CN112107677A - EFTUD2应用及Epro-LUC-HepG2建模法 - Google Patents

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Abstract

本发明为EFTUD2应用及Epro‑LUC‑HepG2建模法。EFTUD2蛋白可以通过剪接作用调节固有免疫信号通路中关键信号分子RIG‑1、MDA5 mRNA的生成，从而影响干扰素刺激基因（ISGs）的生成来抑制HBV复制。本发明通过以EFTUD2为靶点建立稳定的化合物筛选细胞模型，可以供研究和发掘新的分子靶向药物。在该模型基础上筛选能够上调EFTUD2基因表达化合物，为HBV慢性感染患者尤其临床IFN‑α治疗应答不佳患者提供更多的治疗选择。

Description

EFTUD2应用及Epro-LUC-HepG2建模法
技术领域
本发明涉及基因领域，具体的说涉及EFTUD2为靶点的应用及建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)是一种具有高度种属特异性和组织特异性的部分环状双链DNA病毒。其感染会引起肝功能异常、肝炎，部分患者后期会进展为肝硬化甚至肝癌。我国是HBV感染重度流行国家，约有9000万HBV慢性感染者，其中有2800万人迫切需要抗病毒治疗，有700万人正在承受着晚期肝病的痛苦和向肝癌转化的风险。目前用于治疗乙肝病毒(HBV)慢性感染的两种药物干扰素(IFN)和核苷酸类似物(NAs)对慢性乙型肝炎(CHB)的治愈率仍不理想。
发明内容
发明人临床观察发现，HBV慢性感染患者体内EFTUD2基因的表达水平较非感染患者偏低。CHB患者中干扰素应答不佳者EFTUD2表达水平低。
发明人发现，EFTUD2蛋白可以通过剪接作用调节固有免疫信号通路中关键信号分子RIG-1、MDA5 mRNA的生成，从而影响干扰素刺激基因(ISGs)的生成来抑制HBV复制。
进一步的，发明人提出设想：通过以EFTUD2为靶点建立稳定的化合物筛选细胞模型，以供研究和发掘新的分子靶向药物。在该模型基础上筛选能够上调EFTUD2基因表达化合物，以期为HBV慢性感染患者尤其临床IFN-α治疗应答不佳患者提供更多的治疗选择。
由此，本发明提出一种EFTUD2蛋白作为抑制HBV复制的物质的应用。
进一步的，提出EFTUD2蛋白通过剪接作用调节固有免疫信号通路中关键信号分子RIG-1、MDA5 mRNA的生成，从而影响干扰素刺激基因ISGs的生成来抑制HBV复制的应用。
进一步的，提出EFTUD2靶点建立稳定的化合物筛选细胞模型的应用。
进一步的，提出一种建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，以EFTUD2为靶点，包括如下步骤：
步骤S1、融合PCR技术获得目的序列Epro0.5-LUC
通过融合PCR技术将hEFTUD2pro-0.5kb启动子序列与萤火虫荧光素酶报告基因整合成融合基因；
步骤S2、构建LV6-Epro-LUC重组慢病毒
通过XbaI和BamHI双酶切将融合基因同源重组进LV6载体中构建LV6-Epro0.5-LUC穿梭质粒，LV6-Epro0.5-LUC穿梭质粒同包装质粒一起转染293T细胞，进行慢病毒包装，并进行滴度检测，获得LV6-Epro0.5-LUC慢病毒；
步骤S3、LV6-Epro0.5-LUC慢病毒感染HepG2细胞
用LV6-Epro0.5-LUC慢病毒感染HepG2细胞，感染后换新鲜完全培养基继续培养；
步骤S4、建立Epro-LUC-HepG2单克隆稳转株
对长出的多克隆细胞通过有限稀释法挑选出单克隆细胞株，对单克隆细胞株进行测序验证目的序列是否克隆进细胞基因组，并通过荧光素酶实验检测单克隆细胞株的荧光素酶活性，挑选出活性最高的细胞株进行扩大培养，建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型；
进一步的，还包括嘌呤霉素致死浓度筛选的步骤，筛选出能够完全杀死HepG2细胞的最适puro浓度；
较佳的，步骤S4中所述有限稀释法所采用的培养基为能够完全杀死HepG2细胞的最适puro浓度培养基。
进一步的，步骤S1包括第一轮PCR反应和第二轮PCR反应，通过2轮PCR反应获得单一的目的Epro0.5-LUC条带；
第一轮PCR反应:分别获得hEFTUD2pro-0.5kb和LUC两段序列；
分别以前期PCR反应获得的hEFTUD2pro-0.5kb基因序列和Luciferase基因序列作为模板，经一轮PCR反应得到基因片段一hEFTUD2pro-0.5kb和基因片段二LUC；
第一轮PCR反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收Epro0.5-LUC基因片段一hEFTUD2pro-0.5kb和基因片段二LUC；
第一轮PCR反应:用EpL-CEF和EpL-CER引物进行第二轮PCR反应，模板为第一轮PCR反应产物经电泳回收后的Epro0.5-LUC基因片段一hEFTUD2pro-0.5kb和基因片段二LUC；
所述片段一hEFTUD2pro-0.5kb为hEFTUD2pro-0.5kb启动子序列；
所述基因片段二LUC为萤火虫荧光素酶报告基因；
所述Epro0.5-LUC条带为整合成的融合基因。
进一步的，通过XbaI和BamHI双酶切将融合基因同源重组进LV6载体中构建LV6-Epro0.5-LUC穿梭质粒的步骤包括：
(1)LV6载体双酶切
用XbaI和BamHI对LV6载体在酶切体系下进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，然后用DNA凝胶回收试剂盒回收载体psiCHECK-2和载体LV6条带；
(2)目的序列克隆到线性LV6载体
利用
Figure BDA0002613712490000031
Entry One Step Cloning Kit试剂盒，在反应体系下将扩增回收好的Epro0.5-LUC目的片段，重组克隆到线性化的LV6载体中；使用移液器上下吹打反应体系数次，混匀各组分，置于恒温箱中反应，反应完成后将反应管置于冰水浴中，冷却；
(3)琼脂糖凝胶电泳
将DNA与10╳DNA loading Buffer按比例混合，每个加样槽加入样品；
加样后接通电源进行电泳，控制电场强度，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿处时,停止电泳；
染色：电泳结束后，取出凝胶，推入EB染色液中，浸泡进行染色；
拍照：取出染色后的凝胶，用水冲洗胶体表面的染色液，将凝胶置于凝胶成像系统的样品板上，在紫外灯下观察并拍照记录电泳图谱；
(4)DNA片段回收
将无水乙醇加入到漂洗液PW中；
柱平衡步骤：向吸附柱CA2中加入平衡液BL，室温下离心，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
在凝胶成像系统紫外灯下将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量；
向胶块中加入等倍体积PN溶液，置于水浴中，其间不断上下翻转离心管，使胶块充分溶解；
将上一步所得溶液加入到一个吸附柱CA2中，室温放置，室温下离心，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；
向吸附柱CA2中加入漂洗液PW，室温下离心，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中，再重复一次此步骤。
进一步的，所述LV6-Epro0.5-LUC穿梭质粒同包装质粒一起转染293T细胞，进行慢病毒包装的步骤包括：
293T细胞在培养皿中培养至融合时，接种到新的培养皿；
弃去培养液，用D-Hank’s solution液洗涤细胞；
加入Trypsin-EDTA solution,混匀后，放置。
吸去胰酶溶液，加入含FBS的DMEM培养液，吹打混匀使细胞形成单细胞悬液；
将混匀的细胞悬液接种培养皿，加含FBS的DMEM培养液，晃动培养皿使细胞均匀铺满底部，移置培养箱培养；
在无菌的离心管中加入无血清DMEM，按比例加入穿梭质粒LV6-Epro0.5-LUC和包装质粒，充分混匀，取另一支无菌的离心管，加入无血清DMEM，再加入RNAi-mate，混匀，室温放置后将两管混合，室温静置。
去除培养皿中的培养液，加入无血清的DMEM培养液；
将转染混合物逐滴加入培养皿中，摇晃培养皿以混匀复合物，在培养箱中温育；
吸弃转染液，加入含FBS的DMEM培养液，继续培养；
将培养皿中细胞的上清液吸到离心管中，离心；
离心后，将离心管上清液倒入注射器内，用过滤器过滤；
滤液在离心机中进行超速离心；
将浓缩液收集分装至EP管中，取病毒液进行滴度检测；
余病毒液贴上信息标签，冰箱保存；
所述包装质粒包括pGag/Pol、pRev、以及pVSV-G。
进一步的，所述嘌呤霉素致死浓度筛选的步骤包括：
细胞生长密度至融合时，接种孔板；
用PBS洗涤细胞；
加入胰酶消化液,轻晃使其均匀覆盖细胞，置培养箱中消化；
加入新鲜完全培养基终止消化，离心后用完全培养基重悬成单细胞悬液；
计数后按细胞/孔的浓度接种孔板，均匀铺板后培养。
每孔加入嘌呤霉素；
维持puro浓度培养细胞，隔天换液，连续观察并拍照，选择能将细胞完全杀死的孔板的puro浓度作为最适puro浓度。
进一步的，所述LV6-Epro0.5-LUC慢病毒感染HepG2细胞的步骤包括：
从冰箱取出慢病毒原液，从冰箱取出polybrene置冰上融化；
细胞培养至融合时，弃旧培养基，PBS洗涤，消化离心，opti-MEM重悬，血球计数板计数；
将细胞悬液按细胞/孔的浓度分别加入到3个EP管；
取融化混匀的慢病毒原液加入第一个EP管中，吹打混匀后加入第二个EP管，再次吹打混匀后加入第三个EP管吹匀；
细胞在EP管培养，然后离心吸弃上清，再用含胎牛血清的DMEM培养基重悬，混匀后加入孔板；
将细胞继续培养，裂解细胞，检测荧光，观测慢病毒感染结果。
进一步的，所述建立Epro-LUC-HepG2单克隆稳转株的步骤包括：
HepG2细胞在培养皿中培养至融合时，按细胞/孔的浓度接种孔板，培养；
病毒原液按MOI值100感染细胞，感染后换成新鲜含胎牛血清的DMEM培养基继续培养；
将每孔的培养基更换成选择性培养基，所述选择性培养基含1.0μg/ml嘌呤霉素，维持嘌呤霉素浓度在选择压力下持续培养；
待长出大量多克隆细胞后，检测细胞荧光素酶活性，选择活性强的细胞进行扩大培养并冻存；
将扩大培养的多克隆细胞株消化离心制备成单细胞悬液，计数后调制细胞浓度，再逐级稀释，按不同浓度梯度分别接种孔板，维持嘌呤霉素浓度不变；
待细胞贴壁后，显微镜下观察并将含有单个细胞的培养孔进行标记，置于培养箱培养；
待长出单克隆细胞株后，挑取发育状态良好的单克隆细胞株送测序，并留取适量相应的单克隆细胞株进行荧光素酶检测；
选择测序结果正确且荧光读值最高的单克隆细胞株继续扩大培养,维持嘌呤霉素浓度，筛选出具有正常细胞周期且能稳定传代20代以上的单克隆细胞株，大量冻存，并命名为Epro-LUC-HepG2细胞，从而建立出Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型。
有益效果：EFTUD2蛋白可以通过剪接作用调节固有免疫信号通路中关键信号分子RIG-1、MDA5 mRNA的生成，从而影响干扰素刺激基因(ISGs)的生成来抑制HBV复制。本发明通过以EFTUD2为靶点建立稳定的化合物筛选细胞模型，可以供研究和发掘新的分子靶向药物。在该模型基础上筛选能够上调EFTUD2基因表达化合物，为HBV慢性感染患者尤其临床IFN-α治疗应答不佳患者提供更多的治疗选择。
附图说明
图1线性化重组LV6-Epro0.5-LUC载体图谱；
图2琼脂糖凝胶电泳鉴定LV6-Epro0.5-LUC重组载体；
图3重组LV6-Epro0.5-LUC载体测序结果。
具体实施方式
实施例1：本发明提出一种EFTUD2蛋白作为抑制HBV复制的物质的应用。进一步的，提出EFTUD2蛋白通过剪接作用调节固有免疫信号通路中关键信号分子RIG-1、MDA5 mRNA的生成，从而影响干扰素刺激基因ISGs的生成来抑制HBV复制的应用。
实施例2：本发明提出EFTUD2靶点建立稳定的化合物筛选细胞模型的应用。通过以EFTUD2为靶点建立稳定的化合物筛选细胞模型，可以供研究和发掘新的分子靶向药物。在该模型基础上筛选能够上调EFTUD2基因表达化合物，为HBV慢性感染患者尤其临床IFN-α治疗应答不佳患者提供更多的治疗选择。
实施例3：本发明提出一种以EFTUD2为靶点建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，包括如下步骤：
1.构建LV6-Epro0.5-LUC慢病毒载体
通过融合PCR技术将前期实验筛选出的具有最强启动活性的hEFTUD2pro-0.5kb启动子序列与萤火虫荧光素酶报告基因整合成融合基因，通过XbaI和BamHI双酶切将融合基因同源重组进LV6载体中构建LV6-Epro0.5-LUC穿梭质粒，重组质粒酶切鉴定结果见。重组质粒经测序验证正确无误后，同包装质粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)一起转染293T细胞，进行慢病毒包装并进行滴度检测。获得的慢病毒命名为LV6-Epro0.5-LUC慢病毒，如图1所示。
如图2所示，因LV6-Epro0.5-LUC重组载体采用XbaI和BamHI双酶切构建，Epro0.5-LUC融合基因中同时也存在一个BamHI酶切位点，在双酶切重组载体进行跑胶鉴定时，会产生3个酶切条带。
重组LV6-Epro0.5-LUC载体测序结果如图3所示。
2.建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型
在HepG2细胞上进行嘌呤霉素药物筛选浓度摸索，选出能够在6天内全部杀死HepG2细胞的最低嘌呤霉素浓度，作为后续细胞稳筛的使用浓度。用LV6-Epro0.5-LUC慢病毒感染HepG2细胞，感染后8小时换新鲜完全培养基继续培养24小时加入终浓度为1.0μg/ml的嘌呤霉素药筛。维持药物选择压力持续培养2周左右后，用长出的多克隆细胞通过有限稀释法挑选出5株单克隆细胞株，对5株细胞进行测序验证目的序列是否克隆进细胞基因组，并通过荧光素酶实验检测5株单克隆细胞株的荧光素酶活性，挑选出活性最高的细胞株进行扩大培养，建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型。
实施例:4：本发明提出一种建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，以EFTUD2为靶点，包括如下步骤：
1.融合PCR技术获得目的序列Epro0.5-LUC
第一轮PCR反应:分别获得hEFTUD2pro-0.5kb和LUC两段序列。
分别以前期PCR反应获得的hEFTUD2pro-0.5kb基因序列和Luciferase基因序列(Luciferase基因序列来自LV17载体上的序列，序列由吉玛公司合成并提供。)作为模板，经一轮PCR反应得到基因片段一hEFTUD2pro-0.5kb和基因片段二LUC。
PCR反应体系如下：
Epro0.5-LUC基因片段一：
Figure BDA0002613712490000071
Figure BDA0002613712490000081
Epro0.5-LUC基因片段二：
Luciferase 1μl
10×Pfu Buffer(+Mg<sup>2+</sup>) 5μl
dNTP 1μl
EpL-1F 1μl
EpL-CER 1μl
ddH<sub>2</sub>O 41μl
Pfu DNA polymerase 0.3μl
循环条件：
Figure BDA0002613712490000082
第一轮PCR反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收Epro0.5-LUC基因片段一和基因片段二。
用EpL-CEF和EpL-CER引物进行第二轮PCR反应，模板为第一轮PCR反应产物经电泳回收后的Epro0.5-LUC基因片段一和基因片段二。
PCR体系如下：
Figure BDA0002613712490000083
Figure BDA0002613712490000091
第二轮PCR反应循环条件与第一轮PCR反应相同，通过2轮PCR反应可获得单一的目的Epro0.5-LUC条带。
进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收Epro0.5-LUC的PCR产物。
2.构建LV6-Epro-LUC重组慢病毒
2.1构建LV6-Epro-LUC穿梭质粒
2.1.1LV6载体双酶切
用XbaI和BamHI对LV6载体进行双酶切，37℃酶切2小时，酶切体系如下：
10×Buffer 5μl
LV6 5μl
XbaI 1μl
BamHI 1μl
ddH<sub>2</sub>O 38μl
进行琼脂糖凝胶电泳，然后用DNA凝胶回收试剂盒回收载体psiCHECK-2和载体LV6条带。
如图2所示，因LV6-Epro0.5-LUC重组载体采用XbaI和BamHI双酶切构建，Epro0.5-LUC融合基因中同时也存在一个BamHI酶切位点，在双酶切重组载体进行跑胶鉴定时，会产生3个酶切条带。
2.1.2目的序列克隆到线性LV6载体
利用
Figure BDA0002613712490000092
Entry One Step Cloning Kit试剂盒，将扩增回收好的Epro0.5-LUC目的片段，重组克隆到线性化的LV6载体中。
反应体系如下：
Figure BDA0002613712490000093
Figure BDA0002613712490000101
使用移液器上下吹打反应体系数次，轻轻混匀各组分。置于37℃恒温箱中反应30min。反应完成后立即将反应管置于冰水浴中，冷却5min。
2.1.3琼脂糖凝胶电泳
2.1.3.1将适量的DNA与10╳DNA loading Buffer按9:1体积混合，每个加样槽加入10μl样品。
2.1.3.2加样后接通电源进行电泳，控制电场强度不高于5V/cm(电压值V/电泳板两极之间距离cm)，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳。
2.1.3.3染色：电泳结束后，小心取出凝胶，轻轻推入EB染色液(浓度为0.5ug/ml)中，室温下浸泡30min进行染色。
2.1.3.4拍照：取出染色后的凝胶，用水轻轻冲洗胶体表面的染色液，将凝胶置于凝胶成像系统的样品板上，在紫外灯下观察并拍照记录电泳图谱。
2.1.4DNA片段回收
操作步骤：
使用前先按说明将无水乙醇加入到漂洗液PW中。
2.1.4.1柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL，12,000rpm室温下离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2.1.4.2在凝胶成像系统紫外灯下将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量减少切入的不含目的条带的多余凝胶)放入干净的离心管中，称取重量。
2.1.4.3向胶块中加入等倍体积PN溶液(按0.1g凝胶加入100μl的PN溶液)，置于50℃水浴中，其间不断轻轻上下翻转离心管，使胶块充分溶解。(若胶块的体积过大，可先将胶块切成碎块)。
2.1.4.4将上一步所得溶液加入到一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，
12,000rpm室温下离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
2.1.4.5向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm室温下离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中，再重复一次此步骤。
2.2LV6-Epro-LUC慢病毒包装
包装步骤：
2.2.1 293T细胞在10cm培养皿中培养至80-90％融合时，接种到新的15cm培养皿。
2.2.2弃去培养液，用1ml D-Hank’s solution液洗涤细胞两次。
2.2.3加入1ml Trypsin-EDTA solution,混匀后，37℃放置2-3分钟。
2.2.4小心吸去胰酶溶液，加入2ml含10％FBS的DMEM培养液，吹打混匀使细胞形成单细胞悬液。
2.2.5将混匀的细胞悬液接种15cm培养皿，加18ml含10％FBS的DMEM培养液，上下左右晃动培养皿使细胞均匀铺满底部，移置37℃ 5％CO2培养箱培养过夜。
2.2.6在一支无菌的5ml离心管中加入1.5ml无血清DMEM，按比例加入穿梭质粒LV6-Epro0.5-LUC和包装质粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)，充分混匀，取另一支无菌的5ml离心管，加入1.5ml无血清DMEM，再加入300μl RNAi-mate，混匀，室温放置5分钟后将两管混合，室温静置20～25分钟。
2.2.7去除15cm培养皿中的培养液，加入8ml无血清的DMEM培养液。
2.2.8将转染混合物逐滴加入15cm培养皿中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物，在37℃ 5％CO2培养箱中温育4-6小时。
2.2.9吸弃转染液，加入18ml含10％FBS的DMEM培养液。37℃ 5％CO2继续培养72小时。
2.2.10将培养皿中细胞的上清液吸到50ml离心管中，4℃，4000rpm，离心4min。
2.2.11低速离心后，将离心管上清液倒入50ml注射器内，用0.45um过滤器过滤。
2.2.12滤液在离心机中进行超速离心，4℃，20000rpm，离心2h。
2.2.13将浓缩液收集分装至EP管中，取适量病毒液进行滴度检测。
2.2.14余病毒液贴上信息标签，-80℃冰箱保存。
3.嘌呤霉素致死浓度筛选
3.1细胞生长密度至80-90％融合时，接种24孔板。
3.2用PBS洗涤细胞两次。
3.3加入2ml胰酶消化液,轻晃使其均匀覆盖细胞，置37℃ CO2培养箱中消化2min。
3.4加入2ml新鲜完全培养基终止消化，离心后用1ml完全培养基重悬成单细胞悬液。
3.5计数后按5×104个细胞/孔的浓度接种24孔板，每孔液体总量500μl，均匀铺板后于37℃ 5％CO2条件下培养24小时。
3.6每孔加入嘌呤霉素，终浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9 2.0、2.1、2.2、2.3、2.4ug/ml。
3.7维持puro浓度培养细胞，隔天换液，连续观察6天并拍照，选择能将细胞完全杀死的最适puro浓度。
4.LV6-Epro-LUC慢病毒感染HepG2细胞
4.1从-80℃冰箱取出慢病毒原液，从-20℃冰箱取出polybrene置冰上融化。
4.2细胞培养至80-90％融合时，弃旧培养基，PBS洗3次，消化离心，opti-MEM重悬，血球计数板计数。
4.3将细胞悬液按1×104细胞/孔的浓度分别加入到3个1.5ml EP管，每管液体总体积180μl。
4.4取融化混匀的慢病毒原液20μl加入第一个1.5ml EP管中，吹打混匀后吸取20μl加入第二个1.5ml EP管，再次吹打混匀后吸取20μl加入第三个1.5ml EP管吹匀，
即慢病毒稀释比例为1:10:100:1000，并加入终浓度为5ug/mL的Polybrene。
4.5细胞在1.5ml EP管于37℃ 5％CO2条件下培养24小时，然后离心吸弃上清，再用200μl含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬，混匀后加入48孔板。
4.6将细胞置于37℃ 5％CO2条件下继续培养72小时，裂解细胞，检测荧光，观测慢病毒感染结果。
5.5.建立Epro-LUC-HepG2单克隆稳转株
5.1HepG2细胞在10cm培养皿中培养至80-90％融合时，按1×104细胞/孔的浓度接种48孔板，于37℃ 5％CO2培养24小时。
5.2病毒原液按MOI值100感染细胞，感染8个小时后换成新鲜含10％胎牛血清的DMEM培养基继续置于37℃ 5％CO2条件下培养24小时。
10.3将每孔的培养基更换成选择性培养基(含1.0μg/ml嘌呤霉素)，每隔2-3天换一次液，维持嘌呤霉素浓度在选择压力下持续培养2周左右。
5.4待长出大量多克隆细胞后，检测细胞荧光素酶活性，选择活性强的细胞进行扩大培养并冻存。
5.5将扩大培养的多克隆细胞株消化离心制备成单细胞悬液，计数后将细胞浓度调制为5000cells/ml，再逐级稀释成1000cells/ml，100cells/ml，50cells/ml，20cells/ml，10cells/ml，5cells/ml。按不同浓度梯度分别接种96孔板，每孔细胞悬液100μl，维持嘌呤霉素浓度不变。
5.6待细胞贴壁后，显微镜下观察并将含有单个细胞的培养孔进行标记，置于37℃5％CO2培养箱培养。
5.7待长出单克隆细胞株后(约15-20天)，挑取发育状态良好的5株细胞送测序，并留取适量相应的细胞进行荧光素酶检测。
5.8选择测序结果正确且荧光读值最高的细胞株继续扩大培养,维持嘌呤霉素浓度，筛选出具有正常细胞周期且能稳定传代20代以上的单克隆细胞株，大量冻存，并命名为Epro-LUC-HepG2细胞，从而建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型。

Claims (10)

1.EFTUD2蛋白作为抑制HBV复制的物质的应用，EFTUD2蛋白通过剪接作用调节固有免疫信号通路中关键信号分子RIG-1、MDA5 mRNA的生成，从而影响干扰素刺激基因ISGs的生成来抑制HBV复制的应用。
2.EFTUD2靶点建立稳定的化合物筛选细胞模型的应用。
3.一种建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，其特征在于以EFTUD2为靶点，包括如下步骤：
步骤S1、融合PCR技术获得目的序列Epro0.5-LUC
通过融合PCR技术将hEFTUD2pro-0.5kb启动子序列与萤火虫荧光素酶报告基因整合成融合基因；
步骤S2、构建LV6- Epro-LUC重组慢病毒
通过XbaI和BamHI双酶切将融合基因同源重组进LV6载体中构建LV6-Epro0.5-LUC穿梭质粒，LV6-Epro0.5-LUC穿梭质粒同包装质粒一起转染293T细胞，进行慢病毒包装，并进行滴度检测，获得LV6-Epro0.5-LUC慢病毒；
步骤S3、LV6-Epro0.5-LUC慢病毒感染HepG2细胞
用LV6-Epro0.5-LUC慢病毒感染HepG2细胞，感染后换新鲜完全培养基继续培养；
步骤S4、建立Epro-LUC-HepG2单克隆稳转株
对长出的多克隆细胞通过有限稀释法挑选出单克隆细胞株，对单克隆细胞株进行测序验证目的序列是否克隆进细胞基因组，并通过荧光素酶实验检测单克隆细胞株的荧光素酶活性，挑选出活性最高的细胞株进行扩大培养，建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型。
4.根据权利要求3所述的建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，其特征在于：还包括嘌呤霉素致死浓度筛选的步骤，筛选出能够完全杀死HepG2细胞的最适puro 浓度；
步骤S4中所述有限稀释法所采用的培养基为能够完全杀死HepG2细胞的最适puro 浓度培养基。
5.根据权利要求3所述的建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，其特征在于：步骤S1包括第一轮PCR反应和第二轮PCR反应，通过2轮PCR反应获得单一的目的Epro0.5-LUC条带；
第一轮PCR反应:分别获得hEFTUD2pro-0.5kb和LUC两段序列；
分别以前期PCR反应获得的hEFTUD2pro-0.5kb基因序列和Luciferase基因序列作为模板，经一轮PCR反应得到基因片段一hEFTUD2pro-0.5kb和基因片段二LUC；
第一轮PCR反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收Epro0.5-LUC基因片段一hEFTUD2pro-0.5kb和基因片段二LUC；
第一轮PCR反应:用EpL-CEF和EpL-CER引物进行第二轮PCR反应，模板为第一轮PCR反应产物经电泳回收后的Epro0.5-LUC基因片段一hEFTUD2pro-0.5kb和基因片段二LUC；
所述片段一hEFTUD2pro-0.5kb为hEFTUD2pro-0.5kb启动子序列；
所述基因片段二LUC为萤火虫荧光素酶报告基因；
所述Epro0.5-LUC条带为整合成的融合基因。
6.根据权利要求3所述的建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，其特征在于：
通过XbaI和BamHI双酶切将融合基因同源重组进LV6载体中构建LV6-Epro0.5-LUC穿梭质粒的步骤包括：
（1）LV6载体双酶切
用XbaI和BamHI对LV6载体在酶切体系下进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，然后用DNA凝胶回收试剂盒回收载体psiCHECK-2和载体LV6条带；
（2）目的序列克隆到线性LV6载体
利用ClonExpress® Entry One Step Cloning Kit试剂盒，在反应体系下将扩增回收好的Epro0.5-LUC目的片段，重组克隆到线性化的LV6载体中；使用移液器上下吹打反应体系数次，混匀各组分，置于恒温箱中反应，反应完成后将反应管置于冰水浴中，冷却；
（3）琼脂糖凝胶电泳
将DNA与10╳ DNA loading Buffer按比例混合，每个加样槽加入样品；
加样后接通电源进行电泳，控制电场强度，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿处时,停止电泳；
染色：电泳结束后，取出凝胶，推入EB染色液中，浸泡进行染色；
拍照：取出染色后的凝胶，用水冲洗胶体表面的染色液，将凝胶置于凝胶成像系统的样品板上，在紫外灯下观察并拍照记录电泳图谱；
（4）DNA片段回收
将无水乙醇加入到漂洗液PW中；
柱平衡步骤：向吸附柱CA2中加入平衡液BL，室温下离心，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
在凝胶成像系统紫外灯下将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量；
向胶块中加入等倍体积PN溶液，置于水浴中，其间不断上下翻转离心管，使胶块充分溶解；
将上一步所得溶液加入到一个吸附柱CA2中，室温放置，室温下离心，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；
向吸附柱CA2中加入漂洗液PW，室温下离心，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中，再重复一次此步骤。
7.根据权利要求3所述的建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，其特征在于所述LV6-Epro0.5-LUC穿梭质粒同包装质粒一起转染293T细胞，进行慢病毒包装的步骤包括：
293T细胞在培养皿中培养至融合时，接种到新的培养皿；
弃去培养液，用D-Hank’s solution液洗涤细胞；
加入Trypsin-EDTA solution, 混匀后，放置；
吸去胰酶溶液，加入含FBS的DMEM培养液，吹打混匀使细胞形成单细胞悬液；
将混匀的细胞悬液接种培养皿，加含FBS的DMEM培养液，晃动培养皿使细胞均匀铺满底部，移置培养箱培养；
在无菌的离心管中加入无血清DMEM，按比例加入穿梭质粒LV6-Epro0.5-LUC和包装质粒，充分混匀，取另一支无菌的离心管，加入无血清DMEM，再加入RNAi-mate，混匀，室温放置后将两管混合，室温静置；
去除培养皿中的培养液，加入无血清的DMEM培养液；
将转染混合物逐滴加入培养皿中，摇晃培养皿以混匀复合物，在培养箱中温育；
吸弃转染液，加入含FBS的DMEM培养液，继续培养；
将培养皿中细胞的上清液吸到离心管中，离心；
离心后，将离心管上清液倒入注射器内，用过滤器过滤；
滤液在离心机中进行超速离心；
将浓缩液收集分装至EP管中，取病毒液进行滴度检测；
余病毒液贴上信息标签，冰箱保存；
所述包装质粒包括pGag/Pol、pRev、以及pVSV-G。
8.根据权利要求4所述的建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，其特征在于所述嘌呤霉素致死浓度筛选的步骤包括：
细胞生长密度至融合时，接种孔板；
用PBS洗涤细胞；
加入胰酶消化液,轻晃使其均匀覆盖细胞，置培养箱中消化；
加入新鲜完全培养基终止消化，离心后用完全培养基重悬成单细胞悬液；
计数后按细胞/孔的浓度接种孔板，均匀铺板后培养；
每孔加入嘌呤霉素；
维持 puro 浓度培养细胞，隔天换液，连续观察并拍照，选择能将细胞完全杀死的孔板的puro 浓度作为最适 puro 浓度。
9.根据权利要求3所述的建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，其特征在于所述LV6- Epro0.5-LUC慢病毒感染HepG2细胞的步骤包括：
从冰箱取出慢病毒原液，从冰箱取出polybrene置冰上融化；
细胞培养至融合时，弃旧培养基，PBS洗涤，消化离心，opti-MEM重悬，血球计数板计数；
将细胞悬液按细胞/孔的浓度分别加入到3个EP管；
取融化混匀的慢病毒原液加入第一个EP 管中，吹打混匀后加入第二个EP 管，再次吹打混匀后加入第三个EP管吹匀；
细胞在EP管培养，然后离心吸弃上清，再用含胎牛血清的DMEM培养基重悬，混匀后加入孔板；
将细胞继续培养，裂解细胞，检测荧光，观测慢病毒感染结果。
10.根据权利要求3所述的建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，其特征在于所述建立Epro-LUC-HepG2单克隆稳转株的步骤包括：
HepG2细胞在培养皿中培养至融合时，按细胞/孔的浓度接种孔板，培养；
病毒原液按MOI值100感染细胞，感染后换成新鲜含胎牛血清的DMEM培养基继续培养；
将每孔的培养基更换成选择性培养基，所述选择性培养基含1.0μg/ml嘌呤霉素，维持嘌呤霉素浓度在选择压力下持续培养；
待长出大量多克隆细胞后，检测细胞荧光素酶活性，选择活性强的细胞进行扩大培养并冻存；
将扩大培养的多克隆细胞株消化离心制备成单细胞悬液，计数后调制细胞浓度，再逐级稀释，按不同浓度梯度分别接种孔板，维持嘌呤霉素浓度不变；
待细胞贴壁后，显微镜下观察并将含有单个细胞的培养孔进行标记，置于培养箱培养；
待长出单克隆细胞株后，挑取发育状态良好的单克隆细胞株送测序，并留取适量相应的单克隆细胞株进行荧光素酶检测；
选择测序结果正确且荧光读值最高的单克隆细胞株继续扩大培养,维持嘌呤霉素浓度，筛选出具有正常细胞周期且能稳定传代20代以上的单克隆细胞株，大量冻存，并命名为Epro-LUC-HepG2细胞，从而建立出Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型。
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