JP3803499B2 - トランスジェニック真珠貝及びその作出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、トランスジェニック真珠貝びその作出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の真珠養殖では、ひたすら幾種類かの天然に存在する真珠の生産のみが可能であり、色調などは生産後に染色などで色調加工を行なってきた。これら生産後の加工は色調が退色しやすく、また望みの色調に加工することは真珠層の強固なことからほとんど不可能であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
もし、着色真珠を産生する能力を有するトランスジェニック真珠貝が得られれば、養殖真珠産業にとって有利である。しかしながら、着色に関与する所望の外来遺伝子を発現することができるトランスジェニック真珠貝は現在までのところ作出されていない。
【０００４】
従って、本発明の目的は、着色に関与する所望の外来遺伝子を発現することができるトランスジェニック真珠貝及びその作出方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、着色に関与する所望の外来遺伝子とプリズムタンパク質遺伝子又は外套膜タンパク質遺伝子との融合遺伝子を真珠貝のオス及びメスの生殖巣にマイクロインジェクションし、それらのオスとメスを交配することにより、外套膜組織中で着色に関与する所望の外来遺伝子を発現するトランスジェニック真珠貝を作出することに成功し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、着色に関与する所望の外来遺伝子が、プリズムタンパク質遺伝子又は外套膜タンパク質遺伝子との融合遺伝子の形態で導入され、該外来遺伝子を発現し、外套膜組織が着色されたトランスジェニック真珠貝を提供する。また、本発明は、導入しようとする着色に関与する所望の外来遺伝子とプリズムタンパク質遺伝子又は外套膜タンパク質遺伝子との融合遺伝子又は該融合遺伝子を含む核酸をベクターに組み込んだ組換えベクターを真珠貝のオス及び／又はメスの生殖巣にマイクロインジェクションし、これらのオスとメスを交配させて第１代を作り、前記所望の遺伝子を発現している個体を選択することを含む、上記本発明のトランスジェニック真珠貝の作出方法を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のトランスジェニック真珠貝としては、アコヤガイ、シロチョウガイ、クロチョウガイのような真珠貝を挙げることができる。
【０００８】
真珠貝に導入される着色に関与する所望の外来遺伝子の好ましい例として、緑色蛍光発光タンパク質（ＧＦＰ：グリーンフルーオレスンスタンパク質）遺伝子、アントシアニン遺伝子、蛍光ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、フォスファターゼ遺伝子等の着色に関与する遺伝子を挙げることができる。なお、ここで、「着色に関与する遺伝子」とは、上記の例示からも明らかなように、色素(蛍光色素を包含する)をコードする遺伝子のみならず、体内で色素を生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子等、体内での色素生成反応に関与する物質をコードする遺伝子をも包含する。
【０００９】
本発明のトランスジェニック真珠貝は次のようにして作出することができる。第一の方法では、上記着色に関与する所望の外来遺伝子とプリズムタンパク質遺伝子若しくは外套膜タンパク質遺伝子との融合遺伝子又は該融合遺伝子を含む核酸をベクターに組み込んだ組換えベクターを、真珠貝のオス及び／又はメスの生殖巣にマイクロインジェクションにより注入し、これらのオスとメスを交配して第１代の個体を作り、該第１代の個体の中から上記所望の外来遺伝子を発現している個体を選択する。
【００１０】
マイクロインジェクションされる組換えベクターに組み込むべきものは、上記外来遺伝子を他の遺伝子と融合させた融合遺伝子である。ここで、上記着色に関与する所望の外来遺伝子と融合される他の遺伝子は、プリズムタンパク質遺伝子又は外套膜タンパク質遺伝子である。ベクターとしては、アデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターのような動物細胞用ベクターを挙げることができる。これらのベクターは市販されているので、市販品を用いることができる。
【００１１】
上記組換えベクターを真珠貝の生殖巣にマイクロインジェクションする方法について説明する。基本的には、組換えベクターを含む溶液を注射針で直接生殖巣内に注入することにより行なうことができる。マイクロインジェクション用の溶液の媒体としては、ＴＥ緩衝液のような緩衝液でよく、溶液中の組換えベクターの濃度は、２〜２００μｇ／ｍｌ程度が好ましく、特には５〜１０μｇ／ｍｌ程度が好ましい。注入する溶液の量は、１箇所につき１０〜５０μｌ程度が好ましく、卵巣、精巣とも２〜４箇所程度に注入することが好ましい。
【００１２】
マイクロインジェクション後、１０〜２５℃、好ましくは１５〜２０℃で２４〜７２時間、好ましくは２４〜４８時間放置した後、マイクロインジェクションしたオスとメスを交配させる。交配は自然交配でもよいが、再現性良く確実に交配させるために人工授精を行なうことが好ましい。人工授精は、基本的に、マイクロインジェクションした精巣からの精子をマイクロインジェクションしたメスの卵巣中の成熟卵に添加することにより行なうことができる。なお、マイクロインジェクションは、交配させるオス及びメスの両者の生殖巣に対して行うことが好ましいが、いずれか一方の生殖巣に対して行ってもトランスジェニック真珠貝を作出することが可能である。軟体動物の人工授精の方法自体はDev Biol 1994, 163(1): 162-174等に記載の方法により行なうことができる。
【００１３】
受精卵からの個体の育成は、受精卵を海水又は人工海水中で、その真珠貝の通常の生育温度範囲でインキュベートすることにより容易に行なうことができる。
【００１４】
次いで、得られた個体から形質転換体を選択する。これは、真珠貝の細胞中に、導入しようとする着色に関与する所望の外来遺伝子が存在するか否かをサザンブロット法により調べ、さらに真珠貝細胞で該外来遺伝子が発現されているか否かをノーザンブロット法により調べることにより行なうことができる。サザンブロット法及びノーザンブロット法自体及びそのための試料の調製方法自体はこの分野において周知であり、例えば中山・西方著、「バイオ実験イラストレイテッド(2)遺伝子解析の基礎」、秀潤社(１９９５)に記載されている。
【００１５】
形質転換ラインを確立するために、上記の方法により形質転換体であることが確認された第一代の真珠貝のオス及びメスを上記と同様にして交配させ、第二代の個体を得、その中から上記と同様にして形質転換体を選択することが好ましい。さらに第三代以降を同様にして作ることにより、より確実に形質転換ラインを確立することが可能である。
【００１６】
トランスジェニック真珠貝を作出する第二の方法では、形質転換しようとする真珠貝中でプロモーター活性を発揮するプロモーターの下流に、前記着色に関与する所望の遺伝子を機能的に連結した核酸を組み込んだ組換えベクターを該真珠貝の未受精卵、受精卵又は胚に導入し、該未受精卵、受精卵又は胚を個体にまで成長させ、前記所望の遺伝子を発現している個体を選択する。
【００１７】
形質転換しようとする真珠貝でプロモーター活性を発揮するプロモーターは、形質転換しようとする真珠貝中でプロモーター活性を発揮するものであればいずれのものであってもよく、例えばアクチン遺伝子プロモーター、熱ショックプロテイン遺伝子プロモーター等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、所望の外来遺伝子をプロモーターの下流に「機能的に連結」するとは、該外来遺伝子が該プロモーターの支配を受けるように読み枠を合わせて連結することを意味する。この場合、プロモーターの下流に機能的に連結された他の構造遺伝子又はその断片の下流に上記所望の外来遺伝子を読み枠を合わせて連結して、融合タンパク質として発現させることも可能である。なお、プロモーターの下流に構造遺伝子を機能的に連結する方法はこの分野において周知である。組換えベクターは、第１の方法と同様にして調製することができる。
【００１８】
次いで、調製した組換えベクターを真珠貝の未受精卵、受精卵又は胚、好ましくは未受精卵に導入する。これは例えば次のようにして行なうことができる。濃度１００〜２００ｍｇ／ｍｌ程度のベクター溶液をシャーレあるいはウェルに用意し、未受精卵あるいは受精卵又は胚を浸す。このように浸した卵あるいは胚をマイクロインジェクション用マイクロピペットを用いて（これに限るものではない)鋭利に一瞬だけ傷を付けるようにしてベクター液を卵あるいは胚内に注入する。この時、破裂は勿論のこと致命傷にならない程度に傷穴を空けることが肝心である。組換えベクターを導入した受精卵又は胚から第１の方法と同様にして個体を得ることができ、第１の方法と同様にして形質転換体を選択し、形質転換ラインを確立することができる。
【００１９】
また、未受精卵は上記操作の直後あるいは並行して人工授精を行った後、第１の方法と同様にして個体を得ることができる。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を、実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２１】
参考例１ ヒトインターフェロンα遺伝子を導入したトランスジェニックアコヤガイの作出
ヒトあるいはマウスインターフェロンα遺伝子(ＢＢＬ社、ＲＤＳ社より市販）をアデノウイルスベクター(宝酒造社製、タカラ・アデノウイルス発現ベクターキット)に組み込み組換えベクターを作製した。この操作は具体的には次のようにして行なった。上記市販のインターフェロンα遺伝子をコスミドベクター（pAxcwt(44,741 bp), Niwa, M. et al., (1991) Gene 108, 193,上記市販のアデノウイルス発現ベクターキットに含まれている）のSwa I部位に挿入した。組み込まれた遺伝子を持つコスミドベクターと、上記制限酵素で処理した上記市販のアデノウイルス由来ＤＮＡ−ＴＰＣ（Miyake, S. et al., (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 1320)とを２９３細胞（ヒト胎児腎細胞、大日本製薬株式会社製)に共存導入した。共存導入は、具体的には次のように行った。２９３細胞を１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ培地で、５％ＣＯ2、３７℃の条件下に１００％コンフルエントに培養し、上記コスミドベクターＤＮＡ１０μｇと制限酵素処理済みＤＮＡ−ＴＰＣ５μｇとを直径６ｃｍのシャーレ上で混合した。このトランスフェクションはリン酸カルシウム法で行った。共存導入後の細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２４時間培養後、増殖した組換えアデノウイルスの分画を集め、ＤＮＡ量(１００〜２００ｍｇ／個）をアコヤ貝の卵巣に注入し、別にオスから取出した精子(卵子の２倍量）と試験管内で混合し受精させた。これを海水中２５℃で、２４日間培養し、稚貝を得た。２００個の稚貝３１個中に、インターフェロン用ＤＮＡプローブの蛍光（FITC)の発色が見られた。さらに稚貝のＤＮＡを精製し、同じＤＮＡプローブにより配列を確認した。これらの貝は継続養殖された。
【００２２】
また、ウイルス感染により閉殻筋が赤色に変化することが報告されており、インターフェロン遺伝子の存在が確認された成貝では、２０個中１８個でこの積変が見られなかった。
【００２３】
一方、上記のようにして得た組換えアデノウイルスベクターをHela細胞にトランスフェクトし、Hela細胞中で増殖させた。Hela細胞へのトランスフェクト及び増殖は、Nature 1995, 374(6523):660-662に記載された方法により行なった。Hela細胞から常法により組換えベクターＤＮＡを回収し、これを10 mM Tris-HCl (pH7.5)、1 mM EDTAないし20 mMリン酸カリウム、3 mMクエン酸カリウム、2% PEG-6000 (pH7.5)中にＤＮＡ量５０〜１００μｇ／ｍｌの濃度で溶解してマイクロインジェクション用溶液を調製した。該溶液を、アコヤガイのメスの卵巣及びオスの精巣にマイクロインジェクションした。注入した溶液の量は、１箇所当たりＤＮＡ換算１００μｇで、卵巣又は精巣にそれぞれ３箇所注入した。２４〜４８時間後、精巣からの精子と卵巣からの成熟卵を用いて人工授精を行なった。人工授精は具体的には次のようにして行なった。アコヤ貝のオスより精巣を、メスより卵巣をそれぞれ切除し、試験管に精子と卵子を取出し１：２の割合で混合した。受精卵を海水中で２〜３週間、２５℃でインキュベートすることにより受精卵から第一代のアコヤガイ個体を得た。得られたアコヤガイの生殖巣から常法により全ＤＮＡを回収し、ヒトインターフェロンα遺伝子をプローブとして用いて常法（「バイオ実験イラストレイテッド」、上掲）によりサザンブロット法を行なった。さらに、アコヤガイの内臓塊、閉殻筋細胞から常法により全ｍＲＮＡを回収し、ヒトインターフェロンα遺伝子をプローブとして用いて常法（「バイオ実験イラストレイテッド」、上掲）によりノーザンブロット法を行なった。
【００２４】
サザンブロット陽性かつノーザンブロット陽性のメス及びオスの個体から採取した成熟卵及び精子を用いて上記と同様に人工授精を行い、上記と同様にして第２代の個体を得た。上記と同様にサザンブロット及びノーザンブロットを行なうことにより、ヒトインターフェロンα遺伝子を導入したトランスジェニックアコヤガイを３ライン選択した。
【００２５】
養殖アコヤガイの状態から、ウイルス汚染されていると考えられる海域及びウイルス汚染されていないと考えられる海域において、上記のように作出したトランスジェニックアコヤガイ及び対照として従来のアコヤガイを１８０日間養殖し、その致死率を比較した。結果を下記表１に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
表１から明らかなように、本発明のトランスジェニックアコヤガイ(ライン１〜３)では、非汚染海域における致死率は従来種と同等であるにもかかわらず、汚染海域における致死率は従来種よりも遥かに低かった。このことから、ヒトインターフェロンα遺伝子導入による致死率低下の効果が明瞭に認められた。
【００２８】
参考例２ ヒトインターフェロンβ遺伝子を導入したトランスジェニックアコヤガイの作出
ヒトインターフェロンα遺伝子に代えて、ヒトインターフェロンβ遺伝子(ＢＢＬ社より市販、HIGASHI, Y. et al. (1983) J. Biol. Chem. 258:92)を用いること、及びサザンブロット及びノーザンブロットで用いたプローブがインターフェロンβ遺伝子の５’末端４０塩基ないし５０塩基の配列フラグメントをFITC蛍光で修飾したプローブを用いたことを除き、参考例１と同じ操作を行い、ヒトインターフェロンβ遺伝子が導入されたトランスジェニックアコヤガイ(第２代)を作出した。
【００２９】
ヒトインターフェロンβ遺伝子導入の効果を参考例１と同様にして調べた。結果を下記表２に示す。
【００３０】
【表２】
【００３１】
参考例１の場合と同様、ヒトインターフェロンβ遺伝子導入の効果が明瞭に認められた。
【００３２】
参考例３ 緑色蛍光発光タンパク質(ＧＦＰ)遺伝子を持つアコヤガイの作製(1)
完全長ＧＦＰ遺伝子（Science 1994, 263:802-805; GenBank No. U53602、和光純薬工業より市販）を参考例１と同様にしてアデノウイルスベクターへ組み込んだ（増殖に用いた細胞は293細胞）。得られたＧＦＰ含有組換えベクターをＴＥ緩衝液で濃度１００ｍｇ／ｍｌとし、参考例１と同様にしてアコヤガイの卵巣にマイクロインジェクションした。以下、参考例１と同様にして(ただし、サザンブロット及びノーザンブロットで用いたプローブはＧＦＰ遺伝子である)、トランスジェニックアコヤガイ(第２代)を作出した。
【００３３】
得られたトランスジェニックアコヤガイの各組織において蛍光発光が認められるか否かを蛍光顕微鏡により調べた。結果を下記表３に示す。なお、表中「＋」は蛍光発光が認められたことを示し、「＋」の数が多いほど蛍光発光が強いことを意味する。
【００３４】
【表３】
【００３５】
実施例１ 緑色蛍光発光タンパク質(ＧＦＰ)遺伝子を持つアコヤガイの作製(2)
真珠貝のプリズムタンパク質は、真珠を構成している重要なタンパク質である。この実施例では、プリズムタンパク質の遺伝子に緑色蛍光発光タンパク質遺伝子を融合し、真珠に自己蛍光発光をさせる試みである。
【００３６】
アコヤガイのプリズムタンパク質遺伝子（Nature 1997, 387(6633):563-564; GenBank No. D860/3）をその読み始めコドン５ｋｂ上流を含めてクローンし、このプロモーターにＧＦＰ遺伝子を融合し、アデノウイルスベクターに導入した。プリズムタンパク質遺伝子(プロモーター含む)とＧＦＰ遺伝子の融合遺伝子は、M. Chalfie et al., Science 1994, 263:802-805に記載された方法により調製した。すなわち、上記読み始めコドン５ｋｂ上流を含むプリズムタンパク質遺伝子の開始コドンから１０ｎｔ目に、９ｎｔ、１０ｎｔ又は１１ｎｔのリンカー(ポリＴ)を結合し、市販のＧＦＰ遺伝子の５’末端に、それぞれ９、１０、あるいは１１ｎｔのポリＡリンカーを結合させたＤＮＡをハイブリダイズして、融合遺伝子を得た。得られた融合遺伝子を制限酵素NHeI及びEcoRIを用い、参考例１で用いたのと同じアデノウイルスベクターに挿入した。次いで参考例１と同様にして、プリズムタンパク質遺伝子とＧＦＰ遺伝子との融合遺伝子を導入したトランスジェニックアコヤガイを得た。得られたトランスジェニックアコヤガイの外套膜組織を蛍光顕微鏡で観察したところ、蛍光発光を認めた。
【００３７】
本実施例で得られたトランスジェニックアコヤガイは、プリズムタンパク質のプロモーター及び構造遺伝子の下流にＧＦＰ遺伝子を連結したものであり、これが発現されて蛍光が認められているので、このアコヤガイに真珠を作らせれば、真珠を構成するプリズムタンパク質にはＧＦＰが融合しているから、蛍光発光する真珠玉が形成されると考えられる。
【００３８】
実施例３ 緑色蛍光発光タンパク質(ＧＦＰ)遺伝子を持つアコヤガイの作製(3)
外套膜タンパク質は、プリズムタンパク質と同様に真珠を構成する大切なタンパク質である。実施例２のプリズムタンパク質遺伝子に代えてアコヤガイ外套膜タンパク質遺伝子（Nature 1997, 387(6633):563-564; GenBank No. 86074）を用いて実施例２と同様な操作を行ない、外套膜タンパク質遺伝子とＧＦＰ遺伝子との融合遺伝子を導入したトランスジェニックアコヤガイを作出した。なお、アコヤガイ外套膜タンパク質遺伝子とＧＦＰ遺伝子との融合及び該融合遺伝子とアデノウイルスベクターへの組み込みは、具体的には次のように行なった。実施例２と同様、外套膜タンパク質の開始コドン約５ｋｂ上流を含むＤＮＡ断片の開始コドンから１５ｂ目に９、１０あるいは１１ｎｔのポリＴを結合し、実施例２で用いたと同様のＧＦＰ遺伝子に９、１０、１１ｎｔのポリＡをハイブリダイズして融合遺伝子を作製した。得られた融合遺伝子を用いて実施例２と同様な操作を行い、トランスジェニックアコヤガイを得た。
【００３９】
得られたトランスジェニックアコヤガイの外套膜組織を蛍光顕微鏡で観察したところ、蛍光発光を認めた。
【００４０】
本実施例で得られたトランスジェニックアコヤガイは、外套膜タンパク質のプロモーター及び構造遺伝子の下流にＧＦＰ遺伝子を連結したものであり、これが発現されて蛍光が認められているので、このアコヤガイに真珠を作らせれば、真珠を構成する外套膜タンパク質にはＧＦＰが融合しているから、蛍光発光する真珠玉が形成されると考えられる。
【００４１】
参考例４ プロモータートラップ法によるＧＦＰ遺伝子又はLacZ遺伝子の導入
基本的にはI. A. Hope, Development 113巻339-408(1991年）の方法によった。先ず、参考例３に記載した方法により精巣及び卵巣にＧＦＰ遺伝子(１０〜５０ｍｇＤＮＡ／個）を注入し、のち試験管内で受精させた。これを海水中２５℃で培養し、３週間で稚貝を得た。約５〜１５％の稚貝にＧＦＰ特有の発色が認められた。これらを養殖槽で１２ヶ月間養殖し、成貝を得た。成貝を解剖し、特によく発色している臓器を単離し、ＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡ中にＧＦＰ遺伝子を発現するプロモーター遺伝子配列を解析した。タンパク質合成酵素や閉殻筋中の酵素のプロモーター遺伝子がトラップされた。
【００４２】
新しく単離されたプロモーター領域を含む配列の下流にＧＦＰあるいはLacZ遺伝子を挿入し、発現ベクターpAxCAwt（タカラアデノウイルス発現ベクターキット)からβ−アクチンプロモーターを制限酵素により切除したもののSwa I制限部位（サイトメガロウイルスエンハンサー配列とウサギβ−グロビンポリＡシグナルの間）に、得られた遺伝子を導入した。得られた組換えベクターを用い、濃度１００〜２００ｍｇ／ｍｌ程度の該ベクター溶液をシャーレに用意し、未受精卵を浸した。このように浸した未受精卵をマイクロインジェクション用マイクロピペットを用いて鋭利に一瞬だけ傷を付けるようにしてベクター液を卵に注入した。以後、参考例１と同様にしてトランスジェニックアコヤガイを得た。それぞれの遺伝子の発現量は分光学的に検出した。
【００４３】
得られたトランスジェニックアコヤガイについて、自己蛍光発光（ＧＦＰ遺伝子の場合）及び発色基質ＸＧによる染色（LacZ遺伝子の場合）による観察の結果、アコヤガイの種々の組織に蛍光発光あるいは染色が認められた。
【００４４】
【発明の効果】
本発明により、所望の外来遺伝子を発現することができるトランスジェニック軟体動物が初めて提供された。本発明により、着色真珠を形成する真珠貝等の産業上有用な種々の軟体動物を作出することが可能になった。
【発明の属する技術分野】
本発明は、トランスジェニック真珠貝びその作出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の真珠養殖では、ひたすら幾種類かの天然に存在する真珠の生産のみが可能であり、色調などは生産後に染色などで色調加工を行なってきた。これら生産後の加工は色調が退色しやすく、また望みの色調に加工することは真珠層の強固なことからほとんど不可能であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
もし、着色真珠を産生する能力を有するトランスジェニック真珠貝が得られれば、養殖真珠産業にとって有利である。しかしながら、着色に関与する所望の外来遺伝子を発現することができるトランスジェニック真珠貝は現在までのところ作出されていない。
【０００４】
従って、本発明の目的は、着色に関与する所望の外来遺伝子を発現することができるトランスジェニック真珠貝及びその作出方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、着色に関与する所望の外来遺伝子とプリズムタンパク質遺伝子又は外套膜タンパク質遺伝子との融合遺伝子を真珠貝のオス及びメスの生殖巣にマイクロインジェクションし、それらのオスとメスを交配することにより、外套膜組織中で着色に関与する所望の外来遺伝子を発現するトランスジェニック真珠貝を作出することに成功し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、着色に関与する所望の外来遺伝子が、プリズムタンパク質遺伝子又は外套膜タンパク質遺伝子との融合遺伝子の形態で導入され、該外来遺伝子を発現し、外套膜組織が着色されたトランスジェニック真珠貝を提供する。また、本発明は、導入しようとする着色に関与する所望の外来遺伝子とプリズムタンパク質遺伝子又は外套膜タンパク質遺伝子との融合遺伝子又は該融合遺伝子を含む核酸をベクターに組み込んだ組換えベクターを真珠貝のオス及び／又はメスの生殖巣にマイクロインジェクションし、これらのオスとメスを交配させて第１代を作り、前記所望の遺伝子を発現している個体を選択することを含む、上記本発明のトランスジェニック真珠貝の作出方法を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のトランスジェニック真珠貝としては、アコヤガイ、シロチョウガイ、クロチョウガイのような真珠貝を挙げることができる。
【０００８】
真珠貝に導入される着色に関与する所望の外来遺伝子の好ましい例として、緑色蛍光発光タンパク質（ＧＦＰ：グリーンフルーオレスンスタンパク質）遺伝子、アントシアニン遺伝子、蛍光ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、フォスファターゼ遺伝子等の着色に関与する遺伝子を挙げることができる。なお、ここで、「着色に関与する遺伝子」とは、上記の例示からも明らかなように、色素(蛍光色素を包含する)をコードする遺伝子のみならず、体内で色素を生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子等、体内での色素生成反応に関与する物質をコードする遺伝子をも包含する。
【０００９】
本発明のトランスジェニック真珠貝は次のようにして作出することができる。第一の方法では、上記着色に関与する所望の外来遺伝子とプリズムタンパク質遺伝子若しくは外套膜タンパク質遺伝子との融合遺伝子又は該融合遺伝子を含む核酸をベクターに組み込んだ組換えベクターを、真珠貝のオス及び／又はメスの生殖巣にマイクロインジェクションにより注入し、これらのオスとメスを交配して第１代の個体を作り、該第１代の個体の中から上記所望の外来遺伝子を発現している個体を選択する。
【００１０】
マイクロインジェクションされる組換えベクターに組み込むべきものは、上記外来遺伝子を他の遺伝子と融合させた融合遺伝子である。ここで、上記着色に関与する所望の外来遺伝子と融合される他の遺伝子は、プリズムタンパク質遺伝子又は外套膜タンパク質遺伝子である。ベクターとしては、アデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターのような動物細胞用ベクターを挙げることができる。これらのベクターは市販されているので、市販品を用いることができる。
【００１１】
上記組換えベクターを真珠貝の生殖巣にマイクロインジェクションする方法について説明する。基本的には、組換えベクターを含む溶液を注射針で直接生殖巣内に注入することにより行なうことができる。マイクロインジェクション用の溶液の媒体としては、ＴＥ緩衝液のような緩衝液でよく、溶液中の組換えベクターの濃度は、２〜２００μｇ／ｍｌ程度が好ましく、特には５〜１０μｇ／ｍｌ程度が好ましい。注入する溶液の量は、１箇所につき１０〜５０μｌ程度が好ましく、卵巣、精巣とも２〜４箇所程度に注入することが好ましい。
【００１２】
マイクロインジェクション後、１０〜２５℃、好ましくは１５〜２０℃で２４〜７２時間、好ましくは２４〜４８時間放置した後、マイクロインジェクションしたオスとメスを交配させる。交配は自然交配でもよいが、再現性良く確実に交配させるために人工授精を行なうことが好ましい。人工授精は、基本的に、マイクロインジェクションした精巣からの精子をマイクロインジェクションしたメスの卵巣中の成熟卵に添加することにより行なうことができる。なお、マイクロインジェクションは、交配させるオス及びメスの両者の生殖巣に対して行うことが好ましいが、いずれか一方の生殖巣に対して行ってもトランスジェニック真珠貝を作出することが可能である。軟体動物の人工授精の方法自体はDev Biol 1994, 163(1): 162-174等に記載の方法により行なうことができる。
【００１３】
受精卵からの個体の育成は、受精卵を海水又は人工海水中で、その真珠貝の通常の生育温度範囲でインキュベートすることにより容易に行なうことができる。
【００１４】
次いで、得られた個体から形質転換体を選択する。これは、真珠貝の細胞中に、導入しようとする着色に関与する所望の外来遺伝子が存在するか否かをサザンブロット法により調べ、さらに真珠貝細胞で該外来遺伝子が発現されているか否かをノーザンブロット法により調べることにより行なうことができる。サザンブロット法及びノーザンブロット法自体及びそのための試料の調製方法自体はこの分野において周知であり、例えば中山・西方著、「バイオ実験イラストレイテッド(2)遺伝子解析の基礎」、秀潤社(１９９５)に記載されている。
【００１５】
形質転換ラインを確立するために、上記の方法により形質転換体であることが確認された第一代の真珠貝のオス及びメスを上記と同様にして交配させ、第二代の個体を得、その中から上記と同様にして形質転換体を選択することが好ましい。さらに第三代以降を同様にして作ることにより、より確実に形質転換ラインを確立することが可能である。
【００１６】
トランスジェニック真珠貝を作出する第二の方法では、形質転換しようとする真珠貝中でプロモーター活性を発揮するプロモーターの下流に、前記着色に関与する所望の遺伝子を機能的に連結した核酸を組み込んだ組換えベクターを該真珠貝の未受精卵、受精卵又は胚に導入し、該未受精卵、受精卵又は胚を個体にまで成長させ、前記所望の遺伝子を発現している個体を選択する。
【００１７】
形質転換しようとする真珠貝でプロモーター活性を発揮するプロモーターは、形質転換しようとする真珠貝中でプロモーター活性を発揮するものであればいずれのものであってもよく、例えばアクチン遺伝子プロモーター、熱ショックプロテイン遺伝子プロモーター等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、所望の外来遺伝子をプロモーターの下流に「機能的に連結」するとは、該外来遺伝子が該プロモーターの支配を受けるように読み枠を合わせて連結することを意味する。この場合、プロモーターの下流に機能的に連結された他の構造遺伝子又はその断片の下流に上記所望の外来遺伝子を読み枠を合わせて連結して、融合タンパク質として発現させることも可能である。なお、プロモーターの下流に構造遺伝子を機能的に連結する方法はこの分野において周知である。組換えベクターは、第１の方法と同様にして調製することができる。
【００１８】
次いで、調製した組換えベクターを真珠貝の未受精卵、受精卵又は胚、好ましくは未受精卵に導入する。これは例えば次のようにして行なうことができる。濃度１００〜２００ｍｇ／ｍｌ程度のベクター溶液をシャーレあるいはウェルに用意し、未受精卵あるいは受精卵又は胚を浸す。このように浸した卵あるいは胚をマイクロインジェクション用マイクロピペットを用いて（これに限るものではない)鋭利に一瞬だけ傷を付けるようにしてベクター液を卵あるいは胚内に注入する。この時、破裂は勿論のこと致命傷にならない程度に傷穴を空けることが肝心である。組換えベクターを導入した受精卵又は胚から第１の方法と同様にして個体を得ることができ、第１の方法と同様にして形質転換体を選択し、形質転換ラインを確立することができる。
【００１９】
また、未受精卵は上記操作の直後あるいは並行して人工授精を行った後、第１の方法と同様にして個体を得ることができる。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を、実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２１】
参考例１ ヒトインターフェロンα遺伝子を導入したトランスジェニックアコヤガイの作出
ヒトあるいはマウスインターフェロンα遺伝子(ＢＢＬ社、ＲＤＳ社より市販）をアデノウイルスベクター(宝酒造社製、タカラ・アデノウイルス発現ベクターキット)に組み込み組換えベクターを作製した。この操作は具体的には次のようにして行なった。上記市販のインターフェロンα遺伝子をコスミドベクター（pAxcwt(44,741 bp), Niwa, M. et al., (1991) Gene 108, 193,上記市販のアデノウイルス発現ベクターキットに含まれている）のSwa I部位に挿入した。組み込まれた遺伝子を持つコスミドベクターと、上記制限酵素で処理した上記市販のアデノウイルス由来ＤＮＡ−ＴＰＣ（Miyake, S. et al., (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 1320)とを２９３細胞（ヒト胎児腎細胞、大日本製薬株式会社製)に共存導入した。共存導入は、具体的には次のように行った。２９３細胞を１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ培地で、５％ＣＯ2、３７℃の条件下に１００％コンフルエントに培養し、上記コスミドベクターＤＮＡ１０μｇと制限酵素処理済みＤＮＡ−ＴＰＣ５μｇとを直径６ｃｍのシャーレ上で混合した。このトランスフェクションはリン酸カルシウム法で行った。共存導入後の細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２４時間培養後、増殖した組換えアデノウイルスの分画を集め、ＤＮＡ量(１００〜２００ｍｇ／個）をアコヤ貝の卵巣に注入し、別にオスから取出した精子(卵子の２倍量）と試験管内で混合し受精させた。これを海水中２５℃で、２４日間培養し、稚貝を得た。２００個の稚貝３１個中に、インターフェロン用ＤＮＡプローブの蛍光（FITC)の発色が見られた。さらに稚貝のＤＮＡを精製し、同じＤＮＡプローブにより配列を確認した。これらの貝は継続養殖された。
【００２２】
また、ウイルス感染により閉殻筋が赤色に変化することが報告されており、インターフェロン遺伝子の存在が確認された成貝では、２０個中１８個でこの積変が見られなかった。
【００２３】
一方、上記のようにして得た組換えアデノウイルスベクターをHela細胞にトランスフェクトし、Hela細胞中で増殖させた。Hela細胞へのトランスフェクト及び増殖は、Nature 1995, 374(6523):660-662に記載された方法により行なった。Hela細胞から常法により組換えベクターＤＮＡを回収し、これを10 mM Tris-HCl (pH7.5)、1 mM EDTAないし20 mMリン酸カリウム、3 mMクエン酸カリウム、2% PEG-6000 (pH7.5)中にＤＮＡ量５０〜１００μｇ／ｍｌの濃度で溶解してマイクロインジェクション用溶液を調製した。該溶液を、アコヤガイのメスの卵巣及びオスの精巣にマイクロインジェクションした。注入した溶液の量は、１箇所当たりＤＮＡ換算１００μｇで、卵巣又は精巣にそれぞれ３箇所注入した。２４〜４８時間後、精巣からの精子と卵巣からの成熟卵を用いて人工授精を行なった。人工授精は具体的には次のようにして行なった。アコヤ貝のオスより精巣を、メスより卵巣をそれぞれ切除し、試験管に精子と卵子を取出し１：２の割合で混合した。受精卵を海水中で２〜３週間、２５℃でインキュベートすることにより受精卵から第一代のアコヤガイ個体を得た。得られたアコヤガイの生殖巣から常法により全ＤＮＡを回収し、ヒトインターフェロンα遺伝子をプローブとして用いて常法（「バイオ実験イラストレイテッド」、上掲）によりサザンブロット法を行なった。さらに、アコヤガイの内臓塊、閉殻筋細胞から常法により全ｍＲＮＡを回収し、ヒトインターフェロンα遺伝子をプローブとして用いて常法（「バイオ実験イラストレイテッド」、上掲）によりノーザンブロット法を行なった。
【００２４】
サザンブロット陽性かつノーザンブロット陽性のメス及びオスの個体から採取した成熟卵及び精子を用いて上記と同様に人工授精を行い、上記と同様にして第２代の個体を得た。上記と同様にサザンブロット及びノーザンブロットを行なうことにより、ヒトインターフェロンα遺伝子を導入したトランスジェニックアコヤガイを３ライン選択した。
【００２５】
養殖アコヤガイの状態から、ウイルス汚染されていると考えられる海域及びウイルス汚染されていないと考えられる海域において、上記のように作出したトランスジェニックアコヤガイ及び対照として従来のアコヤガイを１８０日間養殖し、その致死率を比較した。結果を下記表１に示す。
【００２６】
【表１】
表１から明らかなように、本発明のトランスジェニックアコヤガイ(ライン１〜３)では、非汚染海域における致死率は従来種と同等であるにもかかわらず、汚染海域における致死率は従来種よりも遥かに低かった。このことから、ヒトインターフェロンα遺伝子導入による致死率低下の効果が明瞭に認められた。
【００２８】
参考例２ ヒトインターフェロンβ遺伝子を導入したトランスジェニックアコヤガイの作出
ヒトインターフェロンα遺伝子に代えて、ヒトインターフェロンβ遺伝子(ＢＢＬ社より市販、HIGASHI, Y. et al. (1983) J. Biol. Chem. 258:92)を用いること、及びサザンブロット及びノーザンブロットで用いたプローブがインターフェロンβ遺伝子の５’末端４０塩基ないし５０塩基の配列フラグメントをFITC蛍光で修飾したプローブを用いたことを除き、参考例１と同じ操作を行い、ヒトインターフェロンβ遺伝子が導入されたトランスジェニックアコヤガイ(第２代)を作出した。
【００２９】
ヒトインターフェロンβ遺伝子導入の効果を参考例１と同様にして調べた。結果を下記表２に示す。
【００３０】
【表２】
参考例１の場合と同様、ヒトインターフェロンβ遺伝子導入の効果が明瞭に認められた。
【００３２】
参考例３ 緑色蛍光発光タンパク質(ＧＦＰ)遺伝子を持つアコヤガイの作製(1)
完全長ＧＦＰ遺伝子（Science 1994, 263:802-805; GenBank No. U53602、和光純薬工業より市販）を参考例１と同様にしてアデノウイルスベクターへ組み込んだ（増殖に用いた細胞は293細胞）。得られたＧＦＰ含有組換えベクターをＴＥ緩衝液で濃度１００ｍｇ／ｍｌとし、参考例１と同様にしてアコヤガイの卵巣にマイクロインジェクションした。以下、参考例１と同様にして(ただし、サザンブロット及びノーザンブロットで用いたプローブはＧＦＰ遺伝子である)、トランスジェニックアコヤガイ(第２代)を作出した。
【００３３】
得られたトランスジェニックアコヤガイの各組織において蛍光発光が認められるか否かを蛍光顕微鏡により調べた。結果を下記表３に示す。なお、表中「＋」は蛍光発光が認められたことを示し、「＋」の数が多いほど蛍光発光が強いことを意味する。
【００３４】
【表３】
実施例１ 緑色蛍光発光タンパク質(ＧＦＰ)遺伝子を持つアコヤガイの作製(2)
真珠貝のプリズムタンパク質は、真珠を構成している重要なタンパク質である。この実施例では、プリズムタンパク質の遺伝子に緑色蛍光発光タンパク質遺伝子を融合し、真珠に自己蛍光発光をさせる試みである。
【００３６】
アコヤガイのプリズムタンパク質遺伝子（Nature 1997, 387(6633):563-564; GenBank No. D860/3）をその読み始めコドン５ｋｂ上流を含めてクローンし、このプロモーターにＧＦＰ遺伝子を融合し、アデノウイルスベクターに導入した。プリズムタンパク質遺伝子(プロモーター含む)とＧＦＰ遺伝子の融合遺伝子は、M. Chalfie et al., Science 1994, 263:802-805に記載された方法により調製した。すなわち、上記読み始めコドン５ｋｂ上流を含むプリズムタンパク質遺伝子の開始コドンから１０ｎｔ目に、９ｎｔ、１０ｎｔ又は１１ｎｔのリンカー(ポリＴ)を結合し、市販のＧＦＰ遺伝子の５’末端に、それぞれ９、１０、あるいは１１ｎｔのポリＡリンカーを結合させたＤＮＡをハイブリダイズして、融合遺伝子を得た。得られた融合遺伝子を制限酵素NHeI及びEcoRIを用い、参考例１で用いたのと同じアデノウイルスベクターに挿入した。次いで参考例１と同様にして、プリズムタンパク質遺伝子とＧＦＰ遺伝子との融合遺伝子を導入したトランスジェニックアコヤガイを得た。得られたトランスジェニックアコヤガイの外套膜組織を蛍光顕微鏡で観察したところ、蛍光発光を認めた。
【００３７】
本実施例で得られたトランスジェニックアコヤガイは、プリズムタンパク質のプロモーター及び構造遺伝子の下流にＧＦＰ遺伝子を連結したものであり、これが発現されて蛍光が認められているので、このアコヤガイに真珠を作らせれば、真珠を構成するプリズムタンパク質にはＧＦＰが融合しているから、蛍光発光する真珠玉が形成されると考えられる。
【００３８】
実施例３ 緑色蛍光発光タンパク質(ＧＦＰ)遺伝子を持つアコヤガイの作製(3)
外套膜タンパク質は、プリズムタンパク質と同様に真珠を構成する大切なタンパク質である。実施例２のプリズムタンパク質遺伝子に代えてアコヤガイ外套膜タンパク質遺伝子（Nature 1997, 387(6633):563-564; GenBank No. 86074）を用いて実施例２と同様な操作を行ない、外套膜タンパク質遺伝子とＧＦＰ遺伝子との融合遺伝子を導入したトランスジェニックアコヤガイを作出した。なお、アコヤガイ外套膜タンパク質遺伝子とＧＦＰ遺伝子との融合及び該融合遺伝子とアデノウイルスベクターへの組み込みは、具体的には次のように行なった。実施例２と同様、外套膜タンパク質の開始コドン約５ｋｂ上流を含むＤＮＡ断片の開始コドンから１５ｂ目に９、１０あるいは１１ｎｔのポリＴを結合し、実施例２で用いたと同様のＧＦＰ遺伝子に９、１０、１１ｎｔのポリＡをハイブリダイズして融合遺伝子を作製した。得られた融合遺伝子を用いて実施例２と同様な操作を行い、トランスジェニックアコヤガイを得た。
【００３９】
得られたトランスジェニックアコヤガイの外套膜組織を蛍光顕微鏡で観察したところ、蛍光発光を認めた。
【００４０】
本実施例で得られたトランスジェニックアコヤガイは、外套膜タンパク質のプロモーター及び構造遺伝子の下流にＧＦＰ遺伝子を連結したものであり、これが発現されて蛍光が認められているので、このアコヤガイに真珠を作らせれば、真珠を構成する外套膜タンパク質にはＧＦＰが融合しているから、蛍光発光する真珠玉が形成されると考えられる。
【００４１】
参考例４ プロモータートラップ法によるＧＦＰ遺伝子又はLacZ遺伝子の導入
基本的にはI. A. Hope, Development 113巻339-408(1991年）の方法によった。先ず、参考例３に記載した方法により精巣及び卵巣にＧＦＰ遺伝子(１０〜５０ｍｇＤＮＡ／個）を注入し、のち試験管内で受精させた。これを海水中２５℃で培養し、３週間で稚貝を得た。約５〜１５％の稚貝にＧＦＰ特有の発色が認められた。これらを養殖槽で１２ヶ月間養殖し、成貝を得た。成貝を解剖し、特によく発色している臓器を単離し、ＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡ中にＧＦＰ遺伝子を発現するプロモーター遺伝子配列を解析した。タンパク質合成酵素や閉殻筋中の酵素のプロモーター遺伝子がトラップされた。
【００４２】
新しく単離されたプロモーター領域を含む配列の下流にＧＦＰあるいはLacZ遺伝子を挿入し、発現ベクターpAxCAwt（タカラアデノウイルス発現ベクターキット)からβ−アクチンプロモーターを制限酵素により切除したもののSwa I制限部位（サイトメガロウイルスエンハンサー配列とウサギβ−グロビンポリＡシグナルの間）に、得られた遺伝子を導入した。得られた組換えベクターを用い、濃度１００〜２００ｍｇ／ｍｌ程度の該ベクター溶液をシャーレに用意し、未受精卵を浸した。このように浸した未受精卵をマイクロインジェクション用マイクロピペットを用いて鋭利に一瞬だけ傷を付けるようにしてベクター液を卵に注入した。以後、参考例１と同様にしてトランスジェニックアコヤガイを得た。それぞれの遺伝子の発現量は分光学的に検出した。
【００４３】
得られたトランスジェニックアコヤガイについて、自己蛍光発光（ＧＦＰ遺伝子の場合）及び発色基質ＸＧによる染色（LacZ遺伝子の場合）による観察の結果、アコヤガイの種々の組織に蛍光発光あるいは染色が認められた。
【００４４】
【発明の効果】
本発明により、所望の外来遺伝子を発現することができるトランスジェニック軟体動物が初めて提供された。本発明により、着色真珠を形成する真珠貝等の産業上有用な種々の軟体動物を作出することが可能になった。
Claims (4)
- 着色に関与する所望の外来遺伝子が、プリズムタンパク質遺伝子又は外套膜タンパク質遺伝子との融合遺伝子の形態で導入され、該外来遺伝子を発現し、外套膜組織が着色されたトランスジェニック真珠貝。
- 前記着色に関与する遺伝子は、緑色蛍光発光タンパク質遺伝子であり、外套膜組織が蛍光を発する請求項１記載のトランスジェニック真珠貝。
- 導入しようとする着色に関与する所望の外来遺伝子とプリズムタンパク質遺伝子又は外套膜タンパク質遺伝子との融合遺伝子又は該融合遺伝子を含む核酸をベクターに組み込んだ組換えベクターを真珠貝のオス及び／又はメスの生殖巣にマイクロインジェクションし、これらのオスとメスを交配させて第１代を作り、前記所望の遺伝子を発現している個体を選択することを含む、請求項１又は２記載のトランスジェニック真珠貝の作出方法。
- 前記所望の遺伝子を発現している前記第１代のオスとメスを交配して第２代を作り、前記所望の遺伝子を発現している個体を選択することをさらに含む、請求項３記載の方法。
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