CN108531644B - 与陆地棉as98矮化性状紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了一种与陆地棉AS98矮化性状紧密连锁的分子标记及应用，该分子标记位于D12染色体上，使用该分子标记的特异性引物对能扩增出120bp的产物，所述特异性引物对正向引物序列如SEQ ID No.1所示，所述特异性引物对反向引物序列如SEQ ID No.2所示。本发明找到了鉴别陆地棉矮化材料AS98突变体及野生型的一对引物。在陆地棉AS98与野生型LHF10构建的F2群体中能解释90％以上的表型变异。可用于陆地棉AS98矮化品种的分子标记辅助选择以及图位克隆，为揭示棉花矮化机理、培育矮化新品种提供一定的理论依据。

Description

与陆地棉AS98矮化性状紧密连锁的分子标记及应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种与陆地棉AS98矮化性状紧密连锁的分子标记。
背景技术
植物矮化是重要的农艺性状。矮化品种具有抗倒伏能力强、适宜密植及机械化管理等特点,对于减少劳动强度、提高肥料利用率和提高产量具有重要意义，矮化突变体在矮化育种中具有重要的利用价值，同时也是研究植物茎的生长及激素调控的重要基因资源。
棉花具有无限生长习性，植株高大。当前，世界上大多数产棉国，广泛采用化学抑制剂缩节胺控制棉花生长，使株高普遍控制在90-100cm左右。尤其是自我国新疆“密、矮、早”种植技术的成功以来，使用化控棉花株高已经成为新疆棉花增产的重要措施。但大量喷施化学抑制剂缩节胺费工费事，还带来严重的环境污染问题。棉花是重要的经济作物之一，在世界及我国国民经济中占重要地位，因此，充分利用自然矮源，选育矮杆品种仍然是提高产量、提高农业生产效率的重要措施。
本课题1998年在陆地棉廊黄1号与野生棉黄褐棉杂交选育12世代的材料LHF10中，发现一个自然矮化突变体，1998-2005年通过自交纯化，暂命名“AS98”。通过构建分离群体实现了AS98矮化性状的粗定位，但并未找到与矮化性状紧密连锁的分子标记。因此在利用陆地棉品种AS98实现棉花的矮化育种中，非常有必要开发一种与矮化性状紧密连锁的分子标记，以在苗期对AS98矮株实现选择，从而加快育种进程。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种与陆地棉矮化性状紧密连锁的分子标记。
本发明的技术方案为：与陆地棉AS98矮化性状紧密连锁的分子标记，该分子标记位于D12染色体上，使用该分子标记的特异性引物对能扩增出120bp的产物，所述特异性引物对正向引物序列为：5'-TCCTCCAATAAAGTTTGTCCCTC-3'(SEQ ID No.1)；所述特异性引物对反向引物序列为：5'-TATAGACTGGAAGCGCGTGAG-3'(SEQ ID No.2)。
与陆地棉AS98矮化性状紧密连锁的分子标记引物在棉花遗传育种上的应用。
进一步地，所述棉花遗传育种是指陆地棉AS98矮化性状鉴定。
进一步地，上述所述应用的具体方法为：提取待鉴定棉花基因组DNA，用序列如SEQID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对提取的DNA进行PCR扩增，如果能扩增出120bp的产物，则表明待鉴定棉花为陆地棉AS98矮化植株。
进一步地，上述所述具体方法中，PCR扩增体系为：基因组DNA50ng，SEQ ID No.1所示的引物、SEQ ID No.2所示的引物均为0.5μl，2×Taq MasterMix酶10μl，ddH2O根据加入的DNA模板的量调节，总反应体系为20μl；PCR扩增程序为：①95℃预变性5min；②95℃变性30s；③53℃退火30s；④72℃延伸30s；其中②-④10个循环；⑤95℃再变性30s；⑥56℃退火30s；⑦72℃延伸30s；其中⑤-⑦20个循环；⑧72℃终延伸7min；⑨4℃保存扩增产物。
本发明与陆地棉AS98矮化性状紧密连锁的分子标记是通过以下方法获得的。
(1)将矮化突变体AS98与正常高株LHF10进行杂交，获得F1代，然后自交产生包含有225个单株的F2；
(2)提取亲本及F2群体单株幼嫩叶片的基因组DNA；
(3)对基因组重测序的数据分析发现在AS98矮株和高株之间存在一个结构变异，即在AS98矮株植株中存在一个串联重复而高株中没有，我们利用这个结构变异设计了7对引物经筛选其中两对引物在AS98矮株中成功扩增出产物且条带单一而在高株中未能扩增出任何的产物；
(4)利用其中的一对引物在亲本及F2分离群体中进行扩增，扩增产物经非变性的聚丙烯凝胶电泳统计带型。
本发明得到的与陆地棉AS98矮化性状紧密连锁的分子标记引物对(序列如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2)在F2分离群体中有带的单株对应的表型是矮株，没有带的单株对应的是正常高株。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明找到了鉴定陆地棉AS98矮化单株的一对引物。在F2分离群体中能解释90％以上的表型变异。可用于陆地棉AS98的分子标记辅助选择以及图位克隆，为棉花矮化机理研究、棉花矮化品种的选育提供一定的理论依据。
附图说明
图1为AS98矮株与正常高株之间结构差异示意图以及设计引物位置。
图2为利用亲本AS98和正常高株LHF10对设计的引物筛选图。
图3为利用分子标记引物在F2分离群体中扩增结果。其中“P1”代表矮株AS98，“P2”代表正常高株LHF10，“E”代表泳道里没有样品，“D”代表该单株表现为矮株，“H”代表该单株表现为高株，“D”和“H”都表示单株的基因型与表型一致，“U”代表单株的基因型与表型不一致。
具体实施方式
实施例1
(1)将陆地棉矮化品种AS98作为父本，将陆地棉正常高株LHF10作为母本，杂交获得F1代，再经自交得到包含225个单株的F2。
(2)用CTAB法提取亲本、F2群体单株幼嫩叶片的基因组DNA。
(3)用设计好的7对引物(表1)对两亲本AS98和LHF10进行扩增，扩增结果显示这7对引物中14k-1、14k-2和14k-3在AS98中的扩增产物条带单一且在LHF10中无扩增产物(图2)。随后利用14k-1引物作为分子标记在F2分离群体中进行基因型分析，结果表明凡是扩增出产物的单株其表型性状均表现为矮化，凡是未能扩增出产物的单株其表型性状均表现为高株，F2群体225个单株中只有9个单株不符合这种规律(图3)，这说明该标记与矮化性状紧密连锁。
(4)实验过程中所用的DNA聚合酶2×Taq MasterMix酶
(5)实验过程的反应体系：
Figure GDA0002403769270000031
(6)实验过程所用PCR反应程序：
Figure GDA0002403769270000032
上述结果说明本发明筛选的引物对：14k-1(见表1)可作为与陆地棉AS98矮化性状紧密连锁的分子标记，可以用于矮化性状的分子标记辅助选择以及棉花矮化品种的选育。
表1 7对引物信息
Figure GDA0002403769270000033
Figure GDA0002403769270000041
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
序列表
<110> 申请人名称：中国农业科学院棉花研究所
<120> 与陆地棉AS98矮化性状紧密连锁的分子标记及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcctccaata aagtttgtcc ctc 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatagactgg aagcgcgtga g 21

Claims (4)

1.与陆地棉AS98矮化性状紧密连锁的分子标记引物，其特征在于，该分子标记引物正向引物序列如SEQ ID No.1所示，该分子标记引物反向引物序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的与陆地棉AS98矮化性状紧密连锁的分子标记引物在陆地棉AS98矮化性状鉴定上的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，方法为：
提取待鉴定棉花基因组DNA，用序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对提取的DNA进行PCR扩增，如果能扩增出120bp的产物，则表明待鉴定棉花为陆地棉AS98矮化植株。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，PCR扩增体系为：基因组DNA 50 ng，SEQ IDNo.1所示的引物、SEQ ID No.2所示的引物均为0.5μl，2×Taq MasterMix酶10μl，ddH2O根据加入的DNA模板的量调节，总反应体系为20μl；PCR扩增程序为：①95℃预变性5min；②95℃变性30s；③53℃退火30s；④72℃延伸30s；其中②-④10个循环；⑤95℃再变性30s；⑥56℃退火30s；⑦72℃延伸30s；其中⑤-⑦20个循环；⑧72℃终延伸7min；⑨4℃保存扩增产物。
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一个新的棉花矮化突变体基因的精细定位及功能初步验证;季高翔;《中国农业科学院学位论文》;20190115;全文 *
基于重测序开发的InDel标记定位陆地棉矮化突变体;季高翔等;《棉花学报》;20181115;第30卷(第6期);448-454 *

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