JP5688800B2 - ｉＰＳ細胞とＢＬＡＳＴＯＣＹＳＴＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴＡＴＩＯＮを利用した臓器再生法 - Google Patents

Description

本発明は、ｉＰＳ細胞を用いて生体内で所望の細胞由来の臓器を作製する方法に関する。

細胞移植あるいは臓器移植といった形での再生医療を論じる上で、多分化能を有する幹細胞への期待は大きい。胚盤胞期受精卵の内部細胞塊より樹立されたＥＳ細胞は、多分化能を持ち、種々の細胞分化の研究に用いられ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでそれを特定の細胞系譜に分化誘導する分化制御法の開発は再生医学研究のトピックである。

ＥＳ細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ分化研究では胚発生初期に分化してくる血球、血管、心筋、神経系などの中胚葉、外胚葉系へは分化しやすい。しかしながら、胚発生中期以降に細胞間相互作用を通じて複雑な組織形成へと向かう器官への分化は難しいという一般的な傾向が知られている。

たとえば、哺乳類の成体腎臓である後腎は胚発生中期に中間部中胚葉より発生する。具体的には後腎間葉細胞と尿管芽上皮という２つのコンポーネントの相互作用により腎臓発生は始まり、最終的に数十種類という他臓器には見られない程の多種類の機能細胞への分化とそれらによる糸球体・尿細管を中心とした複雑なネフロン構造の構成により、成体腎臓が完成する。腎臓の発生時期とその過程の複雑さから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＳ細胞から腎臓を誘導することが非常に手間のかかる難仕事であることは容易に推察でき、事実上不可能であると考えられている。また、腎臓などの臓器では体性幹細胞の同定はいまだ確定的なものではなく、一時盛んに研究された骨髄細胞の障害腎臓修復過程への寄与もさほど大きいものではないということが判明しつつある。

多分化能を有するＥＳ細胞を胚盤胞期受精卵の内腔へ注入すれば産生個体はキメラマウスを形成する。Ｔ細胞、Ｂ細胞系譜を欠損するＲａｇ−２ノックアウトマウスに対して、この技術を応用した胚盤胞補完作用（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によるＴ細胞、Ｂ細胞系譜のレスキュー実験が過去に報告されている（非特許文献１）。このキメラマウス・アッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系の存在しないＴ細胞系譜の分化を確認するｉｎ ｖｉｖｏアッセイ系として用いられている。

しかし、いったんある臓器でこのような技術が使用可能であることがわかっても、実際に他の臓器で成功するかどうかは、臓器の生体内における役割、例えば、臓器を欠失させたときの致死性などが異なることから、予測は困難であり、種々の要因が影響を与える。そして、今回選択した臓器欠損モデルの欠損遺伝子も重要な要因であり、欠損する遺伝子の発生過程における機能、特に臓器形成過程における各臓器の幹／前駆細胞などの分化・維持に必須な転写因子を選択することが必要であるからだと思われる。

これが液性因子や分泌因子の欠損が原因で臓器欠損を示すモデルを利用していたとすると、その放出される因子だけがＥＳ細胞由来の細胞から放出されることにより補充され、臓器レベルではキメラ状態になってしまうことが予想される。

このことから、本発明において臓器において適切なモデル動物の選択が鍵となる要因であり、他臓器への応用を考えたとき、他の臓器において本発明と同様の表現型を示すモデルを用いるのは困難であると思われる。

本発明者らは、臓器再生方法として、ＰＣＴ／ＪＰ２００８／５１１２９を出願した。

また、最近誘導型多能性幹（ｉＰＳ）細胞が注目を浴びている（たとえば、非特許文献２）。ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と同等の機能を有するとされている。

Ｃｈｅｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９０，ｐｐ．４５２８−４５３２，１９９３ Ｏｋｉｔａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｒｍｌｉｎｅ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４４８（７１５１）３１３−７、２００７

本発明は、簡便に作製可能な誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を用いて産業用に適する臓器再生の技術を提供することを課題とする。すなわち、個人の特性に応じて皮膚などの体細胞から、「自分自身の臓器」を再生する技術を提供することを課題とする。また、目的のゲノムを有する細胞に基づいて誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を生産して本発明を実施することにより、種々のゲノム由来の臓器を用いた研究開発を行うことも課題とする。さらに、ＥＳ細胞において問題となっていた倫理に関する問題を回避することも課題とする。

本発明は、胚盤胞補完方法において、発生した胚盤胞に誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を注入することで、膵臓などの臓器の欠損を補うと、次世代が誕生することを見出し、膵臓が補われたトランスジェニック動物はファウンダーとして次世代に表現型を伝えることが可能であることをも見出したことによって、このようなファウンダーを用いて、臓器再生を行うことができることを明らかにし、上記課題を解決するに至った。

本発明においては、たとえば、膵臓などの臓器の欠損を特徴とするノックアウトマウスおよびトランスジェニック動物（たとえば、マウス）中に、多能性細胞として誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を移植して、膵臓を補いファウンダーとして効率的に産仔を得ることができることを見出した。

本発明においては、誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を用いてもＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇの結果より膵臓が補われたノックアウトマウスは正常に成体へと育つことがわかった。

補われたノックアウト（本明細書以下「ＫＯ」ともいう。）マウスはファウンダーとして次世代にその表現型を伝えられるＫＯとヘテロマウスの交配のため理論上メンデル遺伝の法則に従い１／２の確率でＫＯもしくはヘテロ個体になるはずであるところ、実際にそのようになったことを見出した。膵臓を補ったＫＯ同士の交配であれば１００％次世代でＫＯ個体を得ることが可能となり、ＫＯ個体を使った解析が顕著に行いやすくなると思われる。

また、臓器欠損を誘発する導入遺伝子を卵細胞に入れ、この後、移植するのが従来のトランスジェニック（Ｔｇ）動物作製法においても、発生した胚盤胞にＥＳ細胞を注入することで、膵臓の欠損を補うと、次世代が誕生する比較的新しい方法においても、誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を使用しうることが判明した。しかも、誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）でも、膵臓が補われたトランスジェニック動物はファウンダーとして次世代に表現型を伝えることが可能であることも確認された。したがって、このようなファウンダーを用いて、誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を用いても臓器再生を行うことができることが明らかになった。

いったんある臓器について、本発明の方法が適用することができることがわかると、その臓器については、成功した事例に基づいて適宜変更を加えて応用することができることが理解される。その理由は以下のとおりである。適切な欠損動物が存在すれば、本明細書に示されるように蛍光標識されたｉＰＳ細胞（たとえば、皮膚または尻尾より採取した繊維芽細胞由来）等を用い、同様の解析方法を適用すれば構築された臓器が宿主由来かｉＰＳ細胞等由来かは明らかとなり、臓器構築の可否を判定でき、同様の理論で、次世代の動物を再生産させることができることが理解されるからである。

したがって、本発明は、以下を提供する。

１つの局面において、本発明は、発生段階において目的臓器の発生が生じない異常を有する非ヒト哺乳動物の生体内において、該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来の該目的臓器を製造する方法であって、
ａ）該異個体哺乳動物由来の誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を調製する工程；
ｂ）該非ヒト哺乳動物の胚盤胞期の受精卵中に、該細胞を移植する工程；
ｃ）該受精卵を非ヒト仮親哺乳動物の母胎中で発生させて、産仔を得る工程；および
ｄ）該産仔個体から、該目的臓器を取得する工程
を含む、目的臓器を製造する方法を提供する。

１つの実施形態において、前記ｉＰＳ細胞は、ヒト、ラットまたはマウス由来である。

１つの実施形態において、前記ｉＰＳ細胞はラットまたはマウス由来である。

１つの実施形態において、前記製造すべき臓器が膵臓、腎臓、胸腺および毛から選択される。

１つの実施形態において、前記非ヒト哺乳動物はマウスである。

１つの実施形態において、前記マウスはＳａｌｌ１ノックアウトマウス、Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックマウス、Ｐｄｘ−１ノックアウトマウスまたはヌードマウスである。

１つの実施形態において、前記目的臓器は、完全に前記異個体哺乳動物由来のものである。

１つの実施形態において、本発明の方法は、前記ｉＰＳ細胞を、体細胞に初期化因子を接触させることによって得る工程をさらに包含する。

１つの実施形態において、本発明の方法では、前記ｉＰＳ細胞と、前記非ヒト哺乳動物とが、異種の関係のものである。

１つの実施形態において、本発明の方法では、前記ｉＰＳ細胞がラット由来であり、前記非ヒト哺乳動物がマウスである。

別の局面において、本発明は、発生段階において目的臓器の発生が生じない異常を有する非ヒト哺乳動物であって、
ａ）該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来のｉＰＳ細胞を調製する工程；
ｂ）該非ヒト哺乳動物の胚盤胞期の受精卵中に、該ｉＰＳ細胞を移植する工程；および
ｃ）該受精卵を非ヒト仮親哺乳動物の母胎中で発生させて、産仔を得る工程
を含む方法によって生産された哺乳動物を提供する。

他の局面において、本発明は、発生段階において目的臓器の発生が生じない異常を有する非ヒト哺乳動物の、ｉＰＳ細胞を用いた該目的臓器の製造のための使用に関する。

別の局面において、本発明は、目的臓器を製造するためのセットであって、該セットは、
Ａ）発生段階において該目的臓器の発生が生じない異常を有する非ヒト哺乳動物と、
Ｂ）該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来のｉＰＳ細胞または初期化因子および必要に応じて体細胞とを備える、セットを提供する。

別の局面において、本発明は、目的の臓器または身体部分を生産する方法であって、
Ａ）機能すると生存し得ないまたは生存困難となる臓器または身体部分の欠損原因をコードする欠損原因遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、胚盤胞補完により補完される、動物を提供する工程であって、前記欠損原因遺伝子は、該目的の臓器または身体部分の欠損原因をコードするものである、工程；
Ｂ）該動物から卵子を得、胚盤胞に成長させる工程；
Ｃ）該胚盤胞中に、該欠損原因遺伝子による欠損を補完する能力を有する所望のゲノムを有する目的ｉＰＳ細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程；および
Ｄ）該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該個体から該目的の臓器または身体部分を取得する工程
を包含する方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明の方法は、前記ｉＰＳ細胞を、体細胞に初期化因子を接触させることによって得る工程をさらに包含する。

１つの実施形態において、前記Ｄ）工程は、前記キメラ胚盤胞を非ヒト仮親哺乳動物の母胎中で発生させて、産仔を得、該産仔個体から、該目的臓器を取得することを包含する。

別の実施形態において、前記目的ｉＰＳ細胞はラットまたはマウス由来である。

他の実施形態では、前記目的の臓器または身体部分は膵臓、腎臓、胸腺および毛から選択される。

さらに別の実施形態では、前記動物はマウスである。

別の実施形態では、前記マウスはＳａｌｌ１ノックアウトマウス、Ｐｄｘ−１ノックアウトマウス、Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックマウスまたはヌードマウスである。

さらに別の実施形態では、前記目的の臓器または身体部分は、完全に前記目的多能性細胞由来のものである。

さらに別の実施形態では、前記ｉＰＳ細胞と、前記非ヒト哺乳動物とが、異種の関係のものである。

さらに別の実施形態では、前記ｉＰＳ細胞がラット由来であり、前記非ヒト哺乳動物がマウスである。

別の局面において、本発明は、目的の臓器または身体部分を製造するためのセットであって、該セットは、
Ａ）機能すると生存し得ないまたは生存困難となる臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）により補完される、非ヒト動物と、
Ｂ）該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来のｉＰＳ細胞または初期化因子と必要に応じて体細胞との組み合わせとを備える、セットを提供する。

１つの実施形態において、前記非ヒト動物と前記ｉＰＳ細胞とは異種の関係にある。

本発明においては、製造すべき臓器の動物種に合わせて移植される細胞を調製する。たとえば、ヒトの臓器を製造したい場合には、ヒト由来の細胞を、ヒト以外の哺乳動物の臓器を製造したい場合には、その哺乳動物由来の細胞を、それぞれ調製する。本発明において、移植される細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を使用することができる。

本発明の方法において製造すべき臓器としては、腎臓、心臓、膵臓、小脳、肺臓、甲状腺、毛および胸腺などの一定の形状を有する固形臓器であればいずれのものでもよいが、好ましくは、腎臓、すい臓、毛および胸腺が挙げられる。このような固形臓器は、全能性細胞あるいは多能性細胞を、レシピエントとなる胚の中で発生させることにより、産仔の体内において製造する。全能性細胞あるいは多能性細胞は、胚の中で発生させることにより、すべての臓器を形成することができることから、使用する全能性細胞あるいは多能性細胞の種類に依存して製造することができる固形臓器が制約を受けることはない。

一方、本発明は、レシピエントとなる非ヒト胚由来の産仔個体の体内において、移植される細胞にのみ由来する臓器を形成することを特徴としており、レシピエントとなる非ヒト胚由来の細胞と移植される細胞とのキメラの細胞構成を有することは望ましくない。そのため、レシピエントとなる非ヒト胚としては、発生段階において製造すべき臓器の発生が生じず、出生児において当該臓器を欠損する異常を有する動物由来の胚を使用することが望ましい。このような臓器欠損を発生させる動物であれば、特定の遺伝子が欠損することにより臓器が欠損するノックアウト動物であっても、あるいは特定の遺伝子を組み込むことにより臓器が欠損するトランスジェニック動物であってもよい。あるいは、本明細書において説明される「ファウンダー」動物でもよい。

たとえば、臓器として腎臓を製造する場合、レシピエントとなる非ヒト胚として、発生段階において腎臓の発生が生じない異常を有するＳａｌｌ１ノックアウト動物（Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２８，ｐ．３１０５−３１１５，２００１）の胚等を使用することができる。また、臓器として膵臓を製造する場合、レシピエントとなる非ヒト胚として、発生段階において膵臓の発生が生じない異常を有するＰｄｘ−１ノックアウト動物（Ｏｆｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２２，ｐ．９８３−９９５，１９９６）の胚、臓器として小脳を製造する場合、レシピエントとなる非ヒト胚として、発生段階において小脳の発生が生じない異常を有するＷｎｔ−１（ｉｎｔ−１）ノックアウト動物（ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．６２，ｐ．１０７３−１０８５，１９９０）の胚、臓器として肺臓、甲状腺を製造する場合、レシピエントとなる非ヒト胚として、発生段階において肺臓と甲状腺の発生が生じない異常を有するＴ／ｅｂｐノックアウト動物（Ｋｉｍｕｒａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１０，ｐ．６０−６９，１９９６）の胚等を、それぞれ使用することができる。また、腎臓，肺など複数臓器の欠損を引き起こす、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）レセプター（ＦＧＦＲ）の細胞内ドメインの欠損型を過剰発現させるドミナントネガティブ型のトランスジェニック変異体動物モデル（Ｃｅｌｌｉ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ．１７ ｐｐ．１６４２−６５５，１９９８）の胚を使用することもできる。あるいは、ヌードマウスを用いて、毛または胸腺の生産に使用することができる。

本発明においてレシピエントとなる胚の由来としての非ヒト動物という場合、ブタ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、サル、マーモセット、ボノボ等の、ヒト以外の動物であれば、どのような動物であってもよい。製造すべき臓器の動物種と成体のサイズが似ている非ヒト動物から胚を採取することが好ましい。

一方、製造すべき臓器を形成するためにレシピエントとなる胚盤胞期の受精卵中に移植される細胞の由来となる哺乳動物は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物、たとえばブタ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、サル、マーモセット、ボノボ等の、いずれであってもよい。

レシピエントとなる胚と移植される細胞との関係は、同種の関係であっても異種の関係であってもよい。

以上のようにして調製した移植される細胞を、レシピエントとなる胚盤胞期の受精卵の腔内に移植し、胚盤胞期受精卵の内腔において、胚盤胞由来の内部細胞と移植される細胞とによるキメラの細胞混合物を形成させることができる。

このようにして細胞を移植した胚盤胞期受精卵を、仮親となる胚盤胞期受精卵の由来の種の偽妊娠または妊娠メス動物の子宮内に移植する。この胚盤胞期受精卵を、仮親子宮内で発生させて、産仔を得る。そして、この産仔から目的とする臓器を、哺乳動物細胞由来の目的とする臓器として取得することができる。

従って、本発明のこれらおよび他の利点は、以下の詳細な説明を読めば、明白である。

本発明により、産業用に適する臓器再生の技術が提供された。そして、個人の特性に応じて皮膚などの体細胞から、「自分自身の臓器」を再生する技術が提供されたことになる。

また、目的のゲノムを有する細胞に基づいて誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を生産して本発明を実施することにより、種々のゲノム由来の臓器を用いた研究開発を行うことも可能となった。これは、従来技術ではまったく不可能であった技術であるといえる。

また、ＥＳ細胞において問題となっていた倫理に関する問題も、ｉＰＳ細胞を用いることによって一部回避することができ、かつ、同様の効果を奏することができるという利点も有する。

胚盤胞補完によるｉＰＳ細胞由来の膵臓構築を用いた治療モデルを示す。 ａ．はＧＦＰマウス由来ｉＰＳ細胞樹立のストラテジーを示す。ＧＦＰマウス尻尾由来繊維芽細胞（Ｔａｉｌ ｔｉｐ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＴＴＦ）の樹立を行った後、３因子（初期化因子）を導入し、２５〜３０日間ＥＳ細胞用培地にて培養し、ｉＰＳコロニーのピックアップおよびｉＰＳ細胞株を樹立した。ｂ．は、樹立されたｉＰＳ細胞の形態をその形態をカメラ付き顕微鏡にて撮影したものを示す。左は、ＧＦＰ−ｉＰＳ細胞＃２のものを、右には＃３を示す。ｃ．は、アルカリフォスファターゼ活性の測定を示す。ｉＰＳ細胞を蛍光顕微鏡下で撮影し、およびアルカリフォスファターゼ染色キット（Ｖｅｃｔｏｒ社 Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＫ−５２００）により染色を施した。左から明視野像、ＧＦＰ蛍光像およびアルカリフォスファターゼ染色を示す。ｄ．は、ゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲによる導入された３因子（初期化因子）の特定を示す。ｉＰＳ細胞よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行った結果である。上からＫｌｆ４，Ｓｏｘ２，Ｏｃｔ３／４、ｃ−ＭｙｃおよびＭｙｏｇの遺伝子の発現を示す。左から、ＧＦＰ−ｉＰＳ細胞＃２、＃３、Ｎａｎｏｇ−ｉＰＳ（４因子のもの）、コントロールとしてＥＳ細胞（ＮＣ）のものを示す。一番右には蒸留水での結果を示す。本発明において用いたｉＰＳ細胞における３因子の挿入が確認された。ｅ．は、ＲＴ−ＰＣＲによる本発明で用いた細胞におけるＥＳ細胞に特徴的な遺伝子発現パターンの解析と導入遺伝子の発現確認を示す。上からＫｌｆ４，Ｓｏｘ２，Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃである。Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｇａｐｄｈの遺伝子の発現を示す。一番下には、ネガティブコントロール（ＲＴ（−））を示す。Ｋｌｆ４，Ｓｏｘ２，Ｏｃｔ３／４については、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡとトランスジェニック（Ｔｇ）とを分けて発現を確認した。左から、ＧＦＰ−ｉＰＳ細胞＃２、＃３、コントロールとしてＥＳ細胞（ＮＣ）およびさらにコントロールとしてのＴＴＦ（ネガティブコントロール）の発現の様子を示す。一番右には蒸留水での結果を示す。ｆ．は、ｉＰＳ細胞を用いたキメラマウス作製を示す。樹立されたｉＰＳ細胞をＣ５７ＢＬ６とＢＤＦ１系統のマウスの交配により得られた胚盤胞に注入し、キメラマウスを作製した結果を示す。上には、胎生１３．５日目の明視野像（左）ＧＦＰ蛍光像（右）を示す。下には、新生児期のものを示す。ＮＣと記載しているのはネガティブコントロールである。 図３は、胚盤胞補完により構築された膵臓の形態（出生後５日目）を示す。Ｈｏｍｏのマウスでは膵臓の辺縁がきれいにＧＦＰ陽性細胞で構成されているが、ｈｅｔｅｒｏマウス膵臓ではドット状のキメラになっている。 図４は、ｉＰＳ細胞由来膵臓の組織学的な解析（出生後５日目）を示す。ここでは、ｉＰＳ細胞由来の膵臓の凍結切片標本を作製し、核染色としてＤＡＰＩおよび抗ＧＦＰ抗体、抗インスリン抗体による染色を施し、正立蛍光顕微鏡および共焦点レーザー顕微鏡により観察、撮影した。左から明視野像、ＧＦＰ＋ＤＡＰＩの像、および右側には抗インスリン抗体による染色を示す。上パネルは、本発明のＰｄｘ１^{ＬａｃＺ／ＬａｃＺ}にＧＦＰ−ｉＰＳ細胞を導入したものを示し、下パネルにはコントロールであるＰｄｘ１^{ｗｔ／ＬａｃＺ}にＧＦＰ−ｉＰＳ細胞を導入したものを示す。 サイレンシングによってＧＦＰ陰性になった細胞が存在することの確認実験を示す。図３で示した同マウスから骨髄細胞を採取し、フローサイトメーターによりＧＦＰ−の造血幹／前駆細胞（ｃ−Ｋｉｔ＋，Ｓｃａ−１＋，Ｌｉｎａｇｅ ｍａｒｋｅｒ−：ＫＳＬ細胞）を分取し、１細胞ずつ９６ウェルプレートに落とした。これをサイトカイン添加条件下で１２日間培養しコロニーを形成させ、それらからゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝子型判定に用いた。これにより遺伝子サイレンシングによりＧＦＰの発現が消失した細胞がＧＦＰ−側に含まれていたとしても１個の細胞由来のクローナルな遺伝子判定が可能であり、宿主の細胞、遺伝子サイレンシングを起こした細胞を簡便に区別することができる。ａ．は骨髄細胞から純化したＫＳＬ細胞を用いたコロニー形成法のストラテジーを示し、ｂ．は培養１２日目血球コロニーの形態を示し、ｃ．は各コロニーから抽出したＤＮＡを用いたキメラ個体の遺伝子型判定をそれぞれ示す。ａにおけるパネルは、左から骨髄中の造血幹・前駆細胞のｃ−Ｋｉｔ＋、Ｓｃａ−１＋、Ｌｉｎａｇｅ−（ＫＳＬ）のＦＡＣＳパターンを示す。ｂにおける写真は、それぞれ、左から培養１２日目のコロニー、中央には明視野像、左にはＧＦＰ蛍光像を示す。ｃには、前述したＱｉａｇｅｎ社のキットを用いた方法にて単一細胞由来のコロニーからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によりその遺伝子型判定を行った結果を示す。ＰＣＲ法はＰｄｘ１産仔判定時と同様のプライマーおよび条件にて行った。 ＳＴＺ誘発糖尿病マウスへのｉＰＳ由来の膵島の移植を示す。ａおよびｂは、膵島の単離を示す。ｉＰＳ由来の膵臓を総胆管（ａ．矢印）からコラゲナーゼ灌流を行い、密度勾配遠沈後に、ＥＧＦＰを発現するｉＰＳ由来の膵島を濃縮した（ｂ）。ｃは、膵島移植から２ヶ月後の腎臓被膜を示す。ＥＧＦＰを発現するスポット（矢印）が、移植された膵島である。ｄは、腎臓切片のＨＥ染色（左パネル）およびＤＡＰＩによるＧＦＰ染色（右パネル）を示す。ｅは、ＳＴＺ誘発糖尿病マウスへのｉＰＳ由来の１５０の膵島の移植を示す。矢印は、抗体カクテル（抗ＩＮＦ−γ、抗ＴＮＦ−α、抗ＩＬ−１β）を投与した時点を示す。移植から２ヶ月後まで、１週間おきに、腹腔内の血糖値を測定した。ｉＰＳ膵島を移植したＳＴＺ誘発糖尿病マウスは、▲（黒三角）（ｎ＝６）で表し、ｉＰＳ膵島を移植していないＳＴＺ誘発糖尿病マウスは、■（黒四角）で表す。ｆは、膵島の移植から２ヶ月後のグルコース耐性試験（ＧＴＴ）を示す。 Ｓａｌｌ１ノックアウトマウスのＢｌａｓｔｏｃｙｓｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎによる腎臓再生を示す。Ｓａｌｌ１対立遺伝子の遺伝子型判定結果を上に示す。＃３のマウスがＳａｌｌ１ホモＫＯマウスであったことが分かる。下には、＃３マウスを宿主としてｉＰＳ細胞による胚盤胞補完を行い再生された腎臓の形態（生後１日目）を示す。ホモのＫＯマウスでは、腎臓全体がきれいにＧＦＰ陽性細胞で構成されていることが分かる。Ｓａｌｌ１ノックアウトマウスを用いてｉＰＳ細胞由来の腎臓を作ることが可能であることが明らかになった。 Ｂ６由来ｉＰＳ細胞を用いて胚盤胞補完を行い、生まれてきたキメラマウスに毛が生えていることを確認した写真を示す。＃１はＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）野生型（コントロール）マウスで、黒色の毛が見られる。＃３はＫＳＮヌードマウス（コントロール）で毛がない。＃２、４および５は得られた３匹のキメラマウスを示し、これらの個体には毛が生えてきている。 キメラマウスおよびコントロールマウスの胸腺の発生を確認した図である。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）野生型マウス（コントロール）には胸腺が認められる。ヌードマウスには胸腺が存在しない。一方キメラマウスには胸腺が認めれる。 Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）野生型（コントロール）マウスと、図７のキメラマウス（＃２、４および５）の各々からの末梢血をＣＤ４，ＣＤ８陽性細胞（Ｔ細胞）に分画し、ＧＦＰ陽性細胞を分析した結果を示す。ＧＦＰ陰性細胞およびＧＦＰ陽性細胞の分布からキメラ度が示される。 雄性Ｐｄｘ１（−／−）マウス（ファウンダー：マウスｉＰＳ細胞により膵臓が補われたＰｄｘ１（−／−）マウス）と雌性Ｐｄｘ１（＋／−）マウスを交配して受精卵を採取し、これをｉｎ ｖｉｔｒｏで胚盤胞期まで発生させ、得られた胚盤胞にＥＧＦＰでマーキングしたラットｉＰＳ細胞を１０個、顕微鏡下でマイクロインジェクションした。これを疑似妊娠仮親に移植し、妊娠満期で開腹し、得られた新生児を解析した結果を示す。蛍光実体顕微鏡下でＥＧＦＰ蛍光を観察したところ、体表でのＥＧＦＰ発現から、個体番号＃１、＃２、＃３はキメラであることがわかった。開腹すると＃１、＃２ではＥＧＦＰを一様に発現する膵臓が見られた。一方、＃３の膵臓は部分的にＥＧＦＰの発現を呈するが、モザイク状であった。また＃４は＃１〜３と同腹仔であるが、体表でのＥＧＦＰ蛍光が見られず、開腹すると膵臓を欠損していることから非キメラのＰｄｘ１（−／−）マウスである。また、これら新生児より脾臓を摘出し、そこから調整した血球細胞をマウスあるいはラットに対するＣＤ４５のモノクローナル抗体で染色を施し、フローサイトメーターにより解析した。その結果、個体番号＃１〜３ではマウスＣＤ４５陽性細胞とともに、ラットＣＤ４５陽性細胞が認められることから、それらは宿主マウスとラットｉＰＳ細胞由来の細胞が混在したマウス−ラット異種間キメラ個体であることが確認された。さらに、ラットＣＤ４５陽性細胞分画中の細胞はほぼすべてがＥＧＦＰ蛍光を呈することから、ラットＣＤ４５陽性細胞はＥＧＦＰでマーキングしたラットｉＰＳ細胞由来の細胞である。 個体番号＃１〜＃３の宿主マウスのＰＣＲによるＰｄｘ１遺伝子型の確認を示す。宿主マウスの遺伝子型を確認するため、図１０と同じ脾臓サンプルから、図１０の点線四角枠で囲ったマウスＣＤ４５陽性細胞を回収してゲノムＤＮＡを抽出し、Ｐｄｘ１の変異型アレルあるいは野生型アレルを識別できるプライマーを用いＰＣＲを行った。その結果、＃１および＃２においては変異型のバンドのみが認められ、個体番号＃３においては変異型、および野生型両者のバンドが検出された。このことから、宿主の遺伝子型は＃１および＃２においてはＰｄｘ１（−／−）、個体番号＃３においてはＰｄｘ１（＋／−）であることがわかる。この結果から、本来膵臓が形成されるはずのないＰｄｘ１（−／−）マウスである＃１、＃２において、ラットｉＰＳ細胞をドナーとした異種間胚盤胞補完技術を適用することで、マウス個体内にラットの膵臓を構築することに成功した。

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

本発明の実施の形態を具体的に説明することを目的として、以下に例示的な実施形態を記載する。以下に例示として、哺乳動物細胞由来の腎臓をマウスの生体内にて製造する方法を説明する。膵臓、毛、胸腺もこのような方法によって作製することができることが理解される。

（非ヒト動物）
マウスなどの動物の生体内にてヒト以外の哺乳動物細胞由来の腎臓を製造するために、発生段階において腎臓の発生が生じない異常を有するマウスなどの動物を用意する。本発明の１つの実施形態においては、発生段階において腎臓の発生が生じない異常を有するマウスとして、Ｓａｌｌ１ノックアウトマウス（Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２８，ｐ．３１０５−３１１５，２００１）を使用することができる。この動物は、Ｓａｌｌ１（−／−）のホモ接合体ノックアウト遺伝子型の場合に、腎臓のみの発生が行われず、産仔個体に腎臓が存在しないという特徴を有する。あるいは本明細書において説明するファウンダー動物も使用することができる。

このマウスは、Ｓａｌｌ１遺伝子の欠損がホモの状態（Ｓａｌｌ１（−／−））では、腎臓が形成されず、生存することができないため、Ｓａｌｌ１遺伝子の欠損がヘテロの状態（Ｓａｌｌ１（＋／−））で維持されている。このようなヘテロ状態のマウスどうしを交配し（Ｓａｌｌ１（＋／−）×Ｓａｌｌ１（＋／−））、受精卵を子宮内から採取する。受精卵は、確率的にＳａｌｌ１（＋／＋）：Ｓａｌｌ１（＋／−）：Ｓａｌｌ１（−／−）が１：２：１の確率で生じる。本発明においては、２５％の確率で生じるＳａｌｌ１（−／−）の胚を使用する。しかしながら、初期胚の段階で遺伝子型を決定することは困難であり、出産された後に産仔の遺伝子型を決定し、目的とするＳａｌｌ１（−／−）の遺伝子型を有する個体のみをその後の工程で使用することが現実的である。

このノックアウトマウスは、作成段階でＳａｌｌ１遺伝子をノックアウトすると共に、Ｓａｌｌ１遺伝子領域に発現可能な状態で検出用の蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子をノックインしていてもよい（Ｔａｋａｓａｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２１，ｐ．５４７−５５７，２００４）。このような蛍光タンパク質をノックインすることにより、この遺伝子の調節領域が活性化されると、Ｓａｌｌ１の代わりにＧＦＰの発現が生じ、Ｓａｌｌ１遺伝子の欠損状態を蛍光検出により決定することができる。

また、本発明においてはレシピエントとなる胚と移植される細胞との関係は、同種の関係であっても異種の関係であってもよい。このような異種間でのキメラ動物作成は、従来より当該技術分野において多数の報告がなされており、例えばラット−マウス間のキメラ作出（Ｍｕｌｎａｒｄ，Ｊ．Ｇ．，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ．２７６，３７９−３８１（１９７３）；Ｓｔｅｒｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ．２４３，４７２−４７３（１９７３）；Ｔａｃｈｉ，Ｓ．＆Ｔａｃｈｉ，Ｃ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．８０，１８−２７（１９８０）；Ｚｅｉｌｍａｒｋｅｒ，Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ，２４２，１１５−１１６（１９７３））、ヒツジ−ヤギ間のキメラ作出（Ｆｅｈｉｌｌｙ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０７，６３４−６３６（１９８４））など、近縁の動物種間での胚胞キメラ動物が実際に報告されている。したがって、本発明において、例えばヒト以外の哺乳動物細胞由来の腎臓をマウスの生体内で作成する場合には、これらの従来から知られているキメラ作出方法（例えば、移植する細胞を、レシピエントとなる胚盤胞中に挿入する方法（Ｆｅｈｉｌｌｙ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０７，６３４−６３６（１９８４）））に基づいて、異種のある臓器をレシピエントとなる胚中で作成することができる。

本明細書において「非ヒト哺乳動物」とは、移植される細胞を用いてキメラ動物またはキメラ胚等を作製する相手方の哺乳動物をいう。

本明細書において「異個体哺乳動物」とは、上記非ヒト哺乳動物とは異なる個体の任意の哺乳動物をいい、同種異個体であっても、異種であってもよい。

本明細書において「非ヒト仮親哺乳動物」とは、非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来の細胞を移植することによって生成される受精卵が、その母胎中で発生される（仮親となる）哺乳動物をいう。

なお、「非ヒト哺乳動物」および「非ヒト仮親哺乳動物」は、ときに、「非ヒト宿主哺乳動物」または「宿主」と称することがあるが、「非ヒト哺乳動物」および「非ヒト仮親哺乳動物」は互いに異なる動物であり、本発明の文脈において、いずれを指し示すかは当業者に明らかであることが理解されるべきである。

臓器として膵臓を製造する場合、レシピエントとなる非ヒト胚として、発生段階において膵臓の発生が生じない異常を有するＰｄｘ−１ノックアウト動物（Ｏｆｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２２，ｐ．９８３−９９５，１９９６）あるいは本明細書において説明するファウンダー動物の胚を用いることができる。

臓器として毛を製造する場合、レシピエントとなる非ヒト胚として、毛が生えないヌードマウスの胚を用いることができる。

臓器として胸腺を製造する場合、レシピエントとなる非ヒト胚として、ヌードマウスの胚を用いることができる。

（移植される細胞）
次に、腎臓を例に移植される細胞を説明すると、哺乳動物細胞由来の腎臓を製造するための、移植される細胞としてｉＰＳ細胞（非特許文献２などを参照）などを用意する。この細胞は、Ｓａｌｌ１遺伝子に関して野生型の遺伝子型（Ｓａｌｌ１（＋／＋））を有し、腎臓の全ての細胞に発生する能力を有している。

この細胞は、移植する前に、特異的に検出するための蛍光タンパク質を発現可能な状態で組み込んでもよい。たとえば、そのような検出用の蛍光タンパク質として、ＤｓＲｅｄの遺伝子変異体、ＤｓＲｅｄ．Ｔ４（Ｂｅｖｉｓ Ｂ．Ｊ．ａｎｄ Ｇｌｉｃｋ Ｂ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２０，ｐ．８３−８７，２００２）を、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリアクチン遺伝子プロモーター）の制御によりほぼ全身臓器に発現するように配列設計し、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）によりｉＰＳ細胞に組み込むことができる。このような蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）など当該分野において公知のものを使用してもよい。このような移植用の細胞に対する蛍光による標識を行うことにより、製造された臓器が移植された細胞のみから構成されているか否かを容易に検出することができる。

このマウスｉＰＳ細胞等を、前述したＳａｌｌ１（−／−）の遺伝子型を有する胚盤胞期受精卵の内腔に移植してキメラの内部細胞塊を有する胚盤胞期受精卵を作成し、仮親の子宮内でキメラの内部細胞塊を有するこの胚盤胞期受精卵を発生させ、産仔を得る。マーキングがなされていないｉＰＳ細胞を用いる場合は、キメラ作製に用いた場合宿主の胚側と区別する術がなく、臓器の補充がなされたか識別できない。したがって、これを解決するために、ｉＰＳ細胞株に蛍光色素の導入をすることにより、実施例等に記載される常法を用いて実験をすることができる。

（繁殖用のファウンダー動物の生産方法）
本発明において用いられる繁殖用のファウンダー動物は以下のような特徴を有する：機能すると生存し得ないまたは生存困難となる臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、胚盤胞補完により補完される。この動物（本明細書において「ファウンダー動物」ともいう。）を用いて、次世代動物を生産することによって、目的の臓器を欠損させて、その臓器について、所望のゲノム型を有する臓器を生産することができる。しかも、この方法で生産すると、次世代においても臓器生産をすることができることが判明しており、ｉＰＳ細胞でも使用可能であることがわかったことから、本発明の産業用の応用への道が大きく開けることになった。

本明細書において、「機能すると生存し得ないまたは生存困難となる臓器または身体部分」とは、ある因子について言及するとき、その因子により、臓器または身体部分が欠損または機能不全（たとえば、正常でない）となると、生存することができないか、生存が困難となるものをいう。たとえば、外来遺伝子の場合、その遺伝子が生物に導入され、その遺伝子が正常に発現すると、ある臓器または身体部分に欠損が生じ、その結果生存し得ないまたは生存困難となることをいう。生存困難とは、次世代に子孫を残せないことおよびヒトであれば社会的な生活において支障を伴うことを含む。臓器または身体部分としては、たとえば、膵臓、肝臓、毛、胸腺などを挙げることができるがそれらに限定されない。

そのような事象に関連する遺伝子としては、たとえば、Ｐｄｘ−１（これに対する膵臓）などを挙げることができる。

なお、臓器生産用とするには、臓器を補完し、かつ、それ以外の要因(母親マウスからミルクが摂取できない等)により出生後死んだりするようなことのない遺伝子を選択すべきである。そのような遺伝子としては、Ｐｄｘ−１を挙げることができる。このような性質を有する遺伝子を用いて、本願発明を実施することができる。そして、たとえば、表現型が膵臓の欠損と同様であっても意味合いは大きく異なり、具体的にはノックアウトでは生産効率の向上、トランスジェニックではそれに加えて、致死表現型のクローナルな解析を可能にするという特徴がある。

本明細書において「機能すると生存し得ないまたは生存困難となる」とは、ある要因について、その要因が機能すると、宿主である動物がまったく生存できずに死ぬか、あるいは、生きることはできるが、成長困難であるとか生殖困難であるなどの理由で、その後の生存が実質的に不可能になることをいい、当該分野において通常の知識を用いて理解することができる。

本明細書において「臓器」とは、当該分野において通常の意味で用いられ、動物の身体を構成する器官一般を指す。

本明細書において「身体部分」とは、身体のいずれかの部分を指し、一般に臓器と称されないものをも含む。たとえば、腎臓を例に取ると、正常な遺伝子を有するときには完全な腎臓が生成されるが、ある遺伝子が欠損または異常を有すると、腎臓のような器官はできるものの、その一部に異常ないし欠損が生じるようなことがあり、そのような異常ないし欠損が生じる部分がこの「身体部分」の例であるといえる。遺伝子の欠損ないし異常が必ずしも臓器ごとに対応しておらず、その一部に影響があることが頻繁にあることから、遺伝子との対応関係を考える場合は、身体部分での対応を考慮したほうがよいこともあり、本明細書においてもそのような対応関係をも考慮することとする。

本明細書において「胚盤胞補完（作用）」（英語ではｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎという。）とは、多分化能を有するＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの多能性細胞を胚盤胞期受精卵の内腔へ注入すると産生個体はキメラマウスを形成する現象を利用して、欠損している臓器または身体部分を補完させる技術をいう。本発明者らは、困難と考えられていた胚盤胞補完について、腎臓、膵臓、毛および胸腺などの複数種の細胞からなる複雑な細胞構成を有する哺乳動物の臓器を、動物、特に非ヒト動物の生体中で作製することができることを見出し、これが、ｉＰＳ細胞を用いても実施可能であることを確認した。したがって、この技術は、本発明においてｉＰＳ細胞を用いて全面的に利用することができる。

本明細書において「標識」とは、補完された臓器を識別するために使用される限りどのような因子でもよい。たとえば、補完されるべき臓器にのみ特定の遺伝子（たとえば、蛍光タンパク質を発現する遺伝子など）を発現するようにすることにより、その特定の遺伝子に起因する性質（たとえば、蛍光）によって補完されるべき臓器を、補完の宿主から識別することができる。このようにして、外部の細胞由来の細胞が補完によって完全な動物となったのか、内部の細胞由来の細胞が補完されて完全な動物になったのかを区別することができ、これにより、より簡単に本発明で用いるファウンダー動物を選択することができる。この細胞は、移植する前に、特異的に検出するための蛍光タンパク質を発現可能な状態で組み込んでもよい。たとえば、そのような検出用の蛍光タンパク質として、ＤｓＲｅｄの遺伝子変異体、ＤｓＲｅｄ．Ｔ４（Ｂｅｖｉｓ Ｂ．Ｊ．ａｎｄ Ｇｌｉｃｋ Ｂ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２０，ｐ．８３−８７，２００２）を、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリアクチン遺伝子プロモーター）の制御によりほぼ全身臓器に発現するように配列設計し、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）によりＥＳ細胞に組み込むことができる。このような移植用の細胞に対する蛍光による標識を行うことにより、製造された臓器が移植された細胞のみから構成されているか否かを容易に検出することができる。

そのような標識の例としては、たとえば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ），青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ），その他蛍光タンパク質およびＬａｃＺなどを挙げることができる。

本発明において用いられるファウンダー動物を生産する方法は、以下の工程を包含する：Ａ）前記遺伝子を有する第一多能性細胞を提供する工程；Ｂ）該第一多能性細胞を胚盤胞に成長させる工程；Ｃ）該胚盤胞中に、該遺伝子による欠損を補完する能力を有する第二多能性細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程；Ｄ）該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該第二多能性細胞により、前記臓器またはその一部が補完されたものを選択する工程。

本明細書において「機能すると生存し得ないまたは生存困難となる臓器または身体部分の欠損原因をコードする（欠損原因）遺伝子」または「欠損原因遺伝子」とは、交換可能に用いられ、ある遺伝子について言及するとき、その因子が機能すること（たとえば、外来遺伝子の場合、導入され発現されるか、あるいは内因性の場合そのような遺伝子が機能する条件にさらされることなど）により、臓器または身体部分が欠損または機能不全（たとえば、正常でない）となると、生存することができないか、生存が困難となる遺伝子をいう。

本明細書において「多能性細胞」とは、卵細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、多能性生殖幹細胞（ｍＧＳ細胞）などを挙げることができる。

本明細書において「第一多能性細胞」とは、ファウンダー動物等の宿主（本明細書中ホストともいう。）となるべき起源として使用される多能性細胞またはそれに由来する細胞塊をいい、好ましくは、受精卵・胚が使用される。

本明細書において「第二多能性細胞」というときは、生産すべき臓器を目的として使用される多能性細胞をいい、ｉＰＳ細胞が使用される。

本明細書において「欠損を補完する能力を有する」とは、因子または遺伝子等について言及するとき、臓器または身体部分を補うことができる能力をいう。

本明細書において「キメラ胚盤胞」とは、第一多能性細胞由来の細胞と、第二多能性細胞由来の細胞とがキメラ状態となって形成される胚盤胞をいう。そのようなキメラ胚盤胞は、注入法のほか、「凝集法」といった胚＋胚、もしくは胚+細胞をシャーレ内で密着さ
せキメラ胚盤胞を作製する方法などを利用することによって生産することができる。また、本発明においてはレシピエントとなる胚と移植される細胞との関係は、同種の関係であっても異種の関係であってもよい。このような異種間でのキメラ動物作成は、従来より当該技術分野において多数の報告がなされており、例えばラット−マウス間のキメラ作出（Ｍｕｌｎａｒｄ，Ｊ．Ｇ．，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ．２７６，３７９−３８１（１９７３）；Ｓｔｅｒｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ．２４３，４７２−４７３
（１９７３）；Ｔａｃｈｉ，Ｓ．＆Ｔａｃｈｉ，Ｃ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．８０，１８−２７（１９８０）；Ｚｅｉｌｍａｒｋｅｒ，Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ，２４２，１１５−１１６（１９７３））、ヒツジ−ヤギ間のキメラ作出（Ｆｅｈｉｌｌｙ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０７，６３４−６３６（１９８４））など、近縁の動物種間での胚胞キメラ動物が実際に報告されている。したがって、本発明において、例えばヒト以外の哺乳動物細胞由来の腎臓をマウスの生体内で作成する場合には、これらの従来から知られているキメラ作出方法（例えば、移植する細胞を、レシピエントとなる胚盤胞中に挿入する方法（Ｆｅｈｉｌｌｙ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０７，６３４−６３６（１９８４）））に基づいて、異種のある臓器をレシピエントとなる胚中で作成することができる。

本発明において用いられるファウンダー動物の生産方法において、機能すると生存し得ないまたは生存困難となる臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子（本明細書において「欠損原因遺伝子」ともいう。）を有する第一多能性細胞を提供する工程は、たとえば、その遺伝子を持っている多能性細胞を調達するか、あるいは、多能性細胞中に、その遺伝子を導入してその遺伝子を有する多能性細胞を生産することによって実施することができる。このような遺伝子の導入方法は、当該分野において周知であり、当業者は、適宜選択してこのような遺伝子導入を実施することができる。好ましくは、エレクトロポレーションを用いるとよい。それは、細胞懸濁液に電気パルスをかけることで細胞膜に微小な穴を空け、ＤＮＡを細胞内部に送り込むことで、形質転換すなわち目的遺伝子の導入を起こすことから、その後のダメージが少ないなどということが理由として挙げられるが、それに限定されない。

本発明において用いられるファウンダー動物の生産方法において、第一多能性細胞（たとえば、受精卵、胚など）を胚盤胞に成長させる工程は、多能性細胞を胚盤胞にするための任意の公知の成長方法により実施することができる。そのような条件は当該分野において周知であり、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２００２（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（本明細書において参考として援用される。）に記載される。

本発明において用いられるファウンダー動物の生産方法において、胚盤胞中に、該遺伝子による欠損を補完する能力を有する第二多能性細胞である誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程は、第二多能性細胞である誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を胚盤胞に導入することができる限り、当該分野において公知のどのような方法を用いてもよい。そのような手法としては、たとえば、注入法もしくは凝集が挙げられるがこれらに限定されない。

本発明において用いられるファウンダー動物の生産方法において、キメラ胚盤胞から個体を生産する方法は、当該分野において公知の手法を用いることができる。通常は、仮親に前記キメラ胚盤胞を戻し、仮妊娠させて仮親の胎内で成長させるがこの手法に限定されない。

本発明において用いられるファウンダー動物の生産方法において、臓器またはその身体部分が補完されたものを選択することは、その臓器または身体部分の補完を確認しうる任意の手法を用いて実施することができる。

そのような例としては、第二多能性細胞である誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に由来する識別子を識別することを挙げることができる。本明細書において「識別子」とは、ある個体または種などを特定し、由来を同定することができる任意の因子をいい、略称として「ＩＤ」とも称される。そのような識別子は、たとえば、第二多能性細胞である誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に特有のゲノムの配列、発現型等であり得る。あるいは、このような選択は、第二多能性細胞として、標識されたものまたは標識されうるもの（遺伝子発現によって標識となるものも含む）を用い、本発明のファウンダーマウスの生産方法における選択を、該標識を同定することによって実施することができる。このほかにも、適宜当業者は、この手法を改善して実施することができることが理解される。

（ファウンダー動物を用いた臓器再生方法）
別の局面において、本発明は、ファウンダー動物を用いて、誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を利用して目的の臓器または身体部分を生産する方法を提供する。この方法は、ファウンダー動物を提供する工程であって、ファウンダー動物における欠損原因遺伝子は、該目的の臓器または身体部分の欠損原因をコードするものである、工程；Ｂ）該動物から卵子を得、胚盤胞に成長させる工程；Ｃ）該胚盤胞中に、該遺伝子による欠損を補完する能力を有する所望のゲノムを有する目的多能性細胞である誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程；およびＤ）該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該個体から該目的の臓器または身体部分を取得する工程を包含する。

ここで、このＤ）工程は、前記キメラ胚盤胞を非ヒト仮親哺乳動物の母胎中で発生させて、産仔を得、該産仔個体から、該目的臓器を取得することによって実施することができる。

（膵臓の形成）
膵臓の形成については、肉眼的所見、染色後の顕微鏡観察、あるいは蛍光を利用した観察などの方法を用いた、マクロまたはミクロの形態学的解析、遺伝子発現解析などを行うことにより調べることができる。

たとえば、肉眼的所見を行うことにより、実際に臓器が存在するか否か、臓器の外観などの特徴を調べることができる。このようなマクロの形態学的解析とあわせて、ヘマトキシリン−エオジン染色などの一般的組織染色後の組織を顕微鏡によりミクロ的に観察することもできる。このようなミクロ的な観察により、具体的なすい臓内部の様々な細胞の構成まで含めて調べることができる。

さらに、条件に応じて蛍光を発する様に蛍光を使用した遺伝子発現解析を行うことも可能である。たとえば、上述したＰｄｘ１−Ｌａｃ−Ｚノックインによるノックアウトマウスの場合、野生型（＋／＋）あるいはヘテロ（＋／−）の個体では蛍光標識されたＥＳ細胞を使用した場合その寄与が見られたとしてもまだらのキメラ状態の蛍光を示すが、ホモ（−／−）個体では膵臓が完全にＥＳ細胞由来の細胞により構築されるため、まんべんなく一様の蛍光を呈するという特徴を有する。このような特質を利用して、目的とする臓器または臓器を構成する細胞が、Ｐｄｘ１遺伝子に関してどのような遺伝子型であるかを簡便に調べることができる。マーキングがなされていないｉＰＳ細胞を用いる場合は、キメラ作製に用いた場合宿主の胚側と区別する術がなく、臓器の補充がなされたか識別できない。したがって、これを解決するために、ｉＰＳ細胞株に蛍光色素の導入をすることにより、上記同様のプロトコールで実験をすることができる。そして、以上のような細胞を用いれば、ｉＰＳ細胞を用いた場合と同様のプロトコールで臓器を作り、その由来を明らかにすることが可能となる。

（腎臓の形成）
腎臓の形成については、肉眼的所見、染色後の顕微鏡観察、あるいは蛍光を利用した観察などの方法を用いた、マクロまたはミクロの形態学的解析、遺伝子発現解析などを行うことにより調べることができる。

たとえば、肉眼的所見を行うことにより、実際に臓器が存在するか否か、臓器の外観などの特徴を調べることができる。このようなマクロの形態学的解析とあわせて、ヘマトキシリン−エオジン染色などの一般的組織染色後の組織を顕微鏡によりミクロ的に観察することもできる。このようなミクロ的な観察により、具体的な腎臓内部の様々な細胞の構成まで含めて調べることができる。

さらに、条件に応じて蛍光を発する様に蛍光を使用した遺伝子発現解析を行うことも可能である。たとえば、上述したＳａｌｌ１遺伝子ノックアウトマウスの場合、Ｓａｌｌ１遺伝子の欠損がホモの状態（Ｓａｌｌ１（−／−））の場合、ＧＦＰの蛍光が両アリルから発生するため、片方のアリルのみから蛍光が発生するＳａｌｌ１遺伝子の欠損がヘテロの状態（Ｓａｌｌ１（＋／−））の蛍光よりも、蛍光量が少なくなるという特徴を有する。このような特質を利用して、目的とする臓器または臓器を構成する細胞が、Ｓａｌｌ１遺伝子に関してどのような遺伝子型であるかを簡便に調べることができる。マーキングがなされていないｉＰＳ細胞を用いる場合は、キメラ作製に用いた場合宿主の胚側と区別する術がなく、臓器の補充がなされたか識別できない。したがって、これを解決するために、ｉＰＳ細胞株に蛍光色素の導入をすることにより、その由来を明らかにすることが可能となる。

（毛の形成）
毛の形成については、肉眼的所見、あるいは蛍光を利用した観察などの方法を用いた、マクロまたはミクロの形態学的解析、遺伝子発現解析などを行うことにより調べることができる。

たとえば、肉眼的所見を行うことにより、実際に毛が存在するか否か、毛の外観などの特徴を調べることができる。このようなマクロの形態学的解析とあわせて、ヘマトキシリン−エオジン染色などの一般的組織染色後の組織を顕微鏡によりミクロ的に観察することもできる。このようなミクロ的な観察により、具体的な毛内部の様々な細胞の構成まで含めて調べることができる。

さらに、条件に応じて蛍光を発する様に蛍光を使用した遺伝子発現解析を行うことも可能である。たとえば、上述したヌードマウスの場合、毛の場合自家蛍光が強いため生じた毛がヌードマウス由来かｉＰＳ細胞由来かを蛍光顕微鏡下での肉眼的に判断するのが非常に困難であるが、蛍光を適切に観察する手段によって観察することも可能である。このような特質を利用して、目的とする臓器または臓器を構成する細胞が、どのような遺伝子型であるかを簡便に調べることができる。マーキングがなされていないｉＰＳ細胞を用いる場合は、キメラ作製に用いた場合宿主の胚側と区別する術がなく、臓器の補充がなされたか識別できない。したがって、これを解決するために、ｉＰＳ細胞株に蛍光色素の導入をすることにより、上記同様のプロトコールで実験をすることができる。そして、以上のような細胞を用いれば、ｉＰＳ細胞を用いた場合と同様のプロトコールで臓器を作り、その由来を明らかにすることが可能となる。

（胸腺の形成）
胸腺の形成については、肉眼的所見、顕微鏡写真、ＦＡＣＳあるいは蛍光を利用した観察などの方法を用いた、マクロまたはミクロの形態学的解析、遺伝子発現解析などを行うことにより調べることができる。

たとえば、肉眼的所見を行うことにより、実際に臓器が存在するか否か、臓器の外観などの特徴を調べることができる。このようなマクロの形態学的解析とあわせて、ヘマトキシリン−エオジン染色などの一般的組織染色後の組織を顕微鏡によりミクロ的に観察することもできる。このようなミクロ的な観察により、具体的な胸腺内部の様々な細胞の構成まで含めて調べることができる。

さらに、条件に応じて蛍光を発する様に蛍光を使用した遺伝子発現解析を行うことも可能である。たとえば、上述したヌードマウスの場合従来胸腺を持たないが、生存には影響しないため欠損した状態で自然に生まれ生存する。これに胚盤胞補完により蛍光標識されたｉＰＳ細胞を注入するとｉＰＳ細胞の寄与が認められる個体の多くが蛍光を呈する胸腺を持つという特徴を有する。このような特質を利用して、目的とする臓器または臓器を構成する細胞が、どのような遺伝子型であるかを簡便に調べることができる。

（ｉＰＳ細胞）
ｉＰＳ細胞は他の方法によっても作製することができる。すなわち、ｉＰＳ細胞は、体細胞に初期化因子（単数または複数の因子の組み合わせでありうる）を接触させることによって初期化を誘導させて生産することができる。そのような初期化および初期化因子の例としては以下のようなものを挙げることができる。たとえば、本発明の実施例では、ｉＰＳ細胞は３因子（Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４；これらは本発明において使用される代表的な「初期化因子」である。）でＧＦＰトランスジェニックマウスの尻尾より採取した繊維芽細胞を使って本発明者らが独自に作製したが、このほかの組み合わせ、たとえば、Ｙａｍａｎａｋａ因子とも呼ばれるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの４因子を用いることもでき、その改良法を用いることもできる。ｃ−Ｍｙｃの代わりにｎ−Ｍｙｃを用い、レトロウイルスベクターの一種であるレンチウイルスベクターを用いてもｉＰＳ細胞の樹立は可能である（Ｂｌｅｌｌｏｃｈ Ｒ ｅｔ ａｌ．，（２００７）．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １：２４５−２４７）。また、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８の４遺伝子を胎児肺由来の線維芽細胞や新生児包皮由来の線維芽細胞へ導入することで、ヒトｉＰＳ細胞の樹立に成功している（Ｙｕ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，（２００７）．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９１７−１９２０）。

マウスｉＰＳ細胞樹立で使用されたマウス遺伝子のヒト相同遺伝子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃを用いて線維芽様滑膜細胞、および新生児包皮由来の線維芽細胞からヒトｉＰＳ細胞を生産することもできる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，（２００７）．Ｃｅｌｌ １３１： ８６１−８７２．）。Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃの４遺伝子にｈＴＥＲＴ・ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔを加えた６遺伝子を用いてヒトｉＰＳ細胞の樹立することもできる（Ｐａｒｋ ＩＨ，ｅｔ ａｌ．，（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ ４５１：１４１−１４６．）。また、ｃ−Ｍｙｃの遺伝子導入をせずにＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の３因子だけでも、低効率ながらマウスおよびヒトにおいてｉＰＳ細胞の樹立が可能であることが示されており、ｉＰＳ細胞が癌細胞に変化するのを抑えるのに成功していることから、本発明においてこれを利用することもできる（Ｎａｋａｇａｗａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，（２００８）．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６：１０１−１０６．；Ｗｅｒｉｎｇ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，（２００８）．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：１０−１２）。

本発明で得られる目的臓器は、完全に前記異個体哺乳動物由来のものであることが特徴である。従来の方法では、キメラのものが再生されていた。理論に束縛されることは望まないが、欠損する遺伝子の発生過程における機能、特に臓器形成過程における各臓器の幹／前駆細胞の分化・維持に必須な転写因子であったことが原因であると考えられる。ｉＰＳ細胞を使用することができる。ｉＰＳ細胞の作製は上記したとおりである。なお、Ｎａｎｏｇ−ｉＰＳと呼ばれるｉＰＳ細胞株の場合は、マーキングがなされていないため、キメラ作製に用いた場合宿主の胚側と区別する術がなく、臓器の補充がなされたか識別できない。したがって、これを解決するために、このＮａｎｏｇ−ｉＰＳ細胞株に蛍光色素の導入をすることにより、上記ＥＳ細胞の場合と同様のプロトコールで実験をすることができる。そして、以上のような細胞を用いれば、ＥＳ細胞を用いた場合と同様のプロトコールで臓器を作り、その由来を明らかにすることが可能となる。

本発明はまた、本発明の方法によって生産された哺乳動物を提供する。このような目的臓器を有する動物は、従来生産することができなかったことから、動物自体にも発明としての価値があると考えられる。理論に束縛されることは望まないが、このような動物がこれまで作製することができなかったのは、遺伝子欠損により示される欠損臓器が生存に必須であり、それらを救済する方法が存在しなかったことが原因であると考えられる。

本発明はさらに、発生段階において目的臓器の発生が生じない異常を有する非ヒト哺乳動物の、目的臓器の製造のための使用も提供する。このような用途で宿主細胞を使用することは従来十分に想定されていなかった。したがって、このような動物自体にも発明としての価値があると考えられる。理論に束縛されることは望まないが、このような動物がこれまで作製することができなかったのは、遺伝子欠損により示される欠損臓器が生存に必須であり、性成熟に達する週齢まで目的個体の維持が不可能であったことが原因であると考えられる。

（種々の動物を使用する場合の留意点）
マウス以外の動物を使用する場合は、以下の点に留意することで、本明細書の実施例に記載した手法を応用して実施することができる。たとえば、他種の動物におけるキメラ作製に関して、マウス以外の種ではキメラ形成能をもつような多能性幹細胞樹立の報告よりは、胚もしくは胚の中でもＥＳ細胞の起源となる内部細胞塊を注入したキメラの報告（ラット：（Ｍａｙｅｒ，Ｊ．Ｒ．Ｊｒ．＆Ｆｒｅｔｚ，Ｈ．Ｉ．Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｒａｔ ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌｏｐｈｅｎｉｃ ｒａｔｓ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．３９，１−１０（１９７４））；ウシ：（Ｂｒｅｍ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔｔｌｅ ｃｈｉｍｅｒａｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｍｂｒｙｏ ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ．２３，１８２（１９８５））；ブタ：（Ｋａｓｈｉｗａｚａｋｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｉｇｓ ｂｙ ｔｈｅ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１３０，１８６−１８７（１９９２）））が多いが、内部細胞塊を注入したキメラを用いても、本明細書に記載した方法を応用することができる。これらのように内部細胞塊を用いることで欠損動物の失われた臓器を補うことは事実上可能である。すなわち、たとえば、上記細胞をいずれも胚盤胞までｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、得られた胚盤胞から内部細胞塊を物理的に一部剥離し、それを胚盤胞へインジェクションすることができる。途中の８細胞期あるいは桑実胚同士を凝集させキメラ胚を作製することができる。

（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。

人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。

本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

本実施例では、動物愛護の精神にのっとり、東京大学において規定される動物の取り扱いに関する規準に基づいて、以下の実験を行った。

（ｉＰＳ細胞の調製例）
本発明者らは、誘導型多能性幹（ｉＰＳ）細胞は３因子（Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４）でＧＦＰトランスジェニックマウスの尻尾より採取した繊維芽細胞を使って生産した。そのプロトコールは以下のとおりである。そのスキームは図１および詳細には図２ａに示した。

（ＧＦＰマウス尻尾由来繊維芽細胞（Ｔａｉｌ ｔｉｐ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＴＴＦ）の樹立）
ＧＦＰトランスジェニックマウスより尻尾を約１ｃｍ採取し、皮を剥ぎ２〜３片に刻んだ。それをＭＦ−ｓｔａｒｔ ｍｅｄｉｕｍ（ＴＯＹＯＢＯ，日本）中に置き、５日間培養した。そこで出現してきた繊維芽細胞を新たな培養皿に撒きなおし数継代し、これを尻尾由来繊維芽細胞（ＴＴＦ）とした。

（＋３因子（初期化因子）の導入）
目的遺伝子およびウイルスエンベロープタンパク質を導入し作製したウイルス産生細胞株（２９３ｇｐもしくは２９３ＧＰＧ細胞株）より上清を回収し、遠心濃縮後凍結保存しておいたウイルス液を前日に１×１０^５細胞／６ウェルプレートになるよう継代したＴＴＦ細胞の培養液中に加え、これを３因子（初期化因子）の導入とした。

（２５〜３０日間のＥＳ細胞用培地での培養）
３因子（初期化因子）導入後、翌日ＥＳ培養用の培養液に置換し２５〜３０日間培養した。この際、毎日培養液の置換を行った。

（ｉＰＳコロニーのピックアップおよびｉＰＳ細胞株の樹立）
培養後出現してきたｉＰＳ細胞様コロニーをイエローチップ（たとえば、Ｗａｔｓｏｎから入手可能）にてピックアップし、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で単一細胞にまでバラバラにし、新たに用意したマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）上に撒いた。

（結果）
上記方法により樹立されたｉＰＳ細胞株は図２ｂ−ｆに示したようなｉＰＳ細胞としての特徴すなわち未分化性と全能性とを有していることが証明された。

図２に上記実験の結果を示す。図２ｂに示すように、樹立されたｉＰＳ細胞株２株について、その形態をカメラ付き顕微鏡にて撮影した。その条件は以下のとおりである。

ピックアップ後のｉＰＳ細胞を継代後、ディッシュ上でセミコンフルエントになった段階で観察および撮影を行った。

形態的にＥＳ細胞様の未分化コロニーを形成することがわかった。

図２ｃに示すように、ｉＰＳ細胞を蛍光顕微鏡下で撮影し、およびアルカリフォスファターゼ染色キット（Ｖｅｃｔｏｒ 社 Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＫ−５２００）により染色を施した。その条件は以下のとおりである。

明視野像、ＧＦＰ蛍光像をカメラを付属した顕微鏡にて観察・撮影後、培養液を除きリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄したｉＰＳ細胞の培養ディッシュに１０％ホルマリン・９０％メタノールからなる固定液を、添加し、１〜２分固定処理を施した。これを洗浄液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５））で一度洗浄した後、上記キットの染色液を添加し、暗所にて１５分間静置した。その後、再び洗浄液で洗浄後、観察・撮影した。

図２ｃに示されるように、本実施例で作製したｉＰＳ細胞は、ＧＦＰマウス由来であるため、ＧＦＰを恒常的に発現し、未分化細胞に特徴的である高いアルカリフォスファターゼ活性を示すことがわかった。

図２ｄに示すように、ｉＰＳ細胞樹立の際にゲノムＤＮＡ上に挿入された３因子の同定のため、ｉＰＳ細胞よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行った。その条件は以下のとおりである。

ゲノムＤＮＡはＤＮＡ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用い製造業者のプロトコールに従い、１ｘ１０^６個の細胞からＤＮＡを抽出した。そのＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用いＰＣＲを行った。
Ｏｃｔ３／４
Ｆｗ（ｍＯｃｔ３／４−Ｓ１１２０）： ＣＣＣ ＴＧＧ ＧＧＡ ＴＧＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＣＣＡ ＡＧＧ（配列番号１）
Ｒｖ（ｐＭＸ／Ｌ３２０５）： ＣＣＣ ＴＴＴ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＧＡ ＣＴＡ ＡＡＴ ＡＡＡ（配列番号２）

Ｋｌｆ４
Ｆｗ（Ｋｌｆ４−Ｓ１２３６）： ＧＣＧ ＡＡＣ ＴＣＡ ＣＡＣ ＡＧＧ ＣＧＡ ＧＡＡ ＡＣＣ（配列番号３）
Ｒｖ（ｐＭＸｓ−ＡＳ３２００）： ＴＴＡ ＴＣＧ ＴＣＧ ＡＣＣ ＡＣＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ（配列番号４）

Ｓｏｘ２
Ｆｗ（Ｓｏｘ２−Ｓ７６８）： ＧＧＴ ＴＡＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＣＣＡ ＣＴＣ ＣＡＧ（配列番号５）
Ｒｖ（ｐＭＸ−ＡＳ３２００）： 上記と同じ（配列番号４）

ｃ−Ｍｙｃ
ＦＷ（ｃ−Ｍｙｃ−Ｓ１０９３）： ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＡＣ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＣＧＣ（配列番号６）
Ｒｖ（ｐＭＸ−ＡＳ３２００）： 上記と同じ（配列番号４）
その結果図２ｄに示されるように、３因子の挿入が確認された。

図２ｅに示すように、ＥＳ細胞に特徴的な遺伝子発現パターンおよび導入された遺伝子の発現を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法により確認した。その条件は以下のとおりである。

１ｘ１０^５個のＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメーターを用いＴｒｉｚｏｌ−ＬＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に分取し、そこから抽出したｍＲＮＡよりＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍキット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い付属のプロトコールに従いｃＤＮＡ合成をおこなった。合成されたｃＤＮＡを鋳型としＰＣＲ反応を行った。用いたプライマーはトランスジーンの発現（図中Ｔｇと表記）は上記図２ｄと同様のプライマー、それ以外の遺伝子発現についてはＴａｋａｈａｓｈｉ Ｋ ＆ Ｙａｍａｎａｋａ Ｓの報告（Ｃｅｌｌ ２００６ Ａｕｇ ２５；１２６（４）：６５２−５．）等に基づきプライマーを合成したものを用いた。

図２ｅに示すように、いずれの株もＥＳ細胞とほぼ同様の発現パターンを示し、また導入された遺伝子（Ｔｇ）はｉＰＳ細胞の高い遺伝子サイレンシング活性によりその発現が抑えられていることがわかった。

図２ｆに示すように、樹立されたｉＰＳ細胞を胚盤胞に注入し、キメラマウスを作製した。その条件は以下のとおりである。

ＰＭＳＧおよびｈＣＧホルモンの投与により過排卵誘起処理を施したＢＤＦ１系統のマウス（♀，８週齢）より採取した卵子とＣ５７ＢＬ／６由来の精子を用いインビトロ受精（ＩＶＦ；ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｉｔｏｎ）を行い、受精卵を得た。それを８細胞期／桑実胚まで培養した後、凍結保存し、胚盤胞注入を行う前日に起こした。ｉＰＳ細胞はセミコンフルエントになったものを０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡにより剥がし、注入用にＥＳ細胞培養液に縣濁した。胚盤胞注入は胚盤胞補完での手法同様に顕微鏡下でマイクロマニピュレーターを用いて行い、注入後の培養を経て、ＩＣＲ系統の仮親子宮に子宮移植を施した。解析では、胎生１３日目および出生後１日目に蛍光実体顕微鏡下で観察および撮影した。

図２ｆに示されるように、胎児期および新生児期でｉＰＳ細胞由来の細胞（ＧＦＰ陽性）が確認でき、樹立されたｉＰＳ細胞株が高い多分化能を有していることが示唆される。

（実施例１）
本実施例では、ファウンダー動物としてマウスを選び、欠損させるべき臓器として膵臓を選択した。さらに、膵臓欠損を特徴とするノックアウトマウスを作製するためにＰｄｘ１遺伝子を用いた。

（使用したマウス）
膵臓欠損を特徴とするノックアウトマウスとして、Ｐｄｘ１^{ｗｔ／ＬａｃＺ}およびＰｄｘ１^{ＬａｃＺ／ＬａｃＺ}（ファウンダー）を使用した。Ｐｄｘ１遺伝子ローカスにＬａｃＺ遺伝子をノックイン（ノックアウトでもある）したマウス（Ｐｄｘ１−ＬａｃＺノックインマウス）由来胚盤胞を使用した。

（Ｐｄｘ１−ＬａｃＺノックインマウス）
コンストラクト作製に関しては詳しくは既報の論文（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２，９８３−９９５（１９９６））に基づいて作製することができる。簡単には、以下のとおりである。相同領域のアームはＰｄｘ１領域を含むλクローンよりクローニングしたものを使用することができる。本実施例では、京都大学大学院医学研究科腫瘍外科学研究室川口義弥先生より供与されたものを使用した。

（トランスジェニック・ノックインの手法：Ｐｄｘ１−ＬａｃＺノックインマウス）
上記のコンストラクトを上記のように調製したｉＰＳ細胞にエレクトロポレーションで導入しポジティブ／ネガティブ選択後、サザンブロティングによりスクリーニングし、得られたクローンを胚盤胞注入しキメラマウスを作製した。その後生殖系列にのったラインを確立し、遺伝的な背景をＣ５７ＢＬ／６系統にバッククロスさせて作製することができる。

（ファウンダーマウス）
（使用したマウス）
膵臓欠損を特徴とするトランスジェニックマウスとして、Ｐｄｘ１プロモーター領域下にＨｅｓ１遺伝子を繋げたコンストラクトをマウス前核期卵に注入し作製したマウス（Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１マウス）を用いる。コンストラクト作製に関して既報の論文（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４３，３３２−３３９（２０００））で使用されたＰｄｘ１プロモーター領域を含むコンストラクトのＰａｘ６遺伝子部にＨｅｓ１遺伝子（ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００８２３５のｍＲＮＡ）を挿入し作製することができる。

（トランスジェニックの手法）
上記のコンストラクトをＣ５７ＢＬ６マウスおよびＢＤＦ１マウス（日本ＳＬＣ株式会社より購入）を交配して得られた前核期卵にマイクロインジェクターを用いて注入し、仮親へ移植してトランスジェニックマウスを作製する。

Ｐｄｘ１（特に胎生期の膵臓で発現）のプロモーター下で発現するＨｅｓ１の発現量に依存して膵臓の形成度合が異なる。発現が高い（＝コピー数が多い）と膵臓の欠損を示す。Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックの胚盤胞補完による膵臓再生を示す。同マウスを用いてｉＰＳ細胞由来の膵臓を作ることが可能である。

このことからＰｄｘ１ノックアウトマウス同様にこのようにして作製されたトランスジェニックマウスも膵臓を補うことが可能であることが実証される。

（ファウンダートランスジェニックマウスの作製）
上記トランスジェニックマウスは出生後に死んでしまうことが知られているため、このようなマウスのファウンダーを作製する。

簡単に説明すると、Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジーンを注入した胚を胚盤胞まで培養しそこに、マイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡下でｉＰＳ細胞等を注入することで、膵臓の欠損を補う。この際のｉＰＳ細胞にはノックアウトの項と同様にＧＦＰ等でマーキングしたものを使用する。これと同等のマーキングされたｉＰＳ細胞等を用いてもよい。注入後の胚は仮親の子宮へ移植し、産仔を得ることができる。このようにトランスジーンを導入した胚にｉＰＳ細胞を注入するという２重の胚操作を適用することで、１世代目のトランスジェニックから膵臓を補うことが可能となり、それらが次世代へ膵臓欠損という表現型を伝搬できるファウンダー動物となり得る。

（交配）
次に、本実施例では、こうして樹立されたマウスのヘテロマウス同士を交配し、使用した。上記ノックインマウスに関してはホモでの維持ができない（出生後１週間程度で死んでしまう）ため、Ｐｄｘ１^{ｗｔ／ＬａｃＺ}およびＰｄｘ１^{ＬａｃＺ／ＬａｃＺ}（ファウンダー）同士を交配し胚を回収することとした。

（マウスの維持手順および確認）
胚盤胞に上記ｉＰＳ細胞をマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡下で注入した（図１ ｉＰＳ細胞の胚盤胞注入）。従来の方法では、ＧＦＰでのマーキングすることが必要であったが、今回はあらかじめＧＦＰマウスの体細胞からｉＰＳ細胞を樹立したのであとからマーキングする必要はなく、そのまま使用した。もちろん、これと同等のマーキングされた他のｉＰＳ細胞等を用いてもよい。注入後の胚は仮親の子宮へ移植し、産仔を得た。

産仔はノックインマウスであればホモになる確率が１／４となるため目的の“膵臓欠損＋ｉＰＳ細胞由来の膵臓”というマウスがどれかを判定することが必要となる。そのため、両者とも血液および組織の細胞を採取し、フローサイトメーターによりＧＦＰ陰性を示す細胞（ｉＰＳ細胞由来ではなく、注入された胚由来の細胞）を分取し、ゲノムＤＮＡを抽出、ＰＣＲ法により遺伝子型を検出することで当たりのマウスを判定した。用いたプライマーは以下の通りである。
フォワード（Ｆｗ）：ＡＴＴ ＧＡＧ ＡＴＧ ＡＧＡ ＡＣＣ ＧＧＣ ＡＴＧ（配列番号７）

リバース１（Ｒｖ１）：ＴＴＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＡＣＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＣＣ（配列番号８）
リバース（Ｒｖ２）：ＴＧＴ ＧＡＧ ＣＧＡ ＧＴＡ ＡＣＡ ＡＣＣ（配列番号９）。

この方法で作製した場合、ヘテロ同士の交配であるためその仔はメンデル遺伝の法則に従い、野生型：ヘテロ：ＫＯ＝１：２：１であると予想される。したがって、そのうちのＫＯ個体を特定するため、このように末梢血中の宿主由来の細胞を用いた遺伝子型の解析を行いその遺伝子型を特定する。

補われた臓器が正常に機能しているかどうかを確認する最初のステップとして膵臓の形態観察が容易な新生児期において機能マーカーの発現解析を行う。

新生児期で解剖したマウス膵臓より作製した凍結切片に免疫染色を施した像を示す。抗体として内分泌組織の指標として抗インスリン抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンスより購入ｃａｔ．＃４２２４２１）を用いて染めたものを示す。このほかに、外分泌組織の指標として抗α−アミラーゼ抗体（ＳＩＧＭＡ社より購入ｃａｔ．＃Ａ８２７３）、抗グルカゴン抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンスより購入ｃａｔ．＃４２２２７１）、抗ソマトスタチン抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンスより購入ｃａｔ．＃４２２６５１）、膵管の指標としてＤＢＡ−Ｌｅｃｔｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ社より購入ｃａｔ．＃ＲＬ−１０３２）をそれぞれ染め分けることもできる。インスリンが陽性であることから、他の抗体での染色をしなくても補われた膵臓は正常に機能していることが理解される。

この結果からほぼすべての機能マーカーの発現が認められ、生存に事足りる正常な機能を持っていると考えられる。

次に、補われた臓器が正常に機能しているかどうかを確認する次のステップとして成体マウスにて血糖値の測定を行う。

血糖値を指標とした膵臓補完マウスにおける膵機能評価の結果を参酌することができる。定常状態における血糖値で、成熟した膵臓補完マウスの血糖値をメディセーフミニＧＲ−１０２（ＴＥＲＵＭＯ社より購入）により測定した値の平均および標準偏差を参酌することができる。コントロールとしてＰｄｘ１アレルをヘテロにもつキメラマウスおよび、膵臓機能の低下したＳＴＺ−ＤＭモデルの値を使用しうる。また糖負荷後の血糖値の変遷を同メディセーフミニにより測定した結果を参酌することができる。これらの結果は血糖調節能の正常性を示し、作製された膵臓補完マウスがファウンダーとして用いる際にも長期に生存可能であることを示唆している。

すなわち、糖負荷後、一度上昇した血糖値もコントロールとして用いたヘテロ（＋／−）キメラと同様に正常値に戻ることから、作製されたＫＯキメラ（ファウンダー）は糖尿病などの症状を示さず、長期生存の可能性が示すことができる。

次に、ファウンダーマウスとして次世代にその表現型を伝搬することが可能かどうかを、ヘテロ個体との交配により得られた産仔より明らかにしようと試みた。得られた産仔の尻尾よりゲノムＤＮＡを抽出し、（マウスの維持手順および確認）の項で用いたプライマーを使ったＰＣＲを行った。その結果ヘテロもしくはノックアウト個体しか得られないことが明らかとなり、このことはファウンダーがノックアウト個体で、次世代にその表現型を伝えることができるということを強く示唆している。

すなわち、ノックアウト（ＫＯ）とヘテロマウスの交配のため理論上メンデル遺伝の法則に従い１／２の確率でＫＯもしくはヘテロ個体になるはずであり、そのとおりの結果が示された。

このことから例えば膵臓を補ったＫＯ同士の交配であれば１００％次世代でＫＯ個体を得ることが可能となり、ＫＯ個体を使った解析がとても行いやすくなると考えられる。

（キメラの確認）
キメラは毛の色で判断することができる。ドナーのｉＰＳ細胞はＧＦＰトランスジェニックマウス由来、宿主の胚は野生型であるＣ５７ＢＬ６ｘＢＤＦ１（黒）由来であるので、ＧＦＰの蛍光により判断することができる。トランスジェニックの判定は、尻尾から抽出したゲノムＤＮＡのＰＣＲによりトランスジーンを検出することによって行う。

産仔はトランスジェニックであればトランスジーンが次世代に伝わる確率は１／２となるため目的の“膵臓欠損＋ｉＰＳ細胞由来の膵臓”というマウスがどれかを判定することが必要となる。そのため野生型マウスと交配させ、トランスジーンの伝搬を産仔の尻尾から抽出したゲノムＤＮＡを用い、ＰＣＲ法により遺伝子型を検出することで確認するとともに、それら産仔の膵臓の形態を観察した。ＰＣＲには以下のプライマーセットを用いる。
フォワード（Ｆｗ）：ＴＧＡ ＣＴＴ ＴＣＴ ＧＴＧ ＣＴＣ ＡＧＡ ＧＧ（配列番号１０）
リバース（Ｒｖ）：ＣＡＡ ＴＧＡ ＴＧＧ ＣＴＣ ＣＡＧ ＧＧＴ ＡＡ（配列番号１１）。

使用したフォワードプライマーはＰｄｘ１プロモーター領域に対応するヌクレオチド配列に対してはハイブリダイズするように作製されており、リバースプライマーはＨｅｓ１ ｃＤＮＡ（アクセッションＮｏ．がＮＭ＿００８２３５のｍＲＮＡ）ヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするように作製されている。このようなＰｄｘ１プロモーターとＨｅｓ１ ｃＤＮＡが近傍に存在することは野生型マウスでは起こり得ないため、これらのプライマー用いたＰＣＲにより、トランスジーンを効率的に検出することが可能である。

以上の実験より、次世代で膵臓欠損を起こすことが可能であるファウンダーマウスであることが示唆される結果が得られる。

このような方法をマウスに限らずその他大型動物等に適用することで、致死性の表現型を持つトランスジェニック動物およびノックアウト動物をより効率的に生産可能となるはずである。

作製したトランスジェニックかつキメラであった個体を野生型と交配する。産仔の膵臓の形態解析、あるいはゲノムＤＮＡのＰＣＲにより、膵欠損という表現型が次世代に伝わるかを明らかにする。もしトランスジェニック−キメラがファウンダーになりうるなら次世代で膵臓を欠損したマウスが産まれてくることになる。次世代で膵臓を欠損させることに成功したものを選択することができる。このようなマウスは作製段階で膵臓を補われたため出生後の正常性を示したことが示される。このようにトランスジェニックを用いても臓器欠損マウスのような胎生期および出生直後に死んでしまうようなマウスを効率的に生産できるファウンダーを用いてｉＰＳ細胞とともに臓器再生を実現することができる。

以上から、ｉＰＳ細胞を用いてＨＥＳ−１の強制発現により膵臓ができなくなるようにした物を含むマウスであっても、Ｐｄｘ−１ノックアウトマウスであっても、臓器不全動物の死を胚盤法補完によりレスキューしてファウンダーとして使用することができることが示されたことになる。

（膵臓の再生）
図３には、膵臓の再生を示す。ここでは、出生後５日目の新生児を顕微鏡下で解剖し、膵臓を露出した。それを蛍光顕微鏡下で観察および撮影した。その結果の写真が図３に示されている。

（ｉＰＳ細胞由来膵臓の形態）
図４には、ｉＰＳ細胞由来膵臓の形態を示す。ここでは、ｉＰＳ細胞由来の膵臓の凍結切片標本を作製し、核染色としてＤＡＰＩおよび抗ＧＦＰ抗体、抗インスリン抗体による染色を施し、正立蛍光顕微鏡および共焦点レーザー顕微鏡により観察、撮影した。

図３および図４より形態的には胚盤胞補完が成立していると考えられる。

図５に宿主マウスの遺伝子型判定の方法を示す。図３で示した同マウスから骨髄細胞を採取し、フローサイトメーターによりＧＦＰ陰性の造血幹／前駆細胞（ｃ−Ｋｉｔ＋，Ｓｃａ−１＋，Ｌｉｎａｇｅ ｍａｒｋｅｒ−：ＫＳＬ細胞）を分取し、１細胞ずつ９６ウェルプレートに落とした。これをサイトカイン添加条件下で１２日間培養しコロニーを形成させ、それらからゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝子型判定に用いた。これにより遺伝子サイレンシングによりＧＦＰの発現が消失した細胞がＧＦＰ−側に含まれていたとしても１個の細胞由来のクローナルな遺伝子判定が可能であり、宿主の細胞、遺伝子サイレンシングを起こした細胞を簡便に区別することができる。なお、図５での実験は、胚盤胞補完の確立の裏付け（臓器の空き（＝ノックアウト（ＫＯ））であったためこれが起こったか）を確認する実験として、遺伝子型解析によりＫＯであることを念のため確認するために、遺伝子サイレンシングの影響を考慮した上で、単一細胞からの遺伝子型判定を行った（図５）。ａ．はそのストラテジー、ｂ．は培養後形成されたコロニー像、ｃ．は判定結果をそれぞれ示す。

（考察）
以上のように、ｉＰＳ細胞は３因子（Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４）でＧＦＰトランスジェニックマウスの尻尾より採取した繊維芽細胞を使って独自に作製したものでの臓器再生が実証された。Ｐｄｘ１ノックアウトマウスはｈｏｍｏとｈｅｔｅｒｏを掛け合わせたので５０％の確立でｈｏｍｏの膵臓欠損マウスが生まれてくるはずであり、これが実証されたことになる。そして、図４に示すｉＰＳ細胞由来膵臓の形態、および図５に示すようにＧＦＰ陽性細胞、ＧＦＰ陰性細胞を分離回収してＰＣＲを行った結果から、５０％の確立でｈｏｍｏの膵臓欠損マウスが生まれてくるはずであり、これが実証されたといえる。

（ＳＴＺ誘発糖尿病マウスへのｉＰＳ由来の膵島の移植）
（使用したマウス）
使用したＣ５７ＢＬ／６マウス、ＢＤＦ１マウス、ＤＢＡ２マウスおよびＩＣＲマウスは、日本ＳＬＣ株式会社より購入した。Ｐｄｘ１ヘテロ接合性（Ｐｄｘ１（＋／−））マウス（京都大学大学院医学研究科川口義弥先生およびＶａｎｄｅｒｂｉｌｔ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｒ．Ｗｒｉｇｈｔより供与）を、ＤＢＡ２マウスまたはＢＤＦ１マウスと交配させた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発糖尿病モデルのドナーに使用した。１６〜２０時間の絶食の後にＳＴＺ（２００ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与し、そして、このＳＴＺ注射から１週間後に、血中グルコースレベルが４００ｍｇ／ｄＬを超えたマウスを高血糖糖尿病マウスとみなした。

（ｍＥＳ／ｍｉＰＳ細胞の培養）
未分化のマウス胚性幹（ｍＥＳ）細胞（Ｇ４．２）を、ゼラチンコートディッシュにおいて、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ；ニチレイバイオサイエンス製）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ Ｌ−グルタミン ペニシリン ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）および１０００Ｕ／ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を補充したＧｌａｓｇｏｗ改変イーグル培地（ＧＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で、フィーダー細胞なしで維持した。このＧ４．２細胞（ＲＩＫＥＮ ＣＤＢの丹羽仁史先生より供与）は、ＥＢ３ ＥＳ細胞に由来し、そして、ＣＡＧ発現ユニットの制御下で改良型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子を持つ。ＥＢ３ ＥＳ細胞は、Ｅ１４ｔｇ２ａ ＥＳ細胞（Ｈｏｏｐｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９８７）に由来する下位系統の細胞であり、Ｏｃｔ−３／４プロモーター制御下で薬剤耐性遺伝子であるブラストサイジンを発現するように構築したＯｃｔ−３／４−ＩＲＥＳ−ＢＳＤ−ｐＡベクターの組み込みを、Ｏｃｔ−３／４対立遺伝子に標的化することによって樹立されたものである（Ｎｉｗａ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２０００）。

未分化のマウス人工多能性幹（ｍｉＰＳ）細胞（ＧＴ３．２）を、１５％ノックアウト血清代替添加物（ＫＳＲ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ Ｌ−グルタミン ペニシリン ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）および１０００Ｕ／ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、マイトマイシン−Ｃ処理したマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）上に維持した。ＧＴ３．２細胞は、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４の３つの初期化因子をレトロウイルスベクターで導入した、オスのＧＦＰトランスジェニックマウス（大阪大学の岡部勝先生より供与）の尾から採取した繊維芽細胞から樹立した。ＧＴ３．２細胞は、ＣＡＧ発現ユニットの制御下で、ＥＧＦＰをユビキタスに発現する。

（胚の培養および操作）
Ｐｄｘ１ヘテロ接合性（Ｐｄｘ１（＋／−））の異種交配胚の調製は、既報のプロトコール（Ｎａｇｙ Ａ．ｅｔ ａｌ．，２００３）に従って行った。簡単に述べると、マウスの８細胞／桑実胚期の胚を、Ｐｄｘ１異種接合性マウスの交配後２．５日の卵管および子宮から、Ｍ２培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中に採卵した。これらの胚をＫＳＯＭ−ＡＡ培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）滴中に移し、そして、胚盤胞期まで２４時間培養した。

胚操作のために、胚盤胞をＭ２培地を含む微小液滴中に移し、そして、ｍＥＳ／ｍｉＰＳ細胞をトリプシン処理し、そして、その培養培地の微小液滴中に懸濁した。８細胞／桑実胚期で、胚をＨＥＰＥＳ緩衝ｍＥＳ／ｍｉＰＳ培養培地を含む微小滴内に移した。ピエゾ駆動のマイクロマニピュレーター（プライムテック製）を用いて、顕微鏡下で注意深く透明帯および栄養外胚葉に穴を開けた後、胚盤胞腔内の内部細胞塊（ＩＣＭ）付近に、１０〜１５個のｍＥＳ／ｍｉＰＳ細胞をインジェクションした。インジェクション後、胚を１〜２時間ＫＳＯＭ−ＡＡ培地中で培養し、その後、２．５ｄｐｃの偽妊娠交配させた仮親メスＩＣＲマウスの子宮に胚移植した。

（膵島の単離と移植）
コラゲナーゼ消化によって、ｉＰＳ由来の膵臓を持つマウスから膵島を単離し、そして、フィコール勾配にて遠心分離を行ってこれらを分離した。簡単に述べると、１０〜１２週齢の成体マウスを屠殺し、２７Ｇのバタフライ針を用いて、胆管から、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（ヤクルト社製）による膵臓の灌流を行った。灌流した膵臓を切開し、３７℃にて２０分間インキュベートした。消化した画分をＨＢＳＳで２回洗浄し、そして、ストレーナーを用いて消化されなかった組織を除いた。ＨＢＳＳ中のＦｉｃｏｌｌ ＰＭ４００（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた密度勾配遠沈によって画分を分離し、そして、膵島が濃縮された画分を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に回収した。直径がほぼ１５０μｍを超える膵島を、ガラス製のマイクロピペットを用いて、顕微鏡下でチューブ内に回収した。

１５０個の単離した膵島を、ガラス製のマイクロピペットを用いて、ＳＴＺ誘発糖尿病マウスの腎臓被膜下に移植した。膵島の移植物が即座に失われることを防ぐために、移植後０日目、２日目および４日目に、報告された抗炎症促進性モノクローナル抗体のカクテル［抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｒ４−６Ａ２；ラットＩｇＧκ：ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗マウスＴＮＦ−α ｍＡｂ（ＭＰ６−ＸＴ３；ラットＩｇＧ１κ：ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、および抗マウスＩＬ−１β ｍＡｂ（Ｂ１２２；アメリカンハムスターＩｇＧ：ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含有］を３回腹腔内投与した。

（免疫組織化学）
膵島移植から２ヶ月後に、ＧＦＰの発現（移植された膵島を示す）を観察した。腎臓切片のＨＥ染色およびＤＡＰＩによるＧＦＰ染色を行い、移植された膵島の存在を確認した。

（血糖値のモニタリング）
絶食を行わなかったマウスの血糖値を、ｍＡｂを投与した時点、そして、膵島の移植から２ヶ月後まで、１週間おきに血液サンプルを採取して、血糖値をモニタリングした。血糖値は、メディセーフミニＧＰ−１０２（ＴＥＲＵＭＯ社より購入）を用いて測定した。また、膵島の移植から２ヶ月後にグルコース耐性試験（ＧＴＴ）を行った。

データを、図５Ａに示す。図５Ａでは、ＳＴＺ誘発糖尿病マウスへのｉＰＳ由来の膵島の移植が示される。ａおよびｂは、膵島の単離を示す。ｉＰＳ由来の膵臓を総胆管（ａ．矢印）からコラゲナーゼ灌流を行い、密度勾配遠沈後に、ＥＧＦＰを発現するｉＰＳ由来の膵島を濃縮した（ｂ）。ｃは、膵島移植から２ヶ月後の腎臓被膜を示す。ＥＧＦＰを発現するスポット（矢印）が、移植された膵島である。ｄは、腎臓切片のＨＥ染色（左パネル）およびＤＡＰＩによるＧＦＰ染色（右パネル）を示す。ｅは、ＳＴＺ誘発糖尿病マウスへのｉＰＳ由来の１５０の膵島の移植を示す。矢印は、抗体カクテル（抗ＩＮＦ−γ、抗ＴＮＦ−α、抗ＩＬ−１β）を投与した時点を示す。移植から２ヶ月後まで、１週間おきに、腹腔内の血糖値を測定した。ｉＰＳ膵島を移植したＳＴＺ誘発糖尿病マウスは、▲（黒三角）（ｎ＝６）で表し、ｉＰＳ膵島を移植していないＳＴＺ誘発糖尿病マウスは、■（黒四角）で表す。ｆは、膵島の移植から２ヶ月後のグルコース耐性試験（ＧＴＴ）を示す。

このように、図５Ａの結果から、ｉＰＳ由来の膵島を移植することによって、糖尿病の症状が改善していることが示された。したがって、ｉＰＳを用いた臓器再生技術による治療効果が示されたことになる。

（実施例２：腎臓の場合の例）
実施例１に準じて、腎臓の臓器再生を行った。

本実施例においては、腎臓欠損を特徴とするノックアウトマウス中に、多能性細胞として上述のように作製したマウスｉＰＳ細胞を移植して、腎臓発生が生じるか否かを検討した。

腎臓欠損を特徴とするノックアウトマウスとして、Ｓａｌｌ１ノックアウトマウス（熊本大学発生医学研究センター、西中村隆一先生より供与）を使用した。Ｓａｌｌ１遺伝子は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の前後方部位特異的ホメオティック遺伝子ｓｐａｌｔ（ｓａｌ）のマウスホモローグであり、アフリカツメガエルの前腎管誘導実験から、腎発生に重要であることが示唆された、１３２３アミノ酸残基のタンパク質をコードする３９６９ｂｐの遺伝子である（Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２８，ｐ．３１０５−３１１５，２００１、東大浅島研究室）。このＳａｌｌ１遺伝子は、マウスにおいて、腎臓のほか、中枢神経、耳胞、心臓、肢芽、肛門において発現局在していることが報告された（Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２８，ｐ．３１０５−３１１５，２００１）。

このＳａｌｌ１遺伝子のノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６系統にバッククロス（戻し交配）し解析）は、Ｓａｌｌ１遺伝子のエキソン２以降を欠損することにより、分子内に存在していた１０個全てのｚｉｎｃ−フィンガードメインを欠損しており、その欠損の結果、後腎間葉への尿管芽の陥入が起こらず、腎臓形成初期の異常が生じていると考えられている（正常個体、Ｓａｌｌ１ノックアウトマウス）。

実験で使用するＳａｌｌ１ノックアウトマウスの遺伝子型判定は、図５に示す宿主マウスの遺伝子型判定の方法と同様にして行った。マウス骨髄細胞を採取し、フローサイトメーターによりＧＦＰ陰性の造血幹／前駆細胞（ｃ−Ｋｉｔ＋，Ｓｃａ−１＋，Ｌｉｎａｇｅ ｍａｒｋｅｒ−：ＫＳＬ細胞）を分取し、１細胞ずつ９６ウェルプレートに落とした。これをサイトカイン添加条件下で１２日間培養しコロニーを形成させ、それらからゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝子型判定に用いた。なお、胚盤胞補完の確立の裏付け（臓器の空き（＝ノックアウト（ＫＯ））であったためこれが起こったか）を確認する実験として、遺伝子型解析によりＫＯであることを念のため確認するために、単一細胞からの遺伝子型判定を行った。

遺伝子型判定に用いたプライマーは以下の通りである。
注入された胚由来（すなわち宿主）同定用のフォワードプライマー：
ｍｕｔａｎｔ検出用：ＡＡＧ ＧＧＡ ＣＴＧ ＧＣＴ ＧＣＴ ＡＴＴ ＧＧ（配列番号１２）
ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ検出用：ＧＴＡ ＣＡＣ ＧＴＴ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＡＣ（配列番号１３）
注入された胚由来（すなわち宿主）同定用のリバースプライマー：
ｍｕｔａｎｔ検出用：ＡＴＡ ＴＣＡ ＣＧＧ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＡＣ ＧＣ（配列番号１４）
ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ検出用：ＴＣＴ ＣＣＡ ＧＴＧ ＴＧＡ ＧＴＴ ＣＴＣ ＴＣＧ（配列番号１５）。

この方法で作製した場合、ヘテロ同士の交配であるため、その仔はメンデル遺伝の法則に従い、野生型：ヘテロ：ＫＯ＝１：２：１であると予想される。したがって、そのうちのＫＯ個体を特定するため、このように骨髄細胞を用いた遺伝子型の解析を行い、その遺伝子型を特定した（図６）。＃３のマウスがＳａｌｌ１ホモＫＯマウスであったことが分かる。

このような遺伝子型決定を行うことにより、キメラ個体での遺伝子型決定が可能であることを確認することができる。

上記遺伝子型決定にてホモ接合体（Ｓａｌｌ１（−／−））またはヘテロ接合体（Ｓａｌｌ１（＋／−））と決定された出生後１日のマウス産仔個体の腎臓形成について調べると、ヘテロ接合体（Ｓａｌｌ１（＋／−））においては腎臓が形成されており、ホモ接合体（Ｓａｌｌ１（−／−））においては、腎臓が全く形成されていないことを示すことができる。

Ｓａｌｌ１遺伝子ノックアウトマウスのヘテロ接合体個体（Ｓａｌｌ１（＋／−））のオスとメスとを交配し、胚盤胞期受精卵を子宮還流法により採取した。このようにして得られた胚盤胞期受精卵の遺伝子型は、ホモ接合体（Ｓａｌｌ１（−／−））：ヘテロ接合体（Ｓａｌｌ１（＋／−））：野生型（Ｓａｌｌ１（＋／＋））＝１：２：１の比率で出現することが予想される。

採取した胚盤胞期受精卵に、上述のＧＦＰマーキングされたｉＰＳ細胞を、１胚盤胞あたり１５細胞、マイクロインジェクションにより注入し、仮親（ＩＣＲマウス、日本エスエルシー株式会社より購入）の子宮に戻した。

上記遺伝子型決定にてホモ接合体（Ｓａｌｌ１（−／−））であることが確認できた新生仔のキメラ個体には、腎臓が後腹膜領域に存在することを確認することができた。これらの形成された腎臓は、蛍光実体顕微鏡下で観察すると、ＧＦＰの陽性所見を確認することができた（図６）。これは、ホモ接合体（Ｓａｌｌ１（−／−））では、腎臓が胚盤胞期受精卵の内腔に移植したマウスｉＰＳ細胞のみに由来していることを示す。一方、ヘテロ接合体（Ｓａｌｌ１（＋／−））の個体では、腎臓がヘテロ接合体（Ｓａｌｌ１（＋／−））の個体由来の細胞と移植したｉＰＳ細胞由来の細胞のキメラにより構成されているため、ＧＦＰの蛍光並びに抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫組織化学由来の蛍光の両方ともに陽性の細胞像を得ることによって確認することができた。

ホモ接合体（Ｓａｌｌ１（−／−））胚盤胞期受精卵にｉＰＳ細胞を移植した結果得られた腎臓の組織学的解析では、係蹄腔内に赤血球を含む成熟機能糸球体、成熟尿細管構造が観察でき、抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫組織化学解析でそれら成熟細胞のほとんどがＧＦＰ陽性であることを確認することができる。

以上により、上述した方法により作出されたキメラＳａｌｌ１ノックアウトマウス（Ｓａｌｌ１（−／−））において、産仔個体中で形成された腎臓が、Ｓａｌｌ１ノックアウトマウス（Ｓａｌｌ１（−／−））胚盤胞期受精卵の内腔に移植されたｉＰＳ細胞から形成されたものであることを確認することができる。

（実施例３：毛欠損マウス系統における毛発生）
毛に関してはヌードマウス由来の胚盤胞を使用して、多能性幹細胞として上記で生産したマウスｉＰＳ細胞を移植して、毛発生が生じるか否かを検討した。

（使用したマウス）
使用したマウスは、ヌードマウスであり、日本ＳＬＣ株式会社より入手した。使用したヌードマウスは近交系ＤＤＤ／１系統マウスにＢＡＬＢ／ｃヌードのｎｕ遺伝子を導入した際に作られた繁殖効率良かつ丈夫なヌードマウスである。

胚盤胞にマウスｉＰＳ細胞をマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡下で注入した。このマウスｉＰＳ細胞はＧＦＰを導入されたものを使用した。これと同等のマーキングされたマウスｉＰＳ細胞等を用いてもよい。注入後の胚は仮親の子宮へ移植し、産仔を得た。

ヌードマウスは自然発症モデルであり、胸腺、毛の欠損が見られるものの生存・繁殖には何ら支障をきたさないことから、ヌードマウスどうしでの交配が可能となる。したがって、産仔もすべてヌードマウスとなるため遺伝子型の判定の必要はない。よって上記実施例のようなＰＣＲでの検出による確認も不要である。

毛が発生したかどうかを肉眼で確認した。これは、本発明の方法によってヌードマウスに毛が生えてくる実例である。この結果から、生えてきたものは、ＧＦＰ陽性の毛であり、マウスｉＰＳ細胞を用いても毛が再生することができることを検証した。

（まとめ）
以上から、本発明の方法を用いて、マウスｉＰＳ細胞でも毛を再生することができることが示された。

（実施例４：胸腺欠損マウス系統における胸腺発生）
胸腺に関してはヌードマウス由来の胚盤胞を使用して、多能性細胞として上記で生産したマウスｉＰＳ細胞を移植して、胸腺発生が生じるか否かを検討した。

（使用したマウス）
使用したマウスは、ヌードマウスであり、日本ＳＬＣ株式会社より入手した。使用したヌードマウスは近交系ＤＤＤ／１系統マウスにＢＡＬＢ／ｃヌードマウスのｎｕ遺伝子を導入した際に作られた繁殖効率良かつ丈夫なヌードマウスである。

（マウスの維持手順および確認）
胚盤胞にマウスｉＰＳ細胞をマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡下で注入した。このマウスｉＰＳ細胞はＧＦＰを導入されている。これと同等のマーキングされたマウスｉＰＳ細胞等を用いてもよい。注入後の胚は仮親の子宮へ移植し、産仔を得た。本実施例では、実施例３において記載したように、ヌードマウスを使用したので、ＰＣＲによる確認は不要である。

胸腺が発生したかどうかを示すために、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の染色を行った。これは、胸腺が存在すると成熟Ｔ細胞が分化誘導され、一方再生されない場合は、成熟Ｔ細胞が分化誘導されないので、存在しない。しかしヌードマウスの胚盤胞にＧＦＰマーキングした正常ｉＰＳ細胞を移入する（ＢＣ，胚盤胞補完）とＧＦＰ陰性Ｔ細胞（宿主のヌードマウス造血幹細胞由来）ならびにＧＦＰ陽性Ｔ細胞（ｉＰＳ細胞由来）の両方が分化誘導されることから、胸腺がマウスｉＰＳ細胞によって構築されていることが機能的にも確認することができた。

さらに、ヌードマウス、野生型マウス、およびキメラの本発明のマウスにおける胸腺の発達示すために、野生型マウスの胸腺の通常の写真および蛍光を当てたときの写真、ヌードマウスの胸腺の通常の写真および蛍光を当てたときの写真、上記のように胚盤胞補完して生産したキメラのマウスの胸腺の通常の写真および蛍光を当てたときの写真、このキメラマウスから取り出した胸腺に蛍光を当てた写真を撮影することによって確認した。胸腺が蛍光を示すことを確認することによって、マウスｉＰＳ細胞に由来する組織であることが証明された。

（まとめ）
以上から、本発明の方法を用いて、マウスｉＰＳ細胞でも胸腺を再生することができることが示された。

（実施例５）
本実施例では、ホスト動物として膵臓欠損を特徴とするＰｄｘ１ノックアウトマウスを、ドナー細胞として、上記調製例に準じて作製したラットのｉＰＳ細胞（ＥＧＦＰ＋）を用い、異種間の胚盤胞補完を検討した。

Ａ．使用した動物
膵臓欠損を特徴とするノックアウトマウスとして、実施例１と同様に、Ｐｄｘ１遺伝子ノックアウトマウスのヘテロ接合個体（Ｐｄｘ１（＋／−））、およびマウスｉＰＳ細胞により膵臓が補われたホモ接合個体（Ｐｄｘ１（−／−）：ファウンダー）を使用した。

Ｂ．ラットｉＰＳ細胞の調製
１）ラットｉＰＳ細胞作製のためのベクターの構築
レンチウイルスベクターＣＳ−ＣＤＦ−ＣＧ−ＰＲＥのマルチクローニングサイトにｐＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のＴＲＥ、ユビキチンＣプロモーター、ｐＴｅｔ−ｏｎ ａｄｖａｎｃｅｄ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のｔＴＡ、ｐＩＲＥＳ２ＥＧＦＰ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のＩＲＥＳ２ＥＧＦＰを５’側から順に組み込んだ。マウスＯｃｔ４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２はそれぞれウイルス由来のＦ２Ａ、Ｔ２Ａで連結し、上記レンチウイルスベクターのＴＲＥとユビキチンＣプロモーターの間に挿入し作製した（ＬＶ−ＴＲＥ−ｍＯＫＳ−Ｕｂｃ−ｔＴＡ−Ｉ２Ｇ）。

２）ラットｉＰＳ細胞の樹立
継代数５以内のウイスターラット胎児繊維芽細胞（Ｅ１４．５）細胞を０．１％ゼラチンコーテイングしたディッシュに撒き、ＤＭＥＭ、１５％ ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン（ＳＩＧＭＡ）にて培養した。播種翌日、ＬＶ−ＴＲＥ−ｍＯＫＳ−Ｕｂｃ−ｔＴＡ−Ｉ２Ｇ ベクターを使用し作成したレンチウイルスを培養液に加え、細胞へのウイルス感染を行った。２４時間後に培地交換し、マイトマイシンＣ処理をしたＭＥＦに撒き直し、１μｇ／ｍｌ ドキシサイクリン、１０００Ｕ／ｍｌ ラットＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）添加ＤＭＥＭ、１５％ ＦＣＳ、１％ ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミンで培養した。翌日培地を交換し、無血清培地Ｎ２Ｂ２７メディウム（ＧＩＢＣＯ）に１μｇ／ｍｌ ドキシサイクリン、１０００Ｕ／ｍｌ ラットＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）添加とした培地を１日おきに交換し、７日目からインヒビター（２ｉ；３ｍＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ａｘｏｎ）、１ｍＭ ＰＤ０３２５９０１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、３ｉ；２ｉ＋２ｍＭ ＳＵ５４０２（ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ））を添加した。１０日目以降に出現したコロニーをピックアップし、ＭＥＦフィーダー上に撒きなおした。このようにして樹立したｒｉＰＳ細胞は、３〜４日に一度トリプシン−ＥＤＴＡを用いて継代維持を行い、非ヒト哺乳動物の胚盤胞に移入した。

Ｃ．異種間の胚盤胞補完
雄性のＰｄｘ１（−／−）マウスと雌性のＰｄｘ１（＋／−）マウスとを交配させ、受精卵を子宮還流法により採取した。採取した受精卵をｉｎ ｖｉｔｒｏで胚盤胞期まで発生させ、得られた胚盤胞に、上述のＥＧＦＰマーキングされたラットｉＰＳ細胞を、１胚盤胞あたり１０細胞、顕微鏡下でマイクロインジェクションにより注入した。これを擬似妊娠仮親（ＩＣＲマウス、日本エスエルシー株式会社より購入）の子宮に移植し、妊娠満期で開腹し、得られた新生児を解析した。

蛍光実体顕微鏡下でＥＧＦＰ蛍光を観察したところ、体表でのＥＧＦＰ発現から、新生児個体番号＃１、＃２、＃３はキメラであることがわかった。これらを開腹すると＃１、＃２ではＥＧＦＰを一様に発現する膵臓が見られた。一方、＃３の膵臓は部分的にＥＧＦＰの発現を呈するが、モザイク状であった。また＃４は＃１〜３と同腹仔であるが、体表でのＥＧＦＰ蛍光が見られず、開腹すると膵臓を欠損していることから非キメラのＰｄｘ１（−／−）マウスであることが分かった（図１０）。

また、これら新生児より脾臓を摘出し、そこから調整した血球細胞をマウスあるいはラットに対するＣＤ４５のモノクローナル抗体で染色し、フローサイトメーターにより解析した。その結果、個体番号＃１〜３ではマウスＣＤ４５陽性細胞とともに、ラットＣＤ４５陽性細胞が認められることから、それらは宿主マウスとラットｉＰＳ細胞由来の細胞が混在したマウス−ラット異種間キメラ個体であることが確認された。さらに、ラットＣＤ４５陽性細胞分画中の細胞はほぼすべてがＥＧＦＰ蛍光を呈することから、ラットＣＤ４５陽性細胞はＥＧＦＰでマーキングしたラットｉＰＳ細胞由来の細胞である（図１０）。

さらに、胚盤胞補完の確立の裏付け（臓器の空き（＝ノックアウト（ＫＯ））であったためこれが起こったか）を確認する実験として、単一細胞からの遺伝子型解析により個体番号＃１〜＃３の宿主マウスの遺伝子型がＫＯであることを念のため確認するために、上記のフローサイトメーターで解析した脾臓サンプルから、マウスＣＤ４５陽性細胞を回収してゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝子型判定に用いた。

遺伝子型判定に用いたプライマーは以下の通りである：
注入された胚由来の細胞同定用フォワードプライマー：
ｍｕｔａｎｔ、ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ共通：ＡＴＴ ＧＡＧ ＡＴＧ ＡＧＡ ＡＣＣ ＧＧＣ ＡＴＧ（配列番号１６）
注入された胚由来の細胞同定用リバースプライマー：
ｍｕｔａｎｔ検出用：ＴＴＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＡＣＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＣＣ（配列番号１７）
ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ検出用：ＴＧＴ ＧＡＧ ＣＧＡ ＧＴＡ ＡＣＡ ＡＣＣ（配列番号１８）。

その結果、＃１および＃２においては変異型（ｍｕｔａｎｔ）のバンドのみが認められ、個体番号＃３においては変異型、および野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）両者のバンドが検出された。このことから、宿主マウスの遺伝子型は、＃１および＃２においてはＰｄｘ１（−／−）、個体番号＃３においてはＰｄｘ１（＋／−）であることがわかった（図１０Ａ）。この結果から、本来膵臓が形成されるはずのないＰｄｘ１（−／−）マウスである＃１、＃２において、ラットｉＰＳ細胞をドナーとした異種間胚盤胞補完技術を適用することで、マウス個体内にラットの膵臓を構築することに成功した。

（実施例６：マウス以外の動物を使用する例）
本実施例では、マウス以外の動物を使用する場合でも、臓器を製造することができることを実証する。マウス以外の種ではキメラ形成能をもつような多能性幹細胞樹立は、同様に、上記調製例に基づいてｉＰＳ細胞を生産し、キメラを生産することによって実施例１に準じて実施することができる。

ここで、マウスの代わりに、たとえば、ラット、ブタ、ウシおよびヒトについても、実施例１に準じて、ｉＰＳ細胞を生産することができる。

たとえば、本実施例では、マウス以外の例として遺伝子改変動物の作製が可能とされる動物種（ラット（トランスジェニック）、ブタ（トランスジェニック、ノックアウト）、ウシ（トランスジェニック、ノックアウト）、でも実施例１を参酌して、同様の実験を行うことができると想定される。

これにより、致死性遺伝子改変ファウンダーラット、ブタ、ウシ等の製造をすることができる。

このように、ラット、ブタ、ウシを用いた場合でも、実施例１に準じて同様の実験を行うことができる。

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

配列番号１：Ｏｃｔ３／４用フォワードプライマー、Ｆｗ（ｍＯｃｔ３／４−Ｓ１１２０）：ＣＣＣ ＴＧＧ ＧＧＡ ＴＧＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＣＣＡ ＡＧＧ
配列番号２：Ｏｃｔ３／４用リバースプライマー、Ｒｖ（ｐＭＸ／Ｌ３２０５）：ＣＣＣ ＴＴＴ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＧＡ ＣＴＡ ＡＡＴ ＡＡＡ
配列番号３：Ｋｌｆ４用フォワードプライマー、Ｆｗ（Ｋｌｆ４−Ｓ１２３６）：ＧＣＧ ＡＡＣ ＴＣＡ ＣＡＣ ＡＧＧ ＣＧＡ ＧＡＡ ＡＣＣ
配列番号４：Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ用リバースプライマー、Ｒｖ（ｐＭＸｓ−ＡＳ３２００）：ＴＴＡ ＴＣＧ ＴＣＧ ＡＣＣ ＡＣＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ
配列番号５：Ｓｏｘ２用フォワードプライマー、Ｆｗ（Ｓｏｘ２−Ｓ７６８）：ＧＧＴ ＴＡＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＣＣＡ ＣＴＣ ＣＡＧ
配列番号６：ｃ−Ｍｙｃ用フォワードプライマー、ＦＷ（ｃ−Ｍｙｃ−Ｓ１０９３）：ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＡＣ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＣＧＣ
配列番号７ 注入された胚由来の細胞同定用のフォワード（Ｆｗ）プライマー：ＡＴＴ ＧＡＧ ＡＴＧ ＡＧＡ ＡＣＣ ＧＧＣ ＡＴＧ
配列番号８ 注入された胚由来の細胞同定用のリバース１（Ｒｖ１）プライマー：ＴＴＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＡＣＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＣＣ
配列番号９ 注入された胚由来の細胞同定用のリバース（Ｒｖ２）プライマー：ＴＧＴ ＧＡＧ ＣＧＡ ＧＴＡ ＡＣＡ ＡＣＣ
配列番号１０ トランスジーン検出用フォワード（Ｆｗ）プライマー：ＴＧＡ ＣＴＴ ＴＣＴ ＧＴＧ ＣＴＣ ＡＧＡ ＧＧ
配列番号１１ トランスジーン検出用リバース（Ｒｖ）プライマー：ＣＡＡ ＴＧＡ ＴＧＧ ＣＴＣ ＣＡＧ ＧＧＴ ＡＡ
配列番号１２ 注入された胚由来の細胞（ｍｕｔａｎｔ）検出用フォワードプライマー：ＡＡＧ ＧＧＡ ＣＴＧ ＧＣＴ ＧＣＴ ＡＴＴ ＧＧ
配列番号１３ 注入された胚由来の細胞（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）検出用フォワードプライマー：ＧＴＡ ＣＡＣ ＧＴＴ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＡＣ
配列番号１４ 注入された胚由来の細胞（ｍｕｔａｎｔ）リバースプライマー：ＡＴＡ ＴＣＡ ＣＧＧ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＡＣ ＧＣ
配列番号１５ 注入された胚由来の細胞（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）検出用リバースプライマー：ＴＣＴ ＣＣＡ ＧＴＧ ＴＧＡ ＧＴＴ ＣＴＣ ＴＣＧ
配列番号１６ 注入された胚由来の細胞検出用フォワードプライマー（ｍｕｔａｎｔ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ共通）：ＡＴＴ ＧＡＧ ＡＴＧ ＡＧＡ ＡＣＣ ＧＧＣ ＡＴＧ
配列番号１７ 注入された胚由来の細胞（ｍｕｔａｎｔ）検出用リバースプライマー：ＴＴＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＡＣＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＣＣ
配列番号１８ 注入された胚由来の細胞（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）検出用リバースプライマー：ＴＧＴ ＧＡＧ ＣＧＡ ＧＴＡ ＡＣＡ ＡＣＣ

Claims (22)

1. 発生段階において目的臓器または身体部分の発生が生じない異常を有する非ヒト哺乳動物の生体内において、該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来の該目的臓器または身体部分を製造する方法であって、
   ａ）該異個体哺乳動物由来の誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を調製する工程；
   ｂ）該非ヒト哺乳動物の胚盤胞期の受精卵中に、該細胞を移植する工程；
   ｃ）該受精卵を非ヒト仮親哺乳動物の母胎中で発生させて、産仔を得る工程；および
   ｄ）該産仔個体から、該目的臓器または身体部分を取得する工程
   を含み、
   前記ｉＰＳ細胞と前記非ヒト哺乳動物とが異種の関係のものである、
   目的臓器または身体部分を製造する方法。
2. 前記ｉＰＳ細胞が、ヒト、ラットまたはマウス由来である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ｉＰＳ細胞がラットまたはマウス由来である、請求項１に記載の方法。
4. 前記製造すべき臓器または身体部分が膵臓、腎臓、胸腺および毛から選択される、請求項１に記載の方法。
5. 前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項１に記載の方法。
6. 前記マウスがＳａｌｌ１ノックアウトマウス、Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックマウス、Ｐｄｘ−１ノックアウトマウスまたはヌードマウスである、請求項５に記載の方法。
7. 前記目的臓器が、完全に前記異個体哺乳動物由来のものである、請求項１に記載の方法。
8. 前記ｉＰＳ細胞を、体細胞に初期化因子を接触させることによって得る工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
9. 前記ｉＰＳ細胞がラット由来であり、前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項１に記載の方法。
10. 発生段階において目的臓器の発生が生じない異常を有し、かつ、異なる個体の異個体哺乳動物由来の該目的臓器または身体部分を有する非ヒト哺乳動物であって、
    ａ）該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来のｉＰＳ細胞を調製する工程｛ここで、前記ｉＰＳ細胞と前記非ヒト哺乳動物とが異種の関係のものである｝；
    ｂ）発生段階において目的臓器の発生が生じない異常を有する該非ヒト哺乳動物の胚盤胞期の受精卵中に、該ｉＰＳ細胞を移植する工程；および
    ｃ）該受精卵を非ヒト仮親哺乳動物の母胎中で発生させて、産仔を得る工程
    を含む方法によって生産された哺乳動物。
11. 発生段階において目的臓器の発生が生じない異常を有する非ヒト哺乳動物の、ｉＰＳ細胞を用いた該目的臓器の製造のための使用であって、前記ｉＰＳ細胞と前記非ヒト哺乳動物とが異種の関係のものである、使用。
12. 目的臓器を製造するためのセットであって、該セットは、
    Ａ）発生段階において該目的臓器の発生が生じない異常を有する非ヒト哺乳動物と、
    Ｂ）該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来のｉＰＳ細胞、または初期化因子および必要に応じて該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来の体細胞を備え、
    前記ｉＰＳ細胞および体細胞と前記非ヒト哺乳動物とが異種の関係のものである、
    セット。
13. 目的の臓器または身体部分を生産する方法であって、
    Ａ）機能すると生存し得ないまたは生存困難となる臓器または身体部分の欠損原因をコードする欠損原因遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、胚盤胞補完（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により補完される、非ヒト哺乳動物を提供する工程であって、前記欠損原因遺伝子は、該目的の臓器または身体部分の欠損原因をコードするものである、工程；
    Ｂ）該動物から卵子を得、胚盤胞に成長させる工程；
    Ｃ）該胚盤胞中に、該欠損原因遺伝子による欠損を補完する能力を有する所望のゲノムを有する目的ｉＰＳ細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程｛ここで、前記ｉＰＳ細胞と前記非ヒト哺乳動物とが異種の関係のものである｝；および
    Ｄ）該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該個体から該目的の臓器または身体部分を取得する工程
    を包含する方法。
14. 前記ｉＰＳ細胞を、体細胞に初期化因子を接触させることによって得る工程をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。
15. 前記Ｄ）工程は、前記キメラ胚盤胞を非ヒト仮親哺乳動物の母胎中で発生させて、産仔を得、該産仔個体から、該目的臓器を取得することを包含する、請求項１３に記載の方法。
16. 前記目的ｉＰＳ細胞がラットまたはマウス由来である、請求項１３に記載の方法。
17. 前記目的の臓器または身体部分が膵臓、腎臓、胸腺および毛から選択される、請求項１３に記載の方法。
18. 前記動物がマウスである、請求項１３に記載の方法。
19. 前記マウスがＳａｌｌ１ノックアウトマウス、Ｐｄｘ−１ノックアウトマウス、Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックマウスまたはヌードマウスである、請求項１８に記載の方法。
20. 前記目的の臓器または身体部分が、完全に前記目的ｉＰＳ細胞由来のものである、請求項１３に記載の方法。
21. 前記ｉＰＳ細胞がラット由来であり、前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項１３に記載の方法。
22. 目的の臓器または身体部分を製造するためのセットであって、該セットは、
    Ａ）機能すると生存し得ないまたは生存困難となる臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）により補完される、非ヒト哺乳動物と、
    Ｂ）該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来のｉＰＳ細胞、または初期化因子および必要に応じて該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来の体細胞との組み合わせとを備え、
    前記ｉＰＳ細胞および体細胞と前記非ヒト哺乳動物とが異種の関係にある、
    セット。