGGACTAACACCACTGCTC；
5)用含EtBr0.1ug/ml的2％琼脂糖凝胶电泳分离；
6)在紫外透射仪上检测PCR扩增产物及电泳结果；
7)用JI作引物，云南水稻老品种籼稻材料的PCR有两个产物，分子量分别是280bp、380bp；云南水稻老品种粳稻材料PCR有一个产物，分子量为280bp，由此鉴定云南水稻老品种材料籼粳类型。
2.根据权利要求1所述的一种云南水稻老品种籼粳鉴定的分子技术方法，其特征是所述PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序为：
反应液组成：反应总体积为12.5ul，含ddH2O 8.95ul，模板DNA 1ul，引物各1.6pmol，1×buffer，60uM dNTP，0.5U Taq酶，1.8mM MgCl2；
扩增程序：94℃4min；
          94℃50s、58℃50s、72℃1min，38个循环；
          72℃4min。 
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