CN110669864A

CN110669864A - 一种基于叶绿体dna差异的籼粳稻米种类荧光pcr快速检测鉴定方法

Info

Publication number: CN110669864A
Application number: CN201911050790.3A
Authority: CN
Inventors: 陈文炳; 邵碧英; 缪婷玉; 彭娟
Original assignee: Fuzhou Customs Technical Center
Current assignee: Fuzhou Customs Technical Center
Priority date: 2019-10-31
Filing date: 2019-10-31
Publication date: 2020-01-10

Abstract

本发明提供一种基于叶绿体DNA序列差异的籼粳稻米种类荧光PCR快速检测鉴定方法。以正向引物F4：3’‑AATCGCAACCCCTTTCCGC‑5’，反向引物R1：3’‑TTGAGGATTATTCCATGATTCC‑5’，建立了籼‑粳稻米叶绿体DNA SYBR Green荧光PCR检测方法，PCR扩增产物籼稻为135 bp、粳稻为204 bp片段，2种稻米的SYBR Green荧光PCR扩增熔解温度（Tm）为：籼稻Tm值为76.5℃，粳稻Tm值为78.0℃，二者Tm值差为1.5。该熔解温度（Tm）的差别，用于判别鉴定待测稻米所属的种类。

Description

一种基于叶绿体DNA差异的籼粳稻米种类荧光PCR快速检测鉴定方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于叶绿体DNA序列差异的籼粳稻米种类荧光PCR快速检测鉴定方法。

背景技术

稻米是多数国家的主粮，也是我国南方地区的主粮，同时也是重要的加工食品的主要原料，主要有2个亚种，即籼稻（米）亚种（Hsien rice, 国际上也称为Indica rice）与粳稻（米）亚种（Kengrice, 国际上也称为Japonica rice）^[1]，由于稻米种类不同，其商品价值也不一样，因此，有必要进行区分鉴别。从稻谷形态上看，2个亚种之间有一定的区别，但经加工成稻米后，要做到精准鉴定，难度较大，稻米粉碎后加工成米制品，完全无法从形态学上加以鉴别。因此，有必要建立稻米种类的DNA鉴定方法。本发明涉及一种基于叶绿体DNA序列差异的籼粳稻米种类荧光PCR快速检测鉴定方法。该方法的应用，对大米及其加工产品的物种类别的鉴定，维护良好大米及其制品的贸易市场秩序，保护消费者利益，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于叶绿体DNA序列差异的籼粳稻米种类荧光PCR快速检测鉴定方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一对检测鉴定籼粳稻米种类的荧光PCR引物：F4：3’-AATCGCAACCCCTTTCCGC-5’；R1：3’-TTGAGGATTATTCCATGATTCC-5’。

一种基于叶绿体DNA序列差异的籼粳稻米种类荧光PCR快速检测鉴定方法：以粳稻、籼稻的总DNA为模板，以F4/R1为引物，分别进行SYBR Green荧光PCR扩增；

PCR反应体系：2×SYBR Premix Ex Taq 12.5μL，引物F4/R1各0.5μL，总DNA 2μL（200ng），ddH₂O补足至25μL；

反应条件：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃34s，40个循环；65℃~95℃熔解曲线分析。

上述方法中： SYBR Green荧光PCR扩增产物籼稻为135 bp、粳稻为204 bp片段，SYBR Green荧光PCR扩增熔解温度（Tm）为籼稻Tm值76.5℃，粳稻Tm值78.0℃，二者Tm值差为1.5；该熔解温度（Tm）的差别，用于判别鉴定待测稻米所属的种类。

本发明的优点在于：

本发明提供一种基于叶绿体DNA序列差异的籼粳稻米种类荧光PCR快速检测鉴定方法。利用籼粳稻米叶绿体DNA序列差异性，即籼稻叶绿体DNA缺失69 bp片段^[2]，设计特异性引物，通过荧光PCR快速检测鉴定；PCR扩增产物籼稻为135 bp、粳稻为204 bp片段；荧光PCR扩增熔解温度，籼稻Tm值为76.5℃，粳稻Tm值为78.0℃；通过扩增产物与熔解温度的双重差异，准确快速鉴别籼、粳两种稻米。对大米及其加工产品的物种（实际上是籼粳亚种）类别的鉴定，维护良好大米及其制品的贸易市场秩序，保护消费者利益，具有重要意义。

附图说明

图1 SYBR Green荧光PCR结果。A：扩增曲线；B：熔解曲线。

图2 籼、粳稻叶绿体DNA特异序列比对结果。

图3 4条正向引物与3条反向引物所在位置图。

图4 引物筛选SYBR Green荧光PCR的曲线图。A、B：引物组合F1R1；C、D：引物组合F1R2；E、F：引物组合F1R3；A、C、E：扩增曲线；B、D、F：熔解曲线。

图5引物筛选SYBR Green荧光PCR的曲线图。A、B：引物组合F2R1；C、D：引物组合F2R2；E、F：引物组合F2R3；A、C、E：扩增曲线；B、D、F：熔解曲线。

图6引物筛选SYBR Green荧光PCR的曲线图。A、B：引物组合F3R1；C、D：引物组合F3R2；E、F：引物组合F3R3；A、C、E：扩增曲线；B、D、F：熔解曲线。

图7引物筛选SYBR Green荧光PCR的曲线图。A、B：引物组合F4R1；C、D：引物组合F4R2；E、F：引物组合F4R3；A、C、E：扩增曲线；B、D、F：熔解曲线。

图8 引物筛选SYBR Green荧光PCR产物的电泳图。A：1~2. F1R1；3~4. F1R2；5~6.F1R3；8~9. F2R1；10~11. F2R2；12~13. F2R3；B：1~2. F3R1；3~4. F3R2；5~6. F3R3；8~9.F4R1；10~11. F4R2；12~13. F4R3；1、3、5、8、10、12泳道是粳稻；2、4、6、9、11、13泳道是籼稻；7、14. 泳道DNA Marker I。

图9 365份稻种子（稻米）的SYBR Green荧光PCR扩增曲线图和熔解曲线图。A：扩增曲线；B：熔解曲线。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

试验材料：水稻种子由本实验室收集与委托转基因检测的样品。

主要试剂：CTAB裂解液[称取4.00g CTAB，16.38g NaCl，2.42g Tris，1.50gNa2EDTA，用适量水溶解后，调pH至8.0，定容至200mL，高压灭菌]、CTAB沉淀液[称取1.00gCTAB，0.50g NaCl，用适量水溶解后，调pH至8.0，定容至200mL，高压灭菌]自行配制；SYBRPremix Ex Taq（2×）为宝生物工程（大连）有限公司（大连TaKaRa公司）产品。

主要仪器与设备：研磨仪、涡旋仪、水浴锅、台式离心机、大型冷冻离心机、实时荧光定量PCR仪（美国BIO-RAD公司，CFX96）、凝胶成像分析系统。

实施例1引物设计与筛选

本发明基于叶绿体DNA（cpDNA）差异的籼粳稻米种类DNA序列比对快速鉴定方法。基于籼稻叶绿体DNA缺失69 bp片段，在此缺失片段两侧，设计正向引物（F）4个，反向引物（R）3个，进行组合，共得到12个组合。

参考文献^[3,4]合成扩增籼、粳稻叶绿体DNA片段的引物大米-F：AGTCCACTCAGCCATCTCTC、大米-R：GGCCATCATTTTCTTCTTTAG，以引物大米-F和大米-R扩增籼、粳稻叶绿体DNA片段，籼稻叶绿体DNA片段的核苷酸序列见SEQ ID No .1；粳稻叶绿体DNA片段的核苷酸序列见SEQ ID No .2；然后根据叶绿体DNA片段测序结果自行设计用于筛选鉴定籼、粳稻的引物。引物由铂尚生物技术（上海）有限公司合成。用TE溶液（pH8.0）将引物稀释至10μmol/L，-20℃保存备用。

（1）总DNA的提取

将水稻种子或大米研磨成粉；称取1.0g于50 mL 离心管中，加5mL CTAB裂解液，65℃温育过夜；15000 rpm离心10 min，取上清液；加2倍体积的CTAB沉淀液，摇匀，室温放置1h；15000rpm离心10min，取沉淀，加900μL 1.2mol/L 氯化钠溶液，65℃温育，溶解后移至2.0mL离心管中；加900μL 氯仿：异戊醇（24：1），涡旋混匀，12000 rpm离心10 min；取上清液，加入等体积的氯仿，12000 rpm离心10 min；取上清液，加0.8倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀，12000 rpm离心10 min；取沉淀，加入1mL 70%乙醇，涡旋，12000 rpm离心10 min；弃上清，取沉淀，于DNA浓缩仪中干燥；加200 μL TE溶液（pH8.0），65℃温育至沉淀完全溶解；取2μLDNA溶液于超微量核苷酸测定仪中测定浓度，用TE溶液（pH8.0）稀释至100ng/μL，-20℃保存备用。

（2）籼、粳稻叶绿体DNA片段的PCR扩增及测序

提取籼稻（福农优419）、粳稻（东北米）的总DNA进行SYBR Green荧光PCR扩增。PCR反应体系：SYBR Premix Ex Taq（2×） 12.5μL，大米-F、大米-R各0.5μL，总DNA 2μL（200ng），ddH₂O补足至25μL。PCR反应条件：95℃ 1min；95℃ 10s，60℃ 1min，40个循环；65℃~95℃熔解曲线分析。

扩增结果（图1）表明：籼稻（福农优419）、粳稻（东北米）都有明显的扩增曲线，且熔解温度均为80.00℃。

将PCR产物委托铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序，比对结果如图2所示。和粳稻序列相比，籼稻序列中间缺失了69个碱基。

（3）引物设计、筛选结果

选取籼稻缺失序列的前后端一段序列进行引物设计，各引物所在位置如图3所示，引物具体核苷酸序列见表1。

表1 设计的引物

将正向引物和反向引物进行组合，共得到12个组合，以粳稻、籼稻的总DNA为模板，分别进行SYBR Green荧光PCR扩增。反应体系：SYBR Premix Ex Taq（2×） 12.5μL，正向引物和反向引物各0.5μL，总DNA 2μL（200ng），ddH₂O补足至25μL。反应条件：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃34s，40个循环；65℃~95℃熔解曲线分析。

SYBR Green荧光PCR结果如4所示，F3R1、F4R1组合的熔解峰的间距较大，熔解温度（Tm）的差值最大（表2）。

表2 引物筛选SYBR Green荧光PCR的Tm值

各取10μL SYBR Green荧光PCR的产物进行电泳，结果如图5所示。在所有组合中，F4R1组合的粳稻和籼稻的两个目的条带大小区分明显、条带明亮清晰。

根据SYBR Green荧光PCR结果的熔解曲线、熔解温度及其产物电泳结果，选择F4、R1作为粳稻、籼稻SYBR Green荧光PCR鉴别方法的正向和反向引物。

实施例2 鉴别方法的符合性

用以上建立的SYBR Green荧光PCR方法鉴别365份已知籼、粳类别的水稻种子（稻米），SYBR Green荧光PCR结果如图6所示。所有样品均有明显的扩增曲线，而熔解曲线明显地被分为两组，熔解温度分为76.5℃和78℃两种。该方法的鉴别结果与水稻的籼、粳稻类别高度吻合。在125个粳稻米品种样品中，检出cpDNA非缺失型片段长度为204 bp（Tm值为78）的有121个样品，cpDNA缺失型片段长度为135 bp（Tm值为76.5）的有4个样品，与粳稻米符合率为96.8%，不符合率3.24%。在240个籼稻米品种样品中，检出片段长度为135 bp 的cpDNA 缺失型（Tm值为76.5）的有212个样品，cpDNA 非缺失型片段长度为204 bp（Tm值为78）有28个样品，与籼稻米符合率为88.33%，不符合率11.67%。其中，经国家水稻数据中心（Rice DataBase）查询，具有非缺失型DNA片段的28个品种中，9个具有粳稻cpDNA 非缺失型母系血缘。不符合的原因可能是传统上误名，或是以粳稻为母本，籼稻为父本，进行多代回交的而形成具有粳稻细胞质的籼稻品种^[5]，或者相反。可见本方法用于籼粳稻的检测鉴定，准确率高。该方法只检测一个基因位点，比已发表的其他基于核DNA^[6]与叶绿体DNA的检测方法^[7]简单的多，他们检测的DNA位点多个到几十个，本方法则简单且高效。而方法较为相近的报道，用的都是普通PCR方法^[3-5]。

综上所述，建立的籼、粳稻SYBR Green荧光PCR鉴别方法为：

反应体系：SYBR Premix Ex Taq（2×） 12.5μL，F4、R1各0.5μL，总DNA 2μL（200ng），ddH₂O补足至25μL。反应条件：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃34s，40个循环；65℃~95℃熔解曲线分析。根据熔解温度（Tm）的大小来判定是否为粳稻、籼稻，Tm=76.50℃为籼稻，Tm=78.00℃为粳稻。引物序列为：正向F4：3’-AATCGCAACCCCTTTCCGC-5’，反向R1：3’-TTGAGGATTATTCCATGATTCC-5’。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州海关技术中心

<120> 一种基于叶绿体DNA差异的籼粳稻米种类荧光PCR快速检测鉴定方法

<130> 11

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1051

<212> DNA

<213> SEQ ID No. 1

<400> 1

agtccactca gccatctctc cccgttccaa atcgaaaggt ttccgtgata tgacagaggc 60

aagaaaataa cgattgcaaa aaatccttcc tttttctttc aaaagttcaa aaaaaattat 120

attgccaatt ccattttagt tatattcttt tttcttaatg ttaataaaaa aaaagaagaa 180

aattcttctt ttttctttct aattctaaaa ttggatattg gctaaaagac aatcagatag 240

attttctctt cagcaggcat ttccatatag gacttgttat aataaaacaa gcaggttata 300

gaaaaaaact ctttttttta ttatttatca acaaagcaaa aaggggtctt atcaaaccaa 360

cccaccccat aaaattggaa agaaagataa agtaagtgga cctgactcct tgaatgaggc 420

ctctatccgc tattctgata tataaattcg atgtagatga aattgtataa gtggattttt 480

ttgtatttcc ttagacttag accacgcaag gcaagaattt ctcgctattt actatttcat 540

attcttgtta ctagatgttc tataggaata agaagaaatc gcaacccctt tccgctacac 600

ataaaaatgg atttcgaaag tcaatttttc ttttcaatat ctttactttt tttcagaatc 660

ctatttttgt tcttataccc atgcaataga gagcgagtgg gaaaagggag gttacttttt 720

ttcatttttc ccttaaaaaa taggctttct tggaaatagg aatcatggaa taatcctgaa 780

ttccaatgtt tatttctata gtataagaaa aactaattga atcaaattca tggatttacc 840

acgacctcgg ctgtgacccc atagataaaa atgcaaaatt tctatcttcg agaccattga 900

aaaaaggcat tgaacgagaa aaaatcgtcc acagataatc tatcgtatgc cttggaagtg 960

atataaggtg ctcggaaatg gttgaagtaa tttgaatagg aggatcacta tgactatagc 1020

ccttggtaga gttactaaag aagaaaatga t 1051

<210> 2

<211> 978

<212> DNA

<213> SEQ ID No. 2

<400> 2

agtccactca gccatctctc cccgttccaa atcgaaaggt ttccgtgata tgacagaggc 60

aagaaataac gattgcaaaa aatccttcct ttttctttca aaagttcaaa aaaattatat 120

tgccaattcc attttagtta tattcttttt tcttaatgtt aataaaaaaa agaagaaaat 180

tcttcttttt tctttctaat tctaaaattg gatattggct aaaagacaat cagatagatt 240

ttctcttcag caggcatttc catataggac ttgttataat aaaacaagca ggttatagaa 300

aaaaactctt ttttttatta tttatcaaca aagcaaaaag gggtcttatc aaaccaaccc 360

accccataaa attggaaaga aagataaagt aagtggacct gactccttga atgaggcctc 420

tatccgctat tctgatatat aaattcgatg tagatgaaat tgtataagtg gatttttttg 480

tatttcctta gacttagacc acgcaaggca agaatttctc gctatttact atttcatatt 540

cttgttacta gatgttctat aggaataaga agaaatcgca acccctttcc gctacacata 600

aaaatggatt tcgaaagtca atttttcttt tcaatatctt tacttttttt catttttccc 660

ttaaaaaata ggctttcttg gaaataggaa tcatggaata atcctgaatt ccaatgttta 720

tttctatagt ataagaaaaa ctaattgaat caaattcatg gatttaccac gacctcggct 780

gtgaccccat agataaaaat gcaaaatttc tatcttcgag accattgaaa aaaggcattg 840

aacgagaaaa aatcgtccac agataatcta tcgtatgcct tggaagtgat ataaggtgct 900

cggaaatggt tgaagtaatt gaataggagg atcactatga ctatagccct tggtagagtt 960

actaaagaag aaaatgat 978

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 大米-F

<400> 3

agtccactca gccatctctc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 大米-R

<400> 4

ggccatcatt ttcttcttta g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> F1

<400> 5

tagatgaaat tgtataagtg g 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> F2

<400> 6

agacttagac cacgcaaggc 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> F3

<400> 7

ttgttactag atgttctata gg 22

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> F4

<400> 8

aatcgcaacc cctttccgc 19

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> R1

<400> 9

ttgaggatta ttccatgatt cc 22

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> R2

<400> 10

tcacagccga ggtcgtgg 18

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> R3

<400> 11

gtctcgaaga tagaaatttt gc 22

Claims

1.检测鉴定籼粳稻米种类的荧光PCR引物，其特征在于：所述引物的核苷酸序列为

正向引物F4：3’-AATCGCAACCCCTTTCCGC-5’，

反向引物R1：3’-TTGAGGATTATTCCATGATTCC-5’。

2.一种基于叶绿体DNA序列差异的籼粳稻米种类荧光PCR快速检测鉴定方法，其特征在于：以粳稻、籼稻的总DNA为模板，以F4/R1为引物，分别进行SYBR Green荧光PCR扩增；

PCR反应体系：2×SYBR Premix Ex Taq 12.5μL，引物F4/R1各0.5μL，200ng 总DNA 2μL，ddH₂O补足至25μL；

3.根据权利要求2所述的一种基于叶绿体DNA序列差异的籼粳稻米种类荧光PCR快速检测鉴定方法，其特征在于：SYBR Green荧光PCR扩增产物籼稻为135 bp、粳稻为204 bp片段，SYBR Green荧光PCR扩增熔解温度Tm为籼稻Tm值76.5℃，粳稻Tm值78.0℃，二者Tm值差为1.5；该熔解温度的差别，用于判别鉴定待测稻米所属的种类。