JP7071749B2 - 分化ポテンシャルを改変した多能性幹細胞の動物の作製への応用 - Google Patents
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Description
本発明者らは、例えば、遺伝子操作細胞(例えば、ノックアウト細胞、ノックダウン細胞やトランスジェニック細胞)を胚に導入することによって、当該細胞を標的組織への分化を抑制または喪失させるものである(標的組織以外の組織には遺伝子操作細胞自体の本来的に有するキメラ形成能に従って分化を許してもよい)。
これにより、本発明者らは、例えば、標的組織は胚由来の細胞から本質的になるが、その他の組織は胚由来細胞と胚導入細胞由来細胞のキメラ状態である動物を創出させようとするものである。
(1)体細胞キメラ動物を作製する方法であって、
多能性細胞を胚に導入して体細胞キメラ動物を得ること
を含み、
多能性細胞は、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されている、
方法。
(2)体細胞キメラ動物を作製することに用いるための組成物であって、多能性細胞を含み、多能性細胞は、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されている、組成物。
(3)特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、生殖細胞に必須の遺伝子が破壊された細胞である、上記(1)に記載の方法。
(4)特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、生殖細胞に必須の遺伝子が破壊された細胞である、上記(2)に記載の組成物。
(5)特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、Prdm14遺伝子のノックアウト細胞、Otx2遺伝子のノックアウト細胞、またはPrdm14遺伝子とOtx2遺伝子のダブルノックアウト細胞である、上記(1)または(3)に記載の方法。
(6)特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、Prdm14遺伝子のノックアウト細胞、Otx2遺伝子のノックアウト細胞、またはPrdm14遺伝子とOtx2遺伝子のダブルノックアウト細胞である、上記(2)または(4)に記載の組成物。
(7)体細胞キメラ動物および多能性細胞が、雌である、上記(3)または(5)に記載の方法。
(8)体細胞キメラ動物および多能性細胞が、雄である、上記(3)または(5)に記載の方法。
(9)体細胞キメラ動物の製造における多能性細胞の使用であって、多能性細胞は、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されている、使用。
(10)体細胞キメラ非ヒト動物であって、特定の種類の細胞は宿主動物由来の細胞からなる、動物。
(11)生殖細胞が宿主動物由来の細胞からなる、上記(10)に記載の体細胞キメラ非ヒト動物。
図3Dは、HSV-TK/GCVシステムを例示する。具体的には、ガンシクロビル(GCV)は、非リン酸化形態では細胞傷害性が弱い。しかしながら、ヘルペスウイルス属が有するチミジンキナーゼ遺伝子(HSV-TK)を作用させると、GCVはリン酸化され、GCV三リン酸に変換され、細胞傷害性を獲得する。従って、HSV-TKを細胞特異的プロモーターに作動可能に連結し、HSV-TKを細胞特異的に発現させることにより、細胞特異的に細胞死を誘発できる。また、inducible caspase-9は、caspase-9において、CARDがFKBP12により置き換えられたタンパク質であり、AP1903などのタクロリムス誘導体存在下でのみ二量体化することができ、活性化して細胞に細胞死を誘発させることができる。inducible caspase-9を細胞特異的プロモーターに作動可能に連結した系を導入した細胞が特定細胞に分化すると、タクロリムス誘導体により細胞特異的に細胞死が誘発される。
本発明のある態様では、Prdm14遺伝子をノックアウトまたはノックダウンして生殖細胞に分化できない多能性細胞を胚導入細胞として用いてもよい。本発明のある態様では、Prdm14遺伝子のノックアウトは、例えば、遺伝子の一部若しくは全部の欠損、またはフレームシフトの導入等により行うことができる。本発明のある態様では、ノックアウトされたPrdm14遺伝子は、配列番号3または配列番号4の配列を有する。
また、臓器欠損動物の胚盤胞補完では、欠損臓器が胚導入細胞からなる臓器により補完されることが実証されている(例えば、引用することにより本願明細書の一部とされるWO2010/087459)。
例えば、
生殖細胞特異的な発現を示す遺伝子、例えば、Prdm14、Nanos2、Nanos3、DDX4、およびSox17などのエンハンサーおよび/またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子と、
前脳(将来の大脳)特異的な発現を示す遺伝子、例えばOtx1やOtx2のエンハンサーおよび/またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子と
の両方を有する多能性細胞は、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞として用い得る。
また、例えば、
配偶子に特異的に発現する遺伝子、例えば精子に特異的に発現する遺伝子である、Izumo、Tpap、Acrosin、もしくはTra98、または、卵に特異的に発現する遺伝子であるGdf9、Zp1、もしくはZp3などのプロモーターおよび/またはエンハンサーに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子と
前脳(将来の大脳)特異的な発現を示す遺伝子、例えばOtx1やOtx2、のエンハンサーおよび/またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子と
の両方を有する多能性細胞は、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞として用い得る。
また、例えば、
生殖細胞特異的に起る現象である減数分裂に関わる遺伝子、例えばDazl、Stra8、Taf7l、またはSycp3などのプロモーターおよび/またはエンハンサーに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子と、
前脳(将来の大脳)特異的な発現を示す遺伝子、例えばOtx1やOtx2、のエンハンサーおよび/またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子と
の両方を有する多能性細胞は、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞として用い得る。
従って、本発明のある態様では、体細胞キメラ動物を作製する方法であって、多能性細胞を胚に導入して体細胞キメラ動物を得ることを含み、多能性細胞は、特定種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されており、胚は、多能性細胞とは別の特定種類の細胞を欠損するように遺伝子操作されている、方法が提供される。このような胚の遺伝子操作としては、Pdx1遺伝子のノックアウト、またはPdx1-Hes1トランスジェニックによる膵臓の欠損、および、Sal1遺伝子のノックアウトによる腎臓の欠損等が挙げられる。
本発明のある態様では、胚において特定種類の細胞を欠損する遺伝子操作としては、特定種類の細胞に特異的なプロモーターおよび/またはエンハンサーに作動可能に連結した細胞障害性遺伝子を搭載させることが挙げられる。いくつかの態様では、特定細胞または組織が欠損するとしられている遺伝子改変(例えば、ノックアウトまたはトランスジェニック)によって、胚を遺伝子操作してもよい。従って、本発明のある態様では、胚は、特定種類の細胞に特異的なプロモーターおよび/またはエンハンサーに作動可能に連結した細胞障害性遺伝子を有するか、または、特定細胞または組織が欠損するように遺伝子が改変されていてもよい。
従って、本発明は、ある態様では、所望のキメラ形成能を有する多能性細胞を選択することと、得られた多能性幹細胞の分化ポテンシャルを改変することとを含んでいてもよい。キメラ形成能の指標としては、キメラ形成能の強さ、または組織毎のキメラ形成能の強弱のバランスが挙げられ、これらを指標として所望のキメラ形成能を有する多能性細胞を選択すればよい。
本実施例では、Prdm14遺伝子を破壊したノックアウト多能性細胞を作製した。
本実施例では、実施例1で作製したPrdm14遺伝子破壊多能性細胞と野生型多能性細胞とをそれぞれ用いてキメラマウスを作製した。
本実施例では、Otx2遺伝子を破壊した多能性幹細胞を胚に導入した。
配列番号1:gRNAのPrdm14遺伝子標的化配列(GAACCTCGCCACCACCGAGG)
配列番号2:gRNAのPrdm14遺伝子標的化配列(GTATGGAGCCATCGCTAGTC)
配列番号3:破壊されたPrdm14遺伝子配列の一例(CTCGCCACCACCG GTCCGGAGCACCCAACCG)
配列番号4:破壊されたPrdm14遺伝子配列の一例(CTCGCCACCACCG CAGTATTAAAACATGGATGTA)
配列番号5:gRNA1のOtx2遺伝子標的化配列(GAGTCTGACCACTTCGGGTA)
配列番号6:gRNA2のOtx2遺伝子標的化配列(GTATGGAGCCATCGCTAGTC)
配列番号7:Pdx1の増幅用フォワードプライマー(ATTGAGATGAGAACCGGCATG)
配列番号8:Pdx1野生型の増幅用リバーズプライマー(TTCATGCGACGGTTTTGGAAC)
配列番号9:Pdx1変異型の増幅用リバーズプライマー(TGTGAGCGAGTAACAACC)
Claims (15)
- 体細胞キメラ非ヒト動物を作製する方法であって、
多能性細胞を胚に導入して、産仔として、または成体として体細胞キメラ非ヒト動物を得ること
を含み、
多能性細胞は、Otx2遺伝子のノックアウト細胞であるか、またはOtx1遺伝子またはOtx2遺伝子のエンハンサーおよび/またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子を含む細胞であり、これにより多能性細胞の大脳皮質への寄与が制限された細胞であり、
胚は、非ヒト哺乳動物由来の胚であり、Otx2遺伝子に関して正常な細胞からなり、これにより胚由来の細胞が大脳皮質を補完する、
方法。 - 産仔として、または成体として体細胞キメラ動物を作製することに用いるための組成物であって、多能性細胞を含み、多能性細胞は、Otx2遺伝子のノックアウト細胞であるか、またはOtx1遺伝子またはOtx2遺伝子のエンハンサーおよび/またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子を含む細胞であり、これにより多能性細胞の大脳皮質への寄与が制限された細胞である、組成物。
- 多能性細胞が、生殖細胞に必須の遺伝子がさらに破壊された細胞であるか、または生殖細胞特異的な発現を示す遺伝子のエンハンサーおよび/またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子を含む細胞であり、これにより、生殖細胞が前記胚由来の細胞からなる体細胞キメラ非ヒト動物が得られる、請求項1に記載の方法。
- 多能性細胞が、生殖細胞に必須の遺伝子がさらに破壊された細胞であるか、または生殖細胞特異的な発現を示す遺伝子のエンハンサーおよび/またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子を含む細胞であり、これにより、生殖細胞が前記胚由来の細胞からなる体細胞キメラ動物が得られる、請求項2に記載の組成物。
- 多能性細胞が、Prdm14遺伝子とOtx2遺伝子のダブルノックアウト細胞である、請求項1または3に記載の方法。
- 多能性細胞が、Prdm14遺伝子とOtx2遺伝子のダブルノックアウト細胞である、請求項2または4に記載の組成物。
- 体細胞キメラ動物および多能性細胞が、雌である、請求項3または5に記載の方法。
- 体細胞キメラ動物および多能性細胞が、雄である、請求項3または5に記載の方法。
- 産仔として、または成体としての体細胞キメラ非ヒト動物の製造における多能性細胞の使用であって、
多能性細胞は、Otx2遺伝子のノックアウト細胞であるか、またはOtx1遺伝子またはOtx2遺伝子のエンハンサーおよび/またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子を含む細胞であり、これにより多能性細胞の大脳皮質への寄与が制限されている、
使用。 - 請求項1、3、5、7、および8のいずれか一項に記載の方法により得られる体細胞キメラ非ヒト動物であって、
大脳皮質は、胚由来の細胞からなり、
大脳皮質以外は、多能性細胞由来の細胞および胚由来の細胞を含む、
動物。 - 請求項3、5、7、および8のいずれか一項に記載の方法により得られる体細胞キメラ非ヒト動物であって、
大脳皮質および生殖細胞は、胚由来の細胞からなり、
大脳皮質および生殖細胞以外は、多能性細胞由来の細胞および胚由来の細胞を含む、
動物。 - 体細胞キメラ非ヒト動物を作製する方法であって、
多能性細胞を胚に導入して体細胞キメラ非ヒト動物を得ることを含み、
多能性細胞は、Otx2遺伝子のノックアウト細胞であるか、またはOtx1遺伝子またはOtx2遺伝子のエンハンサーおよび/またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子を含む細胞であり、これにより多能性細胞の大脳皮質への寄与が制限された細胞であり、かつ、
胚は、非ヒト哺乳動物由来の胚であり、Otx2遺伝子に関して正常な細胞からなり、かつ、多能性細胞とは別の特定種類の細胞を欠損するように遺伝子操作されており、
これにより、多能性細胞と胚に関して一方が分化しない組織に対しては他方が補完する、
方法。 - 請求項12に記載の方法により得られる体細胞キメラ非ヒト動物であって、
大脳皮質は、胚由来の細胞からなり、
大脳皮質以外の体細胞は、多能性細胞由来の細胞および胚由来の細胞を含む、
動物。 - 請求項12に記載の方法であって、
多能性細胞は、Prdm14遺伝子がさらにノックアウトされた細胞であり、これにより、多能性細胞の大脳皮質への寄与および生殖腺への寄与が制限された細胞であり、かつ、
胚は、非ヒト哺乳動物由来の胚であり、Prdm14遺伝子およびOtx2遺伝子に関して正常な細胞からなり、かつ、多能性細胞とは別の特定種類の細胞を欠損するように遺伝子操作されており、
これにより、多能性細胞と胚に関して一方が分化しない組織に対しては他方が補完する、
方法。 - 請求項14に記載の方法により得られる体細胞キメラ非ヒト動物であって、
大脳皮質および生殖腺は、胚由来の細胞からなり、
大脳皮質および生殖腺以外は、多能性細胞由来の細胞および胚由来の細胞を含む、
動物。
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