KR20200136463A

KR20200136463A - Gmp-수준 무혈청 현탁 세포 사용에 의한 렌티바이러스의 대규모 제조 방법

Info

Publication number: KR20200136463A
Application number: KR1020207030733A
Authority: KR
Inventors: 이 홍; 팅 얀; 지앙구오 잉; 하오지에 장; 루이 장; 리 장
Original assignee: 셀룰라 바이오메디신 그룹 에이치케이 리미티드
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2020-12-07
Also published as: SG11202009826PA; AU2019241301A1; US20240060053A1; WO2019184996A1; US11845962B2; US20210363497A1; CN110317791A; EP3778880A1; JP2021519108A; EP3778880A4

Abstract

GMP-수준 무혈청 현탁 세포 사용에 의한 렌티바이러스의 대규모 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계: (a) 패키징 세포의 시드 용액을 제공하는 단계; (b) 시드 용액을 제1 배양액에 접종하는 단계; (c) 패키징 세포의 계대배양을 수행하는 단계; (d) 액체 교환 유발 조건이 충족되었을 때, 액체 교환 작업을 개시하는 단계; (e) 단계 (c) 및 (d)를 1, 2 또는 3회 반복하는 단계; (f) 형질감염 유발 조건이 충족되었을 때, 형질감염 작업을 개시하는 단계; (g) 임의적으로, 형질감염 후, 액체 교환을 수행하는 단계; (h) 형질감염된 패키징 세포를 배양하는 단계; (i) 액체 교환 유발 조건이 충족되었을 때, 수거 및 액체 교환 작업을 개시하는 단계; (j) 단계 (h) 및 (i)를 1, 2 또는 3회 반복하는 단계; (k) 각 회수액을 조합하는 단계; 및 (l) 정제 처리를 수행하는 단계를 포함한다. 각 단계에서 사용된 배양액은 무혈청 세포 배양액이다.

Description

GMP-수준 무혈청 현탁 세포 사용에 의한 렌티바이러스의 대규모 제조 방법

본 발명은 생물 기술 분야, 특히, GMP-수준 무혈청 현탁 세포 사용에 의한 렌티바이러스의 대규모 제조 방법에 관한 것이다.

유전자 요법은 외인성 치료 유전자를 표적 세포 내로 도입하여 유전자 결함 및 이상에 의해 유발된 질환을 교정 또는 보상하거나, 또는 외인성 유전자에 의해 발현되는 생성물을 통해 질환 표적에 작용하여 치료 목적을 달성하는 것을 지칭한다.

가장 일반적인 재조합 렌티바이러스 벡터는 HIV-1 (인간 면역결핍 바이러스-1)에 기반하여 개발된 유전자 요법 벡터이다. 일반적인 레트로바이러스 벡터와는 상이하게, 재조합 렌티바이러스 벡터는 분열 세포 및 비-분열 세포 둘 모두를 감염시키는 능력을 갖는다. 재조합 렌티바이러스 벡터는 생체내 및 시험관내에서의 그의 높은 생물학적 역가, 낮은 면역원성 및 다른 이점으로 인해 CART 세포 및 유전자 요법을 위해 바람직한 트랜스제닉 벡터가 되었다.

성숙한 HIV-1 바이러스는 직경이 100-120 nm이고, 정20면체 대칭 구조를 갖고, 구형이다. 전자 현미경하에서 균일하고 조밀한 원뿔 형상의 코어를 관찰할 수 있다. 이는 바이러스 RNA 분자 및 효소를 함유한다. 후자로는 역전사효소, 인테그라제 및 프로테아제를 포함한다. HIV-1의 최외각 층은 지단백질 외피이다. 외피는 2종의 당단백질: 표면 단백질 (gp120) 및 내재 단백질 (gp41)을 함유한다. gp120은 스파이크이고, gp41은 막횡단 단백질이다. 외피의 내부 표면은 P17로 구성된 매트릭스이고, 외피 내부는 캡시드 단백질 (P24)에 의해 랩핑된 RNAO이다.

현재 재조합 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 게놈 중 패키징 신호 및 표적 유전자 전사 요소만을 그대로 남겨두고, 역전사효소, 외피 단백질 VSVG, gag/pol, rev, tat 및 다른 구조 또는 조절 유전자는 상이한 벡터 상에 분산시키고, 동시에 재조합 렌티바이러스 벡터의 안전성을 보장하기 위해 병원성 유전자를 결실시키는 유전자 변형 방법을 이용한다.

HEK293T는 인간 배아 신장 상피로부터 유래된 세포주이다. 이는 아데노바이러스 E1A 유전자의 형질감염에 의해 HEK 293 세포주로부터 수득되고, SV40의 큰 T 항원, 및 복제 기점 및 프로모터 영역 함유 SV40을 발현할 수 있다. 복제 기점 함유 SV40 바이러스의 진핵성 발현 벡터는 HEK 293T 세포에서 효율적인 복제 및 전사를 달성하고, 이에 의해 외인성 유전자의 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 그러므로, HEK293T 세포는 렌티바이러스 패키징에서 널리 사용되고, 높은 역가로 렌티바이러스 피드액을 수득할 수 있다.

그러나, 렌티바이러스 제조를 위한 세포주로서 HEK293T 세포는 여전히 하기와 같은 결함을 갖고 있다: 1) 큰 T 항원은 잠재적 발암 위험을 갖고 있다. 하류 공정이 상기 항원을 효과적으로 제거하지 못하면, 임상 치료에서 특정 위험이 존재할 것이고, 큰 T 항원은 특정 면역원성을 가지며, 이는 임상 치료의 어려움을 증가시킬 것이다; 2) HEK293T는 부착성 세포이다. 세포 공장 또는 스피너 병 생산을 통한 산업화를 실현시키기 어렵다; 3) 벽에 부착되는 능력은 약하고, 마이크로캐리어 기술이 사용된다면, 세포는 쉽게 떨어지고, 독소 생산 효율은 유의하게 감소된다.

추가로, 비록 현탁 세포 기반으로 렌티바이러스를 생성하는 일부 기술이 개발되기는 하였지만, 기존의 제조 방법은 여전히 일부 결함을 가지고 있다. 예를 들어, 이들은 대규모 제조에 적합하지 않고, 엄격한 GMP 제조 요건을 거의 충족시키지 못하며, 제조된 바이러스는 낮은 역가를 갖는다.

그러므로, 관련 기술분야에서는 무혈청 및 현탁 배양하에 패키징 세포를 통해 대규모로 렌티바이러스를 효율적으로 제조할 수 있는 방법 개발이 절실히 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 무혈청 및 현탁 배양하에 패키징 세포를 통해 대규모로 렌티바이러스를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 제1 측면에서,

(a) 렌티바이러스의 제조를 위해, 현탁액 중에서 성장하는 패키징 세포인, 패키징 세포의 시드 용액을 제공하는 단계;

(b) 시드 용액을 배양 용기 중 제1 배양액에 접종하여 제1 배양물을 수득하는 단계이며, 여기서 제1 배양액은 무혈청 세포 배양액이고, 접종 밀도는 1x10⁶ 내지 5x10⁶개의 세포/ml이고, 제1 배양액의 부피는 3 내지 100 L (바람직하게는 5 내지 50 L)인 단계;

(c) 온도 30℃ 내지 38℃, 용존 산소 35% 내지 55%, CO₂ 농도 2% 내지 10% 및 pH 6.9 내지 7.4의 설정 조건하에서 제1 배양물에 대해 패키징 세포의 계대배양을 수행하는 단계;

(d) 액체 교환 유발 조건이 충족되었을 때, 액체 교환 작업을 개시하는 단계이며,

여기서 액체 교환 유발 조건은

(s1) 실시간 pH ≤6.9, 바람직하게는 ≤7.0, 더욱 바람직하게는 ≤7.05;

(s2) 산소, 대기, 질소 및/또는 CO₂의 농도 조정에 의해, 실시간 pH 값이 여전히 하락 추세를 보임; 및

(s3) 계대배양 시간 ≥72 h

을 포함하고;

여기서 액체 교환 작업은 배양물 중 무세포 상청액을 배양 용기로부터 배출하는 것 - 여기서 상청액 배출 이전의 배양물 부피는 Vq1이고, 상청액 배출 이후의 배양물 부피는 Vh1이고, Vq1/Vh1 비가 3 내지 15 (바람직하게는 4 내지 7, 더욱 바람직하게는 5 내지 6)임; 및 이어서 배양액을 배양 용기에 보충하여 패키징 세포의 배양물을 형성하는 것을 포함하는 것인 단계;

(e) 단계 (c) 및 (d)를 n회 반복하며, 여기서 n은 1, 2 또는 3인 단계;

(f) 형질감염 유발 조건이 충족되었을 때, 형질감염 작업을 개시하는 단계이며,

여기서 형질감염 유발 조건은

(t1) 세포 총량이 0.05~2x10¹¹개의 세포임;

(t2) 세포 밀도가 0.5~5x10⁶개의 세포/ml임;

(t3) 세포 생존율이 ≥90%임; 및

(t4) 총 배양 시간이 ≥72 h임

을 포함하고;

여기서 형질감염 작업은 렌티바이러스 제조를 위해 제조 플라스미드 및 형질감염 시약을 혼합하는 것, 및 이를 배양 용기에 첨가하여 패키징 세포를 도입하고, 형질감염된 패키징 세포를 형성하는 것을 포함하는 것인 단계;

(g) 임의적으로, 형질감염 후, 액체 교환을 수행하는 단계;

(h) 온도 30℃ 내지 37℃, 용존 산소 35% 내지 55%, CO₂ 농도 2% 내지 10% 및 pH 6.9 내지 7.4의 설정 조건하에서 형질감염된 패키징 세포를 배양하는 단계;

(i) 액체 교환 유발 조건이 충족되었을 때, 수거 및 액체 교환 작업을 개시하는 단계이며,

여기서 액체 교환 유발 조건은

(s2) 산소, 대기, 질소 및/또는 CO₂의 농도 조정에 의해, 실시간 pH 값이 여전히 감소함; 및

(s3) 계대배양 시간 ≥72 h

을 포함하고;

여기서 액체 교환 작업은 배양물 중 무세포 바이러스 함유 피드액을 회수하는 것을 포함하고, 여기서 피드액 회수 이전의 배양물 부피는 Vq2이고, 상청액 회수 이후의 배양물 부피는 Vh2이고, Vq2/Vh2 비가 3 내지 15 (바람직하게는 4 내지 7, 더욱 바람직하게는 5 내지 6)인 단계;

(j) 단계 (h) 및 (i)를 m회 반복하며, 여기서 m은 1, 2 또는 3인 단계이며, 여기서 반복 전에 배양액을 배양 용기에 보충하여 형질감염된 세포 배양물을 형성하는 것인 단계;

(k) 각 회수액을 조합하여 조합된 바이러스 함유 상청액을 수득하는 단계; 및

(l) 조합된 바이러스 함유 상청액을 정제하여 정제된 렌티바이러스 벡터를 수득하는 단계를 포함하고;

여기서 상기 각 단계에서 사용된 배양액은 무혈청 세포 배양액인, 무혈청 현탁 세포로부터 렌티바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 (d)에서, 패키징 세포 배양물의 부피는 Vb1이고, Vb1:Vq1 비는 (0.8-1.2):1이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 (j)에서, 형질감염된 세포 배양물의 부피는 Vb2이고, Vb2:Vq2 비는 (0.8-1.2):1이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 (c) 및/또는 (h)에서, 배양은 진탕 조건하에서 수행된다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 진탕 조건은 분당 10 내지 30회 앞뒤로 로킹(rocking)하는 것이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 매회 로킹의 진폭은 1 내지 20 cm, 바람직하게는 5 내지 10 cm이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 다른 단계에서 첨가되는 배양액은 동일하거나 또는 상이한 배양액이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 (c) 및/또는 (h)에서, pH 값은 7.0 내지 7.35 범위로 유지된다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 (c) 및/또는 (h)에서, 용존 산소는 30% 내지 50% 범위로 유지된다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 (c) 및/또는 (h)에서, CO₂ 농도는 3% 내지 5% 범위로 유지된다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 (d) 및/또는 (i)에서, Vq1/Vh1 비는 5 내지 10이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 (c), (d) 및 (e)의 총 시간은 72 내지 216 h이다 (형질감염 이전).

또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 (f), (g), (h), (i) 및 (j)의 총 시간은 72 내지 120 h이다 (형질감염 이후).

또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 (f)에서, 사용된 멀티-플라스미드 형질감염은 3-플라스미드 형질감염 및 4-플라스미드 형질감염을 포함한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 4-플라스미드 형질감염은 플라스미드 CAR, gag/pol, rev 및 VSVG를 사용하는 형질감염이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 배양 용기는 1회용 배양 용기이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 배양 용기의 부피는 20 내지 120 L, 바람직하게는 30 내지 100 L, 더욱 바람직하게는 50 내지 80 L이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 조합된 바이러스 함유 상청액에 함유된 바이러스의 총 개수는 1x10¹² Tu이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 조합된 바이러스 함유 상청액 중 바이러스 역가는 8x10⁷ Tu/ml이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 패키징 세포는 인간 배아 신장 상피 세포이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 패키징 세포는 인간 배아 신장 상피 세포 HEK293F 또는 그로부터 유래된 세포이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 무혈청 배지는 LV-MAX™ 생산 배지(LV-MAX™ Production Medium) (기브코(Gibco)™)이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 (l)에서, 정제는 한외여과 및 크로마토그래피를 포함한다.

본 발명의 범주 내에서 상기의 본 발명의 기술적 특징 및 하기에서 상세하게 기술되는 기술적 특징 (예컨대, 실시양태)은 서로 조합되어 신규하거나, 또는 바람직한 기술적 해결안을 형성할 수 있음을 이해하여야 한다. 공간상 제한으로 인해, 이들은 본원에 기술되지 않는다.

광범위하고 심도 깊은 연구 후, 본 발명자들은 제조 공정 탐색 및 공정 파라미터 스크리닝을 통해 GMP-수준 무혈청 현탁 세포로부터 대규모로 렌티바이러스를 제조하는 방법을 개발하게 되었다. 본 발명에 의해 제공되는 방법은 50 ℓ 이상의 대규모 제조에 적합할 뿐만 아니라, 매우 효율적인 방식으로 높은 역가의 렌티바이러스를 제조한다. 추가로, 전체 공정은 무혈청 배양 조건을 채택하고 있기 때문에, 본 방법을 통해 혈청 사용으로 인한 동물 기반 단백질 및 다른 오염물이 도입될 위험을 피할 수 있다. 추가로, 본 발명에 의해 제공되는 방법에 의해 제조되는 렌티바이러스 배치들 사이의 변동은 극도로 작으며, 이는 제조 품질에 대한 높은 GMP 제조 요건을 충족시킬 수 있다. 이를 기반으로 본 발명이 완성된다.

용어

본원에서 사용되는, "본 발명의 패키징 세포," "패키징 세포 HEK293F," 및 "본 발명의 패키징 세포 HEK293F"라는 용어는 상호교환적인 방식으로 사용될 수 있고, 본 발명의 제1 측면에 기술되고 렌티바이러스의 패키징 및 제조에 사용되는 세포를 지칭한다.

패키징 세포 및 패키징 시스템

본 발명에서, 사용될 수 있는 렌티바이러스 패키징 시스템에 대한 특별한 제한은 없다. 바람직하게는 3-플라스미드 및 4-플라스미드 시스템이 사용될 수 있다.

특히 바람직한 패키징 시스템은 HIV-1로부터 유래된 렌티바이러스 벡터를 사용하고, 여기서 3-플라스미드 시스템 대신, 4-플라스미드 시스템이 사용되고, tat 조절 유전자는 넉 아웃되고, gag/pol 및 rev 캐리어 플라스미드는 하나에서 둘로 나누어지고, 이에 의해 복제 바이러스가 생성될 가능성은 감소되고, 벡터 시스템의 안전성은 크게 증가된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 렌티바이러스 제조를 위해 4-플라스미드 시스템을 이용함으로써 렌티바이러스 생성물의 안전성 및 신뢰도가 추가로 보장된다.

본 발명은 하기와 같은 주요 이점을 갖는다:

(a) 본 발명의 세포는 현탁 배양 세포이며, 이는 자동 제어 시스템의 도움으로 규모 확장될 수 있고, 이에 따라 재조합 렌티바이러스 벡터 피드액이 대규모로 제조될 수 있고, 제조 비용이 제어될 수 있다.

(b) 본 발명에 기술된 세포 배양 공정은 1회 배양 기술을 채택하고, 무혈청 및 단백질 무함유 배지를 사용하고, 이는 최종 생성물 중 이종 단백질 및 광우병 바이러스의 오염 위험을 제거하고, 생성물의 안전성 및 임상적 적용을 크게 향상시켜, 세포 또는 유전자 제약 제조에서 사용된다.

하기에서 본 발명은 구체적인 실시양태와 함께 추가로 예시된다. 이들 실시양태는 본 발명의 범주를 제한하는 것이 아니라, 본 발명을 예시하는 것으로 의도된다는 것을 이해하여야 한다. 하기 실시양태에서 구체적인 조건이 없는 실험 방법은 일반적으로 통상의 조건, 예컨대, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기술되어 있는 조건을 따르거나, 또는 제조사에 의해 권고되는 조건에 따라 수행된다. 달리 언급되지 않는 한, 백분율 및 부는 중량 백분율 및 중량부이다.

일반적 방법 및 물질

배지: 화학 조성이 명확한 무혈청 및 단백질 무함유 배지.

배양 조건: CO₂ 3%~5%; 온도 30~37℃.

(1) 형질감염 시약 제조:

a) 1xHBS (pH 7.4): 900 ml의 초순수 중에 8.76 g의 NaCl을 용해시키고, 20 ml의 1 M HEPES를 첨가하고, pH 값을 7.4로 조정하고, 부피가 1 L가 되게 만들고, 여과하고 (0.2 ㎛ 필터 막), 이를 추후 사용을 위해 4℃에서 보관한다.

b) PEI 분말 125 mg을 칭량하고, 이를 50 ml 1xHBS (pH 7.4) 중에 용해시키고, 이를 0.2 ㎛ 필터 막을 이용하여 여과하고, 이를 추후 사용을 위해 4℃에서 보관한다.

실시양태 1

렌티바이러스의 대규모 제조 방법

본 발명은 GMP-수준 무혈청 현탁 세포 사용에 의한 렌티바이러스의 대규모 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 의해 제공되는 방법은 하기 단계를 포함한다:

(b) 시드 용액을 배양 용기 중 제1 배양액에 접종하여 제1 배양물을 수득하는 단계이며, 여기서 제1 배양액은 무혈청 세포 배양액이고, 접종 밀도는 1x10⁶ 내지 5x10⁶개의 세포/ml이고, 제1 배양액의 부피는 미리 결정된 큰 부피 (예컨대, 3 내지 100 L)인 단계;

여기서 액체 교환 작업은 배양물 중 무세포 상청액을 배양 용기로부터 배출하는 것; 및 이어서 배양액을 배양 용기에 보충하여 패키징 세포의 배양물을 형성하는 것을 포함하는 것인 단계;

(g) 임의적으로, 형질감염 후, 액체 교환을 수행하는 단계;

여기서 액체 교환 작업은 배양물 중 무세포 바이러스 함유 피드액을 회수하는 것을 포함하는 것인 단계;

여기서 상기 각 단계에서 사용된 배양액은 무혈청 세포 배양액이다.

본 발명에서, 액체 교환 유발 조건은 최적화되고, 이는 각 제조 배치의 품질 변동을 감소시키는 데 도움이 되고, 의학 등급의 렌티바이러스를 높은 역가 및 높은 수율로 수득하는 데 도움이 된다. 전형적으로, 액체 교환 유발 조건은

(s3) 계대배양 시간 ≥72 h

을 포함한다.

본 발명에서, 형질감염 유발 조건은 최적화되고, 이는 각 제조 배치의 품질 변동을 감소시키는 데 도움이 되고, 의학 등급의 렌티바이러스를 높은 역가 및 높은 수율로 수득하는 데 도움이 된다. 전형적으로, 형질감염 유발 조건은

(t1) 세포 총량이 0.05~2x10¹¹개의 세포임;

(t2) 세포 밀도가 0.5~5x10⁶개의 세포/ml임;

(t3) 세포 생존율이 ≥90%임; 및

(t4) 총 배양 시간이 ≥72 h임

을 포함한다.

전형적으로, 본 발명의 구체적인 실시양태에서, 본 방법은 하기 단계를 포함한다:

시드 용액 제조 단계;

접종 밀도 1-5x10⁶개의 세포/ml로 접종 (25 L의 배양액으로 접종)하는 단계;

pH를 6.9 내지 7.4, 바람직하게는 7.0 내지 7.3, 더욱 바람직하게는 7.1 내지 7.2로 제어하면서, 패키징 세포를 계대배양하는 단계 (이 기간 동안, pH 및 용존 산소를 사용하여 용존 CO₂, 질소 및 대기의 환기비 뿐만 아니라, 액체 교환 개시 모드를 자동으로 조정한다);

예를 들어, 25 L → 2 내지 10 L (바람직하게는 3 내지 7 L)로 제1 액체 교환을 수행하는 단계 (pH가 ≤6.9, 바람직하게는 ≤7.0일 때, 액체 교환이 유발될 수 있다);

무혈청 배양액을 보충하고, 24 내지 96 h, 바람직하게는 36 내지 72 h, 더욱 바람직하게는 40 내지 60 h 동안 계속 배양하는 단계이며; 300 h 동안 배양한 후, 세포 개수는 5x10¹⁰개인 단계;

플라스미드를 첨가하여 패키징 세포를 다중 플라스미드로 형질감염시키는 단계;

임의적 단계: 형질감염 후, 2 내지 10 h, 바람직하게는 4 내지 6 h 동안 배양하고, 액체 교환을 다시 수행하는 단계 (먼저 일정량의 배양 혼합물을 배출한 후, 이어서 무혈청 배양액을 첨가한다);

통용 단계: 형질감염 후, 계속 배양한다. pH가 ≤6.9, 바람직하게는 ≤7.0일 때, 형질감염 후, 제1 액체 교환이 유발될 수 있고, 형질감염 후 액체 교환 동안, 배출된 액체 배양 혼합물 (무세포 바이러스 함유 상청액)을 회수하고, 회수액 R1로 기록하고, 2℃ 내지 8℃에서 보관하는 단계;

액체 교환 후, 계속 배양한다. 액체 교환 유발 조건이 충족되었을 때, 형질감염 후, 제i 액체 교환을 수행하며, 여기서 i는 2, 3, 4 또는 5이고; 매회 액체 교환 동안, 배출된 액체 배양 혼합물의 무세포 바이러스 함유 상청액을 회수하고, 회수액 Ri로 기록하는 단계. 본 단계를 1, 2 또는 3회 반복한다;

각 회수액을 조합하여 조합된 바이러스 함유 상청액을 수득하는 단계;

조합된 바이러스 함유 상청액을 정제하여 1x10⁸ 내지 1x10⁹ Tu/mL의 역가로 정제된 렌티바이러스 벡터를 수득하는 단계.

비교 실시예 1

하기 차이를 제외하고 실시양태 1을 반복한다: 초기 pH 값은 6.9 내지 7.4이지만, 계대배양 공정에서, 제1 배양물의 실시간 pH 값은 실시간으로 모니터링되지 않고, 대신, 계대배양은 24 내지 96 h 수행된다.

결과: 300 h 동안 배양한 후, 세포의 개수는 4x10⁹개이다 (바람직한 실시양태에서의 세포의 개수보다 적음).

비교 실시예 2

하기 차이를 제외하고 실시양태 1을 반복한다: CO₂ 함량이 조정되지 않는다.

결과: 렌티바이러스의 생물학적 역가는 바람직한 실시양태에서의 것의 20%이다.

본 발명에서 언급된 모든 문헌은 마치 각 문헌이 개별적으로 참조로 인용된 것과 같이 본 출원에서 참조로 인용된다. 추가로, 본 발명의 상기 교시 내용을 읽은 후, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 대한 다양한 변화 또는 변형을 만들 수 있고, 이들 등가물 형태는 또한 본 출원의 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 범주 내에 포함된다는 것을 이해하여야 한다.

Claims

(a) 렌티바이러스의 제조를 위해, 현탁액 중에서 성장하는 패키징 세포인, 패키징 세포의 시드 용액을 제공하는 단계;
(b) 시드 용액을 배양 용기 중 제1 배양액에 접종하여 제1 배양물을 수득하는 단계이며, 여기서 제1 배양액은 무혈청 세포 배양액이고, 접종 밀도는 1x10⁶ 내지 5x10⁶개의 세포/ml이고, 제1 배양액의 부피는 3 내지 100 L인 단계;
(c) 온도 30℃ 내지 38℃, 용존 산소 35% 내지 55%, CO₂ 농도 2% 내지 10% 및 pH 6.9 내지 7.4의 설정 조건하에서 제1 배양물에 대해 패키징 세포의 계대배양을 수행하고, 계대배양 공정에서 제1 배양물의 실시간 pH 값을 모니터링하고, 실시간 pH 값에 기초하여 용존 산소 및/또는 CO₂의 농도를 제어함으로써 pH 값을 6.9 내지 7.4 범위로 유지시키는 단계;
(d) 액체 교환 유발 조건이 충족되었을 때, 액체 교환 작업을 개시하는 단계이며,
여기서 액체 교환 유발 조건은
(s1) 실시간 pH ≤6.9, 바람직하게는 ≤7.0, 더욱 바람직하게는 ≤7.05;
(s2) 산소, 대기, 질소 및/또는 CO₂의 농도 조정에 의해, 실시간 pH 값이 여전히 하락 추세를 보임; 및
(s3) 계대배양 시간 ≥72 h
을 포함하고;
여기서 액체 교환 작업은 배양물 중 무세포 상청액을 배양 용기로부터 배출하는 것 - 여기서 상청액 배출 이전의 배양물 부피는 Vq1이고, 상청액 배출 이후의 배양물 부피는 Vh1이고, Vq1/Vh1 비가 3 내지 15임; 및 이어서 배양액을 배양 용기에 보충하여 패키징 세포의 배양물을 형성하는 것을 포함하는 것인 단계;
(e) 단계 (c) 및 (d)를 n회 반복하며, 여기서 n은 1, 2 또는 3인 단계;
(f) 형질감염 유발 조건이 충족되었을 때, 형질감염 작업을 개시하는 단계이며,
여기서 형질감염 유발 조건은
(t1) 세포 총량이 0.05~2x10¹¹개의 세포임;
(t2) 세포 밀도가 0.5~5x10⁶개의 세포/ml임;
(t3) 세포 생존율이 ≥90%임; 및
(t4) 총 배양 시간이 ≥72 h임
을 포함하고;
여기서 형질감염 작업은 렌티바이러스 제조를 위해 제조 플라스미드 및 형질감염 시약을 혼합하는 것, 및 이를 배양 용기에 첨가하여 패키징 세포를 도입하고, 형질감염된 패키징 세포를 형성하는 것을 포함하는 것인 단계;
(g) 임의적으로, 형질감염 후, 액체 교환을 수행하는 단계;
(h) 온도 30℃ 내지 37℃, 용존 산소 35% 내지 55%, CO₂ 농도 2% 내지 10% 및 pH 6.9 내지 7.4의 설정 조건하에서 형질감염된 패키징 세포를 배양하고, 계대배양 공정에서 제1 배양물의 실시간 pH 값을 모니터링하고, 실시간 pH 값에 기초하여 용존 산소 및/또는 CO₂의 농도를 제어함으로써 pH 값을 6.9 내지 7.4 범위로 유지시키는 단계;
(i) 액체 교환 유발 조건이 충족되었을 때, 수거 및 액체 교환 작업을 개시하는 단계이며,
여기서 액체 교환 유발 조건은
(s1) 실시간 pH ≤6.9;
(s2) 산소, 대기, 질소 및/또는 CO₂의 농도 조정에 의해, 실시간 pH 값이 여전히 감소함; 및
(s3) 계대배양 시간 ≥72 h
을 포함하고;
여기서 액체 교환 작업은 배양물 중 무세포 바이러스 함유 피드액을 회수하는 것을 포함하고, 여기서 피드액 회수 이전의 배양물 부피는 Vq2이고, 상청액 회수 이후의 배양물 부피는 Vh2이고, Vq2/Vh2 비가 3 내지 15인 단계;
(j) 단계 (h) 및 (i)를 m회 반복하며, 여기서 m은 1, 2 또는 3인 단계이며, 여기서 반복 전에 배양액을 배양 용기에 보충하여 형질감염 세포 배양물을 형성하는 것인 단계;
(k) 각 회수액을 조합하여 조합된 바이러스 함유 상청액을 수득하는 단계; 및
(l) 조합된 바이러스 함유 상청액을 정제하여 정제된 렌티바이러스 벡터를 수득하는 단계를 포함하고;
여기서 상기 각 단계에서 사용된 배양액은 무혈청 세포 배양액인, 무혈청 현탁 세포로부터 렌티바이러스를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c) 및/또는 (h)에서, 배양이 진탕 조건하에서 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c) 및/또는 (h)에서, pH 값이 7.0 내지 7.35 범위로 유지되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (d) 및/또는 (i)에서, Vq1/Vh1 비가 5 내지 10인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c), (d) 및 (e)의 총 시간이 72 내지 216 h인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (f)에서, 사용되는 멀티-플라스미드 형질감염이 3-플라스미드 형질감염 및 4-플라스미드 형질감염을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 배양 용기가 1회용 배양 용기인 방법.
제1항에 있어서, 조합된 바이러스 함유 상청액에 함유된 바이러스의 총 개수가 1x10¹² Tu인 방법.
제1항에 있어서, 패키징 세포가 인간 배아 신장 상피 세포인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (l)에서, 정제가 한외여과 및 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.