CN113526999A - 小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液及制备方法，该培养液由以下化合物和对应的用量配制而成：磷酸二氢钾1～1.5g/L，尿素1.3～1.7g/L，硼酸80～120mg/L，柠檬酸16～24mg/L，2,4‑D 46～54mg/L，蔗糖15～25g/L。本发明不含有亚硫酸和硝酸银成分且所用化合物用量减半，更换营养液间隔由3天延长至7天且只需更换1次，减少人工投入，从而降低双单倍体生产成本，并且有效提升成胚率，提高颖果千粒重和饱满度，有利于颖果是否有胚检测。

Description

小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液及制备方法

技术领域

本发明涉及农业杂交技术领域，特别涉及一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液及制备方法。

背景技术

双单倍体(doubled haploid，DH)技术可使杂合育种材料在一个世代纯合稳定，加速育种进程，成倍提高育种效率。把DH技术与分子设计育种整合构建“快速、精准”高效育种技术体系，已成为作物高效育种技术的一个重要发展方向(Li at al.,2020；Kalinowskaet al.,2019；Kelliher et al.,2019；Wang et al.,2019)。此外，单倍体和双单倍体在基因功能、转基因研究以及遗传群体构建等方面也有重要应用价值(Grewal et al.,2021；Liu et al.,2020)。

双单倍体由单倍体经人工或自然染色体加倍产生。随着单倍体诱导技术和染色体加倍技术不断完善，双单倍体技术已在玉米(Kelliheret al.,2017；Liu et al.,2017)、水稻(Liu et al.,2017)、油菜(Forster et al.,2007；李栒等，2003)、大麦(Kasha et al.,1970,)和小麦(Liu et al.,2002)等作物育种上广泛应用。

小麦×玉米远缘杂交是国际上公认的产生小麦单倍体效率最高的途径之一，已在国内外小麦遗传育种上广泛研究、应用(Skrzypek et al.,2018；Ishii et al.,2016；Niuet al.,2014；Laurie et al.,1986)。

该技术在育种上广泛应用的首要条件是单倍体胚的诱导率(或简称“得胚率”，指平均每授粉100个小麦小花实际能得到的单倍体胚个数)高且稳定，一般应在50％以上，越高越好。因为最终要得到足够数量的双单倍体苗，首先必须有足够数量的胚。研究表明，单倍体胚的诱导率受麦穗离体培养的营养成分影响，即穗培养液配方的影响。

前期研究麦穗离体培养液可诱导单倍体胚约30％诱导率，配方包括磷酸二氢钾2.5g/L，尿素3g/L，亚硫酸8ml/L，硝酸银100mg/L，2,4-D 100mg/L，蔗糖40g/L(专利号：ZL201410000309.0)，成胚率较低，配方中有硝酸银和亚硫酸成分，银属于重金属，亚硫酸易挥发、气味刺鼻，都属于危险化学试剂，对操作人员身体健康存在潜在威胁，培养后的剩余培养液需进行集中特殊处理，且该配方间隔3天需更换1次营养液，操作繁琐。另外，该配方中有硝酸银，银离子易与其他离子形成沉淀，影响培养效果。

小麦玉米杂交诱导小麦双单倍体技术操作过程中，单倍体胚检测接种是整个技术体系中最为耗时耗工的环节，需要在显微镜下检测每个颖果是否有胚，将胚转接到培养基上进行培养。由于成胚率仅约30％，即70％颖果都不含胚，但仍需人工在显微镜下进行鉴定，不仅增加了工作量还增加了接种时污染风险。鉴于此我们发明了颖果是否有胚检测装置(专利号：ZL201821703150.9)，可以无需再显微镜下检测颖果中是否有胚，使接种效率提高2倍以上，但检测效果依赖颖果质量(饱满度，也就是千粒重，千粒重越高饱满度越好)，颖果质量越好，越有利于检测。

因此，需要研究一种能够大幅提高小麦玉米杂交诱导小麦单倍体成胚率的颖果千粒重的离体培养液配方，提高小麦双单倍体生产效率，降低双单倍体单位生产成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高小麦玉米杂交诱导单倍体胚成胚率和颖果千粒重的麦穗离体培养液及制备方法，不含有亚硫酸和硝酸银成分且所用化合物含量减半，更换营养液间隔由3天延长至7天且只需更换1次，减少人工投入，降低双单倍体生产成本，并且有效提高成胚率，提高颖果千粒重和饱满度。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种提高小麦玉米杂交诱导单倍体胚成胚率和颖果千粒重的麦穗离体培养液，该培养液配方由以下化合物和对应的用量配制而成：磷酸二氢钾1～1.5g/L，尿素1.3～1.7g/L，硼酸80～120mg/L，柠檬酸16～24mg/L，2,4-D 46～54mg/L，蔗糖15～25g/L。

进一步优选：该培养液由以下化合物和对应的用量配制而成：培养液配方磷酸二氢钾1.25g/L，尿素1.5g/L，硼酸100mg/L，柠檬酸20mg/L，2,4-D 50mg/L，蔗糖20g/L。

本发明所述的小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液的制备方法，包括以下步骤：

1)配制磷酸二氢钾40×母液，即按照营养液中磷酸二氢钾的含量称量40份，1L容量瓶放入500ml蒸馏水，将称量的磷酸二氢钾放入容量瓶中溶解后，定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；

2)配制尿素40×母液，即按照营养液中尿素的含量称量40份，1L容量瓶放入500ml蒸馏水，将称量的尿素放入容量瓶中溶解后，定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；

3)配制硼酸50×母液，即按照营养液中硼酸的含量称量50份，1L容量瓶放入500ml蒸馏水，将称量的硼酸放入容量瓶中溶解后，定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；

4)配制2,4-D 40×母液，即按照营养液中2,4-D的含量称量40份，放入50ml无水乙醇中，待2,4-D完全溶解倒入1L容量瓶定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；

5)配制柠檬酸50×母液，即按照营养液配方中柠檬酸的含量称量50份，1L容量瓶放入500ml蒸馏水，将称量的柠檬酸放入容量瓶中溶解后，定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；

6)营养液配制

取磷酸二氢钾配40×母液25ml；

取尿素40×母液25ml；

取硼酸50×母液20ml；

取2,4-D 40×母液25ml；

取柠檬酸50×母液20ml；

取蔗糖20g；

将上述成分依次放入盛有885ml蒸馏水烧杯中，待蔗糖完全融化摇匀，1L营养液即配制完成。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

其一、与现有离体培养培养液相比，所用化合物含量减半，不含有亚硫酸和硝酸银成分，没有亚硫酸挥发刺激性气体、银离子生成沉淀影响培养效果，没有处理剩余含银离子培养液的麻烦；

其二、更换营养液间隔从原来3天，变为现在7天，整个培养期间现有培养液需换液3次，本发明营养液仅需换液1次，极大的降低了人工成本；

其三、成胚率提高近1倍，且培养出的颖果质量本发明优于现有培养液；

其四、利用本发明培养液培育出的硕果透明度高，易于观察颖果中是否有胚。

附图说明

图1是使用本发明与现有培养液颖果质量对比图；

图2是使用本发明与现有培养液颖果是否有胚检测效果对比图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

实施例，该培养液由以下化合物和对应的用量配制而成：培养液配方磷酸二氢钾1.25g/L，尿素1.5g/L，硼酸100mg/L，柠檬酸20mg/L，2,4-D 50mg/L，蔗糖20g/L。

营养液制备包括以下步骤：

1)配制磷酸二氢钾40×母液，即称量50g磷酸二氢钾，1L容量瓶放入500ml蒸馏水，将称量的磷酸二氢钾放入容量瓶中溶解后，定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；

2)配制尿素40×母液，即称量60g尿素，1L容量瓶放入500ml蒸馏水，将称量的尿素放入容量瓶中溶解后，定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；

3)配制硼酸50×母液，即称量5.0g硼酸，1L容量瓶放入500ml蒸馏水，将称量的硼酸放入容量瓶中溶解后，定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；

4)配制2,4-D 40×母液，即称量2g 2,4-D，放入200ml 0.1mol/L氢氧化钠溶液中，待2,4-D完全溶解倒入1L容量瓶定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；

5)配制柠檬酸50×母液，即称量1g柠檬酸，放入500ml蒸馏水，将称量的柠檬酸溶解后，定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；

6)营养液配制

取磷酸二氢钾配40×母液25ml；

取尿素40×母液25ml；

取硼酸50×母液20ml；

取2,4-D 40×母液25ml；

取柠檬酸50×母液20ml；

取蔗糖20g；

将上述成分依次放入盛有885ml蒸馏水烧杯中，待蔗糖完全融化摇匀，1L营养液即配制完成。

2020年5月-9月，以云麦52号DH系为材料，“白甜糯”为玉米花粉供体，诱导云麦52号产生单倍体胚。

云麦52号抽穗开花前选取大小和发育程度尽可能一致的穗子，进行常规剪颖去雄(去掉最上部、最下部小穗及中部中间小花)，然后套袋隔离。待柱头发育成熟时(柱头上部羽毛蓬松散开)用新鲜玉米花粉(当天9：00-11：00开花盛期，收集的玉米花粉)授粉，授粉24h后，将杂交穗沿地面根部剪下插入清水中带回实验室，逐穗喷施100mg/L 2,4-D，将穗子平均分成2份，每份50穗，分别插在盛有现有配方培养液和本发明配方的培养液，置于人工气候箱中培养(培养条件：温度23℃，相对湿度80％，光照8000Lx 14h/d)，现有配方营养液中麦穗每隔3天更换1次营养液，本发明间隔7天更换1次营养液。

现有培养液颖果千粒重3.87g，颖果结实率90.08％，得胚率28.19％；本发明培养液颖果千粒重7.43g，颖果结实率94.16％，得胚率55.43％。可见，本发明营养液使颖果千粒重提高近1倍，参照图1，(左图为本发明营养液培养的颖果，右图为现有培养液培养的颖果)，大大提高了颖果的质量。利用装置检测发现得胚率也提高了近1倍，参照图2，左侧为颖果质量好(千粒重高)，透明度高，易于观察颖果中是否有胚(本发明穗离体培养液配方)，右侧为颖果质量不好(千粒重低)，透明度低，较难观察颖果中是否有胚(原培养液配方)。且本发明更换营养液次数减少2次，降低了人工成本和材料成本(营养液用量仅为现有1/3)，同时本发明营养液中无重金属和刺激性等危险化学成分。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (3)

1.一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液，其特征在于，该培养液由以下化合物和对应的用量配制而成：磷酸二氢钾1～1.5g/L，尿素1.3～1.7g/L，硼酸80～120mg/L，柠檬酸16～24mg/L，2,4-D46～54mg/L，蔗糖15～25g/L。

2.根据权利要求1所述的一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液，其特征在于，该培养液由以下化合物和对应的用量配制而成：磷酸二氢钾1.25g/L，尿素1.5g/L，硼酸100mg/L，柠檬酸20mg/L，2,4-D50mg/L，蔗糖20g/L。

3.根据权利要求1或2任意一项所述的一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)配制磷酸二氢钾40×母液，即按照营养液配方中磷酸二氢钾的含量称量40份，1L容量瓶放入500ml蒸馏水，将称量的磷酸二氢钾放入容量瓶中溶解后，定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；

2)配制尿素40×母液，即按照营养液配方中尿素的含量称量40份，1L容量瓶放入500ml蒸馏水，将称量的尿素放入容量瓶中溶解后，定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；

3)配制硼酸50×母液，即按照营养液配方中硼酸的含量称量50份，1L容量瓶放入500ml蒸馏水，将称量的硼酸放入容量瓶中溶解后，定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；

4)配制2,4-D40×母液，即按照营养液配方中2,4-D的含量称量40份，放入200ml0.1mol/L氢氧化钠溶液，待2,4-D完全溶解倒入1L容量瓶定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；

5)配制柠檬酸50×母液，即按照营养液配方中柠檬酸的含量称量50份，1L容量瓶放入500ml蒸馏水，将称量的柠檬酸放入容量瓶中溶解后，定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；

6)营养液配制

取磷酸二氢钾配40×母液25ml；

取尿素40×母液25ml；

取硼酸50×母液20ml；

取2,4-D40×母液25ml；

取柠檬酸50×母液20ml；

取蔗糖20g；

将上述成分依次放入盛有885ml蒸馏水烧杯中，待蔗糖完全融化摇匀，1L营养液即配制完成。

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