CN113604440A - 一种Ago2基因敲除的BHK-21细胞系 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学与细胞生物学领域，提供了一种Ago2基因敲除的BHK‑21细胞系，其保藏编号为CCTCC NO:C2021206。上述Ago2基因敲除的BHK‑21细胞系可用于塞尼卡增殖和塞尼卡疫苗的生产。本发明利用CRISPR/Cas9技术成功构建了Ago2基因敲除的BHK‑21细胞系；该细胞系中塞尼卡病毒复制速率加快，病毒滴度显著提高，且对细胞生长速率无显著影响，可用于塞尼卡疫苗的商业化生产。

Description

一种Ago2基因敲除的BHK-21细胞系
技术领域
本发明属于分子生物学与细胞生物学领域，具体涉及一种Ago2基因敲除的BHK-21细胞系。
背景技术
塞尼卡病毒（Senecavirus A, SVA），曾被称作塞尼卡谷病毒（Seneca Valleyvirus），2016年，国际病毒分类学委员会（ICTV）将其更名为Senecavinus A，是微RNA 病毒科塞尼卡病毒属的唯一成员。2007 年加拿大爆发猪原发性水疱病，经水疱性疾病的病原检测确定了口蹄疫和猪水疱病等病原均为阴性而SVA为阳性，因此，SVA 是导致猪原发性水疱病的病原。起初，在猪群中偶尔能检测到该病毒，但一直未见该病毒引起疾病的报道。因此，塞尼卡被认为是一种新出现的动物传染病。2014年11月至2015年初，在巴西和美国先后爆发该病。自此，随着病例每年在新的地点出现，SVA似乎正在成为一种全球流行的病毒。
目前国内还没有塞尼卡疫苗的上市。灭活疫苗的生产则依赖于病毒在幼仓鼠肾传代细胞BHK-21（Baby hamster kidney cell）中的复制。BHK-21细胞最早由MacPherson和Stoker于1962年利用1日龄叙利亚仓鼠肾细胞建系。该细胞生长迅速、病毒敏感谱较广，随后被用于多种病毒的增殖及疫苗生产，如口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、新城疫疫苗等。原始的BHK-21细胞为贴壁生长型细胞，不利于商业化疫苗的大规模生产。Capstick等对BHK-21细胞进行了悬浮培养驯化，并于1965年在不锈钢发酵罐中用驯化的悬浮培养型BHK-21细胞培养生产了口蹄疫疫苗，开启了利用悬浮培养BHK-21细胞生产疫苗的新时代。目前贴壁生长型BHK-21细胞主要用于实验室的前期研究，而商业化疫苗生产则完全采用悬浮培养型BHK-21细胞。尽管BHK-21细胞已经应用了50多年，除了悬浮培养驯化外，目前尚没有研究利用遗传手段改造BHK-21细胞，使其更有利于塞尼卡病毒复制，并将遗传改造后的BHK-21细胞应用于塞尼卡疫苗的生产。
在生物不断进化的过程中，宿主激发对外来物质的抵抗的能力是维持生命的一个基本属性。关于抗病毒防御，已经演变了许多策略抑制病毒复制。而宿主的这种抗病毒防御，可能会影响病毒在进化过程中的多样性。其中RNA干扰（RNAi）是一种主要的抗病毒防御形式。在抗病毒RNAi的过程中，病毒复制产生的病毒双链RNA（dsRNA）复制中间体（vRI-dsRNAs）或病毒RNA二级结构产生的dsRNA被宿主核糖核酸内切酶（Dicer）酶切成21-23个核苷酸的siRNA，这些siRNA与AGO2蛋白和Dicer酶共同构成诱导沉默复合体（RISC），RISC在结合部位切割mRNA。被切割后的断裂的mRNA 随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA 的降解反应。由以上可见，Ago2是行使RNAi的关键蛋白。迄今为止，RNAi已被广泛认为是真菌，植物和无脊椎动物中最重要的抗病毒机制之一，而许多病毒编码病毒RNA沉默抑制因子（VSRs）来抵抗宿主以RNAi为基础的抗病毒能力。相反，在哺乳动物细胞中，vRI-dsRNAs和其他病毒核酸主要诱导先天性抗病毒免疫防御，例如干扰素（IFN）系统，而RNAi在这个过程中是否发挥重要的抗病毒作用一直是长期争论的话题。
发明内容
针对目前塞尼卡病毒生产细胞系滴度低等问题，本发明提供一种Ago2基因敲除的BHK-21细胞系，采用CRISPR/Cas9技术对BHK-21细胞系进行基因编辑，成功敲除了Ago2基因，该细胞系中塞尼卡病毒复制速率加快，病毒滴度显著提高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种Ago2基因敲除的BHK-21细胞系，其保藏编号为CCTCC NO: C2021206。
上述Ago2基因敲除的BHK-21细胞系可用于塞尼卡增殖和塞尼卡疫苗的生产。
一种靶向Ago2基因的sgRNA，其oligo DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3-4所示。
一种包含上述sgRNA的载体。
优选地，所述载体选自PX458质粒。
本发明具有以下优点：
本发明利用CRISPR/Cas9技术成功构建了Ago2基因敲除的BHK-21细胞系；该细胞系中塞尼卡病毒复制速率加快，病毒滴度显著提高，且对细胞生长速率无显著影响，可用于塞尼卡疫苗的商业化生产。
生物保藏信息
叙利亚仓鼠肾细胞BHK-21-Ago2Δ-，于2021年08月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址为中国武汉 武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: C2021206。
附图说明
图1为不同重组载体经T7E1内切酶酶切后琼脂糖电泳图；
图2为纯合突变细胞系和野生型细胞系的序列对比图；
图3为纯合突变细胞系和野生型细胞系的Western blot结果图；
图4为塞尼卡病毒在不同细胞中RNA表达量对比图；
图5为塞尼卡病毒在不同细胞中病毒滴度变化；
图6为BHK-21-Ago2Δ-细胞系生长曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 靶向Ago2的sgRNA的设计和筛选
1. 靶向Ago2的sgRNA的设计
以叙利亚仓鼠Ago2蛋白基因（Gene ID：101843722）为模板，选择前面且是所有突变体的共有外显子，外显子的序列长度必须不是3的倍数，利用gRNA在线设计网站http://crispor.tefor.net/设计筛选出合适的序列并在前端加入CACCG序列，作为gRNA-F，同时，把筛选出的序列的反向互补序列前端加AAAC、末端加C作为gRNA-R，其对应的oligo DNA序列如表1所示：
表1 sgRNA对应的oligo DNA序列
Figure 288906DEST_PATH_IMAGE002
将上述引物合成后从80℃-30℃梯度降温退火完成复性获得杂交链。将PX458质粒以BbSI酶切，电泳并回收大片段。将杂交链和回收的酶切PX458质粒连接，转化Trelief TM5α感受态，然后涂布于含有氨苄抗性的LB平板，挑取上述平板上的单菌落，测序正确的8个载体保存备用。
2. sgRNA的切割效率检测
采用lipo3000脂质体转染法检测sgRNA的切割效率：将上一步构建好的sgRNA与Cas9共表达的8个载体和PX458空质粒分别转染至BHK-21细胞中。转染36h后，通过GFP荧光观察细胞转染效率。在细胞转染48h后收集细胞，利用试剂盒提取细胞DNA，用表2中的引物进行PCR扩增。PCR体系及程序：使用PCR 检测，每个反应总体系为50μL：primer STAR MaxPreMix 25μL、2μL DNA模板、引物（10μM）各1μL、ddH2O补足至50μL。反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性45sec，59℃退火45sec，72℃延伸45sec，35个循环；72℃延伸10min；4℃forever。
表2 对应的扩增测序引物序列
Figure 111107DEST_PATH_IMAGE004
将PCR扩增产物测序，同时将产物用NEB T7E1内切酶酶切，再进行琼脂糖电泳，初步估计切割条带与未切割条带的比例，从而反映出CRISPR-Cas9的活性。结果如图1所示，sgRNA1被清晰的酶切为两段较短的条带(如白色箭头所示)，故选择PX458-sgRNA1进行后续试验。
实施例2 Ago2基因敲除BHK-21细胞系的的构建
1. Ago2基因敲除BHK-21细胞系的建立
选取切割效率最高的PX458-sgRNA1采用lipo3000脂质体转染法转染至BHK-21细胞中，培养48小时后，利用流式分选细胞得到阳性细胞，置于含有1%双抗、10%FBS的DMEM营养液37℃ 5% CO2培养箱进行培养、扩繁。将单克隆细胞系提取的DNA，并用相应引物进行PCR扩增。PCR产物测序，挑选具有纯合突变序列的细胞保存。保存的纯合突变序列与野生型的序列对比如图2所示：在目标位置有2个碱基（CG）的插入，这种移码突变预期会造成蛋自翻译的移码、提前终止及功能丧失。突变位置附近测序峰图质量很高，表明测序结果可靠。
2. Ago2敲除细胞系蛋白鉴定
将野生型和保存的纯合突变细胞裂解并收集上清液，一部分上清液用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo)定量总蛋白，确定上样体积。剩余上清液加入四分之一体积的4×上样缓冲液混匀，煮沸5分钟，室温静置冷却后进行SDS-PAGE电泳，然后转PVDF膜，免疫显色，以β-actin作为内参，结果如图3所示：纯合突变细胞的Ago2蛋白几乎不表达，这说明在蛋白表达水平Ago2被成功敲除。
将纯合突变细胞命名为BHK-21-Ago2Δ-，进行保藏，保藏编号为CCTCC NO:C2021206。
实施例3 塞尼卡病毒感染Ago2敲除细胞系及病毒复制速率
1. 病毒RNA表达量
将BHK-21-Ago2Δ-细胞和BHK-21细胞培养到大约80%的汇合度时，吸掉培养基，以0.01MOI塞尼卡病毒接种细胞，在培养箱中孵育1h，吸掉病毒液，加入PBS洗两次细胞后加入含2%FBS的DMEM培养基。分别在感染4h、8h、12h、16h、20h、24h收集上清及细胞样品。用试剂盒提取总RNA反转录后进行SYBR Green qPCR，引物如下：
SVA-QRTU：5'-AGAATTTGGAAGCCATGCTCT-3'；
SVA-QRTL：5'-GAGCCA ACATAGAAACAGATTGC-3'；
结果如图4所示，塞尼卡病毒感染后，Ago2敲除细胞系（Ago2Δ-）中塞尼卡病毒的复制速率显著高于对照细胞系（BHK-WT）。
2. 病毒滴度变化
将BHK-21细胞在96孔板培养到汇合度约70%时用PBS冲洗两遍备用；将上述步骤1中获取的各时间点收集的两株细胞系的病毒液分别作连续10倍的梯度稀释，将稀释好的病毒液接种细胞，每孔接种100μL。在培养箱中孵育1h，吸掉病毒液，用PBS洗两次细胞后，每孔加入含有2%FBS的维持培养基200μL，培养箱中继续培养。逐日观察并记录细胞病变结果，连续观察3天后根据Reed-Muench两氏法计算TCID50值。结果如图5所示，塞尼卡病毒感染后病毒滴度在Ago2敲除细胞系培养基中显著升高。
实施例4 Ago2敲除细胞系生长速率
将BHK-21-Ago2Δ-细胞和BHK-21细胞消化后计数，10000/孔接种至96孔板，置细胞培养箱正常培养12h、24h、36h，然后在培养基中添加10μL的CCK8，培养箱继续孵育2h，在多功能酶标仪上测定450nm处的吸光值。根据测定的吸光值制作细胞的生长曲线。结果如图6所示，Ago2敲除后并未显著影响细胞的生长速率。
序列表
<110> 山东省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种Ago2基因敲除的BHK-21细胞系
<130> 20210901
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ago2-1F
<400> 1
caccggtgcc gaagtccggc cgagg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ago2-1R
<400> 2
aaaccctcgg ccggacttcg gcacc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ago2-2F
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<212> DNA
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<220>
<223> Ago2-2R
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<211> 25
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<211> 25
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<220>
<223> Ago2-3R
<400> 6
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<211> 25
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<220>
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<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> AGO2-sg4-R
<400> 14
gtggccccaa ccctaatacc 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SVA-QRTU
<400> 15
agaatttgga agccatgctc t 21
<210> 16
<211> 23
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SVA-QRTL
<400> 16
gagccaacat agaaacagat tgc 23

Claims (5)

1.一种Ago2基因敲除的BHK-21细胞系，其保藏编号为CCTCC NO: C2021206。
2.一种如权利要求1所述的细胞系在增殖塞尼卡病毒或生产塞尼卡病毒疫苗中的应用。
3. 一种靶向Ago2基因的sgRNA，其特征在于，其oligo DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3-4所示。
4.一种包含如权利要求3所述sgRNA的载体。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为PX458质粒。
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