KR20020080190A - 저산소-반응성 프로모터, 그를 이용한 목적 유전자의 대량발현 방법 및 이 방법에 의해 목적 유전자에 선택적으로ｒｎａ 간섭을 유도하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은서열번호 2로 기재되는 저산소-반응성 프로모터 (hypoxia-responsive promoter), 상기 프로모터 뒤에 목적 유전자를 연결시킨 발현벡터를 이용하여 목적 유전자를 대량으로 발현시키는 방법 및 이 방법에 의해 생물체 내에 도입된 목적 유전자에 선택적으로 RNA 간섭을 유도하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 저산소-반응성 프로모터는 열 충격 대신 저산소 조건 하에서 목적 유전자의 전사를 촉진하여 개체 전체에 부수적인 결함을 유발하지 않으면서 목적하는 유전자에 선택적으로 in vivo RNA 간섭 (interference)을 유도함으로써 유전자의 기능을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있을 뿐 아니라 유용 단백질의 대량 생산에도 이용될 수 있다.

Description

저산소-반응성 프로모터, 그를 이용한 목적 유전자의 대량 발현 방법 및 이 방법에 의해 목적 유전자에 선택적으로 ＲＮＡ 간섭을 유도하는 방법{HYPOXIA-RESPONSIVE PROMOTER, METHOD FOR THE MASS EXPRESSION OF A DESIRED GENE BY USING THE SAME AND METHOD FOR SELECTIVELY INDUCING RNA INTERFERENCE TO A DESIRED GENE THEREBY}

본 발명은서열번호 2로 기재되는 저산소-반응성 프로모터 (hypoxia-responsive promoter), 상기 프로모터 뒤에 목적 유전자를 연결시킨 발현벡터를 이용하여 목적 유전자를 대량으로 발현시키는 방법 및 이 방법에 의해 생물체 내에 도입된 목적 유전자에 선택적으로 RNA 간섭을 유도하는 방법에 관한 것이다.

유전자의 기능을 분석하기 위하여 무작위적인 변이유도 (Random mutagenesis)를 통해 특정 유전자의 돌연변이체를 얻는 과정은 궁극적인 유전학적 연구를 위해 필요하지만 상당한 시간과 노력이 소모된다는 단점을 가진다. 최근에는 RNA 간섭 (RNA interference, RNAi)에 의해 일시적이지만 손쉽게 유전자 발현억제의 표현형질을 획득할 수 있는 방법이 개발되었다 (Fire et al.,Nature, 391:806-811, 1998). RNAi 실험은 시험관 내에서 안티센스 (antisense) RNA와 센스 (sense) RNA를 합성하고, 그 혼합물을 선충에 미세주입한 후 그 자손에서 특정 유전자의 발현억제에 따른 표현형질을 관찰하는 것으로, RNAi에서는 특정 유전자에 대한 이중가닥 RNA (double-stranded RNA)를 미세주입 (microinjection) 시킨 성충의 자손에서 해당 유전자의 발현이 억제되며, 그로 인한 표현형질은 유전자 염기서열의 변화 없이 나타나게 된다.

RNAi는 세포 내에 도입된 이중 가닥 RNA가 내생적 mRNA에 혼성화되어 대응하는 유전자의 강력하고 특이적인 억제가 나타난 선충에서 처음으로 관찰된 현상으로서, 유전자-특이적인 기능의 손실 (gene specific loss of function)을 재빠르게 유도할 뿐 아니라 RNA 간섭을 받은 동물의 자손에게도 동일한 영향을 미치게 된다. 따라서, RNAi는 현재 선충에서 유전자를 억제시키기 위한 가장 간단하고 효과적인 방법으로서 선택적이고 지속적인 간섭 효과를 나타내기 때문에 이중가닥 RNA를 이용한 유전자 발현의 RNAi는 특이 유전자의 기능을 규명하기 위한 역방향-유전학적 연구 (reverse genetic study)의 도구로서 그 중요성이 대두되고 있다.

RNAi에서 특이적인 RNA의 상보적 가닥이 결합하여 생산된 이중가닥 RNA는 단백질 발현에 대한 매우 강력하고 선택적인 간섭을 하게 된다. 이러한 이중가닥 RNA의 주입은 원래 성체의 생식선 (gonad)에서 이루어져 왔으나, 생식선 이외의 모든 부위에 주입된 이중가닥 RNA 역시 성체에서 돌연변이 표현형질을 유도할 수 있음이 보고되었다. 더욱이, 이중가닥 RNA를 생산하도록 조작된 세균을 선충에 먹이거나 (feeding) 이중가닥 RNA 용액에 선충을 잠기게 (soaking) 함으로써 돌연변이 표현형질을 생산할 수 있다. 놀랍게도, 이러한 현상은 성체 선충의 자손에게 전달되어 발생의 전 단계에 거쳐 표현형질에 대한 연구를 가능케 하는 장점을 가지고 있다.

이중가닥 RNA가 목적하는 유전자의 발현을 억제하는 기작에 대해서는 아직까지 완벽하게 알려져 있지 않다. 현재까지 연구결과에 의하면, 목적하는 유전자는 RNA 간섭에 의하여 돌연변이화된 것처럼 보이지 않으며 유전자의 전사 역시 이중가닥 RNA의 존재 하에서 중단되지는 않지만 목적 유전자에 의해 생산된 mRNA는 세포질 (cytoplasm) 내에 존재하지 않으며 핵 내에서 감소하게 된다. 이러한 결과는 이중가닥 RNA가 단백질 번역 (protein translation) 전이 아니라 RNA 프로세싱 (processing) 동안 또는 그에 이어서 간섭 효과를 발휘함을 나타내는 것이다.

최근에, 유전자 발현에 대한 RNAi가 선충 (Caenorhabditis elegans) (Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E. & Mello, C. C.,Nature(London) 391, 806811, 1998; Montgomery, M. K., Xu, S. & Fire, A.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA95, 1550215507, 1998; Shi, Y. & Mello, C.,Genes Dev., 12, 943955, 1998; Tabara, H., Grishok, A. & Mello, C. C.,Science282, 430431, 1998; Timmons, L. & Fire, A.,Nature(London) 395, 854 (lett.), 1998)를 비롯하여 식물 (Voinnet, O., Vain, P., Angell, S. & Baulcombe, D. C.,Cell, 95, 177187, 1998; Waterhouse, P. M., Graham, M. W. & Wang, M.-B.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA95, 1395913964, 1998), 초파리 (Drosophila) (Kennerdell, J. R. & Carthew, R. W.,Cell, 95, 10171026, 1998; Misquitta, L. & Paterson, B. M.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA96, 14511456, 1998), 트리파노조마 브루세이(Triponizoma brucei) (Ngo, H., Tschudi, C., Guli, K. & Ullu, E.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA95, 1468714692, 1998) 및 플라나리아 (planarian) (Alvarado, A. S. & Newmark, P. A.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA96, 50495054, 1999) 등에서 보고된 바 있다

상기한 바와 같이 유전자의 기능을 밝히기 위하여 최근에 많이 사용되고 있는 RNAi 방법은 손쉽게 수행하고 빠른 시간 안에 기능을 유추할 수 있다는 강력한 이점을 가지고 있지만 특정 발생시점에서 선택적인 RNA 간섭을 수행하기 어렵다는 단점을 가지고 있다. 따라서 이러한 단점을 극복하기 위한 방법의 연구가 활발하게 진행되어 왔고 특정 시점에 RNAi를 수행할 수 있는 방법으로 열 충격 프로모터 (heat shock promoter)를 이용하는 방법이 개발되었다 (Nektaris T. et al.,Nature genetics, 24:180-183, 2000). 그러나, 상기 방법은 개체 전체에 열 충격에 의한 부수적인 결함을 유발하는 단점을 가지고 있어 새로운 생체내 RNAi 방법의 개발 필요성이 증대되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 목적하는 유전자에 대해 선택적으로 생체내 RNA 간섭을 유도하여 유전자 기능을 분석할 수 있는 유전학적 도구를 개발하고자 예의 노력한 결과, 기존에 열 충격 단백질 유전자로 알려져 있는 hsp16A 유전자가 열 충격 뿐 아니라 저산소 (hypoxia) 조건에 의해서도 그 발현이 급격히 증가됨을 발견하고 이를 조절하는 저산소-반응성 프로모터 부위를 분석하여 상기 저산소-반응성 프로모터를 이용하여 목적 유전자를 대량으로 발현시키는 방법 및 이 방법을 이용하여 목적 유전자에 선택적으로 RNA 간섭을 유도하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 저산소 조건에서 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 저산소-반응성 프로모터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 프로모터를 이용하여 목적 유전자를 대량으로 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 상기 프로모터를 이용하여 열 충격과 같이 개체 전체에 부수적인 결함을 유발하지 않으면서 목적하는 유전자에 선택적으로 생체내 RNA 간섭을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 알코올에 노출된 선충에서 전사발현이 변화되는 유전자들을 찾기 위한 마이크로어레이 (microarray) 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의 hsp16A 유전자의 전사 조절이 열 충격에 의해서 뿐 아니라 저산소 충격에 의해서도 조절됨을 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명에서 hsp16A 유전자의 저산소-유도성 전사 조절에 관여하는 프로모터의 저산소-반응성 부위 (hypoxia-responsive element)를 결정하기 위하여 제작된 다양한 프로모터 유사체의 모식도를 나타낸 것이고,

도 4는 본 발명의 hsp16A 유전자 이외에 다른 hsp16 유전자들의 전사 조절이 저산소 충격에 의해서 조절되는지 확인한 결과이고,

도 5는 본 발명의 저산소-반응성 hsp16A 프로모터를 이용한 생체내 RNAi 분석방법을 검증하기 위하여 제작된 hsp16A 프로모터 융합 apm-1의 센스 (sense) 및안티센스 (antisense) 컨스트럭트를 나타낸 것이고,

도 6은 본 발명의 저산소-반응성 hsp16A 프로모터를 이용한 apm-1 유전자의 생체내 RNAi에 의해 나타난 표현형질을 보여준 것이고,

도 7a및7b는 본 발명의 저산소-반응성 hsp16A 프로모터를 이용한 생체내 RNAi 분석방법에 사용될 수 있는 프로모터 융합 컨스트럭트의 가능한 모식도를 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 저산소 충격에 의해 발현이 유도되는서열번호 2로 기재되는 염기서열을 포함하는 저산소-반응성 프로모터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 hsp16A 유전자의 저산소-반응성 프로모터를 이용하여 목적 유전자를 대량으로 발현시키는 방법 및 생체 내에서 목적 유전자에 선택적으로 RNA 간섭을 유도하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 저산소-반응성 프로모터는서열번호 1의 cDNA 염기서열을 갖는 선충의 hsp16A 유전자 프로모터의 -260 내지 -241 뉴클레오티드 영역을 포함하며서열번호 2의 염기서열을 가지고 있다.

본 발명자들은 마이크로어레이 (microarray) 분석방법으로 알코올에 노출된 선충에게서 전사발현이 변화되는 유전자들을 찾는 과정에서 저산소 (hypoxia) 조건에서 그 발현이 급격히 증가되는 유전자를 발견하고 그의 전사를 조절하는 저산소-반응성 프로모터 부위를 분석하였다.

알코올에 노출된 선충에게서 전사발현이 변화되는 유전자들을 찾는 마이크로어레이 분석 결과, 에탄올에 노출되면서 가장 빠른 시간 안에 그 전사가 증가하는 유전자의 하나로 대조군에서는 발현되지 않다가 에탄올이 첨가된 실험군에서 그 발현이 현저하게 증가된 오픈 리딩 프레임 (open reading frame, ORF)을 발굴하였다 (도 1참조). 상기 유전자는 15분 이내에 그 전사가 증가하기 시작하였고 그 증가의 정도가 6시간 노출 시에도 계속되는 양상을 보였다. 염기서열 분석 결과, 상기 유전자는서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지고 있으며 열 충격에 의해 유도되는 열 충격 단백질 (heat shock protein)의 하나로서 기존에 보고된 바 있는 hsp16A 유전자와 동일한 염기서열을 가지고 있다.

액상의 최소배지에 알코올을 첨가하거나 첨가하지 않은 상태에서 선충을 진탕없이 배양하여 정상적인 산소 공급을 차단함으로써 선충에게 저산소 충격을 가한 결과, 저산소 상태에서 알코올의 존재와 관계없이 아주 빠른 속도로 hsp16A 유전자의 전사가 유도됨을 확인하였다.

이에 본 발명자들은 열 충격 단백질 유전자인 hsp16A의 저산소 조건에 대한반응성을 측정하여 열 충격을 가한 경우의 전사유도와 비교하고자 하였다. 우선, hsp16A의 전체 조절 요소 (regulatory element, 340 bp)를 포함하는 전체 코딩 영역 (coding region)의 뒷부분에 GFP (Green fluorescent protein)를 융합 (translational fusion)시킨 플라스미드를 제작하고 이로부터 추출한 DNA를 선충에게 미세주입하여 형질전환 동물 (transgenic animal)을 제작하였다. 상기 형질전환 동물에 저산소 조건 또는 열 충격을 가한 후 검출되는 GFP의 양을 측정하여 충격에 의해 유도되는 hsp16A의 전사 정도를 결정하였다.

그 결과, 대조군에서는 거의 발현되지 않는 GFP가 저산소 조건 또는 열 충격이 가해진 실험군에서는 강하게 발현되었는데 (도 2참조), 이는 기존에 열 충격 단백질로 알려진 hsp16A 유전자의 전사 조절이 열 충격에 의해서 뿐 아니라 저산소 충격에 의해서도 조절된다는 것을 최초로 규명한 것이다.

기존의 hsp16A에 대한 연구는 열 충격에 대한 반응을 중심으로 그의 전사조절에 관하여 진행되어 왔으며 이로부터 열 충격 반응성 요소 (heat shock responsive element)가 존재한다는 결과가 보고된 바 있다 (Stringham, E. G., et al.,Molecular Biology of the Cell, 3:221-233, 1992; Kay, R. J., et al.,Molecular and cellular Biology,6:3134-3143, 1986). 그러나, 본 발명의 결과로부터 hsp16A 유전자가 열 충격에 의해서 뿐 아니라 저산소 충격에 의해서도 발현이 유도된다는 것을 확인하였고 열 충격 반응성 요소와 구별되는 저산소 반응성 조절 부위 (hypoxia repsonse regulatory region)를 밝히고자 hsp16A-GFP 프로모터 유사체 (derivatives)를 제조하여 프로모터 분석을 수행하였다.

본 발명에서 프로모터 분석을 위해 제작한 hsp16A-GFP 프로모터 유사체들은 전장 프로모터 또는 다양한 부위의 프로모터 결실을 포함하는 GFP 융합 유전자 컨스트럭트로 하기와 같이 제조되었다.

JS301; 340 bp의 전장 프로모터를 모두 포함.

JS304; XbaI 제한 효소 자리를 이용하여 프로모터의 중간 부위, 150 bp를 제거하여 먼 쪽 열 충격 반응 요소의 절반과 가까운 쪽 열 충격 반응 요소의 절반을 융합한 190 bp 길이의 프로모터를 포함.

JS306; 프로모터의 앞 쪽 끝 80 bp를 제거한 260 bp 길이의 프로모터로 두 개의 열 충격 반응 요소를 모두 포함.

JS307; 프로모터의 앞 쪽 255 bp를 제거한 85 bp 길이의 프로모터로 가까운 쪽 열 충격 반응 요소의 절반 부분만을 포함.

JS308; 프로모터의 앞 쪽 끝 100 bp를 제거한 240 bp 길이의 프로모터로 먼 쪽의 열 충격 반응 요소는 절반 부분만 포함하고 가까운 쪽 열 충격 반응 요소는 모두 포함.

JS312; 프로모터의 앞 쪽 120 bp를 제거하여 220 bp 길이의 프로모터로 먼 쪽 열 충격 반응 요소는 제거되고 가까운 쪽 열 충격 반응 요소만 포함.

JS314; 프로모터의 앞 쪽 265 bp를 제거하여 75 bp 길이의 프로모터로 기본 프로모터인 TATA만 포함하는 JS313; 및 프로모터의 가까운 쪽 열 충격 반응 요소를 포함한 15 bp를 제거한 325 bp 길이의 프로모터를 포함.

상기와 같이 제조된 다양한 프로모터 유사체에서 GFP의 전사가 저산소 조건에 대해 어떻게 반응하는지 조사한 결과, hsp16A 유전자의 전사가 열 충격에 의해 조절되기 위한 열 충격-반응성 요소는 기저부위 (proximal element) 또는 말단 부위 (distal element)에 존재한 반면, 저산소 조건에 의해 전사가 조절되기 위해 가장 중요한 저산소-반응성 요소 (hypoxia-responsive element)는서열번호 1로 기재되는 hsp16A 유전자 프로모터 부위에서 -260에서 -241 뉴클레오티드 사이에 존재하였다 (표 1및표 2참조). 상기 -260에서 -241 뉴클레오티드 부위는서열번호 2로 기재되는 염기서열을 가지고 있다. 이로부터 저산소 충격에 의해 hsp16A 유전자의 전사가 유도되는 기작이 열 충격에 의한 전사조절과는 독립적으로 존재하는 저산소-반응성 프로모터 부위에 의한 것임을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 hsp16A 유전자의 저산소-반응성 프로모터를 이용하여 목적 유전자에 선택적으로 RNA 간섭을 유도하는 방법을 제공한다.

hsp16A의 프로모터가 열 충격 이외에도 저산소 조건에 반응하여 전사가 조절됨을 확인한 본 발명자들은 목적 유전자에 선택적으로 RNA 간섭을 유도하는 방법으로서 상기 hsp16A의 프로모터를 이용하여 생체내 RNAi를 용이하게 수행할 수 있는 실험 방법을 개발하였다.

기존의 생체내 RNAi는 hsp16.2나 hsp16.41의 프로모터에 원하는 유전자를 양쪽 방향 (sense and antisense)으로 연결하여 제작한 두 발현벡터를 동시에 도입한 형질전환 생물체을 제조한 후 이들 개체에 열 충격을 가함으로써 생체 내에서 이중 가닥 RNA (doulbe stranded RNA)를 만들도록 하는 방법을 사용하여 왔다. 하지만 상기 방법은 열 충격이라는 강한 자극을 개체 전체에 가함으로써 장기적인 처리가힘들 수 있을 뿐 아니라 열 충격에 의한 부차적인 결과가 나타날 수 있다는 문제점을 가지고 있다. 반면, 본 발명의 저산소 충격에 의한 전사유도 기작을 이용한다면 이러한 문제점들을 해결하면서 강력한 RNA 간섭 효과를 낼 수 있다.

본 발명의 hsp16A의 저산소-반응성 프로모터가 생체내 RNAi 실험 방법의 개발에 이용될 수 있음을 확인하고자 hsp16A의 전장 프로모터 뒷부분에 선충 망상-연합 복합체-1 (clathrin-associated complex-1)의 중간 사슬 유전자 (medium chain gene)인 apm-1이 센스 또는 안티센스 방향으로 연결된 유전자 컨스트럭트를 제작하였다. 상기 apm-1 유전자의 센스 및 안티센스 컨스트럭트로부터 추출한 DNA를 선충에게 미세주입하여 형질전환 동물을 제조한 후 상기 형질전환 동물에 저산소 조건에서 apm-1 유전자 기능의 저해 정도를 관찰하였다.

그 결과, apm-1 유전자의 기능이 저해되어 치사 (lethality) 표현형질이 배 발생단계와 유충 단계에서 관찰되었고 그 빈도는 열 충격에 의한 실험의 결과와 비슷하거나 오히려 약간 높게 나타났다 (표 3참조)(도 6참조).

상기 결과로부터 본 발명의 저산소-반응성 프로모터를 이용한 생체내 RNAi 방법이 기존의 열 충격을 이용한 생체내 RNAi 방법에 비하여 개체 전체에 부수적인 결함을 유발하지 않으면서 목적하는 유전자에 선택적으로 생체내 RNA 간섭 (interference)을 유도할 수 있어 유전자의 기능을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 상기 방법은 선충 (Caenorhabditis elegans)을 비롯하여 식물, 초파리 (Drosophila), 트리파노조마 브루-세이 (Tripanozoma brucei), 플라나리아 (planarian) 또는 포유동물 세포주 등의 생물체에 적용될 수 있다.

본 발명의 저산소-반응성 프로모터를 이용한 생체내 RNAi 방법은 하기와 같은 두 가지 방법으로 구체화될 수 있다.

첫 번째 방법은 1) 목적하는 유전자가 hsp16A 저산소-반응성 프로모터에 센스 및 안티센스 방향으로 각각 연결된 발현벡터를 제작하는 단계; 2) 상기 두 발현벡터를 동시에 생물체에 미세주입하여 형질전환 생물체를 제조하는 단계; 및 3) 상기 형질전환 생물체에 저산소 충격을 가하여 발현을 유도하는 단계로 구성된다 (도 7의 a 참조).

상기 단계에서 저산소 충격은 형질전환 생물체를 배양하는 배지에 물을 적당량 부어 개체들을 잠기게 하거나 개체들을 수확한 후 튜브 상에서 진탕하지 않은 상태로 완충용액 또는 물에 잠기게 하여 가할 수 있다. 이로 인해 저산소 충격이 가해지면 hsp16A 저산소-반응성 프로모터로부터 전사가 촉진되어 각 발현벡터로부터 목적하는 유전자의 센스 또는 안티센스 가닥의 RNA가 만들어지고 이들이 서로 이중가닥 (double strand)을 형성하여 RNA 간섭을 하게 된다.

두 번째 방법은 1) 목적하는 유전자가 hsp16A 저산소-반응성 프로모터에 센스 및 안티센스 방향으로 동시에 연결된 발현텍터를 제작하는 단계; 2) 상기 발현벡터를 개체에 미세주입하여 형질전환 생물체를 제조하는 단계; 및 3) 상기 형질전환 생물체에 저산소 충격을 가하여 발현을 유도하는 단계로 구성된다 (도 7의 b 참조).

상기 두 번째 방법의 발현벡터는 하나의 RNA 분자 내에 센스 가닥과 안티센스 가닥이 동시에 전사되어 이들이 이중 가닥을 형성함으로써 RNA 간섭을 하게 되는데, 첫 번째 방법에 비하여 센스 및 안티센스 가닥이 물리적으로 떨어질 수 없기 때문에 목적하는 유전자에 대한 RNA 간섭이 더욱 효과적이다.

한편, 본 발명의 저산소-반응성 프로모터는 저산소 조건 하에서 목적 유전자의 전사를 촉진하므로 유용 단백질의 대량 생산을 위해서도 사용될 수 있다.

상기 프로모터를 이용하여 저산소 조건 하에서 유용 단백질을 대량으로 생산하는 방법은 1) 제 1항의 저산소-반응성 프로모터에 목적 유전자가 연결된 발현벡터를 제작하는 단계; 2) 상기 발현벡터를 생물체에 미세주입하여 형질전환 생물체를 제조하는 단계; 및 3) 상기 형질전환 생물체에 저산소 충격을 가하여 저산소-반응성 프로모터에 연결된 상기 목적 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 저산소 조건에 의해 전사가 유도되는 유전자의 발굴

본 발명자들은 마이크로어레이 (microarray) 분석방법으로 알코올 (ethanol, 7%)에 노출된 선충에게서 전사발현이 변화되는 유전자들을 찾는 과정에서 저산소 (hypoxia) 조건에서 그 발현이 급격히 증가되는 프로모터를 발견하였다. 우선, 알코올에 노출된 선충에게서 전사발현이 변화되는 유전자를 선별하기 위한 마이크로어레이 분석실험은 하기와 같이 수행하였다.

<1-1> 마이크로어레이 분석실험

100 ㎜ 플레이트 80장 가량에 선충을 배양하여 S 기준 완충용액 (S basalbuffer)으로 수확한 후 이를 반으로 나누어 각각 완충용액 자체 (200 ㎖, 대조군)와 여기에 최종 7% (v/v)로 에탄올이 첨가된 S 완충용액 (200 ㎖, 실험군)을 혼합하여 1 ℓ 플라스크에서 20℃, 250 rpm 조건으로 액체 배양하였다. 에탄올에 노출되는 실험군은 15번의 독립된 실험에서 서로 다른 시간 동안, 즉 15분 동안 2번씩, 30분 동안 2번씩, 1시간 동안 2번씩, 2시간 동안 2번씩, 4시간 동안 2번씩 또는 6시간 동안 5번씩 에탄올에 노출시켰다. 이때, 플라스크의 입구는 파라필름 (parafilm)으로 밀봉하였다. 이로부터 얻은 각각의 배양액을 원심분리하여 선충을 수확한 후 즉시 트리졸 시약 (trizol reagents, GIBCO BRL, 15596-018)을 최종 부피 40 ㎖이 되도록 첨가하여 동결 및 해동을 7번 이상 반복하여 세포를 파쇄하였다. 이를 다시 원심분리하여 RNA가 포함되어 있는 상등액만을 취한 후, 여기에 이소프로판올 (isopropanol)을 상등액과 동량으로 첨가하고 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 침전물을 에탄올로 세척한 후 10 mM Tris-Cl 완충용액 (pH 7.4) 4 ㎖에 용해시켜 실험군과 대조군 선충의 전체 RNA를 얻었다.

상기 전체 RNA로부터 mRNA만을 순수분리하기 위하여 oligo(dT)-Cellulose Type 7 (Amersham Pharmacia Biotech, 27-5543-02) 레진 (resin)을 사용하였는데, 상기 레진에 전체 RNA를 혼합하여 mRNA를 레진에 결합시킨 후 10 ㎖ Poly-Prep Column (biorad, 731-1550)을 이용하여 1*NETS (100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 7.4], 10 mM EDTA, 0.2% SDS)로 세척하고, 10 mM Tris-Cl (pH 7.4 heated to 70℃)로 용출하였다. 여기에 이소프로판올과 NaOAC를 첨가하여 잘 혼합한 후 원심분리하고 이로부터 얻은 침전물을 10 mM Tris-Cl (pH 7.4)에 용해시켜 실험군과 대조군각각의 mRNA를 얻었다.

상기에서 실험군과 대조군으로부터 분리한 mRNA로 마이크로어레이 분석을 수행하기 위하여, 각각의 mRNA에 서로 다른 형광을 띠도록 표지한 후 선충이 지니고 있을 것으로 예상되는 약 2만개의 유전자 조각이 찍혀있는 마이크로어레이에 혼성화 (hybridization)하였다 (Stanford university, Stuart K. Kim). 이 때, 실험군 mRNA는 Cye3-dUTP, 대조군 mRNA는 Cye5-dUTP으로 표지되도록 역전사하고, 스캔 작업 과정에서 Cye3을 초록색으로 Cye5를 붉은색으로 전환시켜 이미지를 만들어 두 이미지가 겹쳐지도록 하였다. 상대적으로 실험군에서 발현정도가 높은 유전자는 상기 이미지 상에서 강한 초록색의 반점 (spot)을 보이게 된다.

그 결과, 본 발명자들은 에탄올에 노출되면서 가장 빠른 시간 안에 그 전사가 증가하는 유전자의 하나로 대조군에서는 발현되지 않다가 에탄올이 첨가된 실험군에서 그 발현이 현저하게 증가된 오픈 리딩 프레임 (open reading frame, ORF)을 발굴하고 이를 T27E4.2라 명명하였다 (도 1).도 1에서, 초록색으로 나타나는 반점은 전사가 증가되었음을 보여주는 것이고, 회색으로 나타나는 반점은 데이타가 없음을 의미하는 것이다. 상기 유전자는 15분 이내에 그 전사가 증가하기 시작하였고 그 증가의 정도가 6시간 노출 시에도 계속되는 양상을 보였다. 염기서열 분석 결과, 상기 유전자는서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지고 있으며, 데이터베이스 상에서 다른 유전자들과의 상동성 (homology) 비교를 통하여 상기 유전자가 기존에 보고된 바 있는 유전자인 hsp16A과 동일한 염기서열 가지고 있음을 확인하였다. hsp16A 유전자는 열 충격에 의해 유도되는 열 충격 단백질 (heat shockprotein)의 하나로서 열 충격에 대한 상기 유전자의 전사 조절 기작에 대해서는 이미 많은 연구가 이루어져 있다.

<1-2> 저산소 조건에 의한 전사유도

본 발명자들은 상기 실시예 <1-1>에서 확인된 선충으로부터 알코올 노출에 의해 전사가 증가되는 hsp16A의 알코올에 대한 민감성을 조사하는 과정에서 상기 유전자가 알코올 뿐 아니라 저산소 조건에 의해서도 전사가 촉진된다는 사실을 규명하였다. 구체적으로, 상기 유전자의 알코올에 대한 반응을 조사하기 위해서 액상의 최소배지에 알코올을 첨가하거나 첨가하지 않은 상태에서 선충을 처리하였다. 이 때 250 rpm 정도의 진탕 상태에서 배양하면 정상적인 산소 공급이 이루어지지만진탕없이 배양하면 산소 공급이 정상적으로 이루어지지 않아 저산소 상태가 된다. 상기와 같은 저산소 상태에서 본 발명의 hsp16A 유전자는 알코올의 존재와 관계없이 아주 빠른 속도로 전사 유도가 일어남을 확인하였다.

<실시예 2> hsp16A의 저산소 및 열 충격에 대한 반응성 검사

열 충격 단백질 유전자인 hsp16A가 저산소 상태에서 전사가 촉진됨을 확인한 본 발명자들은 저산소 조건에 대한 반응성을 측정하여 열 충격을 가한 경우의 전사유도와 비교하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<2-1> hsp16A-GFP 융합 플라스미드 및 그의 형질전환 동물의 제작

우선, hsp16A의 전체 조절 요소 (regulatory element, 340 bp)를 포함하여 전체 코딩 지역 (coding region)의 뒷부분에 GFP (Green fluorescent protein)를 융합 (translational fusion)시킨 플라스미드 JS301을 제작하였다. 상기 플라스미드 JS301을 가진 대장균주를 배양한 뒤, DNA Midi prep kit (Qiagen)를 이용하여 DNA를 순수하게 추출한 후rol-6표지 DNA (rol-6marker DNA,Molecular and Cellular Biology,10:2081-2089, 1990;Transgenic Research,4:323-340, 1995)와 혼합하였다. 상기 혼합물을 Karl Zeiss의 Axiovert 현미경을 포함한 마이크로주입 시스템 (Microinjection system)을 이용하여 성체 전반부 (young adult stage)에 이른 선충 자웅동체 (hermaphrodite)의 생식선에 미세주입하여 표지 DNA를 가진 형질전환 동물 (transgenic animal)을 얻었다. 상기 형질전환 동물은rol-6표지를 포함함으로써 해부 현미경상에서 앞뒤로 잘 가지 못하고 제자리에서 동그라미를 그리며 움직이는 롤러 (roller)의 표현형질 (phenotype)을 보이므로 야생형과 구분이 용이하여 쉽게 선별할 수 있다. 따라서, 저산소 조건 또는 열 충격이 가해진 상기 형질전환 동물로부터 검출되는 GFP의 양은 충격에 의해 유도된 hsp16A의 전사 정도를 나타내게 된다.

<2-2> 저산소 및 열 충격에 대한 반응성 검사

상기 형질전환 동물에 저산소 충격을 주기 위하여 M9 완충용액으로 플레이트에서 완전히 성장한 선충을 수확하여 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브 (eppendorf tube)에 넣은 후 이를 20℃ 배양기에서 진탕없이 정치 배양하였다. 한편, 열 충격을 가하기 위해서는 선충이 완전히 성장한 플레이트를 30℃ 배양기에 플레이트 째로 넣어 배양하였다. 이들을 3시간 동안 배양하면서 시간대별로 GFP 발현 정도를 측정하였다. GFP 발현 정도는 충격을 준 형질전환 선충과 충격을 주지 않은 형질전환 선충을 슬라이드 글래스 (slide glass) 위에 올려 놓고 Zeiss 형광 현미경 (Axioplan)에서 디지털 카메라 (Axiocam)로 630배의 배율에서 1300 x 1030 pixel의 해상도, 3000의 노출로 일정하게 사진을 찍어 GFP의 강도와 선충의 부위별 차이를 관찰하였다.

그 결과,도 2에 나타난 바와 같이 대조군에서는 거의 발현되지 않는 GFP가 저산소 조건 또는 열 충격이 가해진 실험군에서는 강하게 발현됨을 볼 수 있다. 이러한 결과를 통해서 기존에 열 충격 단백질로 알려진 hsp16A 유전자의 전사가 열 충격에 의해서 뿐 아니라 저산소 충격에 의해서도 조절된다는 것을 알 수 있다.

<실시예 3> hsp16A의 프로모터 분석

기존에는 hsp16A 유전자의 전사가 열 충격에 의해서 유도된다는 것에 기초하여 그의 프로모터를 분석하였는데, 상기 실시예 2에서 확인된 바와 같이 hsp16A 유전자는 열 충격 뿐 아니라 저산소 조건에 의해서도 전사가 조절되므로 이에 필요한 프로모터를 다시 정립할 필요가 있다. 이에 본 발명자들은 하기와 같이 전장 프로모터 부위 또는 다양한 부위의 결실을 포함하는 hsp16A-GFP 프로모터 유사체들 (derivatives)을 제조하여 이들의 저산소 조건에 대한 전사 유도 정도를 조사하였다.

<3-1> hsp16A의 프로모터 유사체들의 제작

hsp16A 유전자의 포로모터 유사체들의 제작은 우선적으로 선충 게놈 DNA를 주형으로 하고 BamHI 제한효소 인식부위를 포함하는서열번호 3으로 기재되는 T27E4.2-2 (+490 부위 인식)와 HindIII 제한효소 인식부위를 포함하는서열번호 4로 기재되는 T27E4.2-3 (-340 부위 인식) 표지 프라이머 쌍을 이용한 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, 이하 PCR)으로 -340에서 +490까지의 뉴클리오티드를 포함하는 830 bp 길이의 DNA 단편을 증폭하였다. 여기서 +490은 번역 개시 지역 (translation start site)인 ATG의 A를 +1로 했을 때, 단백질을 코딩하는 부위의 마지막 종결 코돈 (stop codon)인 TAA의 마지막 A를 +490으로 표기한 것이고, 상기 유전자의 프로모터 부위와 코딩 부위를 포함한 전체 부위로 GFP 융합 플라스미드를 제조하였다. 이는 선충에서 특정 유전자의 경우에 코딩 지역을 포함하지 않고 GFP 융합 단백질을 만들게 되면 선충 내에서 그것의 발현 부위가 제한을 받기 때문에 상기 융합 플라스미드로부터 생성되는 GFP 융합 단백질이 실제의 내재적 hsp16A의 발현과 동일한 양상을 나타내게 하기 위해서이다.

상기 DNA 단편을 pPD95.77 (A. Fire, Carnegie Institute, Baltimore, USA) 벡터의 HindIII/BamHI 제한효소 부위에 삽입하여 전장 프로모터를 포함하는 GFP 융합 컨스트럭트 (GFP fusion construct) JS301을 제조하였다. JS301 보다 작은 크기의 유전자 컨스트럭트를 제조하기 위하여 상기 융합 컨스트럭트 JS301에 형성된 제한효소 부위 (XbaI)를 이용하여 JS301을 XbaI으로 절단하여 얻은 DNA 단편을 자가-봉합 (self-ligation)시켜 JS304를 제조하였다. 또한, 상기에서 증폭된 DNA 단편을 벡터 pPD95.77의 PstI/BamHI 부위에 삽입시킨 JS306, 상기 DNA 단편을 XbaI으로 부분 절단 (partial digestion)하여 전기영동한 후 아가로오스 겔에서 길이가 비교적 짧은 단편들 또는 긴 단편들을 잘라내어 겔로부터 용출한 후 이들 각각을 벡터 pPD95.77의 XbaI/BamHI 부위에 삽입시킨 JS307 (575 bp; 490 bp의 코딩 지역과 85 bp의 프로모터 부위) 및 JS308 (730bp; 490 bp의 코딩 지역과 240 bp의 프로모터 부위) 등을 제조하였다. 아울러, 새로운 프라이머들을 고안하여 상기와 동일한 방법으로 PCR한 후 증폭된 DNA 단편을 pPD95.77 벡터에 클로닝하여 유전자 컨스트럭트들을 제조하였는데,서열번호 6및서열번호 3으로 기재되는 T27E4.2-6 (-220 부위 인식)/T27E4.2-2 프라이머 쌍을 이용한 PCR에 의해 증폭된 710 bp 길이의 DNA 단편을 pPD95.77 벡터의 HindIII/BamHI 제한효소 부위에 삽입한 JS312,서열번호 8및서열번호 3으로 기재되는 T27E4.2-8 (-75 부위 인식)/T27E4.2-2 프라이머 쌍을 이용한 PCR에 의해 증폭된 565 bp 길이의 DNA 단편을 pPD95.77 벡터의 SalI/BamHI 제한효소 부위에 삽입한 JS313,서열번호 4및서열번호 7로 기재되는 T27E4.2-3/T27E4.2-7 (-90 부위 인식) 프라이머 쌍을 이용한 PCR에 의해 증폭된 250 bp 길이의 DNA 단편을 pPD95.77 벡터의 HindIII/SalI 제한효소 부위에 삽입한 JS314를 제작하였다 (도 3).

본 발명에서 GFP를 hsp16A에 융합 (translational fusion) 하기 위해서 사용한 클로닝 벡터 pPD95.77는 frame=2를 가지는 Fire vector 95 series 중의 하나로 HindIII, SphI, PstI, SalI, XbaI, BamHI의 순으로 배열된 다중 클로닝 부위 (Multi-cloning site) 다음에 GFP 유전자를 포함하고 있어 목적하는 DNA를 ORF (open reading frame)에 맞게 삽입하면 GFP와 융합된 단백질을 선충 내에서 발현시킬 수 있다.

<3-2> 저산소 및 열 충격에 대한 반응성 조사

상기와 같이 제조된 다양한 프로모터 유사체에서 GFP의 전사가 저산소 조건에 대해 어떻게 반응하는지 확인하기 위하여 실시예 2와 동일한 방법으로 저산소조건을 가하여 각각의 융합 유전자 컨스트럭트의 반응성을 조사하였고 그 결과를 하기표 1및표 2에 나타내었다.

저산소-반응성 지역 (hypoxia-responsive region)을 규명하기 위한 프로모터 분석 결과

컨스트럭트	HN	AI	MI	PI	P	BM	H
JS301	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
JS304	+	++	+	++	-	-	-
JS306	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
JS307	+	++	-	++	-	-	-
JS308	++	+++	+++	+++	++	+	+
JS312	+	+++	+++	+++	+	-	-
JS313	-	-	-	-	-	-	-
JS314	++	+++	+++	+++	++	+	+
HN; head neuron (머리쪽 신경세포),AI; antirior intestine (앞쪽 부위의 창자),MI; mid intestine (중간 부위의 창자),PI; posterior intestine (뒤쪽 부위의 창자),P; pharynx (인두),BM; body wall muscle (몸통근육),H; hypodermis (하피)

표 1에서 +++는 JS301이 HN, AI, MI, PI, P, BM, H의 부위에서 발현되는 정도를 나타내고 +는 가장 약하게 발현되는 정도를 나타내며 ++는 중간 정도의 세기로 발현됨을 의미한다. -는 JS301이 전혀 발현되지 않은 것을 나타낸다. 따라서, 기본 프로모터만 가진 JS313은 저산소 조건에서 HN, AI, MI, PI, P, BM, H의 어느 부위에서도 발현이 되지 않았고, JS301과 JS306은 HN, AI, MI, PI, P, BM, H의 모든 부위에서 강하게 발현되었다.

저산소 충격 반응 및 열 충격 반응의 비교

컨스트럭트	저산소충격	열충격
JS301	+++	+++
JS304	-	-
JS306	+++	+++
JS307	-	-
JS308	+	+++
JS312	+	+++
JS313	-	-
JS314	+++	+++

표 1및표 2에 나타난 바와 같이, hsp16A 유전자가 열 충격에 의해 전사가 조절되기 위한 열 충격-반응성 요소는 기저부위 (proximal element) 또는 말단 부위 (distal element)만으로도 충분한 반면, 저산소 조건에 의해 전사가 조절되기 위해 가장 중요한 저산소-반응성 요소 (hypoxia-responsive element)는 -260에서 -240 뉴클레오티드 사이에 존재함을 알 수 있다. 상기 저산소-반응성 요소는 열 충격-반응성 요소와는 독립적으로 작용하며서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성되어 있다.

<3-3> hsp16 유전자 패밀리의 저산소 조건에 대한 반응성 조사

선충에는 hsp16A 이외에 다른 hsp16 유전자들이 존재하는데, 이들 hsp16 유전자들도 저산소 조건에 반응하여 그들의 전사가 조절되는가를 조사하였다. hsp16 유전자들 중 hsp16A와 아미노산의 염기 서열과 프로모터의 염기 서열이 가장 유사한 유전자는 hsp16.2와 hsp16.41이므로 이들 두 유전자가 저산소 조건에 의해 발현이 유도되는지를 조사하였다. 저산소 충격은 상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 가하였다.

그 결과, 이들 hsp16 유전자들은 저산소 조건에 대해 거의 발현이 유도되지 않았다 (도 4).도 4에서 A와 B는 hsp16A의 JS306의 발현 양상이고, C와 D는 hsp16.2, E와 F는 hsp16.41의 발현 양상이다. 왼쪽 패널은 열 충격에 의해 전사가 유도되는 양상이고, 오른쪽 패널은 저산소 조건에 의해 전사가 유도되는 양상이다.도 4에 나타난 바와 같이, 열 충격에 의해서는 세 유전자 모두 전사가 촉진되지만, 저산소 조건에 의해서는 hsp16A 유전자만이 전사가 촉진되었다. 이러한 결과를 통하여 현재까지 저산소 조건에 반응하는 hsp16 유전자 패밀리의 프로모터는 본 발명자들이 발견한 hsp16A가 유일함을 확인하였다.

<실시예 4> hsp16A 프로모터를 이용한 생체내 RNAi 실험의 디자인

상기 실시예 3에서 hsp16A의 프로모터가 열 충격 이외에도 저산소 조건에 반응하여 전사가 조절됨을 확인한 본 발명자들은 hsp16A의 저산소-반응성 프로모터가 기존에 열 충격을 이용한 RNAi 방법에서 제기된 문제점을 해결하면서 강력한 RNAi 효과를 내는 생체내 RNAi 실험 방법의 개발에 이용될 수 있음을 확인하고자 apm-1 유전자를 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<4-1> hsp16A 프로모터를 포함한 apm-1 유전자 컨스트럭트의 제작

apm-1 유전자는 선충 망상-연합 복합체-1 (clathrin-associated complex-1)의 중간 사슬 유전자 (medium chain gene)의 하나로서, 우선 apm-1의 RNAi를 위한 유전자 컨스트럭트를 제조하기 위하여, 상기 실시예 3에서 제조된 JS301을 주형으로 하고서열번호 4및서열번호 5의 T27E4.2-3/T27E4.2-4 (+3 부위 인식) 프라이머 쌍으로 PCR하여 얻은 340bp 길이의 DNA 단편을 pGEM-T easy 벡터 (Promega사)에 삽입하여 플라스미드 JS302를 제작하였다. 상기 플라스미드 JS302를 제한효소 HindIII/EcoRI로 처리하여 얻은 340bp 길이의 DNA 단편을 동일한 제한효소가 처리된 pBluscript KS+ 벡터에 서브클로닝하여 플라스미드 JS305를 제작하였다. 이로부터 apm-1 유전자의 센스 컨스트럭트 (sense construct)를 제작하기 위하여, 우선 apm-1 cDNA (Shim et al.,Molecular Biology of the Cell, 2000, 11, 2743-2756)를 주형으로 하고서열번호 9및서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 갖는 CE16 APM-1 cDNA의 종결 코돈인 TTA를 포함한 부위 인식)/CE17 (APM-1 cDNA의 개시 코돈인 ATG를 포함한 부위 인식)의 프라이머 쌍으로 PCR하여 얻은 1240bp 길이의 DNA 단편을 제한효소 NdeI/BamHI이 처리하고 동일한 제한효소로 처리된 플라스미드 JS305에 서브클로닝하여 센스 컨스트럭트 MC12를 제작하였다. 또한, apm-1 유전자의 안티센스 컨스트럭트 (anti-sense construct)는 플라스미드 JS305를 제한효소 XhoI/BamHI으로 처리하여 얻은 hsp16A 유전자의 프로모터 부위를 포함하는 약 360bp 길이의 DNA 단편을 apm-1 cDNA이 삽입되어 있는 플라스미드 pJL241 (apm-1 cDNA가 pRSET-B 벡터 [invitrogen]의 NheI/BamHI의 클로닝 부위에 삽입되어 있음)에 서브클로닝하여 안티센스 컨스트럭트 MC13을 제작하였다.

<4-2> 형질전환 동물의 제조와 저산소 및 열 충격에 대한 반응성 검사

상기 실시예 2의 <2-1>의 방법에 따라, apm-1 유전자의 센스 및 안티센스 컨스트럭트 MC12 및 MC13으로부터 DNA를 순수하게 추출한 후 이를 이용하여 선충을 형질전환시켰다. 형질전환된 선충에서 hsp16A의 저산소-반응성 프로모터에 의한amp-1 유전자의 생체내 RNAi 효과를 관찰하기 위하여 실시예 2의 <2-2>와 동일한 방법으로 저산소 조건 또는 열 충격을 가한 후 형광 현미경으로 GFP의 발현정도를 측정하였고 그 결과를 하기표 3및도 6에 나타내었다.

열 충격 또는 저산소 조건을 이용한 생체내 RNAi 효과

충격 후 경과시간 (hours)	열 충격 (% 치명도)	저산소 충격 (% 치명도)
	S	AS	S+AS	S	AS	S+AS
0-8	17.6	23.9	40	0	12.2	46.3
8-16	5.2	16	29.4	8.2	19.2	42.3
16-24	5.2	19.4	34.9	0.6	21.5	53
24-36	9.6	22.9	30.1	6.6	30	30.2

표 3에서 S는 센스 컨스트럭트가 도입된 형질전환 선충, AS는 안티센스 컨스트럭트가 도입된 형질전환 선충, S+AS는 센스 컨스트럭트 + 안티센스 컨스트럭트가 동시에 도입된 형질전환 선충을 나타낸다. 또한, % 치명도는 전체 낳아진 알 중에서 성체가 되지 못하고 성장 과정에서 죽은 개체의 백분율을 의미한다.표 3에 나타난 바와 같이, 열 충격에 의해 태어난 자손들은 센스 컨스트럭트가 도입된 경우에도 열 충격에 의한 부수 효과에 의해 시간대 별로 최소 5.2%에서 최대 17.6% 까지 사멸하였다. 반면, 저산소 조건에 의해 태어난 자손들은 센스 컨스트럭트가 도입된 경우 0% 에서 8.2% 정도로 부수적인 영향이 덜하지만, 센스와 안티센스 컨스트럭트가 동시에 도입된 경우에는 RNAi에 의한 치명도가 최대 53%에 까지 이르렀다. 따라서, 저산소 조건에 의한 in vivo RNAi는 기존에 알려진 열 충격에 의한 in vivo RNAi 보다 우수한 간섭 효과를 보이면서도 부수적인 영향 (side effect)이적었다.

도 6은 hsp16A의 저산소-반응성 프로모터를 이용한 생체내 RNAi 실험결과 관찰된 apm-1 유전자의 표현형질을 나타내는 것으로, A와 D는 정상적으로 발생한 표현형질을, B, C, E, F 및 G는 apm-1의 생체내 저산소 RNAi에 의해 나타난 표현형질을 나타낸 것이다.도 6에서 A, D는 정상적인 성장 과정에서의 2배기 (2-fold stage) 배와 L1 유충기 (larval stage)의 선충을 630 × 배율의 현미경으로 관찰한 사진이고, B, C, E, F, G는 apm-1 유전자의 in vivo RNAi에 의해서 사멸된 선충을 630 × 배율의 현미경으로 관찰한 사진이다.도 6에 나타난 바와 같이, apm-1 유전자의 in vivo RNAi에 의한 선충은 배발생 과정 (Embryogenesis)에서 뿐 아니라 유충의 발생 과정 (Larval development)에서도 문제를 유발하여 선충의 비정상적인 발생을 유도하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 hsp16A의 저산소-반응성 프로모터는 기존에 열 충격 프로모터에 비하여 개체 전체에 부수적인 결함을 유발하지 않으면서 목적하는 유전자에 선택적으로 생체내 RNA 간섭을 유도함으로써 유전자의 기능을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있을 뿐 아니라 저산소 조건을 이용하여 유용 단백질의 대량 생산에도 용이하게 이용될 수 있다.

Claims (7)

1. 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 저산소-반응성 프로모터 (hypoxia-responsive promoter).
2. 1) 제 1항의 저산소-반응성 프로모터에 목적 유전자가 연결된 발현벡터를 제작하는 단계;

   2) 상기 발현벡터를 생물체에 미세주입하여 형질전환 생물체를 제조하는 단계; 및

   3) 상기 형질전환 생물체에 저산소 충격을 가하여 저산소-반응성 프로모터에 연결된 상기 목적 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함하는,

   제 1항의 프로모터를 이용하여 저산소 조건 하에서 목적 유전자를 발현시키는 방법.
3. 제 2항의 방법으로 생물체 내에 도입된 목적 유전자를 발현시키는 것을 포함하는, 상기 생물체 내에 존재하는 목적 유전자에 선택적으로 RNA 간섭을 유도하는 방법.
4. 제 3항에 있어서,

   1) 제 1항의 저산소-반응성 프로모터에 센스 및 안티센스 방향의 목적 유전자가 각각 연결된 발현벡터를 제작하는 단계;

   2) 상기 두 발현벡터를 생물체에 미세주입하여 형질전환 생물체를 제조하는 단계;및

   3) 상기 형질전환 생물체에 저산소 충격을 가하여 저산소-반응성 프로모터에 연결된 상기 목적 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 3항에 있어서,

   1) 제 1항의 저산소-반응성 프로모터의 뒷부분에 센스 및 안티센스 방향의 목적 유전자가 동시에 연결된 발현벡터를 제작하는 단계;

   2) 상기 발현벡터를 생물체에 미세주입하여 형질전환 생물체를 제조하는 단계; 및

   3) 상기 형질전환 생물체에 저산소 충격을 가하여 저산소-반응성 프로모터에 연결된 상기 목적 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 3항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 저산소 충격은 형질전환 생물체를 배양하는 배지에 물을 부어 생물체들을 잠기게 하거나 생물체들을 수확한 후 튜브 상에서 진탕하지 않은 상태로 완충용액 또는 물에 잠기게 하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 3항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 생물체가 선충 (Caenorhabditis elegans), 식물, 초파리 (Drosophila), 트리파노조마 브루세이 (Tripanozomabrucei), 플라나리아 (planarian) 및 포유동물 세포주로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.