JPWO2010087459A1 - 幹細胞を用いた異種間胚胞キメラ動物の作製法 - Google Patents
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Abstract
Description
では異種キメラの作製報告がすでにあり、実験動物レベルから今回示したマウス−ラットのような染色体数も異なるような異種からもキメラ作出が可能であることが示唆された。また大型動物においてもヤギ−ヒツジ間でキメラ個体が作出であることから、ブタやウシであっても本件で示したような多能性幹細胞を胚の内側に取り込まれるような方法を用いればキメラ個体の作出は可能性としてあげられる。
IH,et al.,(2007).Nature 451:141−146.)。また、c−Mycの遺伝子導入をせずにOct−4、Sox2およびKlf4の3因子だけでも、低効率ながらマウスおよびヒトにおいてiPS細胞の樹立が可能であることが示されており、iPS細胞が癌細胞に変化するのを抑えることに成功していることから、本発明においてこれを利用することもできる(Nakagawa M,et al.,(2008).Nat Biotechnol 26:101−106.;Wering M,et al.,(2008).Cell Stem Cell 2:10−12)。
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(実施例1) 本実施例では、マウスのES細胞およびiPS細胞を幹細胞として用いてラットの受精卵または胚盤胞との混合実験または注入を行いキメラ動物が生産されることを実証した。
個のmES/miPS細胞をインジェクションした。インジェクション後、胚をmR1ECM培地中で1〜2時間培養し、その後、仮親に胚移植した。コントロールとして、mES/miPS細胞をまた、同じ方法でマウスの胚にインジェクションした。インジェクション後、これらの胚を、胚盤胞期までKSOM−AA培地中で培養し、その後、2.5dpcの偽妊娠交配させた仮親メスICRマウスの子宮に胚移植した。移植後の産仔率およびキメラ形成率を表1に示す。
キメラの解析は胎児期15.5〜16.5日目、新生児期および成体で行った。それぞれの解析時期の割り振りは表1に示す。胎児期の解析では、仮親への移植から12日目で開腹して胎児を摘出し、蛍光実体顕微鏡下で、ES細胞であればDsRed、iPS細胞であればEGFPの蛍光を指標に、キメラの存在とその寄与率を肉眼的に確認した(表1)。新生児期の解析では、妊娠満期である移植後18日に自然分娩もしくは帝王切開により産仔を得て、それを胎児期同様、肉眼的に蛍光を観察した。
胚移植後11日目または12日目の仔から、胎児繊維芽細胞を樹立した(図2a)。具体的には、胎児を顕微鏡下で解剖し、頭部および臓器を取り出し、そして、20分間トリプシン処理を行った。トリプシン処理の後、この懸濁物をフィルターに通し、その後、ゼラチンコートディッシュに蒔いた。24時間インキュベートした後、接着した細胞を回収した。図2aは、胎児繊維芽細胞を用いたマウス/ラットキメラの解析のうち、mES細胞インジェクションにより作製したE15.5マウス/ラットキメラの仔から樹立した胎児繊維芽細胞を示す。図2a上のパネルは明視野の像であり、図2a下のパネルは赤色蛍光像である。そして、3%FBSを含むリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)(染色用培地;SM)中に懸濁し、そして、氷上にて1時間、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)を結合させた抗ラットCD54抗体(BD Pharmingen,San Diego,CA)で免疫染色を行った。SMで洗浄した後、蛍光強度を高めるために、細胞懸濁物にAlexa647を結合させた抗マウスIgG抗体(Invitrogen)を加え、氷上にて1時間免疫染色を行った。ヨウ化プロピジウム(PI)を含むSM中に懸濁させた後、これらの細胞を、ES細胞由来のマウス細胞(DsRed)およびラット細胞(rCD54+Alexa647)の分布について、MoFlo(Dako,Carpinteria,CA)およびFlow−Joソフトウェアにより解析した。結果を図2bに示す。
マウス/ラットのキメラ新生児からの臓器および組織(腕、心臓、肝臓、膵臓および腎臓)を、4%パラホルムアルデヒドで6時間固定し、そして、パラフィン中に包埋した。包埋した臓器を薄切し、室温にて1時間、抗GFP抗体(Invitrogen)で免疫染色を行った。PBSで洗浄した後、これらの切片を、室温にて1時間、Alexa488を結合させた抗ウサギIgG抗体(Invitrogen)で免疫染色を行った。染色した切片を、DAPIを含む封入溶液(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)で覆い、蛍光実体顕微鏡下で解析した。この切片をまた、ヘマトキシリン・エオシン(HE)染色して、光学顕微鏡下で解析した。
iPS細胞樹立のためのソースとして Wistarラット胎児(雄)から繊維芽細胞を樹立した。iPS細胞の誘導にはマウスiPS細胞の樹立時に用いたレトロウイルスではなく、テトラサイクリン依存的に3因子の発現を誘導できるシステムを組み込んだレンチウイルスベクターを用いた(図5a)。本ベクターではユビキチン−C(UbC)プロモーター下でrtTAとEGFPがIRES配列を介して共に発現する。よって誘導時にレンチウイルスの感染が認められた細胞は恒常的にEGFP蛍光を示すため、樹立したiPS細胞自体の標識も同時に行うことが可能となる。このレンチウイルスを介して3因子を導入しラットiPS細胞を誘導した。導入後しばらくは繊維芽細胞の増殖に必要な血清を含む培地で培養後、途中から阻害剤を含むラットES細胞用の培地に切り替え培養を継続したところ、ラットのiPS細胞様コロニーが得られた。ピックアップ後の継代培養においても自発的に分化することなく維持でき、iPS細胞株として株化することに成功した。ここでできた細胞株のひとつをラットiPS細胞(rWEi3.3−iPS細胞)とした(図5b)。
異種間キメラ作製のため、マウスiPS細胞をラット胚盤胞に、もしくは逆にラットiPS細胞をマウス胚盤胞に注入した。マウスiPS細胞としては、実施例1で樹立したEGFP−Tgマウス由来のmGT3.2−iPS細胞を用いた。胚培養および胚操作は、以下の通りである。マウス交配後の胚の採取および培養、マイクロインジェクション等は既報のプロトコールに従って行った(Nagy et al., 2003)。簡単に述べると、まずマウスの8細胞期/桑実胚期の胚は交配後2.5日後の卵管および子宮から、M2培地(Millipore)に回収した。回収した胚は、アミノ酸を含むKSOM培地(KSOM−AA培地:Millipore)に移し、8細胞期/桑実胚期の胚への注入に用いる場合は注入操作に用いるまでの1〜2時間、胚盤胞への注入に用いる場合は一晩、5%CO2存在下、37℃で培養した。
マウスおよびラットOct3/4
Fw : 5’− CAGTTTGCCAAGCTGCTGAA−3’(配列番号:10)
Rv : 5’− AGGGTCTCCGATTTGCATAT−3’
(配列番号:11)
由来の判定には、両者のゲノムDNAにおけるOct3/4遺伝子座の第2 エクソンと第4エクソン間にあるイントロン鎖長の差異に着目した。この部分の鎖長はラットの方が約100塩基ほど長くなっており、エクソンに存在する共通配列を元に設計したプライマーでPCR反応を行うことで、両者の由来を判定できる (図7b)。PCR反応の結果、マウスCD45陽性細胞のゲノムDNAはマウスOct3/4遺伝子座の鎖長を、ラットCD45陽性細胞ではラットOct3/4遺伝子座の鎖長を示した(図7c)。よって表面抗原を用いた解析結果、あるいは遺伝的な解析結果においても、キメラ胎児肝臓中には両者の細胞が混在していることが分かった。以上のことから、マウス−ラット間における異種間キメラの成立が証明された。
次に我々はマウス−ラット間の異種間キメラが妊娠満期、あるいは産後成体まで発育可能かを確認した。方法は前項で用いたマウスmGT3.2−iPS細胞をラット胚盤胞へ、ラットrWEi3.3−iPS細胞をマウス胚盤胞へそれぞれ注入し、子宮内に移植後、妊娠満期に自然分娩もしくは帝王切開により産仔を摘出した。その結果、新生児において蛍光顕微鏡下で観察したところ、両産仔ともにモザイク状のEGFP蛍光を示した(図8a、8b)。また産後それらを成体まで発育させ毛色によりキメラ形成を判定した。マウスiPS細胞は黒毛のC57BL/6系統を背景にもつEGFP−Tgマウス由来であるため、白毛のWistarラット胚由来と区別がつき、また逆にラットiPS細胞は白毛のWistar由来であるため、黒毛のC57BL/6×BDF1のF1胚由来と区別ができる。その結果、成体においても異種間キメラ形成が確認できた(図8c、8d)。
Pharmingen)、PE−Cy7 標識 抗−B220 抗体 (ラット IgG : BD Bioscience Pharmingen)、APC 標識 抗−CD4 抗体、APC−Cy7 標識 抗−CD8 抗体で染色し、Mo−floとFACSCanto(BD bioscience)を用いて、分取及び解析を行った。
キメラ個体内において異種のiPS細胞由来の細胞がどの程度寄与しているか、蛍光実体顕微鏡下で新生児個体を解析した。マウスiPS細胞をラット胚盤胞に注入して得られた異種間キメラ個体においてはほぼ全ての臓器でEGFP陽性のマウスiPS細胞由来の細胞が観察された(図9a)。代表的な臓器について(心臓、肝臓、膵臓、腎臓)組織切片を作製し、抗EGFP抗体を用いてマウスiPS細胞由来の細胞の局在を確認したところ、全ての組織にモザイク状のEGFP蛍光が見られ、キメラになっていることが分かった(図9b)。また、ラットiPS細胞をマウス胚盤胞に注入して得られた異種間キメラ個体においても同様の結果が得られた(図9c及び図9d)。このことから両者のiPS細胞は異種の環境下においても全身のほぼ全ての組織・臓器に分化可能であることが示唆される。
近年の報告(例えば、Cell Stem Cell 4, 16−19, December 18, 2008=Rat iPS Cell 135,1287−1298, December 26, 2008=Rat ES Cell 135, 1299−1310, December 26, 2008=RatESなど)におけるラットの ES 細胞、iPS細胞樹立による臓器欠損を目的としたノックアウトラット作製に関する技術に基づき、これらのノックアウトラットホストに用いる。
また、他方、実施例3とは逆にラットの幹細胞株を既存の臓器欠損マウスに注入し同様の成果を得ることもできる。実験としては、実施例1に準じてキメラを作製し、そして、ノックアウトした臓器について、異種臓器が再生されることを確認することができる。
配列番号2:Oct3/4用リバースプライマー、Rv(pMX/L3205): CCC TTT TTC TGG AGA CTA AAT AAA
配列番号3:Klf4用フォワードプライマー、Fw(Klf4−S1236): GCG AAC TCA CAC AGG CGA GAA ACC
配列番号4:Klf4、Sox2、c−Myc用リバースプライマー、Rv(pMXs−AS3200): TTA TCG TCG ACC ACT GTG CTG CTG
配列番号5:Sox2用フォワードプライマー、Fw(Sox2−S768): GGT TAC CTC TTC CTC CCA CTC CAG
配列番号6:c−Myc用フォワードプライマー、FW(c−Myc−S1093): CAG AGG AGG AAC GAG CTG AAG CGC
配列番号7 注入された胚由来の細胞同定用のフォワード(Fw)プライマー:TTC ATG CGA CGG TTT TGG AAC
配列番号8 注入された胚由来の細胞同定用のリバース1(Rv1)プライマー:TTC AAC ATC ACT GCC AGC TCC
配列番号9 注入された胚由来の細胞同定用のリバース(Rv2)プライマー:TGT GAG CGA GTA ACA ACC
配列番号10 注入された胚由来の細胞同定用のOct3/4用フォワード(Fw)プライマー:CAG TTT GCC AAG CTG CTG AA
配列番号11 注入された胚由来の細胞同定用のOct3/4用リバースプライマー:AGG GTC TCC GAT TTG CAT AT
Claims (20)
- 以下の工程を包含する、キメラ動物の作製方法:
(A)幹細胞を、該幹細胞に対して異種の動物の胚盤胞期の胚盤胞腔内に注入するか、または該幹細胞に対して異種の動物の分裂受精卵と混合する工程;および
(B)(A)工程で作製した該幹細胞を含む細胞塊を、該幹細胞の生物種と該異種の動物の生物種とのキメラ動物へと成長させる工程
を包含する、方法。 - 前記幹細胞は、胚性幹(ES)細胞または誘導型幹(iPS)細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞は、iPS細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記iPS細胞は、Klf4、Sox2およびOct3/4の3つの初期化因子を用いて初期化されたものである、請求項3に記載の方法。
- 前記幹細胞は、iPS細胞であり、前記混合は、前記異種の動物の胚盤胞への注入によって行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞の生物種は、マウスまたはラットである、請求項1に記載の方法。
- 前記異種の動物の生物種は、マウスまたはラットである、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞は、標識されたものである、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞は、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれることにより標識されたものである、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞は、1000U/ml以下の白血病抑制因子(LIF)の存在下で維持されたものであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(A)工程において、前記幹細胞は、胚の卵割球または卵黄周囲腔の中心に注入されること、または前記胚胞盤の内部細胞塊(ICM)付近に注入されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(A)工程において、前記幹細胞はキメラ形成に適当な所定数注入されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(B)工程において使用される培地は、mR1ECM培地またはKSOM−AA培地である、請求項1に記載の方法。
- 前記(B)工程は、前記細胞の混合物を前記異種動物である非ヒト宿主哺乳動物の母胎中に戻し、該混合物を成長させて、産仔を得る工程を包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記胚盤胞は、妊娠後4日後のラットまたはそれに該当する段階の動物から得られたものであり、前記母胎へ戻す工程は、擬似妊娠して3日目のラットまたはそれに該当する段階にて行われることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 請求項1〜15に記載の方法によって生産されたキメラ動物。
- 請求項1〜15に記載の方法によって生産されたキメラ動物の臓器またはその一部。
- 以下の工程を包含する、所望のゲノム型を有する臓器を製造する方法:
(A)該所望のゲノム型を有する生物種の幹細胞を、該幹細胞に対して異種の動物の胚盤胞期の胚盤胞腔内に注入するか、または該幹細胞に対して異種の動物の分裂受精卵と混合する工程;
(B)(A)工程で作製した該幹細胞を含む細胞塊を、該幹細胞の生物種と該異種の動物の生物種とのキメラ動物へと成長させる工程;および
(C)該キメラ動物から、所望のゲノム型を有する臓器を取り出す工程、
を包含する、方法。 - 所望のゲノム型を有するキメラ動物を生産するための、幹細胞。
- iPS細胞である、請求項19に記載の幹細胞。
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