CN110904032A - 提高慢病毒转染人多能干细胞的方法 - Google Patents

提高慢病毒转染人多能干细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110904032A
CN110904032A CN201911133146.2A CN201911133146A CN110904032A CN 110904032 A CN110904032 A CN 110904032A CN 201911133146 A CN201911133146 A CN 201911133146A CN 110904032 A CN110904032 A CN 110904032A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
transfection
pluripotent stem
culture
culture solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911133146.2A
Other languages
English (en)
Inventor
刘志强
袁增强
朱晓明
王树坤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Original Assignee
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS filed Critical Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority to CN201911133146.2A priority Critical patent/CN110904032A/zh
Publication of CN110904032A publication Critical patent/CN110904032A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

本发明属于转染技术领域，本发明公开了一种提高慢病毒转染人多能干细胞的方法。包括如下步骤：(1)无饲养层培养条件下正常培养的人多能干细胞，生长至传代80％汇合，以人多能干细胞专用分散液ReLeSRTM分散细胞克隆；(2)去除分散液，添加新鲜的培养基，剥离细胞，转移到离心管中；(3)离心，去除上清液，添加新鲜生长培养液重悬；(4)按1∶6的细胞传代比将细胞接种到培养板中，添加Y‑27632孵育培养；(5)24小时后，更换培养液，并继续添加Y‑27632，工作浓度为10‑50uM；(6)6h后，按MOI＝10‑20的剂量加入慢病毒颗粒，并补充5μg/mL的聚凝胺辅助转染；(7)置于37℃、5％CO2孵箱培养12‑24小时，去除上清液，更换新鲜生长培养液正常培养，获得转染细胞。本发明方法能够提高外源基因转染效率。

Description

提高慢病毒转染人多能干细胞的方法
技术领域
本发明涉及转染技术领域，具体涉及一种提高慢病毒转染人多能干细胞的方法。
背景技术
本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本发明的发明内容，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。
胚胎干细胞(ESC)与诱导型多能干细胞(iPSC)是具有高度的自我更新能力与分化能力，几乎可以分化为人体的各种细胞类型，在基因治疗、组织损伤与修复、生殖发育等领域被广泛应用，具有重要研究价值。基于ESC与iPSC在医学与生命科学领域的重要意义。
基因操作在人ESC与iPSC研究中是常用的研究方法，包括特定基因的过表达修饰，特定基因的Knockdown，基因编辑，基因纠正等等。对人多能干细胞的基因操作方法一般包括电转法、质粒转染、慢病毒转染等，其中慢病毒转染具有操作简便、细胞毒性效应小、转染效率相对较高、可操作的外源基因大等优点，是获得稳定基因修饰细胞株最常用的方法。然而，通过慢病毒颗粒介导外源基因转染人多能干细胞的效率并不甚理想，给后续筛选纯化成功转染的细胞带来较为复杂的工作，甚至可能因为转染效率偏低而导致筛选的失败。
探索提高慢病毒转染人ESC/iPSC效率的试剂与方法，对于促进人多能干细胞相关研究具有重要意义和实用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高慢病毒转染人多能干细胞的方法。本发明方法能够显著增加慢病毒进入克隆生长的人ESC/iPSC细胞，提高外源基因转染效率，在ESC/iPSC的基因修饰领域具有重要用途。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明实施例提供了一种提高慢病毒转染人多能干细胞的方法，包括如下步骤：
(1)无饲养层培养条件下正常培养的干细胞，生长至传代80％汇合，以干细胞专用分散液ReLeSRTM分散细胞克隆；
(2)去除分散液，添加新鲜的无血清生长培养基mTeSRTM，使用细胞刮剥离细胞，将细胞转移到离心管中；
(3)1000rpm离心5分钟，去除上清液，添加1mL新鲜生长培养液轻轻吹打重悬，防止分散成单细胞；
(4)按1∶6的细胞传代比将细胞接种到0.1mg/mLMatrigel包被的培养板中，每孔补充培养液至2mL，并添加Y-27632，所述的Y-27632工作浓度为10-50uM；置于37℃、5％CO2孵箱培养；
(5)24小时后，更换培养液，并第二次添加Y-27632，所述的Y-27632工作浓度为10-50uM；
(6)6h后，按MOI＝10-20的剂量加入慢病毒颗粒，并补充5μg/mL的聚凝胺辅助转染；
(7)置于37℃、5％CO2孵箱培养12-24小时，去除上清液，更换新鲜生长培养液正常培养，获得转染细胞。
进一步的，所述的干细胞为人胚胎干细胞或诱导型多能干细胞。
进一步的，在慢病毒孵育过程中始终添加Y-27632，以维持其集落处于较为分散的状态；
进一步的，步骤(6)中按MOI＝20的剂量加入慢病毒颗粒。
进一步的，所述的孵箱培养的培养时间为24小时。
借由上述方案，本发明方法至少具备如下有益效果：
本申请方案在Y-27632辅助下，培养的人ESC/iPSC克隆集落细胞相对松散，有助于慢病毒颗粒穿过细胞膜转染集落内部细胞。与不添加Y-27632的常规慢病毒转染方法相比，本发明提供的方法转染转染效率明显提高。
人多能干细胞在无血清培养体系下成集落样克隆生长，克隆集落中细胞排列致密，显著阻碍慢病毒颗粒转染集落内的细胞，慢病毒成功转染的细胞主要分布在集落外周。通过添加Y-27632化合物，使得人多能干细胞更为伸展，克隆集落变得相对松散，能有效促进慢病毒颗粒的进入。与直接的慢病毒转染方法相比，慢病毒能够同时高效转染人多能干细胞集落外周以及内部细胞，显著提高转染效率。
本申请方法在慢病毒孵育的过程中始终添加Y-27632，添加这个试剂细胞克隆会处于相对分散的状态，病毒颗粒容易进入细胞，从而提高转染效率。
附图说明
图1为本发明一实施例中添加Y-27632与去除Y-27632生长的人iPSC细胞克隆；
a，添加Y-27632培养的iPSC0100细胞克隆；b，去除Y-27632后6小时，同一个克隆集落的形态；
图2为本发明一实施例中慢病毒介导的GFP(绿色荧光蛋白)基因转染人iPSC细胞情况；
图3为本发明一实施例中添加Y-27632与去除Y-27632生长的人H1ESC细胞克隆；
a，添加Y-27632培养的H1ESC细胞克隆；b，去除Y-27632后6小时，同一个克隆集落的形态；
图4为本发明一实施例中慢病毒介导的RFP基因转染人胚胎干细胞H1ESC情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。
一种提高慢病毒转染人多能干细胞的方法，包括如下步骤：
(1)无饲养层培养条件下正常培养的干细胞，生长至传代80％汇合，以干细胞专用分散液ReLeSRTM分散细胞克隆；
(2)去除分散液，添加新鲜的无血清生长培养基mTeSRTM，使用细胞刮剥离细胞，将细胞转移到离心管中；
(3)1000rpm离心5分钟，去除上清液，添加1mL新鲜生长培养液轻轻吹打重悬，防止分散成单细胞；
(4)按1∶6的细胞传代比将细胞接种到0.1mg/mLMatrigel包被的培养板中，每孔补充培养液至2mL，并添加Y-27632，所述的Y-27632工作浓度为10-50uM；置于37℃、5％体积CO2孵箱培养；
(5)24小时后，更换培养液，并第二次添加Y-27632，所述的Y-27632工作浓度为10-50uM；
(6)6h后，按MOI＝10-20的剂量加入慢病毒颗粒，并补充5μg/mL的聚凝胺辅助转染；
(7)置于37℃、5％CO2孵箱培养12-24小时，去除上清液，更换新鲜生长培养液正常培养，获得转染细胞。
在本发明的一些实施例中，所述的干细胞为人胚胎干细胞或诱导型多能干细胞。
在本发明的一些实施例中，在慢病毒孵育过程中始终添加Y-27632，以维持其集落处于较为分散的状态；
在本发明的一些实施例中，步骤(6)中按MOI＝20的剂量加入慢病毒颗粒。
在本发明的一些实施例中，所述的孵箱培养的培养时间为24小时。
这里要说明的是在Y-27632辅助下，培养的人ESC/iPSC克隆集落细胞相对松散，有助于慢病毒颗粒穿过细胞膜转染集落内部细胞。与不添加Y-27632的常规慢病毒转染方法相比，本发明提供的方法转染转染效率明显提高。
人多能干细胞在无血清培养体系下成集落样克隆生长，克隆集落中细胞排列致密，显著阻碍慢病毒颗粒转染集落内的细胞，慢病毒成功转染的细胞主要分布在集落外周。通过添加Y-27632化合物，使得人多能干细胞更为伸展，克隆集落变得相对松散，能有效促进慢病毒颗粒的进入。与直接的慢病毒转染方法相比，慢病毒能够同时高效转染人多能干细胞集落外周以及内部细胞，显著提高转染效率。
在慢病毒孵育的过程中始终添加Y-27632，添加这个试剂细胞克隆会处于相对分散的状态，病毒颗粒容易进入细胞，从而提高转染效率。
实施例1：慢病毒介导人iPSC细胞的基因修饰
(1)无饲养层培养条件下正常培养的人iPSC细胞株0100(购买自中科院上海干细胞库)，生长至传代标准时(80％汇合)，取6孔培养板中1孔细胞，以干细胞专用分散液分散细胞克隆；
(2)去除分散液，添加新鲜的无血清生长培养基mTeSRTM，使用细胞刮剥离细胞，使用移液枪小心将细胞转移到离心管中；
(3)1000rpm离心5分钟，去除上清液，添加新鲜生长培养液轻轻吹打重悬，防止分散成单细胞；
(4)按1∶6的比例将细胞接种到Matrigel包被的新6孔培养板中，每孔补充培养液至2mL，并添加Y-27632，使工作浓度为10μM；置于37℃、5％CO2孵箱培养；
(5)次日，更换新鲜培养液，同样补充10μM的Y-27632；对照细胞不添加Y-27632；
(6)6h后，如图1所示，常规培养的对照细胞，去除Y-27632后细胞克隆收缩而变得非常致密。随后，按MO1＝20的剂量加入携带报告基因GFP(绿色荧光蛋白)的慢病毒颗粒，并补充5μg/mL的Polybrene辅助转染；
(7)置于37℃、5％C02孵箱培养24小时，去除上清液，更换新鲜生长培养液正常培养；
(8)转染后24h，荧光显微镜下观察GFP阳性细胞，并比较转染效率。如图2所示，添加Y-27632条件按下转染的人iPSC0100细胞克隆外周与内部明显有大量的GFP阳性细胞分布，转染效率较高；而无Y-27632条件下的对照组转染细胞，GFP阳性细胞主要分布在细胞克隆外周，转染效率较低；比较而言，本发明通过添加Y-27632辅助慢病毒转染，转染效率显著高于常规方法。提示，Y-27632显著提高慢病毒转染人iPSC细胞的效率。
实施例2：慢病毒介导人ESC细胞的基因修饰
(1)无饲养层培养条件下正常培养的人ESC细胞株H1，生长至传代标准时(80％汇合)，取6孔培养板中1孔细胞，以干细胞专用分散液分散细胞克隆；
(2)去除分散液，添加新鲜的无血清生长培养基mTeSRTM，使用细胞刮剥离细胞，使用移液枪小心将细胞转移到离心管中；
(3)1000rpm离心5分钟，去除上清液，添加新鲜生长培养液轻轻吹打重悬，防止分散成单细胞；
(4)按1∶6的比例将细胞接种到Matrigel包被的新6孔培养板中，每孔补充培养液至2mL，并添加Y-27632，使工作浓度为10μM；置于37℃、5％CO2孵箱培养；
(5)次日，更换新鲜培养液，同样补充10μM的Y-27632；对照细胞不添加Y-27632；
(6)6h后，如图3所示，常规培养的对照细胞，去除Y-27632后细胞克隆收缩而变得非常致密。随后，按MOI＝20的剂量加入携带报告基因RFP(红色荧光蛋白)的慢病毒颗粒，并补充5μg/mL的Polybrene辅助转染；
(7)置于37℃、5％CO2孵箱培养24小时，去除上清液，更换新鲜生长培养液正常培养；
(8)转染后，荧光显微镜下观察GFP阳性细胞，并比较转染效率。如图4所示，添加Y-27632条件按下转染的H1ESC细胞克隆有大量的RFP阳性细胞，转染效率较高；而无Y-27632条件下的对照组转染细胞，RFP阳性细胞较少，转染效率较低。提示，Y-27632显著提高慢病毒转染人ESC细胞的效率。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种提高慢病毒转染人多能干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)无饲养层培养条件下正常培养的干细胞，生长至传代80％汇合，以干细胞专用分散液ReLeSRTM分散细胞克隆；
(2)去除分散液，添加新鲜的无血清生长培养基mTeSRTM，使用细胞刮剥离细胞，将细胞转移到离心管中；
(3)1000rpm离心5分钟，去除上清液，添加1mL新鲜生长培养液轻轻吹打重悬，防止分散成单细胞；
(4)按1∶6的细胞传代比将细胞接种到0.1mg/mLMatrigel包被的培养板中，每孔补充培养液至2mL，并添加Y-27632，所述的Y-27632工作浓度为10-50uM；置于37℃、5％CO2孵箱培养；
(5)24小时后，更换培养液，并第二次添加Y-27632，所述的Y-27632工作浓度为10-50uM；
(6)6h后，按MOI＝10-20的剂量加入慢病毒颗粒，并补充5μg/mL的聚凝胺辅助转染；
(7)置于37℃、5％CO2孵箱培养12-24小时，去除上清液，更换新鲜生长培养液正常培养，获得转染细胞。
2.根据权利要求1所述的提高慢病毒转染人多能干细胞的方法，其特征在于，所述的干细胞为人胚胎干细胞或诱导型多能干细胞。
3.根据权利要求1所述的提高慢病毒转染人多能干细胞的方法，其特征在于，在慢病毒孵育过程中始终添加Y-27632，以维持其集落处于较为分散的状态。
4.根据权利要求1所述的提高慢病毒转染人多能干细胞的方法，其特征在于，步骤(6)中按MOI＝20的剂量加入慢病毒颗粒。
5.根据权利要求1所述的提高慢病毒转染人多能干细胞的方法，其特征在于，所述的孵箱培养的培养时间为24小时。
CN201911133146.2A 2019-11-18 2019-11-18 提高慢病毒转染人多能干细胞的方法 Pending CN110904032A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911133146.2A CN110904032A (zh) 2019-11-18 2019-11-18 提高慢病毒转染人多能干细胞的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911133146.2A CN110904032A (zh) 2019-11-18 2019-11-18 提高慢病毒转染人多能干细胞的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110904032A true CN110904032A (zh) 2020-03-24

Family

ID=69818187

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911133146.2A Pending CN110904032A (zh) 2019-11-18 2019-11-18 提高慢病毒转染人多能干细胞的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110904032A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113430231A (zh) * 2021-04-20 2021-09-24 华夏源细胞工程集团股份有限公司 一种假性慢病毒载体高效感染人脐带间充质干细胞的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017184674A1 (en) * 2016-04-19 2017-10-26 President And Fellows Of Harvard College Methods for increasing efficiency of nuclease-mediated gene editing in stem cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017184674A1 (en) * 2016-04-19 2017-10-26 President And Fellows Of Harvard College Methods for increasing efficiency of nuclease-mediated gene editing in stem cells

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ERIC DENEAULT ET AL: "Complete Disruption of Autism-Susceptibility Genes by Gene Editing Predominantly Reduces Functional Connectivity of Isogenic Human Neurons", 《STEM CELL REPORTS》 *
STEMCELL TECHNOLOGIES: "Maintenance of Human Pluripotent Stem Cells in mTeSR™ Plus", 《STEMCELL TECHNOLOGIES》 *
张鹏等: "ROCK选择性抑制剂Y-27632提高小鼠胚胎干细胞传代效率研究", 《河北农业大学学报》 *
成德等: "Rho相关蛋白激酶抑制剂Y-27632对猪诱导多能干细胞冻存和传代效率的影响", 《农业生物技术学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113430231A (zh) * 2021-04-20 2021-09-24 华夏源细胞工程集团股份有限公司 一种假性慢病毒载体高效感染人脐带间充质干细胞的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019228108A1 (zh) 用于提高细胞转染效率的试剂组合物
WO2022166026A1 (zh) 基于Cre重组酶诱导的大规模慢病毒基因药物制备系统及方法
CN102144027A (zh) 生产多能干细胞的方法
CN101792776B (zh) 一种高效诱导多能性干细胞的重组腺病毒载体、使用该载体的诱导方法及其用途
KR20200136463A (ko) Gmp-수준 무혈청 현탁 세포 사용에 의한 렌티바이러스의 대규모 제조 방법
EP4273236A1 (en) Hek293t cell strain having high dispersibility and screening method therefor
CN110904032A (zh) 提高慢病毒转染人多能干细胞的方法
CN113278635B (zh) 一种促进环状rna成环的序列组合及其应用
CN111662907B (zh) 一种敲除诱导多能干细胞nans基因的方法和应用
US20150247125A1 (en) Micrornas and cellular reprogramming
CN112941034A (zh) 一种永生化人脐带间充质干细胞系的构建方法
CN108753703B (zh) 一种牙鲆胚胎肌卫星细胞系建立方法
CN111254110A (zh) 一种将间充质干细胞转分化为精子的方法
CN112941106B (zh) 一种通过foxp1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法
CN110331165B (zh) 用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法及其应用
CN108103027B (zh) 高效率血细胞重编程同时实现基因编辑的方法
CN108893492B (zh) 一种重组慢病毒生产试剂盒及其应用
CN113025660A (zh) 一种慢病毒体外转染人造血干细胞的试剂盒及方法
WO2012086702A1 (ja) 遺伝子導入方法
CN115975949B (zh) 一种基于microRNA制备诱导性多能干细胞的方法
CN103923920B (zh) 一种增强人类细胞中非整合性基因表达的方法
CN109852637B (zh) 一种提高腺相关病毒转染效率的方法
WO2012156721A1 (en) Methods for providing human cells comprising a human artificial chromosome
CN111500588B (zh) 一种晚期雄性生殖细胞报告系统及其应用
CN111748514B (zh) 一种提高膜片钳实验效率的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200324

RJ01 Rejection of invention patent application after publication