JP2018102303A - 幹細胞を用いた異種間胚胞キメラ動物の作製法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(A)幹細胞を、該幹細胞に対して異種の動物の胚盤胞期の胚盤胞腔内に注入するか、または該幹細胞に対して異種の動物の分裂受精卵と混合する工程;および(B)(A)工程で作製した該幹細胞を含む細胞塊を、該幹細胞の生物種と該異種の動物の生物種とのキメラ動物へと成長させる工程を包含する、方法。
【選択図】なし
Description
った結果、ES細胞、iPS細胞等の幹細胞を異種動物の胚盤胞へ注入する方法、もしくは数回分裂した異種動物受精卵と混合し、その後この混合物を発生させる方法によって、異種間胚胞キメラ動物を作出することができることを見出し、本発明を完成するに至った。ES細胞またはiPS細胞を用いることにより、受精卵を用意することなく、異種間胚胞キメラ動物を作出することに成功した。
(1)以下の工程を包含する、キメラ動物の作製方法:
(A)幹細胞を、該幹細胞に対して異種の動物の胚盤胞期の胚盤胞腔内に注入するか、または該幹細胞に対して異種の動物の分裂受精卵と混合する工程;および
(B)(A)工程で作製した該幹細胞を含む細胞塊を、該幹細胞の生物種と該異種の動物の生物種とのキメラ動物へと成長させる工程
を包含する、方法。
(2)前記幹細胞は、胚性幹(ES)細胞または誘導型幹(iPS)細胞である、上記項目に記載の方法。
(3)前記幹細胞は、iPS細胞である、上記項目に記載の方法。
(4)前記iPS細胞は、Klf4、Sox2およびOct3/4の3つの初期化因子を用いて初期化されたものである、上記項目に記載の方法。
(5)前記幹細胞は、iPS細胞であり、前記混合は、前記異種の動物の胚盤胞への注入によって行われる、上記項目に記載の方法。
(6)前記幹細胞の生物種は、マウスまたはラットである、上記項目に記載の方法。
(7)前記異種の動物の生物種は、マウスまたはラットである、上記項目に記載の方法。(8)前記幹細胞は、標識されたものである、上記項目に記載の方法。
(9)前記幹細胞は、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれることにより標識されたものである、上記項目に記載の方法。
(10)前記幹細胞は、1000U/ml以下の白血病抑制因子(LIF)の存在下で維持されたものであることを特徴とする、上記項目に記載の方法。
(11)前記(A)工程において、前記幹細胞は、胚の卵割球または卵黄周囲腔の中心に注入されること、または前記胚胞盤の内部細胞塊(ICM)付近に注入されることを特徴とする、上記項目に記載の方法。
(12)前記(A)工程において、前記幹細胞はキメラ形成に適当な所定数注入されることを特徴とする、上記項目に記載の方法。
(13)前記(B)工程において使用される培地は、mR1ECM培地またはKSOM−AA培地である、上記項目に記載の方法。
(14)前記(B)工程は、前記細胞の混合物を前記異種動物である非ヒト宿主哺乳動物の母胎中に戻し、該混合物を成長させて、産仔を得る工程を包含する、上記項目に記載の方法。
(15)前記胚盤胞は、妊娠後4日後のラットまたはそれに該当する段階の動物から得られたものであり、前記母胎へ戻す工程は、擬似妊娠して3日目のラットまたはそれに該当する段階にて行われることを特徴とする、前記項目に記載の方法。
(16)項目1〜16に記載の方法によって生産されたキメラ動物。
(17)項目1〜16に記載の方法によって生産されたキメラ動物から得られた臓器またはその一部。
(18)所望のゲノム型を有するキメラ動物を生産するための、幹細胞。
(19)iPS細胞である、項目16に記載の幹細胞。
(20)以下の工程を包含する、所望のゲノム型を有する臓器を製造する方法:
(A)該所望のゲノム型を有する生物種の幹細胞を、該幹細胞に対して異種の動物の胚盤胞期の胚盤胞腔内に注入するか、または該幹細胞に対して異種の動物の分裂受精卵と混合する工程;
(B)(A)工程で作製した該幹細胞を含む細胞塊を、該幹細胞の生物種と該異種の動
物の生物種とのキメラ動物へと成長させる工程;および
(C)該キメラ動物から、所望のゲノム型を有する臓器を取り出す工程、
を包含する、方法。
(キメラ動物)
本明細書において「キメラ動物」とは、2つ以上の動物のゲノムに由来するゲノム型を含む、動物をいう。ゲノムは、同種異系であってもよく、異種であってもよい。
ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,2003)に記載される手法が挙げられる。具体的な例としては、たとえば、以下が挙げられる。ピエゾ駆動のマイクロマニピュレーター(プライムテック製)を用いて、顕微鏡下で注意深く透明帯に穴を開けた後、8細胞期胚あるいは桑実胚であれば胚の卵割球の中心または卵黄周囲腔に、胚盤胞であれば内腔に、それぞれ約10個のmES/miPS細胞をインジェクションすることなどが挙げられるが、それに限定されない。
1つの局面において、本発明は、キメラ動物の作製方法を提供する。この方法は、以下の工程:(A)幹細胞を、該幹細胞に対して異種の動物の胚盤胞期の胚盤胞腔内に注入するか、または該幹細胞に対して異種の動物の分裂受精卵と混合する工程;および(B)(A)工程で作製した該幹細胞を含む細胞塊を、該幹細胞の生物種と該異種の動物の生物種とのキメラ動物へと成長させる工程を包含する。倫理上の問題があることから、ホストとしての人体は除外される。
きることから、所望のゲノムを有する異種キメラ動物を生産することができることなどが挙げられる。
(ICM)付近に注入されることを特徴とする。理論に束縛されることを望まないが、胚盤砲に入れる場合も、アグリゲーションをさせる場合も、ドナー(つまり実施例1の場合はマウス)の方は宿主(実施例1の場合ラット)のかたまりのなるべく内側に入れることが好ましいことが明らかとなった。理論に束縛されることを望まないが、これは、ドナーが宿主の免疫系から多少なりとも逃れられるからであると考えられる。
別の局面において以下の工程を包含する、所望のゲノム型を有する臓器を製造する方法を提供する。この方法は、(A)該所望のゲノム型を有する生物種の幹細胞を、該幹細胞に対して異種の動物の胚盤胞期の胚盤胞腔内に注入するか、または該幹細胞に対して異種の動物の分裂受精卵と混合する工程;(B)(A)工程で作製した該幹細胞を含む細胞塊を、該幹細胞の生物種と該異種の動物の生物種とのキメラ動物へと成長させる工程;および(C)該キメラ動物から、所望のゲノム型を有する臓器を取り出す工程、を包含する。
形臓器は、全能性細胞あるいは多能性細胞を、レシピエントとなる胚の中で発生させることにより、産仔の体内において製造する。全能性細胞あるいは多能性細胞は、胚の中で発生させることにより、すべての臓器を形成することができることから、使用する全能性細胞あるいは多能性細胞の種類に依存して製造することができる固形臓器が制約を受けることはない。
本発明は、所望のゲノム型を有するキメラ動物を生産するための、幹細胞を提供する。特に、本発明では、異種でのキメラ動物の生産が可能になったことが特徴である。このようなキメラ動物は、従来生産することができなかったことから、動物自体にも発明としての価値があると考えられる。理論に束縛されることは望まないが、このような動物がこれまで作製することができなかったのは、異種では、キメラ動物の産生の困難性から成功率が低いと考えられていたことが原因であると考えられる。
iPS細胞は、初期に同定された、Oct3/4、Sox2、Klf4およびc−Mycの4因子を用いてもよく、他の方法によっても作製することができる。すなわち、iPS細胞は、体細胞に初期化因子(単数または複数の因子の組み合わせでありうる)を接触
させることによって初期化を誘導させて生産することができる。そのような初期化および初期化因子の例としては以下のようなものを挙げることができる。たとえば、本発明の実施例では、iPS細胞は3因子(Klf4、Sox2、Oct3/4;これらは本発明において使用される代表的な「初期化因子」である。)を、GFPトランスジェニックマウスの尻尾より採取した繊維芽細胞に導入することにより、本発明者らが独自に作製したが、このほかの組み合わせ、たとえば、Yamanaka因子とも呼ばれるOct3/4、Sox2、Klf4およびc−Mycの4因子を利用した方法を用いることもでき、その改良法を用いることもできる。遺伝子としては、c−Mycの代わりにn−Mycを用い、ベクターとしては、レトロウイルスベクターの一種であるレンチウイルスベクターを用いて、iPS細胞を樹立することも可能である(Blelloch R et al.,(2007).Cell Stem Cell 1:245−247)。また、OCT3/4・SOX2・NANOG・LIN28の4遺伝子を胎児肺由来の線維芽細胞や新生児包皮由来の線維芽細胞へ導入することで、ヒトiPS細胞を樹立することも可能である(Yu J,et al.,(2007).Science 318:1917−1920)。
al.,(2007).Cell 131: 861−872.)。OCT3/4・SOX2・KLF4・C−MYCの4遺伝子にhTERT・SV40 large Tを加えた6遺伝子を用いてヒトiPS細胞を樹立することもできる(Park IH,et al.,(2007).Nature 451:141−146.)。また、c−Mycの遺伝子導入をせずにOct−4、Sox2およびKlf4の3因子だけでも、低効率ながらマウスおよびヒトにおいてiPS細胞の樹立が可能であることが示されており、iPS細胞が癌細胞に変化するのを抑えることに成功していることから、本発明においてこれを利用することもできる(Nakagawa M,et al.,(2008).Nat
Biotechnol 26:101−106.;Wering M,et al.,(2008).Cell Stem Cell 2:10−12)。
本発明の技術は、ノックアウト動物と組み合わせて実施することができる。ノックアウト動物は、概ね、以下の手順で作製される。まず、ターゲッティングベクター(組換えDNA)を調製した後、エレクトロポレーション法などにより、そのターゲッティングベクターを幹細胞(たとえば、ES細胞、iPS細胞など)に導入する。そして、相同的遺伝子組換えの生じたES細胞株を選別する。次に、8細胞期胚又は胚盤胞期胚の中に、その組換えES細胞、iPS細胞などを、インジェクション法により注入し、キメラ胚を作製する。次に、そのキメラ胚を偽妊娠動物の子宮に移植し、産仔(キメラ動物)を得る。次に、作製したキメラ動物と野生型動物を交配し、生殖細胞が組換えES細胞、iPS細胞などに由来する細胞により形成されているか否かを確認する。そして、生殖細胞が組換えES細胞、iPS細胞などに由来する細胞により形成されていることが確認された動物同士を交配し、得られた産仔の中からノックアウト動物を選別する。
本明細書において、本発明において使用される遺伝子(たとえば、Sall1、pdx−1などの欠損遺伝子、またはiPS細胞を生産するのに必要な遺伝子であるKlf4、Sox2、Oct3/4など)には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
おける所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子(例えば、sall1)に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヒトの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物(マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど)においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその動物(例えば、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど)の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
マウス以外の動物を使用する場合は、以下の点に留意することで、本明細書の実施例に記載した手法を応用して実施することができる。たとえば、他種の動物におけるキメラ作製に関して、マウス以外の種ではキメラ形成能をもつような多能性幹細胞樹立の報告よりは、胚もしくは胚の中でもES細胞の起源となる内部細胞塊を注入したキメラの報告(ラット:(Mayer,J.R.Jr.&Fretz,H.I.The culture of preimplantation rat embryos and the prosuction of allophenic rats.J.Reprod.Fertil.39,1−10(1974));ウシ:(Brem,G.et al.Production of cattle chimerae through embryo microsurgery.Theriogenology.23,182(1985));ブタ:(Kashiwazaki N et.al Production of chimeric pigs by the blastocyst injection method Vet.Rec.130,186−187(1992)))が多いが、内部細胞塊を注入したキメラを用いても、本明細書に記載した方法を応用することができる。これらのように内部細胞塊を用いることで欠損動物の失われた臓器を補うことは事実上可能である。すなわち、たとえば、上記細胞をいずれも胚盤胞までin vitroで培養し、得られた胚盤胞から内部細胞塊を物理的に一部剥離し、それを胚盤胞へインジェクションすることができる。途中の8細胞期あるいは桑実胚同士を凝集させキメラ胚を作製することができる。そして、このような技術が異種間のキメラ動物の作出において利用される。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J.et
al.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001);Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience;Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience;Innis,M.A.(1990).PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press;Ausubel,F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biol
ogy,Greene Pub.Associates;Ausubel,F.M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates;Innis,M.A.et al.(1995).PCR Strategies,Academic Press;Ausubel,F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,and annual updates;Sninsky,J.J.et al.(1999).PCR Applications:Protocols for Functional
Genomics,Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
本実施例において、以下の文献を参考にした:
Hooper M,Hardy K,Handyside A et al.HPRT−deficient(Lesch−Nyhan)mouse embryos derived from germline colonization by cultu
red cells.Nature 1987;326:292−295.
Niwa H,Miyazaki J,Smith AG.Quantitative
expression of Oct−3/4 defines differentiation,dedifferentiation or self−renewal
of ES cells.Nat Genet 2000;24:372−376.
Nagy,A.,Gertsenstein,M.,Vintersten,K.& Behringer,R.Manipulating the Mouse Embryos.A Laboratory Manual,3rd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,2003)
Qi−Long Ying, Marios Stavridis, Dean Griffiths, Meng Li, Austin Smith.Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.Nature Biotechnology 2003;21:183−186.
Shyoso Ogawa, Kahei Satoh,Hajime Hashimoto.In vitro Culture of Rabbit Ova from the Single Cell to the Blastocyst Stage.Nature 1971;233:422−424.
Oh,S.H.,K.Miyoshi H.Funahashi.Rat oocytes fertilized in modified rat 1−cell embryo culture medium containing a high sodium chloride concentration and bovine serum albumin maintain developmental ability to the blastocyst stage.Biology Reproduction 1998;59:884−889.
(実施例1)
本実施例では、マウスのES細胞およびiPS細胞を幹細胞として用いてラットの受精卵または胚盤胞との混合実験または注入を行いキメラ動物が生産されることを実証した。
本発明者らは、誘導型多能性幹(iPS)細胞は3因子(Klf4、Sox2、Oct3/4)でGFPトランスジェニックマウスの尻尾より採取した繊維芽細胞を使って生産した。そのプロトコールは以下のとおりである。そのスキームは図1および詳細には図4aに示した。
から入手可能)にてピックアップし、0.25%トリプシン/EDTA(Invitrogen社)で単一細胞にまでバラバラにし、新たに用意したマウス胎児繊維芽細胞(MEF)上に撒いた。
Oct3/4
Fw(mOct3/4−S1120): CCC TGG GGA TGC TGT GAG CCA AGG(配列番号1)
Rv(pMX/L3205): CCC TTT TTC TGG AGA CTA AAT AAA(配列番号2)
Klf4
Fw(Klf4−S1236): GCG AAC TCA CAC AGG CGA GAA ACC(配列番号3)
Rv(pMXs−AS3200): TTA TCG TCG ACC ACT GTG
CTG CTG(配列番号4)
Sox2
Fw(Sox2−S768): GGT TAC CTC TTC CTC CCA CTC CAG(配列番号5)
Rv(pMX−AS3200): 上記と同じ(配列番号4)
c−Myc
FW(c−Myc−S1093): CAG AGG AGG AAC GAG CTG
AAG CGC(配列番号6)
Rv(pMX−AS3200): 上記と同じ(配列番号4)
その結果、図4dに示すように、3因子の挿入が確認された。
の報告(Cell 2006 Aug 25;126(4):652−5.)等に基づきプライマーを合成したものを用いた。その結果、図4eに示すように、いずれの株もES細胞とほぼ同様の発現パターンを示し、また導入された遺伝子(Tg)はiPS細胞の高い遺伝子サイレンシング活性によりその発現が抑えられていることがわかった。
未分化のマウス胚性幹(mES)細胞(EB3DR)(RIKEN CDBの丹羽仁史先生より供与)を、ゼラチンコートディッシュにおいて、10%胎仔ウシ血清(FBS;ニチレイバイオサイエンス製)、0.1mM 2−メルカプトエタノール(Invitrogen,San Diego,CA)、0.1mM非必須アミノ酸(Invitrogen)、1mM ピルビン酸ナトリウム(Invitrogen)、1% L−グルタミン ペニシリン ストレプトマイシン(Sigma)および1000U/mlの白血病抑制因子(LIF;Millipore,Bedford,MA)を補充したGlasgow改変イーグル培地(GMEM;Sigma,St.Louis,MO)中で、フィーダー細胞なしで維持した。このEB3DR細胞は、EB3 ES細胞に由来し、そして、CAG発現ユニットの制御下でDsRed−T4遺伝子を持つ。EB3 ES細胞は、E14tg2a ES細胞(Hooper M.et al.,1987)に由来する下位系統の細胞であり、Oct−3/4プロモーター制御下で薬剤耐性遺伝子であるブラストサイジンを発現するように構築したOct−3/4−IRES−BSD−pAベクターの組み込みを、Oct−3/4対立遺伝子に標的化することによって樹立されたものである(Niwa H.et al.,2000)。
EF)上に維持した。GT3.2細胞は、オスのEGFPトランスジェニックマウス(大阪大学の岡部勝先生より寄与)の尾から採取した繊維芽細胞にKlf4、Sox2、Oct3/4の3つの初期化因子をレトロウイルスベクターで導入することにより樹立した細胞であり、CAG発現ユニットの制御下で改良型緑色蛍光タンパク質(EGFP)をユビキタスに発現する。
これらの胚の調製は、公表されたプロトコール(Nagy A.et al.,2003)に従って行った。簡単に述べると、オスC57BL/6マウスとの交配後2.5日(2.5dpc)のメスBDF1マウスの卵管および子宮から、マウスの8細胞/桑実胚期の胚をM2培地(Millipore)中に採卵した。これらの胚をKSOM−AA培地(Millipore)滴中に移し、そして、胚盤胞期まで24時間培養した。
オスWistar系統ラットとの交配後3.5日(本明細書において3.5dpcとも称する)のメスWistar系統ラットの卵管および子宮からラット8細胞/桑実胚期の胚を、そして、交配後4.5日(本明細書において4.5dpcとも称する)のメスWistar系統ラットの子宮からラット胚盤胞を、それぞれ、A 液(HAM F−12 (SIGMA) 1.272g, NaHCO3 (SIGMA)( 0.192g) + B液(RPMI1640 (SIGMA) 0.416g, NaHCO3 (SIGMA) 0.056g)+ C液(EARLE (SIGMA) 0.344g, EAGLE MEM(SIGMA) 0.0352g, NaHCO3 0.064g) + Penicillin G (SIGMA) 0.015g, Streptomycin (SIGMA) 0.010gを含むHERs培地中に採卵した。これらの胚を、80mM NaCl(和光純薬工業製)および0.1%ポリビニルアルコール(PVA;Sigma)を含む改変ラット1細胞胚培養培地(mR1ECM;Oh et al.,1998)中に移し、そして、胚盤胞期まで24時間培養した。
mES/miPS細胞をトリプシン処理し、そして、1mM HEPES緩衝溶液を加えた培養培地中に懸濁した。8細胞/桑実胚期で、胚をHEPES緩衝mES/miPS培養培地を含む微小滴内に移した。ピエゾ駆動のマイクロマニピュレーター(プライムテック製)を用いて、顕微鏡下で注意深く透明帯に穴を開けた後、胚の卵割球または卵黄周囲腔の各々の中心に、10個のmES/miPS細胞をインジェクションした。インジェクション後、胚を胚盤胞期まで24時間mR1ECM培地中で培養し、その後、3.5dpcの偽妊娠交配させた仮親メスWistar系統ラットの子宮に胚移植した。
キメラの解析は胎児期15.5〜16.5日目、新生児期および成体で行った。それぞれの解析時期の割り振りは表1に示す。胎児期の解析では、仮親への移植から12日目で開腹して胎児を摘出し、蛍光実体顕微鏡下で、ES細胞であればDsRed、iPS細胞であればEGFPの蛍光を指標に、キメラの存在とその寄与率を肉眼的に確認した(表1)。新生児期の解析では、妊娠満期である移植後18日に自然分娩もしくは帝王切開により産仔を得て、それを胎児期同様、肉眼的に蛍光を観察した。
胚移植後11日目または12日目の仔から、胎児繊維芽細胞を樹立した(図2a)。具体的には、胎児を顕微鏡下で解剖し、頭部および臓器を取り出し、そして、20分間トリプシン処理を行った。トリプシン処理の後、この懸濁物をフィルターに通し、その後、ゼラチンコートディッシュに蒔いた。24時間インキュベートした後、接着した細胞を回収した。図2aは、胎児繊維芽細胞を用いたマウス/ラットキメラの解析のうち、mES細胞インジェクションにより作製したE15.5マウス/ラットキメラの仔から樹立した胎児繊維芽細胞を示す。図2a上のパネルは明視野の像であり、図2a下のパネルは赤色蛍光像である。そして、3%FBSを含むリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)(染色用培地;SM)中に懸濁し、そして、氷上にて1時間、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)を結合させた抗ラットCD54抗体(BD Pharmingen,San Diego,CA)で免疫染色を行った。SMで洗浄した後、蛍光強度を高めるために、細胞懸濁物にAlexa647を結合させた抗マウスIgG抗体(Invitrogen)を加え、氷上にて1時間免疫染色を行った。ヨウ化プロピジウム(PI)を含むSM中に懸濁させた後、これらの細胞を、ES細胞由来のマウス細胞(DsRed)およびラット細胞(rCD54+Alexa647)の分布について、MoFlo(Dako,Carpinteria,CA)およびFlow−Joソフトウェアにより解析した。結果を図2bに示す。
マウス/ラットのキメラ新生児からの臓器および組織(腕、心臓、肝臓、膵臓および腎臓)を、4%パラホルムアルデヒドで6時間固定し、そして、パラフィン中に包埋した。包埋した臓器を薄切し、室温にて1時間、抗GFP抗体(Invitrogen)で免疫染色を行った。PBSで洗浄した後、これらの切片を、室温にて1時間、Alexa488を結合させた抗ウサギIgG抗体(Invitrogen)で免疫染色を行った。染色
した切片を、DAPIを含む封入溶液(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)で覆い、蛍光実体顕微鏡下で解析した。この切片をまた、ヘマトキシリン・エオシン(HE)染色して、光学顕微鏡下で解析した。
マウスーラットキメラ動物の成立を実証するため、マウスiPS細胞をラット胚に注入する方法と、ラットiPS細胞をマウス胚に注入する方法の双方を実施した。
iPS細胞樹立のためのソースとして Wistarラット胎児(雄)から繊維芽細胞を樹立した。iPS細胞の誘導にはマウスiPS細胞の樹立時に用いたレトロウイルスではなく、テトラサイクリン依存的に3因子の発現を誘導できるシステムを組み込んだレンチウイルスベクターを用いた(図5a)。本ベクターではユビキチン−C(UbC)プロモーター下でrtTAとEGFPがIRES配列を介して共に発現する。よって誘導時にレンチウイルスの感染が認められた細胞は恒常的にEGFP蛍光を示すため、樹立したiPS細胞自体の標識も同時に行うことが可能となる。このレンチウイルスを介して3因子を導入しラットiPS細胞を誘導した。導入後しばらくは繊維芽細胞の増殖に必要な血清を含む培地で培養後、途中から阻害剤を含むラットES細胞用の培地に切り替え培養を継続したところ、ラットのiPS細胞様コロニーが得られた。ピックアップ後の継代培養においても自発的に分化することなく維持でき、iPS細胞株として株化することに成功した。ここでできた細胞株のひとつをラットiPS細胞(rWEi3.3−iPS細胞)とした(図5b)。
、マイトマイシン−C処理を施したマウス胎児繊維芽細胞上に播種した。
異種間キメラ作製のため、マウスiPS細胞をラット胚盤胞に、もしくは逆にラットiPS細胞をマウス胚盤胞に注入した。マウスiPS細胞としては、実施例1で樹立したEGFP−Tgマウス由来のmGT3.2−iPS細胞を用いた。胚培養および胚操作は、以下の通りである。マウス交配後の胚の採取および培養、マイクロインジェクション等は既報のプロトコールに従って行った (Nagy et al., 2003)。簡単に
述べると、まずマウスの8細胞期/桑実胚期の胚は交配後2.5日後の卵管および子宮から、M2培地(Millipore)に回収した。回収した胚は、アミノ酸を含むKSOM培地(KSOM−AA培地:Millipore)に移し、8細胞期/桑実胚期の胚への注入に用いる場合は注入操作に用いるまでの1〜2時間、胚盤胞への注入に用いる場合は一晩、5%CO2存在下、37℃で培養した。
マウスおよびラットOct3/4
Fw : 5’− CAGTTTGCCAAGCTGCTGAA−3’(配列番号:10)
Rv : 5’− AGGGTCTCCGATTTGCATAT−3’ (配列番号:1
1)
由来の判定には、両者のゲノムDNAにおけるOct3/4遺伝子座の第2 エクソンと第4エクソン間にあるイントロン鎖長の差異に着目した。この部分の鎖長はラットの方が約100塩基ほど長くなっており、エクソンに存在する共通配列を元に設計したプライマーでPCR反応を行うことで、両者の由来を判定できる (図7b)。PCR反応の結果、マウスCD45陽性細胞のゲノムDNAはマウスOct3/4遺伝子座の鎖長を、ラットCD45陽性細胞ではラットOct3/4遺伝子座の鎖長を示した(図7c)。よって表面抗原を用いた解析結果、あるいは遺伝的な解析結果においても、キメラ胎児肝臓中には両者の細胞が混在していることが分かった。以上のことから、マウス−ラット間における異種間キメラの成立が証明された。
次に我々はマウス−ラット間の異種間キメラが妊娠満期、あるいは産後成体まで発育可能かを確認した。方法は前項で用いたマウスmGT3.2−iPS細胞をラット胚盤胞へ、ラットrWEi3.3−iPS細胞をマウス胚盤胞へそれぞれ注入し、子宮内に移植後、妊娠満期に自然分娩もしくは帝王切開により産仔を摘出した。その結果、新生児において蛍光顕微鏡下で観察したところ、両産仔ともにモザイク状のEGFP蛍光を示した(図8a、8b)。また産後それらを成体まで発育させ毛色によりキメラ形成を判定した。マウスiPS細胞は黒毛のC57BL/6系統を背景にもつEGFP−Tgマウス由来であるため、白毛のWistarラット胚由来と区別がつき、また逆にラットiPS細胞は白毛のWistar由来であるため、黒毛のC57BL/6×BDF1のF1胚由来と区別ができる。その結果、成体においても異種間キメラ形成が確認できた(図8c、8d)。
Pharmingen)、PE−Cy7 標識 抗−B220 抗体 (ラット IgG : BD Bioscience Pharmingen)、APC 標識 抗−CD4 抗体、APC−Cy7 標識 抗−CD8 抗体で染色し、Mo−floとFACSCanto(BD bioscience)を用いて、分取及び解析を行った。
キメラ個体内において異種のiPS細胞由来の細胞がどの程度寄与しているか、蛍光実体顕微鏡下で新生児個体を解析した。マウスiPS細胞をラット胚盤胞に注入して得られた異種間キメラ個体においてはほぼ全ての臓器でEGFP陽性のマウスiPS細胞由来の細胞が観察された(図9a)。代表的な臓器について(心臓、肝臓、膵臓、腎臓)組織切片を作製し、抗EGFP抗体を用いてマウスiPS細胞由来の細胞の局在を確認したところ、全ての組織にモザイク状のEGFP蛍光が見られ、キメラになっていることが分かった(図9b)。また、ラットiPS細胞をマウス胚盤胞に注入して得られた異種間キメラ個体においても同様の結果が得られた(図9c及び図9d)。このことから両者のiPS細胞は異種の環境下においても全身のほぼ全ての組織・臓器に分化可能であることが示唆される。
近年の報告(例えば、Cell Stem Cell 4, 16−19, December 18, 2008=Rat iPS Cell 135,1287−1298, December 26, 2008=Rat ES Cell 135, 1299−1310, December 26, 2008=RatESなど)におけるラットの ES 細胞、iPS細胞樹立による臓器欠損を目的としたノックアウトラット作製に関する技術に基づき、これらのノックアウトラットホストに用いる。
また、他方、実施例3とは逆にラットの幹細胞株を既存の臓器欠損マウスに注入し同様の成果を得ることもできる。実験としては、実施例1に準じてキメラを作製し、そして、ノックアウトした臓器について、異種臓器が再生されることを確認することができる。
配列番号2:Oct3/4用リバースプライマー、Rv(pMX/L3205): CCC TTT TTC TGG AGA CTA AAT AAA
配列番号3:Klf4用フォワードプライマー、Fw(Klf4−S1236): GCG AAC TCA CAC AGG CGA GAA ACC
配列番号4:Klf4、Sox2、c−Myc用リバースプライマー、Rv(pMXs−AS3200): TTA TCG TCG ACC ACT GTG CTG CTG配列番号5:Sox2用フォワードプライマー、Fw(Sox2−S768): GGT
TAC CTC TTC CTC CCA CTC CAG
配列番号6:c−Myc用フォワードプライマー、FW(c−Myc−S1093): CAG AGG AGG AAC GAG CTG AAG CGC
配列番号7 注入された胚由来の細胞同定用のフォワード(Fw)プライマー:TTC ATG CGA CGG TTT TGG AAC
配列番号8 注入された胚由来の細胞同定用のリバース1(Rv1)プライマー:TTC
AAC ATC ACT GCC AGC TCC
配列番号9 注入された胚由来の細胞同定用のリバース(Rv2)プライマー:TGT
GAG CGA GTA ACA ACC
配列番号10 注入された胚由来の細胞同定用のOct3/4用フォワード(Fw)プライマー:CAG TTT GCC AAG CTG CTG AA
配列番号11 注入された胚由来の細胞同定用のOct3/4用リバースプライマー:AGG GTC TCC GAT TTG CAT AT
Claims (20)
- 以下の工程を包含する、キメラ動物の作製方法:
(A)幹細胞を、該幹細胞に対して異種の動物の胚盤胞期の胚盤胞腔内に注入するか、または該幹細胞に対して異種の動物の分裂受精卵と混合する工程;および
(B)(A)工程で作製した該幹細胞を含む細胞塊を、該幹細胞の生物種と該異種の動物の生物種とのキメラ動物へと成長させる工程
を包含する、方法。 - 前記幹細胞は、胚性幹(ES)細胞または誘導型幹(iPS)細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞は、iPS細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記iPS細胞は、Klf4、Sox2およびOct3/4の3つの初期化因子を用いて初期化されたものである、請求項3に記載の方法。
- 前記幹細胞は、iPS細胞であり、前記混合は、前記異種の動物の胚盤胞への注入によって行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞の生物種は、マウスまたはラットである、請求項1に記載の方法。
- 前記異種の動物の生物種は、マウスまたはラットである、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞は、標識されたものである、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞は、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれることにより標識されたものである、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞は、1000U/ml以下の白血病抑制因子(LIF)の存在下で維持されたものであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(A)工程において、前記幹細胞は、胚の卵割球または卵黄周囲腔の中心に注入されること、または前記胚胞盤の内部細胞塊(ICM)付近に注入されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(A)工程において、前記幹細胞はキメラ形成に適当な所定数注入されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(B)工程において使用される培地は、mR1ECM培地またはKSOM−AA培地である、請求項1に記載の方法。
- 前記(B)工程は、前記細胞の混合物を前記異種動物である非ヒト宿主哺乳動物の母胎中に戻し、該混合物を成長させて、産仔を得る工程を包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記胚盤胞は、妊娠後4日後のラットまたはそれに該当する段階の動物から得られたものであり、前記母胎へ戻す工程は、擬似妊娠して3日目のラットまたはそれに該当する段階にて行われることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 請求項1〜15に記載の方法によって生産されたキメラ動物。
- 請求項1〜15に記載の方法によって生産されたキメラ動物の臓器またはその一部。
- 以下の工程を包含する、所望のゲノム型を有する臓器を製造する方法:
(A)該所望のゲノム型を有する生物種の幹細胞を、該幹細胞に対して異種の動物の胚盤胞期の胚盤胞腔内に注入するか、または該幹細胞に対して異種の動物の分裂受精卵と混合する工程;
(B)(A)工程で作製した該幹細胞を含む細胞塊を、該幹細胞の生物種と該異種の動物の生物種とのキメラ動物へと成長させる工程;および
(C)該キメラ動物から、所望のゲノム型を有する臓器を取り出す工程、
を包含する、方法。 - 所望のゲノム型を有するキメラ動物を生産するための、幹細胞。
- iPS細胞である、請求項19に記載の幹細胞。
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