CN110305866A - 利用Cas9技术构建EFTUD2单等位基因敲除的HepG2.2.15细胞株的方法 - Google Patents

利用Cas9技术构建EFTUD2单等位基因敲除的HepG2.2.15细胞株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用Cas9技术构建EFTUD2单等位基因敲除的HepG2.2.15细胞株的方法。利用Ⅱ型CRISPR/Cas9系统，以EFTUD2基因外显子exon3为待敲位点设计合成两条sgRNA并构建质粒载体，将两条质粒载体电转入HepG2.2.15细胞中，经流式分选单克隆培养，获得EFTUD2单等位基因敲除HepG2.2.15细胞模型。本发明的建立的EFTUD2单等位基因敲除HepG2.2.15细胞株，对于研究EFTUD2基因在抵抗HBV感染中的作用及其作用机制具有重要意义。

Description

利用Cas9技术构建EFTUD2单等位基因敲除的HepG2.2.15细胞 株的方法
技术领域
本发明涉及生物基因技术领域，尤其涉及一种利用Cas9技术构建EFTUD2单等位基因敲除的HepG2.2.15细胞株的方法。
背景技术
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeatsequences，成簇的、规律间隔的短回文重复序列)是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种用于记忆外界病毒入侵的适应性免疫防御系统。工作原理是CRISPR-derived RNA(crRNA)通过碱基配对与 tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合体，此复合体招募CRISPR内切酶聚集于crRNA配对的序列靶位点处，并且对靶位点DNA双链进行切割。CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种Cas蛋白内切酶(CRISPR-associated protein, CRISPR相关蛋白)共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas9蛋白即可，应用最为广泛。Ⅱ型CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白、sgRNA (short guide RNA，小向导RNA)及PAM(protospacer adjacent motif，前间区序列邻近基序)组成。Cas9蛋白含有两个核酸内切酶结构域，可以分别切割DNA两条单链；sgRNA(short guideRNA,小向导RNA) 是对细菌中tracrRNA/crRNA进行人工改造形成的具有引导作用的 RNA；PAM是位于Cas9靶点DNA的3’端前间区序列邻近基序起到指导Cas9蛋白搜索靶点DNA的作用。Ⅱ型CRISPR/Cas9系统的工作原理如下：Cas9首先与sgRNA结合形成复合物，然后通过PAM 序列结合并侵入DNA，sgRNA与靶点DNA结合形成Cas9蛋白 -sgRNA-DNA复合结构，进而介导cas9蛋白对目的DNA双链进行定点切割，使DNA双链断裂。利用CRISPR/Cas9技术可快速、准确地对细胞进行遗传改造。
宿主基因转录后调控即前体mRNA剪接(pre-mRNA splicing) 所导致的固有免疫相关蛋白差异性表达在机体抵抗外来病毒感染入侵时起到了至关重要的作用。延伸因子结合蛋白2(Elongation factor Tu GTP-binding domain-containing protein 2,EFTUD2)作为GTP水解酶的一种，它是成熟剪切体(spliceosome)组装过程中不可缺少的成分。既往研究中发现EFTUD2可以通过调节固有免疫信号通路中多种关键信号分子的合成发挥抗病毒作用。在巨噬细胞中EFTUD2 可以通过对髓样分化因子(myeloid differentiationfactor88,MyD88) mRNA可变性剪接，调控促进LPS诱导的白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)的生成。登革热病毒NS5蛋白可以通过与EFTUD2结合阻断EFTUD2引起的基因剪接，逃避宿主细胞免疫反应。
申请人在前期研究中发现EFTUD2可以通过mRNA剪接作用调节视黄酸诱导基因蛋白I(retinoic acid-inducible gene I,RIG-I)、黑色素瘤分化相关抗原5(Melanomadifferentiation-associated protein 5, MDA5)的合成，从而抑制HCV的复制，发挥抗病毒作用。然而HBV 研究领域对于EFTUD2研究较少。
HepG2.2.15细胞是整合有HBV全基因组DNA的肝癌细胞系，可在体外培养条件下进行无限增值，长期稳定地分泌HBeAg、 HBsAg、完整的Dane颗粒和HBV复制中间体DNA和RNA，可以模拟慢性乙型肝炎复制状态，是慢性乙型肝炎研究领域广泛应用的有效模型。
目前尚未见到关于构建敲除HepG2.2.15细胞株EFTUD2基因的研究和报道。有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种 CRISPR/Cas9基因编辑技术构建EFTUD2单等位基因敲除的 HepG2.2.15细胞株的方法，用于研究EFTUD2是否具有调控IFN抗 HBV效应。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
提供一种利用Cas9技术构建EFTUD2单等位基因敲除的 HepG2.2.15细胞株的方法，该方法包括以下步骤：
(1)靶点设计：选取EFTUD2基因中可兼顾多个转录本的公共编码区的3号外显子为待敲位点，进行靶点设计，得到SEQ ID NO.2 所示的靶点序列及SEQ ID NO.3所示的sgRNA序列，并设计合成 EFTUD2 sgRNA1 oligo F/R和EFTUD2 sgRNA2 oligo F/R；
(2)鉴定引物合成：针对靶点上下游200～400bp区域分别设计并合成SEQ ID NO.5所示的正反向PCR鉴定引物EFTUD2-F/R；
(3)载体构建：采用携带Cas9的真核表达PX458质粒，采用限制性内切酶Bbs I酶切PX458质粒，并利用T4连接酶将EFTUD2 sgRNA1 oligoF/R、EFTUD2 sgRNA1 oligoF/R导入PX458质粒，构建PX458-EFTUD2 sgRNA1质粒载体、X458-EFTUD2 sgRNA2质粒载体；
(4)质粒转染：提取PX458-EFTUD2 sgRNA1质粒载体、 X458-EFTUD2 sgRNA2质粒载体转染HepG2.2.15细胞，并将转染后的HepG2.2.15细胞加入到细胞培养皿中培养；
(5)流式分选：转染后48小时胰酶消化收集细胞，将细胞分散为单细胞悬液，使用流式细胞仪以绿色荧光蛋白为信号进行分选；
(6)单克隆逐步扩大培养：分选收集的绿色荧光蛋白阳性细胞以1细胞/孔的密度接种至96孔板，4天换液一次，培养2周，成活的细胞长成单克隆细胞团，消化传至48孔板，逐步扩大培养；
(7)鉴定：各克隆基因组DNA，利用SEQ ID NO.5所示的鉴定引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定；通过与基因原序列比对筛选出EFTUD2基因敲除的阳性克隆株；提取细胞总蛋白，并采用Western-blotting鉴定EFTUD2蛋白的表达。
作为可选的技术方案，步骤(1)还包括：在NCBI、ENSEMBLE 数据库中检索EFTUD2基因信息；找到EFTUD2基因的蛋白质编码区，分析相应的基因组结构，明确蛋白质编码区的外显子部分。
作为可选的技术方案，步骤(3)包括：
3.1采用携带Cas9的真核表达PX458质粒，该质粒带有绿色荧光蛋白筛选标记，利用限制性内切酶Bbs I酶切PX458质粒，琼脂糖凝胶电泳并回收酶切的PX458质粒，待用；
3.2利用T4连接酶分别将EFTUD2 sgRNA1 oligo F/R、EFTUD2 sgRNA1 oligoF/R导入PX458质粒，构建PX458-EFTUD2 sgRNA1质粒载体、X458-EFTUD2 sgRNA2质粒载体；
3.3利用热激法将连接产物转入感受态大肠杆菌中，并涂布 Amp+抗性的LB平板，成功得到单克隆菌落；
3.4进行平板克隆测序，筛选连接正确的阳性克隆菌落；以及
3.5将阳性克隆菌落扩大，抽提质粒保存于-20℃，待用。
作为可选的技术方案，步骤(4)包括：
4.1准备HepG2.2.15细胞，将HepG2.2.15细胞以5×105/孔的密度铺至6孔板，培养24小时待用；以及
4.2转染，细胞量达80％时，消化离心细胞，将HepG2.2.15单细胞悬液加入lipo3000脂质体、PX458-EFTUD2 sgRNA1质粒载体、PX458-EFTUD2 sgRNA2质粒载体的混合物中，重悬混匀；并对混合物进行电转，并将电转杯中的HepG2.2.15细胞吸出，加入到细胞培养皿中培养。
作为可选的技术方案，步骤4.2还包括：使用Bio-Rad公司的电转仪，在200V、500uF、4mm电转杯的条件下，将HepG2.2.15单细胞悬液加入lipo3000脂质体、PX458-EFTUD2sgRNA1质粒载体、 PX458-EFTUD2 sgRNA2质粒载体的混合物加入电转杯中，电击一次；轻轻将电转杯中的HepG2.2.15细胞吸出，加入到细胞培养皿中培养。
与现有技术相比，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑系统首次从HepG2.2.15细胞株敲除EFTUD2单等位基因，简便、快速、可作为理想的细胞模型，研究宿主EFTUD2基因在抵抗HBV感染中的作用。
附图说明
图1为EFTUD2基因待敲位点选择示意图；
图2为sgRNA序列的示意图；
图3为Cas9系统EFTUD2基因敲除模式示意图：
图4为HepG2.2.15细胞EFTUD2单等位基因敲除后琼脂糖凝胶电泳鉴定结果的示意图；
图5A和图5B为HepG2.2.15细胞EFTUD2单等位基因敲除后测序鉴定结果的示意图；
图6为HepG2.2.15细胞EFTUD2单等位基因敲除后蛋白水平鉴定的示意图。
具体实施方式
本发明提供一种利用Cas9技术(即CRISPR/Cas9基因编辑技术) 构建EFTUD2单等位基因敲除的HepG2.2.15细胞株的方法，该方法包括以下步骤：
步骤(1)靶点设计：选取EFTUD2基因中可兼顾多个转录本的公共编码区的3号外显子为待敲位点，进行靶点设计，得到SEQ ID NO.2所示的靶序列及SEQ ID NO.3所示的sgRNA序列，并设计合成 EFTUD2sgRNA1oligo F/R和EFTUD2sgRNA2oligo F/R；其中，具体的步骤(1)还包括：在NCBI、ENSEMBLE数据库中检索EFTUD2 基因(NCBI GeneID：9343)信息；找到EFTUD2基因的蛋白质编码区，分析相应的基因组结构，明确蛋白质编码区的外显子部分。
步骤(2)鉴定引物合成：针对靶点上下游200～400bp区域分别设计并合成SEQ IDNO.5所示的正反向PCR鉴定引物EFTUD2-F/R。
步骤(3)载体构建：采用携带Cas9的真核表达PX458质粒，采用限制性内切酶Bbs I酶切PX458质粒，并利用T4连接酶将 EFTUD2 sgRNA1 oligoF/R、EFTUD2 sgRNA1 oligoF/R导入PX458 质粒，构建PX458-EFTUD2 sgRNA1质粒载体、X458-EFTUD2 sgRNA2质粒载体；
而且步骤(3)具体包括以下步骤：
3.1采用携带Cas9的真核表达PX458质粒，该质粒带有绿色荧光蛋白筛选标记，利用限制性内切酶Bbs I酶切PX458质粒，琼脂糖凝胶电泳并回收酶切的PX458质粒，待用；
3.2利用T4连接酶分别将EFTUD2 sgRNA1 oligo F/R、EFTUD2 sgRNA1 oligoF/R导入PX458质粒，构建PX458-EFTUD2 sgRNA1质粒载体、X458-EFTUD2 sgRNA2质粒载体；
3.3利用热激法将连接产物转入感受态大肠杆菌中，并涂布 Amp+抗性的LB平板，成功得到单克隆菌落；
3.4进行平板克隆测序，筛选连接正确的阳性克隆菌落；以及
3.5将阳性克隆菌落扩大，抽提质粒保存于-20℃，待用。
步骤(4)质粒转染：
提取PX458-EFTUD2 sgRNA1质粒载体、X458-EFTUD2 sgRNA2 质粒载体转染HepG2.2.15细胞，并将转染后的HepG2.2.15细胞加入到细胞培养皿中培养；
步骤(4)具体包括以下步骤：
4.1准备HepG2.2.15细胞，将HepG2.2.15细胞以5×105/孔的密度铺至6孔板，培养24小时待用；以及
4.2转染，细胞量达80％时，消化离心细胞，将HepG2.2.15单细胞悬液加入lipo3000脂质体、PX458-EFTUD2 sgRNA1质粒载体、 PX458-EFTUD2 sgRNA2质粒载体的混合物中，重悬混匀；并对混合物进行电转，并将电转杯中的HepG2.2.15细胞吸出，加入到细胞培养皿中培养。
而且步骤4.2具体的为：使用Bio-Rad公司的电转仪，在200V、 500uF、4mm电转杯的条件下，将HepG2.2.15单细胞悬液加入 lipo3000脂质体、PX458-EFTUD2 sgRNA1质粒载体、PX458-EFTUD2 sgRNA2质粒载体的混合物加入电转杯中，电击一次；轻轻将电转杯中的HepG2.2.15细胞吸出，加入到细胞培养皿中培养。
步骤(5)流式分选：转染后6小时更换为完全培养基，转染后 48小时胰酶消化收集细胞，将细胞分散为单细胞悬液，使用流式细胞仪以绿色荧光蛋白为信号进行分选；
步骤(6)单克隆逐步扩大培养：分选收集的绿色荧光蛋白阳性细胞以1细胞/孔的密度接种至96孔板，4天换液一次，培养2周，成活的细胞长成单克隆细胞团，消化传至48孔板，逐步扩大培养；
步骤(7)鉴定：各克隆基因组DNA，利用SEQ ID NO.5所示的鉴定引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定；通过与基因原序列比对筛选出EFTUD2基因敲除的阳性克隆株；提取细胞总蛋白，并采用Western-blotting鉴定EFTUD2蛋白的表达。
为使对本发明的目的、构造、特征、及其功能有进一步的了解，以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以以举例形式进行说明，如有未详尽之处，可以参见常用的实验手册以及所用试剂和仪器的厂商说明书。其中，所有化学试剂均采用分析级，实验用水经Milli-XQ过滤，各试剂均和材料可以商用渠道获得，具体而言：
一、主要实验材料
二、仪器
具体实施例如下：
实施例1
(1)HepG2.2.15细胞针对EFTUD2基因的靶点设计
首先在NCBI、ENSEMBLE数据库中检索EFTUD2基因(NCBI GeneID：9343)信息，找到该基因CDS区(Sequence coding for aminoacids in protein，蛋白质编码区)，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分，并选取EFTUD2基因中位置较靠前，且可兼顾多个转录本的公共外显子3号外显子(exon3)，即选取 EFTUD2-202转录本(序列见SEQ ID NO.1)exon3(序列见SEQ ID NO.4，ENSE00003756120)为待敲位点，如图1所示，图1为EFTUD2 基因待敲位点选择示意图。将exon3序列输入sgRNA设计的软件中 (http://crispr.mit.edu/)，进行设计运算，获得SEQ ID NO.2所示的靶点序列及SEQ ID NO.3所示的sgRNA序列。选择off-target(脱靶) 较少的两条sgRNA1、sgRNA2，分别设计合成EFTUD2 sgRNA1和 sgRNA2oligo F/R，如图2所示，图2为sgRNA序列的示意图。上述靶点序列特异性好，不易脱靶，敲除效率高。具体的，靶点序列如下：
靶点1：CCCTGGGATGGAGGTGGTGC
靶点2：CAGGTACATCAGGAGGACAT
另外，根据靶基因的基因序列，加入与载体连接的碱基序列后，设计合成sgRNA序列为如下：
EFTUD2sgRNA1-F：5’-CACCGGCACCACCTCCATCCCAGGG-3’
EFTUD2sgRNA1-R：5’-AAACCCCTGGGATGGAGGTGGTGCC-3’
EFTUD2sgRNA2-F：5’-CACCGGCAGGTACATCAGGAGGACA-3’
EFTUD2sgRNA2-R：5’-AAACATGTCCTCCTGATGTACCTGCC-3’
另外，请参见图3，图3所示为Cas9系统EFTUD2基因敲除模式示意图，Cas9作用靶点位于EFTUD2基因3号外显子，碱基11、 11’为靶点序列，碱基12、12’为PAM序列，碱基13、13’为sgRNA 中与靶点结合的序列。
(2)鉴定引物合成：针对靶点上下游200～400bp或约200～400bp 区域分别设计并合成SEQ ID NO.5所示的正反向PCR鉴定引物。其中，PCR鉴定引物序列(如SEQ ID NO.5所示)如下：
EFTUD2-F：GTAAAGGGCT GTGCTGTGAT 20
EFTUD2-R：AACGACAGTC TTCATGCACC 20
(3)PX458-EFTUD2 sgRNA质粒载体构建：
3.1采用携带Cas9的真核表达质粒PX458载体，该质粒带有绿色荧光蛋白(GFP)筛选标记。利用限制性内切酶Bbs I酶切PX458 质粒，琼脂糖凝胶电泳并回收酶切的PX458质粒，待用；
3.2连接：利用T4连接酶分别将EFTUD2 sgRNA1 oligo、EFTUD2 sgRNA2 oligo导入PX458质粒；
3.3转化：利用热激法将步连接产物转入感受态大肠杆菌中，并涂布Amp+抗性的LB平板，成功得到单克隆菌落；
3.4进行平板克隆测序，筛选连接正确的阳性克隆菌落；
3.5将阳性克隆菌落扩大，抽提质粒，获得PX458-EFTUD2 sgRNA1质粒载体、PX458-EFTUD2 sgRNA2质粒载体，保存于-20℃备用。
(4)PX458-EFTUD2 sgRNA1、PX458-EFTUD2 sgRNA2质粒转染：
4.1准备生长状态良好的HepG2.2.15细胞，将HepG2.2.15细胞以5×105/孔的密度铺至6孔板，培养24小时待用；
4.2转染，细胞量达80％时，消化离心细胞。将HepG2.2.15单细胞悬液加入lipo3000脂质体、PX458-EFTUD2 sgRNA1质粒载体、 PX458-EFTUD2 sgRNA2质粒载体的混合物中，重悬混匀。
且在转染过程中，使用Bio-Rad公司的电转仪，在200V、500uF、 4mm电转杯的条件下，将HepG2.2.15单细胞悬液加入lipo3000脂质体、PX458-EFTUD2 sgRNA1质粒载体、PX458-EFTUD2 sgRNA2 质粒载体的混合物加入电转杯中，电击一次；轻轻将电转杯中的HepG2.2.15细胞吸出，加入到细胞培养皿中培养。
(5)流式分选
转染后6小时将培养基更换为完全DMEM培养基，转染后48 小时胰酶消化收集细胞，将细胞分散为单细胞悬液，使用流式细胞仪以GFP(Green fluorescent protein，绿色荧光蛋白)为信号进行分选。
(6)单克隆逐步扩大培养：
分选收集的绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞以1细胞/孔的密度接种至96孔板，4天换液一次，培养2周，成活的细胞长成单克隆细胞团，消化传至48孔板，逐步扩大培养，共得到43个存活单克隆株。
(5)鉴定：
各克隆基因组DNA，利用SEQ ID NO.5所示的鉴定引物进行 PCR扩增，将PCR扩增产物提取细胞DNA进行琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定；通过与基因原序列比对筛选出EFTUD2基因敲除的阳性克隆株；提取细胞总蛋白，并采用Western-blotting鉴定EFTUD2蛋白的表达。具体的，请参见图4，图4所示为HepG2.2.15细胞EFTUD2 单等位基因敲除后琼脂糖凝胶电泳鉴定结果的示意图，琼脂糖凝胶电泳结果显示：第39株为杂合子(EFTUD2+/-)，长片段条带为野生型染色体，短片段条带为突变型染色体；第38、40株为混杂克隆；其余均为野生型(WT)。
请继续参见图5A和图5B，图5A和图5B为HepG2.2.15细胞 EFTUD2单等位基因敲除后测序鉴定结果的示意图，第39株 HepG2.2.15细胞测序结果显示：一条染色体为野生型，序列长度 702bp；另一条染色体在sgRNA1、sgRNA2两个切割位点之间产生了 127bp的缺失(敲除碱基序列见SEQ ID NO.6所示)。
提取WT、EFTUD2+/-HepG2.2.15细胞总蛋白采用 Western-blotting法检测EFTUD2蛋白表达量差异，如图6所示，图6 为HepG2.2.15细胞EFTUD2单等位基因敲除后蛋白水平鉴定的示意图，结果显示EFTUD2+/-细胞EFTUD2蛋白表达量显著低于WT HepG2.2.15细胞。亦即，经过Western-blotting法验证表明：HepG2.2.15 细胞中的EFTUD2基因基本被敲除，即EFTUD2单等位基因敲除细胞模型建立成功。
综上所述，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑系统首次从 HepG2.2.15细胞株敲除EFTUD2单等位基因，简便、快速、可作为理想的细胞模型，研究宿主EFTUD2基因在抵抗HBV感染中的作用。
本发明已由上述相关实施例加以描述，然而上述实施例仅为实施本发明的范例。必需指出的是，已揭露的实施例并未限制本发明的范围。相反地，在不脱离本发明的精神和范围内所作的更动与润饰，均属本发明的专利保护范围。
序列表
<110> 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）
<120> 利用Cas9技术构建EFTUD2单等位基因敲除的HepG2.2.15细胞株的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2665
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cattcgctgt ttcaccagcc gactagaatg ctcttcccca ggtacctgta gagcttattc 60
tctgtctgca gattttttgc ttcagtagca cctctttttc cttgattgct ttattactaa 120
cacctggaac agtgcttagc acatattaag tgctcagtaa gtgttttagg acttaaaggg 180
tgatctggtg gccaccttag attatttgga agacttttta gcagaagtga gaatggcttc 240
gttaatgttg catatgacta tgggttaatt tgtaaggagg cagatttgaa gttatttaat 300
tgtaaagtgt acaatttaat ggcttttaga gtattcacag agtcatgcaa ctgtcatcac 360
aatcaatttt agaacatttc cattatctca gaaaaaaact ccacacccct tacccattgt 420
cctcccaccc acacctaccc tgccagccct gggcaatctg ctttctgtct atatagattc 480
gcctattctg aatattttca tataaatgga atcatataat atgcagcttt ttcagtctgg 540
cctctttact cagcatcatg ttttcaaggc ttatctacgc tgtagcatgt atatacctat 600
agcaagtata ggtattttgt ttgtttttgt tgccaaataa tcttttgtat ggatgtacca 660
catttcattt atccagtcat cagttgatcg acatttggtt gttcccactt tttggctatt 720
ataaataatg ccactatgaa cattgatttc taagtttttg tgtggccata agttttcatt 780
tgtcttgggt atatacttag gagtggactt gctgggtcat atgtaactct gtgttgaaca 840
ttttgaggaa ctaccaaaat attttccaaa gcagctgcac ctttttccca tcagcagtgt 900
gggaggtttc agtttctcca catccttgcc agcacctgtt attatctatc acaaagttat 960
tttccaaaaa caattctgtg gatataagtg aaaattttaa aggtatgggc ttatcttcag 1020
tttttacctc tggcttttgg tttctgcctt tggagaaagt tgcttttttc cccgtaaagg 1080
gctgtgctgt gatttgtttt ctccagtctc aacccacttg tgaccagtgg cccacattca 1140
gaaaggggca agtttgaacc aggagcactg tccatggcct cggcttagag tcttctcttt 1200
gtgaagggtc tcaaaggagt ggaacctccc ccactggcat agaactcaga ataagaagct 1260
ggccagcatg tacagtcagt gctgtcactc acggaggtag tcagatatca aacaggaaaa 1320
gcgtgtgcct cttcgattct ccctctccct cttgctttca gatggatgat gatgacgacg 1380
acgatgacgt aggagatcat gacgatgacc accctgggat ggaggtggtg ctgcatgagg 1440
acaagaagta ctacccaaca gccgaggagg tgtatggtcc tgaggtggag accatagttc 1500
aagaggaaga cactcagcct ctcacaggta catcaggagg acatgggctg tgcggagtga 1560
aattgaaacc tggaaacttc atagctctca gcaaacctta aaagttcagt gaatgaattg 1620
atcagttttt ctttactacc ttcaggtact gtttctggtt taagatttag ttaatccttt 1680
tttaatattc agtaaagttc ttaactagtt tctaagcaaa taagagttat ttcttattta 1740
tctgctatca gtttaggtgc atgaagactg tcgttaagtt tatttaccct gtggcctgat 1800
atgtttttcc atccaaataa ctccaaccct tttaaccagt tctcataata tgtattgtcc 1860
atttcttttt ctttttttga gacgaagtct tgctctgtcg cccatgctgg attacggtgg 1920
cacaatcttg gctcactgca acctccgcct ccctgattca agcaattctg cttcagcctc 1980
cctagtagct gggattatag gtgtctgcca ccatgcctgg ctaatttttg tatttttagt 2040
agaaacgggg tttcaccatg ttggcctggc tggtcttgaa ctcctgacct caagtgatct 2100
ctctgccctg tcctcccaaa gagctgggat tacaggcgtg agccactgca accagcctta 2160
ttgtccattt aatagttttc ataggctgga agcggtggct catgcctgta atcccagtac 2220
tttgggaggc cagagcagga ggatcgcttg aacccagcag ttcgagacca acctgggcaa 2280
catggtgaaa ccccatctct acaaaaaaag tacaaaaatt agctgggcat ggtggtagat 2340
gcctcctggc aactcgggag actgaggcag gaggatcact tgatcacgcc atttgtacgc 2400
ttcagcctgg gtaacagtga aaccctgtct cccaaaaaaa aaagttttca ttgatctttt 2460
ggaaagtgat tgcatcttat aaatgcaagg aaagatcctg aactgacatt gacctcaacc 2520
tacatccatt ccccctccct ccctcccact gtccctcaaa atgaagccca gactcctctt 2580
tccacaattc aaggtccttc actgtctcat gccaaacagc atttccaaaa ctttctcaac 2640
atatgagtga tccttgagag taaaa 2665
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccctgggatg gaggtggtgc caggtacatc aggaggacat 40
<210> 3
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccggcacc acctccatcc cagggaaacc cctgggatgg aggtggtgcc caccggcagg 60
tacatcagga ggacaaaaca tgtcctcctg atgtacctgc c 101
<210> 4
<211> 166
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggatgatg atgacgacga cgatgacgta ggagatcatg acgatgacca ccctgggatg 60
gaggtggtgc tgcatgagga caagaagtac tacccaacag ccgaggaggt gtatggtcct 120
gaggtggaga ccatagttca agaggaagac actcagcctc tcacag 166
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtaaagggct gtgctgtgat aacgacagtc ttcatgcacc 40
<210> 6
<211> 127
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgggatggag gtggtgctgc atgaggacaa gaagtactac ccaacagccg aggaggtgta 60
tggtcctgag gtggagacca tagttcaaga ggaagacact cagcctctca caggtacatc 120
aggagga 127

Claims (5)

1.一种利用Cas9技术构建EFTUD2单等位基因敲除的HepG2.2.15细胞株的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）靶点设计：选取EFTUD2 基因中可兼顾多个转录本的公共编码区的3号外显子为待敲位点，进行靶点设计，得到SEQ ID NO.2所示的靶点序列及SEQ ID NO.3所示的sgRNA序列，并设计合成EFTUD2 sgRNA1 oligo F/R和EFTUD2 sgRNA2 oligo F/R；
（2）鉴定引物合成：针对靶点上下游200～400bp区域分别设计并合成SEQ ID NO.5所示的正反向PCR鉴定引物EFTUD2-F/R；
（3）载体构建：采用携带Cas9的真核表达PX458质粒，采用限制性内切酶Bbs I酶切PX458质粒，并利用T4连接酶将EFTUD2 sgRNA1 oligoF/R、EFTUD2 sgRNA1 oligoF/R导入PX458质粒，构建PX458-EFTUD2 sgRNA1质粒载体、X458-EFTUD2 sgRNA2质粒载体；
（4）质粒转染：
提取PX458-EFTUD2 sgRNA1质粒载体、X458-EFTUD2 sgRNA2质粒载体转染HepG2.2.15细胞，并将转染后的HepG2.2.15细胞加入到细胞培养皿中培养；
（5）流式分选：转染后 48 小时胰酶消化收集细胞，将细胞分散为单细胞悬液，使用流式细胞仪以绿色荧光蛋白为信号进行分选；
（6）单克隆逐步扩大培养：分选收集的绿色荧光蛋白阳性细胞以1细胞/孔的密度接种至96孔板，4天换液一次，培养2周，成活的细胞长成单克隆细胞团，消化传至48孔板，逐步扩大培养；
（7）鉴定：各克隆基因组DNA，利用SEQ ID NO.5所示的鉴定引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定；通过与基因原序列比对筛选出EFTUD2基因敲除的阳性克隆株；提取细胞总蛋白，并采用Western- blotting 鉴定 EFTUD2 蛋白的表达。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）还包括：在 NCBI、ENSEMBLE 数据库中检索 EFTUD2 基因信息；找到EFTUD2 基因的蛋白质编码区，分析相应的基因组结构，明确蛋白质编码区的外显子部分。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）包括：
3.1采用携带 Cas9 的真核表达PX458质粒，该质粒带有绿色荧光蛋白筛选标记，利用限制性内切酶Bbs I 酶切PX458质粒，琼脂糖凝胶电泳并回收酶切的 PX458质粒，待用；
3.2利用 T4 连接酶分别将EFTUD2 sgRNA1 oligo F/R、EFTUD2 sgRNA1 oligoF/R导入PX458质粒，构建PX458-EFTUD2 sgRNA1质粒载体、X458-EFTUD2 sgRNA2质粒载体；
3.3利用热激法将连接产物转入感受态大肠杆菌中，并涂布 Amp+抗性的 LB 平板，成功得到单克隆菌落；
3.4进行平板克隆测序，筛选连接正确的阳性克隆菌落；以及
3.5将阳性克隆菌落扩大，抽提质粒保存于-20°C，待用。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）包括：
4.1准备HepG2.2.15细胞，将HepG2.2.15细胞以5×105/孔的密度铺至6孔板，培养24小时待用；以及
4.2转染，细胞量达80%时，消化离心细胞，将 HepG2.2.15 单细胞悬液加入lipo3000脂质体、PX458-EFTUD2 sgRNA1质粒载体、PX458-EFTUD2 sgRNA2质粒载体的混合物中，重悬混匀；并对混合物进行电转，并将电转杯中的HepG2.2.15细胞吸出，加入到细胞培养皿中培养。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4.2还包括：使用 Bio-Rad 公司的电转仪，在200V、500uF、4mm 电转杯的条件下，将 HepG2.2.15 单细胞悬液加入lipo3000 脂质体、PX458-EFTUD2 sgRNA1质粒载体、PX458-EFTUD2 sgRNA2质粒载体的混合物加入电转杯中，电击一次；轻轻将电转杯中的 HepG2.2.15 细胞吸出，加入到细胞培养皿中培养。
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