CN102304587A - 一种快速鉴定水稻直立穗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速鉴定水稻直立穗的方法，属于农业生物工程技术领域。根据水稻弯穗品种与直立穗品种在直立穗基因qpe9-1核酸序列上的差异，设计合成了1对插入-缺失标记（Insert/Delection），InDel-E5。利用这对引物对待测水稻植株的DNA进行PCR扩增，分析标记的特征条带就能快速准确鉴定出水稻直立穗种质资源或育种群体中是否含有直立穗qpe9-1基因。这种鉴定方法还能区分qpe9-1基因的纯合体和杂合体，预测后代基因型，大大提高对直立穗基因的选择效率，加速育种进程。

Description

一种快速鉴定水稻直立穗的方法

一、技术领域

本发明涉及一种快速鉴定水稻直立穗的方法，属于农业生物技术工程技术领域，专用于含直立穗基因qpe9-1的水稻品种的鉴定和选育。

二、背景技术

水稻品种产量潜力的提高，归功于株型的改良。穗型是水稻理想株型研究的重要内容。杨守仁等在20世纪80年代初提出北方粳稻“短枝立叶，大穗直穗”的株型模式；即要求培育直立穗型粳稻品种。在粳稻育种中，由弯曲穗型到直立穗型是十分重要的株型转变。众所周知，历史上栽培的水稻品种穗型几乎都是弯曲穗型，自第一个大面积种植直立穗型品种辽粳5号育成后，直立穗型品种层出不穷，从长江流域到东北稻区都有直立穗型品种的分布。直立穗型品种普遍表现出较高的生物产量、干物质生产速率和产量潜力。直立穗型品种的培育和大面积应用，可认为是继矮化育种和杂种优势利用获得成功以来，我国水稻育种史上的第三个里程碑。因此直立穗型品种的选育也越来越受育种家们的重视。

在直立穗育种中，十分关键的问题是对直立穗性状的准确鉴定，传统的鉴定方法是在水稻成熟后对稻穗进行观察鉴定。由于直立穗基因在不同的遗传背景下表型差异较大，这种鉴定方法存在一定的局限性，加上直立穗的植株仅仅只占分离群体的1/4，传统的鉴定方法也浪费了大量人力、物力、材料。因此，如何准确、快速、简单地对直立穗进行鉴定是提高直立穗育种效率的重要保证。随着控制水稻直立穗基因的克隆，可以利用基因功能标记进行辅助选择加速直立穗基因在生产上的应用。

开发成本低廉且简便实用的基因功能标记是开展水稻分子标记辅助选择育种的基础和前提。直立穗基因的功能已经明确，由于直立穗在qPE9-1的第5外显子缺失了637个核苷酸并有12个核苷酸的插入，突变后形成一个蛋白质翻译终止密码子，造成qpe9-1仅编码了195个氨基酸，缺失了C端231个氨基酸。本研究根据水稻直立穗基因qpe9-1 的DNA序列差异设计了基于PCR的功能标记, 利用该标记对水稻品种资源材料进行了分析验证。并对直立穗分离群体进行鉴定，利用该方法可以快速、准确的鉴定出直立穗品种和单株。

 

三、发明内容

技术问题：本发明的目的是：开发水稻直立穗控制基因qpe9-1的InDel标记，利用本研究开发的基于PCR的经济实用型标记，可以快速准确地对直立穗控制基因qpe9-1进行基因型选择，主要用于qpe9-1基因的高效分子育种。

 

技术方案：

种快速鉴定水稻直立穗的方法，其特征在于：用1对特异扩增水稻直立穗控制基因qpe9-1的PCR分子标记引物InDel-E5，其序列为： 

InDel-E5-F：TCCAGGGATGTAATCATCTTTGTT 

InDel-E5-R：GGCTCCATATCTTCACGGTCTA

扩增水稻品种或分离群体的DNA，如果只能扩增出732bp的1条特征条带，说明该植株是含有直立穗基因的纯合体；如果只能扩增出1357bp的1条特征条带，说明该植株是不含有直立穗基因的纯合体，如果同时能扩增出732bp和1357bp的2条特征条带，说明该植株是含有直立穗基因的杂合体。

有益效果

本发明所提供的鉴定方法，是基于分子生物学手段获得的基因功能标记，具有如下优点：

（1）本发明的鉴定方法是基于基因标记的方法，因此可以在苗期进行选择，且不受环境和遗传材料背景的影响。

（2） 本发明的鉴定方法可用于qpe9-1基因的分子标记选择育种，并且可以区分qpe9-1基因的杂合体。由于该方法可以进行基因型选择，可以降低育种成本，提高育种效率。 

四、附图说明

图1 是直立穗功能标记InDel-E5对不同的水稻品种的PCR扩增后在1%的琼脂糖胶电泳结果（M为DNA ladder，DL2000;1-24为明恢63、镇恢084、9311、明恢81、南粳34、盐稻5号、苏粳5号、泗稻8号、泗稻10号、农垦57、农垦58、广陵、武育粳3号、武运粳23号、南粳45、徐稻3号、镇稻11号、盐稻15号、淮稻10号、宁粳1号、连粳7号、嘉花1号、辽粳 5、沈农265）

图2 是直立穗功能标记InDel-E5对F₂群体中不同单株PCR扩增后在1%的琼脂糖胶电泳结果（M为DNA ladder，DL2000;1-24为弯穗品种农垦57与直立穗品种南粳45的F₂中的部分单株）

五、具体实施方法

下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

（一）快速鉴定直立穗基因 qpe9-1 的基因型分子标记的获得

（1）供试材料

试验材料为生产上的推广品种，弯穗品种包括：明恢63、镇恢084、9311、明恢81、南粳34、盐稻5号、苏粳5号、泗稻8号、泗稻10号、农垦57；直立穗品种包括：武育粳3号、武运粳23号、南粳45、徐稻3号、盐稻8号、扬辐粳7号、镇稻11号、盐稻15号、淮稻10号、宁粳1号、连粳7号、嘉花1号、辽粳 5、沈农 265。

（2）水稻直立穗qpe9-1基因标记的获得

直立穗品种和弯曲穗相比在qPE9-1第5外显子缺失了637个核苷酸并有12个核苷酸的插入，突变后形成一个蛋白质翻译终止密码子，造成qpe9-1仅编码了195个氨基酸，缺失了C端231个氨基酸。根据其缺失位置两侧序列, 利用软件Primer Premier 5 设计引物序列, InDel-E5 -For 为5′-TCCAGGGATGTAATCATCTTTGTT-3′; InDel-E5-Rev 为5′-GGCTCCATATCTTCACGGTCTA-3′。对含有直立穗基因qpe9-1的品种DNA, 能够扩增出733 bp 的片段, 而不带qpe9-1的品种DNA 扩增出1357bp 片段。

（3） DNA提取

在水稻分蘖期或孕穗期取1克左右水稻叶片，利用SDS方法提取DNA。

DNA提取参照Dellapporta 等（1983）的方法，具体步骤如下：

①取200-300 mg新鲜水稻叶片(-20℃保存的叶片)，在-20℃预冷研钵中用液氮研磨成粉末。

②转移到1.5 m1离心管中。

③加入600u1 SDS提取液摇匀，65℃，温浴30 min，振荡3-4次。

④加入1/4体积(约100 ul) KAc，摇匀。

⑤加入1/2体积(约300-400 ul)的氯仿:异戊醇(体积比24: 1)，振荡器上充分摇匀(120rpm, 30min)。

⑥室温下6000-8000rpm离心15min，取上清。

⑦加入2倍体积(700u1左右)-20℃预冷的无水乙醇、摇匀，－20℃自由沉淀20 min。

⑧室温下12000rpm离心6 min，弃上清，沉淀用等体积(400 ul左右)70%乙醇洗涤10min。

⑨弃70%乙醇，DNA沉淀风干后，溶解于200 ul TE(1/10), 4℃保存备用。用0.8%的琼脂糖电泳检测DNA样品质量。

（4）PCR反应及电泳检测

PCR扩增反应体系为：模板DNA（约15 ng μL^-1）2 μL，引物（4 pmol μL^-1）2 μL，10×缓冲液（25 mmol L^-1）2 μL，MgCl2（25 mmol L^-1）1.2 μL，dNTP（2.5 mmol L^-1）0.4 μL，Taq DNA聚合酶（5 U μL^-1）0.2 μL，灭菌双蒸水12.2 Μl, 反应体系为20 μL。在Eppendorf PCR仪上进行扩增，反应条件为：（1）94℃预变性5 min；（2）94℃，1 min；56℃，45 s；72℃，1 min；共35个循环.（3）72℃再延伸10 min。反应产物在１%的琼脂糖上进行分离电泳，溴化乙锭染色，然后在紫外凝胶成像仪上观察并照相。

 

（二）对推广的水稻品种中直立穗的鉴定分析

水稻生产推广的品种中明恢63、镇恢084、9311、明恢81、南粳34、盐稻5号、苏粳5号、泗稻8号、泗稻10号、农垦57、农垦58、广陵香糯是典型的弯穗品种；而武育粳3号、武运粳23号、南粳45、徐稻3号、镇稻11号、盐稻15号、淮稻10号、宁粳1号、连粳7号、嘉花1号、辽粳 5、沈农265是典型的直立穗品种。提取这些品种的DNA，利用InDel-E5对这些材料进行PCR扩增结果见图1。可以看出所有的直立穗品种都能够扩增出732 bp的特征条带，其基因型为qpe9-1qpe9-1；所有的弯曲穗品种都能够扩增出1357bp的特征条带，其基因型为qPE9-1qPE9-1。

（三）对水稻直立穗分离群体中直立穗单株的鉴定分析

     2009年以弯穗品种农垦57与直立穗品种南粳45配制杂交组合，同年于海南种植杂交种F₁，于海南收获F₂种子。2010年在南京种植F₂群体。对F₂群体进行挂牌取样，提取单株DNA，利用InDel-E5对F₂群体进行PCR扩增结果见图2，结合成熟后穗部性状的调查结果发现：所有扩增出732 bp特征条带的单株都表现为直立穗，而扩增出1357bp的特征条带或者732 bp和1357bp特征条带的单株都表现出弯穗性状。

SEQUENCE LISTING

 

 

<110>  江苏省农业科学院

 

 

<120>  一种快速鉴定水稻直立穗的方法

 

 

<130>  0

 

 

<160>  2    

 

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

 

<210>  1

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  InDel-E5-F

<222>  (1)..(24)

<223> 

 

 

 

<400>  1

tccagggatg taatcatctt tgtt                                            24

 

 

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  InDel-E5-R

<222>  (1)..(22)

<223> 

 

 

 

<400>  2

ggctccatat cttcacggtc ta                                              22

Claims (1)

1.一种快速鉴定水稻直立穗的方法，其特征在于：用1对特异扩增水稻直立穗控制基因qpe9-1的PCR分子标记引物InDel-E5，其序列为： 

InDel-E5-F：TCCAGGGATGTAATCATCTTTGTT 

InDel-E5-R：GGCTCCATATCTTCACGGTCTA

扩增水稻品种或分离群体的DNA，如果只能扩增出732bp的1条特征条带，说明该植株是含有直立穗基因的纯合体；如果只能扩增出1357bp的1条特征条带，说明该植株是不含有直立穗基因的纯合体，如果同时能扩增出732bp和1357bp的2条特征条带，说明该植株是含有直立穗基因的杂合体。

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