CN104651392A - 一种利用CRISPR/Cas9系统定点突变P/TMS12-1获得温敏不育系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9系统定点突变PTMS12-1获得温敏不育系的方法，包括克隆控制培矮64S温敏不育的主效基因P/TMS12-1片段；根据P/TMS12-1序列设计靶标序列；构建含靶标序列片段的pU3-gRNA载体；构建pCRISPR/Cas9载体；利用上述含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体获得阳性转基因苗；从阳性转基因苗中筛选突变植株；将突变植株传代种植获得不带转基因成分的温敏不育株系。本发明利用CRISPR/Cas9系统，彻底失活P/TMS12-1非编码RNA的活性，人工培育获得不带转基因成分的温敏不育系，具有目的性强，基因组损伤小等优点，避免转基因的影响。
Description
技术领域
本发明涉及水稻温敏不育系的培育方法，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9系统定点突变P/TMS12-1获得温敏不育系的方法。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是最主要的粮食作物之一，全世界超过一半的人口都以水稻为主食。随着人口的增长和可耕地面积的减少，粮食的供需变得越来越不平衡，增加粮食单位面积产量已成为解决粮食供需不平衡的关键措施之一。幸运的是，杂交水稻可以比常规优质水稻提高20-30％的产量，在解决粮食短缺的问题上起到了非常重要的作用，因此，杂交水稻的种植面积逐年上升，现已超过水稻种植面积的60％。
根据所使用的不育系类型的不同，杂交水稻育种的方法主要分为两系法和三系法。三系法通过使用细胞质雄性不育系和恢复系产生杂种F1代种子，利用保持系和细胞质雄性不育系杂交保留细胞质雄性不育系；但是只有少数水稻品种可以作为恢复系，这大大降低了恢复系与不育系间的遗传多样性，限制了杂种优势的利用。而两系法主要利用光/温敏雄性核不育系来实现，因为光/温敏不育系育性受日长和温度调控，在不育条件下可作为不育系，在可育条件下可作为保持系，一系两用。而且由于不受核质互作影响，几乎所有的正常品种都可以作为恢复系。基于这个本质上的差异，两系法杂交技术具有更为广泛的恢复系，不需要特殊的恢复基因，使得配组更加自由，利于亚种间杂种优势的利用，对 提高杂交稻组合的产量、米质、抗性等存在更大的潜在优势；不育系可一系两用，不需要保持系，简化了生产程序；温敏不育受核基因控制，与细胞质无关，丰富了细胞质遗传物质的多样性，可以避免三系杂交稻不育细胞质的负效应和细胞质单一可能带来的潜在危险。因此，温敏不育系在杂交水稻育种中潜力巨大，相比而言，目前广泛应用的为温敏不育系。
温敏不育材料往往通过自然突变获得，自然突变频率非常低，而用传统育种手段将自然突变的温敏不育材料培育成为温敏不育系过程漫长，如何提高温敏不育系的培育效率已成为迫切需要解决的问题。要突破传统育种的局限，必须使用基因工程手段。尽管，RNAi和反义RNA技术可以实现对基因的抑制表达，但是并不能彻底删除基因的功能，基因残留的功能会提高转基因植株的不育起点温度，不利于育种的安全，而且转基因植株中会残留外源序列，涉及转基因安全问题。近年来，定点突变技术取得了突破性进展，已广泛应用于各种生物中。这些方法都是通过靶识别序列或引导序列将核酸酶引导到靶标位置，然后核酸酶切割靶标DNA，在细胞自身修复系统的作用下将切断的DNA修复链接起来，但是在修复过程中往往会导致碱基丢失，因此该上述方法可以获得定点突变效果。目前，已经通过RNAi技术干涉光/温敏不育基因，获得温敏不育植株；但是RNAi技术只是降低了光/温敏不育基因的表达量，并不能彻底的使其失活，使转基因植株有较高的不育起点温度，且不育起点温度不稳定，影响制种安全。另外，利用定点突变技术可以1-2年内获得温敏不育系，而利用传统育种技术，无论是培育三系不育系还是两系不育系都需要数年甚至10年以上时间。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用CRISPR/Cas9 系统定点突变P/TMS12-1获得温敏不育系的方法，利用CRISPR/Cas9系统，彻底的失活了P/TMS12-1非编码RNA的活性，人工培育出不带转基因成分的温敏不育系，具有目的性强，基因组损伤小等优点，可规避转基因带来的可能风险。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种利用CRISPR/Cas9系统定点突变PTMS12-1获得温敏不育系的方法，其包括以下步骤：
1)克隆控制培矮64S温敏不育的主效基因P/TMS12-1片段；
2)根据CRISPR/Cas9系统靶标设计原则在上述P/TMS12-1片段序列中设计靶标序列；
3)构建含靶标序列序列的pU3-gRNA载体；
4)利用上述pU3-gRNA载体构建含靶标序列序列的pCRISPR/Cas9载体；
5)利用上述含靶标序列序列的pCRISPR/Cas9载体获得阳性转基因苗；
6)利用上述阳性转基因苗获得突变植株；
7)将上述突变植株传代种植后获得不带转基因成分且育性恢复可育的植株作为温敏不育株。
本发明步骤2)中所述P/TMS12-1双链片段中的一条链具有以下结构：5’-NX-NGG-3’，也可以是5’-NX-NAG-3’或5’-NX-NGA-3’，N表示A，T，C和G中的任意一个，14≤X≤30。较好的靶位点序列以A或G开头。本发明根据靶标的设计原则步骤2)中在P/TMS12-1的前体RNA区找到25个5’-NX-NGG-3’，60个5’-NX-NAG-3’，48个5’-NX-NGA-3’序列作为靶标。
上述方案中，步骤3)的具体步骤为：首先合成带粘性末端的靶标序列，将接头序列变性后移至室温冷却完成退火；将退火后的序列链接到经酶切后的pU3-gRNA载体上，经PCR扩增和测序验证阳性质粒。
上述方案中，步骤4)的具体步骤为：将含靶标序列的gRNA表达盒从pU3-gRNA载体上切下后链接到含Cas9表达盒的pCRISPR/Cas9载体上。
上述方案中，步骤5)的具体步骤为：将含靶标的pCRISPR/Cas9载体转化水稻愈伤组织，经筛选，分化和生根成苗，炼苗后种植于网室；通过潮霉素鉴定获得阳性转基因植株。本发明中将含靶标的pCRISPR/Cas9载体转化水稻愈伤组织的方法是通过农杆菌介导的遗传转化法或基因枪法。也可以是能实现其转化的其他生物学方法。
上述方案中，步骤6)的具体步骤为：提取上述阳性转基因植株的DNA，用引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10扩增上述DNA，产物经纯化后送公司测序，测序结果与未转基因的野生型植株序列比较，分析突变情况，获得T0代突变植株。
上述方案中，获得不带转基因成分的温敏不育突变体的步骤具体为：收获T0代已实现定点突变的植株的种子，在高温/长日条件下种植T1代植株，通过育性观察和潮霉素鉴定分离到不带转基因成分且表型不育的植株种植于低温/短日条件下，育性可恢复的植株作为温敏不育株，经自交或回交等方法繁殖后获得温敏不育系。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明所述的利用CRISPR/Cas9系统定点突变P/TMS12-1获得温敏不育系的方法，利用上述技术定点突变已经克隆的温敏不育基因，实现了人工培育实用型温敏不育系，并且这种温敏不育系是不带转基因成分的，与利用化学、物理诱变获得的突变体没有本质的区别，只是目的性强，基因组损伤小，规避转基因带来的可能风险等优点；
2.本发明所述的利用CRISPR/Cas9系统定点突变P/TMS12-1获得温敏不育 系的方法加快了育种的进程，节省了时间、成本；
3.传统育种无论回交、自交多少代都会或多或少的改变遗传背景并导致一些优良性状丢失；本发明所述的利用CRISPR/Cas9系统定点突变P/TMS12-1获得温敏不育系的方法不改变受体材料的遗传背景，并可以通过将三系杂交水稻的保持系定点突变为温敏不育系，达到三系改为两系杂交稻，拓宽恢复系的选择范围，提高杂种优势利用效率，进而提高产量、抗性和稻米品质；
4.本发明通过测序35个主流实用型温敏不育系，发现33个温敏不育系的tms5序列与安农S-1完全一致，而另外2个温敏不育系的p/tms12-1序列与培矮64S完全一致；说明通过自然突变或传统的人工诱变已知温敏不育基因失活是非常困难的；诱变新的可用于两系杂交育种的温敏不育系也是非常困难的。因此，本方法改变了这一现状。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为p/tms12-1的分子定位和功能互补策略图；A，p/tms12-1被精细定位到第12染色体的5.8kb区间内；B，定位区间内的基因预测，并且显示了唯一的点突变；C，用于功能互补片段的示意图；
图2为PA10.4、PA9、PA2.4以及PA0.3功能互补植株的花粉育性；A，低温下的培矮64S的花粉育性；B，高温下的培矮64S的花粉育性；C，高温下的PA10.4的花粉育性；D，高温下的PA9的花粉育性；E，高温下的PA2.4的花粉育性；F，高温下的PA0.37的花粉育性；
图3为本发明实施例2所获得的P/TMS12-1-1的T1代植株潮霉素阳性检测结果图，其中1-10分别为P/TMS12-1-1的T1代植株中的10株，+表示阳性对照， -表示阴性对照；
图4为实施例2中P/TMS12-1-1-3是P/TMS12-1-1的T1代植株中第3株在不同温度条件下生长时的花粉育性结果图，其中，HT表示高温，LT表示低温，WT表示转基因前的植株，bar表示100μm；
图5为实施例3中所获得的P/TMS12-1-2的T1代植株潮霉素阳性检测结果图，其中1-10分别为P/TMS12-1-2的T1代植株中的10株，+表示阳性对照，-表示阴性对照；
图6为本发明实施例3获得的P/TMS12-1-2-7是P/TMS12-1-2的T1代植株中第7株在不同温度条件下的花粉育性，其中ZH11表示野生型水稻中花11，HT表示高温，LT表示低温，bar表示100μm。
具体实施方式
一种利用CRISPR/Cas9系统定点突变PTMS12-1获得温敏不育系的方法，其包括以下步骤：
1)克隆控制培矮64S温敏不育的主效基因P/TMS12-1片段；
2)根据CRISPR/Cas9系统靶标序列设计原则在上述P/TMS12-1片段序列中设计靶标引物；
3)构建含靶标序列片段的pU3-gRNA载体；
4)利用上述pU3-gRNA载体构建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体；
5)利用上述含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体获得阳性转基因苗；
6)利用上述阳性转基因苗获得突变植株；
7)将上述突变植株传代种植后获得不带转基因成分但育性恢复可育的植株作为温敏不育株。
本发明所述P/TMS12-1双链片段中的一条链具有以下结构：5’-NX-NGG-3’，也可以是5’-NX-NAG-3’或5’-NX-NGA-3’，N表示A，T，C和G中的任意一个，14≤X≤30。较佳的靶位点序列以A或G开头。本发明根据靶标的设计原则在P/TMS12-1的前体RNA区找到25个5’-NX-NGG-3’，60个5’-NX-NAG-3’，48个5’-NX-NGA-3’序列作为靶标。
上述方案中，构建含靶标序列的pU3-gRNA载体具体步骤为：首先合成带粘性末端的靶标序列，将接头序列变性后移至室温冷却完成退火；将退火后的序列链接到经酶切后的pU3-gRNA载体上，经PCR扩增和测序验证阳性质粒。
上述方案中，构建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体是将含靶标序列片段的gRNA表达盒从pU3-gRNA上切下，然后链接到含Cas9表达盒的pCRISPR/Cas9载体上。
上述方案中，获得转基因苗的步骤是将含靶标的pCRISPR/Cas9载体转化水稻愈伤组织，经筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于网室；通过潮霉素鉴定阳性转基因植株。本发明中将含靶标的pCRISPR/Cas9载体转化水稻愈伤组织的方法是通过农杆菌介导的遗传转化或基因枪法。也可以是能实现其转化的其他生物学方法。
上述方案中，突变位点的鉴定步骤具体为：提取阳性植株的DNA，设计引物扩增上述DNA，经纯化后，测序，分析突变情况。
上述方案中，获得不带转基因成分的温敏不育系的步骤具体为：收获T0代实现定点突变的植株的种子，在长日/高温条件下种植T1代植株，通过表型观察和潮霉素阳性检测分离到不带转基因成分但表型不育的植株种植于短日/低温条件下，育性恢复可育的植株作为温敏不育株，经自交或回交等方法繁殖后获得温敏不育系。
实施例1
克隆获得的克隆控制培矮64S温敏不育的主效基因P/TMS12-1双链片段，步骤如下：
1)温敏不育基因p/tms12-1的定位
在培矮64S第12染色体上存在一个主效基因p/tms12-1定位在在第12染色体BAC克隆AL731757上分子标记PA301和PAIDL2之间5.8kb的物理区间内，参见图1；
2)克隆P/TMS12-1双链片段
对该区间序列分析发现培矮64S中存在一个C-G突变的SNP，该区间进行基因预测发现有两个可能的基因，上述SNP位于这两个候选基因之间；将这两个预测基因作为候选基因，克隆两个分别包含上述预测基因且片段较大的DNA用于功能互补，分别命名为PA10.4(SEQ ID NO.1)和PA9(SEQ ID NO.2)；这两个片段之间有一段2.4kb的重叠区，C→G的SNP也存在于这个重叠区；将这两个片段转化培矮64S后恢复了它们长日/高温下的花粉育性；确定控制温敏不育的基因应该位于PA10.4和PA9之间重叠的2.4kb区间内，克隆该区间片段用于功能互补，并将其命名为PA2.4，(SEQ ID NO.3)；
经过对花粉母细胞到减数分裂时期的培矮64和培矮64S的幼穗为材料进行了全基因组的测序；分析测序结果显示，上述2.4kb区间内存在一个small RNA：CAUUGUUUGUCGUACCAUCCAU(SEQ ID NO.4)；将包含上述small RNA的一段片段作为前体克隆到ubiquitin启动子驱动的过量表达载体上，将其命名为PA0.37(SEQ ID NO.5)，并转化培矮64S，结果也恢复了其长日/高温下的花粉育性，从而，确定SEQ ID NO.4片段为控制培矮64S温敏雄性不育的片段。
PA10.4和PA9以及PA2.4、PA0.37功能互补转化培矮64S后，花粉育性结 果参见图2；图2的结果显示PA10.4、PA9以及PA2.4、PA0.37复了培矮64S高温长日下的花粉育性。
实施例2
在粳稻品种中花11中利用CRISPR/Cas9系统定点突变P/TMS12-1获得温敏不育系，具体步骤如下：
1)利用CRISPR/Cas9系统根据实施例1的SEQ ID NO.4片段序列设计靶标序列：
Target-P/TMS12-1-1(SEQ ID NO.6)：CTAGATGCAGTATAACTTCT；
2)构建含Target-P/TMS12-1-1片段的pU3-gRNA载体：
首先合成带粘性末端的靶标引物P/TMS12-1-1F(SEQ ID NO.7)：GGCACTAGATGCAGTATAACTTCT，P/TMS12-1-1(SEQ ID NO.8)：AAACAGAAGTTATACTGCATCTAG；将接头引物变性后移至室温冷却完成退火，将退火后的引物链接到经酶切后的pU3-gRNA载体上；经PCR扩增和测序验证获得含Target-P/TMS12-1-1片段的阳性质粒；
3)含Target-P/TMS12-1-1片段的pCRISPR/Cas9载体构建：
将含Target-P/TMS12-1-1片段的阳性质粒中的gRNA表达盒从pU3-gRNA上切下，然后链接到含Cas9表达盒的pCRISPR/Cas9载体上；
4)利用上述含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体获得阳性转基因苗：
将含靶标的pCRISPR/Cas9载体通过农杆菌介导的遗传转化转化水稻愈伤组织；经筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于网室，通过潮霉素鉴定阳性转基因植株；
5)利用上述阳性转基因苗获得突变植株：
提取上述阳性转基因植株的DNA，用引物P/TMS12-1-3F(SEQ ID NO.9)： GCAGAGACATAGATGAGCAAC和P/TMS12-1-3R(SEQ ID NO.10)：GAAGTCTTGGTTGCACATCC扩增上述DNA，产物经纯化后送公司测序，测序结果与转基因前的野生型植株序列比较，分析突变情况；具体参见SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.16；
WT(SEQ ID NO.11)：CAACACGCAGTTCAGATACTCTAGATGCAGTATAACTTCTCGGGTCTATCTATAACGGAG
P/TMS12-1-1-11(SEQ ID NO.12)：CAACACGCAGTTCAGATACTCTAG ATGCAGTATAACTTTCTCGGGTCTATCTATAACGGAG
P/TMS12-1-1-12(SEQ ID NO.13)：CAACACGCAGTTCAGATACTCTAGATGCAGTATAA**TCTCGGGTCTATCTATAACGGAG
P/TMS12-1-1-13(SEQ ID NO.14)：CAACACGCAGTTCAGATACTCTAGATGCAGTATAA***CTCGGGTCTATCTATAACGGAG
P/TMS12-1-1-14(SEQ ID NO.15)：CAACACGCAGTTCAGATACTCTAGATGCAG*************GTCTATCTATAACGGAG
P/TMS12-1-1-15(SEQ ID NO.16)：CAACACGCAGTTCAGATACTCTAGATGCAGTATA******CGGGTCTATCTATAACGGAG
其中，P/TMS12-1-1-11，-12，-13，-14和-15表示不同的转基因株系；WT表示野生型；序列中“T”表示插入的碱基，“*”表示碱基缺失；测序结果显示：突变植株占总阳性转基因植株的58％，突变类型为碱基插入或删除，突变位置始于NGG上游第3到4个碱基之间；即碱基的缺失和插入说明定点突变成功；
6)将上述突变植株传代种植后获得育性恢复可育的植株作为温敏不育株：
收获T0代实现定点突变的植株的种子，在长日/高温条件下种植T1代植株，通过表型观察和潮霉素阳性检测分离到不带转基因成分，结果参见图1；但表型 不育的植株种植于短日/低温条件下，育性恢复可育的植株作为温敏不育株，经繁殖后获得温敏不育系，结果参见图2。
图1结果表明，T1代植株中3和8是不带转基因成分的；图2结果表明P/TMS12-1-1-3植株在高温下表现为花粉败育，而低温下表现为育性恢复。
实施例3
在粳稻品种中花11中利用CRISPR/Cas9系统定点突变P/TMS12-1获得温敏不育系，具体步骤如下：
1)利用CRISPR/Cas9系统根据实施例1的SEQ ID NO.4片段序列设计靶标序列：
Target-P/TMS12-1-2(SEQ ID NO.17)：CTTCTCGGGTCTATCTATAA；
2)构建含Target-P/TMS12-1-2片段的pU6-gRNA载体：
首先合成带粘性末端(下划线部分)的靶标引物P/TMS12-1-2F(SEQ ID NO.18)：GCCGCTTCTCGGGTCTATCTATAA，P/TMS12-1-2R(SEQ ID NO.19)：AAACTTATAGATAGACCCGAGAAG；将接头引物变性后移至室温冷却完成退火，将退火后的引物链接到经酶切后的pU6-gRNA载体上，经PCR扩增和测序验证获得含Target-P/TMS12-1-2片段的阳性质粒；
3)构建含Target-P/TMS12-1-2片段的pCRISPR/Cas9载体：
将含Target-P/TMS12-1-2片段的阳性质粒上的gRNA表达盒从pU6-gRNA上切下，然后链接到含Cas9表达盒的pCRISPR/Cas9载体上；
4)利用上述含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体获得阳性转基因苗：
将Target-P/TMS12-1-2片段的pCRISPR/Cas9载体通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻粳稻品种中花11愈伤组织，经筛选，分化和生根成苗，将转基因 植株种植于网室；通过潮霉素鉴定阳性转基因植株；
5)利用上述阳性转基因苗获得突变植株：
提取阳性植株的DNA，用引物P/TMS12-1-3(SEQ ID NO.9)：GCAGAGACATAGATGAGCAAC和P/TMS12-1-3(SEQ ID NO.10)：GAAGTCTTGGTTGCACATCC扩增上述DNA，经纯化后送公司测序，分析突变情况，测序结果与转基因前的野生型水稻中花比较，测序分析；具体参见SEQ ID NO.20-SEQ ID NO.24；
ZH11(SEQ ID NO.20)：ATACTCTAGATGCAGTATAACTTCTCGGGTCTATCTATAACGGAGCCGCCGCTTCAATTT
P/TMS12-1-2-11(SEQ ID NO.21)：ATACTCTAGATGCAGTATAACTTCTCGGGTCTATCT*TAACGGAGCCGCCGCTTCAATTT
P/TMS12-1-2-12(SEQ ID NO.22)：ATACTCTAGATGCAGTATAACTTCTCGGGTCTATCT**AACGGAGCCGCCGCTTCAATTT
P/TMS12-1-2-13(SEQ ID NO.23)：ATACTCTAGATGCAGTATAACTTCTCGGGTCTAT*****ACGGAGCCGCCGCTTCAATTT
P/TMS12-1-2-14(SEQ ID NO.24)：ATACTCTAGATGCAGTATAACTTCTCGGGTCT*********GGAGCCGCCGCTTCAATTT；
P/TMS12-1-2-11，-12，-13和-14表示不同的转基因株系；ZH11表示野生型水稻中花11；“*”表示碱基缺失；测序结果显示：突变植株占总阳性转基因植株的52％，突变类型为碱基插入或删除，突变位置始于PAM序列TGG上游第3到4个碱基之间；即碱基的缺失和插入说明定点突变成功。
6)将上述突变植株传代种植后获得育性恢复可育的植株作为温敏不育株：
收获T0代实现定点突变的植株的种子，在长日/高温条件下种植T1代植株， 通过表型观察和潮霉素阳性检测分离到不带转基因成分但表型不育的植株种植于短日/低温条件下，育性恢复可育的植株作为温敏不育株，经繁殖后获得温敏不育系，结果参见图3和4。
图3P/TMS12-1-2T1代植株潮霉素检测，+表示阳性对照，-表示阴性对照，T1代植株中2和7是不带转基因成分的；图4的结果表明T1代传代后的P/TMS12-1-2-7突变植株在高温下表现为花粉败育，而低温下表现为育性恢复。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种利用CRISPR/Cas9系统定点突变P/TMS12-1获得温敏不育系的方法，其包括以下步骤：
1)克隆控制培矮64S温敏不育的主效基因P/TMS12-1片段；
2)利用CRISPR/Cas9系统根据上述P/TMS12-1片段序列设计靶标序列；
3)构建含靶标序列片段的pU3-gRNA载体；
4)利用上述pU3-gRNA载体构建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体；
5)利用上述含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体获得阳性转基因苗；
6)利用上述阳性转基因苗获得突变植株；
7)将上述突变植株传代种植后获得不带转基因成分育性恢复可育的植株作为温敏不育株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述P/TMS12-1双链片段中的一条链具有以下结构：5’-NX-NGG-3’或5’-NX-NAG-3’或5’-NX-NGA-3’，N表示A，T，C和G中的任意一个，14≤X≤30。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)根据P/TMS12-1序列设计靶标序列的步骤中通过在P/TMS12-1的前体RNA区找到25个5’-NX-NGG-3’，60个5’-NX-NAG-3’，48个5’-NX-NGA-3’序列作为靶标。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)具体步骤为：合成带粘性末端的靶标引物，将接头引物变性后移至室温冷却完成退火，将退火后的引物链接到经酶切后的pU3-gRNA载体上；经PCR扩增和测序验证获得获取阳性质粒。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4)具体步骤为：将含靶标序列片段pU3-gRNA载体上的gRNA表达盒从pU3-gRNA上切下后链接到含Cas9表达盒的pCRISPR/Cas9载体上。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤5)具体步骤为：将含靶标的pCRISPR/Cas9载体转化水稻愈伤组织，经筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于网室；通过潮霉素鉴定阳性转基因植株。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：将含靶标的pCRISPR/Cas9载体转化水稻愈伤组织的方法为农杆菌介导的遗传转化或基因枪法。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：提取上述阳性转基因植株的DNA，用引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10扩增上述DNA，产物经纯化后送公司测序，测序结果与转基因前的野生型植株序列比较，分析突变情况，获得T0代突变植株。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：获得不带转基因成分的温敏不育系的步骤具体为：收获T0代突变的植株的种子，在长日/高温条件下种植T1代植株，通过表型观察和潮霉素阳性检测分离到不带转基因成分但表型不育的植株种植于短日/低温条件下，育性恢复可育的植株作为温敏不育株，经自交或回交方法繁殖后获得温敏不育系。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |