CN112695125A

CN112695125A - 一种卡特兰属ssr分子标记引物组合物及其应用

Info

Publication number: CN112695125A
Application number: CN202110130211.7A
Authority: CN
Inventors: 李佐; 肖文芳; 吕复兵; 陈和明; 朱根发
Original assignee: Environmental Horticulture Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Environmental Horticulture Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2021-04-23
Anticipated expiration: 2041-01-29
Also published as: CN112695125B; AU2021101595A4

Abstract

本发明提供了一种卡特兰属SSR分子标记引物组合物、指纹码及其在卡特兰属种质资源鉴定中的应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供了卡特兰属15个SSR分子标记及其扩增引物组合物，并利用TP‑M13‑SSR技术对属内26份不同的种质资源进行遗传多样性的分析及分子身份证的构建，可准确、高效、稳定地鉴定卡特兰属种质资源，为卡特兰属的种质资源鉴定、亲缘关系分析、性状基因的定位、分子标记辅助育种及卡特兰属相关的分子研究等奠定了基础。

Description

一种卡特兰属SSR分子标记引物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种卡特兰属SSR分子标记引物组合物、指纹码及其在卡特兰属种质资源鉴定中的应用。

背景技术

卡特兰(Cattleya)又称卡特利亚兰、卡多丽雅兰、嘉德丽雅兰等，是兰科(Orchidaceae)卡特兰属(Cattleya Alliance)及其近缘属物种的统称，原产于美洲热带和亚热带，从墨西哥到巴西都有分布，均为附生类兰花，因其花大形美，色彩艳丽，且不同季节都有不同品种开花，深受人民喜爱，同时还是巴西、哥伦比亚、哥斯达黎加等国的国花，具有很好的国际识别度，因此在国际上享有“洋兰之王”的美誉。

广义卡特兰是一个集合统称，即卡特兰属类(Cattleya Alliance)，这个集合里最知名、种类最多、最引起关注的以Cattleya属为代表，经过100多年来持续不断的与异属间杂交育种，而被糅合成一个共享的大家族的统称。卡特兰家族是各大类兰花之中，近缘属之间杂交最广泛、异属杂交后代最多也最成功的一大类，目前已超过36000多个卡特兰杂交种在英国皇家园艺学会(RHS)登录。

卡特兰在我国未发现原生种分布，需从其他国家引种栽培，而引种栽培的卡特兰存在许多同种异名和同名异种现象，对卡特兰杂交育种造成了不利影响。除传统杂交育种工作外，卡特兰属植物相关研究较少，目前主要集中在组培快繁、栽培管理和野生资源分布及鉴定等方面。崔学强等(2020)采用ISSR标记，筛选出6条引物，对18份卡特兰种质资源进行遗传多样性分析(崔学强,唐璇,黄昌艳,等.基于ISSR标记的卡特兰种质资源遗传多样性分析[J].西南农业学报.2020,33(7):1383-1388)。Fajardo等利用ISSR分子标记技术对巴西一种濒临绝种兰花Cattleya granulosa及其他4种巴西本土种Brassavolatuberculata、Cattleya bicolor、Cattleya labiata和Cattleya schofieldiana的遗传多样性进行分析，结果表明ISSR遗传标记可有效检测卡特兰种间的遗传分化(Fajardo C G,de Almeida Vieira F,Molina W F.Interspecific genetic analysis of orchids inBrazil using molecular markers[J].Plant Systematies and Evolution,2014,300(8):1825-1832)。

微卫星标记(Microsatellite)也称为短串联重复序列(STR)或简单重复序列(SSR)，是由几个核苷酸(2-5个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，广泛分布在真核生物整个基因组的不同位置上，由于重复次数的不同及重复程度的不完全造成了每个位点多态性。利用某个微卫星DNA两端的保守序列设计一对特异引物，扩增这个位点的微卫星DNA序列，通过电泳检测即可显示不同基因型个体在这个SSR位点上的多态性。TP-M13-SSR(simple sequence repeatwith tailed primer M13)技术结合了SSR分子标记技术和荧光测序技术，具有重复性高，结果准确等优点，在较大程度上解决了分析通量较低，扩增产物检测流程繁琐，数据记录的工作量大等一系列问题(李会勇等，2005)。

因此，利用卡特兰属基因组序列开发新的SSR分子标记及其引物组合物，并利用TP-M13-SSR技术进行遗传多样性的分析及分子身份证的构建，将会对卡特兰属的种质资源鉴定、亲缘关系分析、性状基因的定位、分子标记辅助育种及卡特兰属相关的分子研究起重要的作用。

发明内容

针对上述不足，本发明提供了一种卡特兰属SSR分子标记引物组合物、指纹码及其在卡特兰属种质资源鉴定中的应用。本发明利用简化基因组测序技术提供了卡特兰属SSR引物组合物，并利用TP-M13-SSR技术对属内26份不同的种质资源进行遗传多样性的分析及分子身份证的构建，可准确、高效、稳定地鉴定卡特兰属种质资源，为卡特兰属的种质资源鉴定、亲缘关系分析、性状基因的定位、分子标记辅助育种及卡特兰属相关的分子研究等奠定了基础。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种卡特兰属SSR分子标记引物组合物，所述的SSR分子标记包括1-N1006714、2-N1204804、10-N1060688、11-N1995183、12-N2010170、22-N1388702、25-N3457413、36-N1012200、39-N1014795、47-N1036425、212-N1001184、215-N1003355、216-N1006768、220-N1009344和221-N10141；

所述的引物组合物包括：

(1)扩增SSR分子标记1-N1006714的引物：

SEQ ID NO:1：1-N1006714-F：5'-AAATCACAGTCCAGGCCAAC-3'

SEQ ID NO:12：1-N1006714-R：5'-TTAGAATTGTGGACCCAGCC-3'；

(2)扩增SSR分子标记2-N1204804的引物：

SEQ ID NO:3：2-N1204804-F：5'-CAGGCCAGCATCACAAGATA-3'

SEQ ID NO:4：2-N1204804-R：5'-ACTTGGAGTTGTGGACCCAG-3'；

(3)扩增SSR分子标记10-N1060688的引物：

SEQ ID NO:5：10-N1060688-F：5'-ACCCTTTGCTAGCTGTTGGA-3'

SEQ ID NO:6：10-N1060688-R：5'-TAATCAAAGGGCTACCCGTG-3'；

(4)扩增SSR分子标记11-N1995183的引物：

SEQ ID NO:7：11-N1995183-F：5'-CGGTCTTGGACATGACTTGA-3'

SEQ ID NO:8：11-N1995183-R：5'-CGGACTTAGCCTCAAGCAAC-3'；

(5)扩增SSR分子标记12-N2010170的引物：

SEQ ID NO:9：12-N2010170-F：5'-TTTTCCCCAACAACACTTCC-3'

SEQ ID NO:10：12-N2010170-R：5'-CTTGGTTGGATTTATGGAGGA-3'；

(6)扩增SSR分子标记22-N1388702的引物：

SEQ ID NO:11：22-N1388702-F：5'-AGGAGGAGGTAACCCCAAAT-3'

SEQ ID NO:12：22-N1388702-R：5'-TCCATCCAAGCATTGAAACC-3'；

(7)扩增SSR分子标记25-N3457413的引物：

SEQ ID NO:13：25-N3457413-F：5'-TTGGAGGGAAGAAGAAGGGT-3'

SEQ ID NO:14：25-N3457413-R：5'-TCACCCTCATATCCTCCTGG-3'；

(8)扩增SSR分子标记36-N1012200的引物：

SEQ ID NO:15：36-N1012200-F：5'-TGGGTTACTCAGCCGTCTCT-3'

SEQ ID NO:16：36-N1012200-R：5'-ACAGTCCAGGCCAACATCTC-3'；

(9)扩增SSR分子标记39-N1014795的引物：

SEQ ID NO:17：39-N1014795-F：5'-CGATCCACAATTCCTCCATT-3'

SEQ ID NO:18：39-N1014795-R：5'-CCCTGTTGGGACTCAGGTAA-3'；

(10)扩增SSR分子标记47-N1036425的引物：

SEQ ID NO:18：47-N1036425-F：5'-CAAGGAGAAGCTATTGAGGTTGA-3'

SEQ ID NO:20：47-N1036425-R：5'-AGTGCACACTTTGCCCTTCT-3'；

(11)扩增SSR分子标记212-N1001184的引物：

SEQ ID NO:21：212-N1001184-F：5'-CATCCGGTTGTTGTTTACCC-3'

SEQ ID NO:22：212-N1001184-R：5'-GGCCGACAGTGGTAGGTTTA-3'；

(12)扩增SSR分子标记215-N1003355的引物：

SEQ ID NO:23：215-N1003355-F：5'-CTGGCTGTAGCCAAAGCAGT-3'

SEQ ID NO:24：215-N1003355-R：5'-GATGCTGAAGGCTTGAAAGG-3'；

(13)扩增SSR分子标记216-N1006768的引物：

SEQ ID NO:25：216-N1006768-F：5'-ACCAAGCCAAGAAGGGATTT-3'

SEQ ID NO:26：216-N1006768-R：5'-ATTTCGCTCGCCCTAATTCT-3'；

(14)扩增SSR分子标记220-N1009344的引物：

SEQ ID NO:27：220-N1009344-F：5'-CCTGTCGGCCAAATTTCTTA-3'

SEQ ID NO:28：220-N1009344-R：5'-AGGGAGAATTGGCAAAGGTT-3'；

(15)扩增SSR分子标记221-N10141的引物：

SEQ ID NO:29：221-N10141-F：5'-GAACAATATGCAACGGGACA-3'

SEQ ID NO:30：221-N10141-R：5'-CGGTGACTCCATAACGAGTGT-3'。

又一方面，本发明提供了一种卡特兰属SSR分子标记指纹码，所述的指纹码包括指纹图谱和分子身份证，所述的分子身份证SSR分子标记顺序为：1-N1006714、2-N1204804、10-N1060688、11-N1995183、12-N2010170、22-N1388702、25-N3457413、36-N1012200、39-N1014795、47-N1036425、212-N1001184、215-N1003355、216-N1006768、220-N1009344、221-N10141。具体地，所述的分子身份证如下表1所示。

表1

进一步具体地，所述的分子身份证按照二倍体标准构建，依据SSR检测结果，对指纹数据进行数据化编码(各位点扩增片段按分子量大小排列，扩增片段(等位基因)从小到大以阿拉伯数字1-9标注，9个以上的等位基因，以大写英文字母A-Z标注)，若该位点在某个品种中无扩增则记为0，每个位点占两位。

具体地，所述的指纹图谱如下表2所示。

表2

又一方面，本发明提供了一种包含上述SSR分子标记引物组合物或SSR分子标记指纹码的试剂盒。

又一方面，本发明提供了上述SSR分子标记引物组合物、SSR分子标记指纹码或试剂盒在卡特兰属筛选或种质资源鉴定中的应用。

又一方面，本发明提供了上述SSR分子标记筛选方法，所述的方法包括以下步骤：以卡特兰属总DNA为模板，用超声波破碎仪随机打断成长度约350bp的片段，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成文库制备后，使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库至2ng/μL，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段进行检测，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。使用Illumina Hiseq 2500进行测序，原始下机数据首先采用FASTQC软件进行质量检测，去除接头及低质量碱基序列后，将双端reads按照重叠碱基使用Flash软件进行拼接，使用MISA筛选测序结果，保留有微卫星标记SSR的序列。

又一方面，本发明提供了一种卡特兰属筛选或种质资源鉴定的方法，所述的方法包括以下步骤：

(1)待测植株总DNA提取；

(2)以步骤(1)提取的总DNA作为模板进行SSR分子标记PCR扩增；

(3)毛细管电泳检测步骤(2)的PCR扩增产物，收集数据；

(4)根据步骤(3)获得的数据进行遗传多样性指标、聚类及多态信息含量PIC计算分析。

具体地，步骤(2)中所述的PCR扩增体系为：反应体系总体积为10μL，包括1.2μLDNA模板(50ng/μL)，1.0μL 10×BufferΙ缓冲液，0.1μL TAKARA HS Taq酶(5U/μL)，引物(5μM)0.6μL，0.8μL2.5mM dNTP，TP-M13(5μM)0.5μL，去离子水补足至10μL。

进一步具体地，所述的PCR扩增反应程序：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；95℃30s，53℃30s，72℃30s，10个循环；60℃30min；4℃保存。

进一步具体地，所述的PCR扩增体系引物包括如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:30所示的序列。

又一方面，本发明还提供了上述SSR分子标记引物组合物、SSR分子标记指纹码或试剂盒在卡特兰属亲缘关系分析、性状基因的定位和分子标记辅助育种中的应用。

与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：

1、本发明提供了一种卡特兰属SSR分子标记及引物组合物，且利用TP-M13-SSR技术对卡特兰属内26份不同的种质资源进行遗传多样性的分析及分子身份证的构建，为卡特兰属的筛选和种质资源鉴定提供了基础。

2、本申请采用所述的卡特兰属SSR分子标记及引物组合物，可准确、高效、稳定地鉴定卡特兰属种质资源，操作简便。

3、本申请所述的卡特兰属SSR分子标记可用于辅助选择育种，实现苗期提前选择，从而加快卡特兰属的育种进程。

附图说明

图1为SSR分子标记引物扩增结果峰图。

图2为遗传分析及聚类图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学用语均具有本领域技术人员通常理解的含义。

实施例1卡特兰属种质资源

本发明采用广东省农业科学院环境园艺研究所兰花资源圃收集保存的不同种共26份卡特兰属种质资源，具体信息见下表3。所有实验材料均种植于广东省农业现代化科技示范区广东省农业科学院环境园艺研究所温室大棚内。

表3 26份种质资源基本信息

实施例2卡特兰属种植资源鉴定

1.总DNA提取

按照天根生物科技(北京)有限公司的新型植物基因组DNA提取试剂盒操作步骤进行卡特兰植株总DNA的提取，具体步骤如下：

(1)取卡特兰植株幼嫩根尖或嫩叶组织加入液氮充分研磨，称取植物新鲜组织约100mg。

(2)向研磨好的粉末中迅速加入400μL缓冲液GPS和10μL RNase A(10mg/mL)，迅速涡旋混匀后，将离心管放在65℃水浴15min，水浴过程中颠倒离心管以混合样本数次。

(3)加入100μL缓冲液GPA，涡旋震荡1min，12000rpm离心5min，转移上清至过滤柱CS中(过滤柱CS放在收集管中)，然后12000rpm离心1min，转移滤液至新的离心管中。

(4)加入等体积的无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都转移到RNase-Free吸附柱CR2中(吸附柱CR2放在收集管中)，12000rpm离心1min，倒掉废液，将RNase-Free吸附柱CR2放入收集管中。

(6)向RNase-Free吸附柱CR2中加入550μL去蛋白液RD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉废液，将RNase-Free吸附柱CR2放入收集管中。

(7)向RNase-Free吸附柱CR2中加入700μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉废液，将RNase-Free吸附柱CR2放入收集管中。

(8)重复步骤(7)。

(9)将RNase-Free吸附柱CR2放回收集管中，12000rpm离心2min，弃收集管，然后将RNase-Free吸附柱CR2转移到新的离心管中，室温晾干5-10min。

(10)在RNase-Free吸附柱CR2中加入50-100μL洗脱缓冲液TB，室温放置3-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

(11)取2μL DNA用于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，取2μL DNA用于NanoDrop分光光度计测浓度。

2.SSR分子标记及引物组合物

2.1.将检测合格的26份卡特兰属种质资源DNA样品等量混匀后，用Bioruptor超声波破碎仪随机打断成长度约为350bp的片段，按照

Rapid DNA-Seq Kit(BiooScientific，5144-08)试剂盒步骤，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成文库制备后，使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库至2ng/μL，随后使用Agilent2100对文库的插入片段进行检测，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。使用Illumina Hiseq 2500进行测序，原始下机数据首先采用FASTQC软件进行质量检测，去除接头及低质量碱基序列后，将双端reads按照重叠碱基使用Flash软件进行拼接，使用MISA筛选测序结果，保留有微卫星标记的序列作为SSR分子标记。

2.2.根据SSR分子标记设计引物，所述引物如下表4所示。

表4 SSR分子标记引物

3.样品扩增

使用表4中的引物进行样品的PCR扩增。

反应体系总体积为10μL，包括1.2μL DNA模板(50ng/μL)，1.0μL 10×Buffer Ι缓冲液，0.1μL TAKARA HS Taq酶(5U/μL)，引物(5μM)0.6μL，0.8μL2.5mM dNTP，TP-M13(5μM)0.5μL，去离子水补足至10μL。

反应程序：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；95℃30s，53℃30s，72℃30s，10个循环；60℃30min；4℃保存。

4.检测

1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。96孔板中每孔加入扩增产物1.0μL，ROX-500分子量内标和甲酰胺混合液(体积比0.5:8.5)9μL，95℃变性3min后，上ABI 3730XL检测仪进行检测，1kV电压进样10s，电泳15kV，30min。将Data Colletion软件收集的原始数据文件导入到GeneMapper 3.2软件中进行分析，将各峰值的位置与其泳道中的分子量内标予以比较，计算目标DNA片段的准确大小。各荧光标记座位上独立进行3次重复的毛细管电泳检测，取3次重复的平均值并四舍五入取整，作为实验材料在该座位上的数据。

5.数据分析

将整理好的数据，运用NTSYS软件进行遗传多样性指标、聚类及多态信息含量PIC计算分析。

实施例3引物扩增结果

本发明所述的SSR分子标记引物扩增结果详见下表5。因SSR分子标记引物及卡特兰属种类较多，以1-N1006714扩增结果峰图为例进行展示，1-N1006714扩增结果峰图如图1所示。由表5及图1可知，本发明所述的SSR分子标记引物扩增效果好，检出率高，且可扩增出稳定的DNA条带。

表5引物扩增结果

实施例4遗传分析及聚类

遗传多样性指标、聚类及多态信息含量PIC计算分析结果如下表6及图2所示。

表6

实施例5分子身份证构建

按照二倍体标准构建，依据SSR检测结果，对指纹数据进行数据化编码(各位点扩增片段按分子量大小排列，扩增片段(等位基因)从小到大以阿拉伯数字1-9标注，9个以上的等位基因，以大写英文字母A-Z标注)，若该位点在某个品种中无扩增则记为0，每个位点占两位。其中，分子身份证SSR分子标记顺序为：1-N1006714、2-N1204804、10-N1060688、11-N1995183、12-N2010170、22-N1388702、25-N3457413、36-N1012200、39-N1014795、47-N1036425、212-N1001184、215-N1003355、216-N1006768、220-N1009344、221-N10141。分子身份证信息如下表7所示，指纹图谱如下表8所示。

表7

表8指纹图谱

实验例1准确性检测

根据本发明所述的SSR分子标记、引物和种质资源鉴定方法，选取26份卡特兰属各10个样品进行种质资源的鉴定，检测结果如下表9所示。

表9准确性检测结果

由表9可知，采用本发明所述的SSR分子标记引物组合物和种质鉴定方法，可准确鉴定26份卡特兰属，准确率为100％。

本发明所述的SSR分子标记可用于辅助选择育种，实现苗期提前选择，从而加快卡特兰属的育种进程。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广东省农业科学院环境园艺研究所

<120> 一种卡特兰属SSR分子标记引物组合物及其应用

<130> 20200113

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

aaatcacagt ccaggccaac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

ttagaattgt ggacccagcc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

caggccagca tcacaagata 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

acttggagtt gtggacccag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

accctttgct agctgttgga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

taatcaaagg gctacccgtg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

cggtcttgga catgacttga 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

cggacttagc ctcaagcaac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

ttttccccaa caacacttcc 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

cttggttgga tttatggagg a 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

aggaggaggt aaccccaaat 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

tccatccaag cattgaaacc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

ttggagggaa gaagaagggt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

tcaccctcat atcctcctgg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

tgggttactc agccgtctct 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

acagtccagg ccaacatctc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

cgatccacaa ttcctccatt 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

ccctgttggg actcaggtaa 20

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

caaggagaag ctattgaggt tga 23

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

agtgcacact ttgcccttct 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

catccggttg ttgtttaccc 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 22

ggccgacagt ggtaggttta 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

ctggctgtag ccaaagcagt 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 24

gatgctgaag gcttgaaagg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 25

accaagccaa gaagggattt 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 26

atttcgctcg ccctaattct 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 27

cctgtcggcc aaatttctta 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 28

agggagaatt ggcaaaggtt 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 29

gaacaatatg caacgggaca 20

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 30

cggtgactcc ataacgagtg t 21

Claims

1.一种卡特兰属SSR分子标记引物组合物，其特征在于，所述的SSR分子标记包括1-N1006714、2-N1204804、10-N1060688、11-N1995183、12-N2010170、22-N1388702、25-N3457413、36-N1012200、39-N1014795、47-N1036425、212-N1001184、215-N1003355、216-N1006768、220-N1009344和221-N10141；

所述的引物组合物包括：

(1)扩增SSR分子标记1-N1006714的引物：

SEQ ID NO:1：1-N1006714-F：5'-AAATCACAGTCCAGGCCAAC-3'

SEQ ID NO:2：1-N1006714-R：5'-TTAGAATTGTGGACCCAGCC-3'；

(2)扩增SSR分子标记2-N1204804的引物：

SEQ ID NO:3：2-N1204804-F：5'-CAGGCCAGCATCACAAGATA-3'

SEQ ID NO:4：2-N1204804-R：5'-ACTTGGAGTTGTGGACCCAG-3'；

(3)扩增SSR分子标记10-N1060688的引物：

SEQ ID NO:5：10-N1060688-F：5'-ACCCTTTGCTAGCTGTTGGA-3'

SEQ ID NO:6：10-N1060688-R：5'-TAATCAAAGGGCTACCCGTG-3'；

(4)扩增SSR分子标记11-N1995183的引物：

SEQ ID NO:7：11-N1995183-F：5'-CGGTCTTGGACATGACTTGA-3'

SEQ ID NO:8：11-N1995183-R：5'-CGGACTTAGCCTCAAGCAAC-3'；

(5)扩增SSR分子标记12-N2010170的引物：

SEQ ID NO:9：12-N2010170-F：5'-TTTTCCCCAACAACACTTCC-3'

SEQ ID NO:10：12-N2010170-R：5'-CTTGGTTGGATTTATGGAGGA-3'；

(6)扩增SSR分子标记22-N1388702的引物：

SEQ ID NO:11：22-N1388702-F：5'-AGGAGGAGGTAACCCCAAAT-3'

SEQ ID NO:12：22-N1388702-R：5'-TCCATCCAAGCATTGAAACC-3'；

(7)扩增SSR分子标记25-N3457413的引物：

SEQ ID NO:13：25-N3457413-F：5'-TTGGAGGGAAGAAGAAGGGT-3'

SEQ ID NO:14：25-N3457413-R：5'-TCACCCTCATATCCTCCTGG-3'；

(8)扩增SSR分子标记36-N1012200的引物：

SEQ ID NO:15：36-N1012200-F：5'-TGGGTTACTCAGCCGTCTCT-3'

SEQ ID NO:16：36-N1012200-R：5'-ACAGTCCAGGCCAACATCTC-3'；

(9)扩增SSR分子标记39-N1014795的引物：

SEQ ID NO:17：39-N1014795-F：5'-CGATCCACAATTCCTCCATT-3'

SEQ ID NO:18：39-N1014795-R：5'-CCCTGTTGGGACTCAGGTAA-3'；

(10)扩增SSR分子标记47-N1036425的引物：

SEQ ID NO:19：47-N1036425-F：5'-CAAGGAGAAGCTATTGAGGTTGA-3'

SEQ ID NO:20：47-N1036425-R：5'-AGTGCACACTTTGCCCTTCT-3'；

(11)扩增SSR分子标记212-N1001184的引物：

SEQ ID NO:21：212-N1001184-F：5'-CATCCGGTTGTTGTTTACCC-3'

SEQ ID NO:22：212-N1001184-R：5'-GGCCGACAGTGGTAGGTTTA-3'；

(12)扩增SSR分子标记215-N1003355的引物：

SEQ ID NO:23：215-N1003355-F：5'-CTGGCTGTAGCCAAAGCAGT-3'

SEQ ID NO:24：215-N1003355-R：5'-GATGCTGAAGGCTTGAAAGG-3'；

(13)扩增SSR分子标记216-N1006768的引物：

SEQ ID NO:25：216-N1006768-F：5'-ACCAAGCCAAGAAGGGATTT-3'

SEQ ID NO:26：216-N1006768-R：5'-ATTTCGCTCGCCCTAATTCT-3'；

(14)扩增SSR分子标记220-N1009344的引物：

SEQ ID NO:27：220-N1009344-F：5'-CCTGTCGGCCAAATTTCTTA-3'

SEQ ID NO:28：220-N1009344-R：5'-AGGGAGAATTGGCAAAGGTT-3'；

(15)扩增SSR分子标记221-N10141的引物：

SEQ ID NO:29：221-N10141-F：5'-GAACAATATGCAACGGGACA-3'

SEQ ID NO:30：221-N10141-R：5'-CGGTGACTCCATAACGAGTGT-3'。

2.一种卡特兰属SSR分子标记指纹码，其特征在于，所述的指纹码包括指纹图谱和分子身份证，所述的分子身份证SSR分子标记顺序为：1-N1006714、2-N1204804、10-N1060688、11-N1995183、12-N2010170、22-N1388702、25-N3457413、36-N1012200、39-N1014795、47-N1036425、212-N1001184、215-N1003355、216-N1006768、220-N1009344、221-N10141。

3.根据权利要求2所述的指纹码，其特征在于，所述的分子身份证为：

4.根据权利要求3所述的指纹码，其特征在于，所述的指纹图谱为：

5.一种卡特兰属筛选或种质资源鉴定试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1所述的SSR分子标记引物组合物或权利要求2所述的SSR分子标记指纹码。

6.权利要求1所述的SSR分子标记引物组合物、权利要求2所述的SSR分子标记指纹码或权利要求5所述的试剂盒在卡特兰属筛选或种质资源鉴定中的应用。

7.一种权利要求1所述的SSR分子标记筛选方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：以卡特兰属总DNA为模板，用超声波破碎仪随机打断成长度约350bp的片段，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成文库制备后，使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库至2ng/μL，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段进行检测，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。使用Illumina Hiseq 2500进行测序，原始下机数据首先采用FASTQC软件进行质量检测，去除接头及低质量碱基序列后，将双端reads按照重叠碱基使用Flash软件进行拼接，使用MISA筛选测序结果，保留有微卫星标记SSR的序列。

8.一种卡特兰属筛选或种质资源鉴定的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

(1)待测植株总DNA提取；

(2)以步骤(1)提取的总DNA作为模板进行SSR分子标记PCR扩增；

(3)毛细管电泳检测步骤(2)的PCR扩增产物，收集数据；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，

步骤(2)中所述的PCR扩增体系为：反应体系总体积为10μL，包括1.2μL DNA模板(50ng/μL)，1.0μL 10×BufferΙ缓冲液，0.1μL TAKARA HS Taq酶(5U/μL)，引物(5μM)0.6μL，0.8μL2.5mM dNTP，TP-M13(5μM)0.5μL，去离子水补足至10μL；

所述的PCR扩增反应程序：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；95℃30s，53℃30s，72℃30s，10个循环；60℃30min；4℃保存；

所述的PCR扩增体系引物包括如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:30所示的序列。

10.权利要求1所述的SSR分子标记引物组合物、权利要求2所述的SSR分子标记指纹码或权利要求5所述的试剂盒在卡特兰属亲缘关系分析、性状基因的定位和分子标记辅助育种中的应用。