CN107619880A - 一种高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记及其应用，所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记的编号为TM56686，其扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。所述的应用为所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记在鉴别获得母本起源的烟草单倍体中的应用。本发明所述的分子标记具有稳定、可靠、简便、快捷和低成本的特点，可高效、迅速淘汰二倍体和混倍体植株，获得母本起源的烟草单倍体植株。

Description

一种高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于烟草分子遗传育种技术领域，具体涉及一种高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记及其应用。

背景技术

普通烟草（Nicotiana tabacum L.；2n=48）是目前世界上广泛种植的经济作物之一，其单倍体是含有烟草配子体染色体数目（n=24）的植株。大量的研究和生产实践证明，通过单倍体的染色体加倍可获得纯合二倍体，如果获得的高度纯合的二倍体植株符合育种目标即可繁殖推广，相较于传统的常规育种从亲本组配、杂交到纯合品系的获得所需的时间要短，因此，单倍体育种不仅可以加快作物育种的进程，而且还具有省时省力和较高的科学预见性。与其他作物一样，在自然界中通过单纯的环境因素诱导出现烟草单倍体植株的频率极低，且出现的单倍体植株绝大多数不能成活，即使能存活下来，但使其稳定却是个十分漫长的过程，因此在烟草育种实践中难于直接利用。为了加速烟草单倍体在育种中的利用，目前普遍采用父本起源的单倍体诱导法，即诱导来源于父本的单倍体的常用方法为花药培养，具有步骤简便，单倍体苗易获得等优点，但花药培养方式获得的加倍单倍体，其品质及农艺性状等退化严重，同时利用父本来源的单倍体育成的烟草品种还存在产量降低等劣势（Wernsman E. A., and Rebeca C. R., Androgenetic vs. Gynogenetic DoubledHaploids of Tobacco. Crop Sci.,1989, 29: 1151-1155）。

目前母本起源的单倍体育种技术已在烟草育种实践中得到了应用（BURK L. G.,and Wernsman E. A., Maternal Haploids of Nicotiana tabacum L. from Seed.SCIENCE, 1979, 206(2):116; Lewis, R. S. and C. Rose, Identification ofTobacco Haploids on the Basis of Transgenic Overexpression of PAP1 fromArabidopsis thaliana. Crop Science, 2011, 51(4): 1491-1497.），但存在苗期单倍体鉴别困难的问题，即缺乏稳定、可靠、简便、快捷的手段或工具，在幼苗期鉴别出单倍体、二倍体和混倍体，同时高效、迅速淘汰二倍体和混倍体单株，获得母本起源的烟草单倍体植株，其严重阻碍了现有母本起源的烟草单倍体育种的发展。此外，基于母本起源的烟草单倍体诱导方法并结合流式细胞仪技术鉴别其倍性（CN 105993929 A）的方法虽能准确鉴别出待测烟株的倍性，但操作过程繁杂、条件极其严苛，且费时费力、成本高昂、效率低下。鉴于此，开发一种高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记并将其应用在烟草育种实践中是非常必要的。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记；第二目的在于提供所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记的编号为TM56686，其扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

本发明的第二目的是这样实现的，所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记在鉴别获得母本起源的烟草单倍体中的应用。

本发明以野生烟草Nicotiana africana（又名非洲烟草）为父本，分别与红花大金元（烤烟）、Beinhart1000-1（雪茄烟）和白肋21（白肋烟）三种不同类型的普通烟草为母本进行杂交，产生母本起源的烟草群体（后代植株），具体操作可从公开的专利申请“陈学军，曾建敏，焦芳婵，童治军，肖炳光，张谊寒，李永平. 一种母本起源的烟草单倍体及其育种方法（CN 105993929 A）”中获得。 采用本发明提供的标记TM56686（分别由核酸序列SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4组成），通过对待测母本起源的烟草群体中各单株基因组DNA的PCR扩增产物的分析，判断其是否存在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2核酸序列，从而高效鉴别单株的倍性，加速分子标记辅助选择（Marker Assistant Selection， MAS）在育种中对母本起源的烟草单倍体利用。

本发明所述标记具有稳定、可靠、简便、快捷、高效和低成本的特点，因此该分子标记可以作为鉴别母本起源的烟草单倍体在育种中的分子标记辅助选择应用。

附图说明

图1 是标记TM56686和不具备鉴别能力的标记在母本起源的烟草材料中的PCR扩增产物凝胶电泳图；

其中，A，具有高效鉴别能力的标记TM56686；B，不具有鉴别母本起源的烟草单倍体的标记；Fh，烤烟单倍体（红花大金元单倍体）；Fc，烤烟二倍体（红花大金元二倍体）；Ch，雪茄烟单倍体（Beinhart1000-1单倍体）；Cg，雪茄烟二倍体（Beinhart1000-1二倍体）；Bh，白肋烟单倍体（白肋21单倍体）；Bu，白肋烟二倍体（白肋21二倍体）；Af，N.africana（野生烟草）；M，100bp DNA ladder，长度片段分别为：200bp，300bp，400bp，500bp；

图2是标记TM56686在3份母本起源的烟草混倍体材料中的PCR扩增产物凝胶电泳图；

其中，MF，烤烟混倍体（红花大金元混倍体）；MC，雪茄烟混倍体（Beinhart1000-1混倍体）；MB，白肋烟混倍体（白肋21混倍体）；M，100bp DNA ladder，长度片段分别为：200bp，300bp，400bp，500bp；

图3 是利用流式细胞仪检测母本起源的烟草植株倍性图；

其中，A，为单倍体图，其峰值均在横坐标的250,000处；Fh，烤烟单倍体（红花大金元单倍体）；Ch，雪茄烟单倍体（Beinhart1000-1单倍体）；Bh，白肋烟单倍体（白肋21单倍体）；B，为二倍体图，其峰值均处在横坐标的500,000处；C，为混倍体图，其峰值处在横坐标的大于500,000处。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记的编号为TM56686，其扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

所述的分子标记所对应的引物序列为：

TM56686-F：5’- TGCTTAATGCGTAGGCTGTG -3’，

TM56686-R： 5’- GGTCCATATATTGCCAAATGC -3’。

本发明所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记的应用为所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记在鉴别获得母本起源的烟草单倍体中的应用。

所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记的应用，是以标记TM56686的引物扩增待检测母本起源的烟草植株基因组DNA，检测其PCR扩增产物，如果PCR扩增产物中仅含有254bp如SEQ ID No.1所示核酸序列即为母本起源的烟草单倍体；如果PCR扩增产物中仅含有286bp如SEQ ID No.2所示核酸序列即为二倍体；如果PCR扩增产物中同时含有254bp和286bp如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示核酸序列即为混倍体。

PCR扩增的反应体系为50uL，其中包含5.0 μL 的1× buffer （10 mM Tris-Cl,PH=8.4, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂），500 μM 的 dNTPs（Takara Biotechnology Co.Ltd., Dalian, China），1.5 μM 的上下游引物（Takara），2.5 U 的 rTaq 聚合酶（Takara），30-100ng模板DNA，最后用ddH₂O补齐50uL。

PCR扩增的反应条件为： 95℃预变性5分钟，30个循环（95℃变性30秒，60℃复性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5分钟，4℃保存。

下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体标记的编号为TM56686，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

所述的分子标记所对应的引物序列为：

TM56686-F：5’- TGCTTAATGCGTAGGCTGTG -3’，

TM56686-R： 5’- GGTCCATATATTGCCAAATGC -3’。

本发明所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体的标记的应用为所述的标记TM56686在鉴别母本起源的烟草植株的倍性中应用，即利用标记TM56686高效鉴别出待测的母本起源的烟草植株中单倍体、二倍体和混倍体，并迅速淘汰二倍体和混倍体，选择获得母本起源的烟草单倍体。

所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体的标记的应用是以标记TM56686的引物扩增待检测母本起源的烟草植株基因组DNA，检测其PCR扩增产物，如果PCR扩增产物中仅含有254bp如SEQ ID No.1所示核酸序列即为母本起源的烟草单倍体；如果PCR扩增产物中仅含有286bp如SEQ ID No.2所示核酸序列即为二倍体；如果PCR扩增产物中同时含有254bp和286bp如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示核酸序列即为混倍体。

实施例1

具有高效鉴别母本起源的烟草单倍体的标记的筛选与获得

一、实验材料

以野生烟草Nicotiana africana（又名非洲烟草）为父本，分别与红花大金元（烤烟）、Beinhart1000-1（雪茄烟）和白肋21（白肋烟）为母本进行杂交，产生母本起源的烟草单倍体群体，具体操作方法可从公开的专利申请“陈学军，曾建敏，焦芳婵，童治军，肖炳光，张谊寒，李永平. 一种母本起源的烟草单倍体及其育种方法（CN 105993929 A）”中获得。

二、标记分析

在获得待测母本起源的烟草植株生长的任意时期内，均可进行单株取样并进行基因组DNA的提取。但为了体现省时原则，本发明中所涉及的烟草植株DNA提取及利用标记的倍性鉴别，均在幼苗期进行。此外，DNA的提取、标记PCR体系的配制、PCR的扩增及产物的6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（6%-non-PAGE）检测等操作，均无特殊要求，只需按照常规方法进行即可。

在苗期按实施例1所述方法，利用已公开发表的约20000个烟草标记（Bindler, etal. A high density genetic map of tobacco (NicotianatabacumL.) obtained fromlarge scale microsatellite marker development.Theor. Appl. Genet., 2011, 123(2): 219-230; Tong ZJ, et al. Large-scale development of microsatellitemarkers in Nicotianatabacum and construction of a genetic map of flue-curedtobacco. Plant Breeding, 2012, 131: 674-680；Tong ZJ, et al. Large-scaledevelopment of SSR markers in tobacco and construction of a linkage map influe-cured tobacco. Breeding Science, 2016, 66: 381-390）对经过野生烟草Nicotiana africana为父本进行诱导形成的母本起源的烟草群体进行差异性筛选。也即利用公开的烟草标记对包含烤烟、雪茄烟和白肋烟三种类型的7份材料进行多态性分析。筛选的结果如图1A所示：在已公开的约20000个烟草标记中，仅获得1个标记TM56686具有高效鉴别母本起源的烟草单倍体能力，即其在三种类型烟草的单倍体（Fh、Ch和Bh）中均仅含有一个片段大小为254bp的特异性PCR扩增产物（序列如SEQ ID NO.1所示）；在三种类型烟草的二倍体（Fc、Cg和Bu）中均仅含有一个片段大小为286bp的特异性PCR扩增产物（序列如SEQID NO.2所示）；同样如图2所示，在三种类型烟草的混倍体（MF、MC和MB）中，则同时含有片段为254bp和286bp的特异性PCR扩增产物（序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示）。而图1B所示的结果，则是剩余的标记在母本起源的烟草单倍体与其自身二倍体间没有多态性，即PCR扩增产物在二者间完全一致。

以上结果表明，标记TM56686具有鉴别母本起源的烟草单倍体与其二倍体和混倍体的潜力，但需进一步通过实验验证。

实施例2

利用流式细胞技术对标记TM56686的实验结果进行验证

一、实验材料

与实施例1中的实验材料一致。

二、流式细胞术单倍体鉴别

相关操作按照仪器的使用说明书中的实验操作流程进行。

其结果如图3所示，图中的纵坐标轴C值代表测定细胞数的相对值，横坐标轴F值代表荧光的通道值，峰值的位置反应的是测试样品的倍性。结果表明，作为对照的二倍体烟草植株的峰值位于横坐标的500,000处 (图3 B) ，三个不同类型烟草单倍体（Fh、Ch和Bh）的峰值位于横坐标的250,000处（图3 A），而峰值出现在横坐标的大于500,000处的检测植株则为混倍体（图3 C）。

上述利用流式细胞技术检测母本起源的烟草单倍体结果，与利用标记TM56686（由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4序列组成）在苗期对待测烟草植株中的倍性鉴别完全吻合，其证实了本发明公开的标记TM56686（由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4序列组成）不仅具有鉴别母本起源的烟草单倍体能力，而且还具有稳定、可靠、简便、快捷和低成本的特点，可高效、迅速淘汰二倍体和混倍体单株，获得母本起源的烟草单倍体植株，进而加快烟草育种进程。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记及其应用

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 254

<212> DNA

<213> 254bp片段核苷酸序列

<400> 1

acaagaaagc tgggtctcaa acaagattgt tatctatgtt atagtgaact tctgctttag 60

atgatgctct tggaaatttt gttatctctg caagtacctt tagtctcgtt tcagcaaata 120

cttttccttt gttgggctgg attagcattt tcaccagcat cggagacttg gctaatagaa 180

gcttgataag ctcaatttca ggctttgtgc ctgtaatacc ttcaagatta acaaccctga 240

ggtgattcag tgtc 254

<210> 2

<211> 286

<212> DNA

<213> 286bp片段核苷酸序列

<400> 2

caaacaagat tgttatctat gttatagtga acttctgctt tagatgatgc tcttggaaat 60

tttgttatct ctgcaagtac ctttagtctc gtttcagcaa atacttttcc tttgttgggc 120

tggattagca ttttcaccag catcggagac ttggctaata gaagcttgat aagctcaatt 180

tcaggctttg tgcctgtaat accttcaaga ttaacaaccc tgaggtgatt cagtgtcaca 240

tctgaaaagc ttgcaggaat atcattgaca acatcaccgg gcacag 286

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> TM56686-F

<400> 3

tgcttaatgc gtaggctgtg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> TM56686-R

<400> 4

ggtccatata ttgccaaatg c 21

Claims (6)

1.一种高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记，其特征在于所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记的编号为TM56686，其扩增产物核苷酸序列分别为SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记，其特征在于所述的分子标记所对应的引物序列为：

TM56686-F：5’- TGCTTAATGCGTAGGCTGTG -3’，

TM56686-R： 5’- GGTCCATATATTGCCAAATGC -3’。

3.一种权利要求1或2所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记的应用，其特征在于所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记在鉴别获得母本起源的烟草单倍体中的应用。

4.根据权利要求3所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记的应用，其特征在于是以标记TM56686的引物扩增待检测母本起源的烟草植株基因组DNA，检测其PCR扩增产物，如果PCR扩增产物中仅含有254bp如SEQ ID No.1所示核酸序列即为母本起源的烟草单倍体；如果PCR扩增产物中仅含有286bp如SEQ ID No.2所示核酸序列即为二倍体；如果PCR扩增产物中同时含有254bp和286bp如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示核酸序列即为混倍体。

5.根据权利要求4所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记的应用，其特征在于PCR扩增的反应体系为50uL，其中包含5.0 μL 的1× buffer （10 mM Tris-Cl, PH=8.4, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂），500 μM 的 dNTPs（Takara Biotechnology Co. Ltd.,Dalian, China），1.5 μM 的上下游引物（Takara），2.5 U 的 rTaq 聚合酶（Takara），30-100ng模板DNA，最后用ddH₂O补齐50uL。

6.根据权利要求4所述的高效鉴别母本起源的烟草单倍体的分子标记的应用，其特征在于PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5分钟，30个循环（95℃变性30秒，60℃复性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5分钟，4℃保存。