CN108103027B - 高效率血细胞重编程同时实现基因编辑的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及高效率血细胞重编程同时实现基因编辑的方法，该方法包括：将载体组合通过电转染方式导入血细胞，重编程血细胞为iPSC；载体组合包括pEV‑OCT4‑E2A‑SOX2(OS)、pEV‑BCL‑XL(B)，pEV‑MYC(M)、pEV‑Cas9‑E2A‑KLF4(Cas9‑K)。本发明可以根据不同应用及预期目的需求，选择适当的载体组合方式，在不同重编程效率上实现血细胞重编程为iPSC并同时实现高效率基因编辑。

Description

高效率血细胞重编程同时实现基因编辑的方法
技术领域
本发明属于细胞重编程和基因编辑领域，具体涉及利用Episomal载体实现高效率血细胞重编程和血细胞重编程同时实现高效率基因编辑的技术和应用。
背景技术
诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)被认为是干细胞治疗，药物研发和疾病模型领域中革命性的细胞资源。血细胞因为具有容易获取及低创伤等优点，目前广泛应用于临床诊断。以往文献报道利用逆转录病毒载体表达Yamanaka因子
(OCT4，SOX2，MYC和KLF4)可以在包括血细胞在内的多种细胞中实现重编程。对于细胞治疗及相关研究，更需要没有外源基因的非整合型iPSCs。利用Episomal载体可以将血细胞重编程为非整合型的iPSCs。最常用的Episomal载体包含两个来自于Epstein-Barr(EB)病毒的原件：病毒复制起始位点(origin of viral replication,oriP)和EB核抗原1(EB nuclear antigen 1,EBNA1)。经过一次转染将Episomal载体导入细胞即可重编程为iPSCs，并且随着细胞的分裂，iPSCs中Episomal载体逐渐丢失最终得到非整合型的iPSCs。
在临床再生医学方面的应用中，病人来源的iPSCs经常携带一些基因突变，这就需要进行基因编辑的方法修复突变基因后再分化为功能细胞用于细胞治疗。CRISPR是细菌用来抵御噬菌体和外来基因的一个系统，科学家经过一系列研究建立了CRISPR-Cas9这个被广泛应用的基因编辑技术。CRISPR-Cas9实现基因编辑的原理是，通过在细胞中(比如哺乳动物细胞)表达外源的Cas9蛋白和sgRNA，sgRNA通过碱基互补配对原则能够将Cas9蛋白定位到特定的基因组上，Cas9蛋白具有核酸内切酶活性，就可以切割基因组DNA形成双链DNA断裂(DSB)。细胞在面临DSB时主要会通过非同源末端连接(nonhomologous end joining,NHEJ)或者同源重组(homologous recombination,HR)途径修复。如果能提供一个具有左右同源臂的供体模板，细胞就会利用这个供体来修复损伤位点，而不是利用姐妹染色单体。因此，就能在Cas9切割位点处精确敲入一段我们需要的序列，实现基因编辑。但是，同源重组修复介导的基因敲入效率很低，为了解决这个难题，我们发明了一种双切载体(double cutdonor)。相比传统环状质粒载体(circular plasmid donor)，基因敲入效率可以提高5倍。
传统的再生医学策略是先建立iPSCs，然后再进行基因编辑。但是，这将是一个非常耗时耗力的工作，整个过程至少需要三个月的时间，并且需要两次克隆筛选。为了削减时间，重编程同时基因编辑的方法应运而生。这项研究首先在成纤维细胞中开展，其基因编辑细胞的比率是5％，这个数据比直接在iPSCs中基因编辑的效率提高5倍。应用成纤维细胞存在诸多问题，成纤维细胞暴露在外持续接收紫外辐射从而积累更多的突变，并且细胞获取也是一个创伤性过程。相比较成纤维细胞，外周血血细胞则成为一个更好的重编程资源，因此，我们也希望建立外周血血细胞重编程同时高效率重编程的方法。
发明内容
本发明的目的克服现有技术的不足，提供一种高效率血细胞重编程同时实现基因编辑的方法。
本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种血细胞重编程同时实现基因编辑的方法(体外)，该方法包括：将载体组合通过电转染方式导入血细胞，重编程血细胞为iPSC；载体组合包括pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)、pEV-BCL-XL(B)，pEV-MYC(M)、pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)及针对目的基因设计的sgRNA，pDonor。该方法实现高效率血细胞重编程同时实现高效基因编辑。
其中pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)，OCT4和SOX2表达在一个载体上，用E2A序列(CAGTGT ACT AAT TAT GCT CTC TTG AAA TTG GCT GGA GAT GTT GAG AGCAAC CCA GGT CCC)连接OCT4和SOX2两个基因开放阅读框(ORF)序列。
其中pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)，Cas9和KLF4表达在一个载体上，用E2A序列(CAG TGT ACT AAT TAT GCT CTC TTG AAA TTG GCT GGA GAT GTT GAG AGCAAC CCA GGTCCC)连接Cas9和KLF4两个基因开放阅读框(ORF)序列。
优选地，针对每个电转反应，载体用量为：OS 2ug，B 0.5ug，M 1ug，Cas9-K 4ug，针对目的基因设计的sgRNA 1ug，pDonor 2ug。
优选地，所述的载体组合还包括pEV-SV40LT(SV40LT)载体。进一步提高血细胞重编程过程中基因编辑的效率。
优选地，针对每个电转反应，其载体用量为：OS 2ug，B 0.5ug，M 1ug，Cas9-K4ug，SV40LT 1ug，针对目的基因设计的sgRNA 1ug，pDonor 2ug。
本发明还提供了一种用于血细胞重编程同时实现基因编辑的Episomal载体组合，该组合包括pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)、pEV-BCL-XL(B)、pEV-MYC(M)、pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)及针对目的基因设计的sgRNA，pDonor。
优选地，在该组合中，各载体的用量为OS 2ug，B 0.5ug，M 1ug，Cas9-K 4ug，针对目的基因设计的sgRNA 1ug，pDonor 2ug。
优选地，该组合还包括pEV-SV40LT(SV40LT)。更优选地，其用量为：SV40LT 1ug。
本发明还提供了另一种体外血细胞重编程同时实现基因编辑的方法，该方法包括：将载体组合通过电转染方式导入血细胞，重编程血细胞为iPSC；载体组合包括pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)、pEV-BCL-XL(B)、pEV-MYC(M)、pEV-KLF4(K)、pEV-Cas9(Cas9)及针对目的基因设计的sgRNA，pDonor。可以高效率重编程血细胞为iPSC，同时实现一定效率的基因编辑。
优选地，在该组合中，各载体的用量为OS 2ug，B 0.5ug，M 1ug，K 1ug，Cas93ug，针对目的基因设计的sgRNA 1ug，pDonor 2ug。
本发明还提供了另一种用于血细胞重编程同时实现基因编辑的载体组合，载体组合包括pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)、pEV-BCL-XL(B)、pEV-MYC(M)、pEV-KLF4(K)、pEV-Cas9(Cas9)及针对目的基因设计的sgRNA，pDonor；优选地，在该组合中，各载体的用量为OS2ug，B 0.5ug，M 1ug，K 1ug，Cas9 3ug，针对目的基因设计的sgRNA1ug，pDonor 2ug。
本发明中所述的血细胞优选为外周血单个核细胞。
本发明所具有的有益效果：
本发明公开了一种高效率血细胞重编程同时实现基因编辑的方法，并提供了用于高效率血细胞重编程同时实现基因编辑的Episomal载体组合；通过多种Episomal载体的组合方式，可以根据不同应用及预期目的需求，选择适当的载体组合方式，在不同重编程效率上实现血细胞重编程为iPSC并同时实现高效率基因编辑，基因编辑效率可达40％，这些载体的应用能够为干细胞研究，疾病模型的建立及细胞治疗奠定基础。
附图说明
图1PRDM14位点基因编辑图示。
为了产生双链DNA断裂(DSB)，在终止密码子TAG前4bp位置设计sgRNA。为了在PRDM14位点基因敲入(KI)GFP报告基因，设计了双切pDonor包括LHA序列，一个E2A-GFP-Wpre-polyA序列和RHA序列。如果细胞发生了基因编辑，那么在PRDM14位点基因编辑后的序列为PRDM14-E2A-GFP-Wpre-polyA。
图2实施例1中不同载体组合对PB MNC重编程效率的影响。
电转后两周，对每组获得的iPSC克隆计数，由于每组电转后加入培养皿中的PBMNC细胞数目可能不一致，克隆数目进行了平均化后进行的比较。数据是从三个PB MNC样本经过6次独立实验获得的平均值和平均标准偏差(mean±SEM)。显著性检验：*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；ns,不显著。
图3实施例1中不同载体组合对PB MNC重编程为iPSC基因编辑效率的影响。
电转后两周，iPSC克隆群体进行传代，当传到第4代(P4)时，利用流式细胞仪检测GFP荧光阳性细胞比例来指征PRDM14位点基因敲入效率。数据是从三个PB MNC样本经过6次独立实验获得的平均值和平均标准偏差(mean±SEM)。显著性检验：*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；ns,不显著。
图4AAVS1位点基因编辑图示。
为了产生双链DNA断裂(DSB)，在外显子1和外显子2之间设计了sgRNA。双切pDonor包括LHA序列，一个EF1-GFP-Wpre-polyA序列和RHA序列。
图5实施例2中不同载体组合对PB MNC重编程效率的影响。
电转后两周，对每组获得的iPSC克隆计数，由于每组电转后加入培养皿中的PBMNC细胞数目可能不一致，克隆数目进行了平均化后进行的比较。数据是从三个PB MNC样本经过4次独立实验获得的平均值和平均标准偏差(mean±SEM)。显著性检验：*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；ns,不显著。
图6实施例2中不同载体组合对PB MNC重编程为iPSC基因编辑效率的影响。
电转后两周，iPSC克隆群体进行传代，当传到第4代(P4)时，利用流式细胞仪检测GFP荧光阳性细胞比例来指征AAVS1位点基因敲入效率。数据是从三个PB MNC样本经过4次独立实验获得的平均值和平均标准偏差(mean±SEM)。显著性检验：*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；ns,不显著。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
针对pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)、pEV-BCL-XL(B)、pEV-MYC(M)、pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)、pEV-KLF4(K)、pEV-Cas9(Cas9)、pEV-SV40LT载体的构建方法：在包含SSFV启动子，Wpre，PolyA，oriP和EBNA1原件的游离型空载体的基础上，分别将BCL-XL，c-MYC，KLF4和SV40LT基因mRNA编码区序列利用常规分子克隆方法插入上述游离型空载体多克隆位点构建得到pEV-BCL-XL(B)，pEV-MYC(M)、pEV-KLF4(K)和pEV-SV40LT载体；将OCT4和SOX2基因mRNA编码区序列用E2A序列(CAG TGT ACT AAT TAT GCT CTC TTG AAA TTG GCT GGA GATGTT GAGAGC AAC CCA GGT CCC)连接后插入上述游离型空载体构建得到pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)，其中核心元件OCT4-E2A-SOX2序列为SEQ ID NO:1所示；将Cas9和KLF4基因mRNA编码区序列用E2A序列连接后插入上述游离型空载体构建得到pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)，其中核心元件Cas-E2A-KLF4序列为SEQ ID NO:2所示；将Cas9和puro抗性基因mRNA编码区序列用E2A序列连接后插入上述游离型空载体构建得到pEV-Cas9(Cas9)，其中核心元件Cas-E2A-puro序列为SEQ ID NO:3所示；所有载体均经测序验证其正确性。
针对某特定靶基因设计sgRNA的方法：目前有许多软件可以实现靶基因sgRNA的序列设计，我们推荐使用Chopchop(https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/)。该软件可以实现小鼠、大鼠和人等物种基因的sgRNA设计，也可以自行输入需要进行基因操作的DNA片段的序列，得到相应的sgRNA，其他设计要求与目前科学界公认的设计原则没有出入。
sgRNA载体的克隆，在sgRNA打靶序列的基础上，左边添加U6序列，右边添加sgRNA骨架序列后，通过公司合成寡核苷酸，PCR扩增后得到70bp左右产物。sgRNA克隆载体BbsI酶切后凝胶电泳回收克隆骨架，使用Gibson
Figure BDA0001567335510000051
Cloning Kit(NEB)连接PCR产物和克隆骨架。转化大肠杆菌感受态后，挑取2-4个单一菌落克隆，提取质粒进行DNA测序，鉴定阳性克隆。
针对某特定靶基因设计pDonor的方法：在sgRNA识别位点(即需要进行基因操作的DNA序列)上游300-600bp序列为同源左臂序列(LHA)，下游300-600bp序列为同源右臂序列(RHA)。同源左臂序列的5’端添加sgRNA的序列，同源右臂序列的3’端添加sgRNA序列，需要基因编辑的序列(KIsequence)在同源左臂序列和同源右臂序列之间，最终在载体上得到sgRNA-LHA-KIsequence-RHA-sgRNA的序列。经过对载体测序确认序列无误。
所有电转用到的质粒需要使用去内毒素的质粒提取试剂盒提取，为了尽量减少所加质粒体积对电转体系的影响，质粒浓度应大于1000ng/ul，不应有乙醇等有机试剂污染。
所有流程均需要无菌操作，并保证培养基和实验耗材无细菌、真菌和支原体污染。在该方法中，具体的实验步骤如下：
1.复苏冻存的PB MNC，细胞数目最好大于107个；
2.将PB MNC用红系培养基II(红II)在6孔板中培养，细胞密度106-107/ml，记做Day-6；
3.Day-3,-1分别加入1ml红II，细胞培养过程中会先死亡一部分，数目有所下降，然后再出现小幅度增殖，最终细胞数目约为复苏时的30％-50％；
4.在Day-1时用0.1％(or 0.5％)gelatin处理6孔板，37度30min后，吸走gelatin，复苏feeder细胞，加入MEF培养基培养；
5.红II培养到第6天即Day 0时PB MNC可以用来做后续实验；
6.昨日铺好的feeder细胞更换红II 1.5ml，在培养箱中平衡半个小时；
7.75％酒精消毒低氧盒，放入超净台备用；
8.电转PB MNC前需要先准备电转缓冲液，在4度冰箱取出CD34+电转solution和supplement，按照每个电转反应加入57ul solution和13ul supplement配成70ul电转缓冲液，加入相应的质粒(例如OS 2ug，M 1ug，B 0.5ug，Cas9-K 4ug，针对目的基因设计的sgRNA1ug，pDonor 2ug)，质粒浓度尽量大于1000ng/ul，如果一次电转多个细胞，可以配成mix，然后充分混匀后待用；
9.将悬浮的PB MNC充分吹打混匀后吸到15ml离心管中，混匀后吸出少许细胞悬液，用10ul细胞悬液和Trypan Blue Solution等体积混合后用计数板计数，总数目＝九宫格细胞平均数(可以数4个角的九宫格数目总和除以4)x毫升数x2x104，按照每个电转反应2x106个细胞，将PB MNC分装到15ml离心管中，1500rpm离心5min后弃掉上清，将细胞沉淀用电转缓冲液轻轻重悬均匀后，加入到电转杯中，不要加入气泡，然后放到Lonza电转仪上，用U008程序电转；
10.电转后的细胞悬液立即转移到1ml红II中并清洗电转杯1-2次，按照一定的比例转移到第6步准备好的含有feeder和红II的培养皿中，对于大多数健康人来源的样本，约106个细胞种到6孔板中大约能出几十至几百个克隆，混匀后放到低氧盒中密封，打开低氧限压阀，流速稳定在30L/min时，连接低氧盒充入低氧气体2分钟后，同时关闭进气口，出气口和阀门，将低氧盒放入培养箱中培养，此时为Day 0；
11.Day 2直接在红II中加1.5ml iPS培养基，混合均匀后，用同样的方法在低氧盒中，充入低氧气体，放入培养箱培养；
12.Day 4弃掉上清培养基，更换2ml iPS培养基，Day 6及以后，隔天更换2ml E8培养基(含NaB 0.25mM至克隆形成)，充入低氧气体；
13.提前准备好matrigel，冰上溶解，用预冷的移液枪枪尖混匀matrigel成匀浆状，用无血清Knockout DMEM/F12培养基按35:1稀释matrigel后加入24孔板中，室温放置一小时，然后用锡纸包好放到4度冰箱中保存，一周内使用；
14.大约电转Day 7-14后，可以看到克隆，吸走稀释的matrigel放到新的板子中重复使用一次，在旧板子中加入合适体积的E8培养基待用，然后在显微镜下挑取单个克隆，无需消化，放入含E8培养基的matrigel处理过的培养皿中，常氧状态培养iPS克隆；根据经验，一般在Day 14及以后克隆形态会比较适合挑取且克隆成活率较高；
15.24孔板中的iPS克隆培养到不超过10倍物镜视野大小时，用37度预热的0.5mMEDTA消化2-3min后，吸走EDTA，用E8+Y(10uM)轻轻吹打细胞，不要吹成单细胞，1:1传代到24孔板中，传代当天用E8+Y培养基培养(下同)；
16.然后再把iPS细胞传到12孔板中培养，最后传到6孔板中，细胞培养到P4或P5时，根据细胞数量，收集部分细胞-80度冰箱保存备用提取DNA和RNA，并用E8+Y加10％DMSO的冻存液冻存一部分细胞作为备份，细胞冻存后放到含异丙醇的冻存盒存放于-80度冰箱，转天转移到液氮中。如果细胞比较少，则多扩增1-2代以防细胞过少无法存活；
17.继续扩增细胞，多余的细胞可以冻存和收集细胞提取基因组DNA，利用PCR测序等方法鉴定克隆是否为预期的基因编辑克隆，每组iPS细胞可以根据实验需求选取若干个基因编辑或非基因编辑的克隆着重培养和冻存，传代到P10左右，可以做多能性蛋白的免疫荧光检测，real-time PCR检测，核型检测和畸胎瘤等。
18.经上述多能性检测后合格的iPSC克隆可以根据实验需要一次性大量扩增并冻存多支，复苏一支细胞检测细胞活性和生长状态确定冻存质量合格，其余细胞则可长期保存于液氮中，方便进行相应研究，得到重复性高的数据。
实施例1：
利用优化的载体组合，实现血细胞重编程同时高效率的PRDM14位点基因编辑。针对PRDM14基因位点，我们在终止密码子TAG前4bp位置设计sgRNA来产生DSB。双切pDonor包括LHA序列，一个E2A-GFP-Wpre-polyA序列和RHA序列。如果细胞发生了基因编辑，那么在PRDM14位点基因编辑后的序列为PRDM14-E2A-GFP-Wpre-polyA(图1)，在iPSC中，PRDM14的表达同时也使得GFP一起表达，可以通过流式细胞仪检测GFP荧光阳性细胞的比例来判定基因编辑的效率。我们比较了3种载体组合方式，包括组合一：OS 2ug+M 1ug+K 1ug+B 0.5ug+Cas9 3ug+sgRNA 1ug+pDonor 2ug；组合二：OS 2ug+M 1ug+B 0.5ug+Cas9-K 4ug+sgRNA1ug+pDonor 2ug；组合三：OS 2ug+M1ug+B 0.5ug+Cas9-K 4ug+sgRNA 1ug+pDonor 2ug+SV40LT 1ug。通过在电转后2周后克隆计数，我们发现，组合一的重编程效率最高，组合二和组合三相对组合一的重编程效率偏低(图2)；通过将iPSC传代后，在第4代经流式检测GFP荧光阳性细胞的比例，我们发现，组合一，组合二，组合三的基因编辑效率依次升高，基因编辑效率最高可达40％(图3)。
实施例2：
利用优化的载体组合，实现血细胞重编程同时高效率的AAVS1位点基因编辑。针对AAVS1基因位点，在外显子1和外显子2之间设计了sgRNA来产生DSB。双切pDonor包括LHA序列，一个EF1-GFP-Wpre-polyA序列和RHA序列(图4)。经过电转2周后，通过对iPSC计数可以计算重编程效率，同样对GFP荧光阳性细胞比例的统计可以得到基因编辑效率。我们比较了3种载体组合方式，包括组合一：OS 2ug+M 1ug+K 1ug+B 0.5ug+Cas9 3ug+sgRNA 1ug+pDonor 2ug；组合二：OS 2ug+M 1ug+B 0.5ug+Cas9-K 4ug+sgRNA 1ug+pDonor 2ug；组合三：OS 2ug+M 1ug+B 0.5ug+Cas9-K 4ug+sgRNA 1ug+pDonor 2ug+SV40LT 1ug。经克隆计数，我们发现，组合一的重编程效率最高，组合二最低，组合三居中(图5)；利用流式细胞仪检测第4代iPSC中GFP荧光阳性细胞的比例发现，组合一，组合二，组合三的基因编辑效率依次升高(图6)。
Figure IDA0001622539440000011
Figure IDA0001622539440000021
Figure IDA0001622539440000031
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Figure IDA0001622539440000061

Claims (5)

1.一种体外血细胞重编程同时实现基因编辑的方法，其特征在于：该方法包括：将载体组合通过电转染方式导入血细胞，重编程血细胞为iPSC；载体组合为pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)、pEV-BCL-XL(B)，pEV-MYC(M)、pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)、pEV-SV40LT(SV40LT)及针对目的基因设计的sgRNA，pDonor；针对每个电转反应，其载体用量为：OS 2ug，B 0.5ug，M1ug，Cas9-K 4ug，SV40LT 1ug，针对目的基因设计的sgRNA 1ug，pDonor 2ug；
所述血细胞为外周血单个核细胞；
所述pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)、pEV-BCL-XL(B)、pEV-MYC(M)、 pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)、pEV-SV40LT(SV40LT)载体的构建方法为：
在包含SSFV启动子，Wpre，PolyA，oriP和EBNA1元件的游离型空载体的基础上，分别将BCL-XL，c-MYC和SV40LT基因mRNA编码区序列利用常规分子克隆方法插入上述游离型空载体多克隆位点构建得到pEV-BCL-XL(B)，pEV-MYC (M)和pEV-SV40LT(SV40LT)载体；将OCT4和SOX2基因mRNA编码区序列用 E2A序列：CAG TGT ACT AAT TAT GCT CTC TTG AAA TTGGCT GGA GAT GTT GAG AGC AAC CCA GGT CCC，连接后插入上述游离型空载体构建得到pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)，其中核心元件OCT4-E2A-SOX2序列为SEQ ID NO:1所示； 将Cas9和KLF4基因mRNA编码区序列用E2A序列连接后插入上述游离型空载体构建得到pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)，其中核心元件Cas-E2A-KLF4序列为SEQ ID NO:2 所示；
所述pDonor的制备方法：在sgRNA识别位点上游300-600bp序列为同源左臂序列，下游300-600bp序列为同源右臂序列，同源左臂序列的5’端添加sgRNA的序列，同源右臂序列的3’端添加sgRNA序列，需要基因编辑的序列(KIsequence)在同源左臂序列和同源右臂序列之间，最终在载体上得到sgRNA-LHA-KIsequence-RHA-sgRNA的序列。
2. 一种用于血细胞重编程同时实现基因编辑的Episomal载体组合，其特征在于：该组合为pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)、pEV-BCL-XL(B)、pEV-MYC(M)、pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)、pEV-SV40LT(SV40LT)及针对目的基因设计的sgRNA，pDonor；在该组合中，各载体的用量为OS 2ug，B 0.5ug，M 1ug，Cas9-K 4ug，SV40LT 1ug，针对目的基因设计的sgRNA 1ug，pDonor2ug；所述pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)、pEV-BCL-XL(B)、pEV-MYC(M)、 pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)、pEV-SV40LT载体的构建方法为：
在包含SSFV启动子，Wpre，PolyA，oriP和EBNA1元件的游离型空载体的基础上，分别将BCL-XL，c-MYC和SV40LT基因mRNA编码区序列利用常规分子克隆方法插入上述游离型空载体多克隆位点构建得到pEV-BCL-XL(B)，pEV-MYC (M)和pEV-SV40LT(SV40LT)载体；将OCT4和SOX2基因mRNA编码区序列用 E2A序列：CAG TGT ACT AAT TAT GCT CTC TTG AAA TTGGCT GGA GAT GTT GAG AGC AAC CCA GGT CCC，连接后插入上述游离型空载体构建得到pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)，其中核心元件OCT4-E2A-SOX2序列为SEQ ID NO:1所示； 将Cas9和KLF4基因mRNA编码区序列用E2A序列连接后插入上述游离型空载体构建得到pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)，其中核心元件Cas-E2A-KLF4序列为SEQ ID NO:2 所示；
所述pDonor的制备方法：在sgRNA识别位点上游300-600bp序列为同源左臂序列，下游300-600bp序列为同源右臂序列，同源左臂序列的5’端添加sgRNA的序列，同源右臂序列的3’端添加sgRNA序列，需要基因编辑的序列(KIsequence)在同源左臂序列和同源右臂序列之间，最终在载体上得到sgRNA-LHA-KIsequence-RHA-sgRNA的序列。
3.一种体外血细胞重编程同时实现基因编辑的方法，其特征在于：该方法包括：将载体组合通过电转染方式导入血细胞，重编程血细胞为iPSC；载体组合为pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)、pEV-BCL-XL(B)，pEV-MYC(M)、pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)及针对目的基因设计的sgRNA，pDonor；针对每个电转反应，其载体用量为：OS 2ug，B 0.5ug，M 1ug，Cas9-K 4ug，针对目的基因设计的sgRNA 1ug，pDonor 2ug；
所述血细胞为外周血单个核细胞；
所述pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)、pEV-BCL-XL(B)、pEV-MYC(M)、 pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)载体的构建方法为：
在包含SSFV启动子，Wpre，PolyA，oriP和EBNA1元件的游离型空载体的基础上，分别将BCL-XL，c-MYC基因mRNA编码区序列利用常规分子克隆方法插入上述游离型空载体多克隆位点构建得到pEV-BCL-XL(B)，pEV-MYC (M)载体；将OCT4和SOX2基因mRNA编码区序列用E2A序列：CAG TGT ACT AAT TAT GCT CTC TTG AAA TTG GCT GGA GAT GTT GAG AGC AACCCA GGT CCC，连接后插入上述游离型空载体构建得到 pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)，其中核心元件OCT4-E2A-SOX2序列为SEQ ID NO:1所示； 将Cas9和KLF4基因mRNA编码区序列用E2A序列连接后插入上述游离型空载体构建得到pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)，其中核心元件Cas-E2A-KLF4序列为SEQ ID NO:2 所示；
所述pDonor的制备方法：在sgRNA识别位点上游300-600bp序列为同源左臂序列，下游300-600bp序列为同源右臂序列，同源左臂序列的5’端添加sgRNA的序列，同源右臂序列的3’端添加sgRNA序列，需要基因编辑的序列(KIsequence)在同源左臂序列和同源右臂序列之间，最终在载体上得到sgRNA-LHA-KIsequence-RHA-sgRNA的序列。
4. 一种用于血细胞重编程同时实现基因编辑的载体组合，其特征在于：载体组合为pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)、pEV-BCL-XL(B)、pEV-MYC(M)、pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)及针对目的基因设计的sgRNA，pDonor；在该组合中，各载体的用量为OS 2ug，B 0.5ug，M 1ug，Cas9-K 4ug，针对目的基因设计的sgRNA 1ug，pDonor 2ug；所述pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)、pEV-BCL-XL(B)、pEV-MYC(M)、 pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)载体的构建方法为：
在包含SSFV启动子，Wpre，PolyA，oriP和EBNA1元件的游离型空载体的基础上，分别将BCL-XL，c-MYC和SV40LT基因mRNA编码区序列利用常规分子克隆方法插入上述游离型空载体多克隆位点构建得到pEV-BCL-XL(B)、pEV-MYC (M)载体；将OCT4和SOX2基因mRNA编码区序列用 E2A序列：CAG TGT ACT AAT TAT GCT CTC TTG AAA TTG GCT GGA GAT GTT GAGAGC AAC CCA GGT CCC，连接后插入上述游离型空载体构建得到 pEV-OCT4-E2A-SOX2(OS)，其中核心元件OCT4-E2A-SOX2序列为SEQ ID NO:1所示； 将Cas9和KLF4基因mRNA编码区序列用E2A序列连接后插入上述游离型空载体构建得到pEV-Cas9-E2A-KLF4(Cas9-K)，其中核心元件Cas-E2A-KLF4序列为SEQ ID NO:2 所示；
所述pDonor的制备方法：在sgRNA识别位点上游300-600bp序列为同源左臂序列，下游300-600bp序列为同源右臂序列，同源左臂序列的5’端添加sgRNA的序列，同源右臂序列的3’端添加sgRNA序列，需要基因编辑的序列(KIsequence)在同源左臂序列和同源右臂序列之间，最终在载体上得到sgRNA-LHA-KIsequence-RHA-sgRNA的序列。
5.权利要求2或4所述的载体组合在制备基因改造试剂盒中的应用，其特征在于，所述基因改造为在体外改造血细胞同时实现重编程和基因编辑。
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