CN106520834A - 一种重组逆转录病毒载体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组逆转录病毒载体，它是将逆转录病毒载体PQCXIN中的筛选基因Neo替换为DHFR基因、启动子CMV替换为启动子PCEF的逆转录病毒载体，其中DHFR基因和启动子PCEF的核苷酸序列分别如SEQ NO：1和2所示。本发明还公开了重组逆转录病毒载体的用途。本发明逆转录病毒载体PQCEDHFR携带外源基因转染哺乳细胞，转染的比例高，外源基因的表达水平高，且外源基因的表达水平可以持续稳定高产，采用本发明逆转录病毒载体PQCEDHFR容易筛选到外源基因高表达的细胞株，应用前景良好。

Description

一种重组逆转录病毒载体及其用途

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种逆转录病毒载体及其用途。

背景技术

哺乳动物细胞是重组蛋白药物生产的主要表达系统。目前，采用哺乳动物细胞表达系统生产的生物技术药物已超过全球生物技术药物销售份额的70％。在以哺乳动物细胞为生产系统的重组蛋白药物的生产中，获得高效、稳定表达外源目的蛋白的细胞株在整个生产过程中具有重要的地位。

而建立一个重组蛋白高表达细胞株的主要影响因素有：外源基因在染色质中的整合位置；外源基因的拷贝数及其表达载体的表达效率。因此，建立一株高表达细胞株，首先将外源基因整合在宿主细胞染色体转录活跃区域。外源基因在宿主细胞中的整合位点，不但对外源基因表达水平影响很大，而且也影响随后进行的外源基因的扩增效果，以及外源基因在宿主细胞表达的稳定性。哺乳动物细胞的基因组非常庞大，其中包含为数众多的外源基因整合位点，如CHO细胞基因组中大概有15000个整合位点，但其中能使外源基因高效表达的转录活跃位点为数不多，大约有15-30个位点，通常的质粒转染等方法只能将外源目的基因随机整合到宿主细胞基因组内，要想获得高表达的细胞株必须经过大量的筛选，但是获得高效表达外源目的基因的细胞株的几率仍非常低。其次增加外源基因的拷贝数，单拷贝或低拷贝外源基因，无论表达载体调控元件如何强大高效，整合在染色体上的位点多么活跃，其外源基因表达量都是有限的，因此增加外源基因拷贝数对于外源基因的高表达是有效而重要的方法。

由于插入位置无特异性，采用质粒转染等其他传统的外源基因介导方法，获得高效表达外源基因细胞系的难度大，几率小。

而逆转录病毒载体携带的外源目的基因整合到宿主细胞时，具有倾向发生于染色体开放区和转录活跃位点的明显特点，因此，采用逆转录病毒表达系统可以大大提高获得高效表达外源基因细胞系的几率。

比如，许建等，“基于逆转录病毒载体的高效表达系统的建立和应用”，中国人民解放军军事医学科学院，细胞生物学，2008，硕士公开了逆转录病毒PQCXIN获得的EGFP阳性细胞的相对荧光强度约为pcDNA3.1/EGFP质粒转染的EGFP阳性细胞的相对荧光强度的2倍，说明采用逆转录病毒载体PQCXIN比质粒更容易获得高效表达外源基因细胞系，但是，提高幅度不大，有待进一步提升。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种重组逆转录病毒载体，其是在逆转录病毒载体PQCXIN上改进得到的载体PQCEDHFR。

本发明重组逆转录病毒载体PQCEDHFR，它是将逆转录病毒载体PQCXIN中的筛选基因Neo替换为DHFR基因、启动子CMV替换为启动子PCEF的逆转录病毒载体，其中DHFR基因和启动子PCEF的核苷酸序列分别如SEQ NO：1和2所示。

优选地，所述重组逆转录病毒载体PQCEDHFR的核苷酸序列如SEQ NO：3所示。

本发明还提供了一种携带外源基因的转染载体，它是携带有外源基因的重组逆转录病毒载体PQCEDHFR。

其中，所述外源基因是EGFP基因或者TNK-tpa基因以及其它外源基因包括细胞因子及蛋白类激素、蛋白酶类、以及免疫球蛋白融合蛋白、单克隆抗体类等生物技术药物。优选地，所述携带外源基因的转染载体的核苷酸序列如SEQ NO：5或6所示。

EGFP基因：增强绿色荧光蛋白基因。

TNK-tpa基因：组织型纤溶酶原激活剂突变体基因。

本发明还提供了前述的重组逆转录病毒载体在制备表达外源基因的转基因细胞中的用途。

优选地，所述外源基因是EGFP基因或者TNK-tpa基因以及其它外源基因包括细胞因子及蛋白类激素、蛋白酶类、以及免疫球蛋白融合蛋白、单克隆抗体类等生物技术药物。

优选地，所述细胞是哺乳动物细胞。

优选地，所述哺乳动物细胞是CHO、BHK、HEK293、NS0、PERC6细胞。

本发明还提供了一种制备表达外源基因的转基因细胞的方法，步骤如下：

(1)取前述重组逆转录病毒载体，连接外源基因，得携带有外源基因重组逆转录病毒载体；

(2)取携带有外源基因重组逆转录病毒载体，制备病毒，再感染目的细胞即可。

采用本发明重组逆转录病毒载体PQCEDHFR携带外源基因(如，EGFP基因或者TNK-tpa基因)转染哺乳细胞(如，CHO细胞)，转染的比例高，外源基因的表达水平稳定，且外源基因的表达水平高，是传统质粒pcDNA3.1的13.3倍，也是改进前的逆转录病毒载体PQCXIN的6.65倍，效果大幅度提高，采用本发明逆转录病毒载体PQCEDHFR容易筛选到外源基因高表达的细胞株，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1建逆转录病毒载体PQCEDHFR及PQCEDHFREGFP和PQCEDHFR TNK-tpa的载体图；

图2构建pcDNA3.1/DHFR及pcDNA3.1/DHFR/EGFP和pcDNA3.1/dhfr/TNK-tpa的载体图；

图3不同载体表达EGFP的结果比较；

图4不同载体表达TNK-tpa的活性比较。

具体实施方式

实施例1本发明逆转录病毒载体的构建

如图1所示构建本发明逆转录病毒载体PQCEDHFR：

取逆转录病毒载体PQCXIN(其结构如图1所示，购自clontech公司)，用酶切位点AgeI(购自NEB公司)和XhoI(购自NEB公司)切除IRES和Neo；

通过重叠延伸PCR的方法将IRES和DHFR(序列如SEQ NO：1所示)两段基因连接，得基因片段IRESDHFR，在两端设计酶切位点AgeI和XhoI，与PQCXIN用酶切位点AgeI和XhoI切除IRES和Neo后的剩余部分链接，构建得到载体PQCDHFR；

利用载体PQCDHFR上的XbaI(购自NEB公司)和NotI(购自NEB公司)酶切位点将启动子CMV替换为PCEF启动子(序列如SEQ NO：2所示)，构建得到本发明逆转录病毒载体PQCEDHFR，其核苷酸序列如SEQ NO：3所示。

也可以直接合成SEQ NO：3所示核苷酸序列，得到本发明逆转录病毒载体PQCEDHFR。

实施例2采用本发明逆转录病毒载体携带EGFP基因转染细胞

一、实验材料

本发明逆转录病毒载体PQCEDHFR(核苷酸序列如SEQ NO：3所示)：按照实施例1的方法制备。

对照组质粒：通过常规的分子生物学手段在pcDNA3.1(+)(购自Invitrogen公司)用XmaI(购自NEB公司)和BstBI(购自NEB公司)酶切去除筛选基因Neo，连入经同样酶切的DHFR基因，构建成功载体pcDNA3.1/DHFR见附图1和SEQ NO：4。

二、实验方法

在pcDNA3.1/DHFR的EcoRV处连入EGFP报告基因，命名为pcDNA3.1/DHFR/EGFP见附图2，作为对照载体，然后载体PQCEDHFR通过NotI(购自NEB公司)和PacI(购自NEB公司)酶切，连入经同样酶切的EGFP，命名为PQCEDHFR/EGFP见附图1。

质粒pcDNA3.1/DHFR/EGFP的转染：转染前24h，6孔板接种2.0×10⁶细胞/孔。置37℃，5％CO₂培养。至转染时细胞密度以形成80～90％的汇合。转染前1h，更换新鲜的完全培养液0.5ml。用脂质体2000转染CHO-S(购自invitrogen公司)细胞24-48h后，消化细胞分至T25方瓶中培养，加200nM MTX筛选。10天左右后至方瓶中出现阳性克隆，加大MTX浓度为1000nM，继续培养至细胞克隆进一步扩大，用胰酶消化收集阳性克隆细胞用于流式细胞仪测定EGFP表达结果附图3和表1。

逆转录病毒载体PQCEDHFR/EGFP的感染：

(1)病毒的制备和浓缩:

病毒的包装：病毒载体和pVSV-G(购自clontech公司)质粒共转染GP2-293(购自clontech公司)细胞，在75cm2培养瓶中GP2-293细胞汇合度达到90％时进行双质粒共转染。PQCEDHFR/EGFP：pVSV-G为1:1，DNA总量60μg，转染步骤同质粒pcDNA3.1/DHFR/EGFP的转染，转染后5h换成新鲜的D/F培养基20ml(含有10％FBS)。

病毒的收获及浓缩：转染后24～48h观察细胞，状态基本没有变化，培养基变黄很快是病毒产生的标志之一，转染后48h收获。培养瓶中上清转至50ml无菌离心管，0.45μm滤膜滤器过滤除去细胞碎片，(或者3000×g 4℃离心15min)将上清液转移至无菌容器中，向四倍体积的病毒上清液中加入1倍体积的病毒浓缩液(Retro-Concertin VirusPrecipitation Solution,Exvell Bio公司产品)，3000×g离心30min，在容器底部出现沉淀；吸取上清，3000×g离心5min，吸液去除所有的残留液体(注意不能破坏已经沉淀的病毒颗粒)用1/10-1/100体积(或者根据自己的实验实际情况确定更少的体积)冷的无菌PBS缓冲液或DMEM在4℃条件下重悬病毒沉淀，所得悬液用于感染CHO-S-细胞(购自Invitrogen公司)，或者分装至预冷的无菌小管中，-70℃储存备用。

(2)病毒感染CHO-S细胞

病毒感染前24h，6孔板接种CHO-S细胞2.0×10⁶细胞/孔。置37℃，5％CO₂培养。至转染时细胞密度以形成80～90％的汇合；感染当日，弃去目的细胞培养旧液，加入含病毒的贮存液感染培养板中的CHO-S细胞，加入800mg/L聚凝胺至终浓度为8mg/L，培养1～3小时，加入培养液，稀释聚凝胺至2mg/L，培养24-48小时。将一个6孔板细胞移至一个T25细胞方瓶中。当细胞贴壁后加200nM MTX筛选，3-4天换液，10-14天左右至方瓶中出现阳性克隆，加大MTX(购自sigma公司)浓度为1000nM，继续培养至细胞克隆进一步扩大，用胰酶消化收集阳性克隆细胞用于流式细胞仪测定EGFP表达结果见附图3和表1。

3、实验结果

实验结果如图3和表1所示：

表1不同载体表达EGFP的荧光强度单位

从表1可以看出，与传统的质粒pcDNA3.1携带EGFP基因转染CHO细胞相比，利用本发明逆转录病毒载体PQCEDHFR携带EGFP基因转染CHO细胞后，外源基因的表达水平高，是前者的13.3倍。

如背景技术部分所述，采用改进前的逆转录病毒载体PQCXIN携带EGFP基因表达，其表达水平是质粒pcDNA3.1的2倍。也就是说，本发明改进后的逆转录病毒载体PQCEDHFR是改进前逆转录病毒载体PQCXIN的6.65倍，效果大幅度提高。

从图3可以看出，利用传统的质粒携带EGFP基因转染CHO细胞，病毒载体高表达外源基因的比例只有整个细胞群体的0.43％，而利用本发明逆转录病毒载体PQCEDHFR携带EGFP基因(即PQCEDHFR/EGFP载体，核苷酸序列如SEQ NO：5所示)转染CHO细胞，病毒载体高表达外源基因的比例占到了整个细胞群体的55％以上，是前者的125倍。

实验结果说明，与传统的采用质粒携带外源基因转染哺乳细胞相比，采用本发明逆转录病毒载体PQCEDHFR携带外源基因转染哺乳细胞，转染的比例显著提高，外源基因的表达水平显著提高。因此，采用本发明逆转录病毒载体PQCEDHFR更容易筛选到外源基因高表达的细胞株。

实施例3采用本发明逆转录病毒载体携带TNK-tpa基因转染细胞

一、实验材料

为了进一步验证该种方法的可行性，用外源基因TNK-tpa作为测试基因构建载体pcDNA3.1/DHFR/TNK-tpa和PQCEDHFR/TNK-tpa(图1、2)。

二、实验方法

按照实施例2中的转染和感染方法及筛选加压扩增基因的方法获得表达TNK-tpa基因的阳性细胞混合克隆群。

通过有限稀释的方法分别单克隆到96孔板中，至2周左右，单克隆细胞长至整个孔板的1/2-2/3时，用体外纤维蛋白琼脂板溶圈法检测TNK-tPA体外纤维蛋白溶解活性，测定细胞上清的表达情况，各自选取了10株高表达细胞株，结果如表2。

三、实验结果

实验结果如表2所示：

表2不同载体表达TNK-tpa的活性单位

从表1可以看出，与传统的质粒携带TNK-tpa基因转染CHO细胞相比，利用本发明逆转录病毒载体PQCEDHFR携带TNK-tpa基因(即PQCEDHFR/TNK-tpa载体，核苷酸序列如SEQNO：6所示)转染CHO细胞后，外源基因的表达水平高，是前者的10-15倍左右。

实验结果说明，与传统的采用质粒携带外源基因转染哺乳细胞相比，采用本发明逆转录病毒载体PQCEDHFR携带外源基因转染哺乳细胞，外源基因的表达水平显著提高。因此，采用本发明逆转录病毒载体PQCEDHFR更容易筛选到外源基因高表达的细胞株。

实施例4本发明逆转录病毒载体表达外源蛋白的稳定性研究

一、实验方法

从实施例3中的质粒载体和本发明逆转录病毒载体获得的10株高表达单克隆细胞中，分别各选三株表达较高的细胞1C5、2D6、5A2(质粒载体组)；2A8、1F7、4C6(本发明逆转录病毒载体组)，按3x10⁵/ml细胞密度接种，3-4天后细胞密度长至2x10⁶/ml，再按3x10⁵/ml密度接种，在摇瓶中以这种方式连续传代培养60天，每传代一次后的细胞上清留着检测，细胞冻存备用。

分别取最终传代细胞与未经传代培养的初始细胞以及在传代培养中期的细胞，用FeedC补料的无血清培养基(CD-FORTICHO，life technology公司产品)中培养10-14天，检测TNK-tpa表达量。

二、实验结果

如表3所示：

表3不同单克隆细胞连续传代培养的表达量

如表3所示，质粒载体表达的TNK-tpa表达量在30-90mg/L,其中两株细胞不稳定，传代到30天左右时表达量开始下降，到60天时表达量下降50％以上，最终表达量维持在32-82mg/L；而逆转录载体表达的TNK-tpa表达量基本都维持在在500-600mg/L，表达量的稳定性未发生明显的变化。

实验结果说明，采用本发明逆转录病毒载体PQCEDHFR构建的高表达细胞株在CHO细胞中表达外源蛋白能够达到稳定高产。

综上，采用本发明逆转录病毒载体PQCEDHFR携带外源基因转染哺乳细胞，转染的比例高，外源基因的表达水平高，且外源基因的表达水平可以持续稳定高产，采用本发明逆转录病毒载体PQCEDHFR容易筛选到外源基因高表达的细胞株，应用前景良好。

Claims (10)

1.重组逆转录病毒载体，其特征在于：它是将逆转录病毒载体PQCXIN中的筛选基因Neo替换为DHFR基因、启动子CMV替换为启动子PCEF的逆转录病毒载体，其中DHFR基因和启动子PCEF的核苷酸序列分别如SEQ NO：1和2所示。

2.根据权利要求1所述的重组逆转录病毒载体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ NO：3所示。

3.一种携带外源基因的转染载体，其特征在于：它是携带有外源基因的权利要求1或2所述的重组逆转录病毒载体。

4.根据权利要求3述的转染载体，其特征在于：所述外源基因是EGFP基因或者TNK-tpa基因以及其它外源基因包括细胞因子及蛋白类激素、蛋白酶类、以及免疫球蛋白融合蛋白、单克隆抗体类等生物技术药物。

5.根据权利要求4所述的转染载体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ NO：5或6所示。

6.权利要求1或2所述的重组逆转录病毒载体在制备表达外源基因的转基因细胞中的用途。

7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述外源基因是EGFP基因或者TNK-tpa基因以及其它外源基因包括细胞因子及蛋白类激素、蛋白酶类、以及免疫球蛋白融合蛋白、单克隆抗体类等生物技术药物。

8.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述细胞是哺乳动物细胞。

9.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述哺乳动物细胞是CHO、BHK、HEK293、NS0、PERC6细胞。

10.一种制备表达外源基因的转基因细胞的方法，其特征在于：步骤如下：

(1)取权利要求1或2所述的重组逆转录病毒载体，连接外源基因，得携带有外源基因重组逆转录病毒载体；

(2)取携带有外源基因重组逆转录病毒载体，转染细胞，制备病毒，再感染目的细胞即可。