CN108753814A - 一种加速物种突变的新育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种加速物种突变的新育种方法，通过基因工程手段，对物种中负责DNA复制和/或遗传稳定性的基因进行定点突变，使得该基因功能缺失或减弱，从而提高育种对象在生长和发育过程中的突变率，并从中筛选出具备所需性状的突变体；再通过基因工程手段，将突变体中相应的负责DNA复制和/或遗传稳定性，且发生功能缺失或减弱的基因进行定点突变，使得该基因的功能重新恢复，即获得具备所需性状的新品种。本发明提供的育种技术可以做到育种过程与生产种植过程同时进行，因此可供筛选的基数极大，得到优良品种的几率显著提高。

Description

一种加速物种突变的新育种方法

技术领域

本发明涉及遗传育种领域，具体地说，涉及一种加速物种突变的新育种方法。

背景技术

育种技术能提高产品的产量、品质，提高劳动生产率。现代育种大致分为近缘杂交、远缘杂交、回交育种、诱变育种、细胞工程和转基因育种。其中杂交育种利用基因型不同的亲本材料通过有性杂交获得杂种，并对杂种后代进行选择而获得杂种优势的育种方法，是国内外目前广泛应用且卓有成效的一种育种途径。转基因育种是利用现代基因工程技术将某些与高产、优质和抗逆性状相关的基因导入受体物种中培育出具有特定优良性状的新品种技术。

诱变育种对作物的种子、组织、器官进行诱变处理，以诱发基因突变和遗传变异，从而获得新基因、新种质，选育新品种。诱变育种是诱发作物基因组中基因发生突变，从中挑选出突变体，经过选拔、鉴定育成优良品种。诱变育种是较好简便的育种手段，包括遗传变异的发生、有益基因型的选择和比较试验三个重要环节。诱变所产生的变异同物种在自然界进化过程中自发突变所产生的变异没有本质上的差异，只不过自然界植物发生的自发突变频率很低，而各种诱变能产生更高频率的突变体。

常用的诱变育种包括辐射诱变、化学诱变、空间诱变。诱变育种需要用到各种电磁、粒子辐射和化学诱变剂，他们大都对人体有致癌性，因此需要专业的诱变装置、设备和受到良好培训的育种人员小心谨慎的操作。空间诱变需要用到返回式卫星等空间器件，成本特别高。因为需要凭借各种设备、药剂、或者装置，每次诱变育种只能选择小部分种子、原生质体、营养体等材料来进行诱变育种。一般情况下，突变中的有益突变频率较低，变异的方向和性质难以控制。常规诱变育种的对象通常具备相当复杂和完备的DNA修复机制，诱变引起的基因损伤和突变(尤其是点突变)容易在作物的选育过程中得到修复。因此，诱变育种中得到优良性状的几率小，育种效率并不高。

DNA复制过程中原本有较高的突变率，DNA本身也容易受到各种射线、外源和内源化学物、活性氧的攻击而发生改变。但是在长期的生物进化中，物种为了维持其基因稳定性，进化出了一套精巧的维持DNA基因稳定性的分子机制，包括复制过程中对DNA进行实时校对的错配修复、核苷酸切除修复、碱基切除修复、重组修复、活性氧平衡等。正是这套系统使细胞的自然突变中真正能永久保留下来的不到千分之一，实际突变率只有10^-9左右。

发明内容

本发明的目的是提供一种加速物种突变的新育种方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的加速物种突变的新育种方法，通过基因工程手段，对物种中负责DNA复制和/或遗传稳定性的基因进行定点突变，使得该基因功能缺失或减弱，从而提高育种对象在生长和发育过程中的突变率(如突变率提高2-4个数量级)，并从中筛选出具备所需性状的突变体；再通过基因工程手段，将突变体中相应的负责DNA复制和/或遗传稳定性，且发生功能缺失或减弱的基因进行定点突变，使得该基因的功能重新恢复，即获得具备所需性状的新品种。

所述方法包括以下步骤：

1，通过基因敲除或者基因编辑和修饰的技术手段，对维持DNA序列不变和基因稳定性起作用的至少一个基因或者多个基因进行编辑或者敲除，一定程度上削弱育种对象的基因稳定性，从而得以显著提高育种对象在生长和培育过程中的突变率(如突变率提高2-4个数量级)；

2，培育并大量繁殖上述DNA和基因稳定性显著削弱和缺陷的育种对象，产生大量的突变体，并从中挑选出具备特定性状的突变体；

3，再利用基因编辑手段把起先敲除或修饰过的维持基因稳定性和DNA序列不变的原基因序列重新正确插入并更正，后续经鉴定育成基因稳定性重新得到恢复且已具备新性状的新品种。

本发明述及的育种技术，所述的育种对象包括各种微生物如农业微生物、工业微生物、环境微生物等，植物如各种农作物、花卉、蔬菜、果树、林木、牧草等，动物如提供肉类、鱼、奶制品的饲养经济类动物等。

基因编辑的育种对象包括但不限于如下：微生物细胞，植物的体细胞、愈伤组织、花药和原生质体，动物的胚胎干细胞；供筛选的突变体包括但不限于如下：单个微生物克隆，整株植物或植物的器官、组织、芽、胚、愈伤组织、花药和原生质体，动物个体等。

本发明述及的基因工程手段是指具备一定靶向能力的基因编辑技术，包括但不限于下述几种，如CRISPR/Cas基因编辑技术、锌指核酸酶(ZFN)基因编辑技术、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)基因编辑技术等。

本发明述及的负责DNA复制和/或遗传稳定性的基因包括但不限于以下几类：涉及DNA复制中起校对功能的基因；涉及DNA修复的基因如错配修复基因、核苷酸切除修复基因、碱基切除修复基因；涉及细胞活性氧平衡的基因；涉及细胞周期的关卡基因。

本发明述及的删除或编辑涉及DNA复制中起校对功能的基因，削弱或去除该基因对物种DNA校对的分子和生物学功能，包括但不限于如下基因：原核生物DNA聚合酶基因如Pol I、Pol II、Pol III、Pol IV、Pol V；真核生物DNA聚合酶基因如Polα、Polβ、Polγ、Polδ、Polε、Polσ、Polζ、Polλ、Polμ、Polι、Polκ、Polη。

本发明述及的删除或编辑涉及DNA错配修复的基因，削弱或去除该基因的DNA错配修复的分子和生物学功能失去或者削弱，包括但不限于如下基因：原核生物的MutS及其同源基因、MutL及其同源基因、MutH及其同源基因、增殖细胞核抗原β-滑动钳(PCNA β-sliding clamp)基因；真核生物的MSH(MSH1-MSH6)及其同源基因、MLH(MLH1-MLH3)及其同源基因、PMS(PMS1-PMS2)及其同源基因。

本发明述及的删除或编辑涉及碱基切除修复(BER)的基因，削弱或去除该基因的碱基切除修复的分子和生物学功能失去或者削弱，包括但不限于如下基因：DNA糖基化酶基因如Uracil-DNA糖基化酶基因家族、Nth家族、Fgp家族等；AP内切核酸酶基因如Xth家族、Nfo家族、PALF家族；DNA聚合酶基因如Pol I、Polγ。

本发明述及的删除或编辑涉及核苷酸切除修复(NER)的基因，削弱或去除该基因的核苷酸切除修复的分子和生物学功能，包括但不限于如下基因：原核生物的UvrA、UvrB、UvrC基因；真核生物的GC-NER和TC-NER基因，如CSA、CSB、RPA、RAD、ERCC、XPA-XPG等基因。

本发明述及的删除或编辑涉及活性氧(ROS)平衡的基因，削弱该基因Anti-ROS的分子和生物学功能，包括但不限于如下基因：超氧化物歧化酶基因(SOD)、过氧化氢酶基因、谷胱甘肽过氧化物酶基因。

本发明述及的删除或编辑涉及细胞周期的关卡基因，削弱或者去除该基因在细胞周期和分裂中所起的关卡作用，包括但不限于如下基因：ATM丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因，ATR丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因，p53基因。

本发明述及的对维持DNA序列不变和基因稳定性起作用的至少一个基因或者多个基因进行基因编辑或者基因敲除，其目的是适当削弱育种对象的DNA和基因稳定性，在不影响物种正常培育和繁殖的前提下，显著提高育种对象在生长、培育和繁殖过程中的突变率(如突变率提高2-4个数量级)，从而产生大量的突变体，并从中挑选出适合的突变体。

本发明述及的筛选出适合的突变体后，再次利用基因编辑手段把起先敲除或修饰过的维持DNA序列不变和基因稳定性的原基因序列重新正确插入并更正，所采取的技术手段是指具备一定靶向能力的基因编辑技术，包括但不限于下述几种，如CRISPR/Cas基因编辑技术、锌指核酸酶(ZFN)基因编辑技术、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)基因编辑技术等。

本发明述及的对维持DNA序列不变和基因稳定性起作用的至少一个基因或者多个基因进行基因编辑或者基因敲除，以及筛选出适合的突变体后，再次利用基因编辑手段把起先敲除或修饰过的维持DNA序列不变和基因稳定性的原基因序列重新正确插入并更正，其基因编辑的育种对象包括但不限于如下：微生物细胞，植物的体细胞、愈伤组织、花药和原生质体，动物的胚胎干细胞。供筛选的突变体包括但不限于如下：单个微生物克隆，整株植物或植物的器官、组织、芽、胚、愈伤组织、花药和原生质体，动物个体等。

本发明述及的对维持DNA序列不变和基因稳定性起作用的至少一个基因或者多个基因进行基因编辑或者基因敲除以后，为了进一步提高育种对象在生长、培育和繁殖过程中的突变率并产生大量的突变体，在对育种对象进行大量培育和繁殖过程中可以辅以低剂量的诱变措施。辅助的辐射诱变措施可包括电磁辐射和粒子辐射，如X射线、γ射线、中子、离子束、同步辐射、紫外线、激光、质子等。辅助的化学诱变措施是指利用各种化学物质诱导生物体遗传特性发生变异的方法，可包括烷化剂如硫芥、氮芥、环氧衍生物、乙烯亚胺、硫酸酯，碱基类似物如5-溴-尿嘧啶，叠氮化物如叠氮化钠，以及其他种类的化学诱变剂如秋水仙素等。

与现有育种技术相比，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)突变体的产生是基于育种对象在基因稳定性被削弱，后续的突变体可以在育种对象生长、培育和繁殖过程中大量产生。

(二)本发明可以不依赖诱变育种中需要用到的各种电磁、粒子辐射和化学诱变剂，不需要专业的诱变装置、设备和诱变操作的专业人员。本发明中维持DNA序列不变和基因稳定的至少一个基因或者多个基因被编辑或者被敲除后，育种对象的DNA序列和基因稳定性被显著削弱。即便在培养育种对象时辅以诱变措施，其采取的辐射强度和诱变剂浓度显著低于(强度和浓度可低至几个数量级)常规诱变育种技术中需要用到的辐射强度和诱变剂浓度。

(三)育种对象的基因稳定性虽然在一定程度上被削弱，大量突变体可在后续生长、培育和繁殖过程中自然产生。对于整个植株突变体的筛选而言，育种过程可以与该物种的正常培育(或种植)以获得生产经济效益同时进行。这不同于杂交育种技术，其育种过程和生产种植完全分离。常规诱变育种需要各种设备、药剂、或者装置，每次诱变育种只能选择小部分种子、原生质体、营养体等材料来进行诱变育种，得到优良品性的几率很低。本发明提供的育种技术可以做到育种过程与生产种植过程同时进行，因此可供筛选的基数极大，得到优良品种的几率显著提高。

(四)本发明提供的育种技术除了在前后两次基因编辑中需要专业人员以外，在突变株的筛选环节可以不需要专业育种技术人员的参与，可由普通的生产种植人员完成，为此可以大大降低获得优良品种的育种成本。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例下中所用的材料，试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

载体pML104，pRGEB31可购自addgene公司。

pML104质粒已在文献“Laughery MF,Hunter T,Brown A,Hoopes J,Ostbye TShumaker T,Wyrick JJ.2015,New vectors for simple and streamlined CRISPR-Cas9genome editing in Saccharomyces cerevisiae.Yeast,32(12):711-20”公开。

pRGEB31质粒已在文献“Xie K，Yang Y.2013,RNA-guided genome editing inplants using CRISPER-Cas system.Mol Plant,6(6),1975-1983”公开。

使用基于geminivirus的CRISPER-Cas9系统进行同源重组修复已在文献“Wang M,Lu Y,Botella JR,Mao Y,Hua K,Zhu J-K.2017,Gene targeting by homology-directedrepair in rice using a germinivirus-based CRISPER/Cas9system.Mol Plant,10,1007-1010”公开。

MS培养基成分已在文献“Murashige T,Skoog F.1962,A revised medium forrapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.Physiol Plant,15,473-497”中公开。

植物原生质体转化的方法已在文献“Xie K,Yang Y.2013,RNA-guided genomeediting in plants using a CRISPER-Cas system.Mol Plant,6,1975-1983”中公开。

实施例1以错配修复基因(MLH1)为靶的酵母突变体获得方法

1、敲除酵母(Saccharomyces cerevisiae，R64-1-1)错配修复基因(MLH1)的过程和方法

物种名：Saccharomyces cerevisiae R64-1-1(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)

敲除基因名：MLH1

酵母MLH1基因DNA全长序列见SEQ ID NO:1。

(1)根据CRISPR-Cas9中靶标序列设计原则，该基因1320-1339位具有符合原则的靶标序列(MLH1sgRNA)：CCA CTCCCAAGAGGCAGAAAAGC

以上靶标序列的反向互补链含有5’-(N)_X-NGG-3’结构。其中，下划线部分为5’-(N)_X-NGG-3’结构中的NGG的互补链序列。

(2)合成带粘性末端的靶标序列的寡核苷酸链：

该靶标序列包括合成正向寡核苷酸链MLH1sg-F和与之互补的反向寡核苷酸链MLH1sg-R,具体序列为：

MLH1sg-F：5’GATC CTCCCAAGAGGCAGAAAAGC GTTTTAGAGCTAG 3’

MLH1sg-R：5’CTAGCTCTAAAAC GCTTTTCTGCCTCTTGGGAG 3’

其中未标记的为该基因的靶标序列，下划线标记的为与质粒上酶切后互补的BclI粘性末端，灰色标记的是sgRNA结构片段的5'端(末端为swaI的平末端)，导入前用BclI进行酶切和回收。

(3)质粒的酶切连接：在25℃下用SwaI(平末端)消化质粒过夜，然后在65℃下热灭活20min。随后将BclI加入到消化反应中并在50℃温育至少两小时。酶切后切胶回收质粒。含有20mer指导序列和sgRNA的5'末端的杂交寡核苷酸底物随后通常在16℃下过夜连接到切割的sgRNA表达质粒中过夜。将杂交的核苷酸插入物以40-100倍摩尔比加入切割的载体中。将连接反应转化到感受态大肠杆菌中，测序鉴定。

(4)感受态酵母与约50-250ng质粒一起温育，另加入12.5-25μg鲑鱼精子DNA作为单链载体DNA以提高转化效率。将转化反应物在大约45℃温育30分钟并直接涂布在合成完全(SC)尿嘧啶脱失培养基(SC-URA)上，平板于30℃孵育4天。

2、酵母(Saccharomyces cerevisiae)突变体的筛选(以某一特性为筛选原则)

维持DNA序列不变和基因稳定性起作用的至少一个基因(如实施例1中错配修复基因MLH1)或者多个基因经CRISPR技术敲除后，酵母的基因稳定性显著降低。在10％的普通麦芽汁培养基和30℃正常培养环境下或者在显著低于常规诱变育种技术中辐射强度和诱变剂浓度下(强度和浓度可低至几个数量级)，增菌培育和大量繁殖上述DNA稳定机制显著缺陷的酵母菌，产生大量的突变体。选择合适的筛选培养基，经富集、初筛、复筛等常规筛选程序，挑选并培育出具备某一优良性状的突变体(如高产酒精)。

3、以酵母(Saccharomyces cerevisiae)错配修复基因(MLH1)为例的原位修复(1)合成含上游SacII下游EagI酶切位点及上下游500bp的回补基因(MLH1)。为了防止其被CRISPER-Cas9系统酶切，引入同义突变消除PAM位点(1817C→T；1802G→A)。具体序列见SEQID NO:2。

(2)将MLH1回补基因在37℃酶切2h的条件下进行SacII和EagI的双酶切，将pML104质粒同时于37℃进行SacII和EagI双酶切4h，最后利用T4连接酶对两个双酶切回收后的PCR产物和质粒于16℃连接14-16h。得到重组的pML104质粒。

(3)合成带粘性末端的靶标序列的寡核苷酸链：

1281-1303位点符合原则的靶标序列的sgRNA序列为：CCT TGGGTTCACTCAGTTGTCGC

根据该靶标序列合成正向寡核苷酸链MLH1sg2-F和与之互补的反向寡核苷酸链MLH1sg2-R，具体序列为：

MLH1sg2-F：5’GATC TGGGTTCACTCAGTTGTCGC GTTTTAGAGCTAG 3’

MLH1sg2-R：5’CTAGCTCTAAAAC GCGACAACTGAGTGAACCCA 3’

其中未标记的为该基因的靶标序列，下划线标记的为与质粒上酶切后互补的BclI粘性末端，灰色标记的是sgRNA结构片段的5'端。

(4)质粒的酶切连接：在25℃下用SwaI(平末端)消化已经连有MLH1基因的pML104质粒过夜，然后在65℃下热灭活20min。随后将BclI加入到消化反应中并在50℃温育至少两小时。酶切后切胶回收回补重组的质粒。含有20mer指导序列和sgRNA的5'末端的杂交寡核苷酸底物随后通常在16℃下过夜连接到切割的sgRNA表达质粒中过夜。将杂交的核苷酸插入物以40-100倍摩尔比加入切割的载体中。将连接反应转化到感受态大肠杆菌中，测序鉴定。

(5)感受态酵母与约50-250ng质粒一起温育，另加入12.5-25μg鲑鱼精子DNA作为单链载体DNA以提高转化效率。将转化反应物在大约45℃温育30分钟并直接涂布在合成完全(SC)尿嘧啶脱失培养基(SC-URA)上，平板于30℃孵育4天。

结果可获得回补了基因MLH1，且具有所需性状的转化株。

实施例2以错配修复基因(MLH1)为靶的水稻突变体获得方法

1、敲除水稻(Oryza sativa IRGSP-1.0.31)错配修复基因(MLH1)的过程和方法

物种名：Oryza sativa IRGSP-1.0.31(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)

敲除基因DNA序列见SEQ ID NO:3。

(1)在第九个外显子上设计出靶标sgRNA序列：(MLH1sgRNA)：

CCA AATGGTCAGAACAGATCCAC

以上靶标序列的反向互补链含有5’-(N)_X-NGG-3’结构。其中，下划线部分为5’-(N)_X-NGG-3’结构中的NGG的互补链序列。

(2)合成带粘性末端的靶标序列的寡核苷酸链：

该靶标序列包括合成正向寡核苷酸链MLH1sg-F和与之互补的反向寡核苷酸链MLH1sg-R，具体序列为：

MLH1sg-F：5’GTTTT AATGGTCAGAACAGATCCAC 3’

MLH1sg-R：5’GTGGATCTGTTCTGACCATT AAAG 3’

其中未标记的为该基因的靶标序列，下划线标记的为与质粒上酶切后互补的BsaI粘性末端。

(3)质粒pRGEB31通过用BsaI内切酶在37℃4h的情况下进行酶切。酶切后切胶回收质粒。含有20mer指导序列和sgRNA的5'末端的杂交寡核苷酸底物随后通常在16℃下过夜连接到切割的sgRNA表达质粒中过夜。将杂交的核苷酸插入物以40-100倍摩尔比加入切割的载体中。将连接反应转化到感受态大肠杆菌中，测序鉴定。

(4)水稻原生质体的制备和转化：水稻种子在MS培养基中发芽后，从水稻的10日龄幼苗中制备稻原生质体。将原生质体在消化溶液(10mM的MES pH值5.7，0.5M甘露醇，1mM的氯化钙，5mM的β-巯基乙醇，0.1％BSA，1.5％纤维素酶R10，和0.75％Macerozume R10)消化5小时。在通过尼龙网(35μm)过滤后，收集原生质体并在W5溶液(2mM MES，pH 5.7,154mMNaCl，5mM KCl，125mM CaCl₂)在室温(25℃)下保持1小时。然后以300g离心5分钟除去W5溶液，并将稻原生质体重悬于MMG溶液(4mM MES，0.6M甘露醇，15mM MgCl₂)中至终浓度为1.0×10⁷ml^-1。转化时，将10μl质粒(5-10μg)与100μl原生质体和110μl PEG-CaCl₂溶液(0.6M甘露醇，100mM CaCl₂，和40％PEG4000)混合，然后在室温下孵育20分钟。加入2倍体积的W5溶液终止转化。然后通过离心收集转化的原生质体并重悬于WI溶液(4mM MES，pH 5.7,0.6M甘露醇，4mM KCl)中。将转化的原生质体接种在24孔培养板中。在WI溶液温育24-72h后，收集原生质体进行鉴定。

(5)原生质体转化鉴定：通过加入100μl预热的CTAB缓冲液从水稻原生质体中提取基因组DNA，并在65℃温育20分钟。然后加入40μl氯仿，并将所得混合物在室温(25℃)下混合温育20分钟。在16 000g离心5分钟，将上清液转移到新管中，并用250μl乙醇混合。在冰上10分钟温育后，基因组DNA通过在室温下16000g离心10分钟而沉淀。将DNA沉淀用0.5ml70％乙醇洗涤并风干。然后将基因组DNA溶于100μl H₂O中，通过分光光度计测定其浓度。

利用引物(F:ATAAGCATGTCTCTCAGAATAAAAGCA和R:TTAAAGTTAACACCTCTCAAAAACTTT)对基因组进行PCR得到的产物进行测序筛选。

2、水稻(Oryza sativa)突变株的筛选(以某一特性为筛选原则)

维持DNA序列不变和基因稳定性起作用的至少一个基因(如本实施例中错配修复基因MLH1)或者多个基因经CRISPR技术敲除后，水稻的基因稳定性显著降低。按照常规的水稻种植方式，大田中培育上述DNA稳定机制显著缺陷的水稻，产生大量的水稻突变体种子。多次大面积种植选种，筛选性状突出的单株(比如早熟、晚熟、高杆、低杆、抗病性等)。筛选出的具备突出性状的种子再根据所需性状进行分类进行小区种植并收获一定量种子。用上述成熟水稻种子在诱导培养基上诱导愈伤组织，再次利用CRISPR技术原位修复和回补MLH1基因或者其他敲除过的基因。MLH1基因的原位修复方法参照下述方法进行。

3、以水稻(Oryza sativa)错配修复基因(MLH1)为例的原位修复

原位修复利用基于geminivirus的CRISPER-Cas9系统进行同源重组来实现。

(1)设计并合成WDV载体(参见Wang M,Lu Y,Botella JR,Mao Y,Hua K,ZhuJK.Gene Targeting by Homology-Directed Repair in Rice Using a Geminivirus-Based CRISPR/Cas9System.Mol Plant.2017；10(7):1007-10)的T-DNA区域。其包括WDV(wheat dwarf virus)的LIR(large intergenic region)和SIR(short intergenicregion)，以及用于同源重组修复的MLH1基因(SEQ ID NO:4)和选择性标记NPTII(neomycine phosphotransferase)基因。MLH1与NPTII之间包含自我剪切的肽段2A。该区域还包括Cas9基因序列以及gRNA序列。WDV载体全长序列见SEQ ID NO:5，其结构为LIR-MLH1-2A-NPTII-gRNA-SIR-Rep/RepA-LIR-cas9promoter-Cas9-cas9terminator。

(2)在第15个外显子上设计gRNA所针对的靶向序列为CCA ACGTGAGTGGACCATTCAGC

(3)为了防止其被CRISPER-Cas9系统酶切，引入同义突变消除PAM位点(3966C→T；6068C→A)。具体序列见SEQ ID NO:4。

(4)水稻原生质体的制备和转化：水稻种子在MS培养基中发芽后，从水稻的10日龄幼苗中制备稻原生质体。将原生质体在消化溶液(10mM的MES pH值5.7，0.5M甘露醇，1mM的氯化钙，5mM的β-巯基乙醇，0.1％BSA，1.5％纤维素酶R10，和0.75％Macerozume R10)消化5小时。在通过尼龙网(35μm)过滤后，收集原生质体并在W5溶液(2mM MES，pH 5.7,154mMNaCl，5mM KCl，125mM CaCl₂)在室温(25℃)下保持1小时。然后通过300g离心5分钟除去W5溶液，并将稻原生质体重悬于MMG溶液(4mM MES，0.6M甘露醇，15mM MgCl₂)中至终浓度为1.0×107ml-1。转化时，将10μl WDV质粒(5-10μg)与100μl原生质体和110μl PEG-CaCl₂溶液(0.6M甘露醇，100mM CaCl₂和40％PEG4000)混合，然后在室温下孵育20分钟。加入2倍体积的W5溶液终止转化。然后通过离心收集转化的原生质体并重悬于WI溶液(4mM MES，pH5.7,0.6M甘露醇，4mM KCl)中。将转化的原生质体接种在24孔培养板中。在WI溶液温育24-72h后，收集原生质体进行鉴定。

(5)原生质体转化鉴定：通过加入100μl预热的CTAB缓冲液从水稻原生质体中提取基因组DNA，并在65℃温育20分钟。然后加入40μl氯仿，并将所得混合物在室温(25℃)下混合温育20分钟。在16000g离心5分钟，将上清液转移到新管中，并用250μl乙醇混合。在冰上10分钟温育后，基因组DNA通过在室温下16000g离心10分钟而沉淀。将DNA沉淀用0.5ml70％乙醇洗涤并风干。然后将基因组DNA溶于100μl H₂O中，通过分光光度计测定其浓度。

利用引物(F:ATAAGCATGTCTCTCAGAATAAAAGCA和R:TTAAAGTTAACACCTCTCAAAAACTTT)对基因组进行PCR得到的产物进行测序筛选。

结果可获得回补了基因MLH1，且具有所需性状的转化株。

上述实施例中仅列举了通过CRISPR-Cas9基因编辑系统对酵母(Saccharomycescerevisiae，R64-1-1)和水稻(Oryza sativa IRGSP-1.0.31)的错配修复基因(MLH1)进行敲除、突变体筛选、突变体错配修复基因(MLH1)原位修复而获得优良性状的基本方法和一般流程。上述实施例中所使用的实验方法和流程中如果没有特殊说明，均为该技术领域中等从业人员可以掌握的常规方法。基于同样的原理、一般方法和基本流程，为了在一定程度上降低育种对象的DNA序列和基因稳定性，我们还可以对维持DNA序列不变和基因稳定性起作用的其他基因进行基因编辑或者基因敲除，这些基因包括但不限于以下几类：涉及DNA复制中起校对功能的基因；涉及DNA修复的基因如其他错配修复基因、核苷酸切除修复基因、碱基切除修复基因；涉及细胞活性氧平衡的基因；涉及细胞周期的关卡基因。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京师范大学

<120> 一种加速物种突变的新育种方法

<130> KHP181113359.2

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2310

<212> DNA

<213> 酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 1

atgtctctca gaataaaagc acttgatgca tcagtggtta acaaaattgc tgcaggtgag 60

atcataatat cccccgtaaa tgctctcaaa gaaatgatgg agaattccat cgatgcgaat 120

gctacaatga ttgatattct agtcaaggaa ggaggaatta aggtacttca aataacagat 180

aacggatctg gaattaataa agcagacctg ccaatcttat gtgagcgatt cacgacgtcc 240

aaattacaaa aattcgaaga tttgagtcag attcaaacgt atggattccg aggagaagct 300

ttagccagta tctcacatgt ggcaagagtc acagtaacga caaaagttaa agaagacaga 360

tgtgcatgga gagtttcata tgcagaaggt aagatgttgg aaagccccaa acctgttgct 420

ggaaaagacg gtaccacgat cctagttgaa gacctttttt tcaatattcc ttctagatta 480

agggccttga ggtcccataa tgatgaatac tctaaaatat tagatgttgt cgggcgatac 540

gccattcatt ccaaggacat tggcttttct tgtaaaaagt tcggagactc taattattct 600

ttatcagtta aaccttcata taccgtccag gataggatta ggactgtgtt caataaatct 660

gtggcttcga atttaattac ttttcatatc agcaaagtag aagatttaaa cctggaaagc 720

gttgatggaa aggtgtgtaa tttgaatttc atatccaaaa agtccatttc accaattttt 780

ttcattaata atagactagt gacatgtgat cttctaagaa gagctttgaa cagcgtttac 840

tccaattatc tgccaaaggg caacagacct tttatttatt tgggaattgt tatagatccg 900

gcggctgttg atgttaacgt tcacccgaca aagagagagg ttcgtttcct gagccaagat 960

gagatcatag agaaaatcgc caatcaattg cacgccgaat tatctgccat tgatacttca 1020

cgtactttca aggcttcttc aatttcaaca aacaagccag agtcattgat accatttaat 1080

gacaccatag aaagtgatag gaataggaag agtctccgac aagcccaagt ggtagagaat 1140

tcatatacga cagccaatag tcaactaagg aaagcgaaaa gacaagagaa taaactagtc 1200

agaatagatg cttcacaagc taaaattacg tcatttttat cctcaagtca acagttcaac 1260

tttgaaggat cgtctacaaa gcgacaactg agtgaaccca aggtaacaaa tgtaagccac 1320

tcccaagagg cagaaaagct gacactaaat gaaagcgaac aaccgcgtga tgccaataca 1380

atcaatgata atgacttgaa ggatcaacct aagaagaaac aaaagttggg ggattataaa 1440

gttccaagca ttgccgatga cgaaaagaat gcactcccga tttcaaaaga cgggtatatt 1500

agagtaccta aggagcgagt taatgttaat cttacgagta tcaagaaatt gcgtgaaaaa 1560

gtagatgatt cgatacatcg agaactaaca gacatttttg caaatttgaa ttacgttggg 1620

gttgtagatg aggaaagaag attagccgct attcagcatg acttaaagct ttttttaata 1680

gattacggat ctgtgtgcta tgagctattc tatcagattg gtttgacaga cttcgcaaac 1740

tttggtaaga taaacctaca gagtacaaat gtgtcagatg atatagtttt gtataatctc 1800

ctatcagaat ttgacgagtt aaatgacgat gcttccaaag aaaaaataat tagtaaaata 1860

tgggacatga gcagtatgct aaatgagtac tattccatag aattggtgaa tgatggtcta 1920

gataatgact taaagtctgt gaagctaaaa tctctaccac tacttttaaa aggctacatt 1980

ccatctctgg tcaagttacc attttttata tatcgcctgg gtaaagaagt tgattgggag 2040

gatgaacaag agtgtctaga tggtatttta agagagattg cattactcta tatacctgat 2100

atggttccga aagtcgatac atctgatgca tcgttgtcag aagacgaaaa agcccagttt 2160

ataaatagaa aggaacacat atcctcatta ctagaacacg ttctcttccc ttgtatcaaa 2220

cgaaggttcc tggcccctag acacattctc aaggatgtcg tggaaatagc caaccttcca 2280

gatctataca aagtttttga gaggtgttaa 2310

<210> 2

<211> 3310

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttgatctg gagttccttc tgatgtcggg ggatggtcat gaggcgtatg tattatcggt 60

attgaagaac tcaggttcca tgagttcatt atcttttata ccagtcggtt ggaagtgaag 120

attattatgc gtgcttcgtt agaatactca gcgtttgttt tcggcttgct ttgatgtttt 180

ttcaaattaa tgaacacaat gtaagaagtc gctatcgttg tagggtccta gagatgtcaa 240

gttagagttc aatcgcaaga aaaataggaa tgtgatacct tctattgcat gcaaagatag 300

tgtaggaggc gctgctattg ccaaagactt ttgagaccgc ttgctgtttc attatagttg 360

aggagttctc gaagacgaga aattagcagt tttcggtgtt tagtaatcgc gctagcatgc 420

taggacaatt taactgcaaa attttgatac gatagtgata gtaaatggaa ggtaaaaata 480

acatagacct atcaataagc atgtctctca gaataaaagc acttgatgca tcagtggtta 540

acaaaattgc tgcaggtgag atcataatat cccccgtaaa tgctctcaaa gaaatgatgg 600

agaattccat cgatgcgaat gctacaatga ttgatattct agtcaaggaa ggaggaatta 660

aggtacttca aataacagat aacggatctg gaattaataa agcagacctg ccaatcttat 720

gtgagcgatt cacgacgtcc aaattacaaa aattcgaaga tttgagtcag attcaaacgt 780

atggattccg aggagaagct ttagccagta tctcacatgt ggcaagagtc acagtaacga 840

caaaagttaa agaagacaga tgtgcatgga gagtttcata tgcagaaggt aagatgttgg 900

aaagccccaa acctgttgct ggaaaagacg gtaccacgat cctagttgaa gacctttttt 960

tcaatattcc ttctagatta agggccttga ggtcccataa tgatgaatac tctaaaatat 1020

tagatgttgt cgggcgatac gccattcatt ccaaggacat tggcttttct tgtaaaaagt 1080

tcggagactc taattattct ttatcagtta aaccttcata taccgtccag gataggatta 1140

ggactgtgtt caataaatct gtggcttcga atttaattac ttttcatatc agcaaagtag 1200

aagatttaaa cctggaaagc gttgatggaa aggtgtgtaa tttgaatttc atatccaaaa 1260

agtccatttc accaattttt ttcattaata atagactagt gacatgtgat cttctaagaa 1320

gagctttgaa cagcgtttac tccaattatc tgccaaaggg caacagacct tttatttatt 1380

tgggaattgt tatagatccg gcggctgttg atgttaacgt tcacccgaca aagagagagg 1440

ttcgtttcct gagccaagat gagatcatag agaaaatcgc caatcaattg cacgccgaat 1500

tatctgccat tgatacttca cgtactttca aggcttcttc aatttcaaca aacaagccag 1560

agtcattgat accatttaat gacaccatag aaagtgatag gaataggaag agtctccgac 1620

aagcccaagt ggtagagaat tcatatacga cagccaatag tcaactaagg aaagcgaaaa 1680

gacaagagaa taaactagtc agaatagatg cttcacaagc taaaattacg tcatttttat 1740

cctcaagtca acagttcaac tttgaaggat cgtctacaaa gcgacaactg agtgaaccca 1800

aggtaacaaa tgtaagccac tcccaagagg cagaaaagct gacactaaat gaaagcgaac 1860

aaccgcgtga tgccaataca atcaatgata atgacttgaa ggatcaacct aagaagaaac 1920

aaaagttggg ggattataaa gttccaagca ttgccgatga cgaaaagaat gcactcccga 1980

tttcaaaaga cgggtatatt agagtaccta aggagcgagt taatgttaat cttacgagta 2040

tcaagaaatt gcgtgaaaaa gtagatgatt cgatacatcg agaactaaca gacatttttg 2100

caaatttgaa ttacgttggg gttgtagatg aggaaagaag attagccgct attcagcatg 2160

acttaaagct ttttttaata gattacggat ctgtgtgcta tgagctattc tatcagattg 2220

gtttgacaga cttcgcaaac tttggtaaga taaacctaca gagtacaaat gtgtcagatg 2280

atatagtttt gtataatctc ctatcagaat ttgacgagtt aaatgacgat gcttccaaag 2340

aaaaaataat tagtaaaata tgggacatga gcagtatgct aaatgagtac tattccatag 2400

aattggtgaa tgatggtcta gataatgact taaagtctgt gaagctaaaa tctctaccac 2460

tacttttaaa aggctacatt ccatctctgg tcaagttacc attttttata tatcgcctgg 2520

gtaaagaagt tgattgggag gatgaacaag agtgtctaga tggtatttta agagagattg 2580

cattactcta tatacctgat atggttccga aagtcgatac atctgatgca tcgttgtcag 2640

aagacgaaaa agcccagttt ataaatagaa aggaacacat atcctcatta ctagaacacg 2700

ttctcttccc ttgtatcaaa cgaaggttcc tggcccctag acacattctc aaggatgtcg 2760

tggaaatagc caaccttcca gatctataca aagtttttga gaggtgttaa ctttaaaacg 2820

ttttggctgt aataccaaag ttttttgttt atttcctgag tgtgattgtg tttcatttga 2880

aagtgtatgc cctttccttt aacgattcat ccgcgagatt tcaaaggata tgaaatatgg 2940

ttgcagttag gaaagtatgt cagaaatgtt atattcggat tgaaactctt ctacaatagt 3000

tctgaagtca cttggttccg tattgttttc gtcctcttcc tcaagcaacg attcttgtct 3060

aagcttattc aacggtacca aagacccgag tccttttatg agagaaaaca tttcatcatt 3120

tttcaactca attatcttaa tatcattttg tagtattttg aaaacaggat ggtaaaacga 3180

atcacctgaa tctagaagct gtaccttgtc ccataaaagt tttaatttac tgagcctttc 3240

ggtcaagtaa actagtttat ctagttttga accgaatatt gtgggcagat ttgcagtaag 3300

ttcagttaga 3310

<210> 3

<211> 6026

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

cttcctagaa ttgtccctct tcacattttg cagtctcctc tcctcctccg ctcgagcgag 60

tgagtcccga ccacgtcgct gccctcgcct caccgccggc caaccgccgt gacgagagat 120

cgagcagggc ggggcatgga cgagccttcg ccgcgcggag gtgggtgcgc cggggagccg 180

ccccgcatcc ggaggttgga ggagtcggtg gtgaaccgca tcgcggcggg ggaggtgatc 240

cagcggccgt cgtcggcggt gaaggagctc atcgagaaca gcctcgacgc tggcgcctcc 300

agcgtctccg ttgcggtgaa ggacggtggc ctcaagctca tccaggtctc cgatgacggc 360

catggcatca gggtacactt ccaaaccaat ccccccaatc tcttaaaccc tcaccgccca 420

actctccatc tcctaaaccc taatcaatgt cgctaatggt aggaatggtt ttagctaatt 480

ttgtttattt gacagtttga ggatttggca atattgtgcg aaaggcatac tacctcaaag 540

ttatctgcat acgaggatct gcagaccata aaatcgatgg ggttcagagg ggaggctttg 600

gctagtatga cttatgttgg ccatgttacc gtgacaacga taacagaagg ccaattgcac 660

ggctacaggt cagtcattga acagattcgg acttttgtgc gcgaagctaa agttgttttt 720

aattgagtga tatcatattt tgtaccaggg tttcttacag agatggtgta atggagaatg 780

agcctaagcc ttgcgctgcg gtgaaaggaa ctcaagtcat ggtcagtcga ctgagtttgc 840

atgaagtaaa tttttgctgt attagttgga aatgtattgt tctgtgtaac caacagaagg 900

ttctctgcag gttgaaaatc tattttacaa catggtagcc cgcaagaaaa cattgcagaa 960

ctccaatgat gactacccca agatcgtaga cttcatcagt cggtttgcag tccatcacat 1020

caacgttacc ttctcttgca gaaaggtgaa tatggtgtct tgtgttatct catcgacttg 1080

aagaggttga cattttcctc ccattatgtc acagcatgga gccaatagag cagatgttca 1140

tagtgcaagt acatcctcaa ggttagatgc tatcaggagt gtctatgggg cttctgtcgt 1200

tcgtgatctc atagaaataa aggtttcata tgaggatgct gcagattcaa tcttcaagat 1260

ggatggttac atctcaaatg caaattatgt ggcaaagaag attacaatga ttcttttcat 1320

aaatggtaca aaagatagtt tccattcact ggaatatgtg aaactctaga tgctaatggt 1380

ttaatatgaa cataagaact catgtgcact acttcccatg tagataatgc ttgtggttag 1440

gtttggcaag ttggttggct tctgttcatt taactgagtt attattgtca aaagtggtta 1500

atttctaggg aataaatcta tatacccatt gatatgaaac tgcataaatc ccccaaaatc 1560

tatggttaac catagtttac agctcttctt tacggtcaca tatgtttctg tggtttagca 1620

attaattgtc ttcatattta tgtttcagat aggcttgtag actgtactgc tttgaaaaga 1680

gctattgaat ttgtgtactc tgcaacattg cctcaagcat ccaaaccttt catatacatg 1740

tccatacatc ttccatcaga acacgtggat gttaatatac acccaaccaa gaaagaggta 1800

tattgtgacc cacatccttg gaagaatttt tcgagaggac acttctaatt attctttcag 1860

attttgagca ctgcaatttt ccactaagag aacactaaat tgcctttttg gttatccctt 1920

ttgtcttgca ggttagcctt ttgaatcaag agcgtattat tgaaacaata agaaatgcta 1980

ttgaggaaaa actgatgaat tctaatacaa ccaggatatt ccaaactcag gtacttcagg 2040

tttattttac actatatatc tgcatttgta ttgcatacat catttatttc ccttcaatgc 2100

atctgtacta cccaaatcag tatgatgagg ctattgtggg tgataaactg ttaagttttc 2160

ttgtgggtta ctttcgttct gtatgtttgt ttagttttca ttgtgtgact ggtcattatt 2220

ttcggggaca atgtatctgt tgcaatcttc caagctgcat gactgcgtta acttataaac 2280

attcctaaat acttgcaagt actatgctgg aatagtgaaa ttcatgctaa ttttcatcaa 2340

aattttcgcg taagaaaagg atctgtcact agatggtcct ctatgaaaaa gaaaagctta 2400

gattgaataa agcttccctt gtgttcgtga aatggtgtct ggtgtgccag tggtgtttgt 2460

atgcatgcat actggatttt ataatcttta atatatgtaa ctccagtaca atatactctg 2520

aaataaaaac attacttgct tattatcaac ttgtggcatt aagttccaat tattgaattg 2580

cagataaact ttatcttcat catcaaaaat atttacaaat gcatttttca tgatgatgcg 2640

aactttgtcc ccatcaatgc tgctccatgt acattgcagg cattaaactt atcagggatt 2700

gctcaagcta acccacaaaa ggataaggtt tctgaggcca gtatgggttc tggtatgtaa 2760

gatctattca acatttatta tattgggtaa aatactttta gatcaattcc tttttgagct 2820

acagtgttgt aatttgtaaa aaatatggca tgtgctacta gcacattagt ttacggtgga 2880

tattcaacta tcaagttatt agtagtctgc ctccttaccc agccatctct tactgcagga 2940

acaaaatctc aaaaaattcc tgtgagccaa atggtcagaa cagatccacg caatccatct 3000

ggaagattgc acacctactg gcacgggcaa tcttcaaatc ttgaaaagaa atttgatctt 3060

gtatctgtaa ggtatgggct ttgttagcaa actattaact gttcaccgtt ttcatattct 3120

ctgttctgtt cagttatatt tgtgttccct gaacctgaaa ttatttacgt gcactatgca 3180

tcctcatgtg aggaatttgg tgtttacatt actctggttt agttggaagt gctggaaatt 3240

tatttattta ttacattggt tgctaaaatt cagacaatcc atttaaagat gtgagaagga 3300

ttatcttaat tcattgattt tcactgggtt tgtcctgttc tacttgtaca atgttctcca 3360

agaaatgttg taagatcaag gagaaaccaa aaagatgctg gtgatttgtc aagccgtcat 3420

gagctccttg tggaaataga ttctagcttc catcctggta agctcatctt actccccggt 3480

gcctgttgca gtgcctgcct ccattgttct agactaatta tttatttttt cttcaggcct 3540

tttggacatt gtcaagaact gcacatatgt tggacttgcc gatgaagcct ttgctttgat 3600

acaacacaat acccgcttat accttgtaaa tgtggtaaat attaggtaaa tttaacagtg 3660

cattgatttt caccatttcc attttgacta gtgttctatg ccttttctgt catataaatt 3720

tagaatatct gacatgacca gaatcacagt tttattcagc gcaccataat caaactgctg 3780

tctaatgcat atcatataca actgccctct cgcaactacc gacctctatt gcatcaattt 3840

tgtccctgtg gtaaaccact ctggtatttt tttcttatgt atattcactg ttatgcagta 3900

aagaacttat gtaccagcaa gctttgtgcc gttttgggaa cttcaatgct attcagctca 3960

gtgaaccagc tccacttcag gagttgctgg tgatggcact gaaagacgat gaattgatga 4020

gtgatgaaaa ggatgatgag aaactggaga ttgcagaagt aagctatttt ctcaactgct 4080

tgaggttttg ttagtcttgt gacgaatttt gttttgtcca tctgcacgct gtttttactt 4140

tggacttttg gtgcagtcaa cataatttaa tgatgtatta tttatttgtt tgcaggtaaa 4200

cactgagata ctaaaagaaa atgctgagat gattaatgag tacttttcta ttcacattga 4260

tcaagatggc aaattgacaa gacttcctgt tgtactggac cagtacaccc ctgatatgga 4320

ccgtcttcca gaatttgtgt tggctttagg aaatgatgta ggtttcttct ttcactaatt 4380

taaatttgga catggtttct aactacgtat tgaatccaga agtaactctt ttttcttagg 4440

ttataccatt cttatttctc tcttaatttc agtctccaga ggtgtttgtt catgaaatat 4500

tttgcttgac tacactagtt ccttcaattc tggctatctt tatttattgt taattgtaat 4560

tactgtcata taacaggtta cttgggatga cgagaaagag tgcttcagaa cagtagcttc 4620

tgctgtagga aacttctatg cacttcatcc cccaatcctt ccaaatccat ctgggaatgg 4680

cattcattta tacaagaaaa atagagattc aatggctgat gaacatgctg agaatgatct 4740

aatatcaggt gagctctttg catacttgat atttgtattt tagaaccatt gaagtgtgta 4800

cggaacagat atgccaaact gtaaccttag tagacaaact gcacacggat tttcccccag 4860

tcagatagca tggcatggga tttgacaaca tatctaacaa gattccattg catgtgatgc 4920

tacagctaga tattcatggt caattgtagc attgagttta tgtgtttttg attcaaagtt 4980

aactgctagt ggttctaaat accaactgca ctacagatga aaatgacgtt gatcaagaac 5040

ttcttgcgga agcagaagca gcatgggccc aacgtgagtg gaccattcag catgtcttgt 5100

ttccatccat gcgacttttc ctcaagcccc cgaagtcaat ggcaacagat ggaacgtttg 5160

tgcaggttcc ttctgatctt tagtaaacat atgtgcttct attttttgaa ttaaaataga 5220

tatggcttaa ccactgaaac tttactttta aaattaaaag ctcattttgg catcctaatt 5280

ttcttatcat gcttctacaa ttttatgctt actgttccaa gcattggcat tatattgttc 5340

aaaaacctaa tggtgttgtg aattatttga tactccctcc gtcccaaaat atgcctacct 5400

tggatggagg gagtagaaat taaattggaa aatatttaaa ttttagctgc acaaacagaa 5460

aaatgatact ttagaagcag caatgtcttg aagtccaggc cacatacttg taacggtact 5520

ttaaaaagat catctagttt tctgtaggca acttaaaaca taaaaagaaa tgaaatgaat 5580

atatgttcta acaagtagaa ttacgaatca caattactga tgataagttg ataacatctg 5640

ctaatttctg actttgattt tgaacttatt atgcaggttg cttccttgga gaaactctac 5700

aagatttttg aaaggtgtta gctcataagt gagaaaatga aggcagagta agatcatgat 5760

tcatggagtg tttttgaaaa tgtgtataat ttcaccgtat tatgtacttt gatagtgtct 5820

gtagaaactg aagaaagaaa gatggcttta cttctgaatt gaaagttaac gatgccagca 5880

attgtatatt ctgatcaaac attggcgtct actactctac tagcaagtga tcttccttag 5940

ctccaggtcg acaagaatca agaatgtgtg tgttgtaccc aatttattta gccaaaatga 6000

aaaggtatat tttctaagtt caaaaa 6026

<210> 4

<211> 8025

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgtcgcaaa gctgcacaga attgcttgct tgtaacaata gaaatcaaca acccacgctg 60

tgaaatttta ctcaacctaa gccaaactgc taggaagcca gacgcaatgc aagatacctg 120

gagaccatac atgtcttggc cgtggcttgc tccctctgga aagctctcaa cctcgctttc 180

tccatgtata cagctcccga gctcgcgccg caggccgatc taaacaacct caagtgctaa 240

ccgatgaaac acagtgagct cgctactaac taagctgcga tgcgatgcga gaaatcaaag 300

gcgttcgtct ccggcctacc tacctgcgcc ctgcagaaat caacggcgca tcggtagtac 360

gagcctgtag atcacgcaga ggaagagcgc gcatcataga gccgggcggc tgagacggaa 420

tcagcgcctg atttgccatg gacgcggact gaagcgagat cgtggggatt cgagttgctt 480

acccgtccag atggagcgga agcgggagga gcaattgggg ggaatcgccg cgtcgcgctc 540

gtctccgccg ccgcggttgc cgggaagaag agggctcgcc gccgccgccg ccgctctgat 600

agtgaagcga ctccggtggt cgggagctcg gagcggacac cagccgttgg atggaagaac 660

caacggacaa gatgcaggta attcgacatt atgcacaaaa ccccctgaat atattactat 720

ttctttttac cttgtaccct tttgttgaag gggagaaaat tgggaagtac tccctccatc 780

ccaatataag ggattttgat tttttttcct gtactgttta accactcgta ttatttaaaa 840

aaaattagaa ttattattta ttttttttac tttcttttaa agtactttaa gcataacttt 900

ttattttttt atatttacac aaatttttaa ataagacaag tagccaaaca gtacaaacaa 960

aaaattcaag gagtactata gtgtaacatt tacaatttac ttcctagaat tgtccctctt 1020

cacattttgc agtctcctct cctcctccgc tcgagcgagt gagtcccgac cacgtcgctg 1080

ccctcgcctc accgccggcc aaccgccgtg acgagagatc gagcagggcg gggcatggac 1140

gagccttcgc cgcgcggagg tgggtgcgcc ggggagccgc cccgcatccg gaggttggag 1200

gagtcggtgg tgaaccgcat cgcggcgggg gaggtgatcc agcggccgtc gtcggcggtg 1260

aaggagctca tcgagaacag cctcgacgct ggcgcctcca gcgtctccgt tgcggtgaag 1320

gacggtggcc tcaagctcat ccaggtctcc gatgacggcc atggcatcag ggtacacttc 1380

caaaccaatc cccccaatct cttaaaccct caccgcccaa ctctccatct cctaaaccct 1440

aatcaatgtc gctaatggta ggaatggttt tagctaattt tgtttatttg acagtttgag 1500

gatttggcaa tattgtgcga aaggcatact acctcaaagt tatctgcata cgaggatctg 1560

cagaccataa aatcgatggg gttcagaggg gaggctttgg ctagtatgac ttatgttggc 1620

catgttaccg tgacaacgat aacagaaggc caattgcacg gctacaggtc agtcattgaa 1680

cagattcgga cttttgtgcg cgaagctaaa gttgttttta attgagtgat atcatatttt 1740

gtaccagggt ttcttacaga gatggtgtaa tggagaatga gcctaagcct tgcgctgcgg 1800

tgaaaggaac tcaagtcatg gtcagtcgac tgagtttgca tgaagtaaat ttttgctgta 1860

ttagttggaa atgtattgtt ctgtgtaacc aacagaaggt tctctgcagg ttgaaaatct 1920

attttacaac atggtagccc gcaagaaaac attgcagaac tccaatgatg actaccccaa 1980

gatcgtagac ttcatcagtc ggtttgcagt ccatcacatc aacgttacct tctcttgcag 2040

aaaggtgaat atggtgtctt gtgttatctc atcgacttga agaggttgac attttcctcc 2100

cattatgtca cagcatggag ccaatagagc agatgttcat agtgcaagta catcctcaag 2160

gttagatgct atcaggagtg tctatggggc ttctgtcgtt cgtgatctca tagaaataaa 2220

ggtttcatat gaggatgctg cagattcaat cttcaagatg gatggttaca tctcaaatgc 2280

aaattatgtg gcaaagaaga ttacaatgat tcttttcata aatggtacaa aagatagttt 2340

ccattcactg gaatatgtga aactctagat gctaatggtt taatatgaac ataagaactc 2400

atgtgcacta cttcccatgt agataatgct tgtggttagg tttggcaagt tggttggctt 2460

ctgttcattt aactgagtta ttattgtcaa aagtggttaa tttctaggga ataaatctat 2520

atacccattg atatgaaact gcataaatcc cccaaaatct atggttaacc atagtttaca 2580

gctcttcttt acggtcacat atgtttctgt ggtttagcaa ttaattgtct tcatatttat 2640

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<210> 5

<211> 16088

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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aagtgtgata aatcaacatc ttccacgaaa gtgatcagaa aagatgtggt ccaaaagcct 120

ccgcgcactc acgaaaagcc gagtgcgcgt cgggggccac cacgcggggt aatattataa 180

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cgtgagtgga ccattcagca tgtcttgttt ccatccatgc gacttttcct caagcccccg 6540

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gtgcttctat tttttgaatt aaaatagata tggcttaacc actgaaactt tacttttaaa 6660

attaaaagct cattttggca tcctaatttt cttatcatgc ttctacaatt ttatgcttac 6720

tgttccaagc attggcatta tattgttcaa aaacctaatg gtgttgtgaa ttatttgata 6780

ctccctccgt cccaaaatat gcctaccttg gatggaggga gtagaaatta aattggaaaa 6840

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gtccaggcca catacttgta acggtacttt aaaaagatca tctagttttc tgtaggcaac 6960

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caccgtatta tgtactttga tagtgtctgt agaaactgaa gaaagaaaga tggctttact 7260

tctgaattga aagttaacga tgccagcaat tgtatattct gatcaaacat tggcgtctac 7320

tactctacta gcaagtgatc ttccttagct ccaggtcgac aagaatcaag aatgtgtgtg 7380

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tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga 8880

tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg 8940

gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc 9000

agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac 9060

acatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat 9120

cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga 9180

tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc 9240

cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgaacgtg 9300

agtggaccat tcagcctgtc ctagcgcgga cggcgtacag tttctataaa tgtaatatct 9360

cagggtgttg tatttcgttt tccgatgtca ttgtgtaagg gttgtttttt gttataattt 9420

ggtttgtctt tgctcgtagc cgagcctctg taatcgaatg acatgagata aataaaatat 9480

tattttaatg gcctcttcat ctgcacccag gttccgtgtc tattccaagt acctctttct 9540

aacatatcct caatgtaccc ttgagccaca gtacgccttg gattcacttc gcactctctt 9600

gaacaaatat gagcccctct acatcgctgc tgttagagag ctccacgaag atggatcacc 9660

acatctgcac gttctcgtgc agaacaagct tcgtgcttcc atcaccaatc ccaatgcctt 9720

aaacctccgt atggatacat ctccattctc catattccat ccaaatatac aagctgccaa 9780

agactgcaac caagttcgtg attacatcac gaaggaggtt gactccgatg caaacacagc 9840

tgagtgggga acattcgtgg cagtttcaac tccaggtcgt aaagaccgtg atgcggatat 9900

gaaacagatc attgaatcta gttcctctcg cgaggaattc ctcagcatgg tttgcaatcg 9960

ttttccgttt gaatggtcta tccgtctcaa agacttcgag tacacggcac gccatctatt 10020

tcctgaccca gttgccactt acacacctga gtttccaacc gaatcactca tttgccatga 10080

gaccattgaa agctggaaaa atgaacatct ctactccgta agcctcgaat cctatatcat 10140

ttgtacttcc actcctgcgg atcaagcgca atctgactta gagtggatgg acgattattc 10200

caggagtcac cggggaggca taagtccatc tacatctgcg ggccaaccag aacaggaaag 10260

acttcctggg caaggtctct agggacacac aattattata acagtctagt tgatttcaca 10320

acatatgacg tcaacgccaa gtataatatc atcgacgaca ttccattcaa gttcacaccg 10380

aactggaagt gcttcgtcgg ggctcagcgt gacttcacgg tcaatccaaa atatggtaag 10440

cgaaaagtca tacggggtgg aataccttgc atcattttag ttaatccaga cgaagattgg 10500

ctcaaggata tgactcccga acagtcggat tacatgtact ctaacgctgt tgttcactac 10560

atgtatgaag gcgagtcttt catcaactac tcgttcgcct ccggcgaaga tgtcactgct 10620

tcgcagtgac gagatgggct accgcgcact tccttataag ctaaggcatg gcacagattt 10680

ccaagtcaaa agtgtgataa atcaacatct tccacgaaag tgatcagaaa agatgtggtc 10740

caaaagcctc cgcgcactca cgaaaagccg agtgcgcgtc gggggccacc acgcggggta 10800

atattataac ccgcgtggag gccccccgac cacacaccga acagggccca cacgatacgc 10860

tacgctcccg tgggaacaca agggccctgt tctcccgcca aaacctgccc tatataaagc 10920

attggacaca ttgcatttgc agtgtgcaga attcacacct ccacgcaggg tagagcatag 10980

agttttctgg cacaccccgt tttttcgcta aggacctgcc ggacttctgt tcactacctc 11040

attatcaata ctgccatttc aaagaatacg taaataatta atagtagtga ttttcctaac 11100

tttatttagt caaaaaatta gccttttaat tctgctgtaa cccgtacatg cccaaaatag 11160

ggggcgggtt acacagaata tataacatcg taggtgtctg ggtgaacagt ttattcctgg 11220

catccactaa atataatgga gcccgctttt taagctggca tccagaaaaa aaaagaatcc 11280

cagcaccaaa atattgtttt cttcaccaac catcagttca taggtccatt ctcttagcgc 11340

aactacagag aacaggggca caaacaggca aaaaacgggc acaacctcaa tggagtgatg 11400

caacctgcct ggagtaaatg atgacacaag gcaattgacc cacgcatgta tctatctcat 11460

tttcttacac cttctattac cttctgctct ctctgatttg gaaaaagctg aaaaaaaagg 11520

ttgaaaccag ttccctgaaa ttattcccct acttgactaa taagtatata aagacggtag 11580

gtattgattg taattctgta aatctatttc ttaaacttct taaattctac ttttatagtt 11640

agtctttttt ttagttttaa aacaccaaga acttagtttc gaataaacac acataaacaa 11700

acaaaagatc tgatatggat cgaattagat ctcgccacca tggacaagaa gtattctatc 11760

ggactggaca tcgggactaa tagcgtcggg tgggccgtca tcactgacga gtacaaggtg 11820

ccctctaaga agttcaaggt gctcgggaac accgaccggc attccatcaa gaaaaatctg 11880

atcggagctc tcctctttga ttcaggggag accgctgaag caacccgcct caagcggact 11940

gctagacggc ggtacaccag gaggaagaac cggatttgtt accttcaaga gatattctcc 12000

aacgaaatgg caaaggtcga cgacagcttc ttccataggc tggaagaatc attcctcgtg 12060

gaagaggata agaagcatga acggcatccc atcttcggta atatcgtcga cgaggtggcc 12120

tatcacgaga aatacccaac catctaccat cttcgcaaaa agctggtgga ctcaaccgac 12180

aaggcagacc tccggcttat ctacctggcc ctggcccaca tgattaagtt cagaggccac 12240

ttcctgatcg agggcgacct caatcctgac aatagcgatg tggataaact gttcatccag 12300

ctggtgcaga cttacaacca gctctttgaa gagaacccca tcaatgcaag cggagtcgat 12360

gccaaggcca ttctgtcagc ccggctgtca aagagccgca gacttgagaa tcttatcgct 12420

cagctgccgg gtgaaaagaa aaatggactg ttcgggaacc tgattgctct ttcacttggg 12480

ctgactccca atttcaagtc taatttcgac ctggcagagg atgccaagct gcaactgtcc 12540

aaggacacct atgatgacga tctcgacaac ctcctggccc agatcggtga ccaatacgcc 12600

gaccttttcc ttgctgctaa gaatctttct gacgccatcc tgctgtctga cattctccgc 12660

gtgaacactg aaatcaccaa ggcccctctt tcagcttcaa tgattaagcg gtatgatgag 12720

caccaccagg acctgaccct gcttaaggca ctcgtccggc agcagcttcc ggagaagtac 12780

aaggaaatct tctttgacca gtcaaagaat ggatacgccg gctacatcga cggaggtgcc 12840

tcccaagagg aattttataa gtttatcaaa cctatccttg agaagatgga cggcaccgaa 12900

gagctcctcg tgaaactgaa tcgggaggat ctgctgcgga agcagcgcac tttcgacaat 12960

gggagcattc cccaccagat ccatcttggg gagcttcacg ccatccttcg gcgccaagag 13020

gacttctacc cctttcttaa ggacaacagg gagaagattg agaaaattct cactttccgc 13080

atcccctact acgtgggacc cctcgccaga ggaaatagcc ggtttgcttg gatgaccaga 13140

aagtcagaag aaactatcac tccctggaac ttcgaagagg tggtggacaa gggagccagc 13200

gctcagtcat tcatcgaacg gatgactaac ttcgataaga acctccccaa tgagaaggtc 13260

ctgccgaaac attccctgct ctacgagtac tttaccgtgt acaacgagct gaccaaggtg 13320

aaatatgtca ccgaagggat gaggaagccc gcattcctgt caggcgaaca aaagaaggca 13380

attgtggacc ttctgttcaa gaccaataga aaggtgaccg tgaagcagct gaaggaggac 13440

tatttcaaga aaattgaatg cttcgactct gtggagatta gcggggtcga agatcggttc 13500

aacgcaagcc tgggtaccta ccatgatctg cttaagatca tcaaggacaa ggattttctg 13560

gacaatgagg agaaagagga catccttgag gacattgtcc tgactctcac tctgttcgag 13620

gaccgggaaa tgatcgagga gaggcttaag acctacgccc atctgttcga cgataaagtg 13680

atgaagcaac ttaaacggag aagatatacc ggatggggac gccttagccg caaactcatc 13740

aacggaatcc gggacaaaca gagcggaaag accattcttg atttccttaa gagcgacgga 13800

ttcgctaatc gcaacttcat gcaacttatc catgatgatt ccctgacctt taaggaggac 13860

atccagaagg cccaagtgtc tggacaaggt gactcactgc acgagcatat cgcaaatctg 13920

gctggttcac ccgctattaa gaagggtatt ctccagaccg tgaaagtcgt ggacgagctg 13980

gtcaaggtga tgggtcgcca taaaccagag aacattgtca tcgagatggc cagggaaaac 14040

cagactaccc agaagggaca gaagaacagc agggagcgga tgaaaagaat tgaggaaggg 14100

attaaggagc tcgggtcaca gatccttaaa gagcacccgg tggaaaacac ccagcttcag 14160

aatgagaagc tctatctgta ctaccttcaa aatggacgcg atatgtatgt ggaccaagag 14220

cttgatatca acaggctctc agactacgac gtggaccaca tcgtccctca gagcttcctc 14280

aaagacgact caattgacaa taaggtgctg actcgctcag acaagaaccg gggaaagtca 14340

gataacgtgc cctcagagga agtcgtgaaa aagatgaaga actattggcg ccagcttctg 14400

aacgcaaagc taatcactca gcggaagttc gacaatctca ctaaggctga gaggggcgga 14460

ctgagcgaac tggacaaagc aggattcatt aaacggcaac ttgtggagac tcggcagatt 14520

actaaacatg tagcccaaat ccttgactca cgcatgaata ccaagtacga cgaaaacgac 14580

aaacttatcc gcgaggtgaa ggtgattacc ctgaagtcca agctggtcag cgatttcaga 14640

aaggactttc aattctacaa agtgcgggag atcaataact atcatcatgc tcatgacgca 14700

tatctgaatg ccgtggtggg aaccgcccta atcaagaagt acccaaagct ggaaagcgag 14760

ttcgtgtacg gagactacaa ggtctacgac gtgcgcaaga tgattgccaa atctgagcag 14820

gagatcggaa aggccaccgc aaagtacttc ttctacagca acatcatgaa tttcttcaag 14880

accgaaatca cccttgcaaa cggtgagatc cggaagaggc cgctcatcga gactaatggg 14940

gagactggcg aaatcgtgtg ggacaagggc agagatttcg ctaccgtgcg caaagtgctt 15000

tctatgcctc aagtgaacat cgtgaagaaa accgaggtgc aaaccggagg cttttctaag 15060

gaatcaatcc tccccaagcg caactccgac aagctcattg caaggaagaa ggattgggac 15120

cctaagaagt acggcggatt cgattcacca actgtggctt attctgtcct ggtcgtggct 15180

aaggtggaaa aaggaaagtc taagaagctc aagagcgtga aggaactgct gggtatcacc 15240

attatggagc gcagctcctt cgagaagaac ccaattgact ttctcgaagc caaaggttac 15300

aaggaagtca agaaggacct tatcatcaag ctcccaaagt atagcctgtt cgaactggag 15360

aatgggcgga agcggatgct cgcctccgct ggcgaacttc agaagggtaa tgagctggct 15420

ctcccctcca agtacgtgaa tttcctctac cttgcaagcc attacgagaa gctgaagggg 15480

agccccgagg acaacgagca aaagcaactg tttgtggagc agcataagca ttatctggac 15540

gagatcattg agcagatttc cgagttttct aaacgcgtca ttctcgctga tgccaacctc 15600

gataaagtcc ttagcgcata caataagcac agagacaaac caattcggga gcaggctgag 15660

aatatcatcc acctgttcac cctcaccaat cttggtgccc ctgccgcatt caagtacttc 15720

gacaccacca tcgaccggaa acgctatacc tccaccaaag aagtgctgga cgccaccctc 15780

atccaccaga gcatcaccgg actttacgaa actcggattg acctctcaca gctcggaggg 15840

gatgagggag ctcccaagaa aaagcgcaag gtaggtagtt ccggatccta gactctcgag 15900

gcgaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa aataagtgta 15960

tacaaatttt aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat tcttattctt gagtaactct 16020

ttcctgtagg tcaggttgct ttctcaggta tagcatgagg tcgctcttat tgaccacacc 16080

tctaccgg 16088

Claims (10)

1.一种加速物种突变的新育种方法，其特征在于，通过基因工程手段，对物种中负责DNA复制和/或遗传稳定性的基因进行定点突变，使得该基因功能缺失或减弱，从而提高育种对象在生长和发育过程中的突变率，并从中筛选出具备所需性状的突变体；再通过基因工程手段，将突变体中相应的负责DNA复制和/或遗传稳定性，且发生功能缺失或减弱的基因进行定点突变，使得该基因的功能重新恢复，即获得具备所需性状的新品种；

优选地，在筛选突变体的过程中辅以低剂量的诱变措施。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因工程手段是指具备一定靶向能力的基因编辑技术，包括CRISPR/Cas基因编辑技术、锌指核酸酶基因编辑技术、转录激活因子样效应物核酸酶基因编辑技术。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述育种对象包括微生物细胞，植物的体细胞、愈伤组织、花药和原生质体，动物的胚胎干细胞；

供筛选的突变体包括单个微生物克隆，整株植物或植物的器官、组织、芽、胚、愈伤组织、花药和原生质体，动物个体。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述负责DNA复制和/或遗传稳定性的基因包括以下几类：涉及DNA复制中起校对功能的基因；涉及DNA修复的基因，包括错配修复基因、核苷酸切除修复基因、碱基切除修复基因；涉及细胞活性氧平衡的基因；涉及细胞周期的关卡基因。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述涉及DNA复制中起校对功能的基因，包括原核生物DNA聚合酶基因Pol I、Pol II、Pol III、Pol IV、Pol V；真核生物DNA聚合酶基因Polα、Polβ、Polγ、Polδ、Polε、Polσ、Polζ、Polλ、Polμ、Polι、Polκ、Polη。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述错配修复基因包括原核生物的MutS及其同源基因、MutL及其同源基因、MutH及其同源基因、增殖细胞核抗原β-滑动钳基因；真核生物的MSH及其同源基因、MLH及其同源基因、PMS及其同源基因。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述碱基切除修复基因包括DNA糖基化酶基因如Uracil-DNA糖基化酶基因家族、Nth家族、Fgp家族；AP内切核酸酶基因如Xth家族、Nfo家族、PALF家族；DNA聚合酶基因Pol I、Polγ。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述核苷酸切除修复基因包括原核生物的UvrA、UvrB、UvrC基因；真核生物的GC-NER和TC-NER基因，CSA、CSB、RPA、RAD、ERCC、XPA-XPG基因。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述涉及细胞活性氧平衡的基因包括超氧化物歧化酶基因、过氧化氢酶基因、谷胱甘肽过氧化物酶基因。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述涉及细胞周期的关卡基因包括ATM丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因，ATR丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因，p53基因。