CN104560983B - 与黄瓜抗白粉病紧密连锁的两个snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基因工程技术领域的与黄瓜白粉病抗性紧密相关的分子标记，提供了两个与黄瓜抗白粉病QTL紧密连锁的SNP标记，分别命名为Chr6SNP‑pm01和Chr6SNP‑pm02。Chr6SNP‑pm01位于黄瓜第6号染色体4,450,551处，Chr6SNP‑pm02位于黄瓜第6号染色体6,822,412处。本发明利用变异组学与群体遗传学的方法筛选到与黄瓜抗白粉病紧密连锁的SNP标记，通过测序和转化为dCAPS标记的方法检测黄瓜基因型，根据基因型即可判断黄瓜抗白粉病差异性，从而加速黄瓜抗白粉病品系选育进程。同时，这两个SNP标记也为黄瓜抗白粉病基因的克隆奠定了基础。

Description

与黄瓜抗白粉病紧密连锁的两个SNP标记及其应用

技术领域

本发明属于基因工程及分子生物学领域，具体的说，涉及一种与黄瓜抗白粉病紧密连锁的SNP标记。

背景技术

黄瓜(Cucumis sativus L.)是葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属(Cucumis)一年生蔓生草本植物，原产温暖湿润的喜马拉雅山南麓的印度北部地区，传入我国栽培已有2000多年的历史。黄瓜作为世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我国主栽蔬菜作物之一。据世界粮农组织(FAO)统计，2012年我国黄瓜栽培总面积达115.25万公顷，年产量达4804.88万吨，分别占世界总量的54.63％和73.77％。黄瓜生产中面临多种病害威胁，其中白粉病是最为严重的病害之一，常造成严重的产量与质量损失。黄瓜白粉病由专性寄生菌(Podosphaeraxanthii)引起的真菌性病害，主要侵染植株的叶片和茎。白粉病在黄瓜田间生长的各个时期均可发生，在苗期发病可造成黄瓜生长减弱，在开花期发病可导致后期黄瓜减产20～40％，在结瓜期发病，会导致植株叶片枯黄，果实生长缓慢，植株早衰，严重影响果实的品质和产量。使用化学药剂防治不仅浪费人力物力，污染环境，还使果实农药残留增加。传统抗病育种周期长，需要大量及多代配置杂交组合及接种白粉病观察。

随着分子生物学技术的飞速发展，分子育种技术大大加快了抗病育种的进程，显著缩短了抗病新品系的选育周期。分子育种的前提是获得与目标性状密切相关的分子标记或功能基因。利用分子标记辅助选择目标性状，可提高选择效率，缩短育种周期。虽然白粉病是重要的病害之一，然而对于抗白粉病基因的定位研究相对薄弱。目前的报道主要集中于抗白粉病QTL鉴定，尚未有SNP标记用于黄瓜育种性状辅助选择的报道。Sakata等(2006)检测到6个与黄瓜抗白粉病相关的QTL(Chr1、Chr5、Chr16、Chr7)(所用标记：STS)。Hofstede和de Ruiter等(2008)检测到两个黄瓜抗白粉病QTL，分别为与叶片抗性相关的pm-1，以及与下胚轴抗性有关的pm-h(所用标记：SSR)。Zhang等(2011)鉴定到三个位于Chr5的QTLs(pm5.1,pm5.2and pm5.3)，以及1个位于Chr6的QTL(pm6.1)(所用标记：SSR)。He等(2013)使用WI 2757和True Lemon获得的F_2:3群体对黄瓜白粉病基因进行定位，构建了包含七个连锁群共610.4cM的连锁图谱，在第5连锁群上检测到两个主效QTL(pm5.1,pm5.2)与两个微效QTL(pm3.1,pm4.1)(所用标记：SSR)。

发明内容

本发明提供了一种与黄瓜抗白粉病QTL紧密连锁的SNP标记及提供用于扩增上述SNP标记的引物对。

本发明所述的两个与黄瓜抗白粉病紧密连锁的SNP标记，是Chr6SNP-pm01和Chr6SNP-pm02，其中Chr6SNP-pm01位于黄瓜基因组第6号染色体4,450,551处Chr6SNP-pm02位于黄瓜基因组第6号染色体6,822,412处。Chr6SNP-pm01处碱基为G的黄瓜高抗白粉病，此处为A的黄瓜高感白粉病。Chr6SNP-pm02处碱基为C的黄瓜高抗白粉病，此处为T的黄瓜高感白粉病。

本发明还提供了一组用于检测上述与黄瓜抗白粉病相关的SNP的dCAPS标记的引物对，包括Chr6SNP-pm01的上游引物5′-GGTCGCTTAAGAGCAGTTCAATTTA-3′(SEQ ID NO.1)，反向引物5′-GTCGAAATGACTCAACAACG-3′(SEQ ID NO.2)；Chr6SNP-pm02的正向引物5′-TCCATCCGCTTATCAATC-3′(SEQ ID NO.3)，反向引物5′-TGGCGGTGCTGCCGCCGCTCCACTT-3′(SEQ ID NO.4)。

本发明还公开了所述的SNP及衍生的dCAPS引物在黄瓜抗白粉病分子标记辅助育种中的应用。

本发明所述的应用，具体方法是：

1)提取待检测黄瓜基因组DNA；

2)以待检测黄瓜基因组DNA为模板，利用上述SNP衍生的dCAPS引物引物对，进行PCR扩增反应；

3)使用AluI限制性内切酶酶切Chr6SNP-pm01引物对所扩增的PCR产物，使用DdeI限制性内切酶酶切Chr6SNP-pm02引物对所扩增的PCR产物酶切；

4)经上述限制性内切酶酶切反应后，产物经琼脂糖电泳，如条带与Jin5-508一致，则为抗白粉病品系；如条带与D8一致，则为感白粉病品系。

本发明利用变异组学与群体遗传学的方法筛选到与黄瓜抗白粉病紧密连锁的SNP标记，通过测序和转化为dCAPS标记的方法检测黄瓜基因型，根据基因型即可判断黄瓜抗白粉病差异性，从而加速黄瓜抗白粉病品系选育进程。同时，这两个SNP标记也为黄瓜抗白粉病基因的克隆奠定了基础。

附图说明

图1是亲本及各级病叶(P1：感白粉病亲本，P2：抗白粉病亲本JIN5-508)

图2是部分SSR标记亲本间(P1：感白粉病亲本，P2：抗白粉病亲本JIN5-508)聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性。

图3是SSR标记在F₂中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测。

图4是SNP标记在亲本间的琼脂糖凝胶电泳多态性检测。

图5是Chr6SNP-pm01(图5左)和Chr6SNP-pm02(图5右)在F₂中的琼脂糖凝胶电泳多态性检测。

图6是基于F₂重组株对黄瓜抗白粉病QTL进行精细定位(×:重组株)。

图7是Chr6SNP-pm01在八个黄瓜品系中的琼脂糖凝胶电泳多态性检测(P1:感白粉病亲本，P2：抗白粉病亲本JIN5-508,1:LL017，2:CJ223，3:EP56，4:SD41；5:R210，6:EP112，7:GY114，8:JD65)。

图8是Chr6SNP-pm02在八个黄瓜品系中的琼脂糖凝胶电泳多态性检测(P1:感白粉病亲本，P2：抗白粉病亲本JIN5-508,1:LL017，2:CJ223，3:EP56，4:SD41；5:R210，6:EP112，7:GY114，8:JD65)。

具体实施方式

实施例一

一、遗传分离群体的构建与交换单株的鉴定

1、F₂群体的构建

D8(母本)，高感白粉病自交系；引自美国北卡罗来纳大学，茎杆粗壮，节间长到12-14节时顶端以一束雌花封顶而停止生长，叶片暗绿色，果实短，果肉厚，果皮暗绿色；JIN5-508(父本)，高抗白粉病；为蔓生品系，植株高大，节间长，系从国内品种“津春5号”(天津科润农业科技股份有限公司)连续自交分离8代，在每一个子代中选择高抗白粉病的植株，自交至第8代性状不再分离而获得的高抗黄瓜白粉病、长果型自交系。本实施案例利用这两个亲本配置了杂交组合F₁，F₁自交产生F₂群体。在121株F₂群体中，鉴定白粉病病情指数。病情指数的鉴定方法参照Qi等(2010)的实验标准进行：

如图1：

0级：整张叶片无粉斑；

1级：有少数粉斑，但粉斑面积少于叶片面积的1/3；

2级：粉斑增多占全叶面积的1/3-2/3；

3级：粉斑逐渐连接成片，所占面积超过叶面积的2/3；

4级：粉斑铺满整张叶片，碰触叶片，白粉振落；

5级：粉斑布满整张叶片，叶片开始黄化，逐渐枯死。

计算病情指数：

公式为:DI＝∑(sini)/5N×100

DI＝病情指数,si＝发病级别,ni＝相应发病级别的叶数，

i＝病情分级的各个级别,N＝调查总叶数

二、抗白粉病基因的初步定位

1、黄瓜基因组DNA的提取

使用CTAB法提取黄瓜亲本及F₂群体基因组DNA。

2、多态性SSR引物筛选

SSR引物来自于国际黄瓜基因组计划(CUGI)。详细信息可参见Ren等2009年在PLoSONE上发表的文章《An Integrated Genetic And Cytoenetic Map of Cucumber Genome》。SSR的PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性45s，68-58℃退火1min(每个循环降低2℃)，72℃延伸1min，共6个循环；94℃变性30s，58-50℃退火1min(每个循环降低1℃)，72℃延伸1min，共8个循环；72℃延伸1min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共20个循环；72℃延伸7min；4℃保存。采用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR的特异性。共选用998对SSR引物在亲本间进行多态性标记筛选，共有918对引物可以扩增出稳定条带，其中158对引物在两亲本中表现出特异性，多态率为17.2％。图2为部分SSR引物在亲本间扩增条带电泳图。对亲本间具有多态性的158对SSR引物在F₂群体中进行多态性验证，其中共83对引物在F₂群体中表现出特异性，49对多态性引物可用于构建遗传图谱，图3为SSR标记在F₂中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测条带。

3、抗白粉病QTL初步定位

结合F₂每个单株病情指数统计值，利用复合区间作图法(CIM)对黄瓜抗白粉病基因进行定位分析，检测到1个QTL，位于第6连锁群上，QTL的LOD值为3.4614，侧翼标记为SSR03527、SSR16451，两个标记图距为4cM，表型变异率为17.01％，加性效应为-7.0079。

4、SNP分子标记的开发及鉴定

使用Highseq2500仪对双亲(D8和Jin5-508)进行基因组DNA重测序。据重测序结果以及黄瓜基因组信息，在两侧翼标记SSR03527、SSR16451之间共候选50个SNPs。候选SNPs确定之后，使用dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.htm)和PrimerPremier 5.0分别设计衍生的酶切多态性扩增序列(dCAPS)引物的错配引物和另一侧的引物，从而完成SNPs向dCAPS标记的转化。错配引物设计原则为，长度23-25bp，错配碱基数为1个。另一侧引物设计原则为，长度18-22bp，目标条带长度150-200bp。PCR扩增体系使用25μL扩增体系，包含1U Taq酶，1.5ul模板DNA，2ul dNTP，2.5ul引物，2.5ul 10×PCRbuffer(含Mg2+)，加ddH₂O至25μL。PCR扩增程序为：94℃3min，循环过程为94℃30s、退火30s、72℃1min、35个循环，最后72℃延伸10min。，退火温度52℃。在两亲本间进行PCR扩增，经限制性内切酶酶切后使用琼脂糖凝胶电泳检测，50对SNPs在亲本间表现特异性的共14对。图4为部分SNPs在亲本间呈现多态性的检测条带。

三、抗白粉病基因精细定位

利用上述14对SNP标记鉴定F₂群体(1326株)，获得高抗白粉病的重组株共44株。用在亲本中表现特异性的多态性SNP标记在重组株中进行特异性检测，最终将黄瓜抗白粉病基因精细定位到两个SNP标记，分别命名为Chr6SNP-pm01和Chr6SNP-pm02(图5，左侧为Chr6SNP-pm01，右侧为Chr6SNP-pm02)，两个标记的物理距离为1.475Mbp(图6)。利用这两个SNP标记定位的QTL有助于黄瓜抗白粉病基因的最终克隆。

实施例二：

(1)选取8个已知白粉病抗性的黄瓜品系，其中4个抗白粉病(R210，EP112，GY114，JD65)，4个易感白粉病(LL017，CJ223，EP56，SD41)；

(2)分别提取上述八个品系及亲本基因组DNA，使用Chr6SNP-pm01和Chr6SNP-pm02所衍生的dCAPS标记进行PCR扩增，再用AluI限制性内切酶酶切Chr6SNP-pm01引物对所扩增的PCR产物，使用DdeI限制性内切酶酶切Chr6SNP-pm02引物对所扩增的PCR产物；

(3)琼脂糖凝胶电泳结果表明：抗病性鉴定与双酶切结果一致(图7，图8)，上述两个SNP标记可以将抗白粉病与易感白粉病品系区分开。

Claims (3)

1.Chr6SNP-pm01和Chr6SNP-pm02作为与黄瓜抗白粉病紧密连锁的SNP标记在黄瓜抗白粉病分子标记辅助育种中的应用，其中所述Chr6SNP-pm01位于黄瓜基因组第6号染色体4,450,551处，Chr6SNP-pm02位于黄瓜基因组第6号染色体6,822,412处；Chr6SNP-pm01处碱基为G的黄瓜高抗白粉病，此处为A的黄瓜高感白粉病，Chr6SNP-pm02处碱基为C的黄瓜高抗白粉病，此处为T的黄瓜高感白粉病。

2.一组用于检测与黄瓜抗白粉病紧密连锁的SNP的引物对，其特征在于包括Chr6SNP-pm01的正向引物5′-GGTCGCTTAAGAGCAGTTCAATTTA-3′，反向引物5′-GTCGAAATGACTCAACAACG-3′；Chr6SNP-pm02的正向引物5′-TCCATCCGCTTATCAATC-3′，反向引物5′-TGGCGGTGCTGCCGCCGCTCCACTT-3′。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待检测黄瓜基因组DNA；

2)以待检测黄瓜基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物对，进行PCR扩增反应；

3)使用AluI限制性内切酶酶切Chr6SNP-pm01引物对所扩增的PCR产物，使用DdeI限制性内切酶酶切Chr6SNP-pm02引物对所扩增的PCR产物酶切；

4)经上述酶酶切后电泳，如条带与Jin5-508一致，则为抗白粉病品系；如条带与D8一致，则为感白粉病品系。