JP2000245452A - トランスジェニック軟体動物及びその作出方法 - Google Patents
トランスジェニック軟体動物及びその作出方法Info
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- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 所望の外来遺伝子を発現することができるト
ランスジェニック軟体動物及びその作出方法を提供する
こと。 【解決手段】 所望の外来遺伝子が導入され、該外来遺
伝子を発現するトランスジェニック軟体動物並びに導入
しようとする所望の外来遺伝子又は該外来遺伝子を含む
核酸をベクターに組み込んだ組換えベクターを軟体動物
のオス及びメスの生殖巣にそれぞれマイクロインジェク
ションし、これらのオスとメスを交配させて第１代を作
り、前記所望の遺伝子を発現している個体を選択するこ
とを含む、トランスジェニック軟体動物の作出方法が提
供された。
ランスジェニック軟体動物及びその作出方法を提供する
こと。 【解決手段】 所望の外来遺伝子が導入され、該外来遺
伝子を発現するトランスジェニック軟体動物並びに導入
しようとする所望の外来遺伝子又は該外来遺伝子を含む
核酸をベクターに組み込んだ組換えベクターを軟体動物
のオス及びメスの生殖巣にそれぞれマイクロインジェク
ションし、これらのオスとメスを交配させて第１代を作
り、前記所望の遺伝子を発現している個体を選択するこ
とを含む、トランスジェニック軟体動物の作出方法が提
供された。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、トランスジェニッ
ク軟体動物及びその作出方法に関する。
ク軟体動物及びその作出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】一方、従来の真珠養殖では、ひたすら幾
種類かの天然に存在する真珠の生産のみが可能であり、
色調などは生産後に染色などで色調加工を行なってき
た。これら生産後の加工は色調が退色しやすく、また望
みの色調に加工することは真珠層の強固なことからほと
んど不可能であった。
種類かの天然に存在する真珠の生産のみが可能であり、
色調などは生産後に染色などで色調加工を行なってき
た。これら生産後の加工は色調が退色しやすく、また望
みの色調に加工することは真珠層の強固なことからほと
んど不可能であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】もし、ウイルス抵抗性
や、着色真珠を産生する能力を有するトランスジェニッ
ク真珠貝が得られれば、養殖真珠産業にとって有利であ
る。しかしながら、このような有用な性質を有するトラ
ンスジェニック真珠貝は言うに及ばず、軟体動物門全体
においても、所望の外来遺伝子を発現することができる
トランスジェニック軟体動物は現在までのところ作出さ
れていない。
や、着色真珠を産生する能力を有するトランスジェニッ
ク真珠貝が得られれば、養殖真珠産業にとって有利であ
る。しかしながら、このような有用な性質を有するトラ
ンスジェニック真珠貝は言うに及ばず、軟体動物門全体
においても、所望の外来遺伝子を発現することができる
トランスジェニック軟体動物は現在までのところ作出さ
れていない。
【０００４】従って、本発明の目的は、所望の外来遺伝
子を発現することができるトランスジェニック軟体動物
及びその作出方法を提供することである。
子を発現することができるトランスジェニック軟体動物
及びその作出方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、所望の外来遺伝子を軟体動物のオス及びメス
の生殖巣にマイクロインジェクションし、それらのオス
とメスを交配することにより、又は軟体動物中で機能す
るプロモーターの下流に所望の外来遺伝子を連結したも
のを軟体動物の受精卵又は胚に導入することにより、所
望の外来遺伝子を発現するトランスジェニック軟体動物
を作出することに成功し、本発明を完成した。
究の結果、所望の外来遺伝子を軟体動物のオス及びメス
の生殖巣にマイクロインジェクションし、それらのオス
とメスを交配することにより、又は軟体動物中で機能す
るプロモーターの下流に所望の外来遺伝子を連結したも
のを軟体動物の受精卵又は胚に導入することにより、所
望の外来遺伝子を発現するトランスジェニック軟体動物
を作出することに成功し、本発明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、所望の外来遺伝子
（ウイルス抵抗性を付与する遺伝子を除く）が導入さ
れ、該外来遺伝子を発現するトランスジェニック軟体動
物を提供する。また、本発明は、導入しようとする所望
の外来遺伝子又は該外来遺伝子を含む核酸をベクターに
組み込んだ組換えベクターを軟体動物のオス及び／又は
メスの生殖巣にマイクロインジェクションし、これらの
オスとメスを交配させて第１代を作り、前記所望の遺伝
子を発現している個体を選択することを含む、上記本発
明のトランスジェニック軟体動物の作出方法を提供す
る。さらに本発明は、形質転換しようとする軟体動物中
の本来の遺伝子ないしこれを修飾したプロモーター活性
を発揮するプロモーターの下流に、前記所望の遺伝子を
機能的に連結した核酸を組み込んだ組換えベクターを該
軟体動物の受精卵又は胚に導入し、該受精卵又は胚を個
体にまで成長させ、前記所望の遺伝子を発現している個
体を選択することを含む、上記本発明のトランスジェニ
ック軟体動物の作出方法を提供する。
（ウイルス抵抗性を付与する遺伝子を除く）が導入さ
れ、該外来遺伝子を発現するトランスジェニック軟体動
物を提供する。また、本発明は、導入しようとする所望
の外来遺伝子又は該外来遺伝子を含む核酸をベクターに
組み込んだ組換えベクターを軟体動物のオス及び／又は
メスの生殖巣にマイクロインジェクションし、これらの
オスとメスを交配させて第１代を作り、前記所望の遺伝
子を発現している個体を選択することを含む、上記本発
明のトランスジェニック軟体動物の作出方法を提供す
る。さらに本発明は、形質転換しようとする軟体動物中
の本来の遺伝子ないしこれを修飾したプロモーター活性
を発揮するプロモーターの下流に、前記所望の遺伝子を
機能的に連結した核酸を組み込んだ組換えベクターを該
軟体動物の受精卵又は胚に導入し、該受精卵又は胚を個
体にまで成長させ、前記所望の遺伝子を発現している個
体を選択することを含む、上記本発明のトランスジェニ
ック軟体動物の作出方法を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明のトランスジェニック軟体
動物は、軟体動物門に属する動物であればいずれのもの
でもよいが、好ましい例として、ニマイガイ綱（斧足
類）やマキガイ綱(腹足類)のような貝類、とりわけ、ア
コヤガイ、シロチョウガイ、クロチョウガイのような真
珠貝を挙げることができる。
動物は、軟体動物門に属する動物であればいずれのもの
でもよいが、好ましい例として、ニマイガイ綱（斧足
類）やマキガイ綱(腹足類)のような貝類、とりわけ、ア
コヤガイ、シロチョウガイ、クロチョウガイのような真
珠貝を挙げることができる。
【０００８】軟体動物に導入される所望の外来遺伝子
は、軟体動物に付与しようとする形質を与えることがで
きるいずれの遺伝子であってもよい(ただし、ウイルス
抵抗性を付与する遺伝子を除く）。好ましい例として、
軟体動物が真珠貝の場合には、緑色蛍光発光タンパク質
（ＧＦＰ：グリーンフルーオレスンスタンパク質）遺伝
子、アントシアニン遺伝子、蛍光ルシフェラーゼ遺伝
子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、フォスファターゼ遺
伝子等の着色に関与する遺伝子を挙げることができる。
なお、ここで、「着色に関与する遺伝子」とは、上記の
例示からも明らかなように、色素(蛍光色素を包含する)
をコードする遺伝子のみならず、体内で色素を生成する
反応を触媒する酵素をコードする遺伝子等、体内での色
素生成反応に関与する物質をコードする遺伝子をも包含
する。
は、軟体動物に付与しようとする形質を与えることがで
きるいずれの遺伝子であってもよい(ただし、ウイルス
抵抗性を付与する遺伝子を除く）。好ましい例として、
軟体動物が真珠貝の場合には、緑色蛍光発光タンパク質
（ＧＦＰ：グリーンフルーオレスンスタンパク質）遺伝
子、アントシアニン遺伝子、蛍光ルシフェラーゼ遺伝
子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、フォスファターゼ遺
伝子等の着色に関与する遺伝子を挙げることができる。
なお、ここで、「着色に関与する遺伝子」とは、上記の
例示からも明らかなように、色素(蛍光色素を包含する)
をコードする遺伝子のみならず、体内で色素を生成する
反応を触媒する酵素をコードする遺伝子等、体内での色
素生成反応に関与する物質をコードする遺伝子をも包含
する。
【０００９】本発明のトランスジェニック軟体動物は次
のようにして作出することができる。第一の方法では、
上記所望の外来遺伝子又は該外来遺伝子を含む核酸をベ
クターに組み込んだ組換えベクターを、軟体動物のオス
及び／又はメスの生殖巣にマイクロインジェクションに
より注入し、これらのオスとメスを交配して第１代の個
体を作り、該第１代の個体の中から上記所望の外来遺伝
子を発現している個体を選択する。
のようにして作出することができる。第一の方法では、
上記所望の外来遺伝子又は該外来遺伝子を含む核酸をベ
クターに組み込んだ組換えベクターを、軟体動物のオス
及び／又はメスの生殖巣にマイクロインジェクションに
より注入し、これらのオスとメスを交配して第１代の個
体を作り、該第１代の個体の中から上記所望の外来遺伝
子を発現している個体を選択する。
【００１０】マイクロインジェクションされる組換えベ
クターに組み込むべきものは、上記所望の外来遺伝子の
みであってもよいし、該外来遺伝子を含む核酸であって
もよい。このような核酸の例として、該外来遺伝子の上
流に、軟体動物細胞中でプロモーター活性を発揮するプ
ロモーターを結合したもの及び該外来遺伝子を他の遺伝
子と融合させた融合遺伝子等を挙げることができる。な
お、ここで、上記所望の外来遺伝子と融合される他の遺
伝子の好ましい例として、外来遺伝子が着色に関与する
遺伝子であり、軟体動物が真珠貝の場合には、真珠層タ
ンパク質遺伝子、プリズム層骨格タンパク質遺伝子、炭
酸カルシウム結晶化酵素遺伝子等を挙げることができ
る。ベクターとしては、アデノウイルスベクターやレト
ロウイルスベクターのような動物細胞用ベクターを挙げ
ることができる。これらのベクターは市販されているの
で、市販品を用いることができる。
クターに組み込むべきものは、上記所望の外来遺伝子の
みであってもよいし、該外来遺伝子を含む核酸であって
もよい。このような核酸の例として、該外来遺伝子の上
流に、軟体動物細胞中でプロモーター活性を発揮するプ
ロモーターを結合したもの及び該外来遺伝子を他の遺伝
子と融合させた融合遺伝子等を挙げることができる。な
お、ここで、上記所望の外来遺伝子と融合される他の遺
伝子の好ましい例として、外来遺伝子が着色に関与する
遺伝子であり、軟体動物が真珠貝の場合には、真珠層タ
ンパク質遺伝子、プリズム層骨格タンパク質遺伝子、炭
酸カルシウム結晶化酵素遺伝子等を挙げることができ
る。ベクターとしては、アデノウイルスベクターやレト
ロウイルスベクターのような動物細胞用ベクターを挙げ
ることができる。これらのベクターは市販されているの
で、市販品を用いることができる。
【００１１】上記組換えベクターを軟体動物の生殖巣に
マイクロインジェクションする方法について説明する。
基本的には、組換えベクターを含む溶液を注射針で直接
生殖巣内に注入することにより行なうことができる。マ
イクロインジェクション用の溶液の媒体としては、ＴＥ
緩衝液のような緩衝液でよく、溶液中の組換えベクター
の濃度は、２〜２００μｇ／ｍｌ程度が好ましく、特に
は５〜１０μｇ／ｍｌ程度が好ましい。注入する溶液の
量は、１箇所につき１０〜５０μｌ程度が好ましく、卵
巣、精巣とも２〜４箇所程度に注入することが好まし
い。
マイクロインジェクションする方法について説明する。
基本的には、組換えベクターを含む溶液を注射針で直接
生殖巣内に注入することにより行なうことができる。マ
イクロインジェクション用の溶液の媒体としては、ＴＥ
緩衝液のような緩衝液でよく、溶液中の組換えベクター
の濃度は、２〜２００μｇ／ｍｌ程度が好ましく、特に
は５〜１０μｇ／ｍｌ程度が好ましい。注入する溶液の
量は、１箇所につき１０〜５０μｌ程度が好ましく、卵
巣、精巣とも２〜４箇所程度に注入することが好まし
い。
【００１２】マイクロインジェクション後、１０〜２５
℃、好ましくは１５〜２０℃で２４〜７２時間、好まし
くは２４〜４８時間放置した後、マイクロインジェクシ
ョンしたオスとメスを交配させる。交配は自然交配でも
よいが、再現性良く確実に交配させるために人工授精を
行なうことが好ましい。人工授精は、基本的に、マイク
ロインジェクションした精巣からの精子をマイクロイン
ジェクションしたメスの卵巣中の成熟卵に添加すること
により行なうことができる。なお、マイクロインジェク
ションは、交配させるオス及びメスの両者の生殖巣に対
して行うことが好ましいが、いずれか一方の生殖巣に対
して行ってもトランスジェニック軟体動物を作出するこ
とが可能である。軟体動物の人工授精の方法自体はDev
Biol 1994, 163(1): 162-174等に記載の方法により行な
うことができる。
℃、好ましくは１５〜２０℃で２４〜７２時間、好まし
くは２４〜４８時間放置した後、マイクロインジェクシ
ョンしたオスとメスを交配させる。交配は自然交配でも
よいが、再現性良く確実に交配させるために人工授精を
行なうことが好ましい。人工授精は、基本的に、マイク
ロインジェクションした精巣からの精子をマイクロイン
ジェクションしたメスの卵巣中の成熟卵に添加すること
により行なうことができる。なお、マイクロインジェク
ションは、交配させるオス及びメスの両者の生殖巣に対
して行うことが好ましいが、いずれか一方の生殖巣に対
して行ってもトランスジェニック軟体動物を作出するこ
とが可能である。軟体動物の人工授精の方法自体はDev
Biol 1994, 163(1): 162-174等に記載の方法により行な
うことができる。
【００１３】受精卵からの個体の育成は、受精卵を海水
又は人工海水中で、その軟体動物の通常の生育温度範囲
でインキュベートすることにより容易に行なうことがで
きる。
又は人工海水中で、その軟体動物の通常の生育温度範囲
でインキュベートすることにより容易に行なうことがで
きる。
【００１４】次いで、得られた個体から形質転換体を選
択する。これは、軟体動物の細胞中に、導入しようとす
る所望の外来遺伝子が存在するか否かをサザンブロット
法により調べ、さらに軟体動物細胞で該外来遺伝子が発
現されているか否かをノーザンブロット法により調べる
ことにより行なうことができる。サザンブロット法及び
ノーザンブロット法自体及びそのための試料の調製方法
自体はこの分野において周知であり、例えば中山・西方
著、「バイオ実験イラストレイテッド−遺伝子解析の
基礎」、秀潤社(１９９５)に記載されている。
択する。これは、軟体動物の細胞中に、導入しようとす
る所望の外来遺伝子が存在するか否かをサザンブロット
法により調べ、さらに軟体動物細胞で該外来遺伝子が発
現されているか否かをノーザンブロット法により調べる
ことにより行なうことができる。サザンブロット法及び
ノーザンブロット法自体及びそのための試料の調製方法
自体はこの分野において周知であり、例えば中山・西方
著、「バイオ実験イラストレイテッド−遺伝子解析の
基礎」、秀潤社(１９９５)に記載されている。
【００１５】形質転換ラインを確立するために、上記の
方法により形質転換体であることが確認された第一代の
軟体動物のオス及びメスを上記と同様にして交配させ、
第二代の個体を得、その中から上記と同様にして形質転
換体を選択することが好ましい。さらに第三代以降を同
様にして作ることにより、より確実に形質転換ラインを
確立することが可能である。
方法により形質転換体であることが確認された第一代の
軟体動物のオス及びメスを上記と同様にして交配させ、
第二代の個体を得、その中から上記と同様にして形質転
換体を選択することが好ましい。さらに第三代以降を同
様にして作ることにより、より確実に形質転換ラインを
確立することが可能である。
【００１６】トランスジェニック軟体動物を作出する第
二の方法では、形質転換しようとする軟体動物中でプロ
モーター活性を発揮するプロモーターの下流に、前記所
望の遺伝子を機能的に連結した核酸を組み込んだ組換え
ベクターを該軟体動物の未受精卵、受精卵又は胚に導入
し、該未受精卵、受精卵又は胚を個体にまで成長させ、
前記所望の遺伝子を発現している個体を選択する。
二の方法では、形質転換しようとする軟体動物中でプロ
モーター活性を発揮するプロモーターの下流に、前記所
望の遺伝子を機能的に連結した核酸を組み込んだ組換え
ベクターを該軟体動物の未受精卵、受精卵又は胚に導入
し、該未受精卵、受精卵又は胚を個体にまで成長させ、
前記所望の遺伝子を発現している個体を選択する。
【００１７】形質転換しようとする軟体動物中でプロモ
ーター活性を発揮するプロモーターは、形質転換しよう
とする軟体動物中でプロモーター活性を発揮するもので
あればいずれのものであってもよく、例えばアクチン遺
伝子プロモーター、熱ショックプロテイン遺伝子プロモ
ーター等を挙げることができるがこれらに限定されるも
のではない。また、所望の外来遺伝子をプロモーターの
下流に「機能的に連結」するとは、該外来遺伝子が該プロ
モーターの支配を受けるように読み枠を合わせて連結す
ることを意味する。この場合、プロモーターの下流に機
能的に連結された他の構造遺伝子又はその断片の下流に
上記所望の外来遺伝子を読み枠を合わせて連結して、融
合タンパク質として発現させることも可能である。な
お、プロモーターの下流に構造遺伝子を機能的に連結す
る方法はこの分野において周知である。組換えベクター
は、第１の方法と同様にして調製することができる。
ーター活性を発揮するプロモーターは、形質転換しよう
とする軟体動物中でプロモーター活性を発揮するもので
あればいずれのものであってもよく、例えばアクチン遺
伝子プロモーター、熱ショックプロテイン遺伝子プロモ
ーター等を挙げることができるがこれらに限定されるも
のではない。また、所望の外来遺伝子をプロモーターの
下流に「機能的に連結」するとは、該外来遺伝子が該プロ
モーターの支配を受けるように読み枠を合わせて連結す
ることを意味する。この場合、プロモーターの下流に機
能的に連結された他の構造遺伝子又はその断片の下流に
上記所望の外来遺伝子を読み枠を合わせて連結して、融
合タンパク質として発現させることも可能である。な
お、プロモーターの下流に構造遺伝子を機能的に連結す
る方法はこの分野において周知である。組換えベクター
は、第１の方法と同様にして調製することができる。
【００１８】次いで、調製した組換えベクターを軟体動
物の未受精卵、受精卵又は胚、好ましくは未受精卵に導
入する。これは例えば次のようにして行なうことができ
る。濃度１００〜２００ｍｇ／ｍｌ程度のベクター溶液
をシャーレあるいはウェルに用意し、未受精卵あるいは
受精卵又は胚を浸す。このように浸した卵あるいは胚を
マイクロインジェクション用マイクロピペットを用いて
（これに限るものではない)鋭利に一瞬だけ傷を付ける
ようにしてベクター液を卵あるいは胚内に注入する。こ
の時、破裂は勿論のこと致命傷にならない程度に傷穴を
空けることが肝心である。組換えベクターを導入した受
精卵又は胚から第１の方法と同様にして個体を得ること
ができ、第１の方法と同様にして形質転換体を選択し、
形質転換ラインを確立することができる。
物の未受精卵、受精卵又は胚、好ましくは未受精卵に導
入する。これは例えば次のようにして行なうことができ
る。濃度１００〜２００ｍｇ／ｍｌ程度のベクター溶液
をシャーレあるいはウェルに用意し、未受精卵あるいは
受精卵又は胚を浸す。このように浸した卵あるいは胚を
マイクロインジェクション用マイクロピペットを用いて
（これに限るものではない)鋭利に一瞬だけ傷を付ける
ようにしてベクター液を卵あるいは胚内に注入する。こ
の時、破裂は勿論のこと致命傷にならない程度に傷穴を
空けることが肝心である。組換えベクターを導入した受
精卵又は胚から第１の方法と同様にして個体を得ること
ができ、第１の方法と同様にして形質転換体を選択し、
形質転換ラインを確立することができる。
【００１９】また、未受精卵は上記操作の直後あるいは
並行して人工授精を行った後、第１の方法と同様にして
個体を得ることができる。
並行して人工授精を行った後、第１の方法と同様にして
個体を得ることができる。
【００２０】
【実施例】以下、本発明を、実施例に基づきより具体的
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。
【００２１】参考例１ ヒトインターフェロンα遺伝子
を導入したトランスジェニックアコヤガイの作出 ヒトあるいはマウスインターフェロンα遺伝子(ＢＢＬ
社、ＲＤＳ社より市販）をアデノウイルスベクター(宝
酒造社製、タカラ・アデノウイルス発現ベクターキッ
ト)に組み込み組換えベクターを作製した。この操作は
具体的には次のようにして行なった。上記市販のインタ
ーフェロンα遺伝子をコスミドベクター（pAxcwt(44,74
1 bp), Niwa, M. et al., (1991) Gene 108, 193,上記
市販のアデノウイルス発現ベクターキットに含まれてい
る）のSwa I部位に挿入した。組み込まれた遺伝子を持
つコスミドベクターと、上記制限酵素で処理した上記市
販のアデノウイルス由来ＤＮＡ−ＴＰＣ（Miyake, S. e
t al., (1996), Proc. Natl.Acad. Sci. USA 93 1320)
とを２９３細胞（ヒト胎児腎細胞、大日本製薬株式会社
製)に共存導入した。共存導入は、具体的には次のよう
に行った。２９３細胞を１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ培地
で、５％ＣＯ2、３７℃の条件下に１００％コンフルエ
ントに培養し、上記コスミドベクターＤＮＡ１０μｇと
制限酵素処理済みＤＮＡ−ＴＰＣ５μｇとを直径６ｃｍ
のシャーレ上で混合した。このトランスフェクションは
リン酸カルシウム法で行った。共存導入後の細胞を３７
℃、５％ＣＯ2で２４時間培養後、増殖した組換えアデ
ノウイルスの分画を集め、ＤＮＡ量(１００〜２００ｍ
ｇ／個）をアコヤ貝の卵巣に注入し、別にオスから取出
した精子(卵子の２倍量）と試験管内で混合し受精させ
た。これを海水中２５℃で、２４日間培養し、稚貝を得
た。２００個の稚貝３１個中に、インターフェロン用Ｄ
ＮＡプローブの蛍光（FITC)の発色が見られた。さらに
稚貝のＤＮＡを精製し、同じＤＮＡプローブにより配列
を確認した。これらの貝は継続養殖された。
を導入したトランスジェニックアコヤガイの作出 ヒトあるいはマウスインターフェロンα遺伝子(ＢＢＬ
社、ＲＤＳ社より市販）をアデノウイルスベクター(宝
酒造社製、タカラ・アデノウイルス発現ベクターキッ
ト)に組み込み組換えベクターを作製した。この操作は
具体的には次のようにして行なった。上記市販のインタ
ーフェロンα遺伝子をコスミドベクター（pAxcwt(44,74
1 bp), Niwa, M. et al., (1991) Gene 108, 193,上記
市販のアデノウイルス発現ベクターキットに含まれてい
る）のSwa I部位に挿入した。組み込まれた遺伝子を持
つコスミドベクターと、上記制限酵素で処理した上記市
販のアデノウイルス由来ＤＮＡ−ＴＰＣ（Miyake, S. e
t al., (1996), Proc. Natl.Acad. Sci. USA 93 1320)
とを２９３細胞（ヒト胎児腎細胞、大日本製薬株式会社
製)に共存導入した。共存導入は、具体的には次のよう
に行った。２９３細胞を１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ培地
で、５％ＣＯ2、３７℃の条件下に１００％コンフルエ
ントに培養し、上記コスミドベクターＤＮＡ１０μｇと
制限酵素処理済みＤＮＡ−ＴＰＣ５μｇとを直径６ｃｍ
のシャーレ上で混合した。このトランスフェクションは
リン酸カルシウム法で行った。共存導入後の細胞を３７
℃、５％ＣＯ2で２４時間培養後、増殖した組換えアデ
ノウイルスの分画を集め、ＤＮＡ量(１００〜２００ｍ
ｇ／個）をアコヤ貝の卵巣に注入し、別にオスから取出
した精子(卵子の２倍量）と試験管内で混合し受精させ
た。これを海水中２５℃で、２４日間培養し、稚貝を得
た。２００個の稚貝３１個中に、インターフェロン用Ｄ
ＮＡプローブの蛍光（FITC)の発色が見られた。さらに
稚貝のＤＮＡを精製し、同じＤＮＡプローブにより配列
を確認した。これらの貝は継続養殖された。
【００２２】また、ウイルス感染により閉殻筋が赤色に
変化することが報告されており、インターフェロン遺伝
子の存在が確認された成貝では、２０個中１８個でこの
積変が見られなかった。
変化することが報告されており、インターフェロン遺伝
子の存在が確認された成貝では、２０個中１８個でこの
積変が見られなかった。
【００２３】一方、上記のようにして得た組換えアデノ
ウイルスベクターをHela細胞にトランスフェクトし、He
la細胞中で増殖させた。Hela細胞へのトランスフェクト
及び増殖は、Nature 1995, 374(6523):660-662に記載さ
れた方法により行なった。Hela細胞から常法により組換
えベクターＤＮＡを回収し、これを10 mM Tris-HCl (pH
7.5)、1 mM EDTAないし20 mMリン酸カリウム、3 mMクエ
ン酸カリウム、2% PEG-6000 (pH7.5)中にＤＮＡ量５０
〜１００μｇ／ｍｌの濃度で溶解してマイクロインジェ
クション用溶液を調製した。該溶液を、アコヤガイのメ
スの卵巣及びオスの精巣にマイクロインジェクションし
た。注入した溶液の量は、１箇所当たりＤＮＡ換算１０
０μｇで、卵巣又は精巣にそれぞれ３箇所注入した。２
４〜４８時間後、精巣からの精子と卵巣からの成熟卵を
用いて人工授精を行なった。人工授精は具体的には次の
ようにして行なった。アコヤ貝のオスより精巣を、メス
より卵巣をそれぞれ切除し、試験管に精子と卵子を取出
し１：２の割合で混合した。受精卵を海水中で２〜３週
間、２５℃でインキュベートすることにより受精卵から
第一代のアコヤガイ個体を得た。得られたアコヤガイの
生殖巣から常法により全ＤＮＡを回収し、ヒトインター
フェロンα遺伝子をプローブとして用いて常法（「バイ
オ実験イラストレイテッド」、上掲）によりサザンブロ
ット法を行なった。さらに、アコヤガイの内臓塊、閉殻
筋細胞から常法により全ｍＲＮＡを回収し、ヒトインタ
ーフェロンα遺伝子をプローブとして用いて常法（「バ
イオ実験イラストレイテッド」、上掲）によりノーザン
ブロット法を行なった。
ウイルスベクターをHela細胞にトランスフェクトし、He
la細胞中で増殖させた。Hela細胞へのトランスフェクト
及び増殖は、Nature 1995, 374(6523):660-662に記載さ
れた方法により行なった。Hela細胞から常法により組換
えベクターＤＮＡを回収し、これを10 mM Tris-HCl (pH
7.5)、1 mM EDTAないし20 mMリン酸カリウム、3 mMクエ
ン酸カリウム、2% PEG-6000 (pH7.5)中にＤＮＡ量５０
〜１００μｇ／ｍｌの濃度で溶解してマイクロインジェ
クション用溶液を調製した。該溶液を、アコヤガイのメ
スの卵巣及びオスの精巣にマイクロインジェクションし
た。注入した溶液の量は、１箇所当たりＤＮＡ換算１０
０μｇで、卵巣又は精巣にそれぞれ３箇所注入した。２
４〜４８時間後、精巣からの精子と卵巣からの成熟卵を
用いて人工授精を行なった。人工授精は具体的には次の
ようにして行なった。アコヤ貝のオスより精巣を、メス
より卵巣をそれぞれ切除し、試験管に精子と卵子を取出
し１：２の割合で混合した。受精卵を海水中で２〜３週
間、２５℃でインキュベートすることにより受精卵から
第一代のアコヤガイ個体を得た。得られたアコヤガイの
生殖巣から常法により全ＤＮＡを回収し、ヒトインター
フェロンα遺伝子をプローブとして用いて常法（「バイ
オ実験イラストレイテッド」、上掲）によりサザンブロ
ット法を行なった。さらに、アコヤガイの内臓塊、閉殻
筋細胞から常法により全ｍＲＮＡを回収し、ヒトインタ
ーフェロンα遺伝子をプローブとして用いて常法（「バ
イオ実験イラストレイテッド」、上掲）によりノーザン
ブロット法を行なった。
【００２４】サザンブロット陽性かつノーザンブロット
陽性のメス及びオスの個体から採取した成熟卵及び精子
を用いて上記と同様に人工授精を行い、上記と同様にし
て第２代の個体を得た。上記と同様にサザンブロット及
びノーザンブロットを行なうことにより、ヒトインター
フェロンα遺伝子を導入したトランスジェニックアコヤ
ガイを３ライン選択した。
陽性のメス及びオスの個体から採取した成熟卵及び精子
を用いて上記と同様に人工授精を行い、上記と同様にし
て第２代の個体を得た。上記と同様にサザンブロット及
びノーザンブロットを行なうことにより、ヒトインター
フェロンα遺伝子を導入したトランスジェニックアコヤ
ガイを３ライン選択した。
【００２５】養殖アコヤガイの状態から、ウイルス汚染
されていると考えられる海域及びウイルス汚染されてい
ないと考えられる海域において、上記のように作出した
トランスジェニックアコヤガイ及び対照として従来のア
コヤガイを１８０日間養殖し、その致死率を比較した。
結果を下記表１に示す。
されていると考えられる海域及びウイルス汚染されてい
ないと考えられる海域において、上記のように作出した
トランスジェニックアコヤガイ及び対照として従来のア
コヤガイを１８０日間養殖し、その致死率を比較した。
結果を下記表１に示す。
【００２６】
【表１】表１ ヒトインターフェロンα遺伝子導入の効
果(３６０日間養殖)
果(３６０日間養殖)
【００２７】表１から明らかなように、本発明のトラン
スジェニックアコヤガイ(ライン１〜３)では、非汚染海
域における致死率は従来種と同等であるにもかかわら
ず、汚染海域における致死率は従来種よりも遥かに低か
った。このことから、ヒトインターフェロンα遺伝子導
入による致死率低下の効果が明瞭に認められた。
スジェニックアコヤガイ(ライン１〜３)では、非汚染海
域における致死率は従来種と同等であるにもかかわら
ず、汚染海域における致死率は従来種よりも遥かに低か
った。このことから、ヒトインターフェロンα遺伝子導
入による致死率低下の効果が明瞭に認められた。
【００２８】参考例２ ヒトインターフェロンβ遺伝子
を導入したトランスジェニックアコヤガイの作出 ヒトインターフェロンα遺伝子に代えて、ヒトインター
フェロンβ遺伝子(ＢＢＬ社より市販、HIGASHI, Y. et
al. (1983) J. Biol. Chem. 258:92)を用いること、及
びサザンブロット及びノーザンブロットで用いたプロー
ブがインターフェロンβ遺伝子の５’末端４０塩基ない
し５０塩基の配列フラグメントをFITC蛍光で修飾したプ
ローブを用いたことを除き、参考例１と同じ操作を行
い、ヒトインターフェロンβ遺伝子が導入されたトラン
スジェニックアコヤガイ(第２代)を作出した。
を導入したトランスジェニックアコヤガイの作出 ヒトインターフェロンα遺伝子に代えて、ヒトインター
フェロンβ遺伝子(ＢＢＬ社より市販、HIGASHI, Y. et
al. (1983) J. Biol. Chem. 258:92)を用いること、及
びサザンブロット及びノーザンブロットで用いたプロー
ブがインターフェロンβ遺伝子の５’末端４０塩基ない
し５０塩基の配列フラグメントをFITC蛍光で修飾したプ
ローブを用いたことを除き、参考例１と同じ操作を行
い、ヒトインターフェロンβ遺伝子が導入されたトラン
スジェニックアコヤガイ(第２代)を作出した。
【００２９】ヒトインターフェロンβ遺伝子導入の効果
を参考例１と同様にして調べた。結果を下記表２に示
す。
を参考例１と同様にして調べた。結果を下記表２に示
す。
【００３０】
【表２】表２ ヒトインターフェロンβ遺伝子導入の効
果(１８０日間養殖)
果(１８０日間養殖)
【００３１】参考例１の場合と同様、ヒトインターフェ
ロンβ遺伝子導入の効果が明瞭に認められた。
ロンβ遺伝子導入の効果が明瞭に認められた。
【００３２】実施例１ 緑色蛍光発光タンパク質(ＧＦ
Ｐ)遺伝子を持つアコヤガイの作製(1) 完全長ＧＦＰ遺伝子（Science 1994, 263:802-805; Gen
Bank No. U53602、和光純薬工業より市販）を参考例１
と同様にしてアデノウイルスベクターへ組み込んだ（増
殖に用いた細胞は293細胞）。得られたＧＦＰ含有組換
えベクターをＴＥ緩衝液で濃度１００ｍｇ／ｍｌとし、
参考例１と同様にしてアコヤガイの卵巣にマイクロイン
ジェクションした。以下、参考例１と同様にして(ただ
し、サザンブロット及びノーザンブロットで用いたプロ
ーブはＧＦＰ遺伝子である)、トランスジェニックアコ
ヤガイ(第２代)を作出した。
Ｐ)遺伝子を持つアコヤガイの作製(1) 完全長ＧＦＰ遺伝子（Science 1994, 263:802-805; Gen
Bank No. U53602、和光純薬工業より市販）を参考例１
と同様にしてアデノウイルスベクターへ組み込んだ（増
殖に用いた細胞は293細胞）。得られたＧＦＰ含有組換
えベクターをＴＥ緩衝液で濃度１００ｍｇ／ｍｌとし、
参考例１と同様にしてアコヤガイの卵巣にマイクロイン
ジェクションした。以下、参考例１と同様にして(ただ
し、サザンブロット及びノーザンブロットで用いたプロ
ーブはＧＦＰ遺伝子である)、トランスジェニックアコ
ヤガイ(第２代)を作出した。
【００３３】得られたトランスジェニックアコヤガイの
各組織において蛍光発光が認められるか否かを蛍光顕微
鏡により調べた。結果を下記表３に示す。なお、表中
「＋」は蛍光発光が認められたことを示し、「＋」の数が多
いほど蛍光発光が強いことを意味する。
各組織において蛍光発光が認められるか否かを蛍光顕微
鏡により調べた。結果を下記表３に示す。なお、表中
「＋」は蛍光発光が認められたことを示し、「＋」の数が多
いほど蛍光発光が強いことを意味する。
【００３４】
【表３】表３ 蛍光発光の認められた組織
【００３５】実施例２ 緑色蛍光発光タンパク質(ＧＦ
Ｐ)遺伝子を持つアコヤガイの作製(2) 真珠貝のプリズムタンパク質は、真珠を構成している重
要なタンパク質である。この実施例では、プリズムタン
パク質の遺伝子に緑色蛍光発光タンパク質遺伝子を融合
し、真珠に自己蛍光発光をさせる試みである。
Ｐ)遺伝子を持つアコヤガイの作製(2) 真珠貝のプリズムタンパク質は、真珠を構成している重
要なタンパク質である。この実施例では、プリズムタン
パク質の遺伝子に緑色蛍光発光タンパク質遺伝子を融合
し、真珠に自己蛍光発光をさせる試みである。
【００３６】アコヤガイのプリズムタンパク質遺伝子
（Nature 1997, 387(6633):563-564;GenBank No. D860/
3）をその読み始めコドン５ｋｂ上流を含めてクローン
し、このプロモーターにＧＦＰ遺伝子を融合し、アデノ
ウイルスベクターに導入した。プリズムタンパク質遺伝
子(プロモーター含む)とＧＦＰ遺伝子の融合遺伝子は、
M. Chalfie et al., Science 1994, 263:802-805に記載
された方法により調製した。すなわち、上記読み始めコ
ドン５ｋｂ上流を含むプリズムタンパク質遺伝子の開始
コドンから１０ｎｔ目に、９ｎｔ、１０ｎｔ又は１１ｎ
ｔのリンカー(ポリＴ)を結合し、市販のＧＦＰ遺伝子の
５’末端に、それぞれ９、１０、あるいは１１ｎｔのポ
リＡリンカーを結合させたＤＮＡをハイブリダイズし
て、融合遺伝子を得た。得られた融合遺伝子を制限酵素
NHeI及びEcoRIを用い、参考例１で用いたのと同じアデ
ノウイルスベクターに挿入した。次いで参考例１と同様
にして、プリズムタンパク質遺伝子とＧＦＰ遺伝子との
融合遺伝子を導入したトランスジェニックアコヤガイを
得た。得られたトランスジェニックアコヤガイの外套膜
組織を蛍光顕微鏡で観察したところ、蛍光発光を認め
た。
（Nature 1997, 387(6633):563-564;GenBank No. D860/
3）をその読み始めコドン５ｋｂ上流を含めてクローン
し、このプロモーターにＧＦＰ遺伝子を融合し、アデノ
ウイルスベクターに導入した。プリズムタンパク質遺伝
子(プロモーター含む)とＧＦＰ遺伝子の融合遺伝子は、
M. Chalfie et al., Science 1994, 263:802-805に記載
された方法により調製した。すなわち、上記読み始めコ
ドン５ｋｂ上流を含むプリズムタンパク質遺伝子の開始
コドンから１０ｎｔ目に、９ｎｔ、１０ｎｔ又は１１ｎ
ｔのリンカー(ポリＴ)を結合し、市販のＧＦＰ遺伝子の
５’末端に、それぞれ９、１０、あるいは１１ｎｔのポ
リＡリンカーを結合させたＤＮＡをハイブリダイズし
て、融合遺伝子を得た。得られた融合遺伝子を制限酵素
NHeI及びEcoRIを用い、参考例１で用いたのと同じアデ
ノウイルスベクターに挿入した。次いで参考例１と同様
にして、プリズムタンパク質遺伝子とＧＦＰ遺伝子との
融合遺伝子を導入したトランスジェニックアコヤガイを
得た。得られたトランスジェニックアコヤガイの外套膜
組織を蛍光顕微鏡で観察したところ、蛍光発光を認め
た。
【００３７】本実施例で得られたトランスジェニックア
コヤガイは、プリズムタンパク質のプロモーター及び構
造遺伝子の下流にＧＦＰ遺伝子を連結したものであり、
これが発現されて蛍光が認められているので、このアコ
ヤガイに真珠を作らせれば、真珠を構成するプリズムタ
ンパク質にはＧＦＰが融合しているから、蛍光発光する
真珠玉が形成されると考えられる。
コヤガイは、プリズムタンパク質のプロモーター及び構
造遺伝子の下流にＧＦＰ遺伝子を連結したものであり、
これが発現されて蛍光が認められているので、このアコ
ヤガイに真珠を作らせれば、真珠を構成するプリズムタ
ンパク質にはＧＦＰが融合しているから、蛍光発光する
真珠玉が形成されると考えられる。
【００３８】実施例３ 緑色蛍光発光タンパク質(ＧＦ
Ｐ)遺伝子を持つアコヤガイの作製(3) 外套膜タンパク質は、プリズムタンパク質と同様に真珠
を構成する大切なタンパク質である。実施例２のプリズ
ムタンパク質遺伝子に代えてアコヤガイ外套膜タンパク
質遺伝子（Nature 1997, 387(6633):563-564; GenBank
No. 86074）を用いて実施例２と同様な操作を行ない、
外套膜タンパク質遺伝子とＧＦＰ遺伝子との融合遺伝子
を導入したトランスジェニックアコヤガイを作出した。
なお、アコヤガイ外套膜タンパク質遺伝子とＧＦＰ遺伝
子との融合及び該融合遺伝子とアデノウイルスベクター
への組み込みは、具体的には次のように行なった。実施
例２と同様、外套膜タンパク質の開始コドン約５ｋｂ上
流を含むＤＮＡ断片の開始コドンから１５ｂ目に９、１
０あるいは１１ｎｔのポリＴを結合し、実施例２で用い
たと同様のＧＦＰ遺伝子に９、１０、１１ｎｔのポリＡ
をハイブリダイズして融合遺伝子を作製した。得られた
融合遺伝子を用いて実施例２と同様な操作を行い、トラ
ンスジェニックアコヤガイを得た。
Ｐ)遺伝子を持つアコヤガイの作製(3) 外套膜タンパク質は、プリズムタンパク質と同様に真珠
を構成する大切なタンパク質である。実施例２のプリズ
ムタンパク質遺伝子に代えてアコヤガイ外套膜タンパク
質遺伝子（Nature 1997, 387(6633):563-564; GenBank
No. 86074）を用いて実施例２と同様な操作を行ない、
外套膜タンパク質遺伝子とＧＦＰ遺伝子との融合遺伝子
を導入したトランスジェニックアコヤガイを作出した。
なお、アコヤガイ外套膜タンパク質遺伝子とＧＦＰ遺伝
子との融合及び該融合遺伝子とアデノウイルスベクター
への組み込みは、具体的には次のように行なった。実施
例２と同様、外套膜タンパク質の開始コドン約５ｋｂ上
流を含むＤＮＡ断片の開始コドンから１５ｂ目に９、１
０あるいは１１ｎｔのポリＴを結合し、実施例２で用い
たと同様のＧＦＰ遺伝子に９、１０、１１ｎｔのポリＡ
をハイブリダイズして融合遺伝子を作製した。得られた
融合遺伝子を用いて実施例２と同様な操作を行い、トラ
ンスジェニックアコヤガイを得た。
【００３９】得られたトランスジェニックアコヤガイの
外套膜組織を蛍光顕微鏡で観察したところ、蛍光発光を
認めた。
外套膜組織を蛍光顕微鏡で観察したところ、蛍光発光を
認めた。
【００４０】本実施例で得られたトランスジェニックア
コヤガイは、外套膜タンパク質のプロモーター及び構造
遺伝子の下流にＧＦＰ遺伝子を連結したものであり、こ
れが発現されて蛍光が認められているので、このアコヤ
ガイに真珠を作らせれば、真珠を構成する外套膜タンパ
ク質にはＧＦＰが融合しているから、蛍光発光する真珠
玉が形成されると考えられる。
コヤガイは、外套膜タンパク質のプロモーター及び構造
遺伝子の下流にＧＦＰ遺伝子を連結したものであり、こ
れが発現されて蛍光が認められているので、このアコヤ
ガイに真珠を作らせれば、真珠を構成する外套膜タンパ
ク質にはＧＦＰが融合しているから、蛍光発光する真珠
玉が形成されると考えられる。
【００４１】実施例４ プロモータートラップ法による
ＧＦＰ遺伝子又はLacZ遺伝子の導入 基本的にはI. A. Hope, Development 113巻339-408(199
1年）の方法によった。先ず、実施例１に記載した方法
により精巣及び卵巣にＧＦＰ遺伝子(１０〜５０ｍｇＤ
ＮＡ／個）を注入し、のち試験管内で受精させた。これ
を海水中２５℃で培養し、３週間で稚貝を得た。約５〜
１５％の稚貝にＧＦＰ特有の発色が認められた。これら
を養殖槽で１２ヶ月間養殖し、成貝を得た。成貝を解剖
し、特によく発色している臓器を単離し、ＤＮＡを抽出
した。抽出されたＤＮＡ中にＧＦＰ遺伝子を発現するプ
ロモーター遺伝子配列を解析した。タンパク質合成酵素
や閉殻筋中の酵素のプロモーター遺伝子がトラップされ
た。
ＧＦＰ遺伝子又はLacZ遺伝子の導入 基本的にはI. A. Hope, Development 113巻339-408(199
1年）の方法によった。先ず、実施例１に記載した方法
により精巣及び卵巣にＧＦＰ遺伝子(１０〜５０ｍｇＤ
ＮＡ／個）を注入し、のち試験管内で受精させた。これ
を海水中２５℃で培養し、３週間で稚貝を得た。約５〜
１５％の稚貝にＧＦＰ特有の発色が認められた。これら
を養殖槽で１２ヶ月間養殖し、成貝を得た。成貝を解剖
し、特によく発色している臓器を単離し、ＤＮＡを抽出
した。抽出されたＤＮＡ中にＧＦＰ遺伝子を発現するプ
ロモーター遺伝子配列を解析した。タンパク質合成酵素
や閉殻筋中の酵素のプロモーター遺伝子がトラップされ
た。
【００４２】新しく単離されたプロモーター領域を含む
配列の下流にＧＦＰあるいはLacZ遺伝子を挿入し、発現
ベクターpAxCAwt（タカラアデノウイルス発現ベクター
キット)からβ−アクチンプロモーターを制限酵素によ
り切除したもののSwa I制限部位（サイトメガロウイル
スエンハンサー配列とウサギβ−グロビンポリＡシグナ
ルの間）に、得られた遺伝子を導入した。得られた組換
えベクターを用い、濃度１００〜２００ｍｇ／ｍｌ程度
の該ベクター溶液をシャーレに用意し、未受精卵を浸し
た。このように浸した未受精卵をマイクロインジェクシ
ョン用マイクロピペットを用いて鋭利に一瞬だけ傷を付
けるようにしてベクター液を卵に注入した。以後、参考
例１と同様にしてトランスジェニックアコヤガイを得
た。それぞれの遺伝子の発現量は分光学的に検出した。
配列の下流にＧＦＰあるいはLacZ遺伝子を挿入し、発現
ベクターpAxCAwt（タカラアデノウイルス発現ベクター
キット)からβ−アクチンプロモーターを制限酵素によ
り切除したもののSwa I制限部位（サイトメガロウイル
スエンハンサー配列とウサギβ−グロビンポリＡシグナ
ルの間）に、得られた遺伝子を導入した。得られた組換
えベクターを用い、濃度１００〜２００ｍｇ／ｍｌ程度
の該ベクター溶液をシャーレに用意し、未受精卵を浸し
た。このように浸した未受精卵をマイクロインジェクシ
ョン用マイクロピペットを用いて鋭利に一瞬だけ傷を付
けるようにしてベクター液を卵に注入した。以後、参考
例１と同様にしてトランスジェニックアコヤガイを得
た。それぞれの遺伝子の発現量は分光学的に検出した。
【００４３】得られたトランスジェニックアコヤガイに
ついて、自己蛍光発光（ＧＦＰ遺伝子の場合）及び発色
基質ＸＧによる染色（LacZ遺伝子の場合）による観察の
結果、アコヤガイの種々の組織に蛍光発光あるいは染色
が認められた。
ついて、自己蛍光発光（ＧＦＰ遺伝子の場合）及び発色
基質ＸＧによる染色（LacZ遺伝子の場合）による観察の
結果、アコヤガイの種々の組織に蛍光発光あるいは染色
が認められた。
【００４４】
【発明の効果】本発明により、所望の外来遺伝子を発現
することができるトランスジェニック軟体動物が初めて
提供された。本発明により、着色真珠を形成する真珠貝
等の産業上有用な種々の軟体動物を作出することが可能
になった。
することができるトランスジェニック軟体動物が初めて
提供された。本発明により、着色真珠を形成する真珠貝
等の産業上有用な種々の軟体動物を作出することが可能
になった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三輪 錠司 神奈川県横浜市磯子区杉田坪呑６−30 (72)発明者 磯和 望 三重県志摩郡志摩町越賀822−４ Ｆターム(参考） 4B024 AA10 BA80 CA04 DA02 EA02 FA02 GA11 GA18 HA20 4B065 AA90X AC20 BA02 CA52 CA60
Claims (8)
- 【請求項１】 所望の外来遺伝子（ウイルス抵抗性を付
与する遺伝子を除く）が導入され、該外来遺伝子を発現
するトランスジェニック軟体動物。 - 【請求項２】 貝類である請求項１記載のトランスジェ
ニック軟体動物。 - 【請求項３】 真珠貝である請求項２記載のトランスジ
ェニック軟体動物。 - 【請求項４】 前記外来遺伝子は、着色に関与する遺伝
子であり、いずれかの組織が着色された請求項１ないし
３のいずれか１項に記載のトランスジェニック軟体動
物。 - 【請求項５】 前記着色に関与する遺伝子は、緑色蛍光
発光タンパク質遺伝子であり、いずれかの組織が蛍光を
発する請求項４記載のトランスジェニック軟体動物。 - 【請求項６】 導入しようとする所望の外来遺伝子又は
該外来遺伝子を含む核酸をベクターに組み込んだ組換え
ベクターを軟体動物のオス及び／又はメスの生殖巣にマ
イクロインジェクションし、これらのオスとメスを交配
させて第１代を作り、前記所望の遺伝子を発現している
個体を選択することを含む、請求項１ないし５のいずれ
か１項に記載のトランスジェニック軟体動物の作出方
法。 - 【請求項７】 前記所望の遺伝子を発現している前記第
１代のオスとメスを交配して第２代を作り、前記所望の
遺伝子を発現している個体を選択することをさらに含
む、請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 形質転換しようとする軟体動物中でプロ
モーター活性を発揮するプロモーターの下流に、前記所
望の遺伝子を機能的に連結した核酸を組み込んだ組換え
ベクターを該軟体動物の未受精卵、受精卵又は胚に導入
し、該未受精卵、受精卵又は胚を個体にまで成長させ、
前記所望の遺伝子を発現している個体を選択することを
含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のトラン
スジェニック軟体動物の作出方法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04844499A JP3803499B2 (ja) | 1999-02-25 | 1999-02-25 | トランスジェニック真珠貝及びその作出方法 |
| PCT/JP2000/001060 WO2000049862A1 (fr) | 1999-02-25 | 2000-02-24 | Mollusque transgenique et son procede de creation |
| EP00905311A EP1163844B1 (en) | 1999-02-25 | 2000-02-24 | Transgenic mollusc and method for constructing the same |
| AT00905311T ATE371368T1 (de) | 1999-02-25 | 2000-02-24 | Transgener mollusk und verfahren zu seiner herstellung |
| DE60036198T DE60036198T2 (de) | 1999-02-25 | 2000-02-24 | Transgener mollusk und verfahren zu seiner herstellung |
| US11/094,447 US20050198697A1 (en) | 1999-02-25 | 2005-03-31 | Transgenic mollusk and method for producing the same |
| US12/272,471 US20090077678A1 (en) | 1999-02-25 | 2008-11-17 | Transgenic mollusk and method for producing the same |
| US12/544,603 US20090307789A1 (en) | 1999-02-25 | 2009-08-20 | Transgenic mollusk and method for producing the same |
| US12/775,904 US20100218263A1 (en) | 1999-02-25 | 2010-05-07 | Transgenic mollusk and method for producing the same |
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|---|---|---|---|
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| CN103392634A (zh) * | 2013-06-25 | 2013-11-20 | 段升华 | 分子和基因工程技术培育彩色和荧光珍珠 |
| CN106577416A (zh) * | 2016-12-08 | 2017-04-26 | 金华职业技术学院 | 一种基于荧光蛋白的夜明珠培育方法 |
| CN110396526B (zh) * | 2019-08-13 | 2022-06-07 | 中国海洋大学 | 一种适用于贝类软体动物卵的外源物质导入方法 |
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|---|---|---|---|---|
| AU702639B2 (en) * | 1994-02-04 | 1999-02-25 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Genetic engineering of mollusks |
| US5675061A (en) * | 1994-02-04 | 1997-10-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Isolation and characterization of an actin gene from abalone |
| WO1996015662A1 (en) * | 1994-11-18 | 1996-05-30 | Paynter Kennedy T Jr | Enhancing growth and pearl production in mollusks |
| AUPN298895A0 (en) * | 1995-05-16 | 1995-06-08 | International Flower Developments Pty Ltd | Transgenic plants exhibiting altered flower colour and methods for producing same |
| US5876995A (en) * | 1996-02-06 | 1999-03-02 | Bryan; Bruce | Bioluminescent novelty items |
| US5969211A (en) * | 1996-04-19 | 1999-10-19 | Ther Regents Of The University Of California | Pantropic retroviral vectors for gene transfer in mollusks |
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