JP2007143562A - 所望の形質を生物に迅速に付与する方法およびシステム - Google Patents

所望の形質を生物に迅速に付与する方法およびシステム Download PDF

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Abstract

【課題】天然の進化に即しつつ、所望の遺伝形質を生物に付与する方法を提供すること。
【解決手段】細胞の遺伝形質の変換速度を調節する方法であって、（ａ）該細胞の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節する工程、
を包含する、方法；または生物の遺伝形質の変換速度を調節するために使用するための、少なくとも２つのポリメラーゼのセットであって、該ポリメラーゼのエラープローン頻度は互いに異なる、セットであって、その１つの実施形態において、上記少なくとも２つのポリメラーゼのうち少なくとも１つはラギング鎖のエラープローン頻度に関与し、少なくとも別の一つはリーディング鎖のエラープローン頻度に関与する、記載のセットなど。
【選択図】なし

Description

本発明は、生物の遺伝形質を迅速に改変する方法およびこの方法によって得られた生物およびその生産物に関する。
生物の遺伝形質を改変することは、有史以来人類が行ってきた試みである。いわゆる遺伝子工学が発展する前は、かけあわせなどによって所望の形質を有する生物を得ようとし、あるいは、放射線などによる変異体を偶然に発見し、そのような変異体を分離することによって、遺伝形質が改変された生物を得てきていた。
近年の遺伝子工学の発展により、遺伝形質が改変された生物を得ることは、かなり容易になっている。遺伝子工学による遺伝子改変生物の生産において、外来遺伝子を生物に導入することが広く行われている。しかし、そのような外来遺伝子を生物に導入しただけでは、所望の遺伝形質を得られないことも多く、また、天然の進化とは矛盾する操作を行うことから、予想外の結果を招くこともある。したがって、当局は、いわゆる遺伝子組換（ＧＭＯ）由来の食品は、従来の食品よりも厳しい規制をかけている。
したがって、当該分野において、天然の進化に即しつつ、所望の遺伝形質を生物に付与する方法およびそのような生物を生産する方法に対する要望はますます強まるばかりである。
現在までに知られている変異誘発方法としては、以下のものが知られている。
（１）自然変異：生物が通常の環境下で正常に生育しているときに発生する変異を、自然変異という。自然変異の主な原因は、ＤＮＡ複製時の誤りと、内在性の変異原物質（ヌクレオチドアナログ）であると考えられている（非特許文献１）。
（２）放射線、変異原物質などによる処理：紫外線やＸ線などの放射線処理、あるいはアルキル化剤のような人工的な変異原物質処理によって、ＤＮＡに損傷が生じる。その損傷は、ＤＮＡ複製の過程で変異に固定される。
（３）ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法の利用：ＰＣＲ法は、試験管内でＤＮＡを増幅するため、細胞内の変異抑制機構の一部が欠けており、高頻度に変異の誘発が可能である。また、遺伝子シャフリング法（非特許文献２）と組み合わせることで、有害変異の蓄積を避け、複数の有益変異を遺伝子に蓄積することができる。
（４）変異因子（またはミューテーター）の利用：ほとんどすべての生物では、変異抑制機構によって、自然変異の発生率が非常に低いレベルに保たれている。この変異抑制機構には、１０種類以上の遺伝子が関与した複数の段階が存在する。これらの遺伝子の１つあるいは複数が破壊された個体は、高い頻度で変異を発生するので、ミューテーターと呼ばれている。また、これらの遺伝子は、ミューテーター遺伝子と呼ばれている（非特許文献１および３）。
ミューテーターを利用した方法に分類されるものに、ディスパリティー法がある（非特許文献４および５；特許文献１〜４）。しかし、このディスパリティー法では、特に高等生物（例えば、真核生物）実際に生産された生物が正常な成長曲線を示すかどうか判明していない。
複数の複製開始点を持つ複数の染色体よりなる２倍体以上の“高等生物”（例えば、真核生物）における不均衡変異モデルのシミュレーションでは、致死的な変異が入る可能性も否定できておらず、実際の方法に使用され得るか不明であると考えられる。
不均衡変異モデルのシミュレーションに於いては、たとえば複製精度の低い不連続鎖に変異がランダムに入るとされており、そのような場合進化に寄与するかどうか不明である。
大腸菌にミューテーターを導入して作製した変異株を用いた薬剤耐性実験では、実際に薬剤耐性株が得られている。しかし、進化の速度を自由に変換または制御することができるシステムは示唆すらされていない。
進化速度の一つの指標であるゲノムレベルの解析で本当に変異が不均衡に入っているかどうか確かめられた実験はなく、配列決定の技術自体が簡単に行えることにかんがみると、変異が入ったということを報告した例はまったくないといえる。
真木，「自然変異と修復機構」，細胞工学 Ｖｏｌ．１３ Ｎｏ．８，ｐｐ．６６３−６７２，１９９４ Ｓｔｅｍｍｅｒ ，Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．３７０，ｐｐ．３８９−３９１，Ａｕｇ．１９９４ Ｈｏｒｓｔ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．７ Ｎｏ．１，ｐｐ．２９−３６，Ｊａｎ．１９９９ Ｆｕｒｕｓａｗａ Ｍ．ａｎｄ Ｄｏｉ Ｈ．，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１５７，ｐｐ．１２７−１３３，１９９２ Ｆｕｒｕｓａｗａ Ｍ．ａｎｄ Ｄｏｉ Ｈ．，Ｇｅｎｅｔｉｃａ １０３，ｐｐ．３３３−３４７，１９９８ 特開平８-１６３９８６号 特開平８-１６３９８７号 特開平９-２３８８２号 ＷＯ００／２８０１５
本発明は、天然の進化に即しつつ、所望の遺伝形質を生物に付与する方法を提供することを課題とする。
上記課題は、本発明者らが、生物の進化の速度が時間の函数でないことを見出し、生物のエラープローン頻度を調節することにより進化速度を調節することができることを見出し、実際の生物において進化速度が改変された生物が、天然に得られる進化した生物と実質的に同じ増殖速度で増殖することを実証することによって解決された。また、本発明により、エラー閾値は生物の進化に実質的に影響がないという効果を実証することができた。
別の局面において、本発明者らは、本発明において、複製の精度が不均一な準種（ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ）についての誤差閾値について調べた。本発明者らは、エラーフリーポリメラーゼとエラープローンポリメラーゼを共存させることによって、遺伝情報の破壊的な喪失なしに誤差閾値を増大することができることが示された。本発明者らはまた、レプリコア（複製因子；ｒｅｐｌｉｃｏｒｅ）によって誤差閾値が影響を受けることを示した。結果として、本発明者らは複製精度が不均一な準種が多様な変異体を産生する選択
的進化に関する遺伝学的コストを低減することができるということを見出した。
進化がまっとうに行われるためには、遺伝学的な多様性および安定な再生産（生殖）が両方とも満たされるという有利な変異体が誕生することが必要である。ゲノムの正確な複製は安定な再生産を保証し、他方で複製の間の誤差は遺伝学的多様性を生成する。従って、進化にとって重要なキーのひとつは、複製の精度である。複製の精度は、例えば、ヌクレオチドのポリメラーゼに依存する。細胞内のポリメラーゼが均一な複製精度を有すると考えられる。進化モデルのほとんどの研究はまた、均一な複製精度に基づいて行われている。しかし、天然の生物においてエラーフリーポリメラーゼとエラープローンポリメラーゼと共存することがわかっているので、本発明は自然を反映しているといえる。
したがって、本発明は以下を提供する。
（１）細胞の遺伝形質の変換速度を調節する方法であって、
（ａ）上記細胞の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節する工程、
を包含する、方法。
（２）上記遺伝子の複製を担う因子には、少なくとも２種類のエラープローン頻度の因子が存在する、項目１に記載の方法。
（３）上記エラープローン頻度の因子は、エラープローン頻度が少ない因子が少なくとも約３０％存在することを特徴とする、項目２に記載の方法。
（４）上記遺伝子の複製を担う因子は、エラープローン頻度が不均一である、項目１に記載の方法。
（５）上記エラープローン頻度が少ない因子は実質的にエラーフリーである、項目１に記載の方法。
（６）上記エラープローン頻度の相違は、頻度が少なくとも１０１異なることを特徴とする、項目２に記載の方法。
（７）上記エラープローン頻度の相違は、頻度が少なくとも１０２異なることを特徴とする、項目２に記載の方法。
（８）上記エラープローン頻度の相違は、頻度が少なくとも１０３異なることを特徴とする、項目２に記載の方法。
（９）上記エラープローン頻度を調節する工程は、上記細胞の異常塩基の除去修復因子およびミスマッチ塩基対修復因子からなる群より選択される少なくとも１つの因子のエラープローン頻度を調節することを包含する、項目１に記載の方法。
（１０）上記エラープローン頻度を調節する工程は、上記細胞のゲノムＤＮＡ二本鎖の一方の鎖と他方の鎖とのエラーの発生数を異なるようにさせることを包含する、項目１に記載の方法。
（１１）上記エラープローン頻度を調節する工程は、上記細胞のＤＮＡポリメラーゼのエラープローン頻度を調節することを包含する、項目１に記載の方法。
（１２）上記ＤＮＡポリメラーゼは、校正機能を有する、項目１１に記載の方法。
（１３）上記ＤＮＡポリメラーゼは、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＤＮＡポリメラーゼγ、ＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれらに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼを含む、項目１１に記載の方法。
（１４）上記エラープローン頻度の調節は、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼの校正活性を調節することを包含する、項目１に記載の方法。
（１５）上記エラープローン頻度の調節は、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδまたはそれに対応するＤＮＡポリメラーゼの校正活性を調節することを包含する、項目１に記載の方法。
（１６）上記エラープローン頻度の調節は、ＤＮＡポリメラーゼの改変体を上記細胞に導
入することを包含する、項目１に記載の方法。
（１７）上記ＤＮＡポリメラーゼの改変体の導入は、相同組み換え、遺伝子導入またはプラスミドによる形質転換からなる群より選択される方法による、項目１６に記載の方法。（１８）上記エラープローン頻度の調節は、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδまたはそれに対応するＤＮＡポリメラーゼの改変体をコードする核酸分子を上記細胞に導入することを包含する、項目１に記載の方法。
（１９）上記真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδまたはそれに対応するＤＮＡポリメラーゼの改変体は、校正機能のみを欠失するような変異を含む、項目１８に記載の方法。（２０）上記エラープローン頻度の調節は、エラープローン頻度を野生型よりも上げることを包含する、項目１に記載の方法。
（２１）上記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、野生型のものよりも低い、項目１２に記載の方法。
（２２）上記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、野生型ＤＮＡポリメラーゼが提供するよりも少なくとも１つ多い、塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能である、項目１２に記載の方法。
（２３）上記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、少なくとも１つの塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能である、項目１２に記載の方法。
（２４）上記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、少なくとも２つの塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能である、項目１２に記載の方法。
（２５）上記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、１０−６の割合で塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能である、項目１２に記載の方法。
（２６）上記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、１０−３の割合で塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能である、項目１２に記載の方法。
（２７）上記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、１０−２の割合で塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能である、項目１２に記載の方法。
（２８）上記細胞は、グラム陽性または真核生物の細胞である、項目１に記載の方法。
（２９）上記細胞は、真核生物の細胞である、項目１に記載の方法。
（３０）上記細胞は、単細胞細胞または多細胞細胞である、項目１に記載の方法。
（３１）上記細胞は、動物、植物、真菌または酵母の細胞である、項目１に記載の方法。（３２）上記細胞は、哺乳動物の細胞である、項目１に記載の方法。
（３３）上記細胞は、所望の形質の変換後も、野生型と実質的に同じ成長を示す、項目１に記載の方法。
（３４）上記細胞は、天然において少なくとも２種類のポリメラーゼを有する、項目１に記載の方法。
（３５）上記細胞は、天然において少なくとも２種類のポリメラーゼを有し、そのエラープローン頻度が互いに異なる、項目１に記載の方法。
（３６）上記細胞は、少なくとも２種類のポリメラーゼを有し、上記２種類のポリメラーゼのうち一つは、ラギング鎖のエラープローン頻度に関与し、２つ目は、リーディング鎖のエラープローン頻度に関与する、項目１に記載の方法。
（３７）上記細胞は、上記細胞が上記変換前において耐性を有していなかった環境に対する耐性を示す、項目１に記載の方法。
（３８）上記環境は、温度、湿度、ｐＨ、塩濃度、栄養、金属、ガス、有機溶媒、圧力、気圧、粘性、流速、光度、光波長、電磁波、放射線、重力、張力、音波、上記細胞とは異なる他の細胞、化学薬品、抗生物質、天然物、精神的ストレスおよび物理的ストレスからなる群より選択される少なくとも１つの因子またはその組み合わせをパラメータとして包含する、項目３７に記載の方法。
（３９）上記細胞は、がん細胞を含む、項目１に記載の方法。
（４０）上記細胞は、組織を構成する、項目１に記載の方法。
（４１）上記細胞は、生物を構成する、項目１に記載の方法。
（４２）上記細胞の遺伝形質が変換された後に組織または生物体へと分化させる工程をさ
らに包含する、項目１に記載の方法。
（４３）上記エラープローン頻度の調節は、所定の条件下で生じる、項目１に記載の方法。
（４４）上記エラープローン頻度の調節は、温度、湿度、ｐＨ、塩濃度、栄養、金属、ガス、有機溶媒、圧力、気圧、粘性、流速、光度、光波長、電磁波、放射線、重力、張力、音波、上記細胞とは異なる他の細胞、化学薬品、抗生物質、天然物、精神的ストレスおよび物理的ストレス、ならびにその組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの因子を調節することを包含する、項目４３に記載の方法。
（４５）遺伝形質が調節された細胞を生産する方法であって、
（ａ）上記細胞の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節する工程；および
（ｂ）得られた細胞を再生産する工程、
を包含する、方法。
（４６）上記再生産した細胞のうち、所望の形質を有する個体を選択する工程をさらに包含する、項目４５に記載の方法。
（４７）上記遺伝子の複製を担う因子には、少なくとも２種類のエラープローン頻度の因子が存在する、項目４５に記載の方法。
（４８）上記エラープローン頻度の因子は、エラープローン頻度が少ない因子が少なくとも約３０％存在することを特徴とする、項目４５に記載の方法。
（４９）上記遺伝子の複製を担う因子は、エラープローン頻度が不均一である、項目４５に記載の方法。
（５０）上記エラープローン頻度が少ない因子は実質的にエラーフリーである、項目４５に記載の方法。
（５１）上記エラープローン頻度の相違は、頻度が少なくとも１０１異なることを特徴とする、項目４５に記載の方法。
（５２）上記エラープローン頻度の相違は、頻度が少なくとも１０２異なることを特徴とする、項目４５に記載の方法。
（５３）上記エラープローン頻度の相違は、頻度が少なくとも１０３異なることを特徴とする、項目４５に記載の方法。
（５４）上記エラープローン頻度を調節する工程は、上記細胞の異常塩基の除去修復因子およびミスマッチ塩基対修復因子からなる群より選択される少なくとも１つの因子のエラープローン頻度を調節することを包含する、項目４５に記載の方法。
（５５）上記エラープローン頻度を調節する工程は、上記細胞のゲノムＤＮＡ二本鎖の一方の鎖と他方の鎖とのエラーの発生数を異なるようにさせることを包含する、項目４５に記載の方法。
（５６）上記エラープローン頻度を調節する工程は、上記細胞のＤＮＡポリメラーゼのエラープローン頻度を調節することを包含する、項目４５に記載の方法。
（５７）上記ＤＮＡポリメラーゼは、校正機能を有する、項目５６に記載の方法。
（５８）上記ＤＮＡポリメラーゼは、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＤＮＡポリメラーゼγ、ＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれらに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼを含む、項目５６に記載の方法。
（５９）上記エラープローン頻度の調節は、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼの校正活性を調節することを包含する、項目４５に記載の方法。
（６０）上記エラープローン頻度の調節は、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδまたはそれに対応するＤＮＡポリメラーゼの校正活性を調節することを包含する、項目４５に記載の方法。
（６１）上記エラープローン頻度の調節は、ＤＮＡポリメラーゼの改変体を上記細胞に導入することを包含する、項目４５に記載の方法。
（６２）上記ＤＮＡポリメラーゼの改変体の導入は、相同組み換え、遺伝子導入またはプラスミドによる形質転換からなる群より選択される方法による、項目６１に記載の方法。（６３）上記エラープローン頻度の調節は、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδまたはそれに対応するＤＮＡポリメラーゼの改変体をコードする核酸分子を上記細胞に導入することを包含する、項目４５に記載の方法。
（６４）上記真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδまたはそれに対応するＤＮＡポリメラーゼの改変体は、校正機能のみを欠失するような変異を含む、項目６３に記載の方法。（６５）上記エラープローン頻度の調節は、エラープローン頻度を野生型よりも上げることを包含する、項目４５に記載の方法。
（６６）上記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、野生型のものよりも低い、項目５７に記載の方法。
（６７）上記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、野生型ＤＮＡポリメラーゼが提供するよりも少なくとも１つ多い、塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能である、項目５７に記載の方法。
（６８）上記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、少なくとも１つの塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能である、項目５７に記載の方法。
（６９）上記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、少なくとも２つの塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能である、項目５７に記載の方法。
（７０）上記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、１０−６の割合で塩基配列の変異が含まれるように校正する機能である、項目５７に記載の方法。
（７１）上記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、１０−３の割合で塩基配列の変異が含まれるように校正する機能である、項目５７に記載の方法。
（７２）上記ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、１０−２の割合で塩基配列の変異が含まれるように校正する機能である、項目５７に記載の方法。
（７３）上記細胞は、グラム陽性または真核生物の細胞である、項目４５に記載の方法。（７４）上記細胞は、真核生物の細胞である、項目４５に記載の方法。
（７５）上記細胞は、単細胞細胞または多細胞細胞である、項目４５に記載の方法。
（７６）上記細胞は、動物、植物、真菌または酵母の細胞である、項目４５に記載の方法。
（７７）上記細胞は、哺乳動物の細胞である、項目４５に記載の方法。
（７８）上記遺伝形質が調節された細胞は、野生型と実質的に同じ成長を示す、項目４５に記載の方法。
（７９）上記細胞は、天然において少なくとも２種類のポリメラーゼを有する、項目４５に記載の方法。
（８０）上記細胞は、天然において少なくとも２種類のポリメラーゼを有し、そのエラープローン頻度が互いに異なる、項目４５に記載の方法。
（８１）上記細胞は、少なくとも２種類のポリメラーゼを有し、上記２種類のポリメラーゼのうち一つは、ラギング鎖のエラープローン頻度に関与し、２つ目は、リーディング鎖のエラープローン頻度に関与する、項目４５に記載の方法。
（８２）上記細胞は、上記細胞が上記変換前において耐性を有していなかった環境に対する耐性を示す、項目４５に記載の方法。
（８３）上記環境は、温度、湿度、ｐＨ、塩濃度、栄養、金属、ガス、有機溶媒、圧力、気圧、粘性、流速、光度、光波長、電磁波、放射線、重力、張力、音波、上記細胞とは異なる他の細胞、化学薬品、抗生物質、天然物、精神的ストレスおよび物理的ストレスからなる群より選択される少なくとも１つの因子またはその組み合わせをパラメータとして包含する、項目８２に記載の方法。
（８４）上記細胞は、がん細胞を有する、項目４５に記載の方法。
（８５）上記細胞は、組織を構成する、項目４５に記載の方法。
（８６）上記細胞は、生物を構成する、項目４５に記載の方法。
（８７）上記細胞の遺伝形質が変換された後に組織または生物体へと分化させる工程をさ
らに包含する、項目４５に記載の方法。
（８８）上記エラープローン頻度の調節は、所定の条件下で生じる、項目４５に記載の方法。
（８９）上記エラープローン頻度の調節は、温度、湿度、ｐＨ、塩濃度、栄養、金属、ガス、有機溶媒、圧力、気圧、粘性、流速、光度、光波長、電磁波、放射線、重力、張力、音波、上記細胞とは異なる他の細胞、化学薬品、抗生物質、天然物、精神的ストレスおよび物理的ストレス、ならびにその組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの因子を調節することを包含する、項目８８に記載の方法。
（９０）遺伝形質が調節された生物を生産する方法であって、
（ａ）上記生物の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節する工程；および
（ｂ）得られた生物を再生産する工程、
を包含する、方法。
（９１）項目９０に記載の方法によって生産された、遺伝形質が調節された細胞。
（９２）上記生物は、野生型と実質的に同じ成長を示す、項目９１に記載の細胞。
（９３）項目９０に記載の方法によって生産された、遺伝形質が調節された生物。
（９４）上記生物は、野生型と実質的に同じ成長を示す、項目９３に記載の生物。
（９５）遺伝形質が調節された遺伝子をコードする核酸分子を生産する方法であって、
（ａ）生物の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を変化させる工程；
（ｂ）得られた上記生物を再生産する工程；
（ｃ）上記生物において変異を同定する工程；および
（ｄ）同定された変異を含む遺伝子をコードする核酸分子を生産する工程、
を包含する、方法。
（９６）項目９５に記載の方法によって生産された、核酸分子。
（９７）遺伝形質が調節された遺伝子がコードするポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）生物の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を変化させる工程；
（ｂ）得られた上記生物を再生産する工程；
（ｃ）上記生物において変異を同定する工程；および
（ｄ）同定された変異を含む遺伝子がコードするポリペプチドを生産する工程、
を包含する、方法。
（９８）項目９７に記載の方法によって生産された、ポリペプチド。
（９９）遺伝形質が調節された生物の代謝物を生産する方法であって、
（ａ）生物の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を変化させる工程；
（ｂ）得られた上記生物を再生産する工程；
（ｃ）上記生物において変異を同定する工程；および
（ｄ）同定された変異を含む代謝物を生産する工程、
を包含する、方法。
（１００）項目９９に記載の方法によって生産された、代謝物。
（１０１）生物の遺伝形質を調節するための核酸分子であって、上記核酸分子は、エラープローン頻度を調節されたＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を含む、核酸分子。（１０２）上記ＤＮＡポリメラーゼは、真核生物におけるＤＮＡポリメラーゼδまたはε、あるいはグラム陽性細菌における対応するＤＮＡポリメラーゼである、項目１０１に記載の核酸分子。
（１０３）上記ＤＮＡポリメラーゼは、真核生物におけるＤＮＡポリメラーゼδまたはε、あるいはグラム陽性細菌における対応するＤＮＡポリメラーゼにおいて、校正機能のみを欠失するような変異において改変を有する、項目１０１に記載の核酸分子。
（１０４）上記ＤＮＡポリメラーゼは、真核生物におけるＤＮＡポリメラーゼδ、あるいはグラム陽性細菌における対応するＤＮＡポリメラーゼにおいて、校正機能のみを欠失するような変異において改変を有する、項目１０１に記載の核酸分子。
（１０５）項目１０１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
（１０６）項目１０１に記載の核酸分子を含む、細胞。
（１０７）真核生物細胞である、項目１０６に記載の細胞。
（１０８）上記真核生物細胞は、植物、動物および酵母からなる群より選択される、項目１０７に記載の細胞。
（１０９）グラム陽性細菌細胞である、項目１０６に記載の細胞。
（１１０）遺伝形質の変換速度を調節するために使用される、項目１０６に記載の細胞。（１１１）項目１０１に記載の核酸分子を含む、生物。
（１１２）項目１０６に記載の細胞またはその一部が生産する、生産物質。
（１１３）項目１０６に記載の細胞またはその一部に含まれる、核酸分子。
（１１４）上記調節された遺伝形質を担う遺伝子をコードする、項目１１３に記載の核酸分子。
（１１５）項目１０６に記載の細胞を病態モデルとして使用して薬剤の効果を試験する工程、コントロールとして野生型の細胞を使用して薬剤の効果を試験する工程、および上記病態モデルと上記コントロールとの対比を行う工程を包含する、薬剤の試験方法。
（１１６）項目１１１に記載の生物を病態モデルとして使用して薬剤の効果を試験する工程、コントロールとして野生型の生物を使用して薬剤の効果を試験する工程、および上記病態モデルと上記コントロールとの対比を行う工程を包含する、薬剤の試験方法。
（１１７）生物の遺伝形質の変換速度を調節するために使用される、少なくとも２つのポリメラーゼのセットであって、上記ポリメラーゼのエラープローン頻度は互いに異なる、セット。
（１１８）上記少なくとも２つのポリメラーゼのうち少なくとも１つはラギング鎖のエラープローン頻度に関与し、少なくとも別の一つはリーディング鎖のエラープローン頻度に関与する、項目１１７に記載のセット。
（１１９）上記ポリメラーゼのセットは、同一種生物由来である、項目１１７に記載のセット。
（１２０）遺伝形質が調節された生物を生産するために使用される、少なくとも２つのポリメラーゼのセットであって、上記ポリメラーゼのエラープローン頻度は互いに異なる、セット。
（１２１）上記少なくとも２つのポリメラーゼのうち少なくとも１つはラギング鎖のエラープローン頻度に関与し、少なくとも別の一つはリーディング鎖のエラープローン頻度に関与する、項目１２０に記載のセット。
（１２２）上記ポリメラーゼのセットは、同一種生物由来である、項目１２１に記載のセット。
（１２３）生物の遺伝形質の変換速度を調節するための、少なくとも２つのポリメラーゼのセットの使用であって、上記ポリメラーゼのエラープローン頻度は互いに異なる、使用。
（１２４）遺伝形質が調節された生物を生産するための、少なくとも２つのポリメラーゼのセットの使用であって、上記ポリメラーゼのエラープローン頻度は互いに異なる、使用。
従って、本明細書中に記載の発明は、自然の進化に従って所望の遺伝形質を生物に付与するための方法を提供する利点を可能にする。
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
（発明の詳細な説明）
以下に本発明を、添付の図面を参照して例示の実施例により説明する。
本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
（用語）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において「生物」とは、当該分野における最も広義に用いられ、生命現象を営むものをいい、代表的には、細胞構造、増殖（自己再生産）、成長、調節性、物質代謝、修復能力など種々の特性を有し、通常、核酸のつかさどる遺伝と、タンパク質のつかさどる代謝の関与する増殖を基本的な属性として有する。生物には、ウイルス、原核生物、真核生物（酵母のような単細胞生物、植物、動物のような多細胞生物など）などが包含される。本発明の方法は、グラム陽性細菌、および真核生物などの高等生物を含む、どのような生物であっても適用され得ることが理解される。
本明細書において「真核生物」とは、当該分野において通常用いられる意味と同様に用いられ、核膜のある、明確な核構造を持つ細胞からなる生物をいう。真核生物としては、例えば、酵母のような単細胞生物、イネ、コムギ、トウモロコシ、ダイズのような植物、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、サルのような動物、ハエ、カイコなどの昆虫が挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、酵母、線虫、ショウジョウバエ、カイコ、イネ、コムギ、ダイズ、トウモロコシ、シロイヌナズナ、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、カエル、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）などがモデルとして使用され得るがそれらに限定されない。
本明細書において「原核生物」とは、当該分野において通常用いられる意味と同様に用いられ、明確な核構造を持たない細胞からなる生物をいう。原核生物としては、例えば、大腸菌、サルモネラ菌のようなグラム陰性細菌、枯草菌、放線菌、ブドウ球菌のようなグラム陽性細菌、藍藻類、水素細菌などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、代表的に、大腸菌以外に、グラム陽性細菌、として使用され得るがそれに限定されない。
本明細書において「単細胞生物」とは、当該分野において通常用いられる意味と同様に用いられ、一つの細胞からなる生物をいう。単細胞生物には、真核生物および原核生物の両方が含まれる。単細胞生物の例としては、例えば、細菌（例えば、大腸菌、枯草菌など）、酵母、藍藻類などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「多細胞生物」とは、複数の細胞（通常、複数の異なる種類の細胞）が一個体をなす生物をいう。多細胞生物は、その生物を構成する細胞種が異なることから、その生物の生命の維持には単細胞生物とは異なり高度な恒常性維持などのメカニズムが必要とされる。真核生物には多細胞生物が多い。多細胞生物には、動物、植物、昆虫などが含まれる。本発明では、驚くべきことに、多細胞生物においても本発明が適用可能であることが見出されたことに留意すべきである。
本明細書において「動物」は、当該分野において最も広義で用いられ、脊椎動物および無脊椎動物（例えば、節足動物）を含む。動物としては、哺乳綱、鳥綱、爬虫綱、両生綱、魚綱、昆虫綱、蠕虫綱などが挙げられるがそれらに限定されない。動物は、好ましくは、脊椎動物（例えば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）であり得るが、それらに限定されない。ある一つの実施形態では、動物は、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類
、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）であり得るがそれらに限定されない。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）または他のモデル動物となり得る種（例えば、奇蹄類、偶蹄類、マウスなどの齧歯類、ウサギ目など）であり得るがそれらに限定されない。本発明の方法は、生物であればどのようなものであっても適用できることが本発明において初めて解明されたことから、どのような生物であっても、対象とされ得ることが理解されるべきである。
本明細書において用いられる「植物」とは、植物界に属する生物の総称であり、クロロフィル、かたい細胞壁、豊富な永続性の胚的組織の存在，および運動する能力がない生物により特徴付けられる。代表的には、植物は、細胞壁の形成・クロロフィルによる同化作用をもつ顕花植物をいう。「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。好ましい植物としては、有用植物、例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ソルガムなどのイネ科に属する単子葉植物が挙げられるがそれらに限定されない。好ましい植物のほかの例としては、タバコ、ピーマン、ナス、メロン、トマト、サツマイモ、キャベツ、ネギ、ブロッコリー、ニンジン、キュウリ、柑橘類、白菜、レタス、モモ、ジャガイモおよびリンゴが挙げられる。好ましい植物は作物に限られず、花、樹木、芝生、雑草なども含まれる。特に他で示さない限り、「植物」は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。本発明の方法は、生物であればどのようなものであっても適用できることが本発明において初めて解明されたことから、どのような生物であっても、対象とされ得ることが理解されるべきである。
ある実施形態において、本発明において使用され得る植物種の例としては、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科の植物が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「遺伝形質」とは、遺伝子型とも呼ばれ、遺伝によって支配される生物の形態的要素をいう。遺伝形質の例としては、例えば、温度、湿度、ｐＨ、塩濃度、栄養、金属、ガス、有機溶媒、圧力、気圧、粘性、流速、光度、光波長、電磁波、放射線、重力、張力、音波、他の生物、化学薬品、抗生物質、天然物、精神的ストレス、物理的ストレスなどのような環境を構成するパラメータに対する抵抗性レベルなどが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において、「遺伝子」とは、細胞中に存在する核酸の一定の長さの配列をいう。本発明において遺伝子は、遺伝形質を規定するものであっても規定しないものであってもよい。本明細書において、「遺伝子」は、通常ゲノムに存在するものをさすが、それに限定されず、染色体外の配列、ミトコンドリアの配列なども包含することが理解される。多くの遺伝子は、通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、例えば、「ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子」というときは、通常、ＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子ならびにＤＮＡポリメラーゼのプロモーターなどの転写および／または翻訳の調節配列の両方を包含する。本発明では、構造遺伝子のほか、転写および／または翻訳などの調節配列もまた、本発明が対象とする遺伝子として有用であることが理解される。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「
オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
本明細書において「遺伝子の複製」とは、遺伝物質であるＤＮＡまたはＲＮＡにおいて，親の核酸鎖を鋳型として，親核酸と同一の構造と機能を有する新しい核酸分子（ＤＮＡであればＤＮＡ、ＲＮＡであればＲＮＡ）を生成することをいう。真核細胞では，二本鎖ＤＮＡ分子上にある多数の複製開始点に複製酵素（ＤＮＡポリメラーゼα）を含む複製開始複合体が形成されることによって複製が開始され、複製反応が複製開始点から両方向へ進行する。複製開始は、細胞周期によって制御される。酵母における自立複製配列（ＡＲＳ＝ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は複製開始点とされる。大腸菌などの原核細胞では、ゲノムの二本鎖環状ＤＮＡ分子に１個の複製開始点（ｏｒｉ）が存在し、ｏｒｉに複製開始複合体が形成され、反応はｏｒｉから両方向に進行する。複製開始複合体は複製酵素（ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ）を含む１０種類以上のタンパク質因子を含む複雑な構造を有する。複製反応は、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の部分的巻戻しに始まり、その後短いＤＮＡプライマーが合成され、３’−ＯＨ基から新たなＤＮＡ鎖が伸長され、相補鎖鋳型において岡崎フラグメントが合成され、岡崎フラグメントの連結、鋳型と照らし合わせる校正（プルーフリーティング）などの多段階の反応によって複製反応が進行する。
生物の遺伝情報であるゲノムＤＮＡの複製機構は、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ Ａ．ａｎｄ Ｂａｋｅｒ Ｔ．，“ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｆｒｅｅｍａｎ，１９９２に詳述されている。代表的には、１つの１本鎖ＤＮＡを鋳型として相補的な鎖を合成し、その結果、１つの２本鎖ＤＮＡを生じる酵素（ＤＮＡ複製を行う酵素）を、ＤＮＡポリメラーゼという。ＤＮＡ複製には、少なくとも２つのＤＮＡポリメラーゼが必要である。通常、リーディング鎖およびラギング鎖の合成を同時に行わなければならないからである。ＤＮＡ複製は、ＤＮＡ上の決まった位置から開始されるが、その位置を複製開始点（ｏｒｉ）という。例えば、細菌では、通常、環状ゲノムＤＮＡに少なくとも１つの両方向性の複製開始点を有する。これらを総合すると、通常は、１つのゲノムＤＮＡ複製には、４つのＤＮＡポリメラーゼが同時に作用する必要があることになる。本発明では、好ましくは、リーディング鎖およびラギング鎖の一方のみの複製誤りが調節されることが有利であり得、あるいは、二本の鎖のあいだの複製誤りの頻度が異なることが有利であり得る。
本明細書において「複製誤り」とは、遺伝子（ＤＮＡなど）の複製の過程で生じるヌクレオチド取り込みの誤りをいう。複製誤りは、通常、生体では、その頻度は１０８〜１０１２回に１回程度できわめて低い。複製誤りの頻度が低い理由としては、ヌクレオチドの取り込みが鋳型ＤＮＡと取り込まれるヌクレオチドとが相補的な塩基対を形成することによって複製が起こること、ＤＮＡポリメラーゼδ、εなどの酵素の校正機能すなわち３’→５’エキソヌクレアーゼが，鋳型に相補性を示さないヌクレオチドが誤って取り込まれたときそれを察知し直ちに切り出す機能が存在することなどが挙げられる。従って、本発明において複製におけるエラープローン頻度の調節は、特異的塩基対形成の障害、校正機能の障害などによって行うことができる。
本明細書において遺伝形質の「変換速度」とは、生物の生殖または分裂の際に、その生物が元々持っていた遺伝形質と、生殖または分裂後の生物が持っている遺伝形質との相違点の生じる速度をいう。そのような変換速度は、分裂あたりまたは世代あたりの遺伝形質の変化の個数などで表現することができる。本明細書においては、代替的にこのような遺伝形質の変換を「進化」ということもある。
本明細書において「遺伝形質の変換速度の調節」とは、天然に存在する要因以外の人為的な操作によって、遺伝形質の変換速度を変化させることをいう。従って、遺伝形質の変換速度の調節には、遺伝形質の変換速度の遅延化および迅速化が包含される。遺伝形質の変換速度の遅延化により、その生物はほとんどその遺伝形質を変化させないことになる。従って、代替的表現を使用する場合、遺伝形質の変換速度の遅延化によりその生物は進化速度が下降する。逆に、遺伝形質の変換速度の迅速化により、その生物は、遺伝形質を通常よりも頻繁に変化させることになる。従って、代替的表現を使用する場合、遺伝形質の変換速度の迅速化によりその生物は進化速度が上昇する。
本明細書において「エラーフリー」とは、遺伝子（ＤＮＡなど）の複製において誤りがほとんどない、あるいは実質的に全くない性質をいう。エラーフリーは、主に、校正機能を有する酵素(例えば、ＤＮＡポリメラーゼδ、εなど）の校正機能の精度によって影響
を受ける。
本明細書において「エラープローン」とは、遺伝子（ＤＮＡなど）の複製における誤り易い（すなわち、複製誤りの）性質をいう。エラープローンは、主に、校正機能を有する酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼδ、εなど）の校正機能の精度によって影響を受ける。
本明細書においてエラープローンとエラーフリーとは、絶対的に（すなわち、エラープローン頻度のレベルなどで決定する）分類することができ、あるいは相対的（２種類以上の遺伝子の複製を担う因子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼなど）におけるエラープローン頻度について多いほうをエラープローンとし、少ないほうをエラーフリーとする）に分類することができる。
本明細書において「エラープローン頻度」とは、エラープローンの性質のレベルをいう。エラープローン頻度は、例えば、遺伝子配列における変異の絶対数（変異の数そのもの）または相対数（全長における変異の数の比率）で表現することができる。あるいは、ある生物または酵素について言及するとき、エラープローン頻度は、ある生物の生殖または分裂１回あたりの遺伝子配列における変異の絶対数または相対数で表現してもよい。特に言及しない場合、遺伝子配列における複製過程１回あたりの誤差の数で表される。エラープローン頻度は、逆の尺度として本明細書において「精度」ということがある。エラープローン頻度が均一であるとは、複数の遺伝子の複製を担う因子（ポリメラーゼなど）に言及するとき、互いのエラープローン頻度が実質的に等しいことをいう。他方、エラープローン頻度が不均一であるとは、有意な差異が複数の遺伝子の複製を担う因子（ポリメラーゼなど）に存在する場合をいう。
本明細書において「エラープローン頻度の調節」とは、エラープローン頻度を変化させることをいう。そのようなエラープローン頻度の調節には、エラープローン頻度の上昇および低減が含まれる。エラープローン頻度の調節のための手法としては、例えば、校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼの改変、複製中に重合反応または伸長反応を阻害または抑制するような因子の挿入これらの反応を促進するような因子の阻害、抑制、単数または複数の塩基の欠損、二重鎖ＤＮＡ修復酵素の欠損、異常塩基の除去修復因子機能を有する酵素の改変、ミスマッチ塩基対修復因子の改変、複製自体の精度の低減などが挙げられるがそれらに限定されない。エラープローン頻度の調節は、ＤＮＡの二本鎖の両方に対して行われてもよいし、片方のみに対して行われてもよい。好ましくは、片方のみに対して行われることが有利であり得る。有害な変異誘発が低減されるからである。
本明細書において「ＤＮＡポリメラーゼ」または「Ｐｏｌ」とは、４種類のデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸からピロリン酸を遊離してＤＮＡを重合する働きを有する
酵素をいう。ＤＮＡポリメラーゼ反応には、鋳型となるＤＮＡ、プライマー分子、Ｍｇ２＋などが必要とされる。プライマーの３’−ＯＨ末端に鋳型に相補的なヌクレオチドを順次付加し分子鎖を伸長する。
大腸菌にはＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩの少なくとも３種類の酵素が知られている。ＤＮＡポリメラーゼＩはＤＮＡ傷害の修復，遺伝的組換えおよびＤＮＡ複製に関与する。ＤＮＡポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩは補助的機能を有するといわれる。この酵素は数種のタンパク質からなるサブユニット構造をとり，その構成からコア酵素およびホロ酵素の２つに分けられる。コア酵素は，α、εおよびθサブユニットから構成され、ホロ酵素には、α、εおよびθサブユニットのほかに、τ、γ、δおよびβの成分がある。真核生物細胞も複数のＤＮＡポリメラーゼをもつことが知られており、高等生物ではＤＮＡポリメラーゼα、β、γ、δおよびεなど多種類存在する。動物では、ＤＮＡポリメラーゼα（核ＤＮＡの複製に関与、細胞増殖期のＤＮＡ複製に作用）、ＤＮＡポリメラーゼβ（核でのＤＮＡの修復に関与、増殖期、停止期のＤＮＡ傷害の修復などの作用を有する）、ＤＮＡポリメラーゼγ（ミトコンドリアＤＮＡの複製と修復に関与。エキソヌクレアーゼ活性をもつ）、ＤＮＡポリメラーゼδ（ＤＮＡの伸長に関与。エキソヌクレアーゼ活性をもつ）、ＤＮＡポリメラーゼε（ラギング鎖のすき間の複製に関与。エキソヌクレアーゼをもつ）などが知られている。
校正機能を担うＤＮＡポリメラーゼ（グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真核生物など）では、ＥｘｏＩモチーフのアミノ酸配列が３’→５’エキソヌクレアーゼ活性中心を担うとされており、この部位が校正機能の精度に影響すると考えられている。
配列番号５：ＤｎａＱ：８−ＱＩＶＬＤＴＥＴＴＧＭＮ−１９（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）；
配列番号６：ＤｎａＱ：７−ＱＩＶＬＤＴＥＴＴＧＭＮ−１８（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ
ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）；
配列番号７：ＤｎａＱ：８−ＱＩＶＬＤＴＥＴＴＧＭＮ−１９（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；
配列番号８：ＤｎａＱ：１２−ＩＶＶＬＤＴＥＴＴＧＭＮ−２３（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）；
配列番号９：ＤｎａＱ：３−ＳＶＶＬＤＴＥＴＴＧＭＰ−１４（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；
配列番号１０：ＤｎａＱ：５−ＱＩＩＬＤＴＥＴＴＧＬＹ−１６（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）；
配列番号１１：ＤｎａＱ：９−ＦＶＣＬＤＣＥＴＴＧＬＤ−２０（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）；
配列番号１２：ＤｎａＱ：９−ＬＡＡＦＤＴＥＴＴＧＶＤ−２０（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）；
配列番号１３：ｄｎａＱ：１１−ＱＩＶＬＤＴＥＴＴＧＭＮ−２２（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ ｓｔｒ．３０１）；
配列番号１４：ＰｏｌＣ：４２０−ＹＶＶＦＤＶＥＴＴＧＬＳ−４３１（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）；
配列番号１５：ＰｏｌＣ：４２１−ＹＶＶＦＤＶＥＴＴＧＬＳ−４３２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；
配列番号１６：ＰｏｌＣ：４０４−ＹＶＶＹＤＩＥＴＴＧＬＳ−４１５（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｕｌｍｏｎｉｓ）；
配列番号１７：ＰｏｌＣ：４１６−ＦＶＩＦＤＩＥＴＴＧＬＨ−４２７（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）；
配列番号１８：ＰｏｌＣ：４０８−ＦＶＩＦＤＩＥＴＴＧＬＨ−４１９（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；
配列番号１９：Ｐｏｌ ＩＩＩ：３１７−ＩＭＳＦＤＩＥＣＡＧＲＩ−３２８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；
配列番号２０：Ｐｏｌ ＩＩ：２８６−ＶＭＡＦＤＩＥＴＴＫＰＰ−２９７（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；
配列番号２１：Ｐｏｌ ｄｅｌｔａ：３１０−ＶＬＳＦＤＩＥＣＡＧＲＫ−３２１（マウス）；
配列番号２２：Ｐｏｌ ｅｐｓｉｌｏｎ：２７１−ＶＬＡＦＤＩＥＴＴＫＬＰ−２８２（マウス）；
配列番号２３：Ｐｏｌ ｄｅｌｔａ：３１２−ＶＬＳＦＤＩＥＣＡＧＲＫ−３２３（ヒト）；
配列番号２４：Ｐｏｌ ｅｐｓｉｌｏｎ：２７１−ＶＬＡＦＤＩＥＴＴＫＬＰ−２８２（ヒト）；
配列番号２５：Ｐｏｌ ｄｅｌｔａ：３１６−ＩＬＳＦＤＩＥＣＡＧＲＫ−３２７：（イネ）；
配列番号２６：Ｐｏｌ ｄｅｌｔａ：３０６−ＶＬＳＦＤＩＥＣＡＧＲＫ−３１７（シロイヌナズナ）；
配列番号２７：Ｐｏｌ ｅｐｓｉｌｏｎ：２３５−ＶＣＡＦＤＩＥＴＶＫＬＰ−２４６（シロイヌナズナ）；
配列番号２８：Ｐｏｌ ｄｅｌｔａ：３０８−ＶＬＳＦＤＩＥＣＡＧＲＫ−３１９（ラット）；
配列番号２９：Ｐｏｌ ｄｅｌｔａ：３１１−ＶＬＳＦＤＩＥＣＡＧＲＫ−３２２（ウシ）；
配列番号３０：Ｐｏｌ ｄｅｌｔａ：２７３−ＩＬＳＦＤＩＥＣＡＧＲＫ−２８４（ダイズ）；
配列番号３１：Ｐｏｌ ｄｅｌｔａ：２９６−ＩＬＳＦＤＩＥＣＡＧＲＫ−３０７（ショウジョウバエ）；および
配列番号３２：Ｐｏｌ ｅｐｓｉｌｏｎ：２６９−ＶＬＡＦＤＩＥＴＴＫＬＰ−２８０（ショウジョウバエ）。
ここで明らかなように、校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼは、アスパラギン酸（例えば、ヒトＤＮＡポリメラーゼδでは３１６番目）およびグルタミン酸（例えば、ヒトＤＮＡポリメラーゼδでは３１８番目）がよく保存されている。本明細書において、このようなアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む領域は、本明細書において校正機能活性部位ということがある。
また、大腸菌のようなグラム陰性細菌では、ＤＮＡポリメラーゼが上述のようにエキソヌクレアーゼ活性を有する分子と、ＤＮＡ合成活性を有する分子とが２つのタンパク質として存在する。したがって、エキソヌクレアーゼ活性を調節することによって校正機能を調節することができる。
しかし、枯草菌のようなグラム陽性細菌；（ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ）ならびに酵母、動物および植物を含む真核生物では、１つのＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ合成活性およびエキソヌクレアーゼ活性の両方を有することから、ＤＮＡ合成活性を正常に保ち、かつ、エキソヌクレアーゼ活性を調節し、その結果、校正機能を調節することができる分子が必要である。本発明は、生物の進化に使用することができる、ＤＮＡ合成活性を正常に保ち、かつ、エキソヌクレアーゼ活性を調節することができる、そのような真核生物およびグラム陽性細菌のＤＮＡポリメラーゼの改変体を提供することによって、大腸菌とは異なり、かつ、予想もつかない効果を達成した。したがって、本発明は、部分的には、真核生物およびグラム陽性細菌、特に真核生物において、予想外に上記校正機能活性部位が特定されたことによって達成されたといえる。しかも、その効果は、実施例において示されるよう
に、予想外の遺伝形質の獲得という顕著なものである。
多くのエラープローンＤＮＡポリメラーゼがヒトをはじめ細菌などでも見出されている。多くの複製性ＤＮＡポリメラーゼは通常校正機能を有し、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性によってエラーを取り除き、エラーフリーの複製を行う。しかし、エラープローンＤＮＡポリメラーゼは、校正機能がなく、ＤＮＡ損傷をバイパスすることができず、変異を発生させる。エラープローンＤＮＡポリメラーゼの存在は、発がん、進化および抗体進化などに関与する。多くのＤＮＡポリメラーゼは、エラープローンになる可能性を有しており、校正機能を損傷させることによってエラープローンとすることができる。したがって、上述のような校正機能活性部位を改変することによって複製精度を調節することができる。このモデルを使用することによって、いったん獲得された新たな特性は、異常なしに進化を続けることができるという利点を有する。この点は、オリジナルのディスパリティーモデルに比べて、障害変異が顕著に減少するという予想外の利点および効果を有する。
Ｅｉｇｅｎが主張した準種理論では、エラープローン複製のみを考慮した進化モデルを提唱していた（Ｍ．Ｅｉｇｅｎ，Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ５８，４６５（１９７１）など）。この準種理論は、種々の改変を施して使用されていた。準種とは、最も適合する配列の安定な集合と定義され、その変異体は選択により配列の中に分布する。自然淘汰は、単一の配列に起因するのではなく、準種全体に分布するようである。準種の進化は、以下のように説明される：マスター配列より高い適合性を持つ変異体が準種中に現れ、この変異体が古いマスター配列を淘汰によって置換し、ついで新たな準種分布が変異体に生じる。
この理論によると、遺伝情報を維持するためには、エラーの閾値が存在すると予想され、結論付けられていた。したがって、従来技術では、この閾値以下でのみ、準種による進化が起こり得ると考えられていた（Ｍ．Ｅｉｇｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．７５，１４９（１９８９））。これは、すなわち、エラーの上限の閾値によって進化速度の上限が限定されているということにほかならない。準種理論はＲＮＡウイルスの研究において一見説明でき、このＲＮＡウイルスは、エラー閾値付近で高速で進化することが判明した。しかし、変異因子の表現型でエラー率の増大を伴う因子が、このプロセスにおいて重要な役割を果たしているとされた。
細菌のゲノムは、単一の複製起点を有するが、真核生物ゲノムは、複数の複製起点を含む。このことは、ゲノム配列が複数の複製単位（複製因子、レプリコア）を有することを意味する。したがって、複数のポリメラーゼがゲノム複製に同時にかかわることになる。本発明において、複製因子の数がエラー閾値に対して与える影響も考慮され得る。
１つの好ましい実施形態では、このような３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が破壊されるような変異を、ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子（ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子）に導入することにより、校正機能が低下した（すなわち、エラープローン頻度が増加した）ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸分子およびポリペプチドを産生することができる。なお、校正機能の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性校正機能は、単一のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（ＰｏｌＣ，ＰＯＬ２，ＣＤＣ２等）において、ＤＮＡ重合活性を担う分子中に含まれる場合（例えば、真核生物、グラム陽性細菌等）と、ＤＮＡ重合活性をコードする遺伝子（例えば、ｄｎａＥ）とは異なる遺伝子（例えば、ｄｎａＱ）にコードされる場合（例えば、グラム陰性細菌等）があることが知られており（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ Ａ．ａｎｄ Ｂａｋｅｒ Ｔ．，“ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ”，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｆｒｅｅｍａｎ，１９９２）、当業者は、それらの特性を理解したうえで、本発明におけるエラープローン頻度の調節を適宜行うことができる。例えば、真核生物などでは、
校正機能は変化するが、ＤＮＡ重合活性はほとんど変化させない変異をＤＮＡポリメラーゼに導入することが好ましい。この場合、上述のような校正機能に関与する２つの酸性アミノ酸（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０，ｐｐ．１７−２４，Ｊａｎ．１９９１； Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ ａｎｄ Ｓｃｈａａｐｅｒ，“Ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｘｏ Ｉ ｍｏｔｉｆ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｄｎａＱ：Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｕｅ ｔｏ ｅｒｒｏｒ ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｅ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，ｐｐ．２８５６−２８６１，Ａｐｒ．１９９６）を改変すること（好ましくは、保存されない置換（例えば、アラニン、バリンなどへの置換））が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「校正機能」とは、細胞が受けたＤＮＡ損傷および／または誤りを検知し補修する機能をいう。そのような機能は、脱プリン、脱ピリミジンがある場合はそのまま塩基が挿入されることによるか、あるいは、Ａ−Ｐエンドヌクレアーゼ（ａｐｕｒｉｎｉｃ−ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）で一本鎖切断が入れられたのち５’→３’エキソヌクレアーゼで除去されることによって達成され得る。除去部分は、ＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡ合成され補充され、正常ＤＮＡとの連結はＤＮＡリガーゼが行う。このような反応は、除去修復といわれる。アルキル化剤による化学修飾，異常塩基，放射線，紫外線などによるＤＮＡ塩基傷害などは傷害部分をＤＮＡグリコシダーゼで取り除かれた上で上記の反応で修復される（不定期ＤＮＡ合成）。そのような校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、真核生物におけるＤＮＡポリメラーゼδ、ＤＮＡポリメラーゼεなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、校正機能の程度を表すために、「忠実度」という用語もまた用いられ得る。この「忠実度」との用語は、ＤＮＡ複製の精度を意味する。正常なＤＮＡポリメラーゼは、通常、忠実度が高いＤＮＡポリメラーゼであり、改変により校正機能が低下したＤＮＡポリメラーゼは、忠実度が低いＤＮＡポリメラーゼであり得る。
このようなＤＮＡポリメラーゼの校正機能については、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，１２８６６−１２８７４（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｓａｂｏｔｉｎｏ，Ｒ．Ｄ．＆ Ｂａｍｂａｒａ，Ｒ．Ａ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，４８６５−４８６９（１９８７）；Ｗｕ，Ｃ．Ｉ．＆ Ｍａｅｄａ，Ｎ．：Ｎａｔｕｒｅ，３２７，１６７−１７０（１９８７）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．＆ Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，７０６４−７０６８（１９８８）；Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｃ．，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｍ．Ｐ．＆ Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．：Ｂａｓｉｃ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５２，２８７−２９７（１９９０）；Ｔｒｉｎｈ，Ｔ．Ｑ．＆ Ｓｉｄｅｎ，Ｒ．Ｒ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，５４４−５４７（１９９１）；Ｗｅｓｔｏｎ−Ｈａｆｅｒ，Ｋ．，＆ Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２７，６４９−６５５（１９９１）；Ｖｅａｕｔｅ，Ｘ．＆ Ｆｕｃｈｓ，Ｒ．Ｐ．Ｐ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１，５９８−６００（１９９３）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｉｚｕｔａ，Ｓ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｃ．＆ Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１７１１−１７１７（１９９４）；Ｒｏｃｈｅ，Ｗ．Ａ．，Ｔｒｉｎｈ，Ｔ．Ｑ．＆ Ｓｉｄｅｎ，Ｒ．Ｒ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，４３８５−４３９１（１９９５）；Ｋａｎｇ，Ｓ．，Ｊａｗｏｒｓｋｉ，Ａ．，Ｏｈｓｈｉｒｎａ，Ｋ．＆ Ｗｅｌｌｓ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１０，２１３−２１８（１９９５）；Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ，Ｉ．Ｊ．，Ｊｏｎｃｚｙｋ，Ｐ．，Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋａ−Ｔｋａｃｚｙｋ，Ｍ．，Ｂｉａｌｏｓｋｏｒｓｋａ，Ｍ．＆ Ｓｃｈａａｐｅｒ，Ｒ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９５，１００２０−１００２５（１９９８）；Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋａ−Ｔｋａｃｚｙｋ，Ｍ．，Ｊｏｎｅｚｙｋ，Ｐ．，Ｂｉａｌｏｓｋｏｒｓｋａ，Ｍ．，Ｓｃｈａａｐｅｒ，Ｍ．＆ Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ，Ｉ．：Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１２６７８− １２６８３（２０００）；Ｇｗｅｌ，Ｄ．，Ｊｏｎｅｚｙｋ，Ｐ．，Ｂｉａｌｏｓｋｏｒｓｋａ，Ｍ．，Ｓｃｈａａｐｅｒ，Ｒ．Ｍ．＆ Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ，Ｉ．Ｊ．：Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５０１，１２９−１３６（２００２）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｃ．＆ Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，３４６５−３４６９（１９９１）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．＆ Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；３２，４０８３−４０８９（１９９３）；Ｆｒａｎｃｉｎｏ，Ｍ．Ｐ．，Ｃｈａｃ，Ｌ．，Ｒｉｌｅｙ，Ｍ．Ａ．＆ Ｏｃｈｍａｎ，Ｈ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，１０７−１０９（１９９６）；Ａ Ｂｏｕｌｅｔ，Ｍ．Ｓｉｍｏｎ，Ｇ．Ｆａｙｅ，Ｇ．Ａ．Ｂａｕｅｒ ＆ Ｐ．Ｍ．Ｂｕｒｇｅｒｓ．ＥＭＢＯ Ｊ，８，１８４９−１８５４，（１９８９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ａ．，Ａｒａｋｉ Ｈ．，Ｃｌａｒｋ Ａ．Ｂ．，Ｈａｍａｔａｋｅ Ｒ．Ｋ．，＆ Ｓｕｇｉｎｏ Ａ．，Ｃｅｌｌ，６２（６），１１４３−１１５１，（１９９０）などを参照のこと。
本明細書において「ＤＮＡポリメラーゼδ」とは、真核生物のものをさす場合、ＤＮＡの伸長に関与する酵素であって、エキソヌクレアーゼ活性をもち、これに起因して校正機能を有するといわれる。代表的なＤＮＡポリメラーゼδは、配列番号１および２（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列；ｐｏｌδ：Ｘ６１９２０ ｇｉ／１７１４１１／ｇｂ／Ｍ６１７１０．１／ＹＳＣＤＰＢ２［１７１４１１］）を有する。このＤＮＡポリメラーゼδの校正機能の調節は、配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ酸３２２位に改変を導入することによって達成することができる。ＤＮＡポリメラーゼδは、Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，２１６３−２１７０，１９９１に記載されており、その内容は本明細書において参考として援用される。ＤＮＡポリメラーゼδとしては、例えば、シロイヌナズナ（配列番号４５）、イネ（配列番号４７および４８）、ダイズ（配列番号４９および５０）、ヒト（配列番号５１および５２）、マウス（配列番号５５および５６）、ラット（配列番号５９および６０）、ウシ（配列番号６１および６２）、ショウジョウバエ（配列番号６３および６４）などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「ＤＮＡポリメラーゼε」とは、真核生物のものをさす場合、ラギング鎖のすき間の複製に関与する酵素であって、エキソヌクレアーゼ活性をもち、これに起因して校正機能を有するといわれる。代表的なＤＮＡポリメラーゼεは、配列番号３および４（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列；ｐｏｌε：Ｍ６０４１６ ｇｉ／１７１４０８／ｇｂ／Ｍ６０４１６．１／ＹＳＣＤＮＡ ＰＯＬ［１７１４０８］）を有する。このＤＮＡポリメラーゼεの校正機能の調節は、配列番号４のアミノ酸配列においてアミノ酸３９１位に改変を導入することによって達成することができる。ＤＮＡポリメラーゼεは、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＭＧＧ．２４２，２８９−２９６，１９９４；Ａｒａｋｉ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｌｃｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，４８５７−４８７２，１９９１；Ｏｈｙａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８，３８４６−３８５２，２０００に記載されており、その内容は本明細書において参考として援用される。ＤＮＡポリメラーゼεとしては、例えば、シロイヌナズナ（配列番号４６）、ヒト（配列番号５３および５４）、マウス（配列番号５７および５８）、ショウジョウバエ（配列番号６５および６６）などが挙げられるがそれらに限定されない。
ＤＮＡポリメラーゼδおよびεの分類は、ＨＵＧＯ分類によると別名はデルタがＰＯＬＤ１／ＰＯＬ３，イプシロンがＰＯＬＥ／ＰＯＬ２となっており、本明細書では、どの命名法をも用い得る。
その他ＤＮＡポリメラーゼの説明については、例えば、Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｃ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２２，１−２１，１９７８；Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｃ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９２，３９７−４０８；Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｃ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，ＭＧＧ，１９５，４８７−４９０，１９８４；Ｌａｗｒｅｎｃｅ
Ｃ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，ＭＧＧ．２００，８６−９１，１９８５（ＤＮＡポリメラーゼβおよびＤＮＡポリメラーゼζ）；Ｍａｈｅｒ Ｖ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２６１，５９３−５９５，１９７６；ＭｃＧｒｅｇｏｒ，Ｗ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９，１４７−１５４、１９９９（ＤＮＡポリメラーゼη）；Ｓｔｒａｎｄ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６５，２７５−２７６，１９９３；Ｐｒｏｌｌａ Ｔ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，４０７−４１５，１９９４；Ｋａｔ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，６４２４−６４２８；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ Ｎ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，６３１９−６３２３，１９９４、Ｆａｂｅｒ Ｆ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３，２５３−２５６，１９９４；Ｅｓｈｌｅｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０，３３−３７，１９９５；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，９４７３−９４７７，１９９１；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１２，１４６７−１４７３，１９９３；Ｆｏｕｒｙ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１１，２７１７−２７２６，１９９２（ＤＮＡポリメラーゼλ、ＤＮＡポリメラーゼμなど）などに記載されており、その内容は本明細書において参考として援用される。
本明細書においてＤＮＡポリメラーゼなどの遺伝子および酵母などの生物の「野生型」は、もっとも広汎な定義では、天然に存在するＤＮＡポリメラーゼなどの遺伝子および酵母などの生物を含み、通常、天然に存在するＤＮＡポリメラーゼなどの遺伝子および酵母などの生物のうち、由来となる生物種においてもっとも広汎に存在するものをいう。従って、通常、ある種において最初に同定されるＤＮＡポリメラーゼなどの遺伝子および酵母などの生物の種は野生型といえる。野生型はまた、「天然標準型」ともいう。そのような野生型ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼδであれば、配列番号１および２に示す配列を有するものである。また、たとえば、ＤＮＡポリメラーゼεであれば、配列番号３および４４に示す配列を有するものである。また、配列番号４１〜６６に示す配列を有するものもまた野生型の例示として挙げられる。生物であれば、野生型は、酵素活性が正常であり得、形質が正常であり得、行動が正常であり得、生理が正常であり得、繁殖が正常であり得、ゲノムが正常であり得る。
本明細書において校正機能が「野生型のものよりも低い」とは、ある校正機能を有する酵素などについて言及するとき、その酵素の野生型よりも校正機能が低いこと（すなわち、その酵素での校正処理の後に残留する変異の数が野生型による校正処理の後に残留する変異の数よりも多いこと）をいう。そのような野生型との比較は、相対的または絶対的な表示によって行うことができる。そのような比較はまた、エラープローン頻度などによって行うことができる。
本明細書において「変異」とは、遺伝子について言及するとき、その遺伝子の配列の変化を生じることまたはその変化によって生じた遺伝子の（核酸またはアミノ酸）配列の状態をいう。本明細書では、例えば、「変異」は、校正機能について生じる遺伝子配列の変化について用いられる。本明細書では、特に言及しない場合は、「変異」は、「改変」と同義で用いられる。
有用な変異体を作製するためには、生物において変異誘発を行うことがもっとも一般的である。「変異」とは、通常、遺伝子をコードする塩基配列の変化をいい、ＤＮＡ配列の
変化が包含される。変異は、それが発生した個体に与える影響により、大きく次の３種類に分けられる：Ａ）中立変異（ｎｅｕｔｒａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）：この変異は、ほとんどの変異が該当し、生物の成育および代謝にほとんど影響がない。Ｂ）有害変異（ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）：この変異は、中立変異よりは頻度は少ない。生物の成長または代謝を阻害する。有害変異には、生育に必須な遺伝子を破壊するような致死変異（ｌｅｔｈａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）も含まれる。微生物の場合、種によっても異なるが、通常全変異に占める有害変異の割合は、約１／１０〜１／１００とされている。Ｃ）有益変異（ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）：この変異は、生物の育種に有益な変異である。その発生頻度は中立変異と比較して極めて低い。したがって、有益変異が導入された生物個体を得るためには、大きな生物集団と、長い時間が必要となる。また、生物の育種の十分な効果は、単一の変異だけで現れることはまれであり、複数の有益変異の蓄積が必要であることが多い。
本明細書において「成長（または生長）」とは、ある生物について言及するとき、その生物の個体としての量的増大をいう。成長は、具体的には体長（身長）、体重などの計測値の増加で個体の量的増大を認識することができる。個体の量的増大は細胞の増大および細胞数の増加に依存する。
本明細書において「実質的に同じ成長（または生長）」とは、生物について言及するとき、その生物が、比較対象となる生物（例えば、遺伝形質の変換前の生物）と比較して、成長速度がほとんど変化しないことをいう。そのような成長速度がほとんど変化しない範囲には、例えば、通常の成長の統計分布における１偏差分以内に入ることなどが挙げられるがそれに限定されない。また、本発明の生物では、例えば、（１）子供の数が変わらない；（２）形態は変化するが、通常の人為的突然変異と違って、障害的ではなく、変異率が極めて高いにも拘わらず、見た目が“美しい”と予想される。（成長とは直接関係しないが、本発明の方法により創出された変異体の特徴だと考えられる）；（３）一度獲得した形質あるいは遺伝型あるいは表現型は後もどりしないなどの効果が得られる。
本明細書において「薬剤耐性」とは、薬剤（バクテリオファージ、バクテリオシンなどの生理活性物質を含む）に対する耐性または抵抗性をいう。薬剤耐性は、感受性の宿主において、薬剤のレセプターが変化したり、あるいは、薬剤が作用する種々の過程の１箇所以上が変化したりするときに獲得される。あるいは、感受性宿主が抗菌物質そのものを不活化する性質を獲得したときにも薬剤耐性が獲得され得る。薬剤耐性生物では、染色体ＤＮＡの変異、薬剤が作用する酵素および／またはリボソームタンパク質の性質が変わり、通常濃度の薬剤が作用しなくなる場合と，薬剤耐性プラスミド（例えば、Ｒプラスミド）を他の生物から獲得して、薬剤を不活化する酵素活性を獲得すること、あるいは、薬剤の膜透過性を減少させる場合などがあるがそれらに限定されない。
本明細書において「がん細胞」とは、肉腫を含めた「悪性腫瘍細胞」と等価の意味で用いられ、無限の増殖性を有し不死の状態を有する細胞をいう。がん細胞では、正常細胞が遺伝子レベルにおいて何らかの不可逆的変化を生じた結果、異常の細胞へと変換し、無限の増殖性を有し不死の状態に陥るといわれる。
本明細書において生物の「生産」とは、ある生物について言及するとき、その生物の個体を作り出すことをいう。
本明細書において生物の「再生産」とは、ある生物について言及するとき、親個体から次の世代の新たな個体を作り出すことをいう。再生産には、生殖、繁殖など天然現象によるもの、クローン（核移植）技術などの人工技術などによるものが包含されるがそれらに限定されない。再生産に用いられる技術としては、例えば、植物の場合、１培養細胞から
個体ができる；接木、挿し木などが挙げられるがそれらに限定されない。再生産によって生産された生物は、通常、親に由来する遺伝形質を有する。有性生殖によって再生産される生物では、再生産された生物は、通常２つの性にそれぞれ由来する遺伝形質を有する。通常、そのような由来遺伝形質は、２つの性に由来するものをほぼ等しい割合で有する。無性生殖によって再生される生物では、通常再生産された生物は、親に由来する遺伝形質を有する。
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
本発明において使用される細胞は、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の単細胞生物（例えば、細菌、酵母）または多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など））でもよい。例えば、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より詳細には、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞が用いられる。１つの実施形態では、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞、特にヒト由来の細胞が用いられるがそれに限定されない。本発明において用いられる細胞は、上記細胞は、幹細胞であってもよく体細胞であってもよい。そのような細胞は、移植目的に使用されるものであってもよい。あるいは、植物細胞としては、好ましくは、顕花植物（単子葉または双子葉）由来の細胞が用いられ、より好ましくは双子葉植物細胞が用いられ、より好ましくはイネ科、ナス科、ウリ科、アブラナ科、セリ科、バラ科、マメ科、ムラサキ科の植物由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ソルガム、タバコ、ピーマン、ナス、メロン、トマト、イチゴ、サツマイモ、アブラナ、キャベツ、ネギ、ブロッコリー、ダイズ、アルファルファ、アマ、ニンジン、キュウリ、柑橘類、ハクサイ、レタス、モモ、ジャガイモ、ムラサキ、オウレン、ポプラおよびリンゴ由来の細胞が用いられる。植物細胞は、植物体の一部、器官、組織、培養細胞などであり得る。細胞、組織、器官または個体の形質転換法は、当該分野で周知である。そのような技術は、本発明において引用した文献などに十分記載されている。核酸分子の生物細胞への導入は、一過的であっても恒常的であってもよい。一過性または恒常性の遺伝子導入の技術はそれぞれ当該分野において周知である。本発明において用いられる細胞を分化させて形質転換植物を作出する技術もまた当該分野において周知であり、そのような技術は、本発明において引用した文献などに十分記載されていることが理解される。形質転換植物から種子を得る技術もまた、当該分野において周知であり、そのような技術は、本発明において引用した文献などに記載されている。
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書において使用され得る幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞もまた、幹細胞であり得る。「胚性幹細胞」とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている
細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される幹細胞は、遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節することができる限り、胚性幹細胞であっても、組織幹細胞であってもよい。
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。
本明細書において「体細胞」とは、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、そのＤＮＡを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において使用される体細胞は、遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節することができる限り、天然に存在するものであってもよく、遺伝子改変されたものであってもよい。
幹細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の幹細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。中胚葉由来の幹細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞などが含まれる。内胚葉由来の幹細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、膵幹細胞などが含まれる。本明細書では、遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節することができる限り、体細胞はどのような胚葉由来でもよい。
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、「単離された細胞」とは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。核酸またはポリペプチドについていう場合、「単離された」とは、たとえば、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。単離された核酸は、好ましくは、その核酸が由来する生物において天然にこの核酸に隣接している（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列（即ち、該核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。本明細書において使用される細胞は、遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節することができる限り、上記のどのような細胞であってもよい。本明細書において、「分化」または「細胞分化」とは、１個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的および／または機能的に質的な差をもった二つ以上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない細胞に由来する細胞集団（細胞系譜）が、特定のタンパク質の
産生などはっきりした特徴を示すに至る過程も「分化」に包含される。
本明細書において細胞、生物などの「状態」とは、細胞の種々のパラメータ（例えば、細胞周期、外来因子に対する応答、シグナル伝達、遺伝子発現、遺伝子の転写など）に関する状況をさす。そのような状態としては、例えば、分化状態、未分化状態、外来因子に対する細胞応答、細胞周期、増殖状態などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、特に、対象となる生物の環境、例えば、温度、湿度（例えば、絶対湿度、相対湿度など）、ｐＨ、塩濃度（例えば、塩全体の濃度または特定の塩の濃度）、栄養（例えば、炭水化物量など）、金属（例えば、金属全体の量または特定の金属（例えば、重金属）の濃度など）、ガス（例えば、ガス全体の量または特定のガスの量）、有機溶媒（例えば、有機溶媒全体の量または特定の有機溶媒（例えば、エタノールなど）の量）、圧力（例えば、局所圧または全体の圧など）、気圧、粘性、流速（例えば、培地中に生物が存在する場合のその培地の流速など）、光度（ある特定波長の光量など）、光波長（例えば、可視光のほか紫外線、赤外線なども含み得る）、電磁波、放射線、重力、張力、音波、対象となる生物とは異なる他の生物（例えば、寄生虫、病原菌など）、化学薬品（例えば、医薬品など）、抗生物質、天然物、精神的ストレス、物理的ストレスなどのようなパラメータに対する反応性または耐性を、そのような状態に関する指標として使用することができる。
本明細書においてある主体にとって「環境」とは、その主体に対するその外囲を，環境（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、ドイツ語でＵｍｇｅｂｕｎｇ）という。環境は、種々の構成要素、状態量が認められ，これらは環境要因といわれる、上記のようなパラメータが例示される。環境要因は、通常、非生物的環境要因と生物的環境要因とに大別され得る。非生物的環境要因（無機的環境）を物理的と化学的とに、あるいは気候的と土壌的とに区別することもある。こうした種々の環境要因の生物に対する作用は、各々が独立的して行われるとは限らず、互いに関連しあっている場合が多い。したがって、本明細書では、環境は、それぞれの要因ごとに観察してもよいし、環境要因の総体（種々のパラメータの総体）として認識されてもよい。
本明細書において「組織」（ｔｉｓｓｕｅ）とは、多細胞生物において、実質的に同一の機能および／または形態をもつ細胞集団をいう。通常「組織」は、同じ起源を有するが、異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および／-または形態を有するので
あれば、組織と呼ばれ得る。従って、本発明の幹細胞を用いて組織を再生する場合、２以上の異なる起源を有する細胞集団が一つの組織を構成し得る。通常、組織は、臓器の一部を構成する。動物の組織は，形態的、機能的または発生的根拠に基づき、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などに区別される。植物では、構成細胞の発達段階によって分裂組織と永久組織とに大別され、また構成細胞の種類によって単一組織と複合組織とに分けるなど、いろいろな分類が行われている。本明細書において組織が対象として使用される場合、そのような組織としては、遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節することができる限り、上記のどのような組織であってもよい。
本発明において、臓器またはそれらの一部が対象とされる場合、そのような臓器はどのような臓器でもよく、また本発明が対象とする組織または細胞は、生物のどの臓器または器官に由来するものでもよい。本明細書において「臓器」または「器官」とは、互換可能に用いられ、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのような臓器または器官としては、血管系に関連する臓器または器官が挙げられる。１つの実施形態では、本発明が対象とする臓器は、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに限
定されない。本明細書において臓器が対象として使用される場合、そのような臓器としては、遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節することができる限り、上記のどのような臓器であってもよい。
本明細書において「生産物質」とは、対象となる生物またはその一部が生産する物質をいう。そのような物質としては、遺伝子の発現産物、代謝物、排泄物などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明の遺伝形質の変換速度の調節によって、対象となる生物は、その生産物質の種類および／または量を変化させる。本発明はまた、そのような変化した生産物質をもその範囲として企図することが理解される。好ましくは、そのような生産物質は、代謝物であり得るがそれに限定されない。
本明細書において「病態モデル」とは、生物に言及するとき、その生物についての特定の疾患、病状、障害、状態などを再現することができる生物のモデルをいう。そのような病態モデルは、本発明の方法によって生産することができる。そのような病態モデルとしては、例えば、発癌動物、心疾患（例えば、心筋梗塞など）動物、循環器疾患（例えば、動脈硬化など）動物、中枢神経疾患（例えば、痴呆、脳梗塞など）動物などが挙げられるがそれらに限定されない。
（一般生化学・分子生物学）
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法、細胞生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９），Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０），ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２），Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５），Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５），ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９），Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９），ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本発明の遺伝子産物は、通常ポリペプチド形態をとる。このようなポリペプチド形態の本発明の生産物質は、医薬組成物などとして有用であり得る。
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボー
スが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。本発明において使用されるＤＮＡポリメラーゼなどの遺伝子は、通常、このポリヌクレオチド形態をとる。このようなポリヌクレオチド形態の本発明の遺伝子または遺伝子産物は、本発明の方法において有用である。
本明細書では「核酸分子」もまた、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」と互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡなどを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体（改変体）」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。したがって、本明細書では、たとえば、本発明の遺伝子には、そのスプライス変異体もまた包含され得る。
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の同一性とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて相同性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、相同性と類似性とは同じ数値を示す。
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトパラメータを用いて算出される。特に言及する場合は、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴに代えてＦＡＳＴＡ（パラメータはデフォルト）がツールとして使用され得る。
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在す
るアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。
用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチド分子またはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸または核酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸または核酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位（例えば、ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を担う範囲など）中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸またはそれをコードする核酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。このような対応するアミノ酸または核酸は、当該分野において公知のアラインメント技術を用いて同定することができる。そのようなアラインメント技術としては、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ， Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｃ．Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３，１９７０に記載される技術が挙げられるがそれに限定されない。
本明細書において、「対応する」遺伝子（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子）と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子の
オルソログであり得る。したがって、マウスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（ヒト、ラット、ブタ、ウシなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子など）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものをいう。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。本明細書において「因子」としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、低分子（例えば、薬学的に受容可能な低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。このような因子は、本明細書において、生物中のエラープローン頻度を調節するために有用であり得る。
本明細書において「有機低分子」とは、有機分子であって、比較的分子量が小さなものをいう。通常有機低分子は、分子量が約１０００以下のものをいうが、それ以上のものであってもよい。有機低分子は、通常当該分野において公知の方法を用いるかそれらを組み合わせて合成することができる。そのような有機低分子は、生物に生産させてもよい。有機低分子としては、例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、薬学的に受容可能な低分子（例えば、低分子リガンドなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。このような分子は、本明細書において、生物中のエラープローン頻度を調節するために有用であり得る。
本明細書において用いられる用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。
本明細書において「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。
本明細書において「単鎖抗体」とは、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結されることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じたものをいう。
本明細書において「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合分子としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、例えば、ＤＮＡポリメラーゼのような遺伝子またはその産物あるいは本発明の因子と同様の機能を有する限り、それぞれＤＮＡポリメラーゼのような遺伝子またはその産物あるいは本発明の因子としてそのような複合分子も使用することができる。
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた本発明の一形態であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現の減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチド（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現の増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチド（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の発現量の増加を含む。本明細書において遺伝子の「発現の誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。このような遺伝子または遺伝子産物（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）の発現の増加または減少は、本発明において、例えば、複製におけるエラープローン頻度を調節するにおいて有用であり得る。
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。「特異的に発現する」とは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは「特異的に発現する」とは、ある部位においてのみ発現することをいう。したがって、本発明において、ある実施形態では、所望の箇所に局所的にＤＮＡポリメラーゼを特異的に発現させてもよい。
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含される。例えば、２つの因子が相互作用する（例えば、ＤＮＡポリメラーゼとその特異的配列とが結合する）場合、その生物学的活性は、ＤＮＡポリメラーゼとその特異的配列との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、特定のヌクレオチド重合反応；複製エラーの発生；ヌクレオチド除去能；塩基のミスペアーリング認識など）などを包含する。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
本明細書において「アンチセンス（活性）」とは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制または低減することができる活性をいう。アンチセンス活性は、通常、目的とする遺伝子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼなど）の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列によって達成される。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。そのような核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好まし
くは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、もっとも好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。そのようなアンチセンス活性は、目的とする遺伝子の核酸配列の５’末端の配列に対して相補的であることが好ましい。そのようなアンチセンスの核酸配列には、上述の配列に対して、１つまたは数個あるいは１つ以上のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有するものもまた含まれる。このようなアンチセンス活性を有する分子は、本明細書において、生物中のエラープローン頻度を調節するために有用であり得る。
本明細書において「ＲＮＡｉ」とは、ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの略称で、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なｍＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書においてＲＮＡｉはまた、場合によっては、ＲＮＡｉを引き起こす因子と同義に用いられ得る。
本明細書において「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、ＲＮＡｉを引き起こすことができるような任意の因子をいう。本明細書において「遺伝子」に対して「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、その遺伝子に関するＲＮＡｉを引き起こし、ＲＮＡｉがもたらす効果（例えば、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのようなＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約７０％の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。このようなＲＮＡｉは、本明細書において、生物中のエラープローン頻度を調節するために有用であり得る。
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ（アデニン）配列のみまたはＴ（チミン）配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の濃度によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｘｐｒｅｓｓ）を参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）を参照のこと。
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
ＤＮＡポリメラーゼタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１、３、４１、４３、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５などに示される核酸配列の一部を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。好ましいＤＮＡポリメラーゼまたはその改変体あるいはフラグメントの核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ ＥＤＴＡ；４２℃の温度で ７％ ＳＤＳ を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ ＮａＣｌ；６０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ； ７％ ＳＤＳ を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ ＮａＣｌ；３０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）；０．１％
ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１、３、４１、４３、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５などに示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相
同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよび ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用されるＤＮＡポリメラーゼ（例えば、校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼ）には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列（他の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする）と比較したときに、付加または欠失（すなわちギャップ）が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数（すなわちウィンドウサイズ）で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５（８）：２４４４−２４４８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ
ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得
る。
（１） ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２） ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３） ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つのリーディングフレームで変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４） ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つのリーディングフレーム（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５） ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列を６つのリーディングフレームで変換したものを、６つのリーディングフレームで変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、
上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、最も好ましくは、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒなど）を用いて行ってもよい。
本明細書において、「エピトープ」とは、抗原決定基をいい、抗原抗体反応を惹起することができる限りその詳細な構造は必ずしも決定されている必要はない。従って、「エピトープ」には特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、または、Ｔ細胞の場合は、Ｔ細胞レセプタータンパク質および／もしくは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レセプターによる認識について必要であるアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。免疫系分野において、インビボまたはインビトロで、エピトープは、分子の特徴（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または三次ペプチド構造および電荷）であり、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むエピトープは、エピトープに独特な空間的コンフォメーション中に３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のこのようなアミノ酸からなる。エピトープの長さは、より長いほど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフォメーションを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学、および２次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３：７０９（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むエピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
従って、ペプチドを含むエピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは少なくとも５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。エピトープは線状であってもコンフォメーション形態であってもよい。
（遺伝子の改変）
あるタンパク質分子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼなど）において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書に
おいて開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。あるいは、校正機能に改変が加えられるように、ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列に改変が施され得る。
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
親水性指数もまた、本発明において、遺伝子を改変する際に考慮され得る。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
本明細書において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換は、例えば、親水性指数または疎水性指数が、±２以内のもの同士、好ましくは±１以内のもの同士、より好ましくは±０．５以内のもの同士のものが挙げられる。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改
変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体の例としては、基準となる核酸分子またはポリペプチドに対して、１または数個の置換、付加および／または欠失、少なくとも１つの置換、付加および／または欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。そのような改変体は、基準となる分子（例えば、野生型分子など）の生物学的活性を有していてもよく、有していなくてもよい。目的に応じて、あらたな生物学的活性が付与されてもよく、一部の生物学的活性が欠失させられてもよい。そのような設計は、当該分野において周知の技術を用いることによって実施することができる。あるいは、すでに性質が明らかな改変体を産生する生物から単離または核酸配列を増幅してその配列情報を入手してもよい。したがって、本明細書において、ある宿主細胞にとっては、別の生物種に由来する同一の対応する遺伝子およびその産物もまた、野生型にとって「改変体」であると解釈される。
本明細書において「対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）」とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種において、もとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明において使用されるオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法の例としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、および／または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチド鎖のアミノ酸を１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」または「ペプチド誘導体」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体が付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
同様に、本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチドアナログ」または「核酸アナログ」は、ポリヌクレオチドまたは核酸とは異なる化合物であるが、ポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ポリヌクレオチドアナログまたは核酸アナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体が付加または置換されているものが含まれる。
本明細書において使用される核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換」、「付加」または「欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け
加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
（遺伝子工学）
本発明において用いられるＤＮＡポリメラーゼならびにそのフラグメントおよび改変体のようなタンパク質は、遺伝子工学技術を用いて生産および細胞内導入することができる。
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。そのようなベクターとしては、例えば、プラスミドが挙げられる。
本明細書において「プラスミド」とは、染色体とは別個に存在して自律的に増殖する遺伝因子をいう。本明細書において、プラスミドは、特に言及するとき、核細胞のミトコンドリア、葉緑体などに含まれるＤＮＡは一般にはオルガネラＤＮＡと区別して呼び、プラスミドに入らないことが理解される。
そのようなプラスミドとしては、例えば、
大腸菌：ｐＥＴ（ＴＡＫＡＲＡ）、ｐＵＣ（ＴＯＹＯＢＯ）、ｐＢＲ３２２（ＴＯＹＯＢＯ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ）
酵母：ｐＡＵＲ（ＴＡＫＡＲＡ）、ｐＥＳＰ（ＴＯＹＯＢＯ）、ｐＥＳＣ（ＴＯＹＯＢＯ）
枯草菌：ｐＨＹ３００ＰＬＫ（ＴＡＫＡＲＡ）
糸状菌：ｐＰＲＴＩ（ＴＡＫＡＲＡ）、ｐＡＵＲ３１６（ＴＡＫＡＲＡ）
動物細胞：ｐＣＭＶ（ＴＯＹＯＢＯ）、ｐＢＫ−ＣＭＶ（ＴＯＹＯＢＯ）など
が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカー、サイレンサーおよび／またはエンハンサーを含み得る。生物（例えば、植物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。特定のプロモーターなどを含ませることによって、一定条件下でエラープローン頻度を調節するように細胞を操作することができる。
本発明において用いられ得る原核細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ４２、ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。
本発明において用いられ得る動物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＡＧＥ１０３（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７））、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３））、マウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｖｉｒｕｓ）（ＭＳＣＶ）に基づいたレトロウイルス型発現ベクター、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰなどが例示される。
植物細胞に対する「組換えベクター」としては、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター、カリフラワーモザイクウイルスベクター、ジェミニウイルスベクターなどが例示される。
昆虫細胞に対する「組換えベクター」としては、バキュロウイルスベクターなどが例示される。
本明細書において「ターミネーター」とは、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
本明細書において「サイレンサー」とは、遺伝子発現を抑制し静止する機能を有する配列をいう。本発明では、サイレンサーとしてはその機能を有する限り、どのようなものを用いてもよく、サイレンサーを用いなくてもよい。
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも構造遺伝子に隣接して配置される必要はない。
本明細書において、校正機能を改変したＤＮＡポリメラーゼなどをコードする核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、あるいは、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．およびその第三版（２００１），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、例えばｍＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１などが例示される。
本明細書において使用される場合、動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７など、ヒト結腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５など、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−５Ｙなど、マウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２Ａなどが例示される。
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０））、リポフェクション法、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８））、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３））、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法などが例示される。
本明細書において、レトロウイルスの感染方法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 前出（特にＵｎｉｔｓ ９．９−９．１４）などに記載されるように、当該分野において周知であり、例えば、トリプシナイズした胚性幹細胞を単一細胞懸濁物（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）にした後、ウイルス産生細胞（ｖｉｒｕｓ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）（パッケージング細胞株＝ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ）の培養上清と一緒に １−２時間共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）することにより、十分量の感染細胞を得ることができる。
本発明を植物において利用する場合、植物細胞への植物発現ベクターの導入には、当業者に周知の方法、例えば、アグロバクテリウムを介する方法および直接細胞に導入する方法、が用いられ得る。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｎａｇｅｌら（１９９０）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２５）が用いられ得る。この方法は、まず、例えば植物に適切な発現ベクターでエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＧｅｌｖｉｎら（Ｇｅｌｖｉｎら編（１９９４）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ））に記載の方法で植物細胞に導入する方法である。植物発現ベクターを直接細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：２７４−２７６；およびＲｈｏｄｅｓら（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：２０４−２０７を参照のこと）、パーティクルガン法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９９１）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７−９６２を参照のこと）ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法（Ｄａｔｔａら（１９９０）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：７３６−７４０を参照のこと）が挙げられる。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。
本発明において、形質転換体では、目的とする核酸分子（導入遺伝子）は、染色体に導入されていても導入されていなくてもよい。好ましくは、目的とする核酸分子（導入遺伝子）は、染色体に導入されており、より好ましくは、２つの染色体の両方に導入されている。
形質転換細胞は、当該分野で周知の方法により、植物組織、植物器官および／または植物体に分化され得る。
植物細胞、植物組織および植物体の培養、分化および再生のためには、当該分野で公知の手法および培地が用いられる。このような培地には、例えば、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地、Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５（Ｂ）培地、Ｗｈｉｔｅ培地、Ｎｉｔｓｃｈ ＆ Ｎｉｔｓｃｈ（Ｎｉｔｓｃｈ）培地などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらの培地は、通常、植物生長調節物質（植物ホルモン）などが適当量添加されて用いられる。
本明細書において、植物の場合、その植物を「再分化」するとは、個体の一部分から個体全体が復元される現象を意味する。例えば、再分化により、細胞（葉、根など）のような組織片から器官または植物体が形成される。
形質転換体を植物体へと再分化する方法は当該分野において周知である。そのような方法としては、Ｒｏｇｅｒｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１８：６２７−６４０（１９８６）；Ｔａｂａｔａら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ
．，２８：７３−８２（１９８７）；Ｓｈａｗ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２７４（１９８９）；Ｍａｌｉｇａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などに記載されるものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、当業者は、上記周知方法を目的とする形質転換植物に応じて適宜使用して、再分化させることができる。このようにして得られた形質転換植物には、目的の遺伝子が導入されており、そのような遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
さらに、得られた形質転換植物体から種子が取得され得る。導入した遺伝子の発現は、ノーザンブロット法またはＰＣＲ法により、検出し得る。必要に応じて、遺伝子産物たるタンパク質の発現を、例えば、ウェスタンブロット法により確認し得る。
本発明は、任意の生物において利用することができ、特に植物において有用であることが示されている。本発明はまた、他の生物にも適用され得る。本発明において使用される分子生物学技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版およびその第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイなど）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００２ Ｄｅｃ；３２ Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔 羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
本明細書において「発現量」とは、対象となる細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮ
Ａレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。このように、ある因子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼなど）の発現量の変化により、本発明におけるエラープローンの頻度を調節することができる。
本明細書において「上流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの５’末端に向かう位置を示す。
本明細書において「下流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの３’末端に向かう位置を示す。
本明細書において「塩基対の」および「Ｗａｔｓｏｎ ＆ Ｃｒｉｃｋ塩基対の」という表現は、本明細書では同義に用いられ、二重らせん状のＤＮＡにおいて見られるものと同様に、アデニン残基（Ａ）が２つの水素結合によってチミン残基（Ｔ）またはウラシル残基（Ｕ）と結合し、３つの水素結合によってシトシン残基（Ｃ）とグアニン残基（Ｇ）とが結合するという配列の正体に基づいて互いに水素結合可能なヌクレオチドを示す（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照）。
本明細書において「相補的」または「相補体」という用語は、本明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ＆Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。本発明の目的で、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）、またはＣとＧである。本願明細書では、「相補」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、２つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。
胚性幹（ＥＳ）細胞の相同組換えを介したトランスジェニック動物およびノックアウト動物の作製および解析が重要な手段となってきている。トランスジェニック動物またはノックアウト哺乳動物は、例えば相同組換えを応用したポジティブネガティブセレクション法を用いて作製することができる（米国特許第５，４６４，７６４号公報、米国特許第５，４８７，９９２号公報、米国特許第５，６２７，０５９号公報、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，８９３２−８９３５，１９８９、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４２，４３５−４３８，１９８９などを参照）。ノックアウト動物作出（ジーンターゲティングとも呼ばれる）の概説に関しては、例えば、村松正實、山本雅編集、『実験医学別冊 新訂 遺伝子工学ハンドブック 改訂第３版』（１９９９年、羊土社発行）中特に２３９から２５６頁、相沢慎一（１９９５）実験医学別冊「ジーンターゲティング−ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」などに記載され、ますます汎用されている。本発明では、このような方法を適宜用いることができる。
例えば、高等生物では、ネオマイシン耐性遺伝子を用いる陽性選択とＨＳＶのチミジンキナーゼ遺伝子やジフテリア毒素遺伝子を用いる陰性選択により組換え体の効率的な選別が行われている。ノックアウトＰＣＲまたはサザンブロット法により相同組換え体の選択が行われる。すなわち、標的遺伝子の一部を陽性選択用のネオマイシン耐性遺伝子等で置換し、その末端に陰性選択用のＨＳＶＴＫ遺伝子等を連結したターゲティングベクターを作成し、エレクトロポレーションによりＥＳ細胞に導入し、例えば、Ｇ４１８およびガンシクロビルの存在下で選択して、生じたコロニーを単離し、さらにＰＣＲまたはサザンブ
ロットにより相同組換え体を選択する。
このように、内在する標的遺伝子を破壊して、対応する機能が喪失したかまたは減少した変異を有するトランスジェニックまたはノックアウト（標的遺伝子組換え、遺伝子破壊）マウスを作製する方法は、標的とした遺伝子だけに変異が導入されるので、その遺伝子機能の解析に有用である。
所望の相同組換え体を選択した後、得られた組換えＥＳ細胞を胚盤注入法または集合キメラ法により正常な胚と混合してＥＳ細胞と宿主胚とのキメラマウスを作製する。胚盤注入法では、ＥＳ細胞を胚盤胞にガラスピペットで注入する。集合キメラ法では、ＥＳ細胞の塊と透明帯を除去した８細胞期の胚とを接着させる。ＥＳ細胞を導入した胚盤胞を偽妊娠させた代理母の子宮に移植してキメラマウスを得る。ＥＳ細胞は、全能性を有するので、生体内では、生殖細胞を含め、あらゆる種類の細胞に分化することができる。ＥＳ細胞由来の生殖細胞を有するキメラマウスと正常マウスを交配させるとＥＳ細胞の染色体をヘテロに有するマウスが得られ、このマウス同士を交配するとＥＳ細胞の改変染色体をホモに有するノックアウトマウスが得られる。得られたキメラマウスから改変染色体をホモに有するノックアウトマウスを得るには、雄性キメラマウスと雌性野生型マウスとを交配して、Ｆ１世代のヘテロ接合体マウスを産出させ、生まれた雄性および雌性のヘテロ接合体マウスを交配して、Ｆ２世代のホモ接合体マウスを選択する。Ｆ１およびＦ２の各世代において所望の遺伝子変異が導入されているか否かは、組換えＥＳ細胞のアッセイと同様に、サザンブロッティング、ＰＣＲ、塩基配列の解読など当該分野において慣用される方法を用いて分析され得る。
多様な遺伝子機能を選択的に解析することができないという問題を克服する別の技術として、Ｃｒｅリコンビナーゼの細胞種特異的発現とＣｒｅ−ｌｏｘＰの部位特異的組み換えを併用するコンディショナルノックアウト技術が注目されている。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを用いるコンディショナルノックアウトマウスは、標的遺伝子の発現を阻害しない位置にネオマイシン耐性遺伝子を導入し、後に削除するエキソンをはさむようにしてｌｏｘＰ配列を挿入したターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入し、その後相同組換え体を単離する。この単離したクローンからキメラマウスを得、遺伝子改変マウスが作製される。次に、大腸菌のＰ１ファージ由来の部位特異的組換え酵素Ｃｒｅを組織特異的に発現するトランスジェニックマウスとこのマウスを交配させると、Ｃｒｅを発現する組織中でのみ遺伝子が破壊される（ここでは、Ｃｒｅは、ｌｏｘＰ配列（３４ｂｐ）を特異的に認識して、２つのｌｏｘＰ配列にはさまれた配列で組換えを起こさせ、これが破壊される）。臓器特異的なプロモータに連結したＣｒｅ遺伝子を有するトランスジェニックマウスと交配させるか、またはＣｒｅ遺伝子を有するウイルスベクターを使用して、成体でＣｒｅを発現させることができる（Ｓｔａｎｆｏｒｄ ＷＬ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２：７５６−７６８（２００１）を参照）。
このようにして、本発明の生物を作製することができる。
（ポリペプチドの製造方法）
本発明の方法によって生産された微生物、動物細胞などに由来する形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、本発明の培養物より本発明のポリペプチドを採取することにより、本発明に係るポリペプチドを製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、本発明の生物が資化し得る炭素源、窒素源、無
機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フルクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸または有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。
培養温度は１５〜４０℃がよいが、その範囲外の温度も使用され得る。特に、本発明により温度耐性生物または細胞が生産されると、上記範囲外の温度が最適になる可能性があり得る。培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持することが好ましいがそれに限定されない。特に、本発明により酸またはアルカリ耐性の生物または細胞が生産されると、上記範囲外のｐＨが最適になる可能性があり得る。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンまたはテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを含む発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。遺伝子を導入した植物の細胞または器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
例えば、動物細胞を用いる場合、本発明の細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７））、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２））、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０））またはこれら培地にウシ胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離または精製するためには、当該分野で周知慣用の通常の酵素の単離または精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞外に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、その培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。その可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、その細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。その無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることによって、精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈澱画分より、通常の方法により本発明のポリペプチドを回収後、そのポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。この可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないか、または、ポリペプチド変性剤の濃度が、ポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、本発明のポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
また、通常のタンパク質の精製方法（Ｊ．Ｅｖａｎ．Ｓａｄｌｅｒら：Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８）に準じて精製できる。また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる（山川彰夫，実験医学（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１３，４６９−４７４（１９９５））。例えば、Ｌｏｗｅらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７−８２３１（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０））に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
また、本発明のポリペプチドをＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］。
さらに、本発明のポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。本発明のポリペプチドは、公知の方法（Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ，６，１２９−１３４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６−１６８（１９９１））に準じて、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて生産することができる。
本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。本発明の新規ｐｓ２０様ペプチドの生理活性は、公知の測定法（Ｃｅｌｌ，７５，１３８９（１９９３）、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．ｌ１４６，２３３（１９９９）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８，１２３８（１９９８）、Ｎｅｕｒｏｎ １７，１１５７（１９９６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９，１１９７（２０００）など）に準じて測定することができる。
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよく、インシリコ（コンピュータを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。
このようなスクリーニングまたは同定の方法は、当該分野において周知であり、例えば、そのようなスクリーニングまたは同定は、マイクロタイタープレート、ＤＮＡまたはプロテインなどの生体分子アレイまたはチップを用いて行うことができる。スクリーニングの試験因子を含む対象としては、例えば、遺伝子のライブラリー、コンビナトリアルライブラリーで合成した化合物ライブラリーなどが挙げられるがそれらに限定されない。
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、疾患または障害の調節因子を同定する方法を提供する。このような調節因子は、それぞれの疾患の医薬またはそのリード化合物として用いることができる。そのような調節因子ならびにその調節因子を含む医薬およびそれを利用する治療法もまた、本発明の範囲内にあることが意図される。
したがって、本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。
本発明は、他の実施形態において、有効な調節活性を有する本発明の化合物に対するスクリーニングの道具として、コンピュータによる定量的構造活性相関（ｑｕａｎｔｉｔａ
ｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ＝ＱＳＡＲ）モデル化技術を使用して得られる化合物を包含する。ここで、コンピューター技術は、いくつかのコンピュータによって作成した基質鋳型、ファーマコフォア、ならびに本発明の活性部位の相同モデルの作製などを包含する。一般に、インビトロで得られたデータから、ある物質に対する相互作用物質の通常の特性基をモデル化することに対する方法は、最近ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭ ファーマコフォア法（Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，９：４７７〜４８９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８８：２１〜２９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９０：４２９〜４３８，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９１：４２４〜４３３，１９９９）および比較分子電界分析（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｉｅｌｄ ａｎａｌｙｓｉｓ；ＣｏＭＦＡ）（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ＆ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，２４：１〜６，１９９６）などを使用して示されている。本発明において、コンピュータモデリングは、分子モデル化ソフトウェア（例えば、ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭバージョン４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）など）を使用して行われ得る。
活性部位に対する化合物のフィッティングは、当該分野で公知の種々のコンピュータモデリング技術のいずれかを使用して行うことができる。視覚による検査および活性部位に対する化合物のマニュアルによる操作は、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，１９９２）、ＳＹＢＹＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，１９９２）、ＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０６：７６５−７８４，１９８４）、ＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，４：１８７〜２１７，１９８３）などのようなプログラムを使用して行うことができる。これに加え、ＣＨＡＲＭＭ、ＡＭＢＥＲなどのような標準的な力の場を使用してエネルギーの最小化を行うこともできる。他のさらに特殊化されたコンピュータモデリングは、ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８：８４９〜８５７，１９８５）、ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１：２９〜３４，１９９１）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ ａｎｄ Ｏｌｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：１９５〜２０２，１９９０）、ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ ｅｔ
ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１：２６９〜２８８，（１９８２））などを含む。さらなる構造の化合物は、空白の活性部位、既知の低分子化合物における活性部位などに、ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６：６１〜７８，１９９２）、ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ ａｎｄ Ｉｔａｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７：８９８５，１９９１）、ＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などのようなコンピュータープログラムを使用して新規に構築することもできる。このようなモデリングは、当該分野において周知慣用されており、当業者は、本明細書の開示に従って、適宜本発明の範囲に入る化合物を設計することができる。
（疾患）
本発明が対象とし得る疾患および障害（例えば、モデル動物の作製など）は、対象となる生物が罹患し得る疾患および障害であり得る。
１つの実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、循環器系（血液細胞など）であり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるが
それらに限定されない：貧血（例えば、再生不良性貧血（特に重症再生不良性貧血）、腎性貧血、癌性貧血、二次性貧血、不応性貧血など）、癌または腫瘍（例えば、白血病）およびその化学療法処置後の造血不全、血小板減少症、急性骨髄性白血病（特に、第１寛解期（Ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ群）、第２寛解期以降の寛解期）、急性リンパ性白血病（特に、第１寛解期、第２寛解期以降の寛解期）、慢性骨髄性白血病（特に、慢性期、移行期）、悪性リンパ腫（特に、第１寛解期（Ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ群）、第２寛解期以降の寛解期）、多発性骨髄腫（特に、発症後早期）など。
別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、神経系のものであり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：痴呆症、脳卒中およびその後遺症、脳腫瘍、脊髄損傷。
別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、免疫系のものであり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：Ｔ細胞欠損症、白血病。
別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、運動器・骨格系のものであり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：骨折、骨粗鬆症、関節の脱臼、亜脱臼、捻挫、靱帯損傷、変形性関節症、骨肉腫、ユーイング肉腫、骨形成不全症、骨軟骨異形成症。
別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、皮膚系のものであり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：無毛症、黒色腫、皮膚悪性リンパ腫、血管肉腫、組織球症、水疱症、膿疱症、皮膚炎、湿疹。
別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、内分泌系のものであり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：視床下部・下垂体疾患、甲状腺疾患、副甲状腺（上皮小体）疾患、副腎皮質・髄質疾患、糖代謝異常、脂質代謝異常、タンパク質代謝異常、核酸代謝異常、先天性代謝異常（フェニールケトン尿症、ガラクトース血症、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症）、無アルブミン血症、アスコルビン酸合成能欠如、高ビリルビン血症、高ビリルビン尿症、カリクレイン欠損、肥満細胞欠損、尿崩症、バソプレッシン分泌異常、小人症、ウオルマン病（酸リパーゼ（Ａｃｉｄ ｌｉｐａｓｅ）欠損症）、ムコ多糖症ＶＩ型。
別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、呼吸器系のものであり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：肺疾患（例えば、肺炎、肺癌など）、気管支疾患。
別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、消化器系のものであり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：食道疾患（たとえば、食道癌など）、胃・十二指腸疾患（たとえば、胃癌、十二指腸癌など）、小腸疾患・大腸疾患（たとえば、大腸ポリープ、結腸癌、直腸癌など）、胆道疾患、肝臓疾患（たとえば、肝硬変、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型など）、劇症肝炎、慢性肝炎、原発性肝癌、アルコール性肝障害、薬物性肝障害など）、膵臓疾患（急性膵炎、慢性膵炎、膵臓癌、嚢胞性膵疾患など）、腹膜・腹壁・横隔膜疾患（ヘルニアなど）、ヒルシュスプラング病。
別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、泌尿器系のものであり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定
されない：腎疾患（腎不全、原発性糸球体疾患、腎血管障害、尿細管機能異常、間質性腎疾患、全身性疾患による腎障害、腎癌など）、膀胱疾患（膀胱炎、膀胱癌など）。
別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、生殖器系のものであり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：男性生殖器疾患（男性不妊、前立腺肥大症、前立腺癌、精巣癌など）、女性生殖器疾患（女性不妊、卵巣機能障害、子宮筋腫、子宮腺筋症、子宮癌、子宮内膜症、卵巣癌、絨毛性疾患など）。
別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、循環器系のものであり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：心不全、狭心症、心筋梗塞、不整脈、弁膜症、心筋・心膜疾患、先天性心疾患（たとえば、心房中隔欠損、心室中隔欠損、動脈管開存、ファロー四徴など）、動脈疾患（たとえば、動脈硬化、動脈瘤）、静脈疾患（たとえば、静脈瘤など）、リンパ管疾患（たとえば、リンパ浮腫など）。
本発明が対象とし得る疾患（病害）および障害は、植物の病害および障害であり得る。そのような病害および障害としては、例えば、いもち病、寒冷障害が挙げられるがそれらに限定されない。
本発明によって得られた生産物質などが医薬として使用される場合、そのような生産物質などは、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクルおよび／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、アディポネクチンまたはその改変体もしくはフラグメント、またはその改変体もしくは誘導体を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるがそれらに限定されない。
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ約７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビト
ールまたはその適切な代替物を含み得る。
以下に本発明の医薬組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができる。
本発明の生産物質などは、薬学的に受容可能なキャリアと配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、座剤等の固形製剤、またはシロップ剤、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として経口または非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアとしては、上述のように、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸着剤、保湿剤、溶解補助剤、安定化剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じ、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には本発明の生産物質以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内注射、筋肉内注射、経鼻、直腸、膣および経皮等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における賦形剤としては、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デンプン、炭酸カルシウム、軽質無水ケイ酸、塩化ナトリウム、カオリンおよび尿素等が挙げられる。
固形製剤における滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ホウ酸末、コロイド状ケイ酸、タルクおよびポリエチレングリコール等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、白糖、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デキストリン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デンプン溶液、ゼラチン溶液、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、およびシェラック等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カンテン末、ラミナラン末、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、アルギン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、ステアリン酸モノグリセリド、ラクトースおよび繊維素グリコール酸カルシウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における崩壊阻害剤の好適な例としては、水素添加油、白糖、ステアリン、カカオ脂および硬化油等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における吸収促進剤としては、例えば、第四級アンモニウム塩基類およびラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における吸着剤としては、例えば、デンプン、ラクトース、カオリン、ベントナイトおよびコロイド状ケイ酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における保湿剤としては、例えば、グリセリン、デンプン等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における溶解補助剤としては、例えば、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における安定化剤としては、例えば、ヒト血清アルブミン、ラクトース等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤として錠剤、丸剤等を調製する際には、必要により胃溶性または腸溶性物質（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）のフィルムで被覆していてもよい。錠剤には、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーテイング錠あるいは二重錠、多層錠が含まれる。カプセル剤にはハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。座剤の形態に成形する際には、上記に列挙した添加物以外に、例えば、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、半合成グリセライド等を添加することができるがそれらに限定されない。
液状製剤における溶剤の好適な例としては、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。
液状製剤における溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエン酸塩等の緩衝液等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウムおよび塩酸プロカイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、２−フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールおよびシステイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であることが好ましい。通常、これらは、バクテリア保留フィルター等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤（塩酸リドカイン水溶液、生理食塩
水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよい。
さらに、必要ならば、医薬組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。
本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
様々な送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルなど）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
特定の実施形態において、本発明の生産物質またはそれを含む組成物を、処置の必要な領域（例えば、中枢神経、脳など）に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯と組み合わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成され得る。好ましくは、本発明の抗体を含むタンパク質を投与する際、そのタンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。
別の実施形態において、本発明の生産物質は、小胞、特に、リポソーム中に封入された状態で送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
さらに別の実施形態において、本発明の生産物質は、制御された徐放系中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ
Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ
Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）もまた参照のこと）。
さらに別の実施形態において、制御された徐放系は、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
他の制御された徐放系は、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
本発明の処置方法において使用される生産物質および組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
本発明の生産物質などの投与量は、被験体の年齢、体重、症状または投与方法などにより異なり、特に限定されないが、通常成人１日あたり、経口投与の場合、通常には０．０１ｍｇ〜１０ｇであり、好ましくは、０．１ｍｇ〜１ｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇなどであり得る。非経口投与の場合、０．０１ｍｇ〜１ｇであり、好ましくは、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇなどであり得る。
本明細書中、「投与する」とは、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドなどまたはそれを含む医薬組成物を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて投与することを意味する。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法または診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人（患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。
本発明の方法による治療の終了の判断は、商業的に利用できるアッセイもしくは機器使用による標準的な臨床検査室の結果または対象となる疾患に特徴的な臨床症状の消滅によって支持され得る。治療は、対象となる疾患の再発により再開することができる。
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分を満たした１つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。
１つの局面において、本発明は、生物または細胞の遺伝形質の変換速度を調節する方法を提供する。この方法は、（ａ）該生物または細胞の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節する工程、を包含する。ここで、エラープローン頻度の調節は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を調節することによって行うことができる。あるいは、ＤＮＡポリメラーゼの重合反応において重合誤りを増加させることによっても行うことができる。そのようなエラープローン頻度の調節は、当該分野において周知の技術を用いて、本明細書の開示をもとに行うことができる。このようなエラープローン頻度の調節により、従来の変異誘発では達成でいなかった迅速な変異誘発かつ天然に近い進化という効果が奏される。また、従来の変異誘発方法において問題であった、有益変異よりもはるかに高い頻度で発生する有害変異が、ＵＶ、化学物質などの当該分野において公知の任意の変異誘発技術によってもたらされる有害変異の量よりも顕著に減少する。本発明の方法では、導入される変異は、天然において進化現象と同じ現象であるからである。
本発明の細胞または生物を進化させる方法において、エラープローン頻度を調節する工程と、得られた細胞または生物を所望の性質について選択する工程とは、別個に行うことができる。このように２つの工程を別個に行うことによって、エラープローン頻度の調節（すなわち、進化速度の調節につながる）では選択圧をかけない条件で行い、処理個体群を一定の数まで増殖させた後、改変体を選択し、固定する工程を行うことができる。このような工程を、２回目以降、同様の操作を繰り返すことにより効率的、効果的に目的とする進化した細胞または生物を得ることができる。
従来の方法では、生物または細胞の変異率を上昇させれば、有益変異の発生頻度は上昇するが、同時に有害変異もまた発生し、通常は有害変異の発生頻度が高いことから有益変異の発生頻度は、ＵＶ、化学物質などの当該分野において公知の任意の変異誘発技術によってもたらされる有害変異の量よりも顕著に減少する。したがって、従来の方法では、有害変異を、ＵＶ、化学物質などの当該分野において公知の任意の変異誘発技術によってもたらされる有害変異の量よりも顕著に減少させつつ、複数の有益変異を生物または細胞に
誘発することは不可能であった。
また、従来の変異方法では、天然の変異を利用する場合は、発生頻度が極めて低い（例えば、大腸菌等では１０−１０変異（１塩基あたり１複製あたり））であることから、その速度はほとんど実用性に乏しい。また、有益変異は、天然の変異においてほとんど発生しない。したがって、天然の変異を利用した育種は、大きな生物集団と、長い時間が必要となる。本発明の方法は、天然の方法とは異なり、生物集団としては小さな集団のみで十分であり、時間も一世代〜数世代程度しか必要ではなく、その効果は絶大である。
また、部位特異的変異誘発は、決められた変異しか誘発することができず、確実性という点では優れているが、大規模な変異誘発には向いておらず、変異の性質は、生物全体に及ぶものではないことから、必ずしも有益変異とはいえない。従って、天然の進化をまねたものとはいえず、いわゆる遺伝子組み換えによる有害効果が伴うという欠点が存在する。本発明は、結果得られるものがそのような人為的変異誘発ではなく、天然に得られるものと同じであるという特性がある。
他の変異誘発法として、放射線、変異原物質などを用いる方法は、天然の変異と比べて高い頻度で変異を発生させることが可能であるが、有効な線量で放射線を照射した細胞、有効な濃度で変異原物質処理を施した細胞のほとんどが死滅する。すなわち、有害変異が致死量に達することを意味する。また、このような変異原を用いる方法では、有害変異を伴わずに変異誘発することは不可能である。本発明の方法は、このような方法に比べて、有害変異がＵＶ、化学物質などの当該分野において公知の任意の変異誘発技術によってもたらされる有害変異の量よりも顕著に減少する、生物集団としては小さな集団のみで十分であり、時間も一世代〜数世代程度しか必要ではないという効果を有する。
本発明のディスパリティ理論を利用した遺伝形質の変換速度の調節法では、校正機能が調節されたＤＮＡポリメラーゼなどを利用することによって、二本鎖ゲノムＤＮＡの一方の鎖に他方の鎖よりも多く変異が導入される。本発明では、有害変異の蓄積を避けて、複数の有益変異を蓄積することが本発明において初めて実験レベルで実証された。従って、本発明は、理論では変異が多数導入されることが予測されていたものの、その変異にともなってその生物の正常な成長（代謝など）が保たれないとの予測を覆すという意味で画期的な発明といえる。特に、真核生物は、複数の両方向性の複製開始点を有する。ゲノムＤＮＡに両方向性の複製開始点があるとき、ディスパリティ法では、有害変異の蓄積を避けて、複数の有益変異を蓄積することはできない。このような真核生物においても、本発明の方法において、有害変異の蓄積を避けて、複数の有益変異を蓄積することが実証された。
好ましい実施形態では、ラギング鎖およびリーディング鎖の一方のみに機能する、校正機能が変化したＤＮＡポリメラーゼを導入することが有利であり得る。
本発明によって達成される良い育種とは、高速な生物進化を実現することであると考えられる。高速な生物進化には、通常、集団の大きな遺伝的多様性と同時に、有益な変異型の安定な増幅が必要である。安定な増幅は、正確なＤＮＡ複製によって達成され、同時に、遺伝的多様性は、ＤＮＡ複製のエラーによって生じる変異によって達成される。
本発明がもたらす効果は、真核生物においてもまた、高速な進化を達成することができた点にある。真核生物は、明確な核構造を持ち、ゲノムが複数の染色体から構成されているという点で大腸菌とは異なる。従って、本発明は、従来技術からは予測できない効果を奏するといえる。また、仮に大腸菌での進化速度の調節ができたとしても、真核生物およびグラム陽性細菌については、本明細書の実施例に実証されるまでは予測できなかったと
いえる。
特定の実施形態では、遺伝子の複製を担う因子には、少なくとも２種類のエラープローン頻度の因子が存在する。この２種類のエラープローン頻度の因子は、好ましくはＤＮＡポリメラーゼであり、これらのＤＮＡポリメラーゼは異なるエラープローン頻度を有する。特定の実施形態では、エラープローン頻度の因子は、エラープローン頻度が少ない因子が少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約２０％、さらに好ましくは少なくとも約１５％存在することが有利であり得る。この特徴により、劇的な進化を伴う変異体が生じる可能性が高まりつつ、一方で安定な複製を行うことが可能となるからである。
別の好ましい実施形態では、本発明において用いられる遺伝子の複製を担う因子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼなど）は、エラープローン頻度が不均一であることが有利である。不均一のエラープローン頻度を有することにより、進化速度が従来に増して増大し、しかも、エラー閾値の上限がなくなるという効果が奏される。
好ましい実施形態において、エラープローン頻度が少ない因子は実質的にエラーフリーであるが、それに限定されず、１ゲノムあたりに実質的にエラーが生じない程度のエラープローン頻度であれば好ましく用いられ得る。
従って、好ましい実施形態では、少なくとも２つのエラープローン頻度の相違は、通常、頻度が少なくとも１０１異なることを特徴とし、好ましくは、頻度が少なくとも１０２異なることを特徴とし、さらに好ましくは、頻度が少なくとも１０３異なることを特徴とすることが有利である。このような頻度の相違を有することによって、進化速度をより効率よく調節することができる。
１つの実施形態において、本発明の方法におけるエラープローン頻度を調節する工程は、生物のＤＮＡポリメラーゼのエラープローン頻度を調節することを包含する。対象となる生物中のＤＮＡポリメラーゼのエラープローン頻度の調節は、生物中に存在するＤＮＡポリメラーゼを直接改変するか、あるいは、エラープローン頻度が変化するように改変したＤＮＡポリメラーゼを生体外から導入することによって行われ得る。このようなＤＮＡポリメラーゼの改変は、当該分野において周知の分子生物学における技術などを用いて行い得る。そのような技術は、本明細書において他の場所において記載したとおりである。ＤＮＡポリメラーゼの直接の改変は、例えば、すでに変異が導入されているその生物の株を掛け合わせることを利用する方法などが挙げられるがそれに限定されない。
別の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、校正機能を有する。対象となる生物中には、通常校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼが存在する。そのような校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼε、ＤｎａＱ、ＤＮＡポリメラーゼβ、θ、λ（修復機能を持つもの）が挙げられるがそれらに限定されない。ＤＮＡポリメラーゼの校正機能の調節は、生物中に存在するＤＮＡポリメラーゼを直接改変するか、あるいは、校正機能が変化するように改変したＤＮＡポリメラーゼを生体外から導入することによって行われ得る。このようなＤＮＡポリメラーゼの改変は、当該分野において周知の分子生物学における技術などを用いて行い得る。そのような技術は、本明細書において他の場所において記載したとおりである。ＤＮＡポリメラーゼの直接の改変は、例えば、すでに校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼに変異が導入されているその生物の株を掛け合わせることを利用する方法などが挙げられるがそれに限定されない。好ましくは、プラスミドに改変体ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸分子を含ませ、このプラスミドを生物に導入することなどの一過的に発現させることが好ましい。プラスミドなどの一過的発現の特徴を利用することによって、プラスミドなどを消失させた後は、遺伝形質の変換速度の調節が必要とされなくなった後、野生型と同じ
変換速度に戻すことが可能であるからである。
別の実施形態において、本発明において利用されるＤＮＡポリメラーゼは、真核生物におけるＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼを含む。ここで、１つの別の好ましい実施形態において、本発明において利用されるＤＮＡポリメラーゼは、真核生物におけるＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される一方のみが改変の対象とされることが有利であり得る。一方のみのエラープローン頻度を調節することによって、一度現れた遺伝子型（野生型も含まれる）が保存される；高い変異率が許容され得る；ゲノムにおいて、広領域（遺伝子群）の改良が可能となること；形質の元本保証と多様性拡大の実現が可能となること；進化が従来にない速度へと加速され得ること；変異形質が安定であるという性質という効果が得られるからである。
別の実施形態において、本発明におけるエラープローン頻度の調節は、真核生物におけるＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼの校正活性を調節することを包含する。このような校正活性の調節は、このようなポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性中心（あるいは、ＥｘｏＩモチーフ、校正機能活性部位）（例えば、ヒトＤＮＡポリメラーゼδでは３１６番目のアスパラギン酸および３１８番目のグルタミン酸ならびにその周辺部位）の改変が挙げられるがそれらに限定されない。
本発明の好ましい実施形態において、このようなエラープローン頻度の調節は、エラープローン頻度を野生型よりも上げることを包含する。エラープローン頻度を野生型よりも上昇させることによって、生物にとって有害な効果を伴わずに、生物の遺伝形質変換速度すなわち進化速度が上昇した。このような効果は、従来予測されておらず、本発明は、優れた効果を奏するといえる。
別の好ましい実施形態において、本発明において用いられるＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、野生型のものよりも低い。そのようなＤＮＡポリメラーゼは、天然に存在するものを利用してもよいし、本明細書においてすでに述べたようにＤＮＡポリメラーゼを改変することによって達成してもよい。
１つの実施形態において、本発明において用いられる（改変型）ＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、野生型ＤＮＡポリメラーゼよりも少なくとも１塩基多い（ミスマッチが少なくとも１つ多い）変異が含まれるように校正する機能であることが有利である。野生型ＤＮＡポリメラーゼよりも少なくとも１塩基多い変異が含まれることによって、生物にとって有害な効果を伴わずに、生物の遺伝形質変換速度すなわち進化速度が上昇した。このような遺伝形質変換速度は、野生型ＤＮＡポリメラーゼがもたらすものより生じる変異の塩基数が多い方が速い傾向がある。従って、変換速度を上げる場合は、校正機能をさらに低下させることが好ましい。このような校正機能をアッセイする方法は、当該分野において公知であり、例えば、対象となるＤＮＡポリメラーゼを適切なアッセイ系（複製産物の塩基配列決定による判定；校正活性の測定による判定）において用いて得られる生成物を例えば、直接または間接的に配列決定する（例えば、配列決定機によるかあるいはＤＮＡチップを用いる）ことによって判定することができる。
別の好ましい実施形態において、本発明において用いられるＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、少なくとも１つの塩基のミスマッチ変異が含まれるように校正する機能であることが有利である。野生型のＤＮＡポリメラーゼは通常、結果として得られる生成物における塩基配列に変異は含まれていないことが多い。従って、そのような場合、本発明におい
て用いられるＤＮＡポリメラーゼの改変体は、少なくとも１つの塩基のミスマッチ変異を含ませるように校正機能が低下していることが必要であり得る。そのような校正機能もまた、上述のアッセイ系を用いて測定することができる。より好ましくは、本発明において利用されるＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、少なくとも２つのミスマッチ塩基の変異が含まれるように校正する機能であり、さらに好ましくは、少なくとも３つの、４つの、５つの、６つの、７つの、８つの、９つの、１０のミスマッチ塩基の変異が含まれるように校正する機能であり、なおさらに好ましくは、少なくとも１５の、２０の、２５の、５０の、１００のミスマッチ塩基の変異が含まれるように校正する機能であり得る。校正機能が低下し含まれる塩基配列の変異がより多くなるほど、生物の遺伝形質変換速度すなわち進化速度がより速くなると考えられる。
別の実施形態において、本発明において利用されるＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、１０−６の割合で塩基配列の変異が含まれるように校正する機能である。通常、天然に存在する生物は、１０−１２〜１０−８の割合で変異を誘発することから、本発明では、このように有意に校正機能が低下したＤＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。より好ましくは、本発明のＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、１０−３の割合で塩基配列の変異が含まれるように校正する機能であり、さらに好ましくは、本発明のＤＮＡポリメラーゼの校正機能は、１０−２の割合で塩基配列の変異が含まれるように校正する機能であることが有利であり得る。校正機能が低下し生成する塩基配列の変異頻度が多くなるほど、生物の遺伝形質変換速度すなわち進化速度がより速くなると考えられる。
ある実施形態において、本発明が対象とする生物は、真核生物であり得る。真核生物は、大腸菌とは異なり、校正機能が付与されるメカニズムが全く異なる。従って、進化速度を論じる場合にも大腸菌をモデルにした場合とは全く異なる説明が必要であり、本発明では、予想外にも、真核生物を含むすべての生物において、生物の遺伝形質の変換速度すなわち進化速度を調節することが可能であるということが実証された。従って、本発明は、従来技術からは予測不可能であった効果を奏するといえる。特に、真核生物において進化速度調節が可能となったことによって、進化の機構解明；ゲノムと形質との関係の解明；動物および植物を含む種々の高等生物の改良；現存生物の進化能力の検索；未来生物の予測；モデル疾患動物の作製などの種々の適用が達成された。本発明が対象とする真核生物は、特に限定されないが、例えば、酵母のような単細胞生物、動物および植物のような多細胞生物が挙げられるがそれらに限定されない。そのような生物の例としては、例えば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、哺乳綱（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）、鳥綱、爬虫綱、両生綱、魚綱、昆虫綱、蠕虫綱、双子葉植物、単子葉植物（例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ソルガムなどのイネ科植物）、シダ植物、コケ類、真菌類、藍藻類などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、本発明が対象とする生物は、多細胞生物であり得る。別の好ましい実施形態では、本発明が対象とする生物は、単細胞生物であり得る。他の好ましい実施形態では、本発明が対象とする生物は、動物、植物、真菌または酵母であり得る。１つのより好ましい実施形態では、本発明が対象とする生物は、哺乳動物であり得るがそれらに限定されない。
別の実施形態において、本発明において使用される生物または細胞は、天然において少なくとも２種類のポリメラーゼを有する生物または細胞である。少なくとも２種類のポリメラーゼが存在することにより、不均一なエラープローン頻度の環境を提供しやすいからである。より好ましくは、生物または細胞は、天然において少なくとも２種類のポリメラーゼを有し、そのエラープローン頻度が互いに異なる生物または細胞であることが有利である。そのような生物または細胞は、改変生物または改変細胞を提供するために使用することができるからである。
１つの好ましい実施形態において、本発明の方法によって得られた改変生物または改変細胞は、所望の形質の変換後も、野生型と実質的に同じ成長を示す。このような性質は、本発明がもたらす、有害効果を伴わない遺伝形質の変換速度の調節によって初めて得られるものである。このような性質は、従来の変異誘発方法では達成不可能な特徴であり、このような性質もまた、本発明がもたらす有利な効果といえる。このように野生型と実質的に同じ成長を示すという特徴を有することによって、野生型と同じように扱うことができる。
別の実施形態において、本発明の方法によって改変された生物または細胞は、その生物または細胞が改変前において（すなわち野生型において）耐性を有していなかった環境に対する耐性を示すこともまた１つの特徴であり得る。そのような環境としては、例えば、温度、湿度、ｐＨ、塩濃度、栄養、金属、ガス、有機溶媒、圧力、気圧、粘性、流速、光度、光波長、電磁波、放射線、重力、張力、音波、対象となる生物または細胞とは異なる他の生物または細胞（例えば、寄生虫）、化学薬品、抗生物質、天然物、精神的ストレスおよび物理的ストレスからなる群より選択される少なくとも１つの因子またはそれらの任意の組み合わせをパラメータとして包含する。したがって、このようなパラメータは、任意の組み合わせを用いることができ、その組み合わせの数は、２つ以上の因子を任意に選択することができる。
ここで、温度としては、例えば、高温、低温、超高温（例えば、９５℃など）、超低温（例えば、−８０℃など）、１５０〜−２７０℃のような広汎な温度が挙げられるがそれらに限定されない。
湿度としては、例えば、相対湿度１００％、相対湿度０％など０〜１００％の間の任意の点が挙げられるがそれらに限定されない。
ｐＨとしては、例えば、０〜１４の任意の点が挙げられるがそれらに限定されない。
塩濃度としては、例えば、ＮａＣｌ濃度（３％など）、他の塩の塩濃度０〜１００％のうちの任意の点が挙げられるがそれらに限定されない。
栄養としては、例えば、タンパク質、グルコース、脂質、ビタミン、無機塩等が挙げられるがそれらに限定されない。
金属としては、例えば、重金属（例えば、水銀、カドミウムなど）、鉛、金、ウラン、銀が挙げられるがそれらに限定されない。
ガスとしては、例えば、酸素、窒素、二酸化炭素、一酸化炭素、一酸化窒素、およびそれらの混合物などが挙げられるがそれらに限定されない。
有機溶媒としては、例えば、エタノール、メタノール、キシレン、プロパノールなどが挙げられるがそれらに限定されない。
圧力としては、例えば、０〜１０トン/ｃｍ２の任意の点などが挙げられるがそれらに
限定されない。
気圧としては、例えば、０〜１００気圧の任意の点などが挙げられるがそれらに限定されない。
粘性としては、例えば、水、グリセロールなど任意の流体またはそれらの混合物中の粘性が挙げられるがそれらに限定されない。
流速としては、例えば、０〜光速の任意の点などが挙げられるがそれらに限定されない。
光度としては、例えば、暗黒〜太陽光の間の一点などが挙げられるがそれらに限定されない。
光波長としては、例えば、可視光線、紫外線（ＵＶ−Ａ、ＵＶ−Ｂ、ＵＶ−Ｃなど）、赤外線（遠赤外線、近赤外線など）などの任意の波長が挙げられるがそれらに限定されない。
電磁波としては、任意の波長のものが挙げられる。
放射線としては、任意の強度のものが挙げられる。
重力としては、地球上の任意の重力または無重力〜地球上の重力の間の１点、あるいは地球上の重力以上の任意の一点が挙げられるがそれらに限定されない。
張力としては、任意の強度のものが挙げられる。
音波としては、任意の強度および波長のものが挙げられる
対象となる生物とは異なる他の生物としては、例えば、寄生虫、病原菌、昆虫、線虫が挙げられるがそれらに限定されない。
化学薬品としては、例えば、塩酸、硫酸、苛性ソーダが挙げられるがそれらに限定されない。
抗生物質としては、例えば、ペニシリン、カナマイシン、ストレプトマイシン、キノリン等が挙げられるがそれらに限定されない。
天然物としては、例えば、ふぐ毒、蛇毒、アルカロイド等が挙げられるがそれらに限定されない。
精神的ストレスとしては、例えば、飢餓、密度、閉所、高所が挙げられるがそれらに限定されない。
物理的ストレスとしては、例えば、振動、騒音、電気、衝撃が挙げられるがそれらに限定されない。
別の実施形態では、本発明の方法が対象とする生物または細胞は、がん細胞を有する。本発明の方法によって達成されるがんモデル生物または細胞は、従来の方法とは異なり、天然に生じるがんと同じメカニズムで生じることから、真の意味でのがんモデル生物または細胞であると見なすことができる。従って、このようなモデル生物または細胞は、医薬品の開発に特に有用である。
別の局面において、本発明は、遺伝形質が調節された生物または細胞を生産する方法を提供する。この方法は、（ａ）生物または細胞の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節または変化させる工程；および（ｂ）得られた生物または細胞を再生産する工程
、を包含する。ここで、遺伝形質の変換速度の調節に関連する技術は、上述のものを利用することができる。従って、生物または細胞の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を変化させる工程は、本明細書において上述の技術を利用することができる。ここでエラープローン頻度を調節する工程、使用される生物または細胞は、上述の生物または細胞の遺伝形質の変換速度を調節する方法において述べたものがそのまま適用され得る。
得られた生物または細胞を再生産する工程もまた、いったん遺伝形質が調節された生物または細胞が得られたならば、当該分野において公知のどのような方法を用いて行ってもよい。そのような再生産の技術としては、例えば、生殖、繁殖など天然現象によるもの、クローン技術などの人工技術、植物培養細胞からの個体再生産などによるものが包含されるがそれらに限定されない。そのような技術を使用したかどうかは、例えば、塩基配列決定による確認、抗原性等の同定、ベクターを用いる場合のベクター検出、形質の後戻り実験、高変異と非障害性との両立をみることによって確認することができる。このような実験は、当該分野において公知であり、本明細書の記載に基づいて当業者は容易に実施することができる。
好ましい実施形態では、本発明の生物または細胞の再生産方法では、再生産した生物または細胞のうち、所望の形質を有する個体を選択する工程をさらに包含する。このような所望の形質を有する個体の選択は、生物または細胞の遺伝形質（例えば、上記種々の環境に対する耐性など）で行ってもよいし、遺伝子レベルで行ってもよいし、代謝物レベルで行ってもよい。そのような選択の確認には、種々の技術を用いることができ、例えば、肉眼による観察、配列決定、種々の生化学試験、顕微鏡観察、染色、免疫反応、行動解析などが挙げられるがそれらに限定されない。このような実験は、当該分野において公知であり、本明細書の記載に基づいて当業者は容易に実施することができる。
別の局面において、本発明は、本発明によって生産された、遺伝形質が調節された生物または細胞を提供する。このような生物または細胞は、従来の技術では達成され得なかった進化速度によって得られる生物または細胞であることから、その生物または細胞の存在自体が新規であることは明らかである。そのような生物または細胞の特徴としては、例えば、高変異と非障害性との両立；ＳＮＰｓ（一塩基置換）の分布に偏りがある；同じゲノム領域でも、個体によって変異の蓄積の仕方が異なる傾向を示す（特に選択圧のかからない領域において著しい；同一個体のゲノムの特定領域（特に冗長な部分）の変異の分布はランダムではなく、著しい偏りを示す、などの特異的な特徴が挙げられるがそれらに限定されない。本発明の生物または細胞は、好ましくは、野生型と実質的に同じ成長を示す。急激な変異誘発を受けた生物または細胞は、通常野生型と同じ成長を示すことはあり得ない。しかし、本発明で得られる生物または細胞は、野生型と実質的に同じ成長を示すことが可能である。従って、本発明は、そのような意味でも優れた効果を奏する。このような性質を確認する実験は、当該分野において公知であり、本明細書の記載に基づいて当業者は容易に実施することができる。
別の局面において、本発明は、遺伝形質が調節された遺伝子をコードする核酸分子を生産する方法を提供する。この方法は、（ａ）生物または細胞の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を変化させる工程；（ｂ）得られた該生物または細胞を再生産する工程；（ｃ）該生物または細胞において変異を同定する工程；および（ｄ）同定された変異を含む遺伝子をコードする核酸分子を生産する工程、を包含する。ここで、エラープローン頻度の変化および得られた生物または細胞の再生産に関する技術は、本明細書において上述したとおりであり、当業者は適宜本明細書の記載に従って、その実施形態を選択し本発明実施することができる。
生物または細胞における変異の同定もまた、当該分野において周知の技術を用いて行う
ことができる。そのような同定技術としては、例えば、配列決定、ＰＣＲ、サザンブロッティングなどの分子生物学的技術、ウェスタンブロッティングのような免疫化学的技術、顕微鏡観察、肉眼観察など、種々の方法があるがそれらに限定されない。
同定された変異を含む遺伝子をコードする核酸分子の生産もまた、いったん変異を担う遺伝子が同定されたならば、当業者は当該分野において周知の技術を用いて行うことができる。そのような生産としては、例えば、ヌクレオチド合成機による合成、ＰＣＲなどによる半合成法などが挙げられるがそれらに限定されない。そのように合成した核酸分子が目的の配列を有するかどうかは、当該分野において周知の技術を用いて、配列決定することによってあるいはＤＮＡチップなどの技術を用いて確認することができる。
従って、本発明はまた、本発明の方法によって生産された、核酸分子を提供する。このような核酸分子もまた、従来の技術では達成され得なかった進化速度によって得られる生物または細胞に由来する遺伝子であることから、その遺伝子をコードする核酸分子の存在自体が新規であることは明らかである。そのような核酸分子の特徴としては、例えば、ＳＮＰｓの分布に偏りがある；ゲノムに変異が多く蓄積している領域とそうでない領域がモザイク状に分布する傾向を示す；同じゲノム領域でも、個体によって変異の蓄積の仕方が異なる傾向を示す（特に選択圧のかからない領域において著しい）；同一個体のゲノムの特定領域（特に冗長な部分）の変異の分布はランダムではなく、著しい偏りを示すなどの特異的な特徴が挙げられるがそれらに限定されない。このような性質を確認する実験は、当該分野において公知であり、本明細書の記載に基づいて当業者は容易に実施することができる。
別の局面において、本発明は、遺伝形質が調節された遺伝子がコードするポリペプチドを生産する方法を提供する。この方法は、（ａ）生物または細胞の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を変化させる工程；（ｂ）得られた該生物または細胞を再生産する工程；（ｃ）該生物または細胞において変異を同定する工程；および（ｄ）同定された変異を含む遺伝子がコードするポリペプチドを生産する工程、を包含する。ここで、エラープローン頻度の変化および得られた生物または細胞の再生産に関する技術は、本明細書において上述したとおりであり、当業者は適宜本明細書の記載に従って、その実施形態を選択し本発明実施することができる。
生物または細胞における変異の同定もまた、当該分野において周知の技術を用いて行うことができる。そのような同定技術としては、例えば、配列決定、ＰＣＲ、サザンブロッティングなどの分子生物学的技術、ウェスタンブロッティングのような免疫化学的技術、顕微鏡観察、肉眼観察など、種々の方法があるがそれらに限定されない。
同定された変異を含む遺伝子がコードするポリペプチドの生産もまた、いったん変異を担う遺伝子が同定されたならば、当業者は当該分野において周知の技術を用いて行うことができる。そのような生産としては、例えば、ペプチド合成機による合成、遺伝子操作技術を用いて上記遺伝子をコードする核酸分子を合成し、その核酸分子で細胞を形質転換しその遺伝子を発現させ、発現産物を回収すること、あるいは改変された生物または細胞自体から精製することによって得る方法などが挙げられるがそれらに限定されない。そのように得られたポリペプチドが目的の配列を有するかどうかは、当該分野において周知の技術を用いて、配列決定することによってあるいはプロテインチップなどの技術を用いて確認することができる。
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって生産された、ポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドもまた、従来の技術では達成され得なかった進化速度によって得られる生物または細胞に由来する遺伝子がコードするものであることから、その遺
伝子がコードするポリペプチドの存在自体が新規であることは明らかである。そのようなポリペプチドの特徴としては、例えば、ＳＮＰｓの分布に偏りがある；ゲノムに変異が多く蓄積している領域とそうでない領域がモザイク状に分布する傾向を示す；同じゲノム領域でも、個体によって変異の蓄積の仕方が異なる傾向を示す（特に選択圧のかからない領域において著しい；同一個体の精子のゲノムの特定領域（特に冗長な部分）の変異の分布はランダムではなく、著しい偏りを示すなどという遺伝形質を反映したアミノ酸配列となっているポリペプチドとしての顕著な特徴が挙げられるがそれらに限定されない。このような性質を確認する実験は、当該分野において公知であり、本明細書の記載に基づいて当業者は容易に実施することができる。
別の局面において、本発明は、遺伝形質が調節された生物または細胞の代謝物を生産する方法を提供する。この方法は、（ａ）生物または細胞の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を変化させる工程；（ｂ）得られた該生物または細胞を再生産する工程；（ｃ）該生物または細胞において変異を同定する工程；および（ｄ）同定された変異を含む代謝物を生産する工程、を包含する。ここで、エラープローン頻度の変化および得られた生物または細胞の再生産に関する技術は、本明細書において上述したとおりであり、当業者は適宜本明細書の記載に従って、その実施形態を選択し本発明実施することができる。
ここで、本明細書において「代謝物」とは、細胞において細胞の生存活動（代謝）によって得られる分子をいう。そのような代謝物としては、例えば、アミノ酸、脂肪酸およびその誘導体、ステロイド、単糖、プリン、ピリミジン、ヌクレオチド、核酸、タンパク質などの化合物が挙げられるがそれらに限定されない。また、これらの高分子化合物を加水分解により分解して得られる物質、炭水化物または脂肪酸を酸化して得られる物質なども代謝物という。代謝物は、細胞内に存在することもあり、細胞外に排出されることもある。
本発明の方法において、生物または細胞における変異の同定もまた、当該分野において周知の技術を用いて行うことができる。そのような同定技術としては、例えば、代謝物の同定（成分分析など）、配列決定、ＰＣＲ、サザンブロッティングなどの分子生物学的技術、ウェスタンブロッティングのような免疫化学的技術、顕微鏡観察、肉眼観察など、種々の方法があるがそれらに限定されない。代謝物の同定技術は、代謝物に応じて当業者が適宜選択することができる。
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって生産された代謝物を提供する。このような代謝物もまた、従来の技術では達成され得なかった進化速度によって得られる生物または細胞に由来するものであることから、その代謝物の存在自体が新規であることは明らかである。そのような代謝物の特徴としては、例えば、自己に対して毒性を及ぼしにくい；未来の代謝物を先取りしているなどの特徴が挙げられるがそれらに限定されない。このような性質を確認する実験は、当該分野において公知であり、本明細書の記載に基づいて当業者は容易に実施することができる。
別の局面において、本発明は、生物または細胞の遺伝形質を調節するための核酸分子を提供する。この該核酸分子は、エラープローン頻度を調節されたＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を含む。このようなＤＮＡポリメラーゼは、真核生物におけるＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼにおいて、校正活性が調節されたＤＮＡポリメラーゼであってもよい。このような校正活性の調節は、このようなポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性中心（あるいは、ＥｘｏＩモチーフ、校正機能活性部位）（例えば、ヒトＤＮＡポリメラーゼδでは３１６番目のアスパラギン酸および３１８番目のグルタミン酸ならびにその周辺部位）の改変が挙げられるがそれらに限定さ
れない。
好ましくは、本発明の核酸分子に含まれるＤＮＡポリメラーゼをコードする配列は、ＤＮＡポリメラーゼδまたはεをコードすることが有利である。このようなＤＮＡポリメラーゼは、校正機能を天然に有しているからであり、そのような機能を改変することが比較的容易であるからである。
別の局面において、本発明は、本発明の生物または細胞の遺伝形質を調節するための核酸分子を含む、ベクターを提供する。このようなベクターは、プラスミドベクターであってもよい。このようなベクターは、好ましくは、プロモーター配列、エンハンサー配列などを適宜含み得る。このようなベクターは、生物または細胞の遺伝形質を調節するためのキットの構成要件として含まれ、販売されてもよい。
他の局面において、本発明は、生物または細胞の遺伝形質を調節するための核酸分子を含む、細胞を提供する。このような細胞には、本発明の核酸分子は、ベクターの形態で含まれてもよいが、必ずしもそうでなくてもよい。このような細胞は、生物または細胞の遺伝形質を調節するためのキットの構成要件として含まれ、販売されてもよい。好ましい実施形態では、この細胞は、真核生物細胞であることが有利であり得るが、それに限定されない。単に核酸分子を増幅するための目的に使用される場合は、原核生物細胞が使用されること好ましいことがあり得る。
別の局面において、本発明は、生物または細胞の遺伝形質を調節するための核酸分子を含む、生物または細胞を提供する。このような生物は、生物または細胞の遺伝形質を調節するためのキットの構成要件として含まれていてもよい。
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって得られる生物またはその一部（例えば、臓器、組織、細胞など）が生産する、生産物質を提供する。本発明によって得られる生物またはその一部は、従来方法では得られなかった生物を提供することから、その生産物質は、新規物質を含み得る。
別の局面において、本発明は、本発明の生物または細胞を病態モデルとして使用して薬剤の効果を試験する工程、コントロールとして野生型の生物または細胞を使用して薬剤の効果を試験する工程、および病態モデルとコントロールとの対比を行う工程を包含する、薬剤の試験方法を提供する。このような病態モデルは、従来の方法では達成できなかった自然病態発生モデルであることから、それを用いた薬剤の試験方法では、従来方法で生えられなかった天然での試験に近い結果が得られ、その信頼性が高くなることになる。従って、医薬などの開発期間が有意に短縮できるという効果を奏する。あるいは、得られた結果における副作用などの有害情報の精度が高まるという効果も得られ得る。
別の局面において、本発明は、生物または細胞の遺伝形質の変換速度を調節するために使用される、少なくとも２つのポリメラーゼのセットであって、このポリメラーゼのエラープローン頻度は互いに異なる、セットに関する。このようなセットのポリメラーゼがこのような方法に使用されたことは従来なく、その用途はまさしく新しいものであるといえる。ここで、使用されるポリメラーゼは導入が予定される生物または細胞において機能するものである限り、どのようなものであってもよい。従って、２つ以上の種に由来するものであってもよいが、好ましくは同一動物種由来であることが好ましい。上述の用途に使用されるポリメラーゼは、例えば、遺伝子導入によって生物または細胞に導入され得る。
別の局面において、本発明は、遺伝形質が調節された生物または細胞を生産するために使用される、少なくとも２つのポリメラーゼのセットであって、このポリメラーゼのエラ
ープローン頻度は互いに異なる、セットを提供する。このようなセットのポリメラーゼがこのような方法に使用されたことは従来なく、その用途はまさしく新しいものであるといえる。ここで、使用されるポリメラーゼは導入が予定される生物または細胞において機能するものである限り、どのようなものであってもよい。従って、２つ以上の種に由来するものであってもよいが、好ましくは同一動物種由来であることが好ましい。上述の用途に使用されるポリメラーゼは、例えば、遺伝子導入によって生物または細胞に導入され得る。
別の局面において、本発明は、生物または細胞の遺伝形質の変換速度を調節するための、少なくとも２つのポリメラーゼのセットの使用であって、このポリメラーゼのエラープローン頻度は互いに異なる、使用に関する。このような使用の際の、ポリメラーゼの説明は、本明細書において上述したとおりであり、かつ、以下のような実施例に記載されるように使用し、製造することができる。
別の局面において、本発明は、遺伝形質が調節された生物または細胞を生産するための、少なくとも２つのポリメラーゼのセットの使用であって、このポリメラーゼのエラープローン頻度は互いに異なる、使用に関する。このような使用の際の、ポリメラーゼの説明は、本明細書において上述したとおりであり、かつ、以下のような実施例に記載されるように使用し、製造することができる。
（ディスパリティー準種ハイブリッドモデル）
Ａ．不均一複製精度を有する準種の変異体分布
本発明の別の局面において、ゲノムの集団からなる準種であって、各々が二進数の塩基配列長ｎ（すなわち、２ｎの可能な遺伝型または配列空間）が存在すると仮定する。ここで、最高の適合性を有する配列を本明細書において「マスター配列」と呼ぶ。集団サイズは、非常に大きくかつ安定しているものを選択する。１つのテンプレート配列の複製によって、１つの直接コピー配列が生成され、そして複製誤差が１工程によって変異体に固定される。塩基の置換が生じ、配列長は一定である。配列分解は無視することができる。計算の容易のため、本発明者らは、マスター配列（Ｉ０）のすべてのｉ誤差変異体の合計を変異体クラスＩｉ（ｉ＝０，１，．．．ｎ）へと分類する。相対濃度の対応する合計をｘｉとする。すると、ｘｉにおける変化率は、
Figure 2007143562
とあらわされ、ここで、Ａｉは、変異体クラスＩｉの複製率定数（または適合性）であり、ｆは総濃度定数を維持し、そしてΣｉＡｊｘｉである。Ｑｉｉは、Ｉｉの完全にエラーフリーの複製による複製の精度またはＩｉの生成確率を表し、ＱｉｊはＩｊの誤複製によるＩｉの生成確率である。
ゲノム配列はポリメラーゼで複製される。Ｅｋとは、本明細書において異なる精度を有するｐ種類のポリメラーゼ（ｋ＝１、２．．．ｐ）があると仮定する。Ｅｋの相対濃度は、ｃｋによって示される。ポリメラーゼＥｋの単一塩基レベルの精度は、０≦ｑｋ≦１であらわされ、塩基あたりの誤差率は１−ｑｋである。同じポリメラーゼによって１つの配列は一貫して複製されることから、Ｅｋのゲノムあたりの誤差率は、ｎ（１−ｑｋ）となる。次いで、準種のゲノムあたりの平均誤差率は、ｎΣｋｃｋ（１−ｑｋ）＝ｍであらわされる。均一な複製精度を有するものを形質転換する場合（例えば、Ｍ．Ｅｉｇｅｎ、１
９７１前出）、以下のように計算することができる。
Figure 2007143562
ここで、
Figure 2007143562
である。
変異体の定常分布であるｌｉｍｔ→∞ｘｉ＝ｙｉは、準種である。これは、行列の固有ベクトルであるＷ＝{ＡｊＱｉｊ}で示される。図５は、均一複製精度および不均一複製精度を有する準種の例を示す。ここでは、単純な単一ピーク適合性空間を用いた。複製速度定数Ａ０は、マスター配列に割り当てられ、すべての他の変異他クラスは同じ適合性を有するとする。
均一な複製精度を有するパリティー準種は、エラー閾値以下はマスター配列の付近に局在化する（図５（ａ））。誤差の閾値がｍ＝２，３付近になると、移行は非常にシャープになり、マスター配列の濃度は１０桁ほど減少する（ｃ＝０、図６）。このような現象はエラーカタストロフィーと呼ぶ。エラー閾値より高いところでは、準種の局在化は均一の分布に置き換えられる。ここではここの濃度は非常に小さい（例えば、ｙｉ＝８．８８×１０−１６）。現実の有限集団では、誤差の蓄積によりマスター配列の遺伝情報を維持することは淘汰を重ねるにつれ難しくなる。エラー閾値より低いもののみが準種の進化を可能にし、進化速度はエラー閾値の付近で最大に達するようである。
本発明のディスパリティーモデルでは、（図５ｂ〜ｄ）、２つの種類のポリメラーゼが存在すると仮定する。ここでは、２つの異なる精度を有すると仮定する。ポリメラーゼＥｉはエラーフリーであり、ｑ１＝１であり、Ｅ２は、エラープローンであり、０≦ｑ２≦１である。ここで各々は、ｃおよび１−ｃの相対濃度で存在する。この場合、完全なエラーフリーポリメラーゼという仮定は非現実的であるように見えるが、ＤＮＡベースの微生物におけるプルーフリーディング誤差率は、非常に低く、１ゲノムあたり０．００３誤差／複製であるとされ、この場合無視することができる。
エラーフリーポリメラーゼの相対濃度が低い場合、０＜ｃ＜１であり、エラーの閾値は、ｃが増え、エラーカタストロフィーが減少するにつれより高い平均誤差率へとシフトする（図５ｂおよび図６）。ｃ＝０．１では、エラー閾値は消えた（図５ｃ）。マスター配列の相対濃度は、徐々に減少し、最後には、パリティー均一分布よりも１０７倍高い濃度で消滅した（図６ではｃ＝０．１）。ｃ＞０．１の場合、平均誤差率にかかわらず、マスター配列は、充分な濃度で存在する（図５ｄおよび６）。図６では、ｃｃｒｉｔ＝０．１
付近の準種動力学の劇的な変化を示す。ディスパリティ準種モデルでは、マスター配列から遠くはなれた変異体が準種局在の喪失なしに存在することができる。したがって、このことは、進化速度がエラーカタストロフィーなしに増大することができることを意味する。
Ｂ．複数の複製因子での準種についてのエラー閾値
ディスパリティーモデルについての誤差閾値を考慮して、本発明者らは、２つの困難性を見出した。（ｉ）天然におけるゲノムサイズは大きすぎる、ウイルスでさえ１０３以上であり、細菌でｎ＞１０６であり、これらの計算は大変である。（ｉｉ）天然のゲノム複製は、２つ以上の単位（複製因子）へと分かれており、複数のポリメラーゼが同時に関与する。複数の複製因子がエラー閾値に関与するようである。本発明者らは、ここで、マスター配列の相対平衡濃度の近似を用いてエラー閾値を算出した。
Figure 2007143562
ここで、Ａ０は、マスター配列の複製率定数であり、Ａｉ≠０は他の変異体配列の全体の平均である。Ｑ００は、マスター配列の完全なエラーフリー複製の複製精度である。この近似は、数１においてマスター配列に対して変異体が逆変異することを無視した結果である。正確な解への適合は、ゲノムサイズが大きくなるにつれ増大する。マスター配列の相対平衡濃度は、臨界誤差率が以下を満たした場合に消失する：
Figure 2007143562
ここで、ｓは、マスター配列の淘汰優越性である。複数の複製因子を用いてディスパリティー０モデルに関するＱ００を得るために、本発明者らは、Ｅ１およびＥ２という２つの種類のポリメラーゼがあると仮定し、これらはそれぞれｃおよび１−ｃの相対濃度で存在すると仮定した。プルーフリーディングポリメラーゼは、非常に少なく無視し得た。したがって、ポリメラーゼＥ１は、エラーフリーであり、ｑ１＝１である。Ｅ２は、エラープローンであり、０≦ｑ２≦１であり、ゲノムあたりの平均誤差率は以下のとおりである：
Figure 2007143562
エラープローンポリメラーゼＥ２によってゲノムを複製する確率は、二項分布によって得られる。エラープローンポリメラーゼＥ２による非エラー確率は、ポアソン近似によって得られる。ここでは、ゲノムサイズは、複製因子の数に比べて非常に大きいと仮定されている。これらを乗すると、
Figure 2007143562
が得られ、ここで、ａは、ゲノムにおけるすべての複製因子の数である。数５および数７の方程式を組み合わせると、ディスパリティーモデルに関するエラー閾値が得られる：
Figure 2007143562
図７は、種々の数の複製因子でのエラーフリーポリメラーゼの相対濃度の函数としてエラー閾値を示す。パリティーモデルでのエラー閾値はｃ＝０であり、複製因子の数には影響を受けない。ディスパリティーモデルにおいてｃ＞０では、エラーフリーポリメラーゼの臨界濃度で生じる特異点は
Figure 2007143562
であり、これは、エラー閾値の非常にシャープな増加をもたらす。このことは、ｃ≧ｃｃｒｉｔでは、エラー閾値が消えることを示す。ｃｃｒｉｔは、複製因子の数が増大するにつれ増大する。
許容可能な誤差率は、方程式数６および数８から得られる。
Figure 2007143562
ｃ≧ｃｃｒｉｔである場合、２つの拘束がある。（ｉ）ゲノムサイズｎは有限である。（ｉｉ）エラープローンポリメラーゼは非ゼロの精度ｑｍｉｎを現実の生物では有する。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの完全なプルーフリーディングフリーのＤＮＡポリメラーゼの誤差率は、１−ｑｍｉｎ＝１０−５であるとされる。図８では、Ｅ．ｃｏｌｉのパラメータに基づいて許容可能な誤差率の例を示す。このプロットは、形状がλ遷移に似る。ｓ＝１０では、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｐｍｓは、１ゲノムあたり３１エラー／複製となる。この誤差率は、パリティーモデルのエラー閾値（ｌｎ（ｓ）＝２．３）と比べても充分かつ有意に高い。
本発明者らは、エラーフリーのポリメラーゼおよびエラープローンのポリメラーゼが存在するディスパリティー準種ハイブリッドモデルを提供した。この結果、準種の動力学は、誤差率でのみ決定されるのではなく、ポリメラーゼの異なる精度のものの比率によっても、および／またはゲノムを変える複製因子の数によっても決定され得ることが判明した。１つの顕著な知見としては、エラーフリーおよびエラープローンのポリメラーゼの共存が伝統的なパリティーモデルに比較して準種に関するエラー閾値が劇的に上昇したということがある。このことは従来技術ではわからなかった本発明の効果であるといえる。
多くの生物は、天然では、連続的に変化する環境で生きている。これは、微生物病原体およびがん細胞で特に当てはまる。これらの細胞は、宿主の免疫系にさらされるからである。有利な変異体を見出す確率は、マスター遺伝子からのＨａｍｍｉｎｇ距離が増大するにつれ増加する。なぜなら、変異体の数が多くなり、距離が増大するにつれ可能な候補が増えるからである。
誤差率における単なる均一な増大は、一過性とはいえ悪性の変異体がかなり増えるという欠点を有する。パリティー準種のエラー閾値が非常に小さいことから、変異体の分布範囲はマスター遺伝子から短い距離の範囲内に限られている。パリティー準種は、局所的な低いピークにとらわれており、マスター配列からはるかに離れた飛びぬけたピークへと達することがない。他方、ディスパリティー準種では、遺伝情報を失うことなく、エラー閾値を増大させることができ、マスター配列から距離が増えると、有利な変異体を生成する数が増える。このディスパリティー準種は、配列空間にわたって、長い配列を検索することができ、最終的により高いピークを見出すことができる。
エラープローンポリメラーゼの処理能力は、プルーフリーディング能を有する主要な複製ポリメラーゼよりも低いようである。複数の複製因子を伴うディスパリティーモデルは、この観察を計算に入れている。このモデルでは、エラーは、エラープローンポリメラーゼが関与する複数の複製因子にのみ集中する。エラープローン複製は、特定の遺伝子領域に限定され、この領域の誤差率は、他の遺伝子が最小に抑えられている間も非常に増大する。
したがって、本発明で提供するように、少なくとも２種類のエラープローン頻度を達成するＤＮＡの複製因子（例えば、ポリメラーゼ）を生体内に有することによって、その生体は、従来に増して顕著に増大した進化速度を呈することができ、かつ、正常な個体を維持することができることが判明した。このような効果は、従来達成されていなかったものである。
本明細書において引用された、特許、特許出願、科学文献などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬、支持体などは、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）、和光純薬（大阪、日本）などから市販されるものを用いた。以下において使用した動物は、日本の大学において規定される飼育規準を
遵守して飼育および実験した。
（実施例１：酵母を用いた、薬剤耐性株および高温耐性株の作製）
本実施例では、真核生物の代表例として、酵母を用い本発明による不均衡変異酵母の遺伝形質の変換速度の調節を実証した。
不均衡変異の育種分野への有用性を確認するために薬剤耐性能、高温耐性能を持つ酵母の育種を行った。
校正機能の調節は、ＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεの校正機能（Ａｌａｎ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＆，Ａｋｉｏ Ｓｕｇｉｎｏ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）２４２：２８９−２９６）に変異を導入することによって行った。
（材料）
本実施例では、対象生物として酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いた。正常株として、ＡＭＹ５２−３Ｄ：ＭＡＴα，ｕｒａ３−５２ ｌｅｕ２−１ ａｄｅ２−１ ｈｉｓ１−７ ｈｏｍ３−１０ ｔｒｐ１−２８９ ｃａｎＲ（大阪大学杉野教授より入手）を用いた。その作製方法は以下のとおりである。
酵母の正常株として、菌株保存センター（ＡＴＣＣ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）からＭＹＡ−８６８（ＣＧ３７８）を入手した。
エラープローン頻度の調節は、ＤＮＡポリメラーゼδまたはεの校正機能の変更によって行った。校正機能の変更は、不均衡変異株（ＤＮＡポリメラーゼδまたはεの校正部分に欠失を持つ菌株）を作製することによって行った。変異株は、この正常株において、ＤＮＡポリメラーゼｐｏｌδ、ｐｏｌεの特定部位（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ．Ａ，＆ Ｓｕｇｉｎｏ．Ａ， Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４） ２４２：２８９−２９６）を定法（ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）、前出）に従って、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いて塩基の置換を行い作製した。具体的にはｐｏｌδでは、３２２（Ｄ）→（Ａ），３２４（Ｅ）→（Ａ）、ｐｏｌεでは、２９１（Ｄ）→（Ａ），２９３（Ｅ）→（Ａ）へと変換した。これをＤＮＡポリメラーゼδ変異株（ＡＭＹ１２８−１：Ｐｏｌ３−０１ ＭＡＴα，ｕｒａ３−５２ ｌｅｕ２−１ ｌｙｓ１−１ ａｄｅ２−１ ｈｉｓ１−７ ｈｏｍ３−１０ ｔｒｐ１−２８９ ｃａｎＲ；大阪大学杉野教授より入手、ＤＮＡポリメラーゼε変異株（ＡＭＹ２−６：ｐｏｌ２−４ ＭＡＴα，ｕｒａ３−５２ ｌｅｕ２−１ ｌｙｓ１−１ ａｄｅ２−６ ｈｉｓ１−７ ｈｏｍ３−１０ ｔｒｙ１−２８９ ｃａｎＲ；大阪大学杉野教授より入手）として用いたが、このような株の等価物は、部位特異的変異誘発を用いて、ｐｏｌδでは、３２２（Ｄ）→（Ａ），３２４（Ｅ）→（Ａ）、ｐｏｌεでは、２９１（Ｄ）→（Ａ），２９３（Ｅ）→（Ａ）という変異を導入することによって、当業者が製造することができることが理解される。
（方法−薬剤耐性株の作製）
上記３株を完全培地（ＹＰＤ培地：１０ｇ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ），２０ｇ ＢａｃｔｏＰｅｐｔｏｎ（Ｄｉｆｃｏ），２０ｇ Ｇｌｕｃｏｓｅ（和光））を含む寒天平板培地に撒き、単一コロニーをランダムに各５個ずつ集めた。これらをＹＰＤ液体培地３ｍｌに植え、３０℃で振蕩培養し終濃度約１×１０６まで増やした。
これらを、１ミリグラム／リットルのシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉ
ｓ、ＭＯ，ＵＳＡ）を含むＹＰＤ平板培地に希釈して植菌した。対照として薬剤を含まないＹＰＤ平板培地に植菌した。２日間３０℃で培養し、生じたコロニー数を計数した。
（方法−高温耐性株の取得）
上記３株の単一コロニーから液体培養にて順次培養温度を上げていき馴養した。馴養は次の通りに行った。
３７℃２日 → ２８℃１日 → ３８℃２日 → ２８℃１日 → ３９℃２日 →
２８℃１日 → ４０℃２日 → ２８℃１日 最後の培養を冷蔵保存（「馴養済み培養」）。
この後、馴養を次の通りに継続して行った。
３７℃２日 → ２８℃１日 → ３８℃２日 → ２８℃１日 → ３９℃２日 →
２８℃１日 → ４０℃２日 → ２８℃１日 → ４１℃２日 → ２８℃１日 最後の培養を冷蔵保存（「馴養済み培養II」）。
（成長曲線の測定）
完全液体培地（ＹＰＤ）中にて振蕩培養した。成長すなわち細胞密度の測定は５３０ｎｍの吸光度（ＯＤ）を指標にして行った。吸光度は分光光度計（日立）を用いて測定した。正常株および薬剤変異株の成長曲線のための実験は２８℃、高温耐性株の成長曲線は３８．５℃にて行った。
（結果−薬剤耐性株）
薬剤を含まない培地で増殖させる間にシクロヘキシミド耐性菌がＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼε変異株では出現したが、野生型では現れなかった。
Figure 2007143562
δ変異株から得られた耐性株は、１０ｍｌ／Ｌのシクロヘシミドまで生育することができることを観察した。
野生型、変異株の成長特性を比較したが、増殖速度に違いはなかった（表２および図１を参照）。
Figure 2007143562
（結果−高温耐性株）
馴養済み培養を４０℃にて２日間培養した後平面寒天培地に植菌し、３８．５℃にて培養した。親株は高温ではまったく生育できないが、変異株は生育することを確認した（図３Ａ〜Ｂ＝写真）。
野生株、変異株の高温下での成長特性を比較したが、野生株では増殖の停止が確認された（表３および図２を参照）。
さらに、馴養済み培養を４１℃まで継続したものを使用すると、４１℃でも培養し得る変異株が生成していたことが明らかになった（図４Ａ〜Ｂ）。
Figure 2007143562
酵母は、大腸菌に代表されるグラム陰性細菌と異なる遺伝子複製機構を有することから、本発明のエラープローン頻度調節による遺伝形質の変換速度の調節をその生物の生存に影響を与えることなく行うことができるか不明であった。
本実施例により、真核生物である酵母でも、エラープローン頻度調節による遺伝形質の変換速度の調節により、その生存に影響を与えることなく、生物の遺伝形質の変換速度を調節することができることが実証された。
（実施例２：プラスミドを用いた変異導入）
本実施例では、プラスミドベクター（「不均衡変異誘導プラスミド」）を用いた真核生物への遺伝形質の変換速度の調節を実証した。
校正機能の調節は、実施例１と同様、ＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεの校正機能（Ａｌａｎ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，＆ Ａｋｉｏ Ｓｕｇｉｎｏ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）２４２：２８９−２９６）に変異を導入することによって行った。
変異ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）δまたはＤＮＡポリメラーゼεを発現するプラスミドベクターを作製した。ベクターを酵母細胞へトランスフェクトし形質転換させ、突然変異を生じさせ、シクロヘキシミド等薬剤を含む平板培地にて培養し、出現する薬剤耐性コロニーを計測した。
（材料）
本実施例では、対象生物として酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いた。正常株として、ＡＭＹ５２−３Ｄ：ＭＡＴα，ｕｒａ３−５２ ｌｅｕ２−１ ａｄｅ２−１ ｈｉｓ１−７ ｈｏｍ３−１０ ｔｒｐ１−２８９ ｃａｎＲ（ＡＴＣＣ、前出）を用いた。エラープローン頻度の調節は、変異型ＤＮＡポリメラーゼδまたはεを野生型正常株に導入することによって行った。
変異型ＤＮＡポリメラーゼδおよびεをコードする配列は、実施例１で用いたＤＮＡポリメラーゼδ変異株（ＡＭＹ１２８−１：Ｐｏｌ３−０１ ＭＡＴα，ｕｒａ３−５２ ｌｅｕ２−１ ｌｙｓ１−１ ａｄｅ２−１ ｈｉｓ１−７ ｈｏｍ３−１０ ｔｒｐ１−２８９ ｃａｎＲ）、ＤＮＡポリメラーゼε変異株（ＡＭＹ２−６：ｐｏｌ２−４ ＭＡＴα，ｕｒａ３−５２ ｌｅｕ２−１ ｌｙｓ１−１ ａｄｅ２−６ ｈｉｓ１−７ ｈｏｍ３−１０ ｔｒｙ１−２８９ ｃａｎＲ））から生産した。
使用したプラスミドベクターは、プロモーターとしてＧａｌを含み、そのプロモーターに作動可能に変異型ＤＮＡポリメラーゼδまたはεをコードする核酸配列（配列番号３３および３５）をそれぞれ連結したものを含んだ。
（方法）
（ベクターの作製）
分子生物学に関する技術は、本質的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，前出に基づいた。ｐｏｌδ、ｐｏｌε変異株（ＤＮＡポリメラーゼδ変異株（ＡＭＹ１２８−１：Ｐｏｌ３−０１ ＭＡＴα，ｕｒａ３−５２ ｌｅｕ２−１ ｌｙｓ１−１ ａｄｅ２−１ ｈｉｓ１−７ ｈｏｍ３−１０ ｔｒｐ１−２８９ ｃａｎＲ）、およびＤＮＡポリメラーゼε変異株（ＡＭＹ２−６：ｐｏｌ２−４ ＭＡＴα，ｕｒａ３−５２ ｌｅｕ２−１ ｌｙｓ１−１ ａｄｅ２−６ ｈｉｓ１−７ ｈｏｍ３−１０ ｔｒｙ１−２８９ ｃａｎＲ））よりｐｏｌ部位をＰＣＲ法にて増幅させｐｏｌδ、ｐｏｌεを回収する。ｐｏｌ部位の回収に使用したプライマーは、以下の配列である：
正方向（ｐｏｌδ（ｆｏｒｗａｒｄ））：配列番号３７：５’−ＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＣＣＴＴ−’３（δ）
逆方向ｐｏｌ３（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号３８：５’−ＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＡＴＴＴＧＣＴＴＡＡＴＴＧＴ−’３（δ）
正方向ｐｏｌε（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号３９：５’−ＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＴＴＴＧＧＣＡＡＧＡＡＡＡＡＡ−’３（ε）
逆方向ｐｏｌ２（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号４０：５’−ＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣ
ＡＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＣＡＧＣＡ−’３（ε）
このＰＣＲ産物を、ＧＡＬプロモーターを持つベクターへ挿入する。
（形質転換）
このプラスミドベクターは、リン酸カルシウム法にて酵母の正常株中へトランスフェクトする。
（変異導入）
形質転換した酵母を４８〜７２時間ガラクトースを含む液体培地にて２８℃にて振蕩培養する。
（薬剤耐性の確認）
シクロヘキシミドを含む平板培地（含ガラクトース）にて２４時間、２８℃にて培養。生育してきたコロニー数を計測する。
（結果）
薬剤を含まない培地で増殖させる間にシクロヘキシミド耐性菌がＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼε変異株では出現したが、野生型では現れなかった。
（実施例３：動物としてマウスなどを用いた、変異生物の作製）
本実施例では、真核生物の代表例として、動物であるマウスを用いて不均衡変異生物の作製を行った。
ジーンターゲッテイングの技術を用いて、ＤＮＡ複製校正能が不均衡な複製複合体を持つマウスを作製した。
複製校正の機能調節は、ＤＮＡポリメラーゼδ（配列番号５５（核酸配列）および５６（アミノ酸配列））および／またはＤＮＡポリメラーゼε（配列番号５７（核酸配列）および５８（アミノ酸配列））の校正機能を調節することによって行った。変異は、ｐｏｌδでは、３１５（Ｄ）→（Ａ），３１７（Ｅ）→（Ａ）、ｐｏｌεでは、２７５（Ｄ）→（Ａ）， ２７７（Ｅ）→（Ａ）とすることによって行った。
（ジーンターゲッテイング技術）
ジーンターゲティング技術は、本質的には、Ｙａｇｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７ ：９９１８−９９２２，１９９０、ジーンターゲティングの最新技術 八木健編集 別冊実験医学 ２０００，４に従った。変異ｐｏｌを持つターゲッテイングベクターを用いマウスＥＳ細胞の相同組み換えを行った。
組換えＥＳ細胞をマウス初期胚へ導入し胚盤胞を形成させた。この胚盤胞を偽妊娠マウスへ移植しキメラマウスを作製した。
キメラマウスの交配を行い生殖細胞へ変異が導入されたマウスを選択し、交配をすすめ変異がホモとなる変異マウスを作製した。
本実施例では、目的の形質として、発癌を指標に選択を行った。
（手順）
（１．ＥＳ細胞の調製）
胚の内部細胞塊より調製されたマウスＥＳ細胞（熊本大学動物資源開発研究センター、熊本、日本より入手可能）を、フィーダー細胞（マウス胎仔線維芽細胞；大阪大学八木教授より入手）を用いて、培地としてＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）へウシ胎仔
血清を２０〜３０％加えたものを用いて、５％ＣＯ２中で３７℃下にて行った。
フィーダー細胞の調製は、ジーンターゲットの最新技術 八木健編集 別冊実験医学 ２０００，４に従って、マウス胎仔線維芽細胞から初代培養することによって得た。
（２．ターゲッテイングベクターによるｐｏｌ遺伝子の相同組換え）
ターゲッテイングベクターは、相同組換えをおこしたＥＳ細胞を効率よく得るため、ポジティブ・ネガティブ法（Ｅｖａｎｓ，ＭＪ，Ｋａｕｆｍａｎ，ＭＨ，Ｎａｔｕｒｅ，２９２，１５４−１５６ （１９８１））に基づいたベクターを作製した（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，ＭＲ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２（１９８９））。
ターゲティングベクターの作製：ターゲティングベクターの作製は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９８７前出に記載される技術に基づいた。
ターゲッテイングベクターは、変異ｐｏｌδ および／またはｐｏｌ ε 遺伝子をポジティブ遺伝子とネガティブ遺伝子との間に挟んだ。ポジティブ遺伝子としてはネオマイシン耐性遺伝子を用い、ネガティブ遺伝子としてはジフテリアテキシンを用いた。
Ｐｏｌ変異としては、ｐｏｌδおよびｐｏｌεの双方ともに校正活性部位（配列番号５５および５６（δ）、配列番号５７および５８（ε）；ｐｏｌδでは、３１５（Ｄ）→（Ａ），３１７（Ｅ）→（Ａ）、ｐｏｌεでは、２７５（Ｄ）→（Ａ），２７７（Ｅ）→（Ａ））へ１塩基変異を導入し活性を欠失しておいた（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ．Ａ，ａｎｄ Ｓｕｇｉｎｏ Ａ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４２：２８９−２９６，１９９４；Ｇｏｌｄｓｂｙ Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９ ：１５５６０−１５５６５，２００２）。
（３．ＥＳ細胞へのベクターの導入）
エレクトロポーレーション法を用いてベクターをＥＳ細胞へ導入した。培養はＧ４１８（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含む培地（ＤＭＥＭ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）にて行った。
（４．組換えＥＳ細胞の回収）
Ｇ４１８存在下での培養の後、出現したコロニーをプレート（ＤＭＥＭ培地，Ｆｌｏｗ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）へ移した。
（５．相同組換え体の確認）
ＥＳ細胞より、ゲノムＤＮＡを抽出して、変異ｐｏｌが目的のとおり導入されているか、サザンブロット法および／またはＰＣＲ法により確認した。
（６．キメラマウスの作製−組換えＥＳ細胞の胚への導入）
マイクロインジェクション法を用いて上述のように調製された組み換え細胞を胚盤胞へ導入する。ジーンターゲティングの最新技術 八木健編集 別冊実験医学 ２０００，４に記載の常法に従って、胚盤胞としてはＥＳ細胞とは毛色の違うホストマウス胚を選択する。
（７．キメラマウスの作製−偽妊娠マウスへの胚移植）
ＥＳ細胞が１２９系マウス由来の場合はＣ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞内に注入し、ＥＳ細胞がＴＴ−２細胞の場合はＩＣＲマウスの８細胞期胚に注入し偽妊娠マウスを作製する。ＥＳ細胞を注入したマウス胚は仮親の子宮内または卵管内へそれぞれ移植を行ってキメラマウスを誕生させる。
（８．キメラマウスの作製−マウス掛け合わせ）
キメラマウスの掛け合わせを行い、変異ｐｏｌが目的どおり生殖細胞へ導入されたことをＰＣＲ法および／またはＤＮＡ配列決定等にて確認した。さらに掛け合わせを進めホモ変異ｐｏｌを持つマウスを作製する。
（結果）
本実施例で作製されたマウスおよび改変後の細胞について、発癌しているマウスを選択したところ、所望のとおり、従来技術に比べて比較にならない程度の速度で癌を自然に発生したモデルが提供されることがわかる。また、改変後の細胞は、増殖は自然とほぼ同様であるのに対して、その変異率は、１回に２個以上の程度で、従来の変異で得られる変異率とは顕著に異なることがわかる。
（別の形質）
同様の実験を行い、糖尿病、高血圧、動脈硬化、肥満、痴呆、神経障害等についての選択を行ったところ、同様に発症速度が極度に高まっているが、それぞれの症状を自然に発生したモデルを提供することができる。従って、本発明の方法は、動物においても適用可能であることが判明する。
（別の動物）
次に、同様の実験を、ラットをモデルとして行った。ラットについても同様にｐｏｌ δ（配列番号６０のアミノ酸配列において３１５位および３１７位のＤおよびＥをアラニンにする）に変異を入れることによって、発癌モデルを迅速に作製することができる。
（実施例４：別の手順を用いた変異生物の作製）
次に、別のマウスモデルを用いて、変異生物が作製され得るかどうかを実証した。以下にその手順を示す。
（材料および方法）
＜Ｐｏｌｄ１のｃＤＮＡの調製＞
生後４週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（日本チャールス・リバー）の精巣よりＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることにより、ｍＲＮＡを抽出した。抽出したｍＲＮＡよりＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＯｌｉｇｏ−ｄＴプライマーとを利用することで逆転写反応を行いマウス精巣の全ｃＤＮＡを作製した。作製した全ｃＤＮＡよりＫｏｚａｋ配列を含むように設計されたＰｏｌｄ１遺伝子（配列番号８６（核酸配列）および配列番号８７（アミノ酸配列））の５’末端側プライマーＳｐｅＩ−５’Ｐｏｌｄ１（ＧＡＣＴＡＧＴＧＧＣＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＣＧＧＧＡＡ）（配列番号６７）および３’末端側プライマーＥｃｏＲＩ−３’Ｐｏｌｄ１（ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＧＴＣＣＣＧＴＧＴＣＡＧＧＴＣＡ）（配列番号６８）を用いたＰＣＲ法によってＰｏｌｄ１遺伝子のｃＤＮＡ断片の増幅を行った。このようにして野生型のＰｏｌｄ１のｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡにＰｏｌｄ１遺伝子の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させるための変異（Ｄ４００Ａ）（配列番号８８（核酸配列）および配列番号８９（アミノ酸配列））を導入した。そのために変異導入用プライマー配列（ＣＡＧＡＡＣＴＴＴＧＣＣＣＴＣＣＣＡＴＡＣＣＴＣ）（配列番号６９）およびこれと相補的なプライマーを用いてＰＣＲ連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応を行うことで、変異型のＰｏｌｄ１のｃＤＮＡ作成をした。これらのｃＤＮＡの配列（配列番号７０）は、ＡＢＩ
３１００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって全ｃＤＮＡの塩基配列を読み、データベースによるものと同一の配列であることを確認した。このｃＤＮＡを用いてすべての実験を行った。野生型および変異型のＰｏｌｄ１のｃＤＮＡの調製をするのに用いたＰＣＲ法については、すべてＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（ＴＯＹＯＢＯ、Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用した。
＜プロモーター配列のクローニング＞
ｍＰＧＫ２：４５５−ｂｐのｍＰＧＫ２プロモーターの断片（配列番号９４）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムＤＮＡより、５’ｍＰＧＫ２−ｓａｃＩＩ プライマー（ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＡＧ）（配列番号７１）と３’ｍＰＧＫ２−ＳｐｅＩプライマー（ＧＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＧＴＡＴＧＣＡＣＡＡＣＡＧＣＣＴＣ）（配列番号７２）を利用してＰＣＲ法を行うことによりクローニングを行った。ＰＣＲ法にはＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ、Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用した。
Ｆｔｈｌ１７：５７２５−ｂｐのＦｔｈｌ１７遺伝子の上流配列のＤＮＡ断片（配列番号９５）は、５’Ｆｔｈｌ１７−ｓａｃＩＩプライマー（ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＧＡＧＡＣＴＴＡＣ）（配列番号７３）および３’Ｆｔｈｌ１７−ＳｐｅＩプライマー（ＧＧＡＣＴＡＧＴＣＡＧＴＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＡＡＡＧＴ）（配列番号７４）を利用することでクローニングを行った。ＰＣＲ法には、ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（ＴａＫａＲａ）を利用し、その緩衝液にはＧＣ緩衝液（製造業者が提供）を使用した。
＜トランスジェニックマウスの作製＞
トランスジェニックマウス作製用に調製したベクターＤＮＡ（２ｎｇ／mｌ）をＣ５７
ＢＬ／６マウスの受精卵の前核中にマイクロマニュピレーターを用いて注入した。遺伝子を注入した受精卵のうち翌日２細胞期に発生した胚を偽妊娠させておいた雌のＩＣＲマウスの卵管内に移植することで、トランスジェニックマウスを作製した。
＜トランスジーンの有無の確認＞
細かく刻んだマウスの尾をプロテイナーゼＫ（ナカライテスク）を含む可溶化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，２００ｍＭ ＮａＣｌ，１％ ＳＤＳ）に入れて５５℃で一晩インキュベーションした。その後、フェノール／クロロホルムによる抽出を２回行い、エタノール沈澱を行うことでマウスのゲノムＤＮＡを調製した。それぞれのマウスのゲノムＤＮＡについて、トランスジェニックマウス＃１については、Ｃｒｅ−Ｆプライマー（ＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＴＧＡＧＧＴＴＣ）（配列番号７５）およびＣｒｅ−Ｒプライマー（ＣＴＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＣＡＧ）（配列番号７６）によって、トランスジェニックマウス＃２については、Ｎｅｏ−Ｆプライマー（ＧＣＴＣＧＡＣＧＴＴＧＴＣＡＣＴＧＡＡＧ）（配列番号７７）およびＮｅｏ−Ｒプライマー（ＣＣＡＡＣＧＣＴＡＴＧＴＣＣＴＧＡＴＡＧ）（配列番号７８）によってＰＣＲを行い、トランスジーンの有無を判定した。ここでのＰＣＲ法は、Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ、Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。
＜免疫染色＞
ｍＰＧＫ２（生後１４週齢）とＦｔｈｌ１７（生後１３週齢）とのＦ０世代のトランスジェニックマウスを実験に使用した。ネンブタール（（５０ｍｇ／ｍｌ）＝大日本製薬）によって麻酔したマウス個体を開腹させ、まず片方の精巣上体を切り取った。その後、４％パラホルムアルデヒドによって灌流固定を行い、左右２つの精巣を採取しそれを４％パラホルムアルデヒドに浸して４時間置いた。ＰＢＳ（作り方（ＮａＣｌ ８ｇ，Ｎａ２Ｈ
ＰＯ４ １．１５ｇ，ＫＣＬ ０．２ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇに水を加えて１Ｌにする））で軽く洗った後、２０％ショ糖リン酸緩衝液（０．１Ｍ リン酸（ナトリウム）バッファー（ｐＨ７．３），２０％ｓｕｃｒｏｓｅ）に浸して４℃に一晩置いた。一晩置いた組織をＯＣＴ化合物（（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）＝サクラファインテック）に浸して急冷した後、クライオスタットで５mｍの厚さの切片を作成した。２０％ブロッキングワン
（ナカライテスク）と０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでインキュベートした。その後で、４０００倍に希釈したマウス抗Ｃｒｅ リコンビナーゼモノクローナル抗体（ＭＡＢ３１２０，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）とインキュベーションした。二次抗体としては、ビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用した。発色は、３，３−ジアミノベンジジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ＝ＤＡＢ）（同仁化学）および過酸化水素（ナカライテスク）を用いて行った。ＤＡＢによる発色後、メチルグリーン（メルク）によって対比染色を行った。
＜人工授精＞
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの雌（日本チャールス・リバー）に妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）を一匹あたり５ＩＵとなるように腹腔内に投与した。その４６〜４８時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）（帝国臓器）をＰＭＳＧと同様に一匹あたり５ＩＵとなるように腹腔内に投与した。その１２時間後にマウスを頚椎脱臼によって安楽死させ、卵子塊を摘出した。摘出した卵子塊を０．３ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼ（ＳＩＧＭＡ）を含むＭ２培地に入れて１０分間３７℃にてインキュベーションし、未受精卵を採取した。免疫染色用に用いたｍＰＧＫ２とＦｔｈｌ１７のそれぞれのトランスジェニックマウスから灌流固定を行う前に、精巣上体を摘出し、そのうちの精巣上体尾部より精子を採取した。採取した精子は体外受精用培地のＴＹＨ培地中で３７℃，５％ＣＯ２インキュベーターに置き活性化させた後に、未受精卵を含むＴＹＨ培地中に添加した。そのまま５％ＣＯ２インキュベーターに６時間静置した後、卵の洗浄を行い、胚培養用培地ＷＭに移し翌日まで３７℃，５％ＣＯ２インキュベーターにて培養をおこなった。翌日に二細胞期になったものだけを、ＩＣＲ系の偽妊娠マウスの卵管内へ移植した。
＜ｍＲＮＡによる遺伝子発現の確認＞
ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることにより、トランスジェニックマウス＃２の尾よりｍＲＮＡを抽出した。抽出したｍＲＮＡよりＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＯｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを利用することで逆転写反応を行い得られたｃＤＮＡに対して、Ｎｅｏ−Ｆプライマー（ＧＣＴＣＧＡＣＧＴＴＧＴＣＡＣＴＧＡＡＧ）（配列番号７９）およびＮｅｏ−Ｒプライマー（ＣＣＡＡＣＧＣＴＡＴＧＴＣＣＴＧＡＴＡＧ）（配列番号８０）によってＰＣＲを行い、ｍＲＮＡの発現の有無を判定した。ここでのＰＣＲ法は、Ｅｘ−Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて行った。
＜Ｃｒｅ リコンビナーゼを用いた組み換え効率の解析＞
ターゲティングベクター（図１８）のうちｌｏｘ６６とｌｏｘ７１の間の領域の配列をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩの上に作製した。作製したベクター２００ｎｇをＣｒｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ存在下、室温でＣｒｅリコンビナーゼ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と２時間反応させた。反応後は、７０℃で５分間インキュベーションしてＣｒｅリコンビナーゼを失活させた。反応液を熱ショックにてコンピテント細胞に形質転換させ、ＬＢ−Ａｍｐプレート（ＬＢ培地に、１．５％のａｇａｒ ｐｏｗｄｅｒ（ナカライテスク）を加え、オートクレーブ。オートクレーブ後、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＳＩＧＭＡ）を加える。）に播き、翌日コロニーをピックアップした。コロニーをＬＢ−Ａｍｐ培地にて培養した後で、プラスミド抽出をおこなった。組み換わったかどうかの判定は、ＡＢＩ ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｒ ３１００による配列決定の結果によって行った。
トランスジェニックマウスを作製する目的は、変異型Ｐｏｌｄ１を精子形成期特異的に過剰発現させることによって、進化速度を調節することができるかどうかを確認することである。
また、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現を行うことにより、ｌｏｘＰ配列を有するマウスにおいて精子形成期に特異的な発現の制御を可能とすることも考慮した。精子形成期特異的に変異型Ｐｏｌｄ１およびＣｒｅリコンビナーゼをともに発現することを可能にするトランスジェニックマウス＃１と、ｌｏｘＰ配列を利用することで組織特異的な変異型Ｐｏｌｄ１の過剰発現を可能にするトランスジェニックマウス＃２の２種類のトランスジェニックマウスの作成を試みた（図９）。
（ａ）トランスジェニックマウス＃１
トランスジェニックマウス ＃１は、精子形成期において特異的に変異型Ｐｏｌｄ１とＣｒｅリコンビナーゼの発現を引き起こすようなトランスジェニックマウスである。その作製においては、精子形成期に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターの選択が重要な問題となる。ＤＮＡポリメラーゼδは、マウスの精巣では精原細胞期と精母細胞から減数分裂期の前期まで発現することが示唆されている（Ｄｉａ Ｋａｍｅｌら（１９９７）Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ５７，１３６７−１３７４）。
そこで、精原細胞期または精母細胞期の段階で発現を引き起こすプロモーターの利用を考えた。マウスホスホグリセレートキナーゼ２（ｍＰＧＫ２）遺伝子のプロモーターは、精母細胞での過剰発現を行いたいときにしばしば使用されるプロモーターである（Ｎａｄｉａ Ａ．Ｈｉｇｇｙら（１９９５）Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，１９０−２００）。精子形成期に特異的な発現をひき起こすプロモーターの候補のひとつとしてｍＰＧＫ２のプロモーターを利用することにした。また、ｍＰＧＫ２のプロモーターより精子形成の早い段階である精原細胞期において発現を促すプロモーターも利用しようと考えた。しかしながら、精原細胞期や精母細胞期に特異的な発現を示すプロモーターは、今までほとんど報告されていない。そこで、精原細胞に特異的に発現していると言われている遺伝子の上流の配列をＰＣＲ法の利用によりクローニングすることで精子形成期に特異的な新規のプロモーターを開発することにした。ｃＤＮＡサブトラクション法により新たに見つけられた精原細胞に特異的な発現を示す遺伝子（Ｐ．Ｊｅｒｅｍｙ Ｗａｎｇら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２７，４２２−４２６）のなかからフェリチン重鎖ポリペプチド様１７（Ｆｅｒｒｉｔｉｎ ｈｅａｖｙ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−ｌｉｋｅ １７＝Ｆｔｈｌ１７）遺伝子を選び、その上流の約５．７ｋｂｐの配列（配列番号８１）を精原細胞期に特異的な発現を示すプロモーターとして利用することとした。以上の２種類の精子形成期特異的なプロモーターを用いることで、トランスジェニックマウス＃１用のベクターの作製を行った。実際に作製したベクターの概略図が図９である。変異型Ｐｏｌｄ１ 遺伝子とＣｒｅ リコンビナーゼをＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）の配列でつなぎ、精子形成期に特異的に発現を引き起こすことが期待されるプロモーターによって、同時に両方の遺伝子の発現が行われるようなベクターを作製した。
作製したベクターＤＮＡを受精卵前核にマイクロインジェクションすることによってトランスジェニックマウスを作製した。産まれてきたマウスのトランスジーンの有無は、Ｃｒｅリコンビナーゼに特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法によって判定した（図１０）。その結果、ｍＰＧＫ２のプロモーターを用いたものは２系統（産子数４６匹中）、Ｆｔｈｌ１７の上流配列を利用したものは１系統（産子数２７匹中）がトランスジェニックマウスであることが確認された。誕生したトランスジェニックマウスは、どれも外見では正
常のものとの区別はつかなかった。それぞれのプロモーターの発現領域を解析するために、ｍＰＧＫ２（生後１４週齢）およびＦｔｈｌ１７（生後１３週齢）のそれぞれのＦ０世代のトランスジェニックマウスの精巣を採取して、マウスの抗Ｃｒｅリコンビナーゼモノクローナル抗体を用いて免疫染色を行った（図１１）。図１１は、ＤＡＢによって２次抗体の発色（黒茶色）を行い、細胞内に存在するＲＮＡを染色するメチルグリーンで対比染色（青緑色）を行ったものである。コントロールのものも精細管の基底膜部に強い黒茶色の発色がみられる。これは一次抗体にマウスで作製した抗体を用いていることから生じるバックグラウンドである。今回の免疫染色の結果では精細管内部の黒茶色の発色が外来性のＣｒｅ リコンビナーゼの発現箇所である。図１１から、ｍＰＧＫ２のプロモーターを用いたトランスジェニックマウスとＦｔｈｌ１７の上流配列を用いたトランスジェニックマウス、そのどちらの精巣においても精細管内にＣｒｅ リコンビナーゼが発現していることが確かめられた。このことにより、Ｆｔｈｌ１７の上流配列５．７ｋｂｐの領域にも何らかのプロモーター活性を有する可能性があることが示唆された。また、Ｆｔｈｌ１７の上流配列を用いたトランスジェニックマウス精巣におけるＣｒｅ リコンビナーゼの染色結果では、ｍＰＧＫ２のプロモーターを用いたものより発色が弱かったことから、Ｆｔｈｌ１７の上流配列がもつと思われるプロモーター活性（発現能力）はｍＰＧＫ２のプロモーターと比べるとその発現能力が弱い可能性があることも示唆された。Ｒｕｓｓｅｌらは、マウス，ラット，イヌにおいて精巣の組織学的な解析を行っており、精子形成のステージを選別する基準についてまとめている（Ｒｕｓｓｅｌｌ ＬＤ，Ｅｔｔｌｉｎ ＲＡ，Ｈｉｋｉｍ ＡＰＳ，Ｃｌｅｇｇａｎｄ ＥＤ．（１９９０）,Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ
ａｌ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｓｔｉｓ．Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ，ＦＬ：Ｃａｃｈｅ Ｒｉｖｅｒ Ｐｒｅｓｓ）。これに従い、今回得られた２種類のプロモーターを用いたトランスジェニックマウス＃１の染色像において精子形成のどのステージの細胞に発現がみられるのかさらに解析を行った。ｍＰＧＫ２のプロモーターを用いたものは、主に後期精母細胞に発現がみられた（図１２）。これは、従来言われていた領域とは異なる部分で発現していることになる。またＦｔｈｌ１７の上流配列をプロモーターとして利用したものについては、精母細胞期から精原細胞期にかけて発現がみられるのが確認された（図１３）。今回の染色の結果からは、精原細胞における発現については基底膜を染めるバックグラウンドとの区別が難しくその発現の有無を判定することはできなかった。
今回誕生したＦ０世代のｍＰＧＫ２のプロモーターを用いたトランスジェニックマウスとＦｔｈｌ１７の上流配列を用いたトランスジェニックマウスの内訳は、ｍＰＧＫ２（雄１，雌２），Ｆｔｈｌ１７（雄１）である。このうちのそれぞれの雄の精巣を免疫染色の試料として使用した。免疫染色に利用することにしたＦ０世代の雄のマウスは、生後９週齢の頃より繁殖のために交配を開始した。実際に行った交配の結果についてまとめたのが表4（Ａ）である。
Figure 2007143562
表４（Ａ）では、腹部の膨大が確認されたものを妊娠数として数えた。ｍＰＧＫ２のプロモーターを用いた雄のトランスジェニックマウスでは、交配翌日に妊娠が確認されたものもあったにも関わらず、交配によって結局一匹もその子供が産まれることはなかった。
さらに、免疫染色を行う際には、それぞれのトランスジェニックマウスに麻酔をかけた後、灌流固定を行う前に精巣上体を採取し、精巣上体から得られた精子を用いて人工授精を試みた（表４（Ｂ））。
Figure 2007143562
どちらのマウスから採取した精子とも未授精卵の周りに集まり、今回観察したかぎりでは精子の異常はみられなかった。Ｆｔｈｌ１７の上流配列を利用したトランスジェニックマウスにおいては、人工授精を行った翌日には通常より低い割合ながら２細胞期に進むものもみられ、それを移植した仮親からの子供の出産が確認された。しかしながら、ｍＰＧＫ２のプロモーターを用いたトランスジェニックマウスでは、人工授精を行った後、前核期まで進んだ受精卵は存在したが、翌日に２細胞期になっているものはひとつもなかった。これらのことから、今回免疫染色に用いたｍＰＧＫ２のプロモーターを用いたトランスジェニックマウスの雄に関しては、精子形成においてなんらかの異常がある可能性が示唆された。なお、ｍＰＧＫ２のプロモーターを用いたＦ０世代のトランスジェニックマウスのうちの雌は、正常なマウスと同様に出産を行っており、特に異常性はみられなかった。
（ｂ）トランスジェニックマウス＃２
トランスジェニックマウス＃２は、組織特異的にＣｒｅ リコンビナーゼを発現するマウスとかけ合わせることで、変異型Ｐｏｌｄ１をその組織特異的に過剰発現することを目的としたトランスジェニックマウスである。そのベクターの配列は、全身で過剰発現をさせるプロモーターであるＣＡＧプロモーターと２つのｌｏｘＰ配列で挟まれたネオマイシン耐性遺伝子、そしてその後ろに、変異型Ｐｏｌｄ１をつなぐことで作製した（図９）。ネオマイシン耐性遺伝子の後ろには転写終結を意味するｐｏｌｙＡシグナルが付加されているので、このことにより組織特異的なＣｒｅリコンビナーゼの発現によって変異型ｐｏｌｄ１の発現を開始させることが可能となるようなマウスを作成した。トランスジェニックマウス＃２の作製法などは、トランスジェニックマウス＃１の場合と同様である。ネオマイシン耐性遺伝子に対する特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法によって（図１０）、４系統（産子数２０匹中）がトランスジェニックマウスであることが確認された。４系統誕生したトランスジェニックマウスのうち３系統のＦ０世代のマウスについては、正常のものと同様の発育を示した。従って、本発明の遺伝形質の変換速度の調節によっても、マウスに異常はそれほど発生しなかったといえる。
生存している３系統のトランスジェニックマウス＃２のそれぞれの尾よりｍＲＮＡを抽出し、ネオマイシン耐性遺伝子に対する特異的なプライマーを用いて行ったＲＴ−ＰＣＲ法によって、ネオマイシン耐性遺伝子の発現が確認された。
（ターゲティングマウスの作製）
コンディショナルターゲティングマウスは、組織また時期特異的に正常型のＰｏｌｄ１遺伝子が変異型Ｐｏｌｄ１遺伝子に置き換わるようなもので、なるべくもとのＤＮＡポリメラーゼδの発現様式を維持したかたちでの作製を考えた。Ｃｒｅリコンビナーゼを用いた組み換え反応では、２つのｌｏｘＰ配列の方向を向かい合わせるようにしてつなぎあわせると、２つのｌｏｘＰ配列間で組み換えが行われ、ｌｏｘＰ配列に挟まれた領域が逆さ
になるようにして置き換わらせることができる。しかしながら、２つのｌｏｘＰ配列の方向を向かい合わせるだけでは、その間の置き換わりは可逆的な反応過程になってしまう。この組み換え反応の過程を不可逆的にするためにはｌｏｘＰ配列の一部に変異を入れたもの（ｌｏｘ６６， ｌｏｘ７１）を利用することが知られている（Ｋｉｍｉ Ａｒａｋｉら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，８６８−８７２）。
コンディショナルターゲティングマウスの作製を行うにあたり、この変異の入ったｌｏｘＰ配列を使用することにした。Ｌｏｘ６６とｌｏｘ７１の方向を向き合わせて配置し、その間に変異型Ｐｏｌｄ１の変異位置を含むｅｘｏｎ１０の正常型のｅｘｏｎ１０の配列、そして変異型のｅｘｏｎ１０を相補的にした配列を直列につなぐことを考えた（図１４）。このようなベクターを作製してターゲティングマウスを作製すると、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現によってふたつのｌｏｘ配列間で組み換えが生じた後では、スプライシングに利用されるｅｘｏｎ１０が正常型から変異型へと入れ替わることが期待される（図１５）。そうすることによって、内在性のＤＮＡポリメラーゼδがＣｒｅリコンビナーゼの発現によって、正常型から変異型へと置き換えられるように考えた。ターゲティングベクターを作製するにあたっては、スプライシングを行うのに必須とされている配列を含むようにｅｘｏｎ１０の両端のイントロン部分を調製した。
しかしながら、ｌｏｘ６６およびｌｏｘ７１の配列は、変異を含んだ配列であることから、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組み換え反応の効率が、通常のｌｏｘＰ配列を用いたものと比べて低いことが考えられる。またｌｏｘ６６とｌｏｘ７１の配列を用いて方向を向き合わせたときでも反応が正しく起こるかどうかを調べるためにＣｒｅリコンビナーゼの酵素で実際に組換え反応をすることで解析を行った。そこで、ｌｏｘ６６とｌｏｘ７１との間に２つのｅｘｏｎ１０を含む配列（ｌｏｘ６６−７１の組み換え配列と呼ぶことにする）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩの上で作製し、Ｃｒｅリコンビナーゼの酵素と反応させることで、組み換え反応の効率を調べることができないかと考えた。反応が行われていることに対するポジティブコントロールの実験として、トランスジェニックマウス＃２のベクター配列を用いたところ、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組み換え反応は１５分間の反応では５０％，２時間の反応では１００％のプラスミドに組み換えが起こったことが碓認された。ｌｏｘ６６−７１の組み換え配列に対して２時間反応を行ったところ、低頻度（１／３）ながら正しく組み換わったものが確認された。このことから、組み換え反応はｌｏｘ６６−７１の組み換え配列に対しても行われることが碓認された。
（遺伝形質の変換速度の調節）
これらのマウスを、遺伝形質の変換工程（例えば、高温、高湿度、高塩濃度など）の過程に曝すと、そうでないマウスに比べて、適応する個体数が顕著に増加することが分かる。
本実施例の方法により、ＤＮＡポリメラーゼδの校正活性を欠失させることで、リーディング，ラギングの両ＤＮＡ鎖に不均衡な変異を蓄積させることができることが明らかになった。精子形成期に特異的に変異の入ったＤＮＡポリメラーゼdを発現させることで、
マウス個体の全身に生じる変異率をできるかぎり上げないこと。遺伝子操作などによる副次的な影響をできる限り抑えることができることが明らかになった。本実施例では、これらの要求を満たすような不均衡進化マウスの作製が実現される。
トランスジェニックマウス＃１では、精子形成期に特異的に発現するプロモーターについて調べることができた。現在までに知られている精子形成期に特異的な発現を示すプロモーターの多くは、減数分裂後の精子細胞期に特異的に発現するものであったが、本実施例では、精原細胞期やまたは精母細胞期のようにＤＮＡ鎖の複製を行っている雄性生殖細胞において特異的に発現するプロモーターの利用を意図していたところ、その条件に該当
するようなプロモーターはｍＰＧＫ２のプロモーター以外には、有効なものがなかったことから、本実施例では、Ｆｔｈｌ１７遺伝子の上流配列を新規のプロモーターとして利用することを考えた。結果として、少なくとも精母細胞での発現が確認された。精原細胞に関しては、利用することのできるＣＡＧ−ＣＡＴ−ＧＦＰのトランスジェニックマウス （今回作製したトランスジェニックマウス＃２と類似した構造のベクターを用いて作製されたトランスジェニックマウスである。このマウスでは、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現によってＧＦＰの発現が開始されるようになっている。）とかけ合わせることで、今回作製したトランスジェニックマウス＃１のＣｒｅリコンビナーゼの発現領域にＧＦＰが発現すると考えられるので、そのときのＧＦＰの発現領域と今回得られたＣｒｅリコンビナーゼの発現領域との結果を合わせることで、本実施例のプロモーターによる発現領域を分析することが可能である。なお、今回プロモーターとして用いたＦｔｈｌ１７の上流配列中には、ＴＡＴＡボックスなどの基本転写因子結合配列はみられなかった。
ｍＰＧＫ２のプロモーターでの発現は、以前までにあった報告と比べて精子形成期の後の段階に発現がみられた。
トランスジェニックマウス＃１で作製された２種類のトランスジェニックマウスでは、今回の結果から、発現領域が異なることが示唆された。従って、これらのマウスを用いて、変換効率の調節のために、どの領域での発現が効果的であるかを比較することができるので有用であると考える。精子形成期に特異的にＣｒｅリコンビナーゼの発現を行うトランスジェニックマウスの作製は、組織特異的に生じるｌｏｘＰ配列の組み換えを利用した調整的遺伝子欠損マウスを得ることも可能になり、生殖細胞における研究材料としての利用も可能である。
トランスジェニックマウス＃２は、組織特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウスとかけ合わせることで、組織特異的に変異型のＰｏｌｄ１を過剰発現することができる。トランスジェニックマウス＃１では、プロモーターの発現が行われなくなると変異型Ｐｏｌｄ１の発現も行われなくなってしまうが、このマウスとかけ合わせることで、プロモーターでの発現が終了した後も発現させ続けることができる。また、例えば脳や肝臓などの組織に特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現しているトランスジェニックマウスとのかけ合わせにより、その過剰発現による体細胞レベルへの影響も検討できる。
本実施例の結果から、ノックアウトマウスでもまた、遺伝形質の変換速度を調節することが理解される。
（実施例５：植物としてイネを用いた、変異生物の作製）
次に、本実施例では、真核生物の代表例として、植物であるイネを用いて不均衡変異生物の作製を行う。
ジーンターゲッテイングの技術は、本質的に、Ｙａｇｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：９９１８−９９２２，１９９０ 、ジーンターゲティングの最新技術 八木健編集 別冊実験医学 ２０００，４に基づいた。本実施例では、ＤＮＡ複製校正能が不均衡な複製複合体（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４２：２８９−２９６，１９９４）を持つ植物を作製する。
改変する目的となる遺伝形質として、耐病性（いもち病）および耐寒性を選択する。
（ジーンターゲッティング技術）
変異ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４２：２８９−２９６，１９９４）を持つターゲッテイングベクターを作製しカルス細胞等の植物細胞のｐｏｌ遺伝子と相同組み換えを行った。その後、細胞の分化を進め植物体を形成させる。
（手順）
（１．カルス細胞の調製）
カルス細胞の調製は、本質的に、Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｂｈｏｊｗａｎｉ，Ｓ．Ｓ．ａｎｄ Ｒａｚｄａｎ，Ｎ．Ｋ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８３に記載される周知技術に基づいて行う。具体的には、植物体よりカルス細胞を作製する（Ｄａｖｉｅｓ，Ｒ．１９８１．Ｎａｔｕｒｅ．，２９１：５３１−５３２およびＬｕｏ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｒｅｐ．，７：６９−７７，１９８９）。
（２．ｐｏｌ遺伝子の相同組み換え）
相同組み換えをおこした細胞を効率よく得るため、マウスのジーンターゲッテイング法にて用いられているポジティブ・ネガティブ法（Ｙａｇｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：９９１８−９９２２，１９９０、Ｃａｐｅｃｃｈｉ Ｍ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４（１６），１２８８−１２９２，１９８９）に準じて相同組み換えを行う。
ターゲティングベクターの作製：ターゲティングベクターの作製は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９８７前出に記載される技術に基づく。
ターゲッテイングベクターは、変異ｐｏｌδおよび／またはｐｏｌε遺伝子をポジティブ遺伝子とネガティブ遺伝子との間に挟む。ポジティブ遺伝子としてはハイグロマイシン耐性遺伝子を用い、ネガティブ遺伝子としてはジフテリアトキシンを用いる（Ｔｅｒａｄａ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０：１０３０−１０３４，２００２）。
Ｐｏｌ変異としては、ｐｏｌδに校正活性部位（配列番号４８の３２０位（Ｄ）および３２２位（Ｅ）をそれぞれアラニン（Ａ）に変更）へ塩基変異を導入し活性を欠失しておいた（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ．Ａ，ａｎｄ Ｓｕｇｉｎｏ．Ａ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４２：２８９−２９６，１９９４；Ｇｏｌｄｓｂｙ Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９ ：１５５６０−１５５６５，２００２）。
（３．カルス細胞へのベクターの導入）
カルス細胞へのベクターの導入は、本質的に、植物バイオテクノロジーII．山田康之・大山莞爾編．東京化学同人１９９１に記載の技術に基づく。本実施例では、エレクトロポーレーション法またはアグロバクテリウム法等を用いてベクターをカルス細胞へ導入した。培養はハイグロマイシン（１００μｇ／ｍｌ、インビトロゲン社）を含む培地（ＤＭＥＭ （Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））にて行う。
（４．組み換え細胞の回収）
ハイグロマイシン存在下での培養の後、組換え細胞を回収する（Ｔｅｒａｄａ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０：１０３０−１０３４，２００２）。
（５．相同組み換え体の確認）
組み換え体からゲノムＤＮＡを抽出して、変異ｐｏｌが目的どおりＥＳ細胞に導入されているか、サザンブロット法・ＰＣＲ法により確認する（ジーンターゲティングの最新技術 八木健編集 別冊実験医学 ２０００，４）。
（６．植物体の作出）
植物体の作出は、本質的に、植物バイオテクノロジーII．山田康之・大山莞爾編．東京化学同人１９９１、植物組織培養の技術．竹内正幸・中島哲夫・古谷力編 朝倉書店１９８８に基づいて行う。本実施例では、カルスより分化を行い、植物体を形成させる。その後、葯・種子などに由来する１倍体細胞、および／または植物体の掛け合わせ等の後作製されるホモ型の２倍体細胞等を用いてｐｏｌ変異に由来するミューテーター変異としての性質を当該分野において周知の技法に従って確認する（Ｍａｋｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３（３），１３６１−１３６７，１９８３；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．１９９２，Ａ Ｓｈｏｒｔ ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ，Ｎ．Ｙ．）。
（結果）
本実施例で得られた変異が導入された植物は、所望のとおり耐寒性および耐病（いもち病など）性を得た植物が従来技術に比較して迅速に得られたことが観察される。また、改変後の細胞は、増殖は自然とほぼ同様であるのに対して、その変異率は、１世代に２個以上の程度で、従来の変異で得られる変異率とは顕著に異なることがわかる。
（実施例６：シロイヌナズナでの実証）
次に、シロイヌナズナを用いて、変異生物を作製した。
（方法および材料）
（ｐｏｌδ ｃＤＮＡのクローニング）
ｐｏｌδ（Ａｔ１ｇ４２１２０）（配列番号９０（核酸配列）および配列番号９１（アミノ酸配列））はシロイヌナズナ根由来の全ｍＲＮＡから、以下のプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅させ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ２（ＴＯＹＯＢＯ）にサブクローニングした。
Ｘｂａ１−４２１２０−Ｆ： ５’−ＣＴＧＡＧＴＣＴＡＧＡＴＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＴＣＧ−３’（配列番号８２）
２ｇ４２１２０−Ｓａｃ１−Ｒ： ５’−ＡＧＣＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＧＧＴＴＴＡＴＣＴＧ−３’（配列番号８３）
（変異型ｐｏｌδ遺伝子ｐｏｌδ（Ｄ３１６Ａ）（配列番号９２（核酸配列）および配列番号９３（アミノ酸配列））の作製）
ｐｏｌδｃＤＮＡの３１６番目のアミノ酸がＤからＡになるよう、以下のプライマーを用いて点突然変異を誘発させた。
２ｇ４２１２０−Ｄ３１６Ａ−Ｆ：５’−ＡＴＴＴＧＣＴＧＴＣＧＡＴＡＡＴＡＴＣＡＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧ−３’（配列番号８４）
２ｇ４２１２０Ｒ：５’−ＧＡＧＴＧＡＧＧＡＴＴＴＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＴＧＡＡＧＧ−３’（配列番号８５）
（形質転換用のベクターの作製）
植物で遺伝子を恒常的に発現させるバイナリープラスミドは、ｐＢＩ１２１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を改変して作製した。ｐＢＩ１２１のβ−グルクロニダーゼ遺伝子を制限酵素ＸｂａＩおよびＳａｃＩを用いて切り出し、代わりにｐｏｌδ（Ｄ３１６Ａ）を入れた（
以下ｐｏｌδ（Ｄ３１６Ａ）と呼ぶ）。
また形質転換のコントロール用ベクターとして、上記のｐＢＩ１２１（以下ＧＵＳと呼ぶ）と、ｐＢＩ１２１のβ−グルクロニダーゼ遺伝子をＧＦＰ に置き換えたもの（以下ＧＦＰと呼ぶ）も作製した。
（カルスの作製）
シロイヌナズナ種子（エコタイプは、Ｃｏｌｕｍｂｉａ）を発芽用培地にまき、４℃で２、３日間低温処理した後、プレートを培養器（２２℃）に移し暗黒下で１０日間生育させた。徒長した胚軸を約１ｃｍの長さに切り、ＣＩＭ培地上に１０日間置きカルス化させた。
（アグロバクテリウムを用いたカルスの形質転換）
ＧＵＳまたはＧＦＰまたはｐｏｌδ（Ｄ３１６Ａ）を含むバイナリープラスミドをもったアグロバクテリウムｐＭＰ９０株を５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地に接種し、２８℃で２日間振とう培養した。ＯＤ６００＝０．８程度まで増殖したアグロバクテリウムの培養液１．４ｍｌを卓上遠心機で５分間遠心して集菌し、１ｍｌのＡＩＭ（後述）に懸濁した。カルス化した胚軸断片を５ｍｌのＡＩＭを入れた６０ｍｍシャーレに移し、ここに１ｍｌのアグロバクテリウム懸濁液を加え、約２０分間室温で振とうした。滅菌した濾紙にカルスを載せ余分な水分をのぞいた後、新しいＣＩＭプレートにカルスを移した。３日後に形質転換したカルスをＡＩＭの入った６０ｍｍシャーレに移し、２５分間、６０ｒｐｍで旋回させ洗浄した。洗浄は５回繰り返して行った。
洗浄後のカルスは濾紙の上で水分を取り除き、カルベニシリン５０ｍｇ／Ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含むＣＩＭ培地（後述）（自製した）で生育させた。
なお、カルスへの形質転換効率は、９５％以上だった（ＧＦＰを導入した個体のみ測定。ＧＦＰ蛍光を発するか否かでチェックした）。
（カルスの継代および変異株のスクリーニング）
カルスは１０日置きに新しいＣＩＭプレートに植え替えた。その際、１つのカルスを２つに割り、片方は継代用のＣＩＭプレートに、もう片方はスクリーニング用のプレートに移して各条件での耐性株の選抜を行った。
スクリーニング用のプレートには、２００ｍＭまたは３００ｍＭのＮａＣｌを加えた。継代とスクリーニングは、上記のようにして１０日置きに繰り返し行った。
（培地の組成）
発芽用培地（１ Ｌｉｔｅｒ）：
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ） １／２包
スクロース １０ｇ
Ｇｅｌｌｌａｎ Ｇｕｍ （和光製薬） ５ｇ
（ＣＩＭ（１ Ｌｉｔｅｒ））
Ｇａｍｂｏｒｇ’ｓ Ｂ５ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓａｌｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（日本製薬）
１包
グルコース ２０ｇ
ミオイノシトール １００ｍｇ
５％ Ｍｅｓ−ＫＯＨ （ｐＨ５．７） １０ｍｌ
Ｇｅｌｌｌａｎ Ｇｕｍ ５ｇ
オートクレーブ後、以下をくわえる。
塩酸チアミン ２０ｍｇ
ニコチン酸 １ｍｇ
塩酸ピリドキシン １ｍｇ
ビオチン １０ｍｇ
２，４−Ｄ ０．５ｍｇ
カイネチン ０．０５ｍｇ
（ＡＩＭ（１ Ｌｉｔｅｒ））
Ｇａｍｂｏｒｇ’ｓ Ｂ５ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓａｌｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（日本製薬）
１包
グルコース ２０ｇ
５％ Ｍｅｓ−ＫＯＨ （ｐＨ５．７） １０ｍｌ

（結果）
以上の結果、用いた遺伝子（ＧＦＰ、ＧＵＳ（形質転換のコントロール）、ｐｏｌδ（Ｄ３１６Ａ））は、いずれも形質転換効率が９５％以上であった（ＧＦＰを導入した個体のみ測定。ＧＦＰ蛍光を発するか否かでチェックした）。
（進化条件）
以下のような遺伝形質の変化条件に本実施例の植物を暴露した。
変異体の選抜には、以下の条件を用いた。
１）３７℃ プレートを３７℃インキュベーターに入れる。
２）２００ｍＬ ＮａＣｌ 培地に２００ｍＬ ＮａＣｌをくわえ、２２℃で生育させる。
３）３００ｍＬ ＮａＣｌ 培地に３００ｍＬ ＮａＣｌをくわえ、２２℃で生育させる。
（変異の選択結果）
各処理における結果は以下の通りであった。表の数字は、左から順に、無処理と同じくらい生育しているカルスの数（耐性）／あまり生育は良くないが死んではいないカルスの数（弱い耐性）／死んでいるカルスの数（感受性）を示す。

処理 ＧＦＰ ｐｏｌδ
３７℃ ０／２４／２７ １／１８／１０
２００ｍＬ ＮａＣｌ ０／２０／１４５ ０／５８／１１２
３００ｍＬ ＮａＣｌ ０／０／１６５ ０／４／１４６
以上のように、高温処理において、耐性となった植物が増加していた。また、塩濃度に関しては、２００ｍＬ ＮａＣｌでは耐性を示すカルスの個数が、コントロールよりｐｏｌδの方が多かった。従って、塩濃度に対する耐性もまた、本発明の方法によって植物に付与することができることが明らかになった。特に、３００ｍＭ ＮａＣｌでは、コントロールでは、耐性が得られなかったのに対して、本発明の方法では、耐性を得ることができた。
（実施例７：シロイヌナズナを用いた連続耐性実験）
次に、世代を経ても耐性などの遺伝形質の変換が伝播するかどうかを確認した。実験条件は、実施例６と同じものを用いた。
以下に試験した個体数を示す。
Figure 2007143562
＜スクリーニング方法＞
カルスを作製し、ある程度大きくなったら半分に割った。片方は通常培地で元の大きさまで育て、片方は選択培地で培養し耐性獲得を実験した。通常培地のカルスが十分大きくなったら半分を通常培地、半分を選択培地で培養し２回目のスクリーニングとした。以下６回のスクリーニングを行った。３００ｍＭでは耐性カルスが取れなかったため、全ての実験は２００ｍＭで行った。
その模式図を図１６に示す。
＜不連続実験＞
６回のスクリーニングで「不連続」に耐性カルスが出現した個数をカウントする。一度耐性を獲得しても耐性が失われる場合は擬陽性と考えられる。
Figure 2007143562
＜連続実験＞
擬陽性を除くため、連続して耐性を獲得したカルス数をカウントした。６回目までのスクリーニングで連続して耐性を示したカルス数を示す。
Figure 2007143562
このように、連続して耐性を示したのは、変異ｐｏｌδを有する株のみであった。この株は、６世代を経ても、耐性を保持しており、遺伝形質の変換が速度のみならず、安定性
でも従来方法よりも優れていることが明らかになった。
（実施例８：ＥＳ細胞での実験）
次に、ＥＳ細胞でも本発明が実施可能であるかどうかを実証した。以下にその手順を示す。
＜ＥＳ細胞の調製＞
Ｃ５７ＢＬ／６とＣＢＡのＦ１マウス胚由来のＥＳ細胞株（ＴＴ−２細胞）（大阪大学八木研究室で作製された。通常のプロトコールによって作製したものと同じである。）をＥＳ細胞培養液（ＥＳＭ）（２０％ＦＢＳ、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ、１ｍＭ ピルビン酸、ＬＩＦ（エスグロアムラド社）、メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭ培地）を用いてフィーダー細胞上で培養し増殖させた。
導入したベクター（図１７を参照）はタンパク質発現用ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）に変異型Ｐｏｌｄ１，正常型Ｐｏｌｄ１，ＥＧＦＰ遺伝子のｃＤＮＡをそれぞれ組み込んだもので、制限酵素消化により線状化してから、遺伝子導入用に使用した。増殖させておいたＥＳ細胞を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、１つのキュベットあたりＥＳ細胞が２．０×１０６個になるように調製し、２５ｎＭに調製したベクターＤＮＡ溶液１００μｌとよく混和させ、エレクトロポレーション法によって遺伝子導入をおこなった。
エレクトロポレーション後、４８時間はＥＳＭを用いて培養し、その後はＧ４１８（終濃度２００μｇ／ｍＬ）（ＳＩＧＭＡ）を加えたＥＳＭ培地で培養することで、遺伝子導入細胞のセレクションを行った。培養は、ゼラチンコートしたプレート上でおこなった。その後のＥＳ細胞の培養においては、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ 市販品を１００倍希釈で使用）存在下で実験を行った。
＜６ＴＧアッセイ＞
増殖させ、トリプシン（２．５％、ＧＩＢＣＯ）で処理したＥＳ細胞を、１０ｃｍ ｄｉｓｈに５．０×１０６ｃｅｌｌ／ディッシュになるようにまき、６−ＴＧ（終濃度２μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ，ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｔｅｓｔｅｄ）とＧ４１８存在下において、耐性コロニーのセレクションを行った。このセレクションの際も、ゼラチンによりコーティングしたディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ ３５３００３細胞培養ｄｉｓｈに、０．１％ゼラチン溶液を浸し３７℃で３０分インキュベーションしたもの（ゼラチンはｓｉｇｍａ））上で培養した。培地の交換は、二日に一度おこない、細胞を播いた日を０日として、１１日目のコロニーの数を数えた。コロニーは、増殖性がよく大きく成長したもののみをカウントした。
＜実験の結果＞
変異型Ｐｏｌｄ１については、エレクトロポレーションから独立に行ったロットが２種類で、それぞれ＃１，＃２と表示する。すべてについて、１０ｃｍディッシュに６枚ずつ播いて、耐性コロニーの出現を待った。コロニーの数を下に表す。（０×６はコロニーがひとつも生えなかったディッシュが６枚ということを表す）
変異型Ｐｏｌｄ１ ３×１、１×２、０×９
野生型Ｐｏｌｄ１ ０×６
ＥＧＦＰによるコントロール ０×６
本実施例の結果において、増殖してくるコロニーは変異型Ｐｏｌｄ１を導入したものでしかみられなかった。得られたコロニーについては、変異の対象遺伝子であるＨＧＰＲＴ遺伝子の部分の配列決定を行うことによって、変異の導入を確認することができる。
このように、変異型Ｐｏｌｄ１遺伝子の過剰発現により、マウスＥＳ細胞において、変異が入り易いことが明らかになった。従って、ＥＳ細胞でも、遺伝形質の変換が調節可能であり、その速度および安定性が進歩していることが明らかになった。
（実施例９：グラム陽性細菌）
本実施例では、グラム陽性細菌の例として、枯草菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓを宿主細胞として用いて、変異を導入する。変異は、配列番号１５に示されるポリメラーゼＣの４２５位および４２７位の、それぞれアスパラギン酸およびグルタミン酸を変異させる。このポリメラーゼＣ変異体をＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにプラスミド（ｐＨＹ３００ＰＬＫ（ＴＡＫＡＲＡ））にて導入後、進化すべき条件にかける。
この変異株を作製後、例えば、中程度の高温（例えば、４２℃）から徐々に温度を５０℃以上に上昇させる。
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、最も良く研究された土壌細菌の一種であり、成育温度は、２０−５０℃、ｐＨ ６−７、３０分で菌体は２倍に増殖するといわれている。
上述のように、進化条件にかけた場合、本実施例のＢａｃｉｌｌｕｓは、５５℃でも生育する株が得られる。この株は、継代してもその性質が保たれていることが分かる。
従って、大腸菌とは異なるＤＮＡ複製メカニズムを有する細菌であっても、進化の速度を調節することができることがわかる。
（実施例１０：遺伝子の取り出し）
本実施例では、遺伝形質の変化を担う遺伝子を単離する。ここでは、実施例１において薬剤耐性を獲得した生物を単離し、その後、改変前のオリジナルの生物および改変後の生物において、薬剤耐性を担うと考えられる遺伝子の配列を決定する。その結果、ジャイレース（またはトポイソメラーゼＩＩ）サブユニットＡおよびトポイソメラーゼＩＶ遺伝子が改変されていることがわかる。この配列を適切なプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、全長遺伝子を単離する。その遺伝子を改変前のものおよび改変後のものをポリペプチド合成し、活性を測定すると、確かに活性が変化していることがわかる。このように、本発明の方法は、実際に、遺伝子レベルで迅速に変異を導入することができることが明らかになる。
（実施例１１：新規生産物質の取り出し）
本実施例では、改変の結果得られた新規生産物質を単離する。ここでは、実施例１において薬剤耐性を獲得した生物を単離し、その後、ＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー分析（例えば、ＨＰＬＣなど）によって、改変前のオリジナルの生物には存在せず、改変後の生物において存在する物質を同定し、これを新規生産物質として単離する。その結果、ジャイレース（またはトポイソメラーゼＩＩ）サブユニットＡおよびトポイソメラーゼＩＶ遺伝子産物が新規生産物質であることがわかる。このように、本発明の方法は、実際に、新規生産物質を生産するにおいても有用であることが明らかになる。
（実施例１２：他のエラープローン頻度改変方法）
上記変異に変えて、ポリメラーゼδおよびεのポリメラーゼ部分の活性を障害する変異を導入し、ＤＮＡ複製の精度を下げることも可能である。
（実施例１３：エラープローン頻度と進化速度の関係）
上記実施例１で得られた酵母の薬剤耐性獲得、アルコール耐性獲得、および高温度耐性
獲得実験において、対照として従来の変異の入れ方（放射線、化学薬品修理など）を用いたものと比較する。これらの従来の変異の入れ方における上述の耐性獲得スピードは、本発明において顕著に上昇した。これは、同時期に実験を開始して、本実施例では耐性獲得株が得られたのに対して、従来技術では得られていないことに如実に反映されている。
また、本実施例において変異率が段階的に違ったものを使用し、耐性獲得のタイムコースを比較することによって、進化速度を算出することができる。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
本発明によって、従来の方法に比べて、所望の形質を生物に迅速にかつ生物に対して有害な影響をほとんど与えずに、付与することが達成された。また、本発明によれば、簡便な操作により、生物の遺伝形質を改変することができる。これにより、従来の方法では得ることができなかったような、有用な生物、遺伝子、遺伝子産物、代謝物などを効率よく得ることができる。
本発明の例示的実施例である実施例１における変異型および野生型が実質的に同じ成長曲線を示すことを示す。 本発明の例示的実施例である実施例１における高温耐性の付与の様子を示す例である。 Ａは、本発明の例示的実施例である実施例１における高温耐性の付与の様子を示す写真が示される。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｏｌ３変異株（DNAポリメラーゼδのエクソヌクレアーゼ欠損）から高温でも生育できる変異株を単離した。＊印が親株（ＡＭＹ１２８−１）で他の７つは取得した高温耐性変異株である。 Ｂは、本発明の例示的実施例である実施例１における高温耐性の付与の様子を示す別の写真が示される。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｏｌ２変異株（ＤＮＡポリメラーゼεのエクソヌクレアーゼ欠損）から高温でも生育できる変異株を単離した。＊印が親株（ＡＭＹ２−６）で他の７つは取得した高温耐性変異株である。 Ａは、本発明の例示的実施例である実施例１における高温付与の様子を示す写真である。矢印は、死滅して気泡が入っている細胞である。高温耐性株１および２は、別の独立した系で行った実験例である。このように、親株では４１℃では生存できる細胞はいなかったが、本発明で技術で得られた高温耐性株は、４１℃でも生存することができた。 Ｂは、例示的実施例である実施例１における高温耐性の付与の様子を示す別の写真が示される。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｏｌ２変異株（ＤＮＡポリメラーゼεのエクソヌクレアーゼ欠損）から４１℃という酵母では考えられない高温でも生育できる変異株を単離した。一番上が親株（ＡＭＹ２−６）で他の７つは取得した高温耐性変異株である。 均一複製精度および不均一複製精度を有する準種の例。 エラーカタストロフィーを示す例。 種々の数の複製因子でのエラーフリーポリメラーゼの相対濃度の函数としてエラー閾値を示す。 Ｅ．ｃｏｌｉのパラメータに基づいて許容可能な誤差率の例を示す。 図９は、トランスジェニックマウスに入れるベクターの概略である。 図１０は、ＰＣＲによる外来遺伝子の確認。左から、ｍＰＧＫ２ Ｔｇあり、ｍＰＧＫ２ Ｔｇなし、Ｆｔｈ１１７ Ｔｇあり、ｍＰＧＫ２ Ｔｇベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔのみ（コントロール）（それぞれ、トランスジェニックマウス＃１）を示し、続いて、＃２マウス Ｔｇなし、＃２マウス Ｔｇあり、＃２Ｔｇベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（それぞれトランスジェニックマウス＃２）を示し、右端はマーカーを示す。 マウス精巣におけるＣｒｅリコンビナーゼの発現を示す。ａは、ｍＰＧＫ２を示し、ｂは、Ｆｔｈ１１７を示し、ｃはコントロールを示す。バーは５０μｍを示す。 図１２は、ｍＰＧＫ２プロモーターによる発現領域を示す。 図１３は、Ｆｔｈ１１７プロモーターによる発現領域を示す。 図１４は、ターゲティング用ベクターの概略図を示す。 図１５は、組織特異的組み換え反応の模式図を示す。 図１６は、カルスを用いたスクリーニング法の概略を示す。 図１７は、実施例８におけるＥＳ細胞の実験に用いたベクターの概略図を示す。 図１８は、Ｃｒｅ リコンビナーゼを用いた組み換え（ターゲティング）ベクターの概略図を示す。
（配列の説明）
配列番号１：酵母ＤＮＡポリメラーゼδ 核酸配列
配列番号２：酵母ＤＮＡポリメラーゼδ アミノ酸配列
配列番号３：酵母ＤＮＡポリメラーゼε 核酸配列
配列番号４：酵母ＤＮＡポリメラーゼε アミノ酸配列
配列番号５：ＤｎａＱ部分配列（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
配列番号６：ＤｎａＱ部分配列（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）
配列番号７：ＤｎａＱ部分配列（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）
配列番号８：ＤｎａＱ部分配列（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）
配列番号９：ＤｎａＱ部分配列（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）
配列番号１０：ＤｎａＱ部分配列（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）
配列番号１１：ＤｎａＱ部分配列（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）
配列番号１２：ＤｎａＱ部分配列（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）配列番号１３：ＤｎａＱ部分配列（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ ｓｔｒ．３０１）
配列番号１４：ＰｏｌＣ部分配列（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）
配列番号１５：ＰｏｌＣ部分配列（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
配列番号１６：ＰｏｌＣ部分配列（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｕｌｍｏｎｉｓ）
配列番号１７：ＰｏｌＣ部分配列（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）
配列番号１８：ＰｏｌＣ部分配列（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）
配列番号１９：Ｐｏｌ ＩＩＩ部分配列（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
配列番号２０：Ｐｏｌ ＩＩ部分配列（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
配列番号２１：Ｐｏｌ ｄｅｌｔａ部分配列（マウス）
配列番号２２：Ｐｏｌ ｅｐｓｉｌｏｎ部分配列（マウス）
配列番号２３：Ｐｏｌ ｄｅｌｔａ部分配列（ヒト）
配列番号２４：Ｐｏｌ ｅｐｓｉｌｏｎ部分配列（ヒト）
配列番号２５：Ｐｏｌ ｄｅｌｔａ部分配列（イネ）
配列番号２６：Ｐｏｌ ｄｅｌｔａ部分配列（シロイヌナズナ）
配列番号２７：Ｐｏｌ ｅｐｓｉｌｏｎ部分配列（シロイヌナズナ）
配列番号２８：Ｐｏｌ ｄｅｌｔａ部分配列（ラット）
配列番号２９：Ｐｏｌ ｄｅｌｔａ部分配列（ウシ）
配列番号３０：Ｐｏｌ ｄｅｌｔａ部分配列（ダイズ）
配列番号３１：Ｐｏｌ ｄｅｌｔａ部分配列（ショウジョウバエ）
配列番号３２：Ｐｏｌ ｅｐｓｉｌｏｎ部分配列（ショウジョウバエ）
配列番号３３：Ｐｏｌδ 酵母改変核酸配列
配列番号３４：Ｐｏｌδ 酵母改変アミノ配列
配列番号３５：Ｐｏｌε 酵母改変核酸配列
配列番号３６：Ｐｏｌε 酵母改変アミノ配列
配列番号３７：Ｐｏｌδ 正方向プライマー
配列番号３８：Ｐｏｌδ 逆正方向プライマー
配列番号３９：Ｐｏｌε 正方向プライマー
配列番号４０：Ｐｏｌε 逆方向プライマー
配列番号４１：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤｎａＱ 核酸配列
配列番号４２：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤｎａＱ アミノ配列
配列番号４３：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＰｏｌＣ 核酸配列
配列番号４４：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＰｏｌＣ アミノ配列
配列番号４５：シロイヌナズナ Ｐｏｌ ｄｅｌｔａ アミノ配列
配列番号４６：シロイヌナズナ Ｐｏｌ ｅｐｓｉｌｏｎ アミノ配列
配列番号４７：イネＰｏｌδ 核酸配列
配列番号４８：イネＰｏｌδ アミノ配列
配列番号４９：ダイズＰｏｌδ 核酸配列
配列番号５０：ダイズＰｏｌδ アミノ配列
配列番号５１：ヒトＰｏｌδ 核酸配列
配列番号５２：ヒトＰｏｌδ アミノ配列
配列番号５３：ヒトＰｏｌε 核酸配列
配列番号５４：ヒトＰｏｌε アミノ配列
配列番号５５：マウスＰｏｌδ 核酸配列
配列番号５６：マウスＰｏｌδ アミノ配列
配列番号５７：マウスＰｏｌε 核酸配列
配列番号５８：マウスＰｏｌε アミノ配列
配列番号５９：ラットＰｏｌδ 核酸配列
配列番号６０：ラットＰｏｌδ アミノ配列
配列番号６１：ウシＰｏｌδ 核酸配列
配列番号６２：ウシＰｏｌδ アミノ配列
配列番号６３：ショウジョウバエＰｏｌδ 核酸配列
配列番号６４：ショウジョウバエＰｏｌδ アミノ配列
配列番号６５：ショウジョウバエＰｏｌε 核酸配列
配列番号６６：ショウジョウバエＰｏｌε アミノ配列
配列番号６７：Ｐｏｌｄ１遺伝子の５’末端側プライマーＳｐｅＩ−５’Ｐｏｌｄ１
配列番号６８：Ｐｏｌｄ１遺伝子の３’末端側プライマーＥｃｏＲＩ−３’Ｐｏｌｄ１
配列番号６９：Ｐｏｌｄ１遺伝子の変異導入用プライマー配列（実施例４）
配列番号７０：Ｐｏｌｄ１遺伝子の変異ｃＤＮＡの配列（実施例４）
配列番号７１：ｍＰＧＫ２の５’ｍＰＧＫ２−ｓａｃＩＩ プライマー
配列番号７２：ｍＰＧＫ２の３’ｍＰＧＫ２−ＳｐｅＩプライマー
配列番号７３：Ｆｔｈｌ１７の５’Ｆｔｈｌ１７−ｓａｃＩＩプライマー
配列番号７４：Ｆｔｈｌ１７の３’Ｆｔｈｌ１７−ＳｐｅＩプライマー
配列番号７５：トランスジェニックマウス＃１のＣｒｅ−Ｆプライマー
配列番号７６：トランスジェニックマウス＃１のＣｒｅ−Ｒプライマー
配列番号７７：トランスジェニックマウス＃２のＮｅｏ−Ｆプライマー
配列番号７８：トランスジェニックマウス＃２のＮｅｏ−Ｒプライマー
配列番号７９：実施例４のｍＲＮＡの発現確認のためのＮｅｏ−Ｆプライマー
配列番号８０：実施例４のｍＲＮＡの発現確認のためのＮｅｏ−Ｒプライマー
配列番号８１：Ｆｔｈｌ１７の上流の約５．７ｋｂｐの配列
配列番号８２：シロイヌナズナ由来ｐｏｌδの増幅のためのＸｂａ１−４２１２０−Ｆ
配列番号８３：シロイヌナズナ由来ｐｏｌδの増幅のための２ｇ４２１２０−Ｓａｃ１−Ｒ
配列番号８４：変異型ｐｏｌδ遺伝子ｐｏｌδ（Ｄ３１６Ａ）の増幅のための２ｇ４２１２０−Ｄ３１６Ａ−Ｆ
配列番号８５：変異型ｐｏｌδ遺伝子ｐｏｌδ（Ｄ３１６Ａ）の増幅のための２ｇ４２１２０Ｒ
配列番号８６：マウス精巣由来のＫｏｚａｋ配列を含むＰｏｌｄ１遺伝子（核酸配列）
配列番号８７：マウス精巣由来のＫｏｚａｋ配列を含むＰｏｌｄ１遺伝子（アミノ酸配列）
配列番号８８：マウスｐｏｌδ遺伝子変異型（Ｄ４００Ａ）の核酸配列
配列番号８９：マウスｐｏｌδ遺伝子変異型（Ｄ４００Ａ）のアミノ酸配列
配列番号９０：ｐｏｌδ（Ａｔ１ｇ４２１２０）の核酸配列
配列番号９１：ｐｏｌδ（Ａｔ１ｇ４２１２０）のアミノ酸配列
配列番号９２：変異型ｐｏｌδ遺伝子ｐｏｌδ（Ｄ３１６Ａ）（核酸配列）
配列番号９３：変異型ｐｏｌδ遺伝子ｐｏｌδ（Ｄ３１６Ａ）（アミノ酸配列）
配列番号９４：４５５−ｂｐのｍＰＧＫ２プロモーターの断片
配列番号９５：５７２５−ｂｐのＦｔｈｌ１７遺伝子の上流配列のＤＮＡ断片

Claims (5)

  1. 細胞の遺伝形質の変換速度を調節する方法であって、
    （ａ）該細胞の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節する工程、
    を包含する、方法。
  2. 生物の遺伝形質の変換速度を調節するために使用するための、少なくとも２つのポリメラーゼのセットであって、該ポリメラーゼのエラープローン頻度は互いに異なる、セット。
  3. 前記少なくとも２つのポリメラーゼのうち少なくとも１つはラギング鎖のエラープローン頻度に関与し、少なくとも別の一つはリーディング鎖のエラープローン頻度に関与する、請求項２に記載のセット。
  4. 前記ポリメラーゼのセットは、同一種生物由来である、請求項２に記載のセット。
  5. 生物の遺伝形質の変換速度を調節するための、少なくとも２つのポリメラーゼのセットの使用であって、該ポリメラーゼのエラープローン頻度は互いに異なる、使用。
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