CN103789419A - 鉴别水稻光温敏核不育基因p/tms12-1等位基因类型的共显性标记引物组及其应用 - Google Patents

鉴别水稻光温敏核不育基因p/tms12-1等位基因类型的共显性标记引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴别水稻光温敏核不育基因p/tms12-1等位基因类型的共显性标记引物组及其应用，所述共显性标记引物组的碱基序列分别如SEQ ID NO.4～7所示。本发明还提供了所述的共显性标记引物组在鉴别水稻光温敏核不育基因p/tms12-1等位基因类型中的应用。本发明的共显性标记引物能够特异性的对水稻基因组DNA进行标记鉴定，检测水稻材料基因组DNA中p/tms12-1的等位基因类型，检测的准确性高，与传统的酶切和测序的方法相比，具有成本低、操作简单的特点。

Description

鉴别水稻光温敏核不育基因p/tms12-1等位基因类型的共显性标记引物组及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学及水稻育种领域，涉及一种鉴别水稻光温敏核不育基因p/tms12-1等位基因类型的共显性标记引物组及其应用。 
背景技术
水稻是我国乃至世界上最重要的粮食作物之一，通过两系法及三系法培育杂交水稻新品种、提高水稻产量一直是水稻育种学家的重要目标。利用光温敏不育系培育的两系杂交水稻免除了保持系，在不同的光温条件下既可以作为不育系与恢复系杂交制种，又可以自身繁殖，从而简化了繁种制种程序，降低了杂交种子生产成本。更重要的是，两系杂交稻的配组较自由，选配到优良组合的机率较高。因此，两系杂交育种是我国在水稻杂种优势利用的重大突破。 
两系法杂交稻培育的关键之一是光温敏核不育系的培育，现有的光温敏核不育系的培育多采用冷水串灌繁殖、温室控温控光及海南冬繁等繁殖方式，大面积生产应用中存在两大问题，一是水稻光温敏不育系不育起点温度漂变导致的制种不安全，不育系经3-4代繁殖，不育系中部分植株的不育起点温度会上升，繁种产量越低，不育起点温度上升越快。生产中由于不育系不育起点温度上漂而导致制种失败或种子纯度不达标的事件经常出现。二是水稻光温敏不育系繁殖安全性差、产量低、质量不好。因此，开发新的水稻光温敏核不育系的选育方法，加速不育系选育周期及制种质量，对两系杂交水稻的快速发展具有重要意义。 
近来我国科学家成功克隆了控制水稻光温敏核不育基因p/tms12-1，p/tms12-1是一个非编码RNA基因，它的原始转录本经过至少2次加工产生一个小RNA。与正常水稻品种相比，温敏不育水稻在该小RNA序列内存在一个单碱基突变（第789位碱基C→G的突变），这个单碱基突变是在籼稻产生温敏不育性和在粳稻产生光敏不育性的共同原因(Ding et al. PNAS,2012,109:2654-2659；Zhou et al.Cell Research,2012,22:649-660)。在正常水稻中，野生型P/TMS12-1的表达抑制了温敏或光敏不育的发生。而温敏和光敏不育水稻中，p/tms12-1的该突变影响了小RNA的表达水平及其可能与靶基因的互作能力而产生雄性不育。 
水稻p/tms12-1基因的克隆为水稻光温敏核不育系的分子标记辅助选择育种提供了技术基础，能够帮助育种家加快不育系的选育过程，因此，在水稻育种上具有重要的利用价值。在利用含有p/tms12-1的光温敏核不育基因的不育系来配制杂交组合选育水稻不育系的过程中，单纯通过育性鉴定来选育不育系通常需要海南加代，育种周期较长。同时，目前广为应用的“培矮64S”等不育系存在一个明显的问题，即随着种植时间的增加，该品种的“不育起点温度”逐年增加，给育种带来了很大的风险，而导致这一问题的原因尚不清楚。通过p/tms12-1基因的分子标记筛选，有助于确认控制水稻温敏性状的具体基因序列，借助分子生物学手段解决“培矮64S”等不育系不育起点温度逐年增高的问题，使其育种价值大大提高。 
在利用p/tms12-1进行水稻不育系的育种过程中，其杂交或回交后代中会分离出该基因的不同基因型单株，这就需要对杂交或回交后代植株进行单株基因型的检测，选择出p/tms12-1纯合或杂合的单株，用于随后进一步的回交或自交。由于在DNA序列上，p/TMS12-1和其等位基因p/tms12-1仅存在单个核苷酸的差异，在检测p/tms12-1基因时，通常使用PCR对p/tms12-1或p/TMS12-1基因进行扩增后，用限制性内切酶RsaⅠ对扩增产物进行酶切后电泳（如公开号为CN103146696A的中国专利文献所涉及的方法），或者对扩增产物进行直接测序的方法，去检测p/tms12-1或p/TMS12-1基因。但是，酶切和测序的两种方法耗时太长、且成本较高。 
因此，有必要开发水稻光温敏核不育基因(p/tms12-1)/(p/TMS12-1)的共显性标记，将其用于光温敏核不育基因p/tms12-1的分子鉴定，以达到缩短不育系育种周期，简化操作步骤、降低检测成本等目的。 
发明内容
本发明提供了一种共显性标记引物组，特异性好，能够准确、快速的鉴别水稻光温敏核不育基因p/tms12-1的等位基因类型。 
一种共显性标记引物组，由四条引物组成，所述四条引物的碱基序列 分别为： 
PTGMS-F1：5’-CTTGCTACCACAAGCTTTCC-3’； 
PTGMS-F2：5’-AGCAAAGAAGTGCATTGTTTGCGT-3’； 
PTGMS-R1：5’-TCCTTCTGGACTAGGAGCAA-3’； 
PTGMS-R2：5’-AAATTTTACTCTTGATGGATGGTGG-3’。 
p/tms12-1基因内第789位碱基C→G的突变造成了水稻的光温敏雄性不育，本发明针对该SNP位点设计了上述的共显性标记引物组，其中，上游引物PTGMS-F2和下游引物PTGMS-R2处于SNP位点处，同时还对PTGMS-F2和PTGMS-R2的3’端碱基进行特殊设计，加大上游引物PTGMS-F2对基因p/TMS12-1的错配几率，提高其对基因p/tms12-1的特异性，加大下游引物PTGMS-R2对基因p/tms12-1的错配几率，提高其对基因p/TMS12-1的特异性。另外，由于上述四条引物可在同一体系中进行PCR扩增，并利用该四条引物之间的不同组合扩增出三种DNA片段，因此，本发明在设计时，还保证了上游引物PTGMS-F1分别与下游引物PTGMS-R1、下游引物PTGMS-R2的匹配性，以及下游引物PTGMS-R1分别与上游引物PTGMS-F1、上游引物PTGMS-F2的匹配性。 
本发明还提供了所述的共显性标记引物组在鉴别水稻光温敏核不育基因p/tms12-1等位基因类型中的应用。 
所述应用具体包括： 
（1）取待检测水稻样品的组织，提取DNA； 
（2）以所述的DNA为模板，利用如权利要求1所述的共显性标记引物组进行PCR扩增，获得PCR扩增产物； 
（3）对所述的PCR扩增产物进行电泳，根据电泳结果进行判断： 
若所述的电泳结果在497bp和227bp处显示特异性条带，则待检测水稻样品含有等位基因p/tms12-1； 
若所述的电泳结果在497bp和317bp处显示特异性条带，则待检测水稻样品含有等位基因p/TMS12-1； 
若所述的电泳结果在497bp、317bp和227bp处显示特异性条带，则待检测水稻样品同时含有等位基因p/tms12-1和p/TMS12-1。 
所述水稻样品可以为在利用p/tms12-1进行水稻不育系的育种过程中任意的杂交、回交后代植株。 
提取DNA时，可以采用水稻的种子、叶片、根、花器等组织。对水稻DNA的提取方法也没有特殊要求，可以为CTAB法、SDS提取法、ROSE一管法、TPS提取法等，也可以直接采用商用试剂盒进行DNA的提取。 
所述PCR扩增的体系和条件影响鉴别的准确性。 
所述PCR扩增的体系较优的为：10×PCR buffer，2μL；dNTP mixture，0.5μL；10μM PTGMS-F1引物，0.5μL；10μM PTGMS-F2引物，0.5μL；10μM PTGMS-R1引物，0.5μL；10μM PTGMS-R1引物，0.5μL；样品DNA1μL；Taq DNA聚合酶，0.2μL；补充无菌水至20μL。 
所述PCR扩增的条件较优的为：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，共36个循环；72℃延伸10min；4℃保温5min。 
由于本发明在设计时，产生的特异性片段的大小至少为227bp，因此，可采用一般的琼脂糖凝胶进行电泳分析即可，琼脂糖的浓度可以为1.5%。 
与现有技术相比，本发明的有益效果为： 
本发明的共显性标记引物能够特异性的对水稻基因组DNA进行标记鉴定，检测水稻材料基因组DNA中p/tms12-1的等位基因类型，检测的准确性高，与传统的酶切和测序的方法相比，具有成本低、操作简单的特点。 
附图说明
图1是等位基因p/tms12-1和p/TMS12-1序列差异示意图。 
图2是(p/tms12-1)/(p/TMS12-1)的共显性标记开发原理示意图。 
图3是共显性标记检测(p/tms12-1)/(p/TMS12-1)的琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道1～16依次分别为：ddH2O、(p/tms12-1)/(p/TMS12-1)杂合单株、混合模板、5088S、1023S、培矮64S、广占63S、新二S、Y58S、矮占43S、常规稻D84、不育系A81、NC2100S、7001S、深08S、C815S。 
具体实施方式
下面结合具体实施方式进一步阐释本发明。 
实施例1共显性分子标记的开发及引物设计 
本发明利用水稻光温敏不育基因野生型(p/TMS12-1)和突变型 (p/tms12-1)的序列差异（图1），针对p/tms12-1的SNP设计出检测(p/tms12-1)/(p/TMS12-1)的共显性标记，该标记包含3个DNA片段，分别为p/tms12-1和p/TMS12-1的共有片段（497bp），p/TMS12-1特有片段（317bp，）和p/tms12-1特有片段（227bp），其核苷酸序列依次分别如SEQID NO.1～3所示。 
根据图2中所示的标记开发原理，通过SNP位点附近引入错配碱基，设计了开发(p/tms12-1)/(p/TMS12-1)共显性标记的引物（表1）。 
表1开发（p/tms12-1）/(p/TMS12-1)的共显性标记的引物序列 
引物名称 引物序列（5’-3’） 序列表
PTGMS-F1 CTTGCTACCACAAGCTTTCC SEQ ID NO.4
PTGMS-F2 AGCAAAGAAGTGCATTGTTTGCGT SEQ ID NO.5
PTGMS-R1 TCCTTCTGGACTAGGAGCAA SEQ ID NO.6
PTGMS-R2 AAATTTTACTCTTGATGGATGGTGG SEQ ID NO.7
实施例2共显性分子标记及引物的验证 
选取已进行p/tms12-1测序的13个水稻品系和1份(p/tms12-1)/(p/TMS12-1)杂合材料，对本发明的共显性标记进行验证。 
13个水稻品系为：5088S、1023S、培矮64S、广占63S、新二S、Y58S、矮占43S、常规稻D84、不育系A81、NC2100S、7001S、深08S、C815S。对这13个水稻品系，前期已就其p/TMS12-1基因进行了测序分析，发现5088S、1023S、培矮64S、NC2100S及7001S含有基因p/tms12-1，广占63S、新二S、Y58S、矮占43S、常规稻D84、不育系A81、深08S及C815S含有基因p/TMS12-1。 
利用CTAB法提取上述水稻品系叶片的基因组DNA，将表1中的引物等量混合后加入到PCR扩增体系中进行PCR扩增，PCR扩增使用rTaq（Takara，大连，中国）。 
PCR扩增体系为：10×PCR buffer，2μL；dNTP mixture，0.5μL；10μMPTGMS-F1引物，0.5μL；10μM PTGMS-F2引物，0.5μL；10μM PTGMS-R1引物，0.5μL；10μM PTGMS-R1引物，0.5μL；样品DNA1μL；Taq DNA聚合酶，0.2μL；补充无菌水至20μL。 
PCR扩增条件为：首先94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火 30s和72℃延伸1min，连续进行36个循环；随后72℃延伸10min，4℃保温5min。 
使用1.5%琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行检测，鉴定： 
若扩增出497bp和227bp的两条特异DNA片段，则表明待检样品含有等位基因p/tms12-1； 
若扩增出497bp和317bp的两条特异DNA片段，则表明待检样品含有等位基因p/TMS12-1； 
若扩增出497bp、317bp和227bp的三条DNA片段，则表明待检样品同时含有等位基因p/tms12-1和p/TMS12-1。 
电泳检测结果见图3。从图3可以看出，在含有等位基因p/tms12-1的材料5088S、1023S、培矮64S、NC2100S及7001S中，能检测出共有片段（497bp）和1条p/tms12-1特有片段（227bp）；在含有等位基因p/TMS12-1的材料广占63S、新二S、Y58S、矮占43S、常规稻D84、不育系A81、深08S及C815S中，能检测出共有片段（497bp）和1条p/TMS12-1特有片段（317bp）。为检验该共显性标记在(p/tms12-1)/(p/TMS12-1)杂合状态下的检测结果，使用了1个混合模板（5088S和常规稻D84的DNA等量混合）及1个(p/tms12-1)/(p/TMS12-1)杂合单株作为PCR扩增模板，图3结果表明，在混合模板及杂合单株中，该共显性标记能够有效检测出p/tms12-1及p/TMS12-1的共有片段以及各自的特有片段，电泳条带清晰。 
本发明开发出检测(p/tms12-1)/(p/TMS12-1)的共显性分子标记及检测引物，具有成本低、操作简单的特点，能够对p/tms12-1及p/TMS12-1进行有效的检测。 
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 
Figure IDA0000455921330000011
Figure IDA0000455921330000031

Claims (5)

1.一种共显性标记引物组，由四条引物组成，其特征在于，所述四条引物的碱基序列分别为：
PTGMS-F1：5’-CTTGCTACCACAAGCTTTCC-3’；
PTGMS-F2：5’-AGCAAAGAAGTGCATTGTTTGCGT-3’；
PTGMS-R1：5’-TCCTTCTGGACTAGGAGCAA-3’；
PTGMS-R2：5’-AAATTTTACTCTTGATGGATGGTGG-3’。
2.如权利要求1所述的共显性标记引物组在鉴别水稻光温敏核不育基因p/tms12-1等位基因类型中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：
（1）取待检测水稻样品的组织，提取DNA；
（2）以所述的DNA为模板，利用如权利要求1所述的共显性标记引物组进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
（3）对所述的PCR扩增产物进行电泳，根据电泳结果进行判断：
若所述的电泳结果在497bp和227bp处显示特异性条带，则待检测水稻样品含有等位基因p/tms12-1；
若所述的电泳结果在497bp和317bp处显示特异性条带，则待检测水稻样品含有等位基因p/TMS12-1；
若所述的电泳结果在497bp、317bp和227bp处显示特异性条带，则待检测水稻样品同时含有等位基因p/tms12-1和p/TMS12-1。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的体系为：10×PCR buffer，2μL；dNTP mixture，0.5μL；10μM PTGMS-F1引物，0.5μL；10μM PTGMS-F2引物，0.5μL；10μM PTGMS-R1引物，0.5μL；10μM PTGMS-R1引物，0.5μL；样品DNA1μL；Taq DNA聚合酶，0.2μL；补充无菌水至20μL。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，共36个循环；72℃延伸10min；4℃保温5min。
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