JP6407507B2 - 神経変性疾患関連タンパク質を神経細胞内で可視化したモデル動物 - Google Patents
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Landscapes
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Description
(1)アミロイドβタンパク質、タウタンパク質、αシヌクレイン、SOD1、TLS、TDP-43、ハンチンチン及びプリオン蛋白質からなる神経変性疾患関連タンパク質群から選択される少なくとも1つのタンパク質をコードするDNA、少なくとも1個の長さを有し任意のアミノ酸配列からなるリンカー配列をコードするDNA、並びに蛍光タンパク質をコードするDNAを含む組み換えベクター。
(2)アミロイドβタンパク質をコードするDNA、1〜50個の長さを有し任意のアミノ酸配列からなるリンカー配列をコードするDNA及び蛍光タンパク質をコードするDNAがこの順に連結された、(1)に記載のベクター。
(3)アミロイドβタンパク質がAβ1-42である、(1)又は(2)に記載のベクター。
(4)蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質である(1)〜(3)のいずれか1項に記載のベクター。
(5)リンカー配列がLE又はQSTVPRARDPPVATで示されるアミノ酸配列からなるものである(1)〜(4)のいずれか1項に記載のベクター。
(6)前記(1)〜(5)のいずれか1項に記載の組み換えベクターが導入されたトランスジェニック非ヒト動物。
(7)非ヒト動物がマウスである(6)に記載の動物。
(8)前記(1)〜(5)のいずれか1項に記載の組み換えベクターが導入されたトランスジェニック線虫。
(9)前記(1)〜(5)のいずれか1項に記載の組み換えベクターが導入された形質転換細胞。
(10)前記(6)又は(7)に記載の非ヒトトランスジェニック動物からなる、神経変性疾患モデル動物。
(11)前記(8)に記載のトランスジェニック線虫からなる、神経変性疾患モデル線虫。
(12)前記(9)に記載の形質転換細胞からなる、神経変性疾患モデル細胞。
(13)神経変性疾患がアルツハイマー病である(10)に記載の動物。
(14)神経変性疾患がアルツハイマー病である(11)に記載の線虫。
(15)神経変性疾患がアルツハイマー病である(12)に記載の細胞。
(16)前記(10)若しくは(13)に記載の神経変性疾患モデル動物、前記(11)若しくは(14)に記載の神経変性疾患モデル線虫、又は前記(12)若しくは(15)に記載の神経変性疾患モデル細胞に被検物質を投与し、当該被検物質投与後の当該モデル動物又はモデル線虫における神経変性疾患関連タンパク質を検出し、検出結果を指標として神経変性疾患の治療薬を選択する工程を含む、神経変性疾患治療薬のスクリーニング方法。
従来、Aβのように凝集体を形成するタンパク質は、その凝集により融合させた蛍光タンパク質の蛍光が抑制され、生体や培養細胞内で凝集体形成の過程や動態を観察することが困難であった。
この可視化モデルは、Aβが凝集しても蛍光の発光が維持されるタイプ、及びAβが凝集したときに蛍光が消失するが、凝集抑制物質を作用させると凝集が解除されて蛍光を発するタイプの2つのモデルである。これらのモデルを用いることで、生体内でAβの蓄積等の観察を行いながら、凝集抑制物質の探索等が可能になる。
本発明の組換えベクターは、神経変性疾患関連タンパク質をコードするDNA及び蛍光タンパク質をコードするDNAを、所定の長さのアミノ酸配列をコードするDNA(リンカー配列)により連結したものであり、好ましくは神経変性疾患関連タンパク質をコードするDNA、リンカー配列をコードするDNA、蛍光タンパク質をコードするDNAの順で連結されている。
Aβは、β-及びγ-セクレターゼの働きにより前駆体タンパク質(APP: amyloid β protein precursor)から切り出される40-43アミノ酸からなるポリペプチドであり、本発明においては、ヒト由来Aβ、マウス由来Aβ、ラット由来Aβなどを使用することができる。
タウタンパク質をコードするDNAの塩基配列は、所定のデータベースから入手可能である。例えば、ヒトタウタンパク質については例えばGenbankアクセッション番号BC000558.2、マウスタウタンパク質についてはアクセッション番号BC014748.1が利用可能である。
ハンチンチンをコードするDNAの塩基配列は、所定のデータベースから入手可能である。例えば、ヒトハンチンチンについては例えばGenbankアクセッション番号BC014028、マウスハンチンチンについてはアクセッション番号U24233が利用可能である。
プリオン蛋白質をコードするDNA配列は、所定のデータベースから入手可能である。例えばヒトのプリオン蛋白質については例えばGenbankアクセッション番号AY008282、マウスのプリオン蛋白質についてはアクセッション番号BC006703が利用可能である。
例えば、Aβの場合、本発明においては、γセクレターゼにより切断される43のアミノ酸領域(「Aβ1-43」という)、AβのN末端側の1〜40番のアミノ酸領域(「Aβ1-40」という)、あるいはN末端側の1〜42番のアミノ酸領域(「Aβ1-42」という)のポリペプチドを利用することができる。本発明においてはAβ1-42を使用することが好ましい。
ヒト、マウス又はラットのAβをコードするDNAは、ヒト、マウス又はラットのAβ1-43をコードするDNAからPCRなどによって調製することができる。
配列番号1に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトAβ1-43活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトAβ1-40活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトAβ1-42活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号7に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスAβ1-43活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号9に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスAβ1-40活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号11に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスAβ1-42活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号13に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ラットAβ1-43活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号15に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ラットAβ1-40活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号17に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ラットAβ1-42活性を有するタンパク質をコードするDNA。
さらに、配列番号7、9又は11に示す塩基配列と60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上又は99%以上の相同性を有し、かつ、マウスAβ1-43、Aβ1-40又はAβ1-42の構造タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。
本発明においてAβ活性(Aβ1-43活性、Aβ1-40活性又はAβ1-42活性)とは、Aβが被験動物(マウス等)の神経細胞内において生成、蓄積及び/又は凝集し、細胞内で細胞機能や生存に影響を与える活性を意味する。
Aβ活性は、上記DNAを、蛍光タンパク質をコードするDNAにリンカー配列を介して連結しベクターを作製し、これを非ヒト動物又は線虫に導入して蛍光色素を検出又は測定することで確認できる。また、Aβ活性は従来の免疫組織染色、ウエスタンブロット法などにより確認することもできる。
上記蛍光タンパク質をコードするDNAは、化学合成により、あるいは市販品として得ることができる(例えばGFPはClontech社製、TagRFPはEvrogen社製)。
本発明において使用されるリンカーとなるアミノ酸配列は、所定の長さを有し、かつ任意の配列を有するものである。「リンカー」とは、神経変性疾患関連タンパク質と蛍光色素タンパク質とを連結するペプチドである。なお、本明細書において、「リンカー」、「リンカー配列」と表示した場合、塩基配列を意味する場合がある。
本発明においては、神経変性疾患関連タンパク質の凝集により蛍光を発光させることを目的とする場合(タイプ1とする)は、リンカー配列に含まれるアミノ酸数は、14〜20個、より好ましくは14個である。他方、神経変性疾患関連タンパク質の凝集により蛍光を消失させ、凝集抑制により蛍光を発光させることを目的とする場合(タイプ2とする)は、リンカー配列に含まれるアミノ酸数は、1〜10個、好ましくは2〜6個である。
本発明において種々検討した結果、蛍光タンパク質としてGFPを使用する場合において、上記タイプ1を目的とするときは、リンカー配列はQSTVPRARDPPVATで示されるアミノ酸配列(配列番号19)であることが好ましく、上記タイプ2を目的とするときは、リンカー配列はLEで示されるアミノ酸配列であることが好ましい。
例えば、目的の神経変性疾患関連タンパク質をコードするDNA(以下「神経変性疾患関連遺伝子」ともいう)、リンカー配列をコードするDNA(以下「リンカーDNA」ともいう)及び蛍光タンパク質をコードするDNA(以下「蛍光タンパク質遺伝子」ともいう)をPCR等により調製する。PCRは、Taqポリメラーゼ又はその他のDNAポリメラーゼを用いる通常の方法によって実施することができる。
中枢神経細胞において機能するプロモーターとしては、特に限定されるものではないが、例えばβアクチンプロモーター、シナプシンプロモーター、Thy-1プロモーター(脳神経特異的)等が挙げられる。
また、本発明のベクターは、神経変性疾患関連遺伝子、リンカーDNA及び蛍光タンパク質遺伝子を挿入した領域以外の位置に他の外来遺伝子を保持してもよい。このような外来遺伝子としては、例えば、ベクターをモニターするためのマーカー遺伝子などが挙げられ、特に限定されるものではない。
上記のように構築された組換えベクターを、非ヒト動物又は線虫に導入してトランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック線虫を作製する。
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、中枢神経細胞において機能するプロモーター、並びに神経変性疾患関連遺伝子、リンカーDNA及び蛍光タンパク質遺伝子が導入された動物である。
本発明に用いることができる非ヒト動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル(霊長類)、ヒツジ、ヤギ、ウシ及びウマ等のヒトを除く哺乳類動物、あるいはトリ、両生類(カエルやイモリなど)、魚類(ゼブラフィッシュなど)が挙げられ、中でも、マウス、ラット及びモルモット等の齧歯類(ネズミ目)動物が好ましく、より好ましくはマウスである。
以下に、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の作出方法について、説明の便宜上マウスを用いた場合を例に挙げて説明するが、他の非ヒト動物を用いる場合についても同様の方法を適用することができる。また、神経変性疾患関連遺伝子として、Aβ遺伝子を例に説明する。
(i) 雌のマウスにホルモンを注射して強制的に過剰排卵させ、受精を行い、交尾後1日目の卵管から受精卵を採集する。
(ii) 核が融合する前の時期の受精卵に、顕微鏡下で導入対象のDNAをマイクロインジェクションにより注入する。
(iii) マイクロインジェクション後の受精卵を約40個程度、仮親となる偽妊娠雌マウスの子宮又は卵管内に移植する。
(iv) 移植後の雌マウスを通常の飼育条件下で飼育し、子マウスを出産させる。
(v) 必要に応じて、子マウスの一部(尾の先端や耳介片など)からゲノムDNAを抽出し、PCR法又はサザンブロット法等により、Aβ遺伝子の導入の成否を確認する。
Aβトランスジェニックマウスにおいて、中枢神経特異的にAβが発現していることの確認は、例えば、発現ベクターに連結された蛍光タンパク質の蛍光により行なうことができる。
ンジェクションすることにより行う。成虫の生殖巣は多核であるので、前後の生殖巣に一度ずつマイクロインジェクションすれば、外来DNAを持った形質転換した子 (F1)を多数得ることができる。また、Bombardment法やトランスポゾンを用いた遺伝子導入法を用いることも可能である。
本発明においては、上記トランスジェニック非ヒト動物及びトランスジェニック線虫のほか、本発明のベクターを宿主細胞に導入することにより、形質転換細胞を作製することができる。これらの形質転換細胞はAβを発現するため、神経変性疾患のモデル細胞として使用することができる。
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、本発明の遺伝子が宿主中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、転写終結配列を含む構成であることが好ましい。発現ベクターとしては、例えばpGEX、pUC18、pET(Novagen社)等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、trpプロモーター、lac プロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。 細菌への組み換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法や塩化カルシウム法を用いることができる。
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばYEp13、YCp50、pESC(Agilent社)等が挙げられる。プロモーターとしては、例えばgal1 プロモーター、gal10プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
哺乳類細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばpcDNA3、pFP(Clontech社)等が挙げられる。哺乳動物細胞への発現ベクターの導入は、例えばエレクトロポレーション、リポソーム法が挙げられる。
本発明において使用できるウイルスは、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルスなどが挙げられ、市販品(Adeno-X,Clontech社)として入手可能である。
レンチウイルスベクターは、発現可能なポリヌクレオチド配列を含有するエンベロープで覆われたビリオン粒子であり、このビリオン粒子を宿主細胞(COS 細胞や293T 細胞)に導入することができる。
AcNPVの宿主(感染、継代細胞)としては昆虫細胞(例えばSf9、Sf21細胞)などが挙げられ、BmNPVの宿主(感染、継代細胞)としてはBmN4細胞などが挙げられる。
前述の通り、Aβトランスジェニック非ヒト動物は、神経細胞において、ヒトの神経変性疾患(例えばアルツハイマー型認知症)の病態とよく一致するため、これら疾患の治療薬の開発において極めて有用なものである。また、線虫は、世代時間が短く一度に多数の個体を安価に扱えること、また1匹当り極微量の化合物や天然物などの治療薬候補物質で処理し効果を解析することが可能である点で有用であり、利用価値がある。さらに、培養細胞に神経変性疾患関連遺伝子を導入した細胞を用いて、簡易に治療薬候補物質を検索することもできる。
ここで、神経変性疾患としては、例えば、アルツハイマー型認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン舞踏病、プリオン病などが挙げられる。
(a) 治療薬の候補となる被検物質(候補物質)を本発明のトランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック線虫に投与する工程(投与工程)
(b) 上記トランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック線虫について、神経変性疾患関連タンパク質を検出する工程(検出工程)
(c) 上記得られた検出結果を指標として神経変性疾患の治療薬を選択する工程(選択工程)
(a) 治療薬の候補となる被検物質(候補物質)を本発明の形質転換細胞に接種する工程(接種工程)
(b) 上記形質転換細胞について、神経変性疾患関連タンパク質を検出する工程(検出工程)
(c) 上記得られた検出結果を指標として神経変性疾患の治療薬を選択する工程(選択工程)
(a) 投与又は接種工程
本発明のトランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック線虫に投与する被検物質、あるいは形質転換細胞に接種する被検物質としては、限定はされないが、各種ペプチド、タンパク質(酵素や抗体を含む)、非ペプチド性化合物、核酸(ポリヌクレオチド(DNA, RNA)、オリゴヌクレオチド(siRNA等)、ペプチド核酸(PNA)など)、低分子又は高分子合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど)の組織抽出液又は血液成分などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよく、また天然であっても人為的に合成されたものでもよい。被検物質は単一の物質を独立に試験しても、混合物(ライブラリーなどを含む)について試験をしてもよい。複数の被検物質を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー(コンビナトリアルライブラリーなど)、ペプチドライブラリー(コンビナトリアルライブラリーなど)などが挙げられる。
被検動物としては、Aβトランスジェニック非ヒト動物(+/+)を用いてもよいし、又はAβトランスジェニック非ヒト動物(+/-)を用いてもよい。対照動物として、Aβ非トランスジェニック(-/-)の非ヒト動物を用いることができる。
被検物質の投与は、非ヒト動物の場合は経口的又は非経口的に行うことができ、限定はされず、いずれの場合も公知の投与方法及び投与条件等を採用することができる。投与量についても、投与対象動物の種類及び状態、並びに候補物質の種類等を考慮して、適宜設定可能である。
形質転換細胞に被検物質を接種する場合の態様は特に限定されるものではなく、形質転換細胞と被検物質が接触し得る任意の方法を採用することができる。例えば、形質転換細胞が含まれる培養容器中に被検物質を添加すればよい。
被検物質を本発明のトランスジェニック非ヒト動物若しくはトランスジェニック線虫又は形質転換細胞に投与又は接種した後、蛍光タンパク質を検出する。蛍光タンパク質の検出は、蛍光発色や蛍光強度について、肉眼による観察、顕微鏡下の観察、蛍光検出装置を用いた検出など、種々の方法を採用することができる。蛍光検出装置を用いる場合は、使用する蛍光タンパク質の励起波長を発する装置、例えば蛍光プレートリーダー装置(Biotek社製)、細胞イメージアナライザー装置(ThermoFisher社製)などを用いて検出することができる。
神経変性疾患の治療薬を選択(スクリーニング)する場合は、候補物質が投与された非ヒト動物又は線虫、及び候補物質が投与されていない非ヒト動物又は線虫について、例えば、蛍光強度の測定、蛍光発色の有無等について比較評価することが好ましい。これら評価の方法(測定方法等)は、公知の手段及び手順により行うことができる。形質転換細胞についても上記に準じて行なえばよい。
「対照動物」は、被検動物との比較対照に使用されるに適している限り限定されるものではなく、Aβトランスジェニック非ヒト動物〔(+/+)又は(+/-)〕であっても、同腹のAβ非トランスジェニック(-/-)の非ヒト動物であっても、トランスジェニック動物でない野生型動物であってもよい。
比較検討は、Aβトランスジェニック非ヒト動物〔(+/+)又は(+/-)〕を被検動物とし、当該被検動物以外の非ヒト動物(-/-)を対照動物として用い、上記(a)及び(b)の工程を含む方法を採用することができる。また、Aβトランスジェニック非ヒト動物〔(+/+)又は(+/-)〕を被検動物として用い、被検物質を投与しないAβトランスジェニック非ヒト動物〔(+/+)又は(+/-)〕を対照動物として用いることもできる。
そして、前記タイプ1において、対照と比較して、被検動物若しくは線虫又は形質転換細胞における蛍光の凝集体が消失し、細胞内に一様に分布するなどの局在パターンの変化が観察されたとき、被検物質は、神経変性疾患治療薬として選択することができる。
他方、本発明においては、前記のとおりリンカーの長さにより神経変性疾患関連タンパク質が凝集したときに蛍光が消失し、凝集が抑制されたとき、すなわち凝集が解かれたときに蛍光が発する(前記タイプ2)。この態様は、被検物質を投与したときに対照と比較して蛍光が発せられ又は蛍光強度が強くなったときは、当該被検物質は、神経変性疾患治療薬として選択することができる。
本実施例においては、本発明のトランスジェニック動物に対し、APPではなくAβ1-42の細胞内での機能や毒性機構について解析するため、ヒトAβ1-42をβ-アクチンプロモーターを用いて神経細胞内だけに発現させた。さらに、発現したAβ1-42を可視化するため、Aβ1-42と蛍光タンパク質(GFP)のリンカー部分を工夫し、Aβ1-42の重合が進んでも、GFPが蛍光を発することを可能にした。その結果、Aβ1-42の動態を固定や抗原賦活化の影響を受けることなく、生きた細胞内で観察可能とした。
1.Aβ-GFP融合タンパク質発現用プラスミドDNAの作製
(1)トランスジェニックマウス作製用DNA
チキンのβ-actin遺伝子プロモータ領域DNA断片(2.9kb)をpBluescriptII SK(+)ベクターのApaI/HindIIIサイトに挿入し、さらにpEGFP-N1 (Clonetech)から切り出したEGFP-SV40 polyA断片をBamHI/SpeIサイトに挿入し、得られたベクターを神経細胞特異的EGFP発現用ベクターとした。
ヒトのAmyloid beta precursor protein のcDNAクローン(DANAFORM, Clone ID:100068486)を鋳型として、Aβ1-42をコードするDNA断片をPCRで増幅した。プライマーは以下の通り。
Reverse: 5’-ACG CGT CGA CTG CGC TAT GAC AAC ACC GCC-3’ (配列番号21)
PCRは、以下の組成の反応液を用い、98℃で10秒、55℃で10秒及び72℃で1分のサイクルを1サイクルとしてこれを25サイクル行なった。
5×PCRバッファー 10μl
dNTP mix 4μl
Forward primer 1μl
Reverse primer 1μl
Taq polymerase 0.5μl
鋳型DNA 1μl
蒸留水 32.5μl
Total 50μl
得られた断片をHindIIIおよびSalIで処理し、上記EGFP発現用ベクターの同サイトにクローニングした。
(A) pDK291 (Pacr-2:: Aβ1-42:: GFP):
上記のヒトAmyloid beta precursor protein cDNAクローンを鋳型として、Aβ1-42をコードするDNA断片をPCRで増幅した。用いたプライマーは以下の通り。
Forward: 5’-GGC AAG CTT GCG ATG GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC-3’ (配列番号22)
Reverse: 5’-ACG CGT CGA CTG CGC TAT GAC AAC ACC GCC-3’ (配列番号23)
PCR反応液組成及び反応サイクルは前記と同様である。
(B) pDK294:
Aβ1-42-GFP融合タンパク質の対象として、GFPのみをコリン作動性運動神経に発現させるために、上記acr-2プロモータDNAをpPD95.77のSphI/KpnIサイトに挿入した。
pDK291から発現されるAβ1-42-GFP融合タンパク質のAβ凝集を弱めるアミノ酸置換を2つpDK291に導入した。Site-directed mutagenesis kit (Promega)を用いて、Aβの19番目のフェニルアラニンをセリンに、34番目のロイシンをプロリンに置換した。
(D)pDK529:
トランスジェニックマウスに発現させたAβ1-42-EGFPを線虫に発現させるために、上記マウス用DNA(β-actin promoter:: Aβ1-42:: EGFP)を鋳型としてPCRで増幅した。用いたプライマーは以下の通り。
Forward: 5’- ATG CGG TAC CGG TAG AAA AAA TGG ATG CAG AAT TCC GAC AT-3’(配列番号24)
Reverse: 5’- ATG CCA ATT GTT ACT TGT ACA GCT CGT CCA TGC C-3’ (配列番号25)
PCR反応液組成及び反応サイクルは、伸長反応を3分としたこと以外は、前記と同様である。
上記方法から得られたトランスジェニックマウス用のプラスミドDNAをNotIおよびScaIで処理し、導入すべきDNA(β-actin promoter-Aβ1-42-EGFP)を切り出して精製した後、通常の方法を用いてマウス受精卵の核の中に微量注入した。受精卵は、その後代理母マウスの卵管に移植され、正常に発生したものが個体として出生した。出生個体の遺伝子型を確認し、目的遺伝子が導入されたマウス(トランスジェニックマウス)を同定した。複数のトランスジェニックマウスを系統化した後、導入遺伝子の発現状況を調べた。
通常のマイクロインジェクション法を用いて、上記方法から得られた線虫用のプラスミドDNAをlin-15(n765ts)変異体の生殖巣にインジェクションした。その後産まれた子孫を25℃で飼育し、マーカー遺伝子の発現によりlin-15変異体の表現型異常が回復し、かつDsRed2の発現が観察できた個体をF1世代のトランスジェニック個体とした。この中から、F3世代においても安定してトランスジーンが保持されているものを、各DNAの形質転換体ラインとして確立した。インジェクションに用いたmixture DNAは、対象DNA(GFPあるいはAβ-GFP融合遺伝子をコードする各プラスミドDNA); 20ng/μl、 インジェクションマーカーDNAとしてpDK300 (Podr-1:: DsRed2); 30ng/μlおよび pbLH98 (lin-15(+)); 50ng/μlのトータル100ng/μlに調整した混合溶液を用いた。
(a) 海馬スライスの作製:
生後3〜4ヶ月齢のAβ-GFPマウスを頸椎脱臼にて屠殺、抜脳後、ビブラトームで300μm厚のスライスを作り、無固定のまま共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
(b) 灌流固定による組織切片の作製:生後3〜4ヶ月齢のAβ-GFPマウスをイソフルラン麻酔下で4%パラフォルムアルデヒドにて灌流固定し、抜脳後、凍結ミクロトームで30μmの切片を作製し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
Aβ-GFPマウスの雄とICRの雌を掛け合わせ、胎生16日目(E16)の胎児を子宮より取り出し、蛍光実体顕微鏡下で胎児頭部のGFPの蛍光の有無を確認した。GFPの蛍光が確認された胎児の脳より海馬を切り出し、トリプシンで処理後、40000個/cm2の密度で培養した。培養はCO2インキュベーター内で37℃で行った。Neurobasal medium (Invitrogen) 中で1週間培養後、4%パラフォルムアルデヒドで固定して共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
1.Aβ-GFPを発現させたトランスジェニックマウス(図2、図3)
遺伝子を導入した受精卵より得られた10系統のマウスより、遺伝子発現を解析し最終的に明確なGFPの蛍光が観察される2系統を得た。胎児脳、成熟個体の脳スライスおよび灌流固定した脳を用いて、Aβ-GFPの発現を確認した。
まず妊娠16日目の胎児を子宮より取り出し、個体を蛍光実体顕微鏡下で観察した。
結果を図2に示す。図2において、各パネルは以下の通りである。
A: Aβ-GFP融合タンパク質を発現するE16の胎児。骨や皮膚を通して大脳部分にGFPの蛍光が観察される。
B:Aと同腹の野生型マウスの胎児。
C: Aβ-GFP融合タンパク質を発現するE16の胎児から取り出した脳。全体にAβ-GFP融合タンパク質の発現が観察される。
D:Aと同腹の野生型マウスの脳。
E: Aβ-GFP融合タンパク質を発現するE16の胎児の海馬初代培養神経細胞。細胞体・樹上突起に明るい蛍光が観察される。
A: 生後3~4ヶ月齢のAβ-GFPマウスの海馬スライス。CA1領域にAβ-GFP融合タンパク質を発現する錐体細胞が観察される(矢印)。
B: Aと同腹の野生型マウスの海馬スライス像。
C:生後3〜4ヶ月齢のAβ-GFPマウスの灌流固定後の脳切片。海馬錐体細胞の樹上突起にもAβ-GFP融合タンパク質の発現が観察される。
D: Aと同腹の野生型マウスの脳組織像。
各プラスミドDNAを導入したトランスジェニック線虫のGFP発現を観察した。
結果を図4に示す。図4は、Aβ-GFP融合タンパク質を発現させた線虫(C.elegans)のコリン作動性運動神経における蛍光発現パターンであり、最上に示した線虫の模式図において四角で囲った部分を観察した。丸が細胞体の位置を、矢頭が軸索を示している。
配列番号20〜25:合成DNA
Claims (13)
- アミロイドβタンパク質をコードするDNA、QSTVPRARDPPVAT(配列番号19)で示されるアミノ酸配列からなるリンカー配列をコードするDNA、及び緑色蛍光タンパク質をコードするDNAを含む組み換えベクターであって、当該DNAは、アミロイドβタンパク質をコードするDNA、前記リンカー配列をコードするDNA、緑色蛍光タンパク質をコードするDNAの順で連結されている、前記組み換えベクター。
- アミロイドβタンパク質をコードするDNA、LEで示されるアミノ酸配列からなるリンカー配列をコードするDNA、及び緑色蛍光タンパク質をコードするDNAを含む組み換えベクターであって、当該DNAは、アミロイドβタンパク質をコードするDNA、前記リンカー配列をコードするDNA、緑色蛍光タンパク質をコードするDNAの順で連結されている、前記組み換えベクター。
- 請求項1又は2に記載の組み換えベクターが導入されたトランスジェニック非ヒト動物。
- 非ヒト動物がマウスである請求項3に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 請求項1又は2に記載の組み換えベクターが導入されたトランスジェニック線虫。
- 請求項1又は2に記載の組み換えベクターが導入された形質転換細胞。
- 請求項3又は4に記載のトランスジェニック非ヒト動物からなる、神経変性疾患モデル動物。
- 請求項5に記載のトランスジェニック線虫からなる、神経変性疾患モデル線虫。
- 請求項6に記載の形質転換細胞からなる、神経変性疾患モデル細胞。
- 神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項7に記載の神経変性疾患モデル動物。
- 神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項8に記載の神経変性疾患モデル線虫。
- 神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項9に記載の神経変性疾患モデル細胞。
- 請求項7若しくは10に記載の神経変性疾患モデル動物、請求項8若しくは11に記載の神経変性疾患モデル線虫、又は請求項9若しくは12に記載の神経変性疾患モデル細胞に被検物質を投与又は接種し、当該被検物質投与又は接種後の当該モデル動物、モデル線虫又はモデル細胞における神経変性疾患関連タンパク質を検出し、検出結果を指標として神経変性疾患の治療薬を選択する工程を含む、神経変性疾患治療薬のスクリーニング方法。
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